本論文：

腎移植患者における内因性物質を指標とした降圧治療抵抗性および
薬物代謝能の評価に関する研究
Evaluation of Resistance to Antihypertensive Therapy and Drug
Metabolizing Capacity Using Endogenous Substances as Biomarker
in Kidney Transplant Recipients
平 成 25 年 度
論文博士申請者
鈴木
陽 介 （ Suzuki, Yosuke）
指導教員
岸野
吏志
1
目次
頁
【 緒 言 】 ......................................................................................................... 1
【第 1 章】
腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 mid-regional pro-adrenomedullin 濃
度 を 指 標 と し た 降 圧 治 療 抵 抗 性 の 評 価 ........................................................ 3
第1節
酵 素 免 疫 測 定 法 よ る 血 漿 中 mid-regional pro-adrenomedullin 濃 度 の
測 定 法 の 確 立 ................................................................................................. 3
1. 序 ............................................................................................................. 3
2. 方 法 .......................................................................................................... 5
2-1. 試 薬 .................................................................................................... 5
2-2. 対 象 .................................................................................................... 5
2-3. 0.05 M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) の 調 製 ............................................... 6
2-4. 0.15 M 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 の 調 製 ................................................. 6
2-5. 1 mM 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 の 調 製 ............................................... 6
2-6. Assay buffer の 調 製 ............................................................................. 6
2-7. Coating buffer の 調 製 ........................................................................... 7
2-8. Substrate buffer の 調 製 ........................................................................ 7
2-9. Washing buffer の 調 製 ......................................................................... 7
2-10. β-gal 標 識 prepropADM(83-94) の 調 製 ............................................. 7
2-11. 固 相 の 調 製 ........................................................................................ 8
2-12. 血 漿 サ ン プ ル の 前 処 理 ..................................................................... 8
2-13. 酵 素 免 疫 測 定 法 の 測 定 条 件 ............................................................. 9
2-14. 血 漿 サ ン プ ル の HPLC 分 析 ........................................................... 10
2-15. 統 計 解 析 ......................................................................................... 10
3. 結 果 ........................................................................................................ 11
i
4. 考 察 ....................................................................................................... 14
第2節
末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 推
移 .................................................................................................................. 16
1. 序 ........................................................................................................... 16
2. 方 法 . ....................................................................................................... 17
2-1. 対 象 .................................................................................................. 17
2-2. 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定 ...................................................... 17
2-3. 統 計 解 析 ........................................................................................... 17
3. 結 果 ....................................................................................................... 19
4. 考 察 ....................................................................................................... 22
第3節
安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 mid-regional pro-adrenomedullin
濃 度 を 指 標 と し た 降 圧 治 療 抵 抗 性 の 評 価 ................................................... 23
1. 序 ........................................................................................................... 23
2. 方 法 . ....................................................................................................... 24
2-1. 対 象 .................................................................................................. 24
2-2. 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定 ...................................................... 24
2-3. 降 圧 治 療 抵 抗 性 の 評 価 ..................................................................... 24
2-4. 統 計 解 析 ........................................................................................... 25
3. 結 果 ....................................................................................................... 26
4. 考 察 ....................................................................................................... 30
【 小 括 】 ....................................................................................................... 32
【第 2 章】
腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 4β-hydroxycholesterol 濃 度 を 指 標
と し た CYP3A 活 性 の 評 価 .......................................................................... 33
第 1 節
末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 4β-hydroxycholesterol
濃 度 の 推 移 ................................................................................................... 33
ii
1. 序 ........................................................................................................... 33
2. 方 法 . ....................................................................................................... 35
2-1. 試 薬 .................................................................................................. 35
2-2. 2 M ナ ト リ ウ ム メ ト キ シ ド 溶 液 の 調 製 ............................................ 35
2-3. 対 象 .................................................................................................. 35
2-4. 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 測 定 .............................................................. 36
2-5. 統 計 解 析 ........................................................................................... 38
3. 結 果 ....................................................................................................... 39
4. 考 察 ....................................................................................................... 42
第 2 節
安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 4β-hydroxycholesterol 濃 度 を 指
標 と し た CYP3A 活 性 の 変 動 要 因 の 探 索 .................................................... 45
1. 序 ........................................................................................................... 45
2. 方 法 . ....................................................................................................... 46
2-1. 対 象 .................................................................................................. 46
2-2. 16 μM p-エ チ ル フ ェ ノ ー ル 溶 液 の 調 製 ............................................ 46
2-3. 20 mM リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム お よ び 5 mM ヨ ウ 化 テ ト ラ ブ チ ル ア
ン モ ニ ウ ム 水 溶 液 の 調 製 ......................................................................... 46
2-4. 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 測 定 .............................................................. 47
2-5. 血 漿 中 3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 の 測 定 ........................................ 47
2-6. CYP3A5 遺 伝 子 多 型 解 析 .................................................................. 48
2-7. 統 計 解 析 ........................................................................................... 48
3. 結 果 ....................................................................................................... 50
4. 考 察 ....................................................................................................... 56
【 小 括 】 ....................................................................................................... 60
【 総 括 】 ....................................................................................................... 61
iii
【 謝 辞 】 ....................................................................................................... 62
【 掲 載 論 文 】 ............................................................................................... 63
【 参 考 文 献 】 ............................................................................................... 64
iv
【緒言】
近年、わが国における移植医療の発展はめざましく、多くの施設で臓器
移植が行われるようになった。中でも腎移植の治療成績は年々向上し、今
や定着した治療法となっている。しかし、腎移植患者の長期生存に伴い、
安定期における合併症が問題となっている。特に、内科系合併症のうち腎
移 植 後 高 血 圧 は 約 40～ 60%の 症 例 に 認 め ら れ る
1,2)
。そ の 原 因 と し て 、血 管
障害、グラフト腎実質障害、投与薬剤の副作用、水・ナトリウム貯留、自
律神経系バランス障害、内分泌・代謝障害などが報告されており、これら
の要因が互いに絡みあい複合的に高血圧が発症すると考えられている
1,3 )
。
血管障害では、腎動脈系の異常として、移植腎動脈の狭窄から腎血管性高
血 圧 が 生 じ る こ と が あ り 、 約 1～ 23％ の 症 例 に 認 め ら れ る
4)
。また、腎実
質内の動脈硬化もグラフト腎機能の低下に結びつき、高血圧が生じる原因
と な る 。移 植 腎 機 能 が 低 下 し て く る と レ ニ ン -ア ン ジ オ テ ン シ ン 系 の 亢 進 が
みられ、治療抵抗性の高血圧が出現するようになる。そのため、このよう
な症例では多くの種類の降圧剤の投与が余儀なくされ、臨床上大きな問題
となっている。一方、腎移植後は拒絶反応の予防目的に種々の免疫抑制剤
が投与されるが、これらが移植後高血圧を誘発することがある。副腎皮質
ス テ ロ イ ド は 水・ナ ト リ ウ ム 貯 留 を 引 き 起 こ し 、移 植 後 高 血 圧 を 誘 発 す る 。
カ ル シ ニ ュ ー リ ン 阻 害 薬 (CNI) は 、直 接 的 に 腎 あ る い は 全 身 血 管 系 の 収 縮
を惹起すると同時に、動脈硬化を促進し動脈壁の伸展性を奪うと報告され
ている
5)
。したがって、これらの薬剤の使用量が多く、血中濃度が高いほ
ど、高血圧発症率は高くなる
6)
。
このように、腎移植患者では降圧剤や免疫抑制剤等の種々の薬剤が投与
されるが、血圧管理の観点から、適切な剤数および用量を設定する必要が
1
ある。一方、これらの薬剤の多くは肝代謝型であるが、腎不全患者におけ
る腎排泄型薬剤の動態変化に基づいた投与量設計の指針は多く報告されて
いるのに対し、腎不全時の肝代謝型薬剤の体内動態は、通常変化がないも
のとみなし投与量を設定することが多い。しかし、医薬品の副作用発現の
危険因子を探索した多くの研究において、腎不全が独立した危険因子とし
て報告されており
7-9)
、肝 代 謝 型 薬 剤 で あ る ワ ル フ ァ リ ン や 、カ ル シ ウ ム 拮
抗薬や β 遮断薬などの心血管治療薬を対象とした研究においても、同様の
結果が報告されている
7)
。その原因として、腎不全時の肝代謝型薬剤の薬
物 動 態 の 変 化 が 想 定 さ れ る が 、近 年 、腎 機 能 障 害 が Cytochrome P450 (CYP)
の一部の分子種活性を低下させることが報告されている
10-18)
。腎 移 植 に よ
る腎機能の回復の程度は患者個々で異なるため、腎移植患者における薬物
代謝酵素の活性は、患者個々の腎機能に依存して大きく異なる可能性が考
えられる。そのため、それぞれにおける薬物代謝酵素の活性を評価するこ
とは、個々の腎移植患者に最適な薬物療法を行う上で重要である。
このような背景の中、本研究では、腎移植患者における降圧薬および免
疫抑制剤等の肝代謝型薬剤の最適な投与法の確立を目的として、内因性物
質を指標とした降圧治療抵抗性および薬物代謝能の個体差の要因解析を行
った。
2
【第 1 章】
腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 mid-regional pro-adrenomedullin
濃度を指標とした降圧治療抵抗性の評価
第1節
酵 素 免 疫 測 定 法 よ る 血 漿 中 mid-regional pro-adrenomedullin 濃 度 の
測定法の確立
1. 序
Adrenomedullin (ADM) は 、 ヒ ト 褐 色 細 胞 腫 か ら 同 定 さ れ た 52 個 の ア ミ
ノ酸からなるペプチドであり、肺、心臓、腎臓や血管内皮細胞など循環器
系 の 主 要 臓 器 で 産 生 さ れ る 。 ADM は 内 皮 細 胞 や 平 滑 筋 細 胞 に 存 在 す る
calcitonin receptor-like receptor (CRLR) に 結 合 す る こ と に よ り
19,20)
、血 管 拡
張 作 用 、腎 血 流 量 増 加 作 用 、免 疫 調 整 作 用 、殺 菌 作 用 な ど を 発 揮 す る
21-25)
。
そ の た め 、 血 漿 中 ADM 濃 度 の 測 定 は 、 循 環 器 疾 患 、 腎 疾 患 、 感 染 症 な ど
の診断や重症度判定に有用であると考えられる
液中での消失が非常に早く
28)
25-27)
。 し か し 、 ADM は 血
、臨 床 適 応 は 難 し い の が 実 状 で あ っ た 。ADM
は 、 そ の 前 駆 ペ プ チ ド で あ る prepro-adrenomedullin (preproADM) の フ ラ グ
メ ン ト [(preproADM(95-146)] で あ る が
21)
、 preproADM の プ ロ セ ッ シ ン グ
の 際 に 、 他 の フ ラ グ メ ン ト と し て 、 proadrenomedullin N-terminal 20 peptide
[PAMP; preproADM(22-41)]、 mid-regional pro-adrenomedullin [MR-proADM;
