5章sspA遺 伝子破壊株の作製および表現型観察

5章sspA遺
伝 子破 壊株 の作 製 お よび表 現 型観 察
5.1序
これ ま で の 研 究 に よ りSspAの
発 現 条 件 や 細 胞 内 局 在 は 決 定 した 。しか し 、この 段 階
で は 機 能 の 一 端 を 明 らか に した に 過 ぎ な い 。そ こで 、sspA遺 伝 子 が 欠 損 す ることに よ り、
R. sphaeroidesの
生 体 内 で ど の ような 変 化 が 起 こる か を 明 らか に す る べ く、sspA遺
伝子
破 壊 株 の 作 製 を試 み ることに した 。
R. sphaeroidesに
お け る遺 伝 子 破 壊 法 として は 、大 腸 菌 の 形 質 転 換 で も用 い られ る
エ レ クトロポ レ ー シ ョン(Electroporation)法
い る(Scolnik
and Marrs,
1987)。
と接 合 伝 達(Conjugation)法
この うち 、機 器 も 不 要 で 遺 伝 子 導 入 確 率 の 高 い 接 合
伝 達 法 を 採 用 す る こ と に し た 。簡 単 に 概 要 を 述 べ る と 、E. coli
sphaeroidesの
が 知 られ て
繊 毛 を 通 じて プ ラス ミドDNAを
(S17-1)株
が
児
運 び 入 れ る性 質 を 利 用 す るこ とに よ り相
同 組 み 換 え を 起 こし て 、一 重 交 叉 株 と二 重 交 叉 株 を 作 製 、この うち 二 重 交 叉 株 を 薬 剤
耐 性 遺 伝 子 の 活 用 に よ りス クリー ニ ン グ して 欠 損 株 を 作 製 す る手 法 で あ る。
作 製 した破 壊 株 が どのような表 現型 を示 すか を明 らか にす るべ く、野 生 株 と比 較 解
析 す ることにより、SSpA遺 伝 子 が欠 損 した影 響 を観 察 す る事 を 目的 とした。具 体 的 に
は 下記 の6項
(1)生
目に注 目して表 現 型 観 察 を行 なった。
育 の 変 化(5.3.2参
照)
菌 体 を多様 な 条件 下 で培 養 す ることにより、どのような生 育変 化 が 起こるかを液 体培
養 とプ レー ト培 養 で観 察 した。このうち、塩 ストレスを 中心 としたストレス環 境 に対 する影
響 に注 目して比 較 解 析 を行 なった。
(2)光 学 顕 微 鏡 に よ る 菌 体 形 状 観 察(5.3.3参
照)
(3)電
照)
子 顕 微 鏡 に よ る菌 体 形 状 観 察(5.3.5参
NaClス
トレス条 件 下の 菌 体 の変 化 に注 目して顕 微鏡 観 察 を行 なった 。光 学顕 微 鏡
により菌 体 の 大 まか な構 造 と動 態 を観 察 し、電 子 顕 微 鏡 により膜構 造 を中心 とした詳
細 な菌 体 構 造 変 化 を観 察 した。
(4)野
生 株 とSSPA1の
フ ロ ー サ イ トメ ー タ(FCM)に
よ る 解 析(5.3.4参
照)
フロー サイトメー タは 、細 胞 の散 乱 光 と蛍 光 を検 出 す ることにより、細 胞 の相 対 的 な
大 きさ、内 部 構 造 な どの 情 報 を得 ることが 可 能 な装 置 である。この うち、前 方 散 乱 光
35
(FSC:
Forward
Scattered
Light)は
散 乱 光 の 中 で も レー ザ ー ビ ー ム の 光 軸 に 対 して 前
方 に 検 出 され る光 で 、細 胞 の 表 面 積 ま た は 大 きさ に ほ ぼ 比 例 す る。一 方 、側 方 散 乱 光
(SSC:
Side Scattered
Light)は
レ ー ザ ー ビ ー ム の 光 軸 に 対 して90℃
の角 度 で検 出さ
れ る 光 で 、そ の 大 部 分 が 細 胞 内 の 物 質 に 光 が 当 た っ て 散 乱 した も の で あ るこ とか ら 、
細 胞 の 顆 粒 性 状 、内 部 構 造 に ほ ぼ 比 例 す ることが 知 られ て い る(Fig.
イ トメー タ の 解 析 に よ り、棚
5-1)。
フ ロー サ
遺 伝 子 が 破 壊 され た 際 に 、ど の ような 細 胞 構 造 変 化 が 起
こっ た か を 類 推 す る ことが 可 能 で あ る 。
Fig. 5-1 Difference between FSC and SSC (image figure).
(5)野
生 株 とSSPA1の
sspA遺
タン パ ク質 レベ ル で の 比 較 解 析(5.3.6参
伝 子 が 欠 損 した とき に 、SspAが
照)
存 在 す る 外 膜 、さ らに は 細 胞 質 や ペ リプ ラズ
ム で ど の ような 変 化 が 起 こっ て い るか を 解 析 す る こ とに よ り、SspAの
機 能 が 明 らか に な
る 可 能 性 が 挙 げ られ る 。そ の た め 、タ ン パ ク質 発 現 レ ベ ル で 網 羅 的 な 解 析 が 可 能 で あ
る 二 次 元 電 気 泳 動(Two-dimensional
て 、野 生 株 とSSPA1の
electrophoresis)
(O'Farrel
et al., 1975)を
用い
発 現 量 変 化 を 捉 え ようと考 え た 。手 法 として は 、菌 体 破 砕 液 の う
ち 、水 溶 性 画 分 と外 膜 画 分 を 分 離 ・分 画 し 、そ れ ぞ れ を 分 け て 泳 動 す る ことに よ り比 較
解 析 す るこ とに した 。
二 次 元 電 気 泳 動 は 、タンパ ク質 の示 す 二種 類 の性 質 をもとに した二 段 階の 分 離 操
作 を行 なって 、タンパ ク質 を分 離 す る手 法 である。一 次 元 目の泳 動 で は等 電 点 電 気 泳
動(Isoelectric focusing: IEF)で は 、タンパ ク質 を等 電 点(pI)に
次 元 目の 泳 動 であるSDS-PAGEで
よって分 離 す る。二
はタンパ ク質の 分 子 量 によって分離 す る。現 在そ
の 改 良法 が次 々に 考案 され てお り、数 千 種 類 の タンパ ク質 を分 離 す ることも可能 であ
る。その ため 、質 量 分 析 計 とともに近 年 のプ ロテオミクス研 究 の基 本 技 術 として細 胞 分
化 の 解 析 、疾 病 マ ー カー の検 出 、新 薬 開発 など多方 面 で応 用 され てい る効 率 的 な手
法 である。
36
(6)野
生 株 とSSPA1の
適 合 溶 質 トレハ ロー ス の 定 量(5.3.8参
照)
塩 ストレス時 にお ける最 も顕 著 かつ 重 要 な応 答 に適 合 溶 質 の蓄積 が挙 げられ る。そ
の ため 、sspA遺 伝 子 の 欠 損 によって適 合 溶 質 の蓄 積 に どのような変 化 が生 じるかを知
ることは きわ めて重 要 であると考 え 、破 壊 株 にお ける適 合 溶 質 蓄 積 量 を調 べ ることとし
た。R.sphaeoridesはNaClス
トレス条件 下 で、二糖 類 であるトレハ ロースを主 要な適 合
溶 質 として 蓄 積 す ることに より耐 塩 応 答 して い ることが 確 認 され てい る(Xu
1998)。 そ のため 、本 研 究で はsspA遺
伝 子 を破 壊 したときの 菌 体 内 トレハ ロース蓄 積
量 の解 析 を試 み た。
5.2材
5.2.1菌
料 と方 法
株 と培 養 条 件
本 章 で 使 用 した 菌 株 とプ ラス ミドをTable
Table
et al.,
5-1に
5-1 Bacteria
37
示す。
and plasmids
used in this chapter
5.2.2sspA遺
5.2.2.1破
伝 子破 壊 株 の 作製
壊 株 作 製 用 プ ラス ミドの 調 製
本 章 にお ける遺 伝 子 工 学 的 手 法 は2章
R.
sphaeroidesの
ゲ ノ ムDNAを
と同様 に行 なった。
鋳 型
と し て 、forward
primer
(SSPAKS-f:
5'-ATAGTCGACGCCTGAGACCCCATGTTGGCGGC-3')とreverse
(SSPAKS-r:
primer
5'-ATTCCCGGGTCCGGTCCTCGATCTGCCGCGTC-3')を
と に よ りsspA遺
伝 子 の 上 流0.8kbpのDNA断
用 い るこ
片 をPCRに
を プ ラ ス ミド に ラ イ ゲ ー シ ョン す る た め に 、SalIとSmaIの
よ り伸 長 さ せ た 。DNA断
制 限 酵 素 認 識 部 位(下
プ ラ イ マ ー に 付 加 し た 。 電 気 泳 動 に よ り精 製 後 、同 じ くSalI-SmaIで
たKmr-suicide
vector
pJP 5603
(Penfold
et al., 1996)に
片
線)を
制 限 酵 素 処理 し
ラ イ ゲ ー シ ョン し てpRSSP001
を 取 得 した 。
一 方
の
、sspA遺
ゲ
伝 子 の 下 流1.6kbpのDNA断
ノ
片 を 、 同 じ く鋳 型 とし てR.
