1ページ目 2013-生命環境学術誌（by岡本茉佑美et al）

March ２013
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No. 5
CONTENTS
Articles
Breakdown of Clubroot Resistance Hiroshimana
'CR Hiroshima No. 2'
{Bﾉ'cissica rapa L.)
……Takashi OKU, Motoyasu OCHI, Mitsuhiro MAEDA and Suguru CHOKYU
Evaluation of carcinogenic/co-carcinogenic activity of mokusaku-eki, a wood charcoal
by-product used as a folk remedy, in BALB/c ３T3 cells
……Mayumi OKAMOTO, Ryuichiro FUKUTOMI, Masato HORI, Takahiko TSUNO,
Mikiko
FUJII
and
Masaaki
TAT S U K A 9
Basic study on digestion method upon supercritical water oxidation using hydrogen
peroxide in super alloy reactor (Hastelloy C-276) for quantitative microanalysis
……………Jun NISHIMOTO, Kazue NISHIOKA, Yasuaki OKAMOTO, Kazuaki ITO,
Etsuro
IWAMOTO 19
Business analysis of Agricultural Corporations based on the BAST
(BUSINESS ANALYSES & STATISTICS by TKC)
………………………･…………………･……………・Yasuyuki SHIKATA
Note
Red Rice in the Ancient Times in Japan
…………………………･………･…・Masami OGAWA and Tomio ITANI
Student motivation to learn 1
Examples of Faculty of Life and Environmental Sciences
……･………………･…･…………………………………Mizuho HIKIDA
Regional cooperation such as agriculture activation of Commerce and Industry
A Case study of the M potato chip
．…･…………………･…………Satoshi Yamazaki and Yasuyuki Shikata
Thesis Titles of Recent Graduates of Faculty…………･……………･…………・
Titles of Master's Thesis……………………………………･……･………………・
Titles of Ph.D. Dissertations…………･……………………･……………………・
RecentPUblicationsofFacaltyMembers・………………･………………………・
Research Introduction……･…………………．．…………Takuya MATSUMOTO
Faculty Special Research Project………………………Kazuyuki NISHIMURA
Field Science Education Research Center………………………Kohei IRIFUNE
In Reminiscene of My Teaching Career…………………Masayuki ZENIHIRO
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March 2013
Faculty of Life and Environmental Sciences
Prefectural University of Hiroshima
生命環境学術誌第５号
1
０
ション活性を評価することが可能であり、これらふたつの効果に対する抑制活性（ケモ
プリペンション活性）も評価出来る。我々は、以前の研究において、BALB/c 3T3細胞
を標的とした試験管内発がん実験系を用いた竹酢液の発がん性試験をおこない、竹酢液
には入浴時使用濃度である1,000倍希釈以下では発がんイニシエーション活性も発がん
プロモーション活性も検出されず、むしろ、発がんを抑制する傾向にあることを報告し
た(4)。そこで本研究では、市販されている各種木酢液類の抗発がんイニシエーション活
性と抗発がんプロモーション活性を細胞傷害性が出ない1,000倍希釈の濃度で調べた。
