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3D Deconvolution
3D Deconvolution 3D Deconvolution は Blind Deconvolution 法により、標準の 2D Deconvolution よりも精度の高い焦点外から派 生するボケ画像の処理を行います。 本モジュールは透過画像にも対応しており、また、共焦点顕微鏡用のモジュールも追加オプションとしてご用意 しています。 １． デコンボリューションを行いたい Stack ファイルを Load し、Process メニューより、3D Deconvolution を 選択します。初めて起動する場合はモジュール使用ライセンス承諾の確認を聞いてきますので、承認できれ ば OK を押してください。 なお、Please do not show this dialog again にチェックを入れて OK を押すと次回からの起動時にこのメッ セージは表示されません。 ２． 3D Deconvolution の設定ウィンドウが表示されます。まずは Settings のタブです。 処理を行う Stack ファイルを指定します デコンボリューションを行うには画像取得時の顕微 鏡の設定情報が必要になります。 各項目は次項で説明しますが、MetaMorph でそれぞ れの項目を設定した状態で撮影していただくと、画像 から各情報を取得し、自動でデコンボリューションの 設定に反映いたします 処理の回数を設定します。回数が多いほど処理効果は高くなりますが、処理時 間は長くなります。また、過剰の処理を行うと画質低下につながります。デフ ォルトの 40 前後でまずは実行してください。 一般的な蛍光、透過画像は Low、共焦点画像の場合は Mid で実行します。 チェックを入れると処理速度が向上します。画質を重視する場合は チェックを外します。画像枚数が多い場合はチェックを入れて処理 する事をお勧めします。 チェックを入れるとメーカー推奨セッティングのアルゴリズムで実行します。通常は チェックを入れて実行します。 チェックを外すと Expert セッティングタブが追加され、より細かいセッティングが可 能となります。 Nihon Molecular Devices / Imaging (1/4) Molecular Devices Japan KK/ ImagingTeam Team (1/4) ３． 次は Optics のタブになります。ここで、処理対象の画像を撮影した時の光学系の設定を入力します。 ① ② ③ ④ ①Microscope：画像取得の形式を設定します。 ・Confocal-Point Scan･･･ガルバノ式共焦点顕微鏡(FV1000,LSM510 など) ・Confocal-Spining Disk･･･ディスクスキャン型共焦点顕微鏡(CSU シリーズ、DSU など) ・Two－Photon･･･2 光子レーザ顕微鏡 ・Widefield-Fluorescence･･･一般的な蛍光画像 ・Widefield-Transmitted･･･一般的な透過画像 ＊上記の選択肢は御購入頂いたモジュールにより選択可能な項目が異なります。 ②対物レンズの N.A.値、レンズ、標本間の屈折率を入力します。 屈折率はドライレンズの場合は”1”、水浸レンズは”1.333”、油浸レンズの場合は”1.5”か”1.515”の内、使用 しているオイルの屈折率に近い数値を選択してください。なお、対物レンズの設定を行った MetaMorph にて撮影を行った場合、”Image”にチェックを入れることで、画像から対物レンズのデータを読み出します ③画像の空間校正値を入力します。 画像の XY 方向、そしてそれぞれの Z プレーンの空間校正値を入力します。単位はミクロン(μm)です。 なお、予め空間校正(キャリブレーション)を行い、Z モータを使って MetaMorph で撮影した画像の場合、 “Image”にチェックを入れることで、画像から対物レンズのデータを読み出します ④画像の波長情報を入力します。 処理を行う画像の波長を入力します。 蛍光画像であれば、蛍光プローブの蛍光波長(例：GFP=520nm)を入力します。カラー画像であれば通常は 光の三原色(420nm,520nm,600nm)近辺の数値を設定します。 なお、蛍光画像において、MetaMorph でイルミネーションオプションを設定、使用して撮影した画像の場 合、“Image”にチェックを入れることで、画像から対物レンズのデータを読み出します 上記 4 点の設定が一つでも欠けていると処理が実行できませんので、御注意ください。 Nihon Molecular Devices / Imaging (2/4) Molecular Devices Japan KK/ ImagingTeam Team (2/4) ４．次は PSF のタブの説明をいたします。 ① ② ③ ①PSF Starting Point 3D デコンボリューションの PSF アルゴリズムの選択をします。 Theoretical PSF はプログラム内に存在する PSF 理論値に基づきます。Measured PSF は処理画像と同じ設定の 顕微鏡にて撮影した蛍光ビーズ画像より、PSF 値を算出し、それに基づいて処理を行います。Theoretical PSF に比べ、同じ撮影環境下での PSF 値から算出する為、処理制度は向上しますが、別途蛍光ビーズの Z 軸 Stack フ ァイルが必要となります。 ②Theoretical PSF ①で Theoretical PSF を選択した場合だけ利用できます。処理対象の Stack ファイルの画像において、対物レ ンズ、培地などから来る球面収差を必要に応じて補正します。Detect SA ボタンで現在の設定値(レンズ N.A. 値、蛍光波長等)より、修正地を検出します。使用しなくてもデコンボリューションの実行は可能です。 また、更に細かい設定を行う場合、Calculate SA ボタンを押すと下記パネルが表示されますので、サンプルを 取包む培地の屈折率、カバーグラスに標本が接着していない場合、サンプルとカバーグラスの距離(μm)を入力 する事で、球面収差補正地を算出設定します。培地が粘性、油性の場合、ご利用ください。 サンプルを取包む培地の屈折率 サンプルとカバーグラスの距離 注意：カバーグラスの厚みではありません Nihon Molecular Devices / Imaging (3/4) Molecular Devices Japan KK/ ImagingTeam Team (3/4) ③Measured PSF ①で Measured PSF を選択した場合のみ利用可能です。 蛍光ビーズの Z Stack ファイルがある場合、そのファイルがあるディレクトリを指定します。 多重蛍光画像などの場合はそれぞれのチャンネルに適合したファイルを指定します。 また、蛍光ビーズの Stack ファイルにキャリブレーション値(XYZ 軸の空間校正値)がない場合は手動入力で 各値を入力してください。 以上で 3D デコンボリューションの設定が完了です。設定パネル最下段にある Apply ボタンを押して処理を実 行します。 また、入力した各種設定は Load State、Save State で保存、読み出しが可能となっています。 以上 Nihon Molecular Devices / Imaging (4/4) Molecular Devices Japan KK/ ImagingTeam Team (4/4)