ムDNAとforward
primer
5'-TAACCCGGGTAACGAGAGCCGCGCGATCCGCA-3')お
(SSPAKS2-r:
PCRに
(SSPAKS2-f:
よ びreverse
primer
5'-TGTGAATTCTTGTGGATCTGGGGGTCCCCCGT-3')を
よ り伸 長 さ せ た 。DNA断
EcoRIの
sphaeroides
片 を プ ラ ス ミド に ラ イ ゲ ー シ ョン す る た め に 、SmaIと
制 限 酵 素 認 識 部 位(下
同 じ くSmaIとEcoRIで
用 い て
線)を
プ ライ マ ー に 付 加 した 。電 気 泳 動 で 精 製 後 、
制 限 酵 素 処 理 し たpRSSP001に
ラ イ ゲ ー シ ョン し てpRSSP002
を 取 得 した 。
最 後 に 薬 剤 耐 性 を 有 す る ΩSmr/SpcrcassetteをpRSSP002お
Iで
よ びcassette共
にSma
制 限 酵 素 処 理 し た 後 、ラ イ ゲ ー シ ョン す る こ と に よ っ て 組 み 換 え 用 プ ラ ス ミドで あ る
pRSSP002Ω
を 取 得 し た(Fig.
lysogenized
with
λpir株
5-2)。
こ こ ま で の プ ラ ス ミド調 製 は 全 てE.
を 使 用 して 行 な っ た 。
38
coli JM109
Genomic
Fig. 5-2
Construction
scheme
DNA
of R.sphaeroides
of pRSSP002
Ω,
cells.
39
which
is transferred
into
R. sphaeroides
5.2.2.2接
合 伝 達(Conjugation)法
に よ る相 同 組 み 換 え
作 製 した 組 み 換 え 用 プ ラス ミドはE.coliS17-1
al.,1990)に
lysogenized
保 持 させ た 後 、同 株 とR.sphaeroidesをLBプ
ことに よ り、R.sphaeroidesの
with λpir(De Lorenzo
レ ー ト上 で 固 相 接 合 させ る
細 胞 内 に 導 入 した 。 この うち 、Spcr,Kmsで
ある二 重 交 叉
株 が 目 的 の 遺 伝 子 破 壊 株 で あ る 可 能 性 が 高 い た め 、単 離 後 に ゲ ノムDNAを
ORFの
周 辺 をDNAシ
ー ケ ン サ に よる 配 列 を 読 む ことに よ りsspA遺
した 。同 時 に 野 生 株 と同 株 をNaClス
et
抽 出 し、
伝 子 の 欠 損 を確 認
トレス 条 件 下 で 培 養 し、菌 体 破 砕 後 、SspA抗
よ る ウェス タン 解 析 を 行 な い 、タ ンパ ク質 レベ ル で もSspAは
体 に
誘 導 合 成 して い な い ことを
確 認 した 。
5.2.3菌
体 の培 養
SspA遺 伝 子 が欠損 した影 響 を確 認 す るべ く、野 生株 とSSPA1(sspA遺
伝 子破 壊 株)
を液 体 培 養 、お よび プ レー ト培 養 す ることにより、生 育 の違 い を観 察 した。培 養 条件 は
嫌 気 光合 成 条 件 と好 気 暗 条件 の 両方 で行 なった。プ レー トにお ける嫌 気 光 合 成 培 養
はGas-Pak(Becton
Dickinson)を 使 用 して、完 全 に嫌 気 が保 たれる状 態 とした。液 体
培 養 で 生 育 変 化 を観 察 す る際 に、菌 体 のOD660測
定 によって確 認 す る方 法 と重 量 測
定 によって確 認 する方 法 の 二 つ が 考 えられ るが 、い ず れ にお いても違 い が見 られ なか
ったため 、OD660測 定 による結 果 のみ を示 す 。
5.2.4光
学 顕 微 鏡 に よ る観 察
光 学 顕 微 鏡 を 用 い た 菌 体 の 形 状 観 察 に は 下 記 の 装 置 を 使 用 した 。光 学 顕 微 鏡 とし
てOlympus
BX52(OLYMPUS)を
(OLYMPUS)を
contrast;
、対 物 レ ン ズ はUplanApo
100x
使 用 し て 観 察 した 。画 像 は 全 て 微 分 干 渉(differential
DIC)モ
ー ドで 取 り込 ん だ 。菌 体 は 培 養 開 始96h後
objective
lens
interference
の 静 止 期 の もの を 観 察
した 。
5.2.5フ
ロ ー サ イ トメ ー タ(FCM)に
FACSCalibur(Becton
よ る解 析
Dickinson)を
用 い て 解 析 した 。菌 体 は 塩 ス トレス(4%NaCl)
を 誘 導 し て 静 止 期 ま で 培 養 させ た も の を 、前 処 理 等 を 行 な わ ず そ の ま ま 測 定 し た 。
FSCに
お け る 電 圧 は 信 号 を10倍
に して 出 力 す るEO1で
した 。デ ー タ の 収 集 、解 析 に はCellQuestを
使 用 した 。
40
行 い 、細 胞 数 は5,000で
解析
5.2.6電
子 顕 微 鏡 に よ る観 察
5.2.6.1菌
体 サ ンプ ル の 固 定
電 子 顕 微 鏡 に よる観 察 は 塩 ス トレス を か け た も の の み 解 析 した 。NaClス
NaCl濃
度2%)を
地
か け た 状 態 で 、嫌 気 光 合 成 条 件 ま た は 好 気 条 件 で 静 止 期 ま で 培 養
した 菌 体 を 、4℃ 、18,500xg、5min遠
[Phosphate
トレス(培
Buffer Powder
(Wako)
心 して 集 菌 した 菌 体 を1/15MPhosphateBu伍er
in 1L
MilliQ water](PB),
pH7.4で
洗 浄 し て 、培
地 成 分 を 完 全 に 除 い た もの を 使 用 した 。菌 体 は 使 用 す る まで ー80℃ に 保 存 した 。
菌 体 サ ン プ ル を グ ル タル ア ル デ ヒド溶 液(3%グ
浸 して4℃
体 をPBで
、2h振
ル タル ア ル デ ヒドin
1/15MPB)に
とうして 初 期 固 定 した 。溶 液 を デ カ ン テ ー シ ョン に よ り除 い た 後 、菌
洗 浄 後 、再 度PBを
加 え て4℃
、1h振
とうす ることに よ りグ ル タル ア ル デ ヒド
を 除 去 した 。溶 液 を 捨 て て 、PBで 洗 浄 後 、新 た なPBを
加 え て4℃
、1h振
溶 液 を デ カ ン テ ー シ ョン に よ り除 い た 後 、1% OsO4溶
液 を 加 え て4℃
溶 液 を デ カ ン テ ー シ ョン に よ り除 い た 後 、10% sucrose
in PBで
とうした 。
、1h振
とうした 。
洗 浄 後 、室 温 、3min計
3回 振 とうした 。膜 の 染 色 を 向 上 させ る た め に 、溶 液 を デ カ ン テ ー シ ョン に よ り除 い た 後 、
3%飽
和 酢 酸 ウ ラン 溶 液 を 加 え て 室 温 、30min振
5.2.6.2菌
とうした 。
体 サ ンプ ル の 脱 水
固 定 した 菌 体 サ ン プ ル の 溶 液 を デ カ ン テ ー シ ョン に よ り除 去 して 、70%エ
2mlを
加 え て4℃ 、5min振
タノー ル を2ml加
て 、90%エ
え て4℃
タノー ル を2ml加
み 回 収 して 、95%エ
タ ノー ル を
とうした 。デ カ ン テ ー シ ョン に よ り菌 体 の み 回 収 して 、80%エ
、5min振
とうした 。デ カ ン テ ー シ ョン に よ り菌 体 の み 回 収 し
え て4℃ 、5min振
タ ノー ル を2ml加
より菌 体 の み 回 収 して 、100%エ
とうした 。デ カ ン テ ー シ ョン に よ り菌 体 の
え て4℃
タノー ル を2ml加
、5min振
とうした 。デ カ ン テ ー シ ョン に
え て4℃
、15min振
とうした(計2
回)。
5.2.6.3菌
体 サ ンプ ル の 樹 脂 へ の 包 埋
サ ン プ ル と樹 脂 を な じま せ る た め に 、プ ロピ レ ン オ キ サ イ ドを1サ
ず つ 加 え 、室 温 、5min計2回
Quetol-812(エ
(硬 化 剤;日
ポ ン 樹 脂;日
ン プ ル あ た り2ml
振 とうした 。デ カ ン テ ー シ ョン に よ り菌 体 の み 回 収 して
新EM)19.4ml、DDSA(硬
新EM)11ml、DMP-30(加
速 剤;日
化 剤;日
新EM)0.6mlを
新EM)9.6ml,
MNA
混 合 した エ ポ ン 樹 脂
混 合 液 を 加 え て 、ス ター ラ ー で よく攪 拌 した 。エ ポ ン 樹 脂 混 合 液 とプ ロピ レン オ キ サ イ ド
を1:1と
な るよ うに 希 釈 した 溶 液 を 作 製 し、1サ ン プ ル あ た り2mlず
41
つ 加 え て 室 温 、一
晩 静 置 した 。エ ポ ン 樹 脂 混 合 液 を1サ
ン プ ル あ た り2mlず
つ 加 え て 室 温 、1h静
置し
た。
サ ン プ ル を 樹 脂 固 定 用 容 器 に 移 し 、45℃ 、12h静
45℃ 、12h静
置 した 後 、60℃ 、24h、 さら に は
置 す るこ とに よ り樹 脂 を 完 全 に 硬 化 した 。
この 後 の超 薄 切 片 の調 製 ・
電 子 顕 微 鏡 観 察 の操 作 は3章 で述 べ た方 法 と同様 に行
なった.