preproADM(45–92)] お よ び adrenotensin [preproADM(153-185)] が 産 生 さ れ
る
29-31)
(Fig. 1)。 こ の 中 で 、 MR-proADM は 、 血 液 中 で 高 い 安 定 性 を 有 し 、
生 成 さ れ る 物 質 量 が ADM と 同 等 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る
30)
。本節で
は 、 血 漿 中 ADM 濃 度 の 代 替 指 標 と し て MR-proADM 濃 度 の 有 用 性 を 考 慮
し、遅延添加法および二抗体固相法に基づいた酵素免疫測定法よる血漿中
MR-proADM 濃 度 の 測 定 法 の 確 立 を 試 み た 。
3
Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-GlnLys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-ProGln-Gly-Tyr-NH2
Adrenomedullin (ADM)
Signal
1
PAMP
22
MR-proADM
41 45
Adrenotensin
ADM
92 95
146 153
185
Prepro-adrenomedullin (preproADM)
Glu - Leu - Arg - Met - Ser - Ser - Ser - Tyr - Pro - Thr - Gly - Leu - Ala - Asp - Val - Lys - Ala - Gly - Pro Ala - Gln - Thr - Leu - Ile - Arg - Pro - Gln - Asp - Met - Lys - Gly - Ala - Ser - Arg - Ser - Pro - Glu - Asp Ser - Ser - Pro - Asp - Ala - Ala - Arg - Ile - Arg - Val
Mid-regional pro-adrenomedullin (MR-proADM)
Fig. 1
of
Sequence of prepro-adrenomedullin (preproADM) and structure
adrenomedullin
(ADM)
and
mid -regional
(MR-proADM)
4
pro-adrenomedullin
2. 方 法
2-1. 試 薬
MR-proADM お よ び PAMP は 、Phoenix Pharmaceuticals Inc. (CA, USA) よ
り 購 入 し た も の を 用 い た 。 ADM 、 ADM fragment (1–25) お よ び ADM
fragment (22–52) は 、 ペ プ チ ド 研 究 所 (大 阪 ) よ り 購 入 し た も の を 用 い た 。
PreproADM fragment (68–86) お よ び PreproADM fragment (83–94) は 、合 成
品 (東京薬科大学薬学部、病態生化学教室より提供) を使用した。
PreproADM(45–92) を 抗 原 と す る MR-proADM 抗 血 清
(T-4843) は 、
Peninsula Laboratories (California, USA) よ り 購 入 し た も の を 用 い た 。 ヤ ギ
抗 ウ サ ギ IgG (55641) は 、 ICN Pharmaceuticals (OH, USA) よ り 購 入 し た も
の を 用 い た 。 Bovine serum albumin (BSA) 、 polyoxyethylene sorbitan
monolaurate (Tween 20)、 N-(ε-maleimidocaproyloxy) (EMC)-succinimide お よ
び 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside (MUG) は 、 Sigma (MO, USA)
よ り 購 入 し た も の を 用 い た 。 β-D-galactosidase (β-Gal) は 、 Boerhinger
Mannheim (Mannheim, Germany) よ り 購 入 し た も の を 用 い た 。テ ト ラ ハ イ ド
ロ フ ラ ン は 、 ナ カ ラ イ テ ス ク (京 都 ) よ り 購 入 し た も の を 用 い た 。 メ タ ノ
ー ル (HPLC グ レ ー ド ) お よ び ア セ ト ニ ト リ ル (HPLC グ レ ー ド ) は 、 和 光
純 薬 工 業 (大 阪 ) よ り 購 入 し た も の を 用 い た 。 そ の 他 の 試 薬 は 、 全 て 特 級
グレードを用いた。
2-2. 対 象
6 名 の 健 常 人 (男 性 、 25-33 歳 ) お よ び 6 名 の 末 期 腎 不 全 患 者 (男 性 5 名
女 性 1 名 、29-63 歳 ) を 対 象 に 、血 漿 中 MR-proADM 濃 度 を 評 価 し た 。健 常
人 は 8、14 お よ び 22 時 に 、末 期 腎 不 全 患 者 は 8 時 に そ れ ぞ れ 採 血 を 行 っ た 。
血 液 は 、 エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 (EDTA)-2Na 入 り 真 空 採 血 管 に 採 取 し 、
5
採 血 後 30 分 以 内 に 1500×g、 4℃ に て 10 分 間 の 遠 心 分 離 を 行 っ た 後 に 血 漿
を 分 取 し 、測 定 時 ま で -40℃ に て 保 存 し た 。健 常 人 は 全 員 が 本 研 究 実 施 1 ヶ
月前から医薬品を服用しておらず、全ての末期腎不全患者は週に 3 回の頻
度で血液透析を行っており、心疾患および感染症は認められなかった。本
研究は大分大学医学部附属病院臨床研究審査委員会の承認を得ており、患
者からの文書による同意取得後に実施した。
2-3. 0.05 M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) の 調 製
リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム 2 水 和 物 15.6 g を 正 確 に 量 り 取 り 、超 純 水 に 溶
解 し て 全 量 を 1000 mL と し 、0.05 M リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 を 調 製
し た 。 リ ン 酸 水 素 二 ナ ト リ ウ ム 12 水 和 物 35.8 g を 正 確 に 量 り 取 り 、 超 純
水 に 溶 解 し て 全 量 を 1000 mL と し 、0.05 M リ ン 酸 水 素 二 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液
を 調 製 し た 。 こ れ ら を 混 合 し 、 pH メ ー タ ー を 用 い て 、 pH 7.0 の 0.05 M リ
ン酸緩衝液を調製した。
2-4. 0.15 M 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 の 調 製
塩 化 ナ ト リ ウ ム 87.6 g を 正 確 に 量 り 取 り 、超 純 水 に 溶 解 し て 全 量 を 1000
mL と し 、 0.15 M 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 を 調 製 し た 。
2-5. 1 mM 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 の 調 製
塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 10.2 g を 正 確 に 量 り 取 り 、超 純 水 に 溶 解 し て 全 量 を 100
mL と し 、 1 mM 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 を 調 製 し た 。
2-6. Assay buffer の 調 製
BSA 1.0 g お よ び 1 mM 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液 400 μL を 正 確 に 量 り 取
6
り 、 0.05 M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) に 溶 解 し て 全 量 を 100 mL と し 、 assay
buffer を 調 製 し た 。
2-7. Coating buffer の 調 製
0.05 M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) 100 mL お よ び 0.15 M 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶
液 20 mL を 正 確 に 量 り 取 り 、超 純 水 に 溶 解 し て 全 量 を 200 mL と し 、coating
buffer を 調 製 し た 。
2-8. Substrate buffer の 調 製
0.05 M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) 100 mL お よ び 1 mM 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム 水
溶 液 400 μL を 正 確 に 量 り 取 り 、 超 純 水 に 溶 解 し て 全 量 を 200 mL と し 、
substrate buffer を 調 製 し た 。
2-9. Washing buffer の 調 製
0.05 M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) 100 mL、0.15 M 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 100
mL お よ び Tween 20 500 μL を 正 確 に 量 り 取 り 、 超 純 水 に 溶 解 し て 全 量 を
1000 mL と し 、 washing buffer を 調 製 し た 。
2-10. β-gal 標 識 prepropADM(83-94) の 調 製
β-gal の prepropADM(83-94) へ の 標 識 は 、EMC-succinimide を 架 橋 試 薬 と
して用いて行った
32)
。prepropADM(83-94) 2mg を 0.05 M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH
7.0) 1 mL に 溶 解 し 、2 mg の EMC-succinimide を 含 む テ ト ラ ハ イ ド ロ フ ラ ン
溶 液 100 μL を 加 え 、 20 ℃ で 60 分 間 撹 拌 し 、 反 応 さ せ た 。 生 成 し た 粗
EMC-prepropADM(83-94) を 、Sephadex DG-25 カ ラ ム (1.5×50 cm) に 0.05 M
リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) を 移 動 相 と し て 展 開 し 、 紫 外 部 220 nm の 検 出
7
(UV-120、島 津 製 作 所 、京 都 ) に よ っ て 精 製 EMC-prepropADM(83-94) 画 分
を 得 た 。精 製 EMC-prepropADM(83-94) と β-gal 2 mg を 直 ち に 20℃ で 60 分
間 撹 拌 し 、 反 応 さ せ た 。 生 成 し た 粗 β-gal 標 識 prepropADM(83-94) を 、
Sephacryl S-300 カ ラ ム (1.5×52 cm) に 1 mM 塩 化 マ グ ネ シ ウ ム を 含 む 0.05
M リ ン 酸 緩 衝 液 (pH 7.0) を 移 動 相 と し て 展 開 し 、紫 外 部 220 nm の 検 出 に
よ っ て 精 製 β-gal 標 識 prepropADM(83-94) を 得 た 。 精 製 β-gal 標 識
prepropADM(83-94) 画 分 は 、assay buffer で 希 釈 し て 酵 素 標 識 抗 原 と し て 使
用した。
2-11. 固 相 の 調 製
結 合 型 /遊 離 型 分 離 は 、第 二 抗 体 固 相 化 マ イ ク ロ プ レ ー ト を 用 い て 行 っ た
(Fig. 2)。 マ イ ク ロ プ レ ー ト (Nunc-Immuno Module Maxisorp F8, InterMed,
Nunc Corp, Denmark) に 、 coating buffer で 希 釈 し た 第 二 抗 体 を 添 加 し 、 4℃
で 24 時 間 保 持 し 、 第 二 抗 体 を 非 特 異 的 に マ イ ク ロ プ レ ー ト に 吸 着 さ せ た 。
Coating buffer を 流 去 し 、 washing buffer で 4 回 洗 浄 、 続 い て 超 純 水 で 4 回
洗 浄 後 、 assay buffer を 200 mL 添 加 し 、 4℃ で 24 時 間 保 持 し て イ ム ノ プ レ
ートとした。
2-12. 血 漿 サ ン プ ル の 前 処 理
血 漿 200 μL に メ タ ノ ー ル 1 mL を 添 加 し 、撹 拌 後 、遠 心 分 離 (1500×g、4℃ 、
15 分 間 ) し た 。上 清 を 新 た な 試 験 管 に 分 取 し 、溶 液 中 の メ タ ノ ー ル を 減 圧
遠 心 分 離 機 (VC-960、 タ イ テ ッ ク 、 埼 玉 ) を 用 い て 除 去 し た 後 、 凍 結 乾 燥
(VA-300、 タ イ テ ッ ク 、 埼 玉 ) を 行 っ て 血 漿 サ ン プ ル の 残 渣 乾 固 体 を 得 た 。
前 処 理 サ ン プ ル は 測 定 ま で -40℃ で 保 存 し た 。
8
+
Antigen
First antibody
E
Enzyme labeled
antigen
E
Insolubilized second
antibody
E
Substrate
E
Fluorescence
Fig. 2
Diagram of enzyme immunoassay for quantifying mid -regional
proadrenomedullin (MR-proADM)
2-13. 酵 素 免 疫 測 定 法 の 測 定 条 件
本酵素免疫測定法では、抗体と非標識抗原を反応させた後に酵素標識抗
原 を 追 加 す る 遅 延 添 加 法 を 採 用 し た (Fig. 2)。試 験 管 内 で 、試 料 (血 漿 前 処
理 サ ン プ ル お よ び MR-proADM 標 品 ) を assay buffer 100 μL で 溶 解 し 、assay
buffer で 希 釈 し た 第 一 抗 体 抗 血 清 (T-4843) 100 μL を 加 え 、4℃ で 24 時 間 反
応 さ せ た 。 こ の 反 応 液 に 、 assay buffer で 希 釈 し た β-gal 標 識
prepropADM(83-94) 50 μL を 添 加 し て 、 さ ら に 4℃ で 24 時 間 反 応 さ せ た 。
続 い て イ ム ノ プ レ ー ト に 反 応 液 100 μL を 添 加 し 、4℃ で 12 時 間 保 持 、反 応
さ せ た 。反 応 液 を 除 去 後 、washing buffer で 4 回 洗 浄 し 、続 い て 超 純 水 で 4
回 洗 浄 後 、 substrate buffer に 溶 解 し た 0.1 mM MUG 200 μL を 加 え 、 37℃ で
3 時 間 反 応 さ せ た 。 最 後 に 、 β-gal に よ り 生 成 し た 4-methylumbelliferon の
蛍 光 強 度 (励 起 波 長 360 nm、蛍 光 波 長 450 nm) を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ
ー (SH-9000、 コ ロ ナ 電 気 、 茨 城 ) を 用 い て 測 定 し た 。
9
2-14. 血 漿 サ ン プ ル の HPLC 分 析
ヒ ト 血 漿 中 に 存 在 す る MR-proADM の 分 子 形 態 に つ い て 、 高 速 液 体 ク ロ
マ ト グ ラ フ ィ ー (HPLC) (Alliance model e2695、Waters、 MA, USA) を 用 い
て 検 討 し た 。カ ラ ム は 、Cosmosil 5C18 (ナ カ ラ イ テ ス ク 、京 都 ) を 用 い た 。
0.1%ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 (TFA) で 緩 衝 化 し た カ ラ ム に 、 初 期 組 成 の 移 動 相
(0.1%TFA : CH 3 CN = 95 : 5, v/v%) で 溶 解 さ せ た ヒ ト 血 漿 前 処 理 サ ン プ ル お
よ び MR-proADM 標 品 (10 μg) を 注 入 し た 。 MR-proADM の 溶 出 は 、
0.1%TFA 存 在 下 で ア セ ト ニ ト リ ル に よ る 濃 度 勾 配 法 (5-55%) で 行 い 、紫 外
部 220 nm で 検 出 し た 。 流 速 は 、 1.0 mL/min、 画 分 容 量 は 1.0 mL と し た 。
各 画 分 は 、減 圧 遠 心 分 離 機 を 用 い て 溶 液 中 の ア セ ト ニ ト リ ル を 除 去 し た 後 、
凍結乾燥を行い、残差乾固体を酵素免疫測定法に供した。
2-15. 統 計 解 析
血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 日 内 変 動 の 比 較 に は Tukey–Kramer の 多 重 比
較 検 定 を 、 健 常 人 と 末 期 腎 不 全 患 者 の 比 較 に は Welch の t 検 定 を 用 い た 。
統 計 解 析 に は 、 PASW Statistics version 18 (SPSS Inc., IL, USA) を 用 い た 。
デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 表 し 、 有 意 水 準 は p < 0.05 と し た 。
10
3. 結 果
Fig. 3 に MR-proADM の 標 準 曲 線 を 示 す 。標 準 曲 線 は 、MR-proADM 濃 度
が 0.16-10 nmol/L の 範 囲 内 で 直 線 性 を 示 し 、 酵 素 標 識 抗 原 と し て 用 い た
preproADM(83-94) を 除 き 、 他 の preproADM fragment と 交 差 反 応 性 は 認 め
ら れ な か っ た 。 定 量 限 界 は 0.08 nmol/L で あ り 、 標 準 曲 線 の IC 50 は 0.87
nmol/L で あ っ た 。 0.2 お よ び 2.0 nmol/L の MR-proADM を 含 有 す る 血 漿 サ
ン プ ル を 用 い て 回 収 率 を 評 価 し た 結 果 、 そ れ ぞ れ 99.4 ± 7.1 お よ び 97.5 ±
2.8%で あ っ た (n = 6)。 同 様 に 、 日 内 変 動 係 数 は そ れ ぞ れ 10.8 お よ び 8.8%
(n = 6)、 日 間 変 動 係 数 は そ れ ぞ れ 3.9 お よ び 7.8% (n = 6) で あ っ た 。
Enzyme activity
(fluorescence intensity % of maximum)
100
90
80
MR-proADM (●)
70
PreproADM(68-86) (●)
60
PreproADM(83-94) (
50
Proadrenomedullin N-terminal
20 peptide (PAMP) (■)
40
)
Adrenomedullin (ADM) (+)
30
ADM(1-25) ( )
20
ADM(22-52) (×)
10
0
0.001
Fig.
3
0.1
10
Concentration (nmol/L)
Displacement
curves
of
1000
mid-regional
proadrenomedullin
(MR-proADM) and other adrenomedullin-related peptides
HPLC 分 析 に よ る 溶 出 パ タ ー ン を Fig. 4 に 示 す 。 ヒ ト 血 漿 中 の
MR-proADM 様 免 疫 活 性 の 最 大 ピ ー ク は fraction 番 号 33 で 認 め ら れ 、 こ れ
は 対 照 と し て 同 条 件 で 注 入 し た MR-proADM の 標 品 の 保 持 時 間 と 一 致 し た 。
11
MR-proADM
70
60
55
50
45
50
40
35
40
30
30
25
20
20
Acetonitrile (%)
MR-proADM (pmol/well)
60
15
10
10
5
0
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59
Fraction number
Fig.
4
HPLC
elution
profile
of
immunoreactive
mid -regional
proadrenomedullin (MR-proADM) in human plasma
Synthetic MR-proADM was run separately under the sa me condition (indicated by the arrow)
健 常 人 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 日 内 変 動 を Fig. 5 に 示 す 。 血
漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、8:00、14:00、22:00 に お い て そ れ ぞ れ 、0.19 ± 0.07、
0.20 ± 0.08、 0.16 ± 0.05 nmol/L で あ り 、 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 Fig. 6
に 健 常 人 と 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 を 示 す 。 健 常
人 お よ び 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は そ れ ぞ れ 、0.19
± 0.07 お よ び 1.39 ± 0.50 nmol/L で あ り 、 両 群 間 に 有 意 差 が 認 め ら れ た 。
12
0.3
(nmol/L)
Plasma MR-proADM level
0.4
0.2
0.1
0.0
morning
Fig.
5
Circadian
profiles
afternoon
of
plasma
night
levels
of
midregional
proadrenomedullin (MR-proADM) in six healthy subjects
p = 0.022
2.0
(nmol/L)
Plasma MR-proADM level
2.5
1.5
1.0
0.5
0.0
healthy subjects
Fig. 6
end-stage renal disease
Plasma mid-regional proadrenomedullin (MR-proADM) levels at
8:00 in 6 healthy subjects and 6 patients with end -stage renal disease
Each bar indicates the mean values.