その結果、.メーカーにより差があるものの、発がんプロモーションを抑制する活性を持
つ商品があった。
２．材料と方法
2. 1.細胞と培養BALB/c 3T3 A31-1-1細胞を試験管内発がん実験標的細胞とし
て用いた(5)。この実験系は被検因子（例えば､化合物や放射線など）の発がんイニシエー
ター活性(DNA損傷を誘起する作用）と発がんプロモーター活性（がん形質発現を促
進する作用）をそれぞれ定量的に評価可能である(6.7)。標的細胞であるBALB/c 3T3
A31-M細胞は角永らのオリジナルストックを使用し(5)、凍結融解後初期継代細胞を用
いた。培養はイーグル最小必須培地(Life Technologies Japan)に10%ウシ胎児血清を
添加した培地を用い、３７℃の5％炭酸ガス購卵器で培養した。尚、５％炭酸ガス解卵器は
機器のシーリング剤その他の原因でトランスフオーメーシヨンに大きな影響を与えるこ
とがあるので(8)、本研究では、経年使用の照卵器を洗剤できれいに洗浄した後、トラン
スフオーメーションに影響が無いことを事前にテストしている。また、薬剤処理により
シャーレからの揮発成分が同時に培養している細胞に影響を与えるので、薬剤処理をす
る実験群の細胞は標的細胞の培養とは異なる騨卵器内で培養した。
２．２．化合物発がんイニシエーターとして3-methylcholantlirene (3-MCA) (SigmaAldrich Japan)、発がんプロモーターとして12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)
(Sigma-Aldrich Japan)を用いた。また、木酢液類として、市販品の5種類の木酢液（メー
カー名は匿名でA、Ｂ、Ｃ、Ｄ，Ｅと称す）と3種類の竹酢液（メーカー名は匿名でF，Ｇ、
Ｈと称す）の8種類を用いた。尚、化合物や木酢液類の処理は処理前に細胞培養用の培
地や蒸留水、DMSOなどの溶媒で希釈すると、その効果が大きく変更するので(8'９)、化
合物については溶媒に溶解された原液(3-MCAの場合はDMSOに1 mg/mlで溶解した原
液、TPAの場合はDMSOに0.1 mg/mlで溶解した原液）を最終濃度(3-MCAの場合は最
終濃度2.5 ^g/ml、TPAの場合は最終濃度100 ng/ml)となるように標的細胞の培地に直
接添加した（添加時期は図1参照のこと)。また、木酢液類も最終濃度が原液の0.1%と
なるように原液を標的細胞の培地に直接添加した（添加時期は図1参照のこと)。尚、木
酢液類は未開封のものを使用し、無菌的に取り出してそのまま滅菌せずに用いたが、全
てのメーカー品で細胞が細菌やカビ等で培養細胞が汚染すること（コンタミネーション）
は見られなかった。
２．３．試験管内発がん実験木酢液類は以前の研究結果から0.1% (1,000倍希釈）
以下では細胞傷害性を示さない(4)^本研究では、トランスフォーメーション頻度を計測
するために、試験管内発がん実験系の標準的な方法でコロニー形成能によって細胞の生
存率を計測した(3)。それに基づき、生存細胞あたりのトランスフォーメーション頻度を
求めた。具体的な発がんイニシエーシヨンと発がんプロモーションに対する木酢液類の
効果を調べるためのプロトコールは、図1に示すように、以前の報告(4)に準拠した。
２．４．統計処理マン・ホイツトニー・ウイルコクソン検定によ陰りおこなった。
BALB/c 3T3細胞を標的とした試験管内発がん実験系による各種類の発がん性試験(岡本･福富･堀･津野･農井･達家) 11
３．結果
３．１．各種木酢液類の発がんイニシエーシヨン効果市販品の木酢液5種類、竹酢
液3種類について0.1%濃度でのA31-1-1細胞に対するコロニー形成能への影響を調べた
が、以前の我々の観察と同様に、どの市販品においても有意な細胞傷害性は認められな
かった。また、コロニー形成能に基づく生存細胞あたりのトランスフオーメーション頻
度を求めたところ、表1に示すようにいずれの木酢液類においても有意なトランスフオー
メーシヨン頻度の増加は認められず、発がんイニシエーシヨン活性は認められなかった。
３．２．各種木酢液類の発がんプロモーション効果市販品の木酢液5種類、竹酢液３
種類について0.1％濃度で、3-MCAを発がんイニシエーターとして用いた時のプロモー
ション効果を調べた。その結果、表2に示すように、木酢液C、木酢液E、竹酢液Fの3種
類の商品について3-MCAによるトランスフオーメーシヨン頻度を有意に下げることが
わかった。
４．考察
以前の我々の研究から、竹酢液において0.1%以下の濃度ではBALB/c 3T3 A31-1-1細
胞を標的とした試験管内発がん実験系での発がん性は認めないことがわかっていた(4)。
この濃度は、通常、竹酢液を入浴剤として使用する時に皮膚や粘膜に接触する濃度を越
える程度に匹敵し、竹酢液による細胞傷害が起こらない濃度域での安全性試験である。
しかし、竹酢液はその成分がロット間やメーカー間で大きくばらつくことが予想されて
