蛋白質核酸酵素:植物RNAウイルス遺伝子の発現と複製過程

総説植物ウイルス遺伝子の発現と複製過程渡辺雄一郎
タバ コモ ザ イ クウ イ ル ス (TMV)
に代 表 され る よ うに, 植 物RNAウ
イル ス の遺 伝 子
に つ い ての 情 報 が 塩 基 配 列 の決 定 に よ って 得 られ て き た。 そ して植 物RNAウ
通 に 複 製, 細 胞 間 転 移,
遺 伝 子 保 護 とい った 機 能 を もつ 蛋 白質 を コー ドす る こ とが わ か っ
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て きた 。 本 稿 で はTMVの
染 性TMV
RNAの
RNAの
イルスが共
プ ロ トプ ラ ス トへ の 同 調 感 染 系,
発現 系 に よ る reverse
genetics,
な らび に in vitro
そ して in vitro
合 成 系 を 用 い て な され た 最 近 の 実 験 結 果 をま とめ て,
での感
でのウイルス
植 物RNAウ
イルスの遺
伝 子 の 複 製 と 発 現 の 問 題 に つ い て 述 べ る。
は じめ に
現 在 知 られ て い る多 くの植 物 ウ イ ル ス の遺
伝 子 は1本 鎖RNAで,
そ の遺 伝 子RNAの
多 くは そ の
形 で翻 訳 活 性 を もつ プ ラ ス 鎖RNA〔(+)
RNA〕
であ
DNAと
比較 して分 子 生 物 学 的 に取 扱 い が 困難 で あ り,
DNA遺
伝 子 の解 析 に対 して強 力 な 武器 とな っ た組 換 え
DNA技
術 を利 用 す る こ とが で きな か った の も, も う1
る^<1)>。
最 初 に 結 晶 化 され た タ バ コ モ ザ イ ク ウ イ ル ス
つ の大 き な理 由 で あ った 。 しか し, cDNAに
(TMV)^<2)>は そ の 中 の 代 表 的 な もの で あ る。
こ とでRNA遺
RNAを
遺 伝 子 とす る ウ イル ス の中 には レ トロ ウ イ ル
ス の一 群 の よ うに, そ の 複製 中 間段 階 でDNAの
伝 子 の全 一 次 構 造 の決 定 が 可 能 とな り,
さ らに最 近 に な っ て い くつ か のRNAウ
形をと
読みかえ る
長 のcDNAか
ら大 腸 菌 やSP6フ
イ ル ス で, 完 全
ァ ー ジ な ど のRNA
る とい った 初 期 の セ ン トラ ル ドグ マ の枠 組 み か らは ず れ
ポ リ メラ ー ゼ を 用 い て 感 染 性 の転 写 産 物 (transcript)
た 遺 伝 情 報 の 流 れ を示 す も の も あ る^<1)>が,
TMVな
が in vitro
植物 ウ イル ス のRNA遺
伝 子 はRNAフ
(+)RNA→(-)RNA→(+)RNAと
どの
ァ ー ジ と同 様,
い っ た,
で 生 成 され る実験 系 が報 告 され て きた 。 プ
ロモ モザ イ クウ イ ル ス (BMV)^<3,4)>,TMV^<5)>の植物 ウイ ル
ス を は じめ, ポ リオ ウイ ル ス^<6)>な
ど の動 物 ウ イ ル スで の
相 補 鎖
RNAを
経 る複 製 反 応 を 行 な って い る。 し か し 植 物
報 告 例^<7,8)>も
続 い て い る。 した が っ て, これ か らはRNA
RNAウ
イ ル ス の場 合, 宿 主 細 胞 内 で どの よ うな 遺 伝 子
遺 伝 子 をDNAレ
ベ ル で操 作 し, reverse genetics の 手
が発 現 し, どの よ うな 役 割 を 果 た して い るか, とい う複
法 で, 今 後, 植 物 ウイ ル ス の研 究 が 急速 に進 展 す る もの
製 過 程 の分 子 レベ ル で の研 究 は 非 常 に 立 ち 遅 れ て いた 。
と思 わ れ る。
そ の理 由 の1つ は 分 子 遺 伝 学 的 研 究 の遅 れ で あ る。 た
こ のほ か 宿 主 で あ る植物 細 胞 が 細 胞壁 を もつ こ と も障
とえ ば, い くつ か の複 製 に 関 す る温 度 感 受 性 の変 異 株 は
壁 の1つ であ った が, セ ル ラー ゼ な どの酵 素処 理 に よっ
報 告 され て い るが, そ の形 質 は 不 安 定 で, 以 後 の 解 析 が
て細 胞 壁 のな い 裸 の細 胞 (プ ロ トプ ラ ス ト) が 多量 に 得
不 可 能 で あ る こ とか ら遺 伝 学 的 ア プ ロ ーチ は 現 在ま で の
られ る よ うに な り, 植 物 ウイ ル スの 同 調 感 染 系 も確 立 さ
と ころ, ほ とん ど行 な わ れ て い な い。 ま たRNAは
れ^<9∼11)>, in vivo
で の複 製 過 程 を 生化 学 的 に解 析 で き る
Yuichiro
Watanabe,
istry,Faculty
東 京 大学 理 学 部 生 物 化学 科
of Science,
The
University
of
(〒113
東 京 都 文 京 区 本郷
Tokyo,
Expression and Replication Process of Plant Viral RNNA
Key 【植
word物RNAウ
214
イ ル ス 】 【TMV】
Hongo,
Genomes
【RNA複
製】
7-3-1)
Bunkyo-ku,
[Department
Tokyo
113,
of
Japan]
Biophysics
and
Biochem
I
植物RNAウ
イル ス遺伝子 の発現 と複 製過程
27
よ うに な った。
最 近 は植 物RNAウ
イル スをRNAベ
.
ク タ ー と して利
植 物RNAウ
イル ス の遺 伝 子 産 物
用 す る試 み に も成 功 し^<12,13)>,
植物 の遺 伝 子工 学 とい う応
TMVの
用 面 で注 目され てい る。 この よ うな 背 景 に あ っ て, そ の
基 本 と な る のは 植 物RNAウ
ゲ ノ ムRNAは,
mRNAと
イル ス の 複製 過 程 の よ り詳
す で に 述 べ た よ うに
し て 働 く (+)
あ る。
細 な分 子 レベ ル での 解 明 で あ ろ う。 本 稿 で は, 最 も研 究
TMV
の進 ん で い る と思 わ れ るTMVを
かつ て は 網 状 赤 血 球 由来^<14)>ま
た は 小 麦 胚 芽 由 来^<15)>の in
中 心 に, 遺 伝 子操 作 の
RNA上
鎖 の1本 鎖RNAで
に コ ー ドされ る蛋 白質 につ い て の解 析 は,
vitro の蛋 白質 合 成 系 を用 い た研 究 に よっ て す す め ら れ
技 術 や プ ロ トプ ラ ス トヘの 同 調 感 染 系 を用 い て 集 積 され
て きた が, 現 在 は ゲ ノ ムRNAの
複 製 過 程 につ い ての 知 見 を ま とめ て み た い。
て そ の 全 貌 が 明 らか に さ れ て い る。
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て きた デ ー タを も とに, 植物 ウ イル スの遺 伝 子 の 発 現 と
図1.