13
4. 考 察
血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定 法 と し て 、 過 去 に 唯 一 、 発 光 免 疫 測 定 法
が報告されている
33)
。こ の 方 法 は 測 定 の た め に 専 用 の 機 器 が 必 要 と な る が 、
本機器は本邦の薬事法で認可されていないため、輸入が困難であるのが現
状 で あ っ た 。 そ こ で 、 本 節 で は 、 簡 便 か つ 高 感 度 な 血 漿 中 MR-proADM 濃
度の測定法を開発することを目的に、酵素免疫測定法よる血漿中
MR-proADM 濃 度 の 測 定 法 の 確 立 を 検 討 し た 。 本 測 定 法 で は 、 抗 体 と 非 標
識抗原とを反応させた後に標識抗原を追加する遅延添加法を採用すること
で 、 測 定 感 度 の 向 上 を 図 っ た 。 抗 体 結 合 型 の 標 識 体 (bound; B 型 ) と 遊 離
標 識 体 (free; F 型 ) の 分 離 は 、 第 二 抗 体 固 相 化 マ イ ク ロ プ レ ー ト を 用 い た
二抗体固相法により行った。二抗体法は、蛋白質抗原やペプチドホルモン
の 免 疫 測 定 に 最 適 と さ れ る B/F 分 離 法 で あ る 。 固 相 法 の B/F 分 離 は 、 遠 心
分 離 を 必 要 と せ ず 、 洗 浄 操 作 の み で B/F 分 離 が 完 了 す る た め 、 液 相 法 と 比
較して操作が簡便であり汎用性が高い。加えてマイクロプレートを用いる
ことにより、多数の検体を短時間で処理することが可能となった。
本 測 定 法 の 定 量 限 界 は 0.08 nmol/L で あ り 、 Morgenthaler ら の 報 告
33)
の
0.12 nmol/L に 比 べ 高 感 度 で あ っ た 。 ま た 、 preproADM(83-94) を 除 い た 他
の preproADM fragment と 交 差 反 応 性 が 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、本 測 定
法 で 使 用 し た MR-proADM 抗 血 清 (T-4843) は 、MR-proADM に 対 す る 高 い
選 択 性 を 有 す る と と も に 、 MR-proADM の C 末 端 側 を 認 識 す る と 考 え ら れ
た。血漿サンプルの前処理法としてメタノールによる除タンパク法を採用
し た 結 果 、高 い 回 収 率 が 得 ら れ た 。ま た 、日 内 変 動・日 間 変 動 は と も に 10.8%
以下であり、高い再現性が認められた。
血 漿 中 に お け る MR-proADM は 、抗 凝 固 剤 の 種 類 (EDTA、ヘ パ リ ン 、ク
エ ン 酸 塩 ) に 関 わ ら ず 、 室 温 で 72 時 間 、 4℃ で 14 日 間 、 -20℃ で 尐 な く と
14
も 1 年間安定であることが報告されている
33)
。本 研 究 で は 、抗 凝 固 剤 と し
て EDTA-2Na を 使 用 し 、 血 液 サ ン プ ル は 採 血 後 30 分 以 内 に 遠 心 分 離 を 行
っ た 後 に 血 漿 を 分 取 し 、測 定 時 ま で -40℃ に て 保 存 し た 。そ の た め 、本 研 究
で は 採 血 後 か ら 測 定 完 了 時 ま で 、 血 漿 中 MR-proADM の 高 い 安 定 性 を 確 保
出 来 て い た と 考 え ら れ る 。 Fig. 5 に 示 す と お り 、 血 漿 中 MR-proADM 濃 度
に 大 き な 日 内 変 動 は 認 め ら れ ず 、こ の 結 果 は Morgenthaler ら の 報 告
33)
と一
致 し て い た 。 こ の こ と か ら 、 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 を 測 定 す る 際 は 、 採
血ポイントを固定させる必要性は尐ないことが示唆された。また、末期腎
不 全 患 者 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 健 常 人 と 比 較 し て 有 意 に 高 値
であり、過去の報告
34-36)
と同様の傾向が認められた。これらの結果から、
今回確立した酵素免疫測定法は、正常および病態時における血漿中
MR-proADM 濃 度 の 評 価 に 応 用 可 能 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。
本 節 で 、 酵 素 免 疫 測 定 法 よ る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定 法 を 確 立 し
た 。 本 測 定 法 は 、 臨 床 で の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 評 価 に 有 用 で あ る と
確信する。
15
第2節
末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の
推移
1. 序
ADM は 腎 血 流 量 増 加 作 用 を 有 し て お り 、慢 性 腎 不 全 の 代 償 機 構 の 中 心 的
役割を果たす
25)
。 血 漿 中 ADM 濃 度 は 初 期 の 慢 性 腎 不 全 時 か ら 上 昇 し て お
り、腎不全の進行の予測因子となることが報告されている
25,34)
。
MR-proADM に つ い て も 同 様 に 、 慢 性 腎 不 全 患 者 に お い て そ の 血 漿 中 濃 度
が上昇しており
34-36)
、 ADM の 代 替 指 標 と な る こ と が 考 え ら れ る 。 一 方 、
腎移植術は末期腎不全患者の腎機能を著しく改善させるが、それによる血
漿 中 MR-proADM 濃 度 へ の 影 響 に つ い て は 分 か っ て い な い 。 そ こ で 本 節 で
は 、 腎 機 能 の 改 善 が 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 に お よ ぼ す 影 響 を 明 ら か と す
る た め に 、 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の
経時的な変化を評価した。
16
2. 方 法
2-1. 対 象
2011 年 1 月 か ら 2012 年 11 月 の 間 に 、大 分 大 学 医 学 部 附 属 病 院 腎 臓 外 科・
泌尿器科で、腎移植術を行う末期腎不全患者を対象とした。全症例におい
て 、腎 移 植 を 行 う 前 ま で 、週 3 回 の 頻 度 で 血 液 透 析 が 行 わ れ て い た 。ま た 、
免疫抑制療法として、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチルおよび
メチルプレドニゾロンの 3 剤併用療法が行われ、腎移植直前および移植後
4 日 目 に 、 バ シ リ キ シ マ ブ の 追 加 投 与 が 行 わ れ た 。 血 漿 中 MR-proADM 濃
度 測 定 の た め の 採 血 は 、腎 移 植 前 お よ び 移 植 後 3、7、10、14、21、30、60、
90 日 後 の 午 前 に 行 っ た 。 血 液 は 、 EDTA-2Na 入 り 真 空 採 血 管 に 採 取 し た 。
血 液 検 体 は 、1500×g、4℃ に て 10 分 間 の 遠 心 分 離 を 行 っ た 後 に 血 漿 を 分 取
し 、測 定 時 ま で -40℃ に て 保 存 し た 。血 液 生 化 学 検 査 は 、大 分 大 学 医 学 部 附
属 病 院 検 査 部 に て 行 っ た 。 ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス は 、 Cockcroft-Gault
の式
35)
に て 算 出 し た 。 腎 移 植 後 90 日 目 ま で に 、 拒 絶 反 応 ま た は 感 染 症 が
認められた症例は解析から除外した。本研究は大分大学医学部附属病院臨
床研究審査委員会の承認を得ており、患者からの文書による同意取得後に
実施した。
2-2. 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定
血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定 は 、 前 節 で 確 立 し た 酵 素 免 疫 測 定 法 に て
行った。
2-3. 統 計 解 析
腎 移 植 前 後 の 患 者 背 景 お よ び 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 比 較 に は Dunnet
の 多 重 比 較 検 定 を 用 い た 。 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 変 動 要 因 の 探 索 は 、
17
重 回 帰 分 析 に て 行 っ た 。統 計 解 析 に は 、PASW Statistics version 18 (SPSS Inc.,
IL, USA) お よ び R software version 2.14.2 (http://www.r-project.org) を 用 い
た 。 デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 表 し 、 有 意 水 準 は p < 0.05 と し た 。
18
3. 結 果
12 名 の 患 者 が 本 研 究 へ の 参 加 に 同 意 し た 。そ の う ち 1 名 の 患 者 に お い て
移植後に拒絶反応が認められたため、解析対象から除外した。腎移植前お
よ び 移 植 後 30、90 日 に お け る 11 名 の 患 者 背 景 を Table 1 に 示 す 。収 縮 期 血
圧 、拡 張 期 血 圧 お よ び 血 中 尿 素 窒 素 は 、腎 移 植 前 と 比 べ 、移 植 後 30 お よ び
90 日 に 有 意 に 低 下 し て い た 。
Table 1
Characteristics of patients in the study
Before
transplantation
30 days after
transplantation
90 days after
transplantation
No. of patients
11
11
11
Males / females
8/3
8/3
8/3
Characteristic
Cause of kidney disease
Glomerulonephritis
6
Immunoglobulin A nephropathy
1
Thin basement membrane disease
1
Unknown nephritis
3
Age (year)
45.1 ± 12.2
[24-66]
Body weight (kg)
61.0 ± 12.7
[44.7-83.1]
57.1 ± 11.8
[42.4-75.4]
57.2 ± 11.2
[43.6-73.4]
Systolic blood pressure (mmHg)
144.4 ± 14.3
[127-172]
122.4 ± 13.6 †
[96-149]
120.5 ± 10.8 †
[101-134]
Diastolic blood pressure (mmHg)
90.5 ± 11.1
[74-106]
75.6 ± 9.5 †
[63-90]
75.5 ± 7.7 †
[61-88]
Number of antihypertensive drugs
1.8 ± 1.5
[0-5]
1.3 ± 0.8
[0-3]
1.5 ± 0.9
[0-3]
White blood cell count (/μL)
6853 ± 2248
[3290-9860]
6211 ± 1829
[2810-8630]
5630 ± 1974
[2680-8820]
Hemoglobin (g/dL)
12.1 ± 1.7
[10.5-16.1]
10.6 ± 1.4
[8.5-13.9]
10.8 ± 1.7
[8.2-14.1]
C-reactive protein (mg/dL)
0.06 ± 0.05
[0.01-0.18]
0.10 ± 0.11
[0.01-0.37]
0.11 ± 0.12
[0.01-0.29]
Blood urea nitrogen (mg/dL)
48.7 ± 23.8
[26.3-100.7]
21.5 ± 4.0 †
[12.7-26.2]
23.3 ± 7.1 †
[13.3-37.5]
Data are expressed as numbers, or mean ± S.D. [Range].
†p < 0.01, vs. before kidney transplantation.
19
腎 移 植 後 の ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス お よ び 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の
推 移 を Fig. 7 お よ び 8 に 示 す 。ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス は 移 植 前 と 比 べ 、
移植後 3 日目以降に有意に上昇し、移植後 7 日目以降はおおよそ一定の値
で 推 移 し た 。 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 移 植 前 と 比 べ 、 移 植 後 3 日 目 以 降
に有意に低値を示し、移植後 7 日目以降はおおよそ一定の値で推移した。
血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 変 動 要 因 を 明 ら か に す る た め に 、 ク レ ア チ ニ ン
クリアランスおよび各種患者背景を対象に重回帰分析を行った結果、クレ
ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス が 唯 一 有 意 な 説 明 因 子 と し て 抽 出 さ れ た (Table 2)。
Creatinine clearance (mL/min)
70
60
† †
†
†
50
†
†
†
†
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Day after kidney transplantation
Fig. 7
Change in creatinine clearance over time after living kidney
transplantation
Data are expressed as means ± SD, n = 11. † p < 0.01, vs. before kidney transplantation
20
Plasma MR-proADM-IS level
(nmol/L)
2.0
1.6
1.2
0.8
†
† †
0.4
†
†
†
†
†
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Day after kidney transplantation
Fig.
8
Change
in
plasma
mid-regional
proadrenomedullin
(MR-proADM) level over time after living kidney transplantation
Data are expressed as means ± SD, n = 11. † p < 0.01, vs. before kidney transplantation
Table 2
Multiple regression analysis of factors associated with plasma
mid-regional proadrenomedullin (MR-proADM) level
Explanatory variable
Creatinine clearance (mL/min)
21
Partial r²
p value
Partial
regression
coefficient
0.57
< 0.0001
-0.017
4. 考 察
本 節 で は 、 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度
推 移 を 評 価 し た 。 腎 移 植 に よ る 腎 機 能 の 回 復 が 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 に
およぼす影響を正確に評価するために、本研究では腎機能の低下をもたら
す 拒 絶 反 応 の 出 現 を 除 外 基 準 と し て 定 め た 。 ま た 、 血 漿 中 MR-proADM 濃
度は細菌感染
38-41)
およびウイルス感染
42)
により上昇することが報告され
ているため、感染症の発現についても同様の扱いとした。
本 研 究 の 末 期 腎 不 全 患 者 の 腎 移 植 前 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、 前 節
で の 健 常 人 に 比 べ 高 値 で あ り (1.17 ± 0.44 vs. 0.19 ± 0.07 nmol/L)、過 去 の 報
告と同様の結果であった
34-36)
。ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス は 腎 移 植 後 に 急
激 に 上 昇 し た こ と か ら (Fig. 7)、 本 研 究 の 対 象 症 例 に お け る 腎 移 植 術 は 成
功 し た と 考 え ら れ た 。 腎 移 植 後 3 日 目 か ら 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 急 激
に 低 下 し た こ と か ら 、 腎 移 植 に よ る 腎 機 能 の 改 善 は 、 血 漿 中 MR-proADM
濃度を低下させることが初めて明らかになった。また、重回帰分析の結果
(Table 2) か ら 、腎 移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、腎 機 能 に 強 く 依 存
す る こ と が 示 さ れ た 。 腎 移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 急 激 な 減 尐 に
つ い て 、 推 察 さ れ る 機 序 と し て 、 腎 移 植 後 の 腎 血 流 量 増 加 に よ る ADM 分
泌 の 低 下 に 伴 う MR-proADM 産 生 の 低 下 が 考 え ら れ る 。 ま た 、 移 植 腎 に よ
る MR-proADM の 尿 中 排 泄 の 促 進 も 考 え ら れ る が 、 MR-proADM の 体 内 か
らの消失機序は分かっておらず、詳細は不明である。今後、腎移植後の血
漿 中 ADM 濃 度 お よ び 尿 中 MR-proADM 濃 度 の 推 移 を 評 価 す る こ と に よ り 、
機序の解明につながるエビデンスを構築することが望まれる。
本 節 に よ り 、 腎 移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 推 移 が 明 ら か と な っ
た 。 こ の 結 果 は 、 腎 移 植 後 の 患 者 を 対 象 に 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 を 指 標
とした研究を行う際に、有益な情報をもたらすと考えられる。
22
第3節
安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 mid-regional pro-adrenomedullin
濃度を指標とした降圧治療抵抗性の評価
1. 序
安 定 期 腎 移 植 患 者 に お い て 、腎 移 植 後 高 血 圧 は 約 40～ 60%の 症 例 に 認 め
られ
1,2)
、多 く の 患 者 で 降 圧 剤 に よ る 薬 物 療 法 が 行 わ れ る 。し か し 、一 部 の
患者では治療抵抗性の高血圧が出現し、多くの 種類の降圧剤の投与が余儀
なくされ、臨床上大きな問題となっている。一方、前述のとおり、血漿中
ADM 濃 度 は 初 期 の 慢 性 腎 不 全 時 か ら 上 昇 し て お り 、腎 不 全 の 進 行 の 予 測 因
子となることが報告されている
ていることから
21)
25,34)
。 ま た 、 ADM は 血 管 拡 張 作 用 を 有 し
、高血圧の進行に密接な関係があることが推察される。
実際に、血圧が正常である健常人を対象に、その後の高血圧症の発症の有
無 を 追 跡 調 査 し た 前 向 き 研 究 に よ る と 、 初 期 の 血 漿 中 ADM 濃 度 が 高 値 で
ある場合、その後の高血圧症の発症率が有意に高くなることが報告されて
いる
43)
。 し た が っ て 、 血 漿 中 ADM 濃 度 は 、 降 圧 治 療 を 行 う 上 で の 降 圧 治
療 抵 抗 性 の 予 知 マ ー カ ー と な る 可 能 性 が あ る 。そ こ で 本 節 で は 、ADM の 代
替 指 標 と し て MR-proADM を 用 い て 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 の 血 漿 中
MR-proADM 濃 度 を 測 定 し 、 降 圧 治 療 抵 抗 性 と の 関 連 性 を 検 討 し た 。
23
2. 方 法
2-1. 対 象
腎 移 植 後 90 日 以 上 経 過 し て お り 、降 圧 治 療 に よ り 収 縮 期 血 圧 お よ び 拡 張
期 血 圧 が 、 そ れ ぞ れ 130 お よ び 80 mmHg 以 下 に コ ン ト ロ ー ル 出 来 て い る
安 定 期 腎 移 植 患 者 46 名 を 対 象 と し た 。透 析 を 行 っ て い る 患 者 、心 不 全 な ど
の心疾患および感染症を有する患者は除外した。大分大学医学部附属病院
腎臓外科・泌尿器科の外来受診日の午前中に採血を行った。血液は、
EDTA-2Na 入 り 真 空 採 血 管 に 採 取 し 、 1500×g、 4℃ に て 10 分 間 の 遠 心 分 離
を 行 っ た 後 に 血 漿 を 分 取 し 、測 定 時 ま で -40℃ に て 保 存 し た 。血 液 生 化 学 検
査は、大分大学医学部附属病院検査部にて行った。クレアチニンクリアラ
ン ス は 、Cockcroft-Gault の 式
37)
に て 算 出 し た 。本 研 究 は 大 分 大 学 医 学 部 附
属病院臨床研究審査委員会の承認を得ており、患者からの文書による同意
取得後に実施した。
2-2. 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定
血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定 は 、 第 1 節 で 確 立 し た 酵 素 免 疫 測 定 法 に
て行った。
2-3. 降 圧 治 療 抵 抗 性 の 評 価
本 研 究 で は 、降 圧 治 療 抵 抗 性 の 指 標 と し て 、Treatment Intensity Score (TIS)
を用いた
44)
。す な わ ち 、各 患 者 が 服 用 す る そ れ ぞ れ の 降 圧 剤 の 一 日 当 た り
の 投 与 量 を 、1 日 最 大 投 与 量 で 除 し た 値 の 総 和 を TIS と し た 。1 日 最 大 投 与
量 は 、2013 年 6 月 の Monthly Prescribing Reference (http://www.empr.com) に
従った。
24
2-4. 統 計 解 析
2 変量の相関性の検定には、スピアマンの順位相関係数の有意性検定を
用 い た 。TIS の 変 動 要 因 の 探 索 は 、重 回 帰 分 析 に て 行 っ た 。統 計 解 析 に は 、
PASW Statistics version 18 (SPSS Inc., IL, USA) お よ び R software version
2.14.2 (http://www.r-project.org) を 用 い た 。 デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で
表 し 、 有 意 水 準 は p < 0.05 と し た 。
25
3. 結 果
患 者 背 景 を Table 3 に 示 す 。 37 名 の 患 者 に お い て 、 腎 機 能 障 害 が 認 め ら
れ た (ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス < 60 mL/min)。 降 圧 薬 は 、 カ ル シ ウ ム 拮
抗 薬 、ア ン ジ オ テ ン シ ン 変 換 酵 素 阻 害 薬 、ア ン ジ オ テ ン シ ン II 受 容 体 拮 抗
薬 、β 遮 断 薬 、ル ー プ 利 尿 薬 が 使 用 さ れ て お り 、TIS は 患 者 間 で ば ら つ き が
認 め ら れ た (0.95 ± 0.77; range, 0-2.90)。
Table 3
Characteristics of patients in the stud y
Characteristic
Value
Males / females
26/20
Age (year)
47.0 ± 13.9 [16-74]
BMI (kg/m2 )
Duration after kidney transplantation (day)
20.6 ± 2.3 [14.6-26.7]
Systolic blood pressure (mmHg)
115.9 ± 9.0 [92-130]
Diastolic blood pressure (mmHg)
69.7 ± 7.9 [52-80]
1405 ± 1901 [93-9516]
Antihypertensive drugs
Amlodipine
13
Nifedipine
4
Benidipine
2
Manidipine
1
Imidapril
3
Enalapril
1
Olmesartan
16
Telmisartan
16
Candesartan
2
Losartan
2
Valsartan
1
Carvedilol
13
Bisoprolol
1
Furosemide
3
Treatment intensity score
0.95 ± 0.77 [0-2.90]
Creatinine clearance (mL/min)
45.3 ± 18.6 [10.8-80.8]
Blood urea nitrogen (mg/dL)
27.0 ± 9.8 [12.1-61.2]
C-reactive protein (mg/dL)
0.06 ± 0.09 [0.01-0.49]
White blood cell count (/μL)
6347 ± 2705 [1680-13450]
Data are expressed as numbers, or mean ± S.D. [Range].