5.2.7二
次 元 電 気 泳 動 に よる解 析
5.2.7.1サ
ンプ ル 調 製
二 次 元 電 気 泳 動 に よ る 解 析 に は 塩 ス トレ ス を か け た 菌 体 サ ン プ ル の み を 使 用 し た 。
NaClス
トレ ス(培
地NaCl濃
度2%)を
で 静 止 期 ま で 培 養 し た 菌 体 を4℃
Phosphate
Buffer[Phosphate
か け た 状 態 で 、嫌 気 光 合 成 条 件 ま た は 好 気 条 件
、18,500xg、5min遠
Buffer
Powder
(Wako)
心 し て 集 菌 した 菌 体 を1/15M
in 1L
MilliQ
water](PB),
pH7.4
で 洗 浄 し て 、培 地 成 分 を 完 全 に 除 い た も の を 使 用 し た 。菌 体 は 使 用 す る ま で-80℃
に
保 存 し た 。外 膜 画 分 は 、4章 で 行 な っ た シ ョ糖 密 度 勾 配 法 に よ り調 製 した 。超 遠 心 後 の
溶 液 の う ち 、 外 膜 タ ン パ ク 質 を 主 に 含 ん で い る 下 層 の2mlを2-D
(Amersham
Biosciences)を
Thiourea,
4%w/v
用 い て 濃 縮 し た 後 、Rehydration
Dithiothreitol]100μlを
CHAPS,
0.5%
IPG
Buffer
solution[7M
pH4-7(Amersham
Urea,
Biosciences)
kit
2M
, 40mM
加 え て 完 全 に 可 溶 化 し て 、電 気 泳 動 サ ン プ ル とし た 。
水 溶 性 画 分 に つ い て は 、4章 で 分 画 した 水 溶 性 画 分 約10mlア
より濃 縮 した 。操 作 として は 、画 分 に3倍
使 用)を
Clean-Up
量(30ml)の
添 加 して 、軽 く攪 拌 後 、-20℃ で2h放
セ トン 沈 殿 の 操 作 に
冷 ア セ トン(-20℃
に冷 却 後 に
置 した 。これ を2,680xg、4℃
、5min
遠 心 し た 後 、沈 殿 を 室 温 で 風 乾 し た 。沈 殿 が 完 全 に 乾 燥 す る 前 にRehydration
solution 500μlを
5.2.7.2一
加 え て 完 全 に 可 溶 化 し て 、電 気 泳 動 用 サ ン プ ル とした 。
次 元 目等 電 点 電 気 泳 動
一 次 元 目 の 分 離 シ ス テ ム としてIPGphor
ス トリップ ホ ル ダ ー 、及 びImmobiline
ゲ ル のpHレ
ン ジ がpH3-10の
(Amersham
DryStrip gel(pH
Bioscienc
es)を 使 用 した 。IPG
4-7)は11cmの
もの も検 討 した が(data
not shown)、
も の を 使 用 した 。
分 離 が不 充 分 で
あ っ た こと、酸 性 側 に タン パ ク質 が 集 中 して い た ことに よ り、レン ジ は 常 にpH4-7の
の を 使 用 した 。サ ン プ ル はBradfbrd法
る 場 合 に は 総 タン パ ク量 が40μg、
も
に よ りタ ンパ ク 質 濃 度 測 定 を 行 な い 、銀 染 色 す
クマ シ ー 染 色 す る 場 合 は500μgと
製 して 添 力口した 。泳 動 条 件 は 、ゲ ル 膨 潤 を20℃
42
、12h行
な る ように 調
な っ た 後 、500Vを1h、
1,000Vを1h、
SDS-PAGEを
5.2.7.3二
8,000Vを1h
50minで
行 な うま で-80℃
に 保 存 した 。
次 元 目SDS-PAGE
-80℃ に保 存 していたゲル にSDS平
8.8), 6M
blue]を
行 な っ た 。電 気 泳 動 後 の ゲ ル は 二 次 元 目
衡 化 用バ
[50mM Tris-HCI(pH
a trace amount of Bromophenol
Urea, 30%(v/v)Glycerol, 2%(w/v)SDS,
加 え て 室 温 で15min振
とうして 平 衡 化 した 。
平 衡 化 し た ゲ ル を 二 次 元 目 ゲ ル(14.5%,
ー ス 溶 液(0
ル1枚
ッフ ァ ー10ml
.5% agarose,
a trace
当 た り定 電 流40mAで
気 泳 動 装 置NA1119(Nihon
5.2.7.4ゲ
amount
13cmx
13cm)の
of Bromophenol
上 面 に 置 い て 、ア ガ ロ
blue)で
泳 動 し た 。電 気 泳 動 装 置 は4連
Eido)を
封 入 固 定 し た 後 、ゲ
式 冷 却 型 スラ ブ ゲ ル 電
使 用 した 。
ル ・メ ン ブ レ ン の 染 色
銀 染 色 は2D-銀
染 色 試 薬 ・II「第 一 」(Daiichikagaku)を
染 色 は 、泳 動 の 後 の ゲ ル をSemidry
et aｌ, 1988)に
よ り、Immobilon-P
色 し た 。各 サ ン プ ル は 最 低5連
blotting
Transfer
system
用 い て 染 色 し た 。ク マ シ ー
NA-1512(Nihon
Eido)(LeGendre
Membrane(Millipore)に
転 写 した もの を 染
で 比 較 解 析 を 行 な い 、 目 視 し て 顕 著 に 差 異 が 認 め られ
た ス ポ ッ トの み 、シ ー ケ ン サ に よ り同 定 を 行 な っ た 。
5.2.7.5タ
ン パ ク質 の 同 定
誘 導 合 成 量 の 増 減 が 見 られ た タン パ ク質 は 、クマ シ ー 染 色 したMembraneを
り、Edmann分
に よ りN末
解 法 を 原 理 とした 気 相 シ ー ケ ン サProcise
cLC(Applied
端 を 決 定 した 。各 ス ポ ットの 同 定 ・
解 析 は 、得 られ たN末
ノ ム 情 報 が 公 開 さ れ て い るR.sphaeroides
(hLtp://mmg.uth.tmc.edu/sphaeroides/)
(http://www。ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
2.4.1の
切 り取
Biosystems)
端 配 列 を 元 に 、ゲ
推 定 ア ミノ 酸 配 列
、BLAST
に よ る ア ミノ 酸 配 列 の 相 同 性 、SignalP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SigllalP-2.0/)
によるシグナル 配列 解析 を利 用す
る ことに よる 、全 ア ミノ酸 配 列 、細 胞 内 局 在 、機 能 を 推 測 した 。
5.2.8菌
体 内 トレ ハ ロ ー ス 量 測 定
本 実 験 にお けるR.sphaeroidesの
NaClに
培 養 条件 に関 しては 、5朗
遺 伝 子 を破 壊 しても
対す る生 育 変 化 が 見 られ なか った嫌 気 光 合 成 条件 では培 地NaCl濃
43
度 を4%
(0.68M)、NaClス
トレ ス に よ り生 育 が 大 きく阻 害 され た 好 気 暗 条 件 で は 培 地NaCl濃
を2%(0.34M)と
して 、菌 体 が 充 分 な 量 回 収 で きる 条 件 で ス トレス を 誘 導 した 。
ま た 、通 常 の 培 養 の 際 に 添 加 して い るYeast
