リポ蛋白Lp(a)に学ぶ

リポ蛋白(a)に学ぶ
岐阜医療科学大学 安部 彰
2009.2.21 第19回生物試料分析科学会 大会長講演
名古屋国際会議場 ２号館
1. Lp(a)との出会い
2
医療界の変遷
私の勤めた時代
1966
1960
70
80
90
2000
61国民皆保険制度
臨床検査技師制度と教育
59衛生検査技師
71臨床検査技師
60山口県医科大
80大阪大検査診断学講座
85岐阜大検査医学講座
臨床検査の自動化
65テクニコンAA
医療経済
73ロトケム
75日立705
81検査マルメ
98DRG(疾患別分類）
/PPS（包括支払い方式）
03ISO15189
08特定健診・特定保健指導制度
3
2. Lp(a)とは
4
Lp(a)発見から研究の進展
1963 Berg Lp(a)の発見
年代
６３－８０
1972 Dahlen 冠動脈疾患
８１－８５
1974 Albers RID、RIA測定法
1982 Murai 脳梗塞
1984 Kawade 急性期蛋白
1987 Utermann
日本
世界
９１－９５
アイソフォーム（フェノタイプ）
McLean アポ(a)DNAシーケンス
1988 Abe ELISA測定法
1992 Kraft
８６－９０
９６－００
０１－０５
アイソフォーム（ジェノタイプ ）
０６－０８
2005 Tsimikaｓ 酸化Lp(a)
0
200
400
600
論文数
PubMedから検索
800
5
プラスミノゲンとapo(a)の相同性
(McLean 1987, Koschinsky 2006)
プラスミノゲン
末端ペプチド
I
活性プロテアーゼ
II
III
IV
V
クリングル
apo(a)
IV1
IV2
IV3 IV4 IV5 IV6 IV7 IV8 IV9 IV10 V
ｎ n=3～40
アイソフォーム
非活性プロテアーゼ
WLBS（IV5ｰ8) SH（IV9) SLBS（IV10)
WLBS:弱いリジン基結合域 SLBS:強いリジン基結合域 SH:apoB100とSS結合
6
Lp(a)構造
(Koschinsky, 2006)
LDL
K4(1-10)
Ｓ
K4-7-8: B100のLys残基と弱い結合
K4-9：B100と共有結合してLp(a)が生まれる
K5: プラスミノ
ゲン活性阻害、
酸化リン脂質と
結合
10 K5
K4-10：FibrinのLys残基と強い結合
7
7
電気泳動によるLp(a)のパターン
(Extra pre-β lipoprotein)
PAG
0.5%アガロース、ズダンブラック染色
Origin
Origin CM
CM
VLDL
Lp(a)
LDL
LDL
Lp(a)
VLDL
HDL
HDL
117
124
69
（前田 1980）
148 mg/dl
8
Lp(a)抗原精製と抗体作製
（川出、1983）
プール血清10容に①
0.5%デキストラン硫酸+
1mol/lCaCl2 混液1容を加えて
①全血清
②LDL+VLDL沈殿
・LDL+VLDL分画沈殿②
③1.065<d<1.120分画 Lp(a)
CBB R250染色
・沈殿物を1mo/lNaCl2 2容+
0.2mol/lシュウ酸アンモウム1容に溶解
10,000g 10分遠心
・上清を透析
Origin
超遠心1.063<d<1.120③
・分画を透析 ・BioGel精製
抗原を家兎に免疫
抗Lp(a)
①
②
③
9
3. Lp(a)の研究
10
ELISA法による
Lp(a)測定の確立
POD標識抗体
CHM：N-(4-carbokycyclohexylmethyl)
mareimide
マイクロプレートELISA法
検出感度：0.04mg/dl
2,600倍希釈を血清20μｌ
第1抗体反応2時間
第2抗体反応1時間
(Abe, 1988)
11
11
血清Lp(a)のELISA法による測定
成人血清濃度 平均値 14.1 中央値 9.8mg/dl
臍帯血濃度
平均値 1.56 中央値 0.98mg/dl
新生児は1歳経過後成人値になる
12
Lp(a)は他の脂質と独立した存在である
Lp(a)、総コレステロール、トリグリセリド、
アポ蛋白（AI, AII, B)の相関性と主成分分析した
13
Lp(a)血清濃度は民族差がある
血清Lp(a)濃度は遺伝により規定されている
アフリカ黒人
チロル人
中国人
対数正規分布 0.1～100mg/dl
1414
血清濃度はapo(a)分子サイズに負相関する
白人
中国人
黒人
1515
4千万年前に進化した旧世界のサルと
ヒトにのみapo(a)遺伝子は存在
新世界
Lp(a)はアスコルビン
酸合成能力のない
動物にある。
Lp(a)は組織修復の
役割をする 。
(Pauling, 1990)
旧世界
（Makino, 1989）
16
16
Lp(a)アイソフォーム測定法
（フェノタイプ）
還元剤：２メルカプトエタノール（２ME)