26
Fig. 9、10 お よ び 11 に 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 、ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ
ン ス お よ び TIS の 関 係 を 示 す 。 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 と ク レ ア チ ニ ン ク
リ ア ラ ン ス (Fig. 9; r s = -0.44, p = 0.0032) お よ び TIS (Fig. 10; r s = 0.53, p =
0.00043) の 間 に 、有 意 な 相 関 が 認 め ら れ た 。一 方 、ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ
ン ス と TIS の 間 に は 有 意 な 相 関 は 認 め ら れ な か っ た (Fig. 11; r s = 0.010, p =
0.94)。 TIS の 変 動 要 因 を 明 ら か に す る た め に 、 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 、
クレアチニンクリアランスおよび各種患者背景を対象に重回帰分析を行っ
た 結 果 、血 漿 中 MR-proADM 濃 度 お よ び BMI が 有 意 な 説 明 因 子 と し て 抽 出
さ れ た (Table 4)。
Plasma MR-proADM level
(nmol/L)
1.6
rs = -0.44
p = 0.0032
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
20
40
60
80
100
Creatinine clearance (mL/min)
Fig. 9
Correlation of creatinine clearance and plasma mid -regional
proadrenomedullin (MR-proADM) level in stable kidney transplant
recipients
27
Plasma MR-proADM level
(nmol/L)
1.6
rs = 0.53
p = 0.00043
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Treatment intensity score
Fig. 10
Correlation of treatment intensity score an d plasma mid-regional
proadrenomedullin (MR-proADM) level in stable kidney transplant
recipients
Treatment intensity score
3.5
rs = -0.010
p = 0.94
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
20
40
60
80
100
Creatinine clearance (mL/min)
Fig. 11
Correlation of creatinine clearance and treatment intensity score
in stable kidney transplant recipients
28
Table 4
Multiple regression analysis of factors associated with treatment
intensity score
Explanatory variable
Partial r²
p value
Partial
regression
coefficient
Plasma MR-proADM level (nmol/L)
0.28
0.00021
1.7
BMI (kg/m2)
0.13
0.0025
0.12
MR-proADM, mid -regional proadrenomedullin; BM I, body mass index.
29
4. 考 察
本 節 で は 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 と 、 TIS
を 指 標 と し た 降 圧 治 療 抵 抗 性 と の 関 連 性 を 検 討 し た 。 血 漿 中 MR-proADM
濃 度 は 、心 不 全 な ど の 心 疾 患
45-47)
や感染症
38-42)
により上昇することが報告
されているが、本研究はこれらを有する患者は対象外としたため、腎不全
と高血圧の影響のみを独立して評価できたと考えられる。また、前節で腎
移 植 後 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 お よ び 収 縮 期 血 圧 、 拡 張 期 血 圧 は 、 移 植
後 90 日 目 ま で に 十 分 低 下 す る こ と が 確 認 で き た こ と か ら 、本 節 で は 移 植 後
90 日 以 上 経 過 し た 患 者 を 対 象 と し た 。
本 研 究 の 安 定 期 腎 移 植 患 者 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、 第 1 節 で の 健
常 人 に 比 べ 高 値 で あ っ た (0.44 ± 0.21 v.s. 0.19 ± 0.07 nmol/L) 。 対 象 患 者 の
80.4%に お い て 腎 機 能 障 害 が 認 め ら れ た こ と か ら 、 こ の 原 因 と し て 腎 機 能
障害の影響が大きいと考えられた
34-36)
。血 漿 中 MR-proADM 濃 度 と ク レ ア
チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス の 間 に 有 意 な 負 の 相 関 が 認 め ら れ た こ と か ら (Fig. 9)、
前 節 と 同 様 に 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 の 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、 腎 機 能 に
強 く 依 存 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 と TIS の
間 に 有 意 な 正 の 相 関 が 認 め ら れ た こ と か ら (Fig. 10)、 血 漿 中 MR-proADM
濃度と降圧治療抵抗性の間に関連性が認められることが明らかになった。
一 方 、 ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス と TIS の 間 に は 有 意 な 相 関 が 認 め ら れ な
か っ た こ と か ら (Fig. 11)、降 圧 治 療 抵 抗 性 は 腎 機 能 に 依 存 し な い こ と が 示
唆 さ れ た 。 そ し て 、 重 回 帰 分 析 の 結 果 か ら (Table 4) 、 安 定 期 腎 移 植 患 者
に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、 TIS が 患 者 間 で 異 な る 要 因 の 一 つ で
あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。す な わ ち 、血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 評 価 は 、
降 圧 治 療 抵 抗 性 の 予 測 に 有 用 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。一 方 、BMI も 同 様
に降圧治療抵抗性の有意な説明因子として抽出されたが、これは肥満が降
30
圧 治 療 抵 抗 性 を 上 昇 さ せ る と い う Xu ら の 報 告 に 一 致 す る も の で あ っ た
48)
本 研 究 に は い く つ か の 限 界 が 存 在 す る 。 一 つ は 、 TIS は 降 圧 薬 の 治 療 強
度を示すパラメータであることから、降圧治療抵抗性を厳密に反映できて
いない可能性が考えられる。二つ目に、本節は血圧コントロールが良好な
安定期腎移植患者を対象にしており、対象患者の収縮期血圧および拡張期
血圧には基準値以下の範囲でばらつきが認められる。そのため、このこと
が TIS の 個 体 差 に 一 部 起 因 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 ま た 、 同 様 の 理
由から、高血圧を呈する患者に対する本研究結果の適応の可否は不明瞭で
ある。今後、更なる前向き研究の実施が望まれる。
本 節 に よ り 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 と TIS
の 関 連 性 が 明 ら か に な っ た 。 こ の こ と か ら 、 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 評
価は、降圧治療抵抗性の予測に有益であることが示唆された。
31
。
【小括】
本章において、腎移植患者における降圧治療の適正化を目的に、血漿中
MR-proADM 濃 度 と 降 圧 治 療 抵 抗 性 の 関 連 性 を 検 討 し た 。 第 1 節 で 、 遅 延
添加法および二抗体固相法に基づいた酵素免疫測定法よる血漿中
MR-proADM 濃 度 の 測 定 法 を 確 立 し 、 正 常 お よ び 病 態 時 に お け る 血 漿 中
MR-proADM 濃 度 の 評 価 に 応 用 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 第 2 節 で 、 末
期 腎 不 全 患 者 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、 腎 移 植 後 に 急 激 に 低 下
することが明らかになった。第 3 節で、安定期腎移植患者における血漿中
MR-proADM 濃 度 と TIS の 関 連 性 が 明 ら か に な っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、
血 漿 中 MR-proADM 濃 度 は 、 降 圧 薬 の TIS の 個 体 差 を 説 明 す る 一 因 子 で あ
り 、 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 評 価 は 、 降 圧 治 療 抵 抗 性 の 予 測 に 有 益 で あ
ることが示唆された。
32
【第 2 章】
腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 4β-hydroxycholesterol 濃 度 を 指 標
と し た CYP3A 活 性 の 評 価
第1節
末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 4β-hydroxycholesterol
濃度の推移
1. 序
CYP は 、 多 く の 薬 物 の 代 謝 に 関 与 す る 薬 物 代 謝 酵 素 で あ り 、 中 で も
CYP3A は ヒ ト 肝 臓 に お け る CYP 発 現 量 の 約 3 割 を 占 め る
49)
。CYP3A 活 性
は 個 体 内・個 体 間 変 動 が 大 き い た め 、CYP3A で 代 謝 さ れ る 薬 剤 は 、そ の 効
果または副作用の発現の予測が困難である。そのため、外因性または内因
性 物 質 を 指 標 と し た CYP3A の フ ェ ノ タ イ ピ ン グ が 有 用 と な る 。 外 因 性 物
質を指標とする方法では、ミダゾラム、エリスロマイシン、アルプラゾラ
ム や ニ フ ェ ジ ピ ン な ど 、CYP3A の 基 質 で あ る プ ロ ー ブ 薬 剤 を 用 い る こ と が
一般的である
ール比
51,52)
50 )
。内 因 性 物 質 で は 、尿 中 6β-水 酸 化 コ ル チ ゾ ー ル /コ ル チ ゾ
や 、 コ ル チ ゾ ー ル の 6β-水 酸 化 代 謝 ク リ ア ラ ン ス
53,54)
などが従
来 か ら 用 い ら れ て い る 。 近 年 、 内 因 性 コ レ ス テ ロ ー ル の
4β-hydroxycholesterol (4β-OHC) へ の 代 謝 が CYP3A に よ る も の で あ る こ と
が発見され
55)
(Fig. 12)、CYP3A 活 性 の 指 標 と し て の 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の
有 用 性 が 着 目 さ れ て い る 。CYP3A4 誘 導 薬
56-60)
または阻害薬
59-61)
服用時に、
血 漿 中 4β-OHC 濃 度 が 上 昇 ま た は 減 尐 す る こ と や 、 CYP3A5 の 機 能 を 欠 損
さ せ る CYP3A5*3 ア レ ル の 保 持 が 、 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 減 尐 さ せ る
62)
こ
と が 相 次 い で 報 告 さ れ 、血 漿 中 4β-OHC 濃 度 は CYP3A 活 性 の 新 規 内 因 性 マ
ー カ ー と し て 重 要 視 さ れ て い る 。 ま た 、 4β-OHC の 体 内 動 態 は 腎 機 能 の 影
響を受けないため
63)
、 腎 不 全 時 の CYP3A 活 性 の 評 価 に お い て 特 に 有 用 で
ある。
33
一 方 、CYP3A 活 性 に 影 響 を 与 え る 因 子 と し て 、環 境 的 、遺 伝 的 お よ び 生
理的要因が多く関わっていると考えられているが
近 年 、生 理 的 要 因 と し て 、動 物
10-15)
およびヒト
64)
16-18)
、未 だ 不 明 な 点 が 多 い 。
に お い て 、腎 機 能 障 害
が CYP3A 活 性 の 低 下 を も た ら す こ と が 報 告 さ れ て い る 。 し か し 、 腎 機 能
の 改 善 が CYP3A 活 性 の 上 昇 を も た ら す か ど う か は 分 か っ て い な い 。 そ こ
で 本 節 で は 、 腎 機 能 回 復 の 程 度 と CYP3A 活 性 と の 関 連 性 を 明 ら か に す る
た め に 、 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 経 時 的
な変化を評価した。
CYP3A4/5
4β-hydroxycholesterol
Cholesterol
Fig. 12
Pathway to the formation of 4 β-hydroxycholesterol (4β-OHC)
34
2. 方 法
2-1. 試 薬
4β-OHCお よ び 4β-OHC-d7は 、 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) よ
り 購 入 し た も の を 用 い た 。 Tert-butyldimethylsilyl imidazole-dimethylformamideは 、 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) よ り 購 入 し た も の を 用 い た 。
その他の試薬は、全て特級グレードを用いた。
2-2. 2 M ナ ト リ ウ ム メ ト キ シ ド 溶 液 の 調 製
ナ ト リ ウ ム メ ト キ シ ド 1.08 g を 正 確 に 量 り 取 り 、エ タ ノ ー ル に 溶 解 し て
全 量 を 10 mL と し 、 2 M ナ ト リ ウ ム メ ト キ シ ド 溶 液 を 調 製 し た 。
2-3. 対 象
2011 年 1 月 か ら 2012 年 11 月 の 間 に 、大 分 大 学 医 学 部 附 属 病 院 腎 臓 外 科・
泌尿器科で、腎移植術を行う末期腎不全患者を対象とした。第 1 章、第 2
節と同様、全症例において、腎移植を行う前まで、週 3 回の頻度で血液透
析が行われていた。また、免疫抑制療法として、タクロリムス、ミコフェ
ノール酸モフェチルおよびメチルプレドニゾロンの 3 剤併用療法が行われ、
腎 移 植 直 前 お よ び 移 植 後 4 日 目 に 、バ シ リ キ シ マ ブ の 追 加 投 与 が 行 わ れ た 。
血 漿 中 4β-OHC 濃 度 測 定 の た め の 採 血 は 、腎 移 植 前 お よ び 移 植 後 3、7、10、
14、 21、 30、 60、 90、 180 日 後 の 午 前 に 行 っ た 。 血 液 は 、 EDTA-2Na 入 り
真 空 採 血 管 に 採 取 し た 。血 液 検 体 は 、 1500×g、4℃ に て 10 分 間 の 遠 心 分 離
を 行 っ た 後 に 血 漿 を 分 取 し 、測 定 時 ま で -40℃ に て 保 存 し た 。血 液 生 化 学 検
査は、大分大学医学部附属病院検査部にて行った。クレアチニンクリアラ
ン ス は 、 Cockcroft-Gault の 式
37)
に て 算 出 し た 。 腎 移 植 後 180 日 目 ま で に 、
拒絶反応が認められた症例は解析から除外した。本研究は大分大学医学部
35
倫理委員会の承認を得ており、患者からの文書による同意取得後に実施し
た。
2-4. 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 測 定
血 漿 中 4β-OHC濃 度 の 測 定 は 、 過 去 の 報 告 55,65) を 一 部 改 良 し た gas
chromatography/mass spectrometry (GC/MS) 法 に て 行 っ た 。サ ン プ ル 血 漿 100
μLに 内 標 準 物 質 (1000 nM 4β-OHC-d7) 20 μLを 加 え 、さ ら に 2 Mナ ト リ ウ ム
メ ト キ シ ド 溶 液 を 加 え 、攪 拌 後 室 温 で 20分 間 放 置 し た 。そ の 後 超 純 水 0.5 mL
と 抽 出 溶 媒 と し て ヘ キ サ ン 2 mLを 加 え 、 攪 拌 後 1分 間 振 と う し た 。 遠 心 分
離 (1500×g、20℃ 、5分 間 ) 後 、別 の 試 験 管 に 有 機 層 1.5 mLを 採 取 し 、窒 素
ガ ス を 用 い て 40℃ に て 蒸 発 乾 固 し た 。 残 渣 に Tert-butyldimethylsilylimidazole-dimethylformamide 100 μLを 加 え て 再 溶 解 し 、 室 温 で 12時 間 放 置 し た 。
そ の 後 超 純 水 1 mLと 抽 出 溶 媒 と し て 酢 酸 エ チ ル 2 mLを 加 え 、 攪 拌 後 1分 間
振 と う し た 。遠 心 分 離 (1500×g、20℃ 、5分 間 ) 後 、別 の 試 験 管 に 有 機 層 1.5
mLを 採 取 し 、窒 素 ガ ス を 用 い て 40℃ に て 蒸 発 乾 固 し た 。残 渣 に ヘ キ サ ン 100
μLを 加 え て 再 溶 解 し 、そ の 1 μLを GC/MSに 注 入 し た 。GCは 7890GC (Agilent)、
オ ー ト サ ン プ ラ ー は HP 7693 (Agilent)、 MSは HP 5975 (Agilent) を 用 い 、 カ
ラ ム は HP-5MS capillary column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm, Agilent) を 用 い
た 。カ ラ ム オ ー ブ ン の 温 度 は 、開 始 後 1分 間 180℃ を 維 持 し 、そ の 後 1分 あ た
り 35℃ の ペ ー ス で 270℃ ま で 上 昇 さ せ た 。 次 に 1分 あ た り 20℃ の ペ ー ス で
310℃ ま で 上 昇 さ せ 、 そ の 後 15分 間 310℃ を 維 持 し た 。 キ ャ リ ア ガ ス と し て
ヘ リ ウ ム を 用 い 、流 速 は 1 mL/minと し た 。イ ン タ ー フ ェ ー ス 温 度 は 280℃ と
し た 。 MS測 定 は 選 択 イ オ ン 検 出 法 に よ り 行 い 、 イ オ ン 源 温 度 270℃ 、 イ オ
ン 加 電 圧 70 eVと し た 。 モ ニ タ ー イ オ ン と し て 、 m/z = 573.5 (4β-OHC) お よ
び 580.6 (4β-OHC-d7) を 用 い た 。ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 13に 示 す 。検 量 線 は 、
36
ほ ぼ 原 点 を 通 る 良 好 な 直 線 性 が 認 め ら れ た (Fig. 14)。 20お よ び 200 ng/mL
の 4β-OHCを 含 有 す る サ ン プ ル に お け る 本 測 定 法 の 日 内 変 動 係 数 は 、そ れ ぞ
れ 3.8お よ び 4.2% (n = 6)、日 間 変 動 係 数 は そ れ ぞ れ 3.4お よ び 4.7% (n = 6) で
あ っ た 。 定 量 限 界 は 1 ng/mLで あ っ た 。
4β-OHC-d7
4β-OHC
Fig. 13
Chromatogram of plasma sample
3
y = 0.0051x - 0.0327
R² = 0.9998
4β-OHC/I.S.