TMVが
コー ドす る 蛋 白 質 とゲ ノムRNA,
サ ブゲ ノムRNAと
の関係
影 部 は 各RNAか
ら翻 訳 され る シ ス トロン, ●は キ ャ ップ構 造 (30K蛋
白 質mRNAに
確 定) を 示す 。サ ブ ゲ ノムRNAは
長 さを 誇 張 して 図 示 して あ る。 ゲ ノ ムRNA
6395塩
白質mRNA
1558塩
基, CP
表1.
a)
内 部 の ポ リA鎖 の長 さを 平 均19塩
とを 示 す 。SB
: サ ブ ゲ ノ ムRNAか
とを 示 す^<51)>。
mRNAは693塩
植 物RNAウ
基 と し た 。b)
一 次 構 造 の決 定 に よっ
ついては未
基, 30K蛋
基。
イ ル ス の遺 伝 子構 造 と コー ドされ る蛋 白質
3'末 端 の ポ リA鎖 の 長 さは 除 い た 。RT
ら翻 訳 され る こ と を 示す 。PR
: 読 み 越 しの 機 構 で 産 出 され る こ
: 蛋 白 質 が プ ロセ シン グ を 受 け, 機 能 単 位 にわ か れ る こ
215
28
蛋 白 質
TMVの
り,
普通系
トマ ト系L株
Vulgare
に つ い て は Goelet
(126K),
180K
ー ト蛋 白 質
frame)
ら^<16)>に
よ
存 在 が 予 測 さ れ て い た130
(183K),
(17 .5K)
が確 認 され た
TMVと
酵 素
に つ い て は 大 野 ら^<17)>に
よ って 全一 次 構
造 が 決 定 さ れ た 。 そ の 結 果,
K
核 酸
30K各
蛋 白 質,
に 対 応 す る解 読 枠
(図1,
そ して コ
(open
reading
(1987)
列 を も っ てい た 。 この よ うな相 同性 は遺 伝 子 の発 現 様 式
に共 通 性 を もつ 動 物 ウ イル スで あ る シ ン ドビ ス ウイ ル ス
(SIN)
との 間 で も認 め られ た^<32)>。TMVが コー ドして い
る130K,
180K蛋
白質 が 複製 反 応 に 関 与 して い る こ と
を示 唆 した 実 験 と しては, 酒 井 ら の報 告^<33)>が
あ るが, 生
イ ル ス の中 には 分 節 し
BMV^<34)>, AlMV^<35)>な どで は, 分 画 した ウ イル ス また は
た ゲ ノ ム 構 造 を も っ も の も 多 い^<1)>。
分 節 ゲ ノ ム構 造 を も
RNAを
つ ア ル フ ァ ル フ ァモ ザ イ ク ウ イ ル ス
RNA2の
(AIMV)^<18∼20)>,
プ ロ トプ ラス トに感 染 させ る実 験 で, RNA1と
み で複 製 が 可 能 な こ とか ら, この2つ のRNA
BMV^<21∼23)>, キ ュ ウ リ モ ザ イ ク ウ イ ル ス (CMV)^<24∼26)>, カ
上 に の っ て い る情 報 が 複 製 に必 須 で あ る こ とが 確 か め ら
ウ ピ ー モ ザ イ ク ウ イル ス
ど につ い て も
れ て い た。 こ の よ うな実 験 デ ー タ と とも に, 今 回 見 い だ
全 一 次 構 造 が す で に 報 告 さ れ, 各 ウ イ ル
され た ア ミノ酸 配 列 上 の相 同性 は これ ら の蛋 白質 が ゲ ノ
ゲ ノ ムRNAの
(CPMV)^<28,29)>な
ス の コ ー ドす る 蛋 白 質 に つ い て の 情 報 が 得 ら れ て い る。
表1に
こ れ ま で に 報 告 の あ っ た も の に つ い て,
RNAの
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No. 3
化 学 的 に は まだ 証 明 され て い な い。 分 節 ゲ ノ ムを もつ
表1)。
異 な り, 植 物RNAウ
Vol. 32
分 節 構 造 の 有 無,
ヌ ク レ オ チ ド数,
ゲ ノム
コ ー ドす る
蛋 白質 の分 子 量 な どの 情 報 を ま とめ た。
ゲ ノ ム 構 造 上,
大 き な 差 異 の あ る 植 物 ウ イ ル ス で も,
コ ー ド し て い る 蛋 白 質 が 担 っ て い る 機 能 は か な り共 通 で
あ る こ とが わ か っ て き た 。 ま ず 最 近,
各 ウ イ ル ス の コー
ドす る 分 子 量 の 大 き い 蛋 白 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 間 で 相 同
ムRNAの
複 製 に関 与 して い る蛋 白質 で あ る こ とを強 く
示 唆 して い る。 な お, これ らの ア ミノ酸 配 列 中 の狭 い領
域 に は 〔TMVの
through)領
るRNA依
場 合, 180K蛋
白質 の 読 み越 し(read
域 の中 に あ る〕, 種 々の ウイ ル ス が コー ドす
存 性 ポ リ メ ラー ゼ に共 通 に見 いだ され る相 同
的 な ア ミノ酸 配 列 の存 在 が報 告 され て い る^<36)>。
TMVが
コー ドす る30K蛋
白質 の機 能 に 関 して は 温
度 感 受 性 変 異 株Ls1^<37,38)>を用 いた 解 析 か ら,
ウイ ル ス
性 の 高 い 部 分 が あ る こ と が 見 い だ さ れ た^<31,32)>。AIMV,
の細 胞 間 転 移 に 関 与 す る こ とが 示 唆 され て い る。Ls1を
BMVな
プ ロ トプ ラ ス トに 感 染 させ る と非 許容 温 度下 で も野 生株
ど の 分 節 した ゲ ノ ムRNAか
量 の 大 き い2つ
1 30Kま
SINは
の 蛋 白 質 は,
た は180K蛋
示 す よ う にTMVの
白質 と相 同 性 の高 い ア ミノ酸 配
Lと 同 レベ ル の増 殖 を示 す が^<37)>,
植物 体 に 感 染 し た 場
合, 非 許 容 温 度 下 で は1つ
図2.