して い る 。そ の た め 、R.sphaeroidesは
extractは
度
成 分 中 に トレハ ロー ス を 含 有
培 地 成 分 に 含 ま れ るを トレハ ロー ス を 生 体 内 に
取 り込 ん で 適 合 溶 質 として 利 用 す る ことも 可 能 で あ る。本 実 験 で は 生 体 内 で 生 合 成 し
た トレ ハ ロ ー ス 量 の 違 い を 確 認 す る ことを 目 的 として い るた め 、今 回 測 定 した 菌 体 サ ン
プ ル は 全 て 培 地 中 にYeast
一方
extractを 添 加 せ ず に 培 養 した 。
、菌 体湿 重 量1gあ
た りに添加 す る抽 出溶 媒 量(80%ア
セ トニ トリル)を 一 定 に
して菌 体 内 トレハ ロー スを抽 出 した。二糖 類 であるトレハ ロースは特 徴 的 な紫 外 吸 収 波
長 を持 たないため 、HPLCに
よる検 出 には光 学示 差屈 折 計 を使 用 した。以 上 の培 養 、
測 定 条件 を考 慮 した実 験 条 件 は 下記 の通 りである。
NaClス
トレ ス 条 件 下 で 培 養 した 静 止 期 の 菌 体 を4℃
菌 し た 後 、菌 体1gあ
た り80%ア
(IKA)で60W、30s超
min遠
音 波 破 砕 し て 、100℃
か け た も の をHPLC測
用 カ ラ ムShodex
10mm)を
SUGAR
、5min加
熱 し た 後 、4℃ 、18,500xg、20
ラ ム(6mmx
直 列 に 連 結 し て 、溶 媒 の80%ア
た 。サ ン プ ル 量 は 常 に10μlを
monitor(JASCO)を
ィル タ ー(Minisart-RC4;
定 用 サ ン プ ル とし た 。HPLCに
SZ5532カ
心 して 集
加 え て 懸 濁 し た 。Ultrasonicator
心 し て タ ン パ ク 質 を 除 去 し た 。 上 清 を0.20μmフ
Sartorius)に
mmx
セ トニ トリル5mlを
、18,500xg、5min遠
150mm)、
よる測 定 は 糖 分 析
ガ ー ドカ ラ ムSZ-G(4.6
セ トニ トリル を 流 速1ml/minで
注 入 し 、検 出 は 示 唆 屈 折 計RI
830
分 析 し
refractive
index
使 用 した 。
実 サ ン プ ル を 測 定 す る前 に 、市 販 の トレハ ロ ー ス 二 水 和 物(Wako)をMilliQ水
溶 解 させ た も の を 用 い て 、1mM∼50mMの
に
範 囲 で トレハ ロー ス 測 定 用 検 量 線 を 作 成 し
た。
5.3結
果
5.3.1 sspa遺
SspAは
伝子破壊株の作製
ア ミノ酸 配 列 中 の ど の 部 位 に 機 能 を 有 し て い る の か 分 か ら な い の で 、sspA
遺 伝 子 を 完 全 に 抜 い た 後 、ΩSmr/Spcr
形 の 破 壊 株 を 作 製 し た(Fig.
保 持 さ せ た 後 、同 株 とR.
こ とに よ り、R. sphaeroidesの
et al., 1996)で
組 み換 えた
5-3)。
作 製 し た 組 み 換 え 用 プ ラ ス ミド はE.
al., 1990)に
cassette(Penibld
coliS17-1
lysogenized
sphaeroidesをLBプ
with λpir(De
Lorenzo
レ ー ト上 で 固 相 接 合 さ せ る
細 胞 内 に 導 入 し た 。 こ の うち 、Spcr, KmSで
ある二 重 交 叉
株 が 、 目 的 で あ る 遺 伝 子 破 壊 株 で あ る 可 能 性 が 高 い た め 、単 離 後 に ゲ ノムDNAを
44
et
抽
出 し 、ORFの
周 辺 をDNAシ
ー ケ ン サ に よる 配 列 を 読 む ことに よりsspA遺
を 確 認 した 。同 時 に 野 生 株 と同 株 をNaClス
伝 子 の欠 損
トレ ス 条 件 下 で 培 養 し、菌 体 破 砕 後 、SspA
抗 体 に よる ウ ェ スタ ン 解 析 の 結 果 、野 生 株 に はSspAの
バ ン ドが 検 出 され た もの の 、欠
損 株 で は バ ン ドが 検 出 され な か っ た の で 、遺 伝 子 レ ベ ル だ け で な く、タン パ ク質 レ ベ ル
で もsspAは
誘 導 合 成 し て い な い ことが 確 認 され た(Fig.
5-4)。 この 株 をSSPA1株
とし
た。
Hypothetical
Hypothetical
Transcriptional
Hypothetical
N-utilization
6,7-dimethyl-8-
protein
protein
regulator
protein
substance
protein
ribityllumazine
synthase
Fig.
5-3
Physical
ΩSmr/Spcr
and
cartridge
genetic
map of R. sphaeroides
strains.
sonicated
protein
Cells
of
SSPA1
blot analysis of cell lysates from wild type and sspA-deleted
were
in NP-lysis
(10μg)
Insertion
is indicated.
wild-type
Fig. 5-4 Western
sspA regions.
was
cultured
anaerobic
buffer,
loaded
into
condition
and separated
each
lane.
45
in the
by SDS-PAGE.
NaCl-containing
The
SSPA1
media,
same amount
of
5.3.2野
生 株 とSSPA1の
sspA遺
生 育 の比 較 解 析
伝 子 が 欠損 した影 響 を明 らか にす るべく、野 生株 とSSPA1(sspA遺
伝子破
壊 株)を 液 体 培 養 、お よび プ レー ト培 養 す ることにより、生 育 の違 いを観 察 した。培 養
条 件 は嫌 気 光 合 成 条件 と好 気 暗 条 件 で行 なった。プレー トにお ける嫌 気 光 合 成 培 養
はGas-Pak(Becton
Dickinson)を 使 用 して、完 全 に嫌 気 が保 たれる状 態 とした。液 体
培 養 で 生 育 変化 を観 察 す る際 に 、菌 体 のOD測
定 によって確認 す る方 法 と重 量 測 定
によって確 認 す る方 法 の 二 つ が 考 えられ るが 、い ず れ にお いても違 いが 見 られなか っ
たため 、OD測
定 による結 果 の み を示 す 。
そ の 結 果 、嫌 気 光 合 成 条 件 で は 野 生 株 とSSPA1(sspA遺
は 見 られ な か っ た(Fig.
5-5)。
添 加 した 時 の みSSPA1は
伝 子 破 壊 株)の
間 に違 い
一 方 、プ レ ー ト培 養 に 関 して は 、塩 ス トレス(NaCl)を
野 生 株 に 比 べ て 若 干 生 育 が 抑 制 され て い るこ とが 見 出 され
た(Fig.5-7A)。
さら に 、好 気 暗 条 件 に お い て は 、両 者 の 間 に 大 きな 生 育 の 違 い が 観 察 され た 。ス ト
レス の か か っ て い な い 通 常 培 地 に お い て も 、SSPA1は
大 菌 体 濁 度 が 約1.0ま
で きな か っ た(Fig.
れ た(Fig.