いた。更に、ｍ皿C-lacZ融合遺伝子を導入したサルモネラ菌を用いる短期変異原性試
験(umu試験）において、木酢液からカラム分画により部分的な抗菌成分の除去後、ラッ
ト肝ホモジネート9,000Xg上清分画(s9)で代謝活性化した検体においては調べられた
19種類全ての木酢液で突然変異原性を認めたという報告がある(2)^そこで、本研究では
市販の3種類の竹酢液に加えて、５種類の木酢液の発がんイニシエーシヨン活性と発がん
プロモーション活性を調べた。
一般に発がん剤（化学物質のみならず、Ｘ線などの電離放射線や非電離放射線である
紫外線）の発がん性は細胞傷害性を発揮する濃度域で認められる。更に、究極発がん物
質(ultimate carcinogen，あるいは、ultimate carcinogenic metaboliteに与えられた訳語で、
元の化合物が生体内代謝や化学修飾により構造変化した結果生じたDNA損傷誘起作用
のある化合物のこと）になるためには、人体内での代謝活性化を必要とする化学物質も
少なくない。しかしながら、本研究では、実際に民間療法として入浴などの目的で用い
られている濃度域での人体への影響を想定し、また、内服は基本的には無いという観点
から、検体である木酢液類の試験濃度を0.1%とし、s9による代謝活性化をおこなわずに
試験に用いた。これまでの多くの公的機関や民間機関での木酢液類の成分分析、あるい
は米国の国立がん研究所、あるいは、フランスのリヨンに本部を置く国際がん研究機構
などの調査から、タール類には多くの発がん性物質が認められており、樹木を原材料と
したものにおいても例外では無い(!｡)。タール類の上澄み液である木酢液には、例え検出
限界以下という数値での試験結果であったとしてもbenzopyreneや3-MCAなどといった
タールに含まれる発がん物質が存在する可能性が高い。しかしながら、こういった種類
のものが広く民間に使われており、健康への効能を謡うがごとく（明確に効能表示すれ
ば薬事法違反であるが）販売されている現状を考えると、その商品群の人体に対する影
響を実際の使用方法や使用濃度に即して評価しておくことは非常に大事なことである。
本研究の結果、1,000倍希釈濃度の木酢液類では発がんイニシエーション活性を認め
なかった。また、発がんプロモーション活性については、８種類の商品の内3種類に抑制
効果のあることがわかった。木酢液類は多くの成分が爽雑物として存在しており、どう
生命環境学術誌第５号
1
２
いった成分が発がんプロモーションを抑制するかは不明である。また、発がんプロモー
ション作用は細胞の増殖や分化のための細胞内シグナル経路ががん形質発現のために活
性化された時に起こると考えられるが、こういったシグナル伝達を修飾する細胞表面で
の出来事は非常に複雑であり、複合要因が関与するため、単一の物質に起因しているか
どうかも不明である。但し、今回観察した木酢液類の発がん抑制効果はプロモーション
作用の抑制であり、発がんイニシエーシヨンの原因を消去すると考えられる抗酸化作用
を持つとされる物質がこの作用に関与しているとは考えにくい。
多くのケモプリペンション研究、あるいはファイトケミカルと言われる食品の研究で
は抗酸化作用が抗発がんの作用機作であるとされている。抗酸化作用はDNA損傷の誘
起を抑制するので発がんイニシエーションを抑制していると考えられるが、一方におい
て、発がんプロモーションの抑制もケモプリベンシヨンにおける重要な研究対象である。
発がんプロモーション抑制の作用機作として、単に発がんイニシエーションされた細胞
の増殖抑制効果のみならず、発がん因子によりイニシエーシヨンされた細胞を選択的に
自爆的細胞死（アポトーシス）へと導くような抗発がん作用も考えられる。ファイトケ
ミカルと言われる食品の中にも木酢液類同様、こういった作用機作で効力を持つものが
存在するかも知れず、今後の解析に期待がかかる。
本研究結果を受けたとしても、木酢液類を原材料とした抗発がんプロモーション効果
物質の開発は木酢液類に爽雑している化合物の種類の多種多様さや、そこに必ず存在し
ている可能性が拭い得ないbenzopyrene-^ 3-MCAなどの発がん性化合物の存在といった
理由から、非現実的である。しかしながら、今回の観察は次のような可能性を想像させ
る。すなわち、欧米では許認可されないクレオソートなどのタール由来の内服医薬品が
本邦では古くから長年にわたり消化器機能改善薬などで広く使用されていることや、ま
た、タール成分を含む酒類（ウイスキーやバーボンなど）は欧米でも大いに好まれて長
年愛飲されていることなどと関連して、実際にはこういったタール由来の多種多様な夷
雑物がヒトの発がんに対して促進的に働いているのではなく、本研究で観察した木酢液
類と同様に、実はむしろ抑制的に働いているかも知れないという可能性である。
BALB/c 3T3細胞由来の試験管内発がん標的細胞にはA31-1-1よりも発がん感受性の高
V*A31-1-13が存在する(刃。この細胞系では発がんイニシエーションに対する感受性は