RNAウ
イ ル ス の 遺 伝 子 産 物 の 相 同性 (文 献32よ
動 物 ウイ ル ス の一 種 で あ る シン ドビス ウ イ ル ス, nsp は非 構 造 蛋 白質 の略 で,
れ る 。 ●は キ ャ ップ構 造 。
216
図2に
ら翻 訳 さ れ る 分 子
の感 染 中 心 の 細 胞 か ら まわ り
り改 変)
プ ロセ シン グに よ っ て nsp^<1∼4>に わ か
植物RNAウ
の細 胞 へ と広 が らな くな る^<38)>。
こ のLs1の
Lと 比 較 す る と, 30K蛋
イルス遺伝 子の発現 と複製過程
29
塩 基配列を
白質 に ア ミノ酸 置 換1つ を 起
こ して い る こ とが 明 らか とな った^<39)>。
す な わ ち, TMV
の30K蛋
白質 は ウ イル スの 細胞 間 転 移 に 関 与 す る蛋 白
質 で あ り, 植 物 ウ イル スが 植 物 に 感 染 して広 が るた め の
機 能 を ウ イ ル ス 自身 がコ ー ドし てい る こ とが 明 らか に な
った 。 こ の よ うな 機 能 はTMV以
外 の ウ イル ス も も って
い る も の と推 測 され, 実 際 に お 互 い に 相補 性 の あ る こ と
が い くつ か の例 で示 され てい る。 た とえ ば, Ls1の
細胞
間 転 移 の機 能 が 非 許 容 温 度 下 にお い て, ポ テ トウ イ ル ス
Xと の混 合 感 染 に よ っ て相 補 され て い る こ とが 示 され て
い る^<40)>。
また, タバ コ ラ ッ トル ウイ ル ス のRNA1上
コー ドされ る29K蛋
白質 がTMVの30K蛋
に
白質 と相
同的 な ア ミノ酸 配 列 を もつ こ とが 報 告 され た^<41)>。
以上 の結 果 か ら考 え て, す べ て の植 物RNAウ
イルス
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の遺 伝 子 が コー ドして い る蛋 白質 の機 能 は, 現 在 の とこ
ろ, 複 製, 細 胞 間 転 移, コ ー ト蛋 白質 に よ る遺 伝 子 保 護
の3つ に大 き くわ け られ る こ とが 明 らか と な っ て きた 。
遺 伝 子 の形 態 が 大 き く異 な っ て い て も, こ の よ うに ウ イ
ル ス 間 で遺 伝 情 報 の共 通 性 が 見 いだ され た と とは, た と
え ばTMVの
遺 伝 子 の発 現 と 複 製 過 程 の 研 究 で得 られ
る知 見 が, 広 く植 物RNAウ
イ ル ス全 般 の研 究 に きわ め
て 有 用 な もの とな る こ とを示 して い る とい え よ う。
図3.
TMVが
コ ー ドす る蛋 白質 の 発現^<42)>
TMV感
染 プ ロ トプ ラス トと非 感 染プロ トプ ラス トを [^3H]
ロイ シン で感 染3∼4時
間 後 に パ ル ス 標 識 を し, 中 で合 成 され
た 蛋 白質 をSDS-PAGEお
よび フル オ ログ ラフ ィ ー に よ っ て
解 析 した 。
論 の正 しか った こ とが 一 次 構 造 か ら も確 認 され た^<16,17)>。
II.
TMVの
遺伝子の発現
現 在 で は, こ の読 み越 しは 植 物 細 胞 内 に存 在 す る あ る種
の チ ロ シ ンtRNAの
1. in vivo
で発 現 す る蛋 白質 の 同 定 と発 現 様 式
A.
白 質 と180K蛋
130K蛋
図3にTMVを
と考 え られ て い る^<44)>。
TMV感
白質
感 染 させ た プ ロ トプ ラ ス ト を非 感 染
プ ロ トプ ラ ス トを [^3H] ロイ シ ンで標 識 し, 合 成 され た
サ プ レ ッサ ー活 性 に よ っ て起 こ る
K蛋
染 細 胞 内 で は 図3に 示 す よ うに, 130K,
180
白質 が 両 者 と も に合 成 さ れ て い る。 のち に触 れ る よ
うに両 者 の合 成 の 比 は, 感 染 後 の時 間 を通 して一 定 で あ
フ ル オ ログ ラ フ ィ ー で解 析 した
り, そ の 比 (読 み越 しの効 率) を積 極 的 に調 節 す る 因子
例 を 示 した^<42)>。
感 染 プ ロ トプ ラ ス ト特 異 的 に合 成 され て
が あ るか 否 か は, 複 製 機 構 を解 析 す る うえ で の1つ の問
い る4種 類 の蛋 白質 が あ る こ とがわ か る。
題 点 で あ る。 ま た, 180K蛋
蛋 白質 をSDS-PAGE,
この うち, 分 子量 の 大 き い2種 の 蛋 白質 は, TMV
RNAを in vitro
130Kと180K蛋
Kと180K蛋
白質 は130K蛋
白質 と同 じ
ア ミノ酸 配列 を部 分 的 に も っ て い るが, 両 者 が そ れ ぞ れ
の翻 訳系 に 加 え た際 に合 成 され る^<14,15)> ま っ た く別 の機 能 を果 た して い る のか, あ る い は一 方 が
白質 と考 え られ る。Pelham
は130
白質 の間 で共 通 な トリプ シ ン分 解 の ペ プ
他方 の機 能 を相 補 す る こ とが で き る のか とい う点 も興 味
の あ る と ころ で あ る。 他 のRNAウ
イ ル ス の蛋 白質 との
チ ドが あ る こ とを 見 い だ し, in vitro の翻 訳 系 に お い て
相 同 性 か ら も, との2つ
酵 母 由 来 の サ プ レ ッサ ーtRNAを
は 特 に重 要 で あ る。今 後 こ の 点 に 関 して は, cDNAか
加 え た際 に130K蛋
白質 の 合 成 が 減 少 し, そ の代 りに180K蛋
白質 の合 成
の感 染 性TMV
の蛋 白質 の機 能 分 担 とい う問題
RNAの
ら
発 現 系^<5)>を
用 い た reverse
ge
が 増 大 す る こ とを 示 した^<43)>。
つ ま り, あ る種 の サ プ レ ッ
neticsの 実験 で そ れ ら の性 質 の詳 細 が 明 らか に な っ て い
サ ーtRNAに
く と思わ れ る。 た とえ ば, 石 川 らの 最 近 の結 果^<45)>に
よれ
ン (UAG)
180Kの
よ り130K蛋
白質 シ ス トロ ンの終 止 コ ド
を 読 み越 して (readthrough),
さ らに分 子量
長 い蛋 白質 を合 成 す る と説 明 され た が, そ の推
ば, 180K蛋
白質 はTMVの
示 され た 。 そ れ はUAGコ
複 製 に必 須 で あ る こ とが
ドンの下 流 領 域 を人 工 的 に 改
217
30
蛋 白 質
変 したTMV
RNAを
核 酸
酵 素
数 種 類 作 成 し, そ の感 染 性 を調 べ
た 結果 か ら得 られ た 。UAGコ
ドンの下 流 に塩 基 を挿 入
ま た は 置 換 して, 読 み 越 しの あ とにす ぐに別 の終 止 コ ド
ンが現 わ れ る よ うに したRNA
(R3, R4, R5)
ノ酸 の 挿 入 は 起 こ る も の の, 以 後180K蛋
に読 まれ る よ うに したRNA
4)。 これ らのRNAを
と, 180K蛋
と, ア ミ
白質 が 正 常
(R6, R7)
を作 成 した (図
植 物 体 に接 種 し, 感 染 性 を調 べ る
白質 が 合成 さ れ る こ とが 予 想 され るRNA
に は感 染 性 が あ り, 途 中 でそ の合 成 が 止 ま る と予 想 され
たRNAに
は 感 染 性 が 認 め られ な か った。 こ の こ とは
130K蛋
白質 の み で はTMV
RNAの
複 製 は で き ず,
180K蛋
白質 は そ の合 成 量 は 少 な く て も複 製 に必 須 で あ
る こ とを示 して い る。 な お, 厳 密 な130K,
180K蛋
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30K蛋
白
白質 と コー ト蛋 白 質
図3の 残 りの2種
質 と分 子 量17.5Kの
は, TMV
RNAの
の蛋 白質 は, 表1で
No. 3
(1987)
ノ酸 に対 応 す る抗 ペ プチ ド抗 体 を 用 い て 確 か め られ て い
る^<47)>。
また,
コ ー ト蛋 白質 は 従 来 か ら得 られ て い る ウ イ
ル ス に対 す る抗 体 と の反 応 性 か ら確 か め られ た 。
とこ ろ で, TMV
も30K蛋
RNAを in vitro
真 核 生 物 のmRNAで
は そ の5'端
の キ ャ ップ構 造 か
ら, い ちば ん 近 い 開 始 コ ド ン (AUG)
か ら蛋 白質 が 合成
され る こ とが 多 い^<48)>。
で は, in vivo
で この2つ の蛋 白
質 は いか に して合 成 され てい るの だ ろ うか 。
こ の問 題 は, サ ブ ゲ ノ ムRNAが
1)。 サ ブ ゲ ノ ムRNAと
そ の3'端)
各 シス トロ ンに 対応
白
は, ゲ ノムRNA
各 蛋 白質 の合 成 開 始 コ ドンが そ の5'端
ら30K蛋
に 近 くな る こ と
質 が 読 まれ る よ うに な る と考 え られ る。AIMV,
CMVの
場 合 に もRNA3の3'側
塩 基 配 列 か ら推 定 され た30K蛋
白
され る コー ト蛋 白質 が 翻 訳 され る際 に, RNA4と
ミ
れ る サ ブ ゲ ノムRNAが
合 成 され る (表1)。
図4.