生 育 が 抑 制 され た 。野 生 株 は 最
で 到 達 す るの に 対 して 、SSPA1は
5-6A)。
で しか 到 達
様 々 な ス トレ ス を か け た 時 に そ の 違 い は さらに 顕 著 に 現 わ
5-6)。Sorbitolを
養 した 酸 性 ス トレ ス(data
最 大 で も 約0.7ま
用 い た 浸 透 圧 ス トレス(Fig.
not shown)に
5-6B)、pHを6.0条
お い て は 、SSPA1は
件 で培
生 育 が し ば らく抑 制 され
た 後 生 育 を 開 始 して 、最 終 的 に 野 生 株 と同 じ最 大 菌 体 濁 度 に 到 達 す る現 象 が 観 察 さ
れ た 。さ ら に 、決 定 的 な 違 い は 塩 ス トレ ス 条 件 下 で 生 育 させ た 時 に 現 わ れ た 。SSPA1
はNaClやKCIを0.68M(4%)添
(Fig. 5-6C,
加 した 培 地 で は 全 く生 育 す るこ とが で き な くな っ た
D)。 そ の た め 、ssPA1が
す る べ く、培 地NaCl濃
どの 程 度 の 塩 耐 性 を 有 して い る の か を 明 らか に
度 を低 下 させ て い っ た 結 果 、0.34M(2%)に
な って 初 め て生 育
が 可 能 に な っ た 。ま た 、好 気 に お け るす べ て の 液 体 培 養 条 件 下 で 、培 養 開 始6h程
度
か ら 肉 眼 で も 観 察 で き る菌 体 の 凝 集 が 観 察 され た 。プ レ ー ト培 養 に お い て は 野 生 株 、
SSPA1共
に 液 体 培 養 よ りも塩 耐 能 が 低 か っ た が 、培 地NaCl濃
い て 野 生 株 は 生 育 で きた も の の 、SSPA1は
度 が0.34M(2%)に
お
コ ロニ ー を 形 成 す る ことが で き な か っ た 。こ
の 事 か ら 、プ レ ー ト培 養 に お い て も塩 耐 性 が 低 下 して い る ことが 明 らか に な っ た(Fig.
5-7B)。3章
に お い て 、SspAは
塩 ス トレス 条 件 下 で 特 異 的 に 誘 導 合 成 され ることを 明 ら
か に した 。この 結 果 を 合 わ せ て 考 え ると、本 菌 は 塩 ス トレス 耐 性 を 高 め る た め にSspAを
誘 導 合 成 し 、そ れ に よ っ て 耐 塩 性 を 獲 得 して い る と考 え られ る。
46
Fig. 5-5 Growth profiles of wild-type
and sspA-deleted
SSPA1 under anaerobic
photosynthesis conditions. Wild-type and SSPA1 in the control condition (A), in the
sorbitol-containing media (B), in the NaCl-containing media (C), wild-type in the
KCl-containing media (D).
47
Fig. 5-6 Growth profiles of wild-type and sspA-deleted
conditions.
Wild-type
sorbitol-containing
and
SSPA1
in
the
control
media (B), in the NaCl-containing
KCl-containing media (D).
48
SSPA1 under aerobic dark
condition
(A),
in
the
media (C), wild-type in the
Fig. 5-7 Phenotypic change of the R. sphaeroides SSPA1 strain on plate culture under
salt-stressed
(with addition of 2% NaCI) anaerobic photosynthesis
condition (A), and
aerobic dark condition (B).
5.3.3
野 生 株 とSSPA1の
光 学 顕 微 鏡 に よる観 察
好 気 条 件 にお ける生 育の 比較 解 析 の 結 果 、SSPA1は
いず れ の条 件 にお いても、野
生株 に比 べ て 菌体 が集 まって浮遊 している様 子 が肉 眼 でも観 察 できた。特 にNaC1ス ト
レス条 件 下で は 、凝 集 がより顕 著 にな り沈 殿 する菌 体 も観 察 され た(Fig .5-8A)。 これ
は 菌 体 に何 らか の形 状 変 化 が起 こっているので はな いか と考 え、まず は 光学 顕 微鏡
で形 状 変 化 を観 察 することにした。
そ の 結 果 、野 生 株 で は 通 常 条 件 で も 、塩 ス トレス 条 件 下 で も 菌 体 の 凝 集 体 は 観 察 さ
れ な か っ た(Fige5-8B)。
shown)、
一 方 、SSPA1株
は 嫌 気 光 合 成 条 件 に お い て も(data
好 気 暗 条 件 に お い て も(Fig,5-8B)、10-20程
not
度 の 菌 体 が 凝 集 体 を形 成 し
て い る 様 子 が 観 察 され た 。さら に 菌 体 の 生 育 が 大 き く抑 制 され た 好 気 塩 ス トレス 条 件
(0,68MNaCl添
(Fig.5-8B)。
加)で
は 、無 数 の 菌 体 が 凝 集 体 を 形 成 して い る 現 象 が 観 察 され た
形 成 され た 凝 集 体 を 通 常 培 地 に 戻 す と、速 や か に 破 壊 株 を 通 常 培 地 に
培 養 した 時 と同 レベ ル のOD660が0.7程
度 ま で 上 昇 した 。また 、凝 集 体 の 外 側 の 菌 体
を は じめ 多 数 の 菌 体 は 動 い て い た た め 、菌 体 が 完 全 に 死 ぬ こ とに よっ て 形 成 され た 凝
集 で は な い こ とが 推 測 され た 。培 養 試 験 管 の 形 状 や 振 とう角 度(垂
直 ・水 平)、 振 とう
速 度 を 変 化 さ せ て も 同 様 の 現 象 が 観 察 され た 。この 凝 集 は 手 や ボ ル テ ックス ミキ サ ー
に よ る振 とうで 容 易 に 拡 散 し 、し ば らく培 養 を 継 続 す る と再 度 凝 集 を 生 じる レベ ル の 弱
い 結 び つ きに よ るもの で あ っ た 。
49
Fig. 5-8 Wild-type and SSPA1 strains cultured under aerobic dark conditions. (A) A
stationary-phase
culture of wild type and SSPA1 under indicated conditions. (B) Wild
type and SSPA1 strains were grown under aerobic condition in the normal (left) and
NaCI-containing media (right). Cells were observed at an early-exponential
arrows
5.3.4野
indicate
cell'
s precipitation
生 株 とSSPA1の
SSPA1が
formed
by their
フ ロ ー サ イ トメ ー タ(FCM)に
cohesion.
phase. Red
Bars,10μm.
よ る解 析
形 成 す る凝 集 体 は 菌 体の形 状 変化 によるもので はないかと考 え、フロー サ
イトメー タによって嫌 気 光 合 成 、好 気 暗 条件 の 両条 件 下で 、菌 体形 状 の変 化 を観 察 し
た。
解 析 の 結 果 、嫌 気 光 合 成 条 件 下 で は 塩 ス トレ スの 有 無 に 関 わ らず 、野 生 株 とSSPA1
の 間 に 変 化 は 見 られ な か っ た(data
not shown)。
一 方 、好 気 暗 条 件 の サ ン プ ル に 関
して は 、塩 ス トレ ス の 有 無 に か か わ らず 、野 生 株 とSSPA1の
50
間 で 細 胞 の 表 面 積 また は
大 きさ に ほ ぼ 比 例 す る 前 方 散 乱 光(FSC)の
形 状 に 変 化 は 見 られ な か っ た(Fig.5-9
A, B)。 一 方 、細 胞 の 顆 粒 性 状 、内 部 構 造 に ほ ぼ 比 例 す る側 方 散 乱 光(SSC)に
て 野 生 株 と比 べ て 、SSPA1で
の こ とか ら、SSPA1は
減 少 して い ることが 明 らか に な っ た(Fige5-9C,
関し
D)。 こ
野 生 株 に 比 べ て 内 部 構 造 が 希 薄 に な っ て い る ことが 示 唆 され
た。
Fig. 5-9 Differential analysis of FSC (propotional to cell size) and SSC (propotional to
intracellular compositions) between wild-type (Blue line) and SSPAI strain (Red line)
under salt-stressed
(4% NaC1) anaerobic photosynthesis
and under salt-stressed
condition (A; FSC, C; SSC)
(4% NaC1) anaerobic photosynthesis
SSC) by flow cytometry.