A31-1-1と同じであるにもかかわらず、内因性の発がんプロモーター活性力塙い(6. 7. 11)。
こういった細胞系を用いた抗発がんプロモーター作用を持つ素材の研究開発は新規ファ
イトケミカル発見のために有用であろう。
謝辞
本研究遂行にあたり技能補佐して下さった竹下由紀さん、更に、研究遂行に協力を頂
いた本学生命科学科ゲノム制御システム生物学の皆さんに心より感謝します。
文献
Dikun PP, Kostenko LD, Kiprianov AI, Demchenko EA, Romanoyskaia LS. Effect
of heating on the benz(a)pyrene content in wood pyrolysis products. Vopr Onkol
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駒形修,本山直樹．各種市販および自家製木酢液・竹酢液の変異原性．環動昆
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達家雅明,角永武夫．細胞形質転換試験.血：石館基, ed.変異原性，遺伝毒性.東
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BALB/c 3T3細胞を標的とした調措内発がん実験系による各種類の発がんｾ獄験(岡本･福富･堀･津野･藤井･達家）
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1
３
Kimura Y, Suto S, Tatsuka M. Evaluation of carcinogenic/co-carcinogenic activity
of chikusaku-eki, a bamboo charcoal by-product used as a folk remedy, in BALB/c
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Kakunaga T, Crow JD. Cell variants showing differential susceptibility to ultraviolet
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角永武夫. 3T3株細胞を用いたトランスフオーメーシヨン.組織培養1979; 5: 405１
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IARC．Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to
1
０
Man: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, 1972２
０
１
２
Tats¥止a M, Mitsui H, Wada M, Nagata A, Nojima H, Okayama H. Elongation
皿
factor-1 alpha gene determines susceptibihty to transformation. Nature 1992; 359:
333-6.
Summary
Chikusaku-eki and Mokusaku-eki are
an acidic dark brown liquid obtained
from wood charcoal burners. Both of them, diluted by water,
as
a by-product
are used as a folk medicine for
skin diseases such as scabies, eczema, and at叩ic dermatitis. Here, the carcinogenic and tumorpromoting potentials of both folk remedies obtained from various makers were detem血ed bv
using the BALB/c 3T3 A31-1-1 in vitro transformation assay system・All of them tested here
were non-carcmogenic when applied at 0.1%. On the other hand, three of eight samples showed a
suppressive
effect
on tumor-promotion.
Thus,
Chikusaku-eki
and Mokusaku-eki are non-
carcinogenic or incidentally anti-carcinogenic in the in vitro transformation assay when diluted to
1/1,000.