130K蛋
白質 の 読 み 越 し (readthrough)
領 域 を 改 変 した mutant
TMV
RNAと
感 染 性^<45)>
in vitro で の mutagenesis
法 に よ って 作 製 され た “mutant” RNAの
読 み越 し領 域 の配 列, そ こか ら の
218
字 表 記 で, 野 生 型 (W3)
そ して 各RNAを
タ バ コ の葉 に接 種 した 際 の 感 染 性 を 示す 。 ア ミノ酸 配
と違 うもの を 表 示 して あ る。
BMV,
の シ ス トロ ンに コー ド
白質
産 出 が 予 想 され る 読 み 越 し産 物,
あ り,
白質 また は コー ト蛋 白
コー ト蛋 白質 で あ る。30K蛋
質 の ア ミノ酸 配 列 を も とに人 工 合 成 したC末 端16ア
列 は1文
(こ の場 合,
の配 列 と同 じ配 列 を も ったmRNAで
で, これ ら のRNAか
い う30K蛋
の 翻 訳 系 に加 え て
白質 と コー ト蛋 白質 は合 成 され な い。 実 際,
して合 成 され る こ と^<49,50)>が
見 い だ さ れ て 解 決 した (図
質 の 同定 は抗 体 と の反 応 性 か ら確 か め られ て い る^<46)>。
B.
Vol. 32
呼ば
植物RNAウ
2.
TMVの
A.
蛋 白質 の 合 成 の 時 間 変 化
イル ス遺伝子 の発現 と複製過程
遺 伝 子 の 発 現 とそ の 制 御
B.
RNAの
同調 感 染 系 で は最 初 の ウイ ル ス活 性
合 成 の時 間 変化
の レベ ル で 制御 さ れ て い るの だ ろ うか 。 こ の問 題 を解 く
第1段 階 と して, 翻 訳 の鋳 型 とな るべ き ゲ ノ ムRNA,
が 感 染 後6時 間 で 現わ れ る^<11)>の
で, 複 製 に必 要 な遺 伝 子
30K蛋
の 発 現 過程 の追 跡 に は感 染 直 後 か ら数 時 間 の解 析 が 特 に
の合 成 の 時 間変 化 を, 蛋 白質 の合 成 と並 行 して 解 析 し
必 要 で あ る。 ウイ ル スが コー ドして い るす べ て の蛋 白質
た。
が い か な る タイ ム ・コー ス で合 成 され るか を解 析 す る た
め, TMV感
染後, 種 々 の 時 間 で [^3H] ロイ シ ンを用 い
白質mRNA,
TMV感
コ ー ト蛋 白質mRNA
(CPmRNA)
染 プ ロ トプ ラ ス トを [^3H] ウ リジ ンで パ ル ス
標 識 し, RNA産
物 を8M尿
素 を含 む2.4%
てパ ル ス標 識 を 行 な い, そ れ ぞ れ の蛋 白質 の合 成 を経 時
フル オ ロ グ ラ フ ィー で 解 析 す る と, 図6の
釣 に 追 った^<42)>の
が 図5で
RNAが
あ る。
発 現 量 に違 い は あ る もの の, 4種 の蛋 白 質 の 合成 は ほ
ゲ ノ ムRNA,
replicative form
ぼ同 時 に 感 染3時 間後 に は 検 出 され た 。 そ して 各 蛋 白質
の 合 成 は 感 染6∼9時
た 。 こ の帰 属 は, TMV感
間後 に ピー クに 達 した (こ の時 期
子 が 最 初 に検 出 され る)。 少 な く と も こ
白質mRNA,
CP
種cDNA断
り決 定 され た^<42)>。
こ こ でRF-RNAと
は, 複 製 の際 に感
染 細 胞 内 で作 られ る マ イ ナ ス鎖RNAが
現 象 も特 に認 め られ な か った 。
ア ニ ール した2本 鎖RNAで
下 が り, つ い に は 検 出 され な くな る。 他 の蛋 白質 の合 成
各
片 との サ ザ ン ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ンに よ
に伴 う宿 主 自身 の蛋 白質 合 成 の減 少, shut-off とい った
白質 の 合 成 のみ 著 しく
(RF
推 定 され
プ ロ ー ブ と し, TMVの
の 時 期 ま で, 感 染 前期 ・後 期 と表 現 され る よ うな遺 伝 情
こ の時 期 を 過 ぎ る と, 30K蛋
RNA
mRNAと
染 プ ロ トプ ラス トを [^<32>P]
正
リ ン酸 で 標 識 した 各RNAを
報 の発 現 の切 替 え は認 め られ な い 。 また, TMVの
感染
PAGE,
よ うに4種 の
感 染 特 異 的 に認 め られ る^<42)>。
泳 動 度 の うえ で遅
い順 に,
RNA),30K蛋
に 子 孫TMV粒
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ウ イ ル スRNAの
この よ うな蛋 白質 の 合 成 の 時 間 変 化 は 遺 伝 子 発 現 の ど
筆 者 らの タバ コの培 養 細 胞 由来 の プ ロ トプ ラス トを用
いたTMV
31
ゲ ノ ムRNAと
あ り, 青 木 らな ど^<53∼55)>に
よ
っ て も検 出 され て い る。
これ ら のRNAの
合 成 は, 感 染2時
間後 に は 検 出 され
も徐 々 に減 少 は す るが, 感 染3目 後 の プ ロ トプ ラ ス トに
る。 合 成 の ピ ー クは 感 染 後 数 時 間 か ら9時 間 に か け て 現
お い て も合 成 の継 続 して い る こ とが 認 め ら れ る。 そ こ
わ れ, そ の時 点 ま で ゲ ノムRNA,
で, こ こに 見 だ され た30K蛋
CP mRNAの
白 質 の 合成 に 関 す る現 象
を transient synthesis と呼 ぶ こ とに した^<42,52)>。
30K蛋
ぎ る と, 30K蛋
白質mRNAの
合成 の み が 急激 に 減 少
し, つ い には 止 ま る。 こ の事 実 は30K蛋
図6.