51
condition (B; FSC, D;
5.3.5野
生 株 とSSPA1の
電 子 顕 微 鏡 に よ る観 察
光 学 顕 微 鏡 による観 察 によって、SSPA1に
は何 らか の形状 ・
形 態 変 化 が起 こってい
ることが予 測 され た。さらに詳 細 に菌 体 の 形 状 を観 察 す るべ く、電 子 顕 微 鏡 を用 い て
その 変 化 を捉 えることにした。その 際 に 、SspAが
局 在 している外 膜 を中 心 とした膜 構
造 にどのような影 響 が及 ん できるのか を中心 に解 析 した。そのた め 、膜 構 造 が鮮 明 に
確 認 できるOsO4に
より菌 体 を固 定 して観 察 した。
第 一 に 、野 生 株 に お い て 嫌 気 光 合 成 条 件 と好 気 暗 条 件 の 間 の 菌 体 構 造 変 化 を 観
察 した 。R.sphaeroidesを
嫌 気 条 件 で 培 養 す ると、内 膜 の 構 造 が 大 きく変 化 して 、胞 状
の 細 胞 質 内 膜(Intracytoplasmic
(Zeilstra-ryalls et al., 1998;Chory
membrane;ICM)が
et al.,1984)。
形 成 され る こ とが 知 られ て い る
今 回 の 結 果 に お い て も小 型 の 胞 状
体 で あ る 細 胞 質 内 膜 が 多 数 見 出 され た(Fig.5-10A,B)。
ま た 、い ず れ の 条 件 に お い
て も 、一 部 に 大 き な 胞 状 体 が 観 察 され る が 、これ は 代 謝 の 中 間 体 で あ るポ リヒドロキ シ
酪 酸 を 含 む 構 造 体 で あ る と考 え られ る。両 条 件 を 比 較 す る と好 気 暗 条 件 の 方 で よ り大
型 の 胞 状 体 が 形 成 され て い るこ とが 観 察 され た 。
次 に野 生株 とSSPA1の
間 の菌 体 構 造 変 化 を比 較 した。嫌 気 光 合 成 条件 にお いても、
好 気 暗 条 件 にお い ても、共 通 して胞 状 体 が 少 なくな ってい ることが 明 らか になった
(Fig.5-10,5-11)。
しか し、細 胞 構 造 、特 に注 目していた膜 構 造 の変 化 は観 察され な
かった。一 方 、両培 養 条件 にお けるSSPA1問
の違 い は 、嫌 気 光 合成 条件 にお いて 、
膜 周 辺 に電 子 密 度 の 高 い部 分 が複 数 形 成 されて いることである(Fig.5-10D)。
野生
株 に見 られ たような胞 状 体 のサイズ変 化 といった現 象 は観 察 されなかった.
以 上 の観 察 結 果 より、sspAの 欠損 により菌 体 内の胞 状 体 が減 少 す る、つ まり内部構
造 に何 らか の変 化 が 起きていることが示 唆 され た。
52
Fig.5-10
Electron micrographs of a thin section of wild-type(A,B)and
(sspA-deletion
mutant)(C,D)grown
SSPA1
under anaerobic photosynthesis salt-stressed(2%
NaCl in culture medium)conditions.Red
arrow indicate vesicle structures
bepoly-β-hydroxibutyrate.Barsindicate
0 .5
supposed to
μm.OM;Outermembrane,IM;Inner
membrane
Fig.5-11
Electron micrographs of a thin section of wild-type(A,B)and
(sspA-deletion
mutant)(C,D)grown
culture medium)conditions.Red
poly-β-hydroxybutyrate.Bars
under aerobic dark salt-stressed(2%
arrows indicate vesicle structures
indicate
0.5
membrane
53
μm.OM;Outer
SSPA1
NaCl in
supposed to be
membrane,IM;Inner
5.3.6野
生 株 とSSPA1の
野 生株 とSSPA1の
二 次 元 電 気 泳 動 に よるタ ン パ ク質 レベ ル で の 比 較 解 析
間 にお い て、タンパ ク質発 現 レベ ル でどのような変 化 が起 こって
い るのかを明 らか にしようと考 えた。菌 体破 砕 液 のうち 、外 膜 画 分 と水 溶 性 画 分 を二 次
元 電 気 泳 動 で分 離 す ることにより、発 現 タンパ ク質 の 変 化 を比 較 解 析 した。外 膜 画 分
に関 しては 、SspAが 外 膜 に局 在 す る事 か ら、sspA遺 伝 子 の欠 損 によって、他 の外 膜
タンパ ク質 に何 らか の影 響 が及 ん でい るので はない か と考 えて解 析 を試 み た。一 方 、
水 溶 性 画 分 は 主 に細 胞 質 とペ リプラズムの タンパ ク質 を多 く含 む ため 、生 育 に関 連 す
る重要 因 子 の発 現 量 に変 化 が起 こっていることを想 定 して解 析 を試 み た。
その結 果 、一 次 元 目等 電 点 電気 泳 動 のpI範 囲 を4-7に 絞 り込 む ことにより、良好 に
タンパ ク質 を分 離 す ることに成 功 した。また 、銀 染 色 す る場 合 には 総 タンパ ク量 が40
μg、クマシー 染 色 する場 合 は500
μgとなるように調 製 してサンプル 添加 す ることによ
り、充 分な比 較 解 析 が できるような条件 とした。
こ の うち 、多 数 の タ ン パ ク 質 が 存 在 す る 水 溶 性 画 分 は クマ シ ー 染 色 に よ り検 出 し
(Fig.5-12,5-13)、
外 膜 画 分 に つ い て は ク マ シ ー 染 色 と銀 染 色 の 両 方 で 検 出 し た
(Fig.5-14,5-15,5-16)と
も に 野 生 株 とSSPA1の
サ ン プ ル を 各5枚
著 に 変 動 して い るこ とが 明 らか に な っ た も の の み をPVDF膜
りN末
以 上 泳 動 して 、顕
に 転 写 して シ ー ケ ン サ に よ
端 を 決 定 した 。
発 現 量 変 化 の 顕 著 で あ っ た 各 ス ポ ットの 解 析 は 、シ ー ケ ン サ で 得 られ たN末
端配列
を 元 に デ ー タベ ー ス 情 報 を 活 用 して 、全 ア ミノ酸 配 列 、細 胞 内 局 在 、機 能 を 推 測 した
(Table 5-2)。
な お 、ゲ ル の 泳 動 図(Fig.5-12,5-13,5-16)で
示 した 番 号 とTable
5-1
で 示 した 番 号 は 同 じタ ンパ ク質 して 表 記 す る 。
水 溶 性 画 分 の 中で選 択 したスポット1∼9の うち、N末 端 の配 列 か ら同定 可能 であっ
たタンパ ク質 の局 在 は細 胞 質 かペ リプラズム、つ まり水 溶 性 画 分 に局 在 してい ることが
推 測 され た。一 方 、外 膜 画 分 の 中で選 択 したスポ ット10∼16の
うち、2種(ス ポット13,
16)の み が 外 膜 へ の局 在 が予 測 され るタンパ ク質 で あり、残 りは他 の部 位 に局 在 して
いることが示 唆 され た。そのた め、これ らのタンパ ク質 は他 の部 位 か ら混入 したものと考
えられ る。
細 胞 質 由 来 で 発 現 量 が 減 少 し た タ ン パ ク 質 の うち 、ス ポ ッ ト2は
ト3は
脂 質 代 謝 に 関 連 す る タ ン パ ク 質 で あ っ た 。 一 方 、発 現 量 が 増 加 し た タ ン パ ク 質 の
うち 、ス ポ ッ ト5、7、8、9は
15は
糖 質 代 謝 に 関 連 す る タ ン パ ク 質 で あ り、ス ポ ッ ト10、11、13、
物 質 輸 送 に 関 連 す る タ ン パ ク 質 で あ っ た 。そ の 他 、ス ポ ッ ト6(Ribosomal
S32)、 ス ポ ッ ト12(alkene
ッ ト16(Probable
1,4に
ア ミノ 酸 代 謝 、ス ポ ッ
serine
monooxygenase)、
protease)の
ス ポ ッ ト14(Electron
transfer
protein
protein)、 ス ポ
発 現 量 が 増 加 し て い る こ と が 見 出 され た 。ス ポ ッ ト
関 し て は 、一 部 の 配 列 は 決 定 で き た も の の 、ゲ ノ ム 配 列 を 元 に し た 解 析 か ら は
同 定 で き な か っ た 。菌 株 の 差 異(f.sp.denitrificansと2.4.1)に
54
由 来 す る可 能 性 が 高
いと考 察 され る。
これ らの 結 果 か ら、sspA遺
伝 子 の 欠 損 により、代 謝 全般 や 物 質 輸 送 に変 化 が生 じ
て いる可能 性 が 示 唆 され た。しか し、目的 として いた外 膜 タンパ ク質 や 生 育 に 重 要な
因 子 の特 徴 的な 変化 や傾 向を捉 えることはで きなか った。そ のため 、本 法 によりSspA
の 機 能 を特 定す ることは難 しい と判 断 した。
Fig.5-12
Two-dimentional
sphaeroides(wild-type
electrophoresis
strain)grown
NaCl in the medium.The
analysis
of soluble fractions
under aerobic dark condition with addition of 2%
gel was separated on pI 4-7 from left to right,stained
Coomasie brilliant blue.The
of R.
with
approximate size of bands in kDa is indicated on the right.