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
100
200
300
400
500
600
4β-OHC conc. (ng/mL)
Fig. 14
Standard curve of 4β-hydroxycholesterol
37
2-5. 統 計 解 析
腎 移 植 前 後 の 患 者 背 景 お よ び 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 比 較 に は Dunnet の
多 重 比 較 検 定 を 用 い た 。統 計 解 析 に は 、PASW Statistics version 18 (SPSS Inc.,
IL, USA) を 用 い た 。 デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 表 し 、 有 意 水 準 は p <
0.05 と し た 。
38
3. 結 果
14 名 の 患 者 が 本 研 究 へ の 参 加 に 同 意 し た 。そ の う ち 1 名 の 患 者 に お い て
移植後に拒絶反応が認められたため、解析対象から除外した。腎移植前お
よ び 移 植 後 30、 90 日 に お け る 13 名 の 患 者 背 景 を Table 5 に 示 す 。 血 中 尿
素 窒 素 は 、 腎 移 植 前 と 比 べ 移 植 後 30 お よ び 90 日 に 有 意 に 低 下 し て い た 。
Table 5
Characteristics of patients in the study
Before
transplantation
30 days after
transplantation
90 days after
transplantation
No. of patients
13
13
13
Males / females
8/5
8/5
8/5
Characteristic
Cause of kidney disease
Glomerulonephritis
6
Immunoglobulin A nephropathy
2
Thin basement membrane disease
1
Unknown nephritis
4
Age (year)
46.1 ± 11.2
[24-66]
Body weight (kg)
57.4 ± 11.8
[44.7-83.1]
54.7 ± 10.2
[40.7-71.9]
54.2 ± 10.0
[40.7-71.5]
White blood cell count (/μL)
7022 ± 2187
[3290-9860]
5688 ± 1791
[2810-8630]
5008 ± 1834
[2680-8820]
Hemoglobin (g/dL)
11.7 ± 1.8
[9.5-16.1]
10.5 ± 1.5
[8.5-13.9]
10.4 ± 1.5
[8.2-14.1]
C-reactive protein (mg/dL)
0.08 ± 0.08
[0.01-0.27]
0.10 ± 0.11
[0.01-0.37]
0.12 ± 0.11
[0.01-0.29]
ALT (IU/L)
15.9 ± 12.5
[4.6-44.6]
14.3 ± 10.8
[4.0-32.6]
13.6 ± 7.5
[6.4-29.6]
γ-GTP (IU/L)
20.8 ± 9.4
[10.3-35.4]
23.6 ± 10.1
[10.3-43.5]
25.3 ± 11.9
[10.4-43.9]
Total bilirubin (mg/dL)
0.44 ± 0.14
[0.28-0.70]
0.39 ± 0.10
[0.26-0.60]
0.45 ± 0.19
[0.17-0.74]
Blood urea nitrogen (mg/dL)
52.9 ± 17.2
[28.5-100.7]
24.3 ± 6.6**
[12.7-38.5]
23.4 ± 4.8**
[13.3-30.2]
ALT, alanine aminotransaminase; γ -GTP, gamma -glutamyl transpeptidiase.
Data are expressed as numbers, or mean ± S.D. [Range].
**p < 0.01, vs. before kidney transplantation.
39
腎 移 植 後 の ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス お よ び 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 推 移
を Fig. 15 お よ び 16 に 示 す 。 ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス は 移 植 前 と 比 べ 、
移植後 3 日目以降に有意に上昇し、移植後 7 日目以降はおおよそ一定の値
で 推 移 し た 。 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 は 移 植 前 と 比 べ 、 移 植 後 90 お よ び 180
日 に 有 意 な 上 昇 が 認 め ら れ た 。 な お 、 腎 移 植 後 の 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 上
昇 の 程 度 に は 、 個 体 差 が 認 め ら れ た (Fig. 17)。
Creatinine clearance (mL/min)
70
60
50
† †
†
†
†
†
†
†
40
†
30
20
10
0
0
30
60
90
120
180
Day after kidney transplantation
Fig. 15
Change in creatinine clearance over time in patients with
end-stage renal disease after kidney transplantation
Data are expressed as means ± SD, n = 13. † p < 0.01, vs. before kidney transplantation.
40
Plasma 4β-hydroxycholesterol
(ng/mL)
80
70
60
*
*
50
40
30
20
10
0
0
30
60
90
120
180
Day after kidney transplantation
Fig. 16
Change in plasma concentration of 4β -hydroxy- cholesterol
(4β-OHC) over time in patients with end -stage renal disease after kidney
transplantation
Data are expressed as means ± SD, n = 13. * p < 0.05, vs. before kidney transplantation.
Plasma 4β-hydroxycholesterol
(ng/mL)
100
80
*
*
90
120
180
60
40
20
0
0
30
60
Day after kidney transplantation
Fig. 17
Change in plasma concentration of 4β -hydroxy- cholesterol
(4β-OHC) over time in individual patients with end -stage renal disease
after kidney transplantation
Data are expressed as means ± SD, n = 13. * p < 0.05, vs. before kid ney transplantation.
The dotted line shows plasma concentration of 4β -OHC in individual patients.
41
4. 考 察
本 節 で は 、 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 指 標 と し て 、 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る
腎 移 植 後 の CYP3A 活 性 の 推 移 を 推 定 し た 。 CYP3A の フ ェ ノ タ イ ピ ン グ の
方 法 と し て 、CYP3A の 基 質 と な る プ ロ ー ブ 薬 剤 を 用 い る こ と が 一 般 的 で あ
るが、プローブ薬剤の投与はその薬剤のタンパク結合が問題となる可能性
がある。ミダゾラムを例に挙げると、健常人におけるミダゾラムの遊離形
分 率 は 約 3.9%で あ る が 、慢 性 腎 不 全 患 者 で は 結 合 タ ン パ ク で あ る 血 清 ア ル
ブ ミ ン 濃 度 が 低 下 し 、 遊 離 形 分 率 は 約 6.5%ま で 上 昇 す る
66)
。その結果、
総濃度を指標としたミダゾラムの全身クリアランスが上昇する可能性が考
え ら れ る 。実 際 に 、Nolin ら は 、ミ ダ ゾ ラ ム を プ ロ ー ブ 薬 剤 と し て 用 い て 、
健 常 人 お よ び 末 期 腎 不 全 患 者 の CYP3A 活 性 を 評 価 し た 結 果 、 両 群 間 に 差
が認められなかったことを報告している
67)
。ま た 、プ ロ ー ブ 薬 剤 の 投 与 は 、
腎移植患者などの急性期症例には安全性の面から適していない。より安全
性 の 高 い 方 法 と し て 、 内 因 性 コ ル チ ゾ ー ル の 6β-水 酸 化 コ ル チ ゾ ー ル へ の
代 謝 が CYP3A に よ る も の で あ る こ と を 利 用 し た 、尿 中 6β-水 酸 化 コ ル チ ゾ
ー ル /コ ル チ ゾ ー ル 比 が 従 来 か ら 用 い ら れ て い る
51,52)
。し か し 、こ の 方 法 は
コルチゾールの腎クリアランスの影響を受ける可能性があるため、腎不全
患者には適していない。この点を改良した方法として、近年コルチゾール
の 6β-水 酸 化 代 謝 ク リ ア ラ ン ス が 提 唱 さ れ て い る
52,54)
。しかし、この方法
は 蓄 尿 を 必 要 と す る た め 、末 期 腎 不 全 患 者 に は 適 し て お ら ず 、CYP3A 活 性
の経時的な変化の評価も難しい。また、コルチゾールの日内変動も問題と
な る 。一 方 、本 研 究 で は CYP3A 活 性 の 指 標 と し て 、血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を
用 い た 。 4β-OHC は 7 位 の 水 酸 化 に よ り 緩 や か に 消 失 す る た め
63)
、その動
態 は 腎 機 能 の 影 響 を 受 け な い 。 そ の た め 、 腎 移 植 患 者 に お け る CYP3A 活
性の評価に最も適した物質であると考えられる。
42
腎 機 能 障 害 は 、薬 物 の 腎 ク リ ア ラ ン ス を 低 下 さ せ る だ け で な く 、CYP3A
を始めとした薬物代謝酵素による代謝クリアランスも低下させることが、
動物実験の結果から明らかになっている
10-15)
。近 年 、ヒ ト に お い て も 同 様
の 報 告 が な さ れ て い る 。 Dowling ら は 、 エ リ ス ロ マ イ シ ン 呼 気 テ ス ト を 用
い て 、 健 常 人 と 比 較 し て 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る CYP3A 活 性 が 約 28%低
下していることを報告している
16)
。Kirwan ら は 、急 性 腎 不 全 の 重 症 度 お よ
び期間と、ミダゾラムの全身クリアランスの関連性を報告している
17,18)
。
し か し 、 腎 機 能 の 改 善 が CYP3A 活 性 の 回 復 を も た ら す か は 未 だ 明 ら か に
なっていないため、本研究が立案された。
ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス は 腎 移 植 後 に 急 激 に 上 昇 し た こ と か ら (Fig.
15)、本 研 究 の 対 象 症 例 に お け る 腎 移 植 術 は 成 功 し た と 考 え ら れ た 。腎 移 植
後 90、180 日 目 に 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 有 意 な 上 昇 が 認 め ら れ た こ と か ら 、
腎 移 植 に よ る 腎 機 能 の 改 善 は 、CYP3A 活 性 を 回 復 さ せ る こ と が 初 め て 示 唆
された。
本 研 究 に は い く つ か の 限 界 が 存 在 す る 。 一 つ は 、 4β-OHC の 半 減 期 が 約
62 時 間 か ら 17 日 間 と 長 い た め
58,63,68 )
、CYP3A の 回 復 を 鋭 敏 に 反 映 で き て
い な い こ と が 考 え ら れ る 。 そ の た め 、 腎 移 植 後 の CYP3A 活 性 の 回 復 は 、
実際はより早期に生じている可能性がある。二つ目に、免疫抑制療法に使
用されているタクロリムス、ミコフェノール酸モフェチルおよびメチルプ
レ ド ニ ゾ ロ ン に つ い て は 、 肝 CYP3A に お よ ぼ す 影 響 は 尐 な い が
69-71)
、バ
シ リ キ シ マ ブ は 肝 CYP3A 活 性 を 阻 害 す る こ と が 報 告 さ れ て い る
72,73)
。そ
のため、腎移植直前および移植後 4 日目のバシリキシマブの投与後に、
CYP3A 活 性 の 上 昇 が 低 減 さ れ て い る 可 能 性 が あ る 点 に 注 意 が 必 要 で あ る 。
本 節 に よ り 、腎 移 植 に よ る 腎 機 能 の 改 善 は 、CYP3A 活 性 を 回 復 さ せ る こ
とが示唆された。また、患者間でその回復の程度に個体差が認められたこ
43
と か ら 、CYP3A 活 性 の 回 復 に 腎 機 能 以 外 の 要 因 も 関 与 し て い る 可 能 性 が 考
えられた。
44
第2節
安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 4β-hydroxycholesterol 濃 度 を
指 標 と し た CYP3A 活 性 の 変 動 要 因 の 探 索
1. 序
前 節 で 、腎 移 植 に よ る 腎 機 能 の 改 善 は 、CYP3A 活 性 の 回 復 を も た ら す こ
とが明らかになった。しかし、患者間でその回復の程度に個体差が認めら
れ た こ と か ら 、CYP3A 活 性 の 回 復 に 腎 機 能 以 外 の 要 因 の 関 与 が 示 唆 さ れ た 。
CYP3A 活 性 の 個 体 差 の 遺 伝 的 要 因 と し て 、 そ の サ ブ フ ァ ミ リ ー で あ る
CYP3A5 の 酵 素 発 現 量 を 低 下 さ せ る CYP3A5*3 (Intron 3, A6986G) 型 の 保 持
が挙げられる
7 4)
。 ま た 、 腎 機 能 障 害 時 に CYP3A 活 性 が 低 下 す る 機 序 と し
て 、 尿 毒 症 物 質 の 蓄 積 に よ る 影 響 が 明 ら か に な っ て お り 、 特 に indoxyl
sulfate (3-INDS) お よ び indole-3-acetic acid (3-IAA) の 関 与 が 示 唆 さ れ て い
る
75-78)
。 し た が っ て 、 本 節 で は 、 CYP3A 活 性 の 変 動 要 因 を 探 索 す る こ と
を 目 的 に 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 を 対 象 と し て 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 測 定 し 、
CYP3A 活 性 と CYP3A5 遺 伝 子 多 型 、 血 漿 中 3-INDS、 3-IAA 濃 度 お よ び 各
種患者背景との関連性を検討した。
45
2. 方 法
2-1. 対 象
対 象 は 、 CNI 等 の 免 疫 抑 制 療 法 を 行 っ て い る が 、 他 に CYP3A を 誘 導 ま
たは阻害する薬剤
79)
を 服 用 し て い な い 腎 移 植 後 90 日 以 上 経 過 し た 安 定 期
腎 移 植 患 者 45 名 と し た 。透 析 を 行 っ て い る 患 者 は 除 外 し た 。大 分 大 学 医 学
部附属病院腎臓外科・泌尿器科の外来受診日の午前中に採血を行った。血
液 は 、 EDTA-2Na 入 り 真 空 採 血 管 に 採 取 し 、 1500×g、 4℃ に て 10 分 間 の 遠
心 分 離 を 行 っ た 後 に 血 漿 を 分 取 し 、測 定 時 ま で -40℃ に て 保 存 し た 。血 液 生
化学検査は、大分大学医学部附属病院検査部にて行った。クレアチニンク
リ ア ラ ン ス は 、Cockcroft-Gault の 式
37)
に て 算 出 し た 。本 研 究 は 大 分 大 学 医
学部倫理委員会の承認を得ており、患者からの文書による同意取得後に実
施した。
2-2. 16 μM p-エ チ ル フ ェ ノ ー ル 溶 液 の 調 製
p-エ チ ル フ ェ ノ ー ル 1.95 mg を 正 確 に 量 り 取 り 、 エ タ ノ ー ル に 溶 解 し て
全 量 を 100 mL と し 、 160 μM p-エ チ ル フ ェ ノ ー ル 溶 液 を 調 製 し た 。 160 μM
p-エ チ ル フ ェ ノ ー ル 溶 液 5 mL を 正 確 に 量 り 取 り 、エ タ ノ ー ル に 溶 解 し て 全
量 を 50 mL と し 、 16 μM p-エ チ ル フ ェ ノ ー ル 溶 液 を 調 製 し た 。
2-3. 20 mM リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム お よ び 5 mM ヨ ウ 化 テ ト ラ ブ チ ル ア ン
モニウム水溶液の調製
リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム 2.76 g お よ び ヨ ウ 化 テ ト ラ ブ チ ル ア ン モ ニ ウ ム
1.85 g を 正 確 に 量 り 取 り 、 超 純 水 に 溶 解 し て 全 量 を 1 L と し 、 20 mM リ ン
酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム お よ び 5 mM ヨ ウ 化 テ ト ラ ブ チ ル ア ン モ ニ ウ ム 水 溶 液
を調製した。
46
2-4. 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 測 定
血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 測 定 は 、 前 節 と 同 様 GC/MS 法 に て 行 っ た 。
2-5. 血 漿 中 3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 の 測 定
血 漿 中 3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 の 測 定 は 、 Calaf ら の 報 告
80)
に従った
HPLC-蛍 光 検 出 法 に て 行 っ た 。 サ ン プ ル 血 漿 100 μL に 内 標 準 物 質 (16 μM
p-エ チ ル フ ェ ノ ー ル ) 300 μL を 加 え 、 さ ら に 塩 化 ナ ト リ ウ ム 0.1 g を 加 え 、
室 温 で 10 分 間 攪 拌 し た 。 そ の 後 20 mM リ ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム お よ び 5
mM ヨ ウ 化 テ ト ラ ブ チ ル ア ン モ ニ ウ ム 水 溶 液 700 μL を 加 え 、室 温 で 5 分 間
攪 拌 し た 。 遠 心 分 離 (10000×g、 4℃ 、 10 分 間 ) 後 、 上 清 15 μL を HPLC に
注 入 し た 。HPLC お よ び オ ー ト サ ン プ ラ ー は Waters e2695 (Warets)、検 出 器
は Waters 2475 (Waters) を 用 い 、波 長 は 励 起 光 278 nm、蛍 光 348 nm と し た 。
カ ラ ム は Merck Lichrospher 60 RP Select B (5 μm, 125 mm × 4 mm, Merk
Chimie, Fontenay sous Bois, France) を 用 い 、 カ ラ ム オ ー ブ ン の 温 度 は 40℃
と し た 。移 動 相 は 5 mM ヨ ウ 化 テ ト ラ ブ チ ル ア ン モ ニ ウ ム を 含 む 20 mM リ
ン 酸 二 水 素 ナ ト リ ウ ム : ア セ ト ニ ト リ ル = 78 : 22 (v/v) を 用 い 、 流 速 は 1
mL/min と し た 。 ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 18 に 示 す 。 検 量 線 は 、 ほ ぼ 原 点 を
通 る 良 好 な 直 線 性 が 認 め ら れ た (Fig. 19)。12.5、125 μM の 3-INDS お よ び
1.25、 12.5 μM の 3-IAA を 含 有 す る サ ン プ ル に お け る 本 測 定 法 の 日 内 変 動
係 数 は 、そ れ ぞ れ 5.8、4.3%お よ び 2.7、3.2% (n = 6)、日 間 変 動 係 数 は そ れ
ぞ れ 4.8、3.7%お よ び 3.8、2.7% (n = 6) で あ っ た 。定 量 限 界 は 3-INDS お よ
び 3-IAA に お い て 、 そ れ ぞ れ 0.1 お よ び 0.5 μM で あ っ た 。
47
p-ethylphenol
3-IAA
Fig. 18
3-INDS
Chromatogram of plasma sample
20
160
120
3-INDS/I.S.