泳動：4%SDS-PAGE
転写：ニトロセルロース膜
検出：１次抗体抗 apo(a)抗体
2次抗体 金標識IgG抗体
（1998年改良）
17
アイソフォームとクリングル繰り返し数
Utermannの分類 クリングル数
apoB100より速い F
11～13
apoB100を基準
B
14～16 LMW
LMW:low molecural weight
遅い S1
17～19
HMW:high molecural weight
S2
20～22
S3
23～25
HMW
S4
>26
アイソフォームマーカー（クリングル42のナンバー）
アイソフォームマーカーのクリングル数（三和化学）
18
フェノタイプのクリングル数表示
フェノタイプとジェノタイプの比較
19
ジェノタイプ法の測定法
EDTA処理血液からリンパ球を採取
リンパ球を1%LMPアガロース・プラグにする
プロテアーゼK、48hr 55℃
apo(a)DNAを制限酵素KpnIで断片化する
パルスフィールド電気泳動
メンブランに転写
DIGラベル化DNAプローブとハイブリダイズ
DIG発光法でDNAを検出
(DIG:digoxigenin)
20
パルスフィールド電気泳動
分子量の大きいＤＮＡ断片を泳動する。
電場を2方向に交替させてDNA断片をジ
グザクに分子ふるい効果で分離する。
21
Lp(a)のジェノタイプ分析
・KpnI制限酵素に
よりDNAの断片が
できる
・クリングル４の１個
は5.6kb
・クリングル４の繰り
返し数12～52個を
検出できる
（クリングル42として340個）
22 22
Lp(a)の臨床的意義
デシジョンレベル >30ｍｇ/dl
動脈硬化（虚血性心疾患）
血栓症（脳血管障害）
診療報酬
3ケ月に1回
1993年250点
2008年120点
23
図：Mebio, 5(7),1988から引用
一瀬白帝：Brain Nerve, 2008
Lp(a)の動脈硬化
促進作用
抑制
内皮細胞
血小板
亢進
放出
aTGFβ←LTGFβ
tPA
PAI-1
プラスミン←プラスミノゲン
血小板
放出
PDGF
増殖抑制
←Lp(a)
PAI-1産生亢進
↑
Lp(a) Plg活性抑制
平滑筋細胞 増殖
酸化Lp(a)→
Lp(a)→ 放出↓
IL-8産生亢進 IL-8
粥状動脈硬化巣
24
24
酸化LDL抗体とLp(a)の反応
酸化ホスホリルコリン
酸化フォスファチジルコリン
MDA化LDL
（MDA:マロンジアルデヒド）
DLH3抗体
E06抗体
B100抗体
OxPL
OxPL
OxPL
OxPL
apo(a)
apo(a)
B100
B100
B100
MB47
（B100抗体）
Tsimikas 2004
MDA
B100抗体
協和メデックス
抗MDA
抗LDL抗体
積水メディカル
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Lp(a)は酸化LDLと相関
（リン脂質抗体E06）
ブルーニコ地方（イタリア）の研究
r=0.87
対象：1995年と2000年に40～79歳
男女について 頚動脈、大腿部
の動脈硬化性疾患1,990人を調査。
成績：OxPL/apoB比とLp(a)との
相関性r=0.87。
疾患群のOxPL/apo比は 0.087
以上と有意に高値o
結論：OxPL/apoBバイオマーカー
は冠動脈疾患の診断と経過観察
に意義がある。
（Tsimikas 2004)
26
お世話になった研究者の方々に感謝いたします（敬称略）
岐阜大学 川出眞坂、野間昭夫、前田悟司、福井加代子、国立栄養研究所 板倉弘重、
順天堂大学 李 英俊、霊長類研究所 竹中 修、増子記念病院 利見和夫、栄研化学 浦田武義、
シノテスト 山田晋呉、インスブルグ大学 G.Utermann, H.G.Kraft, F.Kronenberg 、
岐阜県赤十字血液センター、千手堂病院、岐阜医療科学大学
2727
ご清聴ありがとうございました
http://homepage2.nifty.com/abe-akira/
28
29
クリングル繰り返しを認識しない
モノクロナール抗体の開発
（Yamada,1999)
T1～10 kringle ４
5'
1
2
2
3
4
5
6
7
8
kringle ５ protease
9
10
V
P
variable
repeats
2B3
243F7
203E2 202A9
3'
Lp(a)の血管新生抑制作用
血管新生(angiogenesis)
慢性炎症
創傷治癒
悪性腫瘍の進展
Lp(a)は心血管に影響するほ
か抗血管新生作用がある
Lp(a)はアンギオスタチン（クリ
ングル3～4個のPlg断片、
38kDa）のファミリー
(Lippi, 2007)
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