TMV感
白 質mRNA,
合 成 は そ ろ って 増 大 す る。 この ピ ー クを 過
-図5.
TMV感
染 プ ロ トプ ラス ト中 の 蛋 白質 合 成^<42)>
TMV感
染 後, 各 時 間 プ ロ トプ ラス トを [^3H] ロイ シン で
パ ル ス 標 識 した の ち, 蛋 白 質 をSDS-PAGE,
フル オ ロ グ ラ
TMV感
染 後,
で パ ル ス 標 識 した のち,
フ ィー で 解 析 した 。
ィ ーに か け て 解 析 し た 。
白質 の tran
染 プ ロ トプ ラ ス ト中 のRNA合
成^<42)>
プ ロ トプ ラス トを 各 時 間, [^3H] ウ リジン
RNAをPAGE,
フル オ ロ グ ラ フ
219
32
蛋 白 質
sient synthesis
核 酸
酵 素
と よ く対 応 して お り, そ の制 御 が 転 写^*
Vol. 32
No. 3
(1987)
関与 して い る こ とが 明 らか に な った。
レベ ル で 行 な わ れ て い る こ とが 明 らか とな った 。
複 製 に 必 要 な マ イ ナ ス鎖RNAの
はRF-RNAの
合 成 は, こ の ゲ ル で
形 で 見 い だ され て い る と思 わ れ る。1本
鎖DNAプ
ロー ブ を 用 い た 別 の 解 析 で,
RNAの
弱 毒 ウ イ ル ス に お け る 遺伝 子 発 現
TMVト
マ ト系L株 か ら安 定 なL_<11>A株 と呼 ば れ る弱
マ イ ナ ス鎖
毒 株 が 得 られ て い る^<59)>。Lが
トマ トに感 染 す る と著 しい
合 成 が 特 に プ ラス鎖 の合 成 に先 立 つ とい うこ と
病 徴 を示 す の に対 し, L_<11>Aを単 独 に トマ トに 接 種 して
は な く, プ ラ ス鎖 ゲ ノムRNAに
対 して1/40∼1/100の
も無 病 徴 も し くは非 常 に 弱 い病 徴 を 示 す に と ど ま る
割 合 で, 感 染 の初 期 か ら後 期 ま で通 して合 成 さ れ て い
(L_<11>はLか らL_<11>Aへ至 る中 間 の 株 で あ り, 形 質 的 に は
る こ とが 明 らか と な った^<56)>。
した が って,
マ イ ナ ス鎖
L_<11>Aと変 わ ら な いが, 不 安 定 で, あ る 頻 度 で 強 毒株 に
合 成 比 は あ る一 定 の
戻 る も のが 出 て くる)。 なお, このL_<11>A株を トマ トに接
RNA,
ゲ ノ ムRNA,
CP mRNAの
種 して お い てや る と, あ とか らの 強毒 株 の 感 染 に 対 して
割 合 で感 染 を通 じて 合成 さ れ て い る と考 え られ る。
C.
サ ブ ゲ ノ ムRNAの
30K蛋
白質mRNAの
そ の トマ トは 抵 抗 性 を 示 す 。 こ の現 象 に cross-protec
転写開始部位
転 写 が なぜ transient な 制御 を
受 け る のか を 明 らか に す るた め, ま ず, そ の 転写 開始 部
位 を 決 定 し, そ の近 辺 の構 造 に こ の よ うな性 質 を反 映 す
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3.
tionと 呼 ばれ, 実 際 に温 室 栽 培 の トマ トにL_<11>Aを噴 霧
して, 果 実 の収 量 ・品質 の維 持 に応 用 され て い る。
L_<11>Aを植 物 体 に 接 種 した 場 合,
ウイ ル スの収 量 はL
る何 らか の特 微 が な い か を 調 べ た。 そ の結 果, 転 写 開始
の場 合 と比較 す る と1/5∼1/10に
部 位 はTMVRNAの3'末
ころ が, プ ロ トプ ラス トにL_<11>Aを感 染 させ た場 合 に は
端 か ら1558塩
基 目のGで
あ る こ とがわ か った^<57)>。
同 じ サ ブ ゲ ノ ムRNAで
CP
mRNAの
あ る
転 写 開 始 点^<58)>と
比 較 す る と, 図7の 中 で 四
角 に 囲 まれ る よ うな 配 列 の 相 同 性 (homology)
が見いだ
され た^<57)>。
この こ とか ら, 2つ のサ ブ ゲ ノ ムRNAの
合
と ど ま って い る^<60)>。
と
Lの 場 合 と同 等 の増 殖 を 示 す^<61)>。
この よ うなL_<11>Aの 増
殖 の 挙動 は 野 生株 で あ るL
(強毒 株 で も あ る) との どの
よ うな違 い に よっ て ひ き起 こされ る のだ ろ うか 。
L_<11>A,L_<11>の
ゲ ノ ムRNAの
一 次 構 造 を調 べ た 結 果,
成 が 転 写 酵 素 に よ る これ らの 配 列 の 認 識 に よ って 始 ま る
コー ドす る蛋 白質 の 中 で130K
こ と, さ らに両 者 の部 分 的 な違 い がCP
の 中 の ア ミノ酸配 列 に だ け ア ミノ酸 置 換 が起 き て い る こ
蛋 白質mRNAの
mRNAと30K
転 写 の 制 御 の違 い に 関 与 して い る こ と
以 上 の よ うに, TMVの
特 異 的 な 各RNAの
遺 伝 子 発 現 の制 御 に は, TMV
合 成 (複製 と転 写) の段 階 が 大 き く
図7.
30K蛋
白 質mRNAとCP mRNAの
L_<11>か
らL_<11>Aに 至 る段 階 で2つ の ア ミノ酸 置
換 を 起 こ してい た 。
こ の130K
(180K)
蛋 白質 の変 化 が 前 項 で 述 べ た各 種
転 写 開 始 部 位 の 配 列 の 比 較^<57)>
白抜 きのGか ら各 サ ブ ゲ ノ ムRNAの
転 写 が 開 始 さ れ る 。 下 線 の付 い たAUGは
ス トロン の 開 始 コ ドン, 数 字 は ゲ ノ ムRNAの3'末
端 か ら の 塩 基数 を示 す 。
各シ
* 本来, DNA遺
伝子か らmRNAへ
と遺伝情報が流れ る過程 をさすが, 本稿 では広義にとらえて, 遺伝子RNAか
で きる過程 も転写 と呼ぶ ことにす る。
220
蛋 白質
とが 明 らか とな った (図8)^<17,62)>。Lか
らL_<11>へ
至 る段 階
で1つ,
が 示 唆 され た。
(同時 に180K)
らmRNAが
植物RNAウ
イルス遺伝子 の発現 と複製過程
33
白質 の 合 成 が 低 下 した も の と解 釈 され,
130K
(180K)
蛋 白質 の サ ブ ゲ ノ ムRNA
の転 写 へ の 関 与 が 示 唆 され た 。 また, 30
K蛋 白 質 の 細 胞 間 転 移 とい う機 能 を 考 え
る と, 弱 毒株 は 個 々の 細 胞 で 常 に 増 殖 で
き る が, まわ りの 細 胞 へ 効 率 よ く広 が っ
て い け な い た め に ウ イル ス の 増 殖 が 阻 害
され, そ の 結 果, 病 徴 も弱 くな った もの
と考 え られ る。
III. in vitro
RNAの
1.