3-IAA/I.S.
y = 0.2909x + 0.7478
R² = 0.9995
140
y = 0.7047x + 0.029
R² = 0.9999
16
12
8
100
80
60
40
4
20
0
0
0
5
10
15
20
25
30
3-IAA conc. (μM)
Fig. 19
0
100
200
300
400
500
600
3-INDS conc. (μM)
Standard curves of indoxyl sulfate (3 -INDS) and indole-3-acetic
acid (3-IAA)
2-6. CYP3A5 遺 伝 子 多 型 解 析
Maxwell ® 16 DNA Purification Kits (Promega, Tokyo, Japan) を 用 い て DNA
の 抽 出 を 行 い 、一 塩 基 多 型 A6986G (CYP3A5*3) の 検 出 を 、TaqMan プ ロ ー
ブ (C_26201809_30) を 用 い た リ ア ル タ イ ム PCR 法 (LightCycler ® Nano
System (Roche Applied Science, Penzberg, Germany)) に て 行 っ た 。CYP3A5*3
が 検 出 さ れ な か っ た 場 合 は 、 そ の ア レ ル は CYP3A5*1 と み な し た 。
2-7. 統 計 解 析
CYP3A5 の 遺 伝 子 多 型 別 の 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 比 較 に は 、Tukey-Kramer
48
の多重比較検定を用いた。2 変量の相関性の検定には、ピアソンの積率相
関 係 数 の 有 意 性 検 定 を 用 い た 。 な お 、 血 漿 中 3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 は
対数正規分布を示したため、相関性の検討の際は対数変換を行った。血漿
中 4β-OHC 濃 度 の 変 動 要 因 の 探 索 は 、 重 回 帰 分 析 に て 行 っ た 。 統 計 解 析 に
は 、PASW Statistics version 18 (SPSS Inc., IL, USA) お よ び R software version
2.14.2 (http://www.r-project.org) を 用 い た 。 デ ー タ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で
表 し 、 有 意 水 準 は p < 0.05 と し た 。
49
3. 結 果
45 名 の 患 者 背 景 を Table 6 に 示 す 。 CYP3A5*3 に 関 し て 、 15 名 が ヘ テ ロ
接 合 体 (CYP3A5*1/*3)、 25 名 が ホ モ 接 合 体 (CYP3A5*3/*3) で あ っ た 。 ク
レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス は 患 者 間 で ば ら つ き が 見 ら れ た が 、 ALT、 γ-GTP
および総ビリルビンは正常範囲内であった。このことから、本研究におけ
る 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 に お よ ぼ す 肝 機 能 の 影 響 は 尐 な い と 考 え ら れ た 。
Table 7 に 対 象 患 者 が 服 用 し て い た 薬 剤 を 示 す 。 す べ て の 患 者 に お い て 、
CYP3A を 誘 導 ま た は 阻 害 す る 薬 剤
76)
が使用されていないことが確認され
た。
Table 6
Characteristics of patients in the study
Characteristic
Value
Males / females
26/19
Age (year)
47.0 ± 14.1 [16-74]
Body weight (kg)
56.3 ± 10.5 [40.2-79.7]
Duration after kidney transplantation (day)
1398 ± 1315 [93-6369]
Calcineurin inhibitor (cyclosporine / tacrolimus)
8/37
Trough concentration (ng/mL)
Cyclosporine
76.4 ± 33.0 [33.5-145.6]
Tacrolimus
5.9 ± 3.0 [1.3-13.3]
CYP3A5 polymorphism
CYP3A5*1/*1
5
CYP3A5*1/*3
15
CYP3A5*3/*3
25
White blood cell count (/μL)
6112 ± 1949 [1680-10750]
Hemoglobin (g/dL)
11.9 ± 1.5 [6.8-14.2]
C-reactive protein (mg/dL)
0.05 ± 0.07 [0.01-0.37]
Total cholesterol (mg/dL)
193.9 ± 32.1 [104-280]
ALT (IU/L)
13.9 ± 6.3 [3.3-35.5]
γ-GTP (IU/L)
29.1 ± 22.9 [6.2-91.9]
Total bilirubin (mg/dL)
0.61 ± 0.19 [0.26-0.97]
Creatinine clearance (mL/min)
47.5 ± 18.4 [10.7-87.1]
Blood urea nitrogen (mg/dL)
26.3 ± 9.2 [14.4-54.9]
CYP, cytochrome P450; ALT, alanine aminotransaminase; γ -GTP, gamma -glutamyl transpeptidiase.
Data are expressed as numbers, or mean ± S.D. [Range].
50
Table 7
Description of administered drugs
Medications
Number of
patients
Medications
Number of
patients
Adenosine triphosphate disodium hydrate
1
Lactomin
2
Alendronate sodium hydrate
1
Lanthanum carbonate hydrate
1
Alfacalcidol
3
Levothyroxine sodium hydrate
1
Allopurinol
32
Limaprost alfadex
3
Alogliptin benzoate
1
lornoxicam
1
Amlodipine besilate*
16
Losartan potassium
2
Aprindine hydrochloride
1
Magnesium oxide
10
Aspirin
4
Methylprednisolone*
45
Atorvastatin calcium hydrate*
12
Minodronic acid hydrate
10
Benidipine hydrochloride
2
Mizoribine
16
Benzbromarone*
2
Mycophenolate mofetil
29
Betahistine mesilate
1
Nicorandil
1
Brotizolam*
8
Nifedipine*
5
Calcitriol
2
Olmesartan medoxomil
21
Calcium lactate hydrate
2
Omeprazole*
11
Calcium polystyrene sulfonate
3
Potassium citrate
5
Candesartan cilexetil
2
Precipitated calcium carbonate
1
Carvedilol
16
Pregabalin
1
Cetraxate hydrochloride
1
Propiverine hydrochloride
1
Cyclosporine*
8
Rabeprazole sodium
19
Cilostazol*
1
Sarpogrelate hydrochloride
1
Cinacalcet hydrochloride
2
Sennoside A, B
9
Dipyridamole
1
Sevelamer hydrochloride
1
Dutasteride*
1
Silodosin*
1
Enalapril maleate
1
Sodium ferrous citrate
11
Esomeprazole magnesium hydrate*
8
Sodium polystyrene sulfonate
4
Ethyl icosapentate
23
Sulfamethoxazole/trimethoprim
17
Etizolam*
1
Tacrolimus*
37
Famotidine
1
Tamsulosin hydrochloride
2
Febuxostat
2
Telmisartan
13
Flunitrazepam
1
Teprenone
9
Furosemide
5
Troxipide
5
Fursultiamine
1
Valganciclovir hydrochloride
3
Imidapril hydrochloride
6
Voglibose
1
Irsogladine maleate
2
Zopiclone*
1
* CYP3A substates
51
対 象 患 者 に お け る 血 漿 中 3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 は 、10.9 ± 9.4 お よ び
2.6 ± 1.4 μM で あ っ た 。 Fig. 20 に ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス と 血 漿 中
3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 の 関 係 を 示 す 。ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス と 血 漿
中 3-INDS 濃 度 の 間 に 、 有 意 な 負 の 相 関 が 認 め ら れ た (Fig. 20a; r = -0.42, p
= 0.0042)。一 方 、ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス と 血 漿 中 3-IAA 濃 度 の 間 に は 、
有 意 な 相 関 は 認 め ら れ な か っ た (Fig. 20b; r = -0.25, p = 0.097)。
(a)
Plasma indoxyl sulfate
concentration (μM)
1000.0
r = -0.42
p = 0.0042
100.0
10.0
1.0
0.1
0
20
40
60
80
100
Creatinine clearance (mL/min)
Plasma indole-3-acetic acid
concentration (μM)
(b)
100.0
r = -0.25
p = 0.097
10.0
1.0
0.1
0
20
40
60
80
100
Creatinine clearance (mL/min)
Fig.
20
Correlations
of
creatinine
clearance
with
plasma
concentrations of indoxyl sulfate (3-INDS) (a) and indole-3-acetic acid
(3-IAA) (b) in
stable kidney transplant recipients
52
対 象 患 者 に お け る 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 は 、 39.5 ± 11.7 ng/mL で あ っ た 。
CYP3A5 の 遺 伝 子 多 型 別 の 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を Fig. 21 に 示 す 。
CYP3A5*1/*1、*1/*3 お よ び *3/*3 保 有 群 に お い て そ れ ぞ れ 、57.1 ± 11.2、42.1
± 11.8 お よ び 34.5 ± 7.3 ng/mL で あ り 、す べ て の 群 間 で 有 意 差 が 認 め ら れ た 。
Fig. 22 に 血 漿 中 3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 と 、 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 と の 関
係 を 示 す 。 血 漿 中 3-INDS 濃 度 と 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 間 に 、 有 意 な 負 の
相 関 が 認 め ら れ た (Fig. 22a; r = -0.35, p = 0.017)。一 方 、血 漿 中 3-IAA 濃 度
と 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 間 に は 、有 意 な 相 関 は 認 め ら れ な か っ た (Fig. 22b;
r = 0.11, p = 0.46)。 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 変 動 要 因 を 明 ら か に す る た め に 、
CYP3A5*3 ア レ ル 保 持 数 、 血 漿 中 3-INDS、 3-IAA 濃 度 お よ び 各 種 患 者 背 景
を 対 象 に 重 回 帰 分 析 を 行 っ た 結 果 、CYP3A5*3 ア レ ル 保 持 数 、血 漿 中 3-INDS
濃 度 お よ び 体 重 が 有 意 な 説 明 因 子 と し て 抽 出 さ れ た (Table 8)。
p = 0.000043
p = 0.0097
p = 0.046
Plasma 4β-hydroxycholesterol
concentration (ng/mL)
80
60
40
20
0
* 1 /* 1
Fig. 21
* 1 /* 3
* 3 /* 3
Plasma concentrations of 4β-hydroxycholesterol (4β-OHC) in
stable kidney transplant recipients with CYP3A5*1/*1,
Each bar indicates the mean values.
53
*1/*3 and *3/*3
(a)
Plasma 4β-hydroxycholesterol
concentration (ng/mL)
80
r = -0.35
p = 0.017
60
40
20
0
0.1
1.0
10.0
100.0
1000.0
Plasma indoxyl sulfate concentration (μM)
(b)
Plasma 4β-hydroxycholesterol
concentration (ng/mL)
80
r = 0.11
p = 0.46
60
40
20
0
0.1
1.0
10.0
100.0
Plasma indole-3-acetic acid concentration (μM)
Fig. 22
(3-INDS)
Correlations of plasma concentrations of indoxyl sulfate
(a)
and
indole-3-acetic
acid
(3-IAA)
(b)
with
4β-hydroxycholesterol (4β-OHC) in stable kidney transplant recipients
54
Table 8
Multiple regression analysis of factors associated with plasma
concentrations of 4β-hydroxycholesterol (4β-OHC)
Explanatory variable
Number of CYP3A5*3 allele
Plasma concentrations of 3-INDS (μM)
Body weight (kg)
CYP, cytochrome P450; 3 -INDS, indoxyl sulfate.