図の説明
図1 . BALB/c 3T3細胞を標的とした試験管内発がん実験系の処理スケジュール。対数増殖期の
細胞を6 cm径のシャーレ10枚に10<個播種する。24時間後に培地交換と同時に発がんイニシエー
ター（本実験の場合は3-MCA、あるいは被験のための木酢液類）を添加し24時間処理する。コ
ントロール群は培地交換のみおこなう。その後、１週間に２回の培地交換をおこない、３０日目にシャー
レをメタノール固定しギムザ氏染色液で染色後、トランスフオーメーシヨンして生じたフォーカ
ス（1個の細胞を出発とする試験管内発がんで生じ、悪性転換したがん細胞の集団）を実体顕微
1４
生命環境学術誌第５号
鏡下で判定し、個数を計測してイニシエーション活性とする。プロモーション活性については、
同様に発がんイニシエーター処理した後、細胞播種後1週間目の培地交換の時に、発がんプロモー
ター（本実験の場合はTPA、あるいは被験のための木酢液類）を添加する。処理は播種後3週間
目まで培地交換のたびに持続的におこなう。その後、３０日目にシャーレをメタノール固定しギム
ザ氏染色液で染色後、トランスフォーメーションしたフォーカス数を計測する。平行して、
6 cm径のシャーレ3枚に100個、あるいは1000個の処理群も作成する。また、一般に発がんプロ
モーターは細胞傷害性では無いが（この場合も、実験で用いている濃度域においては、TPAや被
験のための木酢液類に細胞傷害効果は無いが)、発がんイニシエーターは一般に細胞傷害性を有
するので（本実験の場合も3-MCAには細胞傷害性効果がある)、トランスフオーメーション試験
と平行して、6 cm径のシャーレ3枚に100個、あるいは1000個の処理群も作成し、発がんイニシ
エーターを処理した後、１週間後に生じた生存細胞のコロニー数を計測し、発がんイニシエーター
の細胞傷害効果を計測する。この計測数は、生存細胞あたりのトランスフォーメーション頻度の
計算に利用される（詳細は文献3を参照のこと)。
BALB/c 3T3細胞を標的とした言握管内発がん実験系による各種富の発がんｾ獄験(岡本･福富･堀･津野･喜井･達家). 15
表１．木醗夜類のBALB/c 3T3A31-1-1細胞に対する発がんイニシエーシヨン効果
トランスフォーメーション頻度零
末処理群に対する
位10-4）
有意差検定(P)
処理群
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生命環境学術誌第５号
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表２．木酢液類のBALB/c 3T3A31-1-1細胞に対する発がんプロモーシヨン効果
トランスフォーメーション頻度＊
未処理群に対する
(xlO斗）
有意差検定(P)
処理譜
3-MCA
+TPA
４５ ０ 士
１６ ３
士
１ ７８
６ ３８
十
＋木酢液Ａ
４１ ０ 一
＋木酢液Ｂ
５１ ０
十
２ ２８
２ ３３
一
＋木酢液ｃ
２４ ０ 士
＋木酢液、
４８ ０ 士
十
２９ ０
一
＋木酢液Ｅ
＋竹酢液Ｆ
３６ ０ 士
２ ００
２ １５
１ ５２
１ ５１
士
＋竹酢液Ｇ
５４ ０
＋竹酢液Ｂ
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１ ６６
* 標準偏差(n=10)
**有意にプロモーション効果あり（発がん促進作用Ｉ
＊＊剣
有意差の有無
有意に抗プロモーション効果あり（発がん抑制作用）
０１２
７
３
０
日
］
2
コントロール群
↑
イニシエーション試験群
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
１
Ｉ
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
１
ロ
↑
プロモーション試験群
↑
0日目：細胞播種日
↑：培地交換臼
■：イニシエーター処理期間
Ｚ：プロモーター処理期間
口
置
は
舌
・
屋
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卵
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門
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国
師
該
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洲
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湯
が
醜
圃
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説
強
否
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叫
郷
霊
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誠
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