The identities assigned are listed in Table 5-2.
55
Fig.5-13
Two-dimentional
sphaeroides(SSPA1
NaCl
in the
Coomasie
electrophoresis
strain)grown
medium.The gel
assigned
of soluble
fractions
of R.
under aerobic dark condition with addition of 2%
was senarated
brilliant blue. The approximate
The identities
analysis
on pI
4-7
from left to right.
size of bands in kDa is indicated
are listed in Table 5-2.
56
stained
with
on the right.
Fig.5-14
Two-dimentional
electrophoresis
analysis
protein-enriched fractions
of R.sphaeroides(wild-type
dark condition
of 2% NaCl in the medium.The
with addition
from left to right,stained
with silver.The
approximate
on the right.
57
of outer
membrane(OM)
strain)grown
under aerobic
gel was separated
on pI 4-7
size of bands in kDa is indicated
Fig.5-15
Two-dimentional
protein-enriched fractions
condition
with addition
electrophoresis
analysis
of R.sphaeroides(SSPA1
on the
strain)grown
of 2% NaCl in the medium.The
from left to right, stained with silver. The approximate
right.
58
of outer
membrane(OM)
under aerobic dark
gel was separated
on pI 4-7
size of bands in kDa is indicated
Fig. 5-16 Differential analysis of outer membrane (OM) protein-enriched
fractions
between wild-type (A) and SSPA1 (B) grown under aerobic dark condition with addition
of 2% NaCI in the medium,
separated
focused
on cationic
on pl 4-7 from left to right,
bands in kDa is indicated
stained
range
SspA. The gel was
with silver. The approximate
on the right. The identities
59
including
assigned
size of
are listed in Table 5-2.
6
0
Table 5-2 N-terminal
amino acids sequence
and identification
of proteins reduced or induced by the disruption
of sspA gene
5.3,7野
生 株 とSSPA1の
適 合 溶 質 トレハ ロー ス の 定 量
R. sphaeoridesはNaClス
トレス 条 件 下 に お い て 二 糖 類 で あ る トレハ ロ ー ス を 主 要 な
適 合 溶 質 として 蓄 積 す る ことに よ り耐 塩 応 答 して い る ことが 確 認 され て い る(Xu
1998)。
そ の た め 、表 現 型 観 察 の 一 環 として 、sspA遺
et al.,
伝 子 を破 壊 した とき に 菌 体 内 トレ
ハ ロー ス蓄積 量 にどの ような変 化 が起 こるのか を検 討 した 。分析 手 法 として は 、HPLC
の 検 出に光 学 示 差 屈 折 計 を用 いる事 により菌 体 内 トレハ ロースを定 量 した。
5.3.7.1野
生 株 とSSPA1の
菌 体 内 トレ ハ ロ ー ス 量 測 定
本 実 験 に お け るR.sphaeroidesの
NaClに
培 養 条 件 に 関 して は 、sspA遺
伝 子 を破 壊 して も
対す る生 育 変 化 が 見 られ なか った嫌 気 光合 成 条件 で は培 地NaCl濃
(0.68M)、NaClス
を2%(0.34M)と
度 を4%
トレス に よ り生 育 が 大 き く阻 害 され た 好 気 暗 条 件 で は 培 地NaCl濃
度
して 菌 体 が 充 分 な 量 回 収 で きる 条 件 で ス トレス を 誘 導 した 。
実 サ ン プ ル を 測 定 す る前 に 、市 販 の トレハ ロー ス2水
和 物 をMilliQ水
に 溶 解 させ た
もの を 用 い て 、トレハ ロー ス 測 定 用 検 量 線 を 作 成 した 。そ の 結 果 、トレハ ロー ス は 約15
minで
溶 出 され 、1mM∼50mMの
範 囲 で良 好 な検 量線 を作 成 す ることに成 功 した
(Fig.5-17)。
この 検 量 線 をも とに 野 生 株 、及 びSSPA1の
果 、NaClス
菌 体 内 トレハ ロー ス を 定 量 した 。そ の 結
トレ ス を 誘 導 して い な い 条 件 で は 、嫌 気 光 合 成 条 件 、好 気 暗 条 件 共 に 、ト
レハ ロー ス は 全 く検 出 され な か っ た(data
not shown)
。培 養 条 件 で 蓄 積 量 を 比 較 す る
と、塩 ス トレス 強 度 が 異 な るた め 、嫌 気 塩 ス トレ ス 条 件(4%NaCl)に
条 件(2%NaCl)で
は10分
の1以
比 べ て 、塩 ス トレス
下 に 減 少 して い る こ とが 明 ら か に な っ た(Fig
.
5-18)。
一方
、野 生 株 とSSPA1株
の 菌 体 内 トレハ ロ ー ス 量 を 比 較 定 量 した ところ 、嫌 気 塩 ス ト
レス 条 件 で は 特 に 違 い は 見 られ な か っ た(Fig
も 野 生 株 とSSPA1株
5-18B)。
.5-18A)。
ま た 、好 気 塩 ス トレ ス 条 件 で
の 菌 体 内 トレハ ロ ー ス 量 に は 大 きな 違 い は 見 られ な か っ た(Fig
そ の た め 、sspA遺
伝 子 の 有 無 に 依 っ て 、菌 体 内 トレハ ロー ス の 合 成 量 が 変
化 す ることはないことが 明 らか になった。
61
.
Fig. 5-17 Calibration
curve of treha1ose standard detemlined
by refractive index
monitor.
Fig.
5-18
Trehalose
level
between
wild-type
and
SSPA1
under
photosynthesiscondition(A), and under aerobic dark condition(B).
62
anaerobic
5.4
考 察
SspAの
生 体 内機i能を探 索 す るべ く、sspA遺 伝 子 破 壊 株 を作製 してその表 現 型 を
野 生株 と比 較 解 析 した。
は じ め に 、接 合 伝 達 法 を 用 い てsspA遺
cassetteで
SSPA1は
伝 子 を 完 全 に 抜 い た 後 、ΩSmr/Spcr
組 み 換 え た 形 の 破 壊 株 の 作 製 を 試 み た(Fig.5-3)。
その結果取得 した
遺 伝 子 レ ベ ル だ け で な く、タン パ ク質 レ ベ ル で もSspAを
誘 導 合 成 して い な い
ことが ウェ ス タ ン に よ り明 らか に な っ た(Fig.5-4)。
本 章 で はSSPA1に
関 して 、種 々 の
手 法 を 用 い て 野 生 株 との 表 現 型 の 違 い を 観 察 した 。
第 一 に 、生 育 の 変 化 を 比 較 解 析 した 。そ の 結 果 、嫌 気 光 合 成 条 件 下 で は 液 体 培 養
で は 変 化 が 見 られ な か っ た(Fig.5-5)。
一 方 、プ レ ー ト培 養 で は 塩 ス トレス を誘 導 した
条 件 で 若 干 の 生 育 抑 制 が 観 察 され た(Fig.5-7)。
で も 塩 耐 性 が 培 地NaCl濃
度2%(通
常 は4%)ま
プ レ ー ト培 養 に お い て は 、野 生 株
で 低 下 して い た 。現 段 階 で は 要 因 は
明 らか に な っ て い な い 。さ らに 、好 気 暗 条 件 下 で は 、い くっ か の 顕 著 な 変 化 が 観 察 さ
れ た 。最 も 大 きな 変 化 は 、破 壊 株 に 見 られ た 生 育 の 抑 制 で あ る 。液 体 培 養 で 比 較 した
結 果 、ス トレ ス の な い 条 件 で も破 壊 株 は 野 生 株 と同 レベ ル の 菌 体 濁 度 ま で 生 育 す るこ
とが で きな か っ た(Fig.5-6A)。
SSPA1は
さら にNaClを
生 育 が 大 き く抑 制 され た(Fig.5-6C
で は 、好 気 条 件 下 でSorbitolを
培 地 に 添 加 した 塩 ス トレ ス 条 件 下 で は 、
and D)。 塩 ス トレス 以 外 の ス トレス 条 件
添 加 して 培 養 す る と、SSPAIは
培 養 開 始 か らか な り遅
れ て か ら生 育 が 始 ま り、野 生 株 と同 等 レ ベ ル まで 菌 体 濁 度 が 到 達 す る現 象 が 観 察 され
た(Fig.5-6B)。
今 後 はSorbitolも
含 め 、炭 素 源 を 変 化 させ て 生 育 させ た 時 に ど の よ う
な 変 化 が 起 こる か を 観 察 す る ことも 検 討 課 題 として 挙 げ られ る 。一 方 、プ レ-ト 培 養 に
お い て も 、SSPA1は
5-7B)。
野 生 株 と比 べ て 耐 塩 能 が 低 下 して い る ことが 明 らか に な っ た(Fig.