で の ウ イル ス
複 製 活 性 ・転 写 活 性
植 物 細 胞 が も っRNA合
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ウ イ ル スRNAの
TMVの
複製
複 製 機 構 を 研 究 す るた め に,
以 前 か らTMV感
homogenate
RNA合
成活性と
染植物 の 葉 を 材料 に
を 調 製 し, そ の 中 に あ る
成 活 性 を検 索 す る 試 み は な され
て き た^<64∼67)>。homogenate
に ゲ ノ ムRNA
を加 え, 新 た なRNA合
成 活 性 を と らえ
よ う と した が, 検 出 で きた もの は非 感 染
の植 物 中 に も見 い だ さ れ る活 性 か, 期 待
図8.
L,
L_<11>,
L_<11>Aの130K
(180K)
蛋 白質 内 の ア ミノ酸 変 化 と各 株
感 染 プ ロ トプ ラス トに お け る各 ウイ ル スRNAの
産 出量 の比 較^<63)>
上 部 に 各 シ ス トロン を 模 式 的 に 示 し, 各 株 間 で ア ミノ酸 変 化 の 起 こ った 箇 所
の み1文 字 表 記 で 示 した 。 各 株 感 染 プ ロ トプ ラス トお よび 非 感 染 プ ロ トプ ラス
ト (M)
RNAの
を [^<32>P]
正 リン酸 に よ って 感 染4∼8時
間 後 に 標 識 し, 各 ウイ ル ス
産 出 をS_1マ ッピン グの 要 領 で3'末 端 か ら 約2,200塩
基 の 長 さの1
本 鎖cDNAと
(M)
の ハ イ ブ リ ッ ドを 形 成 させ, 解 析 した 。(P)
は マ イ ナス 鎖 配 列 を も った 産 物 の 検 出。(M^*)
は (M)
は プ ラ ス鎖 配 列,
され る鋳 型 特 異性 を も た な い活 性 で あ っ
た 。TMVに
限 らず, 他 の植 物RNAウ
イ ル ス につ い て も, こ の よ うな時 代 が長
く続 き^<68∼71)>,
宿主が元来 もっているこの
RNA依
存 性RNAポ
リメ ラ ー ゼ (RdRp)
の長時間露光。
に よ って 植 物 ウ イ ル スが 複 製 す る と, 一
部 の研 究 者 が 主 張 した 時 代 が あ った 。 し
蛋 白質, RNAの
産 生 に どの よ うな 影響 を与 え て い るか
か し現在 で は, 分 節 ゲ ノ ム を もつ 植 物 ウ イル スの 場 合
を 調 べ るた め, L, L_<11>,
L_<11>A各株 を そ れ ぞ れ プ ロ トプ
に, ウイ ル ス 自身 の もつ遺 伝 子 が ゲ ノ ムRNAの
ラ ス トに感 染 させ て そ の合 成 パ タ ー ンを調 べ た。 蛋 白質
必 要 で あ る こ とが直 接 的 に 示 され^<34,35)>,
さ らにI節
の 合成 を パ ル ス標 識 で解 析 す る と, 130K,
コー
べ た よ うな異 な る植 物 ウイ ル ス 間 で 分 子量 の 大 きな 蛋 白
ト蛋 白質 の合 成 は各 株 の あ いだ で大 き な違 い は なか った
質 に ア ミノ酸 の相 同 性 が 見 い だ され た^<31,32,36)>こ
とで, こ
が, 30K蛋
の主 張 は否 定 され た 。
180K,
白質 の合 成 の み が 特 異 的 に, 弱 毒 化 す る に
つれ て合 成 量 が 少 な くな っ て い る こ とが 明 ら か と な っ
た^<63)>。RNAの 合 成 を 同様 に調 べ る と, 図8で
うに,
ゲ ノ ムRNA〔(+)
mRNAの
鎖,
(-)
示 す よ
鎖 と も に 〕, CP
合 成 には 株 間 で違 いが な い の に対 し, 30K蛋
白質mRNAの
合 成 のみ が 特 異 的 にL>L_<11>>L_<11>Aの順
複製に
で述
先 に見 いだ され た, 非 感染 植物 細 胞 内 に もあ るRNA
合 成 活 性 は, ウ イル ス の感 染 後,
ウイ ル ス の複 製 よ りか
な り遅 れ て増 大 す る。 しか も, そ のRNA産
物 も長 さ の
不 均一 な 低 分 子量 の も の で, ウ イ ル ス の複 製 へ の関 与 の
可 能 性 は 否 定 され た^<73)>。
現 在 では, む しろ植 物 側 の あ る
に落 ちて い く こ とが 明 らか とな った^<63)>。
つ ま り, 弱 毒株
種 の 防御 機 構 に 関 係 した 活 性 と考 え られ て い る。RNA
の130K
合 成 活 性 を研 究す る うえ で, 産 物 を 明 確 に 解 析 しな か っ
(180K)
蛋 白質mRNAの
蛋 白質 に起 きた ア ミノ酸 変 化 は30K
転 写量 を 減 少 させ, そ の結 果, 30K蛋
た こ とで事 態 が混 乱 した とい え るご。
221
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34
蛋 白 質
核 酸
酵 素
図9. in vitro
Vol. 32
No. 3
(1987)
で の 反 応 産 物 の 解 析^<72)>
非 感 染 とTMV感
染 プ ロ トプ ラス ト由 来 の 粗 破 砕 液 中 で のRNA産
物 を未 変 性 状 態 また は グ リオ キサ ル
に よる 変 性 を 施 した の ち に1.5%ア
ガ ロー ス ゲル で分 析 した 。1. 分 画 前, 2.2M
LiCl存 在 下 沈 殿 分 画,
3. 同 可 溶 性 分 画 。2M LiCl存 在 下 で は2本 鎖RNAは
可 溶 性 で あ り, TMV感
染 プ ロ トプ ラス トの破 砕
液 中 で の 反 応 物 にRFも
2.