55
Partial r²
p value
Partial
regression
coefficient
0.346
0.126
0.052
< 0.0001
0.00415
0.0233
-12.3
-0.404
-0.296
4. 考 察
本 節 で は 、 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 指 標 と し て 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け
る CYP3A 活 性 の 変 動 要 因 を 探 索 し た 。 前 節 で 腎 移 植 後 の 血 漿 中 4β-OHC
濃 度 は 、移 植 後 90 日 目 ま で に 十 分 上 昇 す る こ と が 確 認 で き た こ と か ら 、本
節 で は 移 植 後 90 日 以 上 経 過 し た 患 者 を 対 象 と し た 。
前 節 で 、 末 期 腎 不 全 患 者 に お い て 、 腎 移 植 後 に よ り CYP3A 活 性 が 回 復
す る こ と が 示 唆 さ れ た が 、患 者 間 で そ の 回 復 の 程 度 に 個 体 差 が 認 め ら れ た 。
本 節 で は 、CYP3A 活 性 の 個 体 差 の 要 因 と し て 、遺 伝 的 要 因 と し て CYP3A5
遺 伝 子 多 型 (CYP3A5*3) に 、生 理 的 要 因 と し て 腎 機 能 障 害 時 に 蓄 積 す る 尿
毒 症 物 質 に 着 目 し た 。日 本 人 に お け る CYP3A5 タ ン パ ク の 発 現 頻 度 は 、約
33%で あ る
74)
。 そ の 原 因 と し て 、 CYP3A5*3 ア レ ル の 影 響 が 大 き く 、 本 ア
レ ル の ホ モ 接 合 体 (CYP3A5*3/*3) は 、CYP3A5 タ ン パ ク を 全 く 発 現 し な い
74)
。CYP3A5 の 他 の 一 塩 基 多 型 と し て 、CYP3A5*2、CYP3A5*4 や CYP3A5*5
などが報告されているが、日本人におけるこれらの変異の発現頻度は非常
に尐ないため
81 ,82)
、本 研 究 で は 調 査 対 象 外 と し た 。日 本 人 に お け る CYP3A4
タンパク発現量の個体差も非常に大きいが
の一塩基多型
83-85)
、 こ れ を 反 映 す る CYP3A4
(CYP3A4*1B 、 CYP3A4*4 、 CYP3A4*16 、 CYP3A4*18 、
CYP3A4*22) の 発 現 頻 度 も 日 本 人 で は 尐 な い た め
86-89)
、これらについても
調 査 対 象 外 と し た 。 ま た 、 ヒ ト に お け る CYP3A の サ ブ フ ァ ミ リ ー に は 、
CYP3A4 お よ び CYP3A5 の 他 に 、CYP3A7 や CYP3A43 が 報 告 さ れ て い る 90) 。
CYP3A7 は そ の 活 性 を 減 弱 さ せ る 一 塩 基 多 型 が い く つ か 報 告 さ れ て い る が
91,92)
、本酵素は胎児のみに発現し、成人ではほとんど発現していない
93)
。
本 研 究 の 対 象 患 者 は 16 歳 以 上 で あ っ た た め 、本 酵 素 の 遺 伝 子 多 型 の 影 響 は
尐 な い と 考 え ら れ る 。ま た 、CYP3A43 は オ ラ ン ザ ピ ン の 全 身 ク リ ア ラ ン ス
を低下させる一塩基多型存在が報告されているが
56
94)
、 CYP3A 活 性 に お よ
ぼす影響は不明瞭である。よって、これらについても本研究では調査対象
外とした。一方、尿毒症物質の蓄積は、腎不全の進行を促すのみだけでな
く 、 CYP3A 活 性 を 低 下 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る
75 -78)
。その機序は未
だ 不 明 瞭 だ が 、 CYP3A 遺 伝 子 の 転 写 過 程 に お け る NF-κB の 阻 害 作 用 を 尿
毒症物質が増強する可能性が報告されている
78)
。 ま た 、 CYP3A に よ る 薬
物代謝を非競合的に直接的に阻害する可能性も示唆されている
76)
。尿 毒 症
物 質 は 数 多 く 存 在 す る が 、 そ の 中 で も 3-INDS お よ び 3-IAA に お い て 、 in
vitro で の CYP3A 阻 害 作 用 が 認 め ら れ て い る こ と か ら
76 )
、本研究ではこれ
らを対象とした。
本 研 究 で は 、 CYP3A5*3 ア レ ル の 発 現 頻 度 に つ い て 、 CYP3A5*1/*1 群 、
CYP3A5*1/*3 群 お よ び CYP3A5*3/*3 群 で そ れ ぞ れ 11.1、 33.3 お よ び 55.6%
で あ っ た (Table 6)。こ の 分 布 は 、日 本 人 に お け る 過 去 の 報 告 と お お よ そ 一
致していた
74,95,96)
。 ま た 、 Diczfalusy ら の 報 告 と 同 様 に
62)
、 CYP3A5*3 ア
レ ル の 保 持 数 が 多 く な る に つ れ 、 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 は 有 意 に 低 下 す る 傾
向 が 認 め ら れ た (Fig. 21)。 こ の こ と か ら 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 の CYP3A 活
性 に お け る CYP3A5 の 重 要 性 が 示 さ れ た 。
本 研 究 の 対 象 患 者 に お け る 血 漿 中 3-INDS お よ び 3-IAA 濃 度 は 、 そ れ ぞ
れ 10.9 ± 9.4 お よ び 2.6 ± 1.4 μM で あ り 、 Calaf ら の 報 告 に お け る 慢 性 腎 不
全 ス テ ー ジ 3-5 の 患 者 群 と 同 様 の 結 果 で あ っ た
と同様に
97)
80)
。 ま た 、 Huang ら の 報 告
、 ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス と 血 漿 中 3-INDS 濃 度 の 間 に 、 有
意 な 負 の 相 関 が 認 め ら れ た (Fig. 20a)。 こ の こ と か ら 、 安 定 期 腎 移 植 患 に
お け る 3-INDS の 蓄 積 は 、腎 機 能 に 強 く 依 存 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。一 方 、
ク レ ア チ ニ ン ク リ ア ラ ン ス と 血 漿 中 3-IAA 濃 度 の 間 に 有 意 な 相 関 は 認 め ら
れ な か っ た こ と か ら (Fig. 20b)、3-IAA の 蓄 積 に 腎 不 全 以 外 の 要 因 が 関 わ っ
ている可能性が示唆された。
57
Fig. 22a に 示 し た と お り 、血 漿 中 3-INDS 濃 度 と 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 間
に 、 有 意 な 負 の 相 関 が 認 め ら れ た 。 こ の こ と か ら 、 血 漿 中 3-INDS 濃 度 と
CYP3A 活 性 の 間 に 関 連 性 が 認 め ら れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。3-INDS は 、
in vitro の 検 討 に よ り 、 CYP3A に よ る 薬 物 代 謝 を 非 競 合 的 に 直 接 的 に 阻 害
することが報告されており
76)
、 こ の 阻 害 作 用 が 血 漿 中 3-INDS 濃 度 と
CYP3A 活 性 の 間 の 関 連 性 の 一 因 と な る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。一 方 、血 漿 中
3-IAA 濃 度 と 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 間 に 有 意 な 相 関 が 認 め ら れ な か っ た こ
と か ら (Fig. 22b)、安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る CYP3A 活 性 は 、血 漿 中 3-IAA
濃 度 と 関 連 を 示 さ な い こ と が 示 唆 さ れ た 。こ の 原 因 と し て 、3-INDS に 比 べ
て 3-IAA の CYP3A の 代 謝 阻 害 定 数 が 大 き い こ と
76)
、 血 漿 中 3-INDS 濃 度
に 比 べ て 血 漿 中 3-IAA 濃 度 が 低 か っ た こ と な ど が 考 え ら れ る 。そ し て 、重
回 帰 分 析 の 結 果 か ら (Table 8) 、CYP3A5*3 ア レ ル の 保 持 (partial r² = 0.346)
お よ び 3-INDS の 蓄 積 (partial r² = 0.126) は 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 低 下 さ せ 、
そ の 個 体 差 の 約 47%を 説 明 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。す な わ ち 、安 定 期
腎 移 植 患 者 に お け る CYP3A 活 性 の 個 体 差 は 、CYP3A5 遺 伝 子 多 型 と 尿 毒 症
物質の蓄積により、部分的に説明が可能であることが示唆された。体重
(partial r² = 0.052) も 血 漿 中 4β-OHC 濃 度 の 有 意 な 説 明 因 子 と し て 抽 出 さ れ
た が 、こ れ は 4β-OHC の 肝 固 有 ク リ ア ラ ン ス を 反 映 し て い る と 考 え ら れ た 。
本 研 究 は 、血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 指 標 と し た CYP3A 活 性 と 、CYP3A5 遺 伝
子 多 型 お よ び 血 漿 中 3-INDS 濃 度 の 関 連 を 証 明 し た 初 め て の 報 告 で あ る 。
近年、薬物代謝酵素活性の個体間変動における遺伝的要因では説明できな
い 乖 離 、い わ ゆ る missing heritability が 問 題 と な っ て い る
64)
。血 漿 中 3-INDS
濃 度 は 、安 定 期 腎 不 全 患 者 に お け る CYP3A の missing heritability を 説 明 す
る一要因になる可能性が示された。これらの結果のより詳細な臨床的意義
および有用性を明らかにするために、今後さらなる研究が求められる。
58
本 節 に よ り 、安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る CYP3A 活 性 の 個 体 差 は 、CYP3A5
遺伝子多型と尿毒症物質の蓄積により、部分的に説明が可能であることが
示 唆 さ れ た 。こ の 結 果 は 、CYP3A の 基 質 と な る 薬 剤 の 最 適 な 投 与 設 計 に 関
する有用な知見をもたらすと確信する。
59
【小括】
本章において、腎移植患者における肝代謝型薬剤の投与量の適正化を目
的 に 、血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 指 標 と し た CYP3A 活 性 の 個 体 差 の 要 因 の 探 索
を 行 っ た 。 第 1 節 で 、 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る 腎 移 植 後 の 血 漿 中 4β-OHC
濃度の経時的な変化を評価した結果、腎移植による腎機能の改善は、
CYP3A 活 性 を 回 復 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ た 。第 2 節 で 、血 漿 中 4β-OHC 濃
度 を 指 標 と し て 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る CYP3A 活 性 の 変 動 要 因 を 探
索 し た 結 果 、CYP3A 活 性 の 個 体 差 は 、CYP3A5 遺 伝 子 多 型 と 血 漿 中 3-INDS
濃度により、部分的に説明が可能であることが示唆された。これらの結果
か ら 、 腎 移 植 患 者 に お い て CYP3A の 基 質 と な る 薬 剤 を 投 与 す る 際 は 、 こ
れらの要因を考慮する必要があることが明らかになった。
60
【総括】
本研究では、腎移植患者における降圧治療および肝代謝型薬剤の投与量
の適正化に繋がる有益な情報を構築することを目的に、内因性物質を指標
とした降圧治療抵抗性の評価および薬物代謝能の個 体差の要因解析を行っ
た 。 第 1 章 で 、 酵 素 免 疫 測 定 法 よ る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 の 測 定 法 を 確
立 し 、 安 定 期 腎 移 植 患 者 に お け る 血 漿 中 MR-proADM 濃 度 と TIS の 関 連 性
を 明 ら か に し た 。第 2 章 で 、血 漿 中 4β-OHC 濃 度 を 指 標 と し て CYP3A 活 性
を 評 価 す る こ と に よ り 、 末 期 腎 不 全 患 者 に お け る CYP3A 活 性 は 、 腎 移 植
による腎機能の改善に伴い上昇する可能性を明らかにした。また、安定期
腎 移 植 患 者 に お け る CYP3A 活 性 の 個 体 差 は 、CYP3A5 遺 伝 子 多 型 と 血 漿 中
3-INDS 濃 度 に よ り 、部 分 的 に 説 明 が 可 能 で あ る 可 能 性 を 明 ら か に し た 。こ
れ ら の 結 果 は 、 降 圧 治 療 の 適 正 化 お よ び CYP3A の 基 質 と な る 薬 剤 の 最 適
な投与設計に関する有用な知見をもたらすと確信する。
61
【謝辞】
稿を終えるにあたり、終始ご指導、ご鞭撻を賜りました明治薬科大学薬
剤情報解析学教室
岸野吏志教授に深甚なる謝意を表します。
本研究は、大分大学医学部附属病院薬剤部で行った ものであり、本研究
の機会を賜り、終始ご指導ご鞭撻を賜りました大分大学医学部
名誉教授、大分大学医学部附属病院薬剤部
武山正治
伊東弘樹教授に謹んで感謝の
意を表します。
本論文の作成に際し、多くの有益なご助言、ご指導を賜りました明治薬
科大学薬物治療学教室
越前宏俊教授、同薬効学教室
庄司優教授に心か
ら感謝の意を表します。また、本論文作成にあたり、多くの貴重なご助言
をいただきました明治薬科大学薬剤情報解析学教室
大野恵子准教授に深
く感謝いたします。
本研究の企画、立案、実施に際して、多くのご指導と多大なるご協力を
いただきました大分大学医学部腎泌尿器外科学
三股浩光教授、佐藤文憲
准教授に心より深謝いたします。
共同研究の遂行にあたり、ご指導、ご協力いただきました東京薬科大学
病態生化学教室
片桐文彦助教に深く感謝いたします。
また、本研究の遂行に際し、ご助言、ご協力いただきました大分大学医
学部附属病院薬剤部
佐藤雄己博士、藤岡佳奈子修士、佐藤幸恵修士、
藤岡孝志博士をはじめとする諸先生方に心より感謝の意を表します。
さらに、温かい励ましを賜りました明治薬科大学実務教育部門
邦洋講師、同大学生支援部
松本
高橋靖拡様に厚くお礼申し上げます。
最後に、日々の研究生活にあたり、優しさと愛情を持って支えてくれた
妻・聡子と両親に心より感謝します。
62
【掲載論文】
本論文は以下の論文をまとめたものである。
1. Development and clinical application of an enzyme immunoassay for the
determination of midregional proadrenomedullin.
Suzuki Y., Itoh H., Katagiri F., Sato F., Sato Y., Kawasaki K., Sato Y.,
Mimata H., Takeyama M., J. Pept. Sci., 19, 59-63 (2013).
2. Significant decrease in plasma midregional proadrenomedullin level in
patients with end-stage renal disease after living kidney transplantation.
Suzuki Y., Itoh H., Katagiri F., Sato F., Kawasaki K., Sato Y., Sato Y.,
Mimata H., Takeyama M., Peptides, 43, 102-104 (2013).
3. Relationship between plasma mid-regional pro-adrenomedullin level and
resistance to antihypertensive therapy in stable kidney transplant recipients.
Suzuki Y., Itoh H., Katagiri F., Sato F., Kawasaki K., Sato Y., Sato Y.,
Mimata H., Takeyama M., Peptides, 48, 45-48 (2013).
4. Significant increase in plasma 4β-hydroxycholesterol concentration in
patients after kidney transplantation.
Suzuki Y., Itoh H., Sato F., Kawasaki K., Sato Y., Fujioka T., Sato Y., Ohno
K., Mimata H., Kishino S., J. Lipid Res., 54, 2568-2572 (2013).
5. Association
of Plasma Concentration of 4β-Hydroxycholesterol
with
CYP3A5 Polymorphism and Plasma Concentration of Indoxyl Sulfate in
Stable Kidney Transplant Recipients.
Suzuki Y., Itoh H., Fujioka T., Sato F., Kawasaki K., Sato Y., Sato Y., Ohno
K., Mimata H., Kishino S., Drug Metab. Dispos., 42, 105-110 (2014).
63
【参考文献】
1）
Midtvedt K., Neumayer H.H., Transplantation, 70, 64-69 (2000).
2）
Tedla F., Hayashi R., McFarlane S.I., Salifu M.O., J. Clin. Hypertens.
(Greenwich), 9, 538-545 (2007).
3）
Koomans H.A., Ligtenberg G., Transplantation, 72, 9-12 (2001).
4）
Bruno S., Remuzzi G., Ruggenenti P., J. Am. Soc. Nephrol., 15, 134-141
(2004).
5）
Mason J., Br. J. Dermatol., 122, 71-77 (1990).
6）
Curtis J.J., Am. Soc. Nephrol.,
7）
Zaidenstein R., Eyal S., Efrati S., Akivis on L., Michowitz M.K., Nagornov
2, 243-245 (1992).
V., Golik A., Pharmacoepidemiol. Drug Saf., 11, 235-238 (2002).
8）
Onder G., Petrovic M., Tangiisuran B., Meinardi M.C., Markito -Notenboom
W.P., Somers A., Rajkumar C., Bernabei R., van der Cammen T.J., Arch.
Intern. Med., 170, 1142-1148 (2010).
9）
O'Connor M.N., Gallagher P., Byrne S., O'Mahony D., Age Ageing, 41,
771-776 (2012).
10） Uchida N., Kurata N., Shimada K., Nishimura Y., Yasuda K., Hashimoto M.,
Uchida E., Yasuhara H., Jpn. J. Pharmacol., 68, 431-439 (1995).
11） Leblond F.A., Giroux L., Villeneuve J.P., Pichette V., Drug Metab. Dispos.,
28, 1317-1320 (2000).
12） Leblond F., Guévin C., Demers C., Pellerin I., Gascon -Barré M., Pichette V.,
J. Am. Soc. Nephrol., 12, 326-332 (2001).
13） Rege B., Krieg R., Gao N., Sarkar M.A., Pharm. Res., 20, 1600-1606
(2003).
64
14） Naud J., Michaud J., Beauchemin S., Hébert M.J., Roger M., Lefrancois S.,
Leblond F.A., Pichette V., Drug Metab. Dispos., 39, 1363-1369 (2011).
15） Kusaba J., Kajikawa N., Kawasaki H., Kurosaki Y., Aiba T., Biopharm.
Drug Dispos., 33, 22-29 (2012).
16） Dowling T.C., Briglia A.E., Fink J.C., Hanes D.S., Light P.D., Stackiewicz
L., Karyekar C.S., Eddington N.D., Weir M.R., Henrich W.L., Clin.