ま た 、嫌 気 光 合 成 条 件 と比 較 して も 、そ の 抑 制 度 合 い は 若 干 高 い こ とが 見 出
され た 。
第 二 に 、光 学 顕 微 鏡 により、培 養 中 の菌 体 の動 態 変 化 を観 察 した。その結 果 、最 も
大 きな変 化 で あったの が 、好 気 暗 条 件 で 見 られ たSSPA1の
菌 体 凝 集 である(Fig.
5-8B)。 特 に、NaClス トレス条 件 下で は大 きな凝 集 体 が観 察 され た(Fig . 5-8B)。 同
様 の凝 集 体 はKCIに
よる塩 ストレスでも観 察 され た(data
not shown)。 興 味深 いこと
に、形 成 され た凝 集 体 を通 常 培 地 に戻 す と速 や か にOD660が0.7程
度 まで上 昇 す る。
これ は破 壊 株 を通 常 培 地 に培 養 した時 と同 レベル で あり、この凝 集 体 が 細胞 死 ではな
く、生 育 抑 制 を意 味 していることが 示 唆 され る。また 、この凝 集 体 は培 養 開始 か ら数 時
間 という生育 の 初期 段 階 で形 成 され ることか ら、sspA遺 伝 子 の欠 損 がただ ちに菌 体 に
重 大 な影 響 を与 え、その結 果 生育 抑 制 が 起こっていることが予 測 される。
三 番 目として、フロー サ イトメー タを用 いて細 胞 構 造 の変 化 にっ いて比 較解 析 した。
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そ の 結 果 、SSPA1は
塩 ス トレス 条 件 下 で 、菌 体 の 大 き さ に 変 化 は な い も の の 、内 部 構
造 が 変 化 して い るこ とが 明 らか に な っ た(Fig.5-9)。
四番 目として、電 子 顕 微 鏡 による観 察 により、膜 構 造 の変 化 を解 析 した。そ の結 果 、
FACSの
結 果 で示 され た知 見 と同様 に内部 構 造 が変 化 していることが明 らか になった
(Fig.5-10,5-11)。
現 段 階 で は 代 謝 変 化 に よるの か 、菌 体 構 造 の 変 化 に よる もの な の
か判 断 できな いが 、sspAの 欠 損 により細胞 内 で何 らか の変化 が生 じている可能 性 も考
え られ る。
その ため 、五 番 目として 、sspAを 欠 損 させ たときの タンパ ク質 発 現 レベ ル で の差 異
を解 析 す るべ く、二 次 元 電 気泳 動 を用 いて野 生株 とSSPA1の
比 較 解 析 を行 なった 。こ
れ まで に得 られ た知 見 か ら、SSPA1で 見 られ た 内部構 造変 化 がタンパ ク質 レベ ルで評
価 で きな い か と考 えて分 画 を行 なった 後 で 比 較 解 析 す る手 法 を試 み た 。この うち 、
SspAを
含 む外 膜 画分 と代 謝 全 般 の特 徴 的 な変 化 や傾 向 を捉 えることを 目標 に 、外 膜
画 分 と水 溶 性 画 分 に注 目して解 析 を行 なった。分 離 条件 に関 して は 、外 膜 タンパ ク質
と水 溶 性 タンパ ク質 を主 に含 む 画 分 に 関 して 、一 次 元 目の泳 動 条 件 や 添 加 す る総 タ
ンパ ク量 を検 討 す ることにより、充分 に比 較 解 析 が 可 能 な分 離 を得 ることに成 功 した。
そのデ ー タを元 に野 生株 とSSPA1を 比 較 解 析 した結 果 、Table5-2に 示 され るように糖
質 代謝 や 物 質 輸 送 に関 連 す るタンパ ク質 の発 現 量 が増 加 していることが 明 らか になっ
た。しか し、これ らのタンパ ク質 が持 っている機 能 ドメインや 酵 素 活性 などを含 めると、
これ らがSspAの 代 替 的 な役 割 を担 っているとは考 えにくい。そ のため 、sspA遺 伝 子 の
欠 損 により何 らか の細 胞 内 変 化 が生 じたことは見 出され たものの 、SspAの 細 胞 内機能
を特 定す るの に 充分 な情 報 を取 得 することは できなかった。二 次元 電気 泳 動 を用 いた
手 法 の欠 点 として、同手 法 で は検 出され にくい微 少 量 の タンパ ク質 の 存在 が挙 げられ
る。そのた め、sspAを 欠 損 させ てもタンパ ク質 レベル で特徴 的な変 化 が起 こらなかった
と断 定 す ることは できな い。
最 後 に 、R.sphaeroldesが
塩 ス トレス 条 件 下 で 適 合 溶 質 として 生 合 成 す る トレハ ロ ー
スの 蓄 積 量 を測 定 した 。そ の結 果 、塩 ストレス条 件 で蓄 積 量 を比 較 す ると、嫌 気 光 合
成 条 件 下 に比 べ て、好 気 暗 条件 下で は10分
なった(Fig.5-18)。
の1以
下 に減 少 していることが 明 らか に
塩 ストレス強度 が 異 なるため一 概 には 比 較 で きな い が 、酸 素 の
有 無 と塩 耐 性 に 相 関 関 係 が あ るこ とも 予 測 され 、今 後 の 検 討 課 題 として 挙 げ られ る。一
方 、野 生 株 とSSPA1の
(Fig.5-18)。
間 の トレ ハ ロー ス 蓄 積 量 に は 大 き な 変 化 は 観 察 され な か っ た
そ の た め 、SspAの
有 無 とトレハ ロ − ス の 蓄 積 に は 関 連 性 が 低 い ことが 示
唆 され た 。
以 上 、sspA遺
伝 子 破 壊 株(SSPAI)の
作 製 お よ び 、そ の 表 現 型 に 著 し い 変 化 を観
察 す る こ とに 成 功 した 。ま た 、い くつ か の 方 法 論 に よ りそ の 影 響 は 主 に 好 気 暗 条 件 下
で 観 察 され た 。R.sphaeroldesを
含 め た 光 合 成 細 菌 は 、酸 素 の 有 無 に よ り多 数 の 光 合
成 因 子 を 含 む 内 膜 構 造 が 大 き く変 化 す る こ とが 知 られ て い る(Cohen-Bazire
64
et al.,
1957)。
酸 素 が 存 在 す る と 、bacteriochlorophyll(bch)
harvesting-II(puc)な
ど の 光 合 成 関 連 遺 伝 子 の 発 現 が 大 き く抑 制 さ れ る 事 が 知 ら れ
て お り、ま た 、こ れ ら の 光 合 成 因 子 がRegA-RegBと
る 事 も 報 告 さ れ て い る(Sganga
(Elsen
、carotenoid(crt)、light
et al., 2000)、nitrogen
et al., 2000)、cytochrome
呼 ば れ るregulatorに
et al., 1992)。RegA-RegBはhydrogen
fixation (Elsen
biosynthesis
et al., 2000)、carbon
(Swem
et al., 2002)と
utilization
fixation (Vichivanives
い った 多 様 な役 割 を果 た
す こ と が 知 ら れ て い る 。 一 方 、 酸 素 が 存 在 す る 条 件 で は 、aa3-type
oxidaseや
一 部 のNADH-ubiquinone
superoxide
dismutase
(sox)、glutathione
れ て い る(Garcia-Horsman
制 御 され て い
et al., 1994;
dehydrogenase、
peroxidaseの
Pappas
cytochrome
さ ら に はcatalase
c
(cat) 、
発 現 量 が 増 加 す る こ とが 報 告 さ
et al., 2004)。
そ の た め 、sspAの
欠 損
が 、酸 素 に 由 来 す る 細 胞 内 構 造 や 代 謝 系 の 変 化 と合 わ さ っ て 、生 育 変 化 や 菌 体 の 凝
集 、さ ら に は 内 部 構 造 の 変 化 を 引 き 起 こ し た 可 能 性 も 考 え ら れ る 。し か し 、今 回 解 析 し
た 方 法 で はSspAの
具 体 的 な 機 能 解 明 に は 至 らな か っ た 。
以 後 の 章 で はSspAの
機 能 を 直 接 的 に 解 析 す る の で は な く、相 互 作 用 し て い る 可 能
性 の あ る タ ン パ ク 質 、関 連 し て い る 遺 伝 子 や タ ン パ ク 質 を 調 べ る こ と に よ りSspAの
内 機 能 を 探 索 す る ことに した 。
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