TMV
含 まれ る こ とが わ か る。
RNAの in vitro
TMVの
合 成系
複 製 に 関 与 す るRNA合
筆 者 らはTMV感
成 活 性 を 調 べ るた め
染 プ ロ トプ ラ ス トを材 料 に選 ん だ 。 プ
ロ トプ ラス トを Dounce
型 の ホモ ジナ イザ ー で 破 砕 し,
粗 破 砕 液 を 得 た 。 こ の粗 破 砕 液 にRNAの
合成基質を加
え, 30℃
染 プ ロ トプ ラ
で15分
間 保 温 す る と, TMV感
ス ト特 異 的 なRNA合
成 活 性 が 認 め られ た^<72)>。
産物 を 未 変 性 状 態 で ア ガ ロー ス ゲ ル にか け て解 析 す る
と, ゲ ノ ムRNAよ
mediateRNA
り泳 動 度 の遅 い replicative inter
(RI-RNA)
と思 わ れ る幅 広 いバ ン ドを な
す 産 物 が 認 め られ た (図9)。RI-RNAと
RNAで
は複製中間体
あ っ て, 複 数 の合 成 途 中 のRNAが
鋳 型RNA
に結 合 した構 造 を した もの を い う。 実際 に, こ こ で見 い
だ され たRI-RNAに
高 イ オ ン強 度下 で の RNase
処理
を施 す と, 2本 鎖 のRF-RNAの
核 が 残 り, グ リオ キ サ
ル に よ る完 全 変 性 をRI-RNAに
施 す と, 多 くの nas
centなRNA産
物 の中 に ゲ ノ ム長 のRNAも
い る こ とが わ か っ た (図9)。
TMV
RNAを
含まれて
た だ し, この際,
外か ら
加 え て反 応 を行 なわ せ て も新 た な 活 性 の
図10.
TMV感
TMV感
染後 の時 間 と粗 破 砕 液 中の 活 性 と の関 係^<72)>
染 後, 時 間 を 追 って プ ロ トプ ラ ス トか ら粗 破 砕 液 を
調 製 し, 反 応 を 行 なわ せ, 未 変 性 の ま ま1.5%ア
で解 析 した 。
いRI-RNAの
ガ ロー ス ゲル
合 成 活 性 が感 染3時 間 ご ろか ら検 出 され
は じめ る (図10)。
る。 実 際 に in vivo
活 性 は感 染9時 間 後 に ピー クに達 す
でTMV
RNAの
合 成 の さか ん な時
期 に 活 性 が ピ ー クに 達 して い る こ とは,
このRI-RNA
上 昇 は 認 め られ ず, ここ で み て い る活 性 は, 内在 す る鋳
の合 成 活 性 が in vivo の 複製 を反 映 して い る こ とを裏 づ
型RNAを
け て い る。
も とに, す で に合 成 途 中 に あ った 反 応 の継 続
をみ て い る も の と考 え られ る。
TMV感
染 後, 時 間 を追 って プ ロ トプ ラス トの破 砕液
を調 製 し反 応 を 行 な わ せ る と, 感 染 直 後 に は認 め られ な
222
次 に, こ のRI-RNAの
TMV
11 (a)
RNAの
中 で 合 成 され て い る の は,
配 列 そ の も の で あ る こ とを 示 す 目的 で 図
の よ うなTMV
RNAのcDNAを
組み込んだ
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植物RNAウ
イルス遺 伝子の発現 と複製過程
図11. in vitro
で TMV
RNA,
サ ブゲ ノ ムRNA,
て い る こ との 証 明 (文 献72よ
り改変)
(a)
解 析 に 用 い たDNAプ
ロー ブ の 構 築, (b)
(-)
35
鎖 ゲ ノ ムRNAが
産出され
S_1耐 性 ハ イ ブ リ ッ ドの解 析 。 各 プ ロー ブDNAと
in vitro 合 成 系 の 産 物 とを ア ニール させ, S_1ヌ ク レア ー ゼ処 理 を施 し, (+) 鎖 配 列, (-) 鎖 配 列 を
も った 産 物 に 由 来 す る ハ イ ブ リ ッ ドを2.4%
PAGEに
か け て 解 析 した 。 バン ドの 由 来 を, 模 式 図 の番
号 と対 応 させ て示 した 。
鎖 特 異 的1本 鎖DNAプ
ロー ブ を作 製 し, ヒ の in vitro
反 応 産 物 とア ニ ー ル させ, S_1ヌ ク レア ーゼ処 理 を 施 し,
TMV
RNAの
配 列 を もっ たRNAと
では1/40∼1/100,
こ の in vitro の反 応 中 で は 約1/75〕
も明 らか とな った 。
プ ロ ー ブDNAと
以 上 の こ とは, こ の in vitro で のRNA合
の ハ イ ブ リ ッ ドを ゲル で 解 析 した 〔図11 (b)〕 。 そ の結
外 か ら加 え た ウイ ル スRNAを
果, TMVの
いが, in vivo
ゲ ノ ムRNAの5'末
端 か ら3'末 端 ま で合
鋳 型 とす る こ とは で きな
の状 態 を反 映 した 形 で ゲ ノ ムRNAの
成 され て い る こ と (た だ し, 5'末 端 由来 のバ ン ドが3'
製 反 応 とサ ブ ゲ ノ ムRNAの
末 端 由 来 の バ ン ドよ り濃 い こ とか ら, 現 在 の反 応 条 件 で
る ユ ニ ー クな活 性 で あ る こ とを 示 して い る。
は反 応 が不 完全 に終 わ っ て しま うも のが 多 い こ とを 示 し
て い る) お よび約700塩
基 の産 物, つ ま りCP
mRNA
も この反 応 の 中 で 合 成 さ れ て い る こ と (30K蛋
mRNAも
白質
合 成 され て い る こ とは 別 の 構 築 のcDNAプ
ロ ー ブ を用 いた 解 析 で 明 らか とな って い る) が 明 らか と
な った 。 また,
マ イナ ス鎖 ゲ ノ ムRNAの
合 成 も in
vivo で 実 際 に 合成 され る比 を反 映 して 含 まれ て い る こ
と 〔(+) 鎖 と (-) 鎖 ゲ ノ ムRNAの
合成 比 は in vivo
成 活性 は,
とこ ろ で, TMV
RNAの
複
転 写 の反 応 とを行 な っ て い
複 製, サ ブ ゲ ノムRNAの
転 写 は, 細 胞 内 の ど と で行 なわ れ て い るの だ ろ うか 。 プ
ロ トプ ラ ス トの粗 破 砕 液 を分 画 して , 2500×g,
g,
20000×gの
6500×
各 沈 殿 画 分 と可 溶 性 画 分 とに 分 け た場
合, こ の活 性 は お もに2500×g沈
殿 画 分 に見 い だ され る
こ とか ら, 何 らか の 大 きな 構 造 体 上 で これ らのRNA合
成 が 行 な わ れ て い る もの と考 え られ る。 こ の画 分 に は核
も存 在 し, TMVの
複 製 へ の 宿 主 の 因 子 の関 与 を考 え る
223
36
蛋 白 質
うえ で興 味 深 い事 実 で あ る。 な お,
X-100の
核 酸
酵 素
この 活 性 は Triton
よ うな界 面 活 性剤 を加 え る と見 い だ され な く
Vol. 32
BMV
No. 3
RNAを
(1987)
用 いた 実 験 で, RNAが
鋳 型 と して機 能 す
るた め の条 件 な ど が 調 べ られ て い る。 ゲ ノ ムRNAの
な る こ とか ら, 活 性 の 保 持 に は あ る種 の 膜 構 造 が必 要 で
3'末 端 はtRNAと
あ る と考 え られ る。 なお, 複 製 酵 素 の活 性 を担 うと考 え
るが, そ の構 造 を 改変 した際 の鋳 型 と して の活 性 を調 べ
られ る130K,
180K蛋
白質 も こ の画 分 に見 いだ され て
い る。 活 性 と の直 接 の関 連 を証 明す る には まだ 至 っ て い
な い が, 今 後 こ の系 を用 い てTMVの
複 製 と転 写 に関 与
す る因 子 の研 究 を 行 な って い く道 が 開 け た とい え よ う。
同 様 の ク ロ ーバ ー葉 様 の構 造 が 組 め
て^<77,78)>,
興 味 深 い実 験 デ ー タ を 出 して い る。 た とえ ば,
tRNAの
構 造 でDル
ー プに 対応 す る領 域 を 削 って も鋳 型
とな り得 る こ と, ゲ イ ムRNAの3'末
端134塩
基 の断
片 だ け で も鋳 型 とな る こ とが 明 らか に され て い る。
ま た, こ の活 性 は転 写 も行 な うこ とが で き, 人工 的 に
3.