Pharmacol. Ther., 73, 427-434 (2003).
17） Kirwan C.J., Lee T., Holt D.W., Grounds R.M., MacPhee I.A., Philips B.J.,
Intensive Care Med., 35, 1271-1275 (2009).
18） Kirwan C.J., MacPhee I.A., Lee T., Holt D.W., Philips B.J., Intensive Care
Med., 38, 76-84 (2012).
19） McLatchie L.M., Fraser N.J., Main M.J., Wise A., Brown J., Thompson N.,
Solari R., Lee M.G., Foord S.M., Nature, 393, 333-339 (1998).
20） Nagae T., Mukoyama M., Sugawara A., Mori K., Yahata K., Kasahara M.,
Suganami T., Makino H., Fujinaga Y., Yoshioka T., Tanaka I., Nakao K.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 270, 89-93 (2000).
21） Kitamura K., Kangawa K., Kawamoto M., Ichiki Y., Nakamura S., Matsuo
H., Eto T., Biochem. Biophys. Res. Commun., 192, 553-560 (1993).
22） Hinson J.P., Kapas S., Smith D.M., Endocr. Rev., 21, 138-167 (2000).
23） Pio R., Martinez A., Unsworth E.J., Kowalak J.A., Bengoechea J.A., Zipfel
P.F., Elsasser T.H., Cuttitta F., J. Biol. Chem., 276, 12292-12300 (2001).
24） Linscheid
P.,
Seboek
D.,
Zulewski
H.,
Keller
U.,
Müller
B.,
Endocrinology, 146, 2699-2708 (2005).
25） Nishikimi T., Curr. Med. Chem., 14, 1689-1699 (2007).
26） Kobayashi K., Kitamura K., Etoh T., Nagatomo Y., Takenaga M., Ishikawa
65
T., Imamura T., Koiwaya Y., Eto T., Am. Heart J., 131, 994-998 (1996).
27） Hirata Y., Mitaka C., Sato K., Nagura T., Tsunoda Y., Amaha K., Marumo F.,
J. Clin. Endocrinol. Metab., 81, 1449-1453 (1996).
28） Meeran K., O’Shea D., Upton P.D., Small C.J., Ghatei M.A., Byfield P.H.,
Bloom S.R., Circulating adrenomedullin does not regulate systemic blood
pressure but increases plasma prolactin after intravenous infusion in
humans: a pharmacokinetic study. J. Clin. Endocrinol. Metab., 82, 95-100
(1997).
29） Kitamura K., Kangawa K., Ishiyama Y., Washimine H., Ichiki Y.,
Kawamoto M., Minamino N., Matsuo H., Eto T., FEBS Lett., 351, 35-37
(1994).
30） Struck J., Tao C., Morgenthaler N.G., Bergmann A., Peptides, 25,
1369-1372 (2004).
31） Gumusel B., Chang J.K., Hyman A., Lippton H., Life Sci.,
57, PL87-90
(1995).
32） Kitagawa T., Shimozono T., Aikawa T., Yoshida T., Nishimura H., Chem.
Pharm. Bull., 29, 1130–1135 (1981).
33） Morgenthaler N.G., Struck J., Alonso C., Bergmann A., Clin. Chem., 51,
1823-1829 (2005).
34） Dieplinger B., Mueller T., Kollerits B., Struck J., Ritz E., von Eckardstein
A., Haltmayer M., Kronenberg F; MMKD Study Group., Kidney Int., 75,
408-414 (2009).
35） Gouya G., Sturm G., Lamina C., Zitt E., Freistätter O., Struck J., Wolzt M.,
Knoll F., Lins F., Lhotta K., Neyer U., Kronenberg F., PLoS One, 6, e17803
(2011).
66
36） Yoshihara F., Ernst A., Morgenthaler N.G., Horio T., Nakamura S.,
Nakahama H., Nakata H., Bergmann A., Kangawa K., Kawano Y., Nephrol.
Dial. Transplant., 22, 2263-2268 (2007).
37） Cockcroft D.W., Gault M.H., Nephron, 16, 31-41 (1976).
38） Huang D.T., Angus D.C., Kellum J.A., Pugh N.A., Weissfeld L.A., Struck J.,
Delude R.L., Rosengart M.R., Yealy D.M., Chest, 136, 823-831 (2009).
39） Krüger S., Ewig S., Giersdorf S., Hartmann O., Suttorp N., Welte T., Am. J.
Respir. Crit. Care Med., 182, 1426-1434 (2010).
40） Guignant C., Voirin N., Venet F., Lepape A., Monneret G., J Trauma Acute
Care Surg., 72, 293-296 (2012).
41） Al Shuaibi M., Bahu R.R., Chaftari A.M., Al Wohoush I., Shomali W.,
Jiang Y., Debiane L., Raad S., Jabbour J., Al Akhrass F., Hachem R.Y.,
Raad I., Clin. Infect. Dis., 56, 943-950 (2013).
42） Michels M., Djamiatun K., Faradz S.M., Koenders M.M., de Mast Q., van
der Ven A.J., J. Clin. Virol., 50, 8-12 (2011).
43） Kato J., Kitamura K., Eto T., J. Hum. Hypertens., 20, 566-570 (2006).
44） Bailey K.R., Grossardt B.R., Graves J.W., Hypertension, 51, 841-847
(2008).
45） Adlbrecht C., Hülsmann M., Strunk G., Berger R., Mörtl D., Struck J.,
Morgenthaler N.G., Bergmann A., Jakowitsch J., Maurer G., Lang I.M.,
Pacher R., Eur. J. Heart Fail., 11, 361-366 (2009).
46） von Haehling S., Filippatos G.S., Papassotiriou J., Cicoira M., Jankowska
E.A., Doehner W., Rozentryt P., Vassanelli C., Struck J., Banasiak W.,
Ponikowski P., Kremastinos D., Bergmann A., Morgenthaler N.G., Anker
S.D., Eur. J. Heart Fail., 12, 484-491 (2010).
67
47） Maisel A., Mueller C., Nowak R.M., Peacock W.F., Ponikowski P., Mockel
M., Hogan C., Wu A.H., Richards M., Clopton P., Filippatos G.S., Di
Somma S., Anand I., Ng L.L., Daniels L.B., Neath S.X., Christenson R.,
Potocki M., McCord J., Hartmann O., Morgenthaler N.G., Anker S.D., J.
Am. Coll. Cardiol., 58, 1057-1067 (2011).
48） Xu D., Chen W., Li X., Zhang Y., Li X., Lei H., Wei Y., Li W., Hu D.,
Wedick N.M., Wang J., Xu Y., Li J., Ma Y., PLoS One., 8, e63135 (2013).
49） Shimada T., Yamazaki H., Mimura M., Inui Y., Guengerich F.P., J.
Pharmacol. Exp. Ther., 270, 414-423 (1994).
50） Streetman D.S., Bertino J.S. Jr, Nafziger A.N., Pharmacogenetics, 10,
187-216 (2000).
51） Karayalçin U., Takeda Y., Miyamori I., Morise T., Takeda R., Steroids 56,
598-600 (1991).
52） Galteau M.M., Shamsa F., Eur. J. Clin. Pharmacol., 59, 713-733 (2003).
53） Kovacs S.J., Martin D.E., Everitt D.E., Patterson S.D., Jorkasky D.K., Clin.
Pharmacol. Ther., 63, 617-622 (1998).
54） Furuta T., Suzuki A., Mori C., Shibasaki H., Yokokawa A., Kasuy a Y., Drug
Metab. Dispos. 31, 1283-1287 (2003).
55） Bodin K., Bretillon L., Aden Y., Bertilsson L., Broomé U., Einarsson C.,
Diczfalusy U., J. Biol. Chem., 276, 38685-38689 (2001).
56） Wide K., Larsson H., Bertilsson L., Diczfalusy U., Br. J. Clin. Pharmacol.,
65, 708-715 (2008).
57） Niemi M., Kivistö K.T., Diczfalusy U., Bodin K., Bertilsson L., Fromm
M.F., Eichelbaum M., Pharmacogenet. Genomics., 16, 565-568 (2006).
58） Diczfalusy U., Kanebratt K.P., Bredberg E., Andersson T.B., Böttiger Y.,
68
Bertilsson L., Br. J. Clin. Pharmacol., 67, 38-43 (2009).
59） Josephson F., Bertilsson L., Böttiger Y., Flamholc L., Gisslén M.,
Ormaasen V., Sönnerborg A., Diczfalusy U., Eur. J. Clin. Pharmacol., 64,
775-781 (2008).
60） Goodenough A.K., Onorato J.M., Ouyang Z., Chang S., Rodrigues A.D.,
Kasichayanula S., Huang S.P., Turley W., Burrell R., Bifano M., Jemal M.,
LaCreta F., Tymiak A., Wang-Iverson D., Chem. Res. Toxicol., 24,
1575-1585 (2011).
61） Lütjohann D., Marinova M., Schneider B., Oldenburg J., von Bergmann K.,
Bieber T., Björkhem I., Diczfalusy U., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 47,
709-715 (2009).
62） Diczfalusy U., Miura J., Roh H.K., Mirghani R.A., Sayi J., Larsson H.,
Bodin K.G., Allqvist A., Jande M., Kim J.W., Aklillu E., Gustafsson L.L.,
Bertilsson L., Pharmacogenet. Genomics, 18, 201-208 (2008).
63） Bodin K., Andersson U., Rystedt E., Ellis E., Norlin M., Pikuleva I.,
Eggertsen
G.,
Björkhem
I.,
Diczfalusy
U.,
J.
Biol.
Chem.,
277,
31534-31540 (2002).
64） Klein K., Zanger U.M., Front. Genet., 4, 1-15 (2013).
65） van de Merbel N.C., Bronsema K.J., van Hout M.W., Nilsson R., Sillén H.,
J. Pharm. Biomed. Anal., 55, 1089-1095 (2011).
66） Vinik H.R., Reves J.G., Greenblatt D.J., Abernethy D.R., Smith L.R.,
Anesthesiology, 59, 390-394 (1983).
67） Nolin T.D., Frye R.F., Le P., Sadr H., Naud J., Leblond F.A., Pichette V.,
Himmelfarb J., J. Am. Soc. Nephrol., 20, 2269-2276 (2009).
68） Yang Z., Rodrigues A.D., J. Clin. Pharmacol., 50, 1330-1338 (2010).
69
69） Lecointre K., Furlan V., Taburet A.M., Fundam. Clin. Pharmacol., 16,
455-460 (2002).
70） Kagaya H., Miura M., Satoh S., Inoue K. , Saito M., Inoue T., Habuchi T.,
Suzuki T., J. Clin. Pharm. Ther., 33, 193-201 (2008).
71） Konishi H., Sumi M., Shibata N., Takada K., Minouchi T., Yamaji A., J.
Pharm. Pharmacol., 56, 1259-1266 (2004).
72） Strehlau J., Pape L., Offner G., Nashan B., Ehrich J.H., Lancet, 356,
1327-1328 (2000).
73） Sifontis N.M., Benedetti E., Vasquez E.M., Transplant. Proc., 34,
1730-1732 (2002).
74） Kuehl P., Zhang J., Lin Y., Lamba J., Assem M., Schuetz J., Watkins P.B.,
Daly A., Wrighton S.A., Hall S.D., Maurel P., Relling M., Brimer C .,
Yasuda K., Venkataramanan R., Strom S., Thummel K., Boguski M.S.,
Schuetz E., Nat. Genet., 27, 383-391 (2001).
75） Guévin C., Michaud J., Naud J., Leblond F.A., Pichette V., Br. J.
Pharmacol., 137, 1039-1046 (2002).
76） Hanada K., Ogawa R., Son K., Sasaki Y., K ikkawa A., Ichihara S., Ogata H.,
Nephron Physiol., 103, 179-186 (2006).
77） Nolin T.D., Appiah K., Kendrick S.A., Le P., McMonagle E., Himmelfarb J.,
J. Am. Soc. Nephrol., 17, 2363-2367 (2006).
78） Michaud J., Nolin T.D., Naud J., Dani M., Lafrance J.P., Leblond F.A.,
Himmelfarb J., Pichette V., J. Pharmacol. Sci., 108, 157-163 (2008).
79） Huang S.M., Temple R., Throckmorton D.C., Lesko L.J., Clin. Pharmacol.
Ther., 81, 298-304 (2007).
80） Calaf R., Cerini C., Génovésio C., Verhaeghe P., Jourde -Chiche N.,
70
Bergé-Lefranc D., Gondouin B., Dou L., Morange S., Argilés A., Rathelot
P., Dignat-George F., Brunet P., Charpiot P., J. Chromatogr. B Analyt.
Technol. Biomed. Life Sci., 879, 2281-2286 (2011).
81） Hiratsuka M., Takekuma Y., Endo N., Narahara K., Hamdy S.I., Kishikawa
Y., Matsuura M., Agatsuma Y., Inoue T., Mizugaki M., Eur. J. Clin.
Pharmacol., 58, 417-421 (2002).
82） Goto M., Masuda S., Kiuchi T., Ogura Y., Oike F., Okuda M., Tanaka K.,
Inui K., Pharmacogenetics, 14, 471-478 (2004).
83） Goto M., Masuda S., Saito H., Uemoto S., Kiuchi T., Tanaka K., Inui K.,
Pharmacogenetics, 12, 451-457 (2002).
84） Masuda S., Uemoto S., Goto M., Fujimoto Y., Tanaka K., Inui K., Clin.
Pharmacol. Ther., 75, 352-361 (2004).
85） Nakai K., Tanaka H., Hanada K., Ogata H., Suzuki F., Kumada H.,
Miyajima A., Ishida S., Sunouchi M., Habano W., Kamikawa Y., Kubota K.,
Kita J., Ozawa S., Ohno Y., Drug Metab. Dispos., 36, 1786-1793 (2008).
86） Lamba J.K., Lin Y.S., Thummel K., Daly A., Watkins P.B., Strom S., Zhang
J., Schuetz E.G., Pharmacogenetics, 12, 121-132 (2002).
87） Yamamoto T., Nagafuchi N., Ozeki T., Kubota T., Ishikawa H., Ogawa S.,
Yamada Y., Hirai H., Iga T., Drug Metab. Pharmacokinet., 18, 267-268
(2003).
88） Nakajima M., Fujiki Y., Kyo S., Kanaya T., Nakamura M., Maida Y.,
Tanaka M., Inoue M., Yokoi T., J. Clin. Pharmacol., 45, 674-682 (2005).
89） Okubo M., Murayama N., Shimizu M., Shimada T., Guengerich F.P.,
Yamazaki H., J. Toxicol. Sci., 38, 349-354 (2013).
90） Daly A.K., Clin. Pharmacokinet., 45, 13-31 (2006).
71
91） Smit P., van Schaik R.H., van der Werf M., van den Beld A.W., Ko per J.W.,
Lindemans J., Pols H.A., Brinkmann A.O., de Jong F.H., Lamberts S.W., J.
Clin. Endocrinol. Metab., 90, 5313-5316 (2005).
92） Lee S.S., Jung H.J., Park J.S., Cha I.J., Cho D.Y., Shin J.G., Mol. Biol. Rep.,
37, 213-217 (2010).
93） Itoh S., Yanagimoto T., Tagawa S., Hashimoto H., Kitamura R., Nakajima
Y., Okochi T., Fujimoto S., Uchino J., Kamataki T., Biochim. Biophys. Acta.,
1130, 133-138 (1992).
94） Bigos K.L., Bies R.R., Pollock B.G., Lowy J.J., Zhang F., Weinberger D.R.,
Mol. Psychiatry., 16, 620-625 (2011).
95） Fukuen S., Fukuda T., Maune H., Ikenaga Y., Yamamoto I., Inaba T., Azuma
J., Pharmacogenetics, 12, 331-334 (2002).
96） Saeki M., Saito Y., Nakamura T., Murayama N., Kim S.R., Ozawa S.,
Komamura K., Ueno K., Kamakura S., Nakajima T., Saito H., Kitamura Y.,
Kamatani N., Sawada J., Hum. Mutat., 21, 653 (2003).
97） Huang W.H., Hung C.C., Yang C.W., Huang J.Y., Ther. Apher. Dial., 16,
361-367 (2012).
72