CPMV
CPMVの
RNAの in vitro
合成系
作製 したRNA3の
感 染 葉 か ら得 られ た31000×g膜
宿 主 が 元 来 もつ RdRp
に 関 係 したRNA合
分 画 に は,
(前 々項 参 照) と ウ イ ル ス の複 製
成 活 性 とが 存 在 す る^<73)>。Dorssers
ら
は この 膜 分 画 をMg^<2+>を 含 ま な い緩 衝 液 で洗 うこ とに よ
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り, 宿 主 の RdRp
のTMVの
活 性 が 分離 し, 残 りの膜 分 画 に は前 項
場 合 と同 様 の, 内在 性 の鋳 型RNAに
た nascent RNAの
合 成 の継 続 に 由来 す る活 性 が 存 在 す
る こ とを示 した 。 この in vitro
B-RNA,
M-RNA
(表1参
合 成 さ れ る。Dorssers
X-100で
依存 し
マ イ ナ ス鎖RNAを
ブ ゲ ノ ムなRNA4を in vitro
加 え る こ とで サ
で de novo
る。 この こ とか ら, サ ブ ゲ ノムRNAの
の マ イ ナ ス鎖RNAの
に合成で き
合 成 が ゲ ノ ム長
内 部 か ら開 始 され るこ とが 直 接 的
に示 され た^<79)>。
なお, こ の活 性 を 担 う分 画 に は ウイ ル ス の コー ドす る
109K蛋
白質 (表1参 照) が 存 在 す るが^<75)>,
活 性 へ の関
与 は まだ 生 化 学 的 に 示 され てい な い 。
活 性 に よ りCPMVの
照) に対 応 す るRF-RNAが
らは さ ら に, この 活 性 を Triton
可 溶 化 し, セ フ ァ ロー ス2Bカ
ラム に よ る ゲ
お わ りに
分 子 生 物 学 的 手 法 の進 歩 に よ り一 次 構 造 か
らの情 報 が 得 られ,
プ ロ トプ ラ ス トヘの ウ イ ル スの 同
ル 濾 過, グ リセ ロ ー ル密 度 勾 配 遠 心 に よ る解 析 を 行 な
調 感 染 系 を 用 い た解 析 も行 なわ れ る よ う に な り, 植 物
い, 活 性 複 合 体 中 にCPMVが
RNAウ
(表1で
示 した208Kの
コー ドす る110K蛋
白質
ポ リペ プ チ ドが プ ロセ シ ング を
受 け て産 生 さ れ る) が あ る こ と, 宿 主 由 来 の68K,
57K
イル スの遺 伝 子 の発 現 と複 製 過 程 がか な り解 明
され て きた 。 植 物RNAウ
イ ル ス は共 通 して複 製 ・細 胞
間 転 移 ・遺 伝 子 保 護 とい った 機 能 を 担 う蛋 白質 を コー ド
の分 子 量 を もつ蛋 白質 も存 在 す る こ とを 示 した^<74)>。
この
す る が, 今 後 はcDNAか
実 験 に よ り, 直 接 的 に複 製 反 応 に宿 主 の RdRp
転 写 系 を用 い た reverse genetics
が関与
らの感 染 性 ウイ ル スRNAの
の 手 法 で,
これ らの
して い な い こ と, 複 製 活 性 に ウ イル ス由 来 の蛋 白質 が 関
蛋 白 質 の よ り細 か い機 能 が 明 らか に な っ て い くも の と思
与 して い る こ とが 示 され た 。 た だ し, 本 来110K蛋
わ れ る。 ま た, in vitro で の ウイ ル スRNAの
は110K→24K+87Kと
87K蛋
白質
合成系 を
さ らに プ ロセ シ ン グを 受 け^<51)>, 用 い た 研 究 に よ って, 複 製 ・転 写 活性 を担 う酵 素 のサ ブ
白質 が ポ リ メラ ー ゼ活 性 の コ ア ・サ ブ ユ ニ ッ ト
と考 え られ て い た だ け に, こ の活 性 分 画 に110K蛋
白
質 が 検 出 され た こ とに 関 して, さ らに細 か い検 討 を要 す
る も の と考 え られ る。
ユ ニ ッ ト構 造, 宿 主 因 子 の 関 与 の 有 無, そ してRNA側
の認 識 され る シ グ ナ ル配 列 な どが 明 らか に な る で あ ろ
う。
また 今 後,
ウイ ル ス の コ ー ドす る蛋 白質 の詳 細 な 機 能
の解 明 とな らん で, ウ イ ル ス と宿 主 との相 互 作 用 とい う
4
BMV
BMVの
RNAの in vitro
合成系
点 が 注 目 され る と思 われ る。TMVの
感 染 葉 を破 砕後, 膜 分 画 を dodecyl-β-D-mal
toside(界 面 活 性 剤 の一 種)
場 合, 30K蛋
白質
が か らん だ ウイ ル ス の細 胞 間転 移 の機 構, ウ イ ル ス の宿
に よる処 理^<75)>,
ミク ロ コ ッ
主 域 と病徴 の 問題, 植 物 側 の ウイ ル ス に対 す る抵 抗 性 の
カル ヌ ク レア ー ゼ に よる 内在 性 の鋳 型 の消 化^<76)>を
施 す
正体 な ど興 味深 い 問 題 が あ る。 これ らの問 題 も これ か ら
と, 外 か ら加 えたBMV
分 子 生 物 学 的 手 法 で 解 析 さ れ て い くで あ ろ う。
マ イ ナ ス鎖RNAの
外 のRNAに
RNAに
依 存 した, ゲ ノ ム長 の
合 成 が 認 め られ る。BMV
RNA以
対 して は反 応 しな い鋳 型 特 異 性 を示 す ユ ニ
ー クな活 性 で あ る。
こ の鋳 型 特 異 性 を 利 用 して, 現 在, 人 工 的 に 改変 した
224
ここで紹介 した筆者 らの研究は, 東大理学部生物化学科岡田
研究室で なされた ものであ る。共同実験者の方 々, ならびに本
稿 のこ校閲 もしていただいた 岡田吉美教授に感謝いた します。
植物RNAウ
イルス遺伝子 の発現 と複製過程
23)
文
Dasgupta,
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