ECL Prime データファイル日本語

GE Healthcare
Life Sciences
Data file
ウェスタンブロッティング検出試薬
Amersham ECL Prime
ウェスタンブロッティング試薬
1990 年に ECL（Enhanced ChemiLuminescence）ウェス
タンブロッティングシステムが登場して以来、ECL 検
出システムのポートフォリオは広がり、ルーチンのタ
ンパク質検出から Amersham ECL Plex を用いる蛍光多
重検出までの幅広いアプリケーションに対応可能とな
りました。ECL 検出システムを用いることで、放射性
同位体を使わずに、迅速、高感度かつフレキシブルな
タンパク質検出が可能です。
Amersham ECL ファミリーに新しく加わった ECL Prime
は、ECL Plus と比べて 2 倍以上の感度を示します。ECL
Prime はシグナルの安定性が大きく向上したためにく
り返し検出が可能となり、1 回の実験で複数のブロッ
トを簡単に処理できるようになりました。さらに、ECL
Prime で得られるシグナル強度は ECL Plus と比較して
3 ∼ 5 倍に増加しているため、一次抗体や二次抗体の
濃度を ECL Plus の場合の 1/3 に希釈しても検出が可能
で、バックグラウンドを低く抑え、高価な抗体の使用
量を減らすことができます。
ECL Prime（図 1）では、検出原理は ECL Plus と変わら
ないまま、その利点が強化されています。タンパク質
濃度を幅広いダイナミックレンジで高感度、安定かつ
正確に定量可能である一方で、高価な抗体の使用量は
減らすことができる検出系となっています。
図 1 Amersham ECL Prime：GE ヘルスケアが提供する新しい高感
度化学発光ウェスタンブロッティング試薬です。
• シグナル強度と感度が高く、一次抗体および二次抗
体の希釈倍率を高くしても検出が可能です。
• シグナルの安定性が高いためくり返し検出が可能で
す。多サンプル実験に適しており、反応操作終了か
ら検出までの時間を有効に利用できます。
• ImageQuant LAS 4000 シリーズ（CCD イメージャー）
を 用 い た 画 像 処 理 に 適 し て い ま す が、Amersham
Hyperfilm ECL もご利用いただけます。
• Rainbow 分 子 量 マ ー カ ー お よ び Amersham ECL
DualVue ウェスタンブロッティング用マーカーをご
利用いただけます。
• Amersham Hybond-P（PVDF）メンブレンでの使用に
適していますが、Amersham Hybond-ECL（ニトロセ
ルロース）メンブレンもご利用いただけます。
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化学発光
am ECL
Amersh
Prime
HRP
ウェスタンブロッティングにおける
ECL Prime
ECL Prime はウェスタンブロッティングの検出段階（図
3）で使用しますが、その上流プロセスにも影響します。
たとえば、ECL Prime によって検出する場合は、一次
抗体の希釈倍率を高くすることができます。これは経
済的に望ましいだけでなく、バックグラウンドシグナ
ルを抑えることができ、目的タンパク質と一次抗体の
弱い特異的相互作用を検出する可能性を向上させます。
ECL Prime の検出感度は非常に高いため、非タンパク
質結合部位をブロックするための注意および、途中の
すべての洗浄ステップを十分に行うことが必要です。
西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（HRP）
標識二次抗体
サンプル
一次抗体
ターゲット
タンパク質
ゲル電気泳動
Amersham ECL DualVue マーカー
Rainbow 分子量マーカー
Amersham Hybond-P
Amersham Hybond-ECL
Amersham ECL Prime
ブロッキング試薬
図 2 Amersham ECL Prime 試薬と二次抗体に結合した HRP との反
応。Amersham ECL Prime 試薬は HRP によって高感度分子に変換さ
れます。この高感度分子はさらに酸化を受けると励起され、減衰し
ながら発光が起こります。
タンパク質の化学発光検出
ECL Prime はウェスタンブロッティングによる微量タ
ンパク質の検出を可能にします。発光シグナル（化学
発光、図 2）は検出されたタンパク質量に比例するため、
1 枚のブロットから幅広いタンパク質濃度範囲を対象
に正確なデータを得ることができます。
マーカー
メンブレン
ブロッキング試薬
一次抗体
Amersham ECL HRP
標識二次抗体
二次抗体
Amersham ECL Prime
検出試薬
ImageQuant LAS 4000 シリーズ
Amersham Hyperfilm ECL
検出
ImageQuant TL software
解析
西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）によりルミノール
が酸化されると、波長 425 nm の化学発光が生じます。
ECL Prime は試薬中に酵素のターンオーバーを促進す
るエンハンサーが含まれているために他の化学発光試
薬と比べて性能が向上しており、シグナルの強度と持
続時間が増加します。
図 3 ウェスタンブロッティングにおける Amersham ECL Prime の
使用手順。ウェスタンブロッティングの実験は、一般的に上記の手
順で行われます。GE ヘルスケアは各実験ステップに対応する製品
を用意しており、ウェスタンブロッティング全体を通して最適なソ
リューションを提供します。
2
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ECL Prime：
性能特性
シグナルの安定性
感度および精度
ECL Prime は ECL Plus と比べて感度が高く、広いタン
パク質濃度範囲で線形的なシグナル応答が得られます。
図 4 に、ECL Prime は露光時間 75 秒、ECL Plus は露光
時間 3 分で得られた画像を示します。ECL Prime は感
度が 4 倍に向上し（図 4 の検出限界の項を参照）、ダイ
ナミックレンジが改善されているため、同じブロット
上にある多量のタンパク質と微量タンパク質の両方を
1 回の反応で検出・定量することができます。
サンプル：トランスフェリンを 2.5 ng から段階的に 2 倍希釈した溶液
メンブレン：Amersham Hybond-P
ブロッキング試薬：Amersham ECL Prime ブロッキング試薬（Amersham ECL
Prime）および 5％スキムミルク（Amersham ECL Plus）
一次抗体：ウサギ抗トランスフェリン（3,000 倍希釈）
二次抗体：HRP 標識抗ウサギ IgG（30,000 倍希釈）
検出：Amersham ECL Prime / Amersham ECL Plus
画像処理：ImageQuant LAS 4000mini（Amersham ECL Prime は露光時間 75 秒、
Amersham ECL Plus は露光時間 3 分）
検出限界：2.4 pg（Amersham ECL Prime）、9.8 pg（Amersham ECL Plus）
ダイナミックレンジ：3.0 桁（Amersham ECL Prime）、2.4 桁（Amersham ECL
Plus）
解析：ImageQuant TL 7.0 ソフトウェア
ECL Prime によって得られる化学発光シグナルは安定
性が非常に高く、サンプル中の目的タンパク質が微量
な場合も、試薬の添加から 3 時間後でも十分なシグナ
ル強度が持続します。このためくり返し検出が可能と
なり、反応操作終了から解析までの時間を有効に利用
できます（図 5 および表 1）。
ECL Plus を使用した場合は 1 時間後にシグナル強度は
15 ％となりましたが、ECL Prime を使用した場合は 1
時間後に約 60％のシグナル強度が持続していました。
サンプル：トランスフェリンを 2.5 ng から段階的に 2 倍希釈した溶液
メンブレン：Amersham Hybond-P
ブロッキング試薬：5％ウシ血清アルブミン（BSA）の PBS-T 溶液
一次抗体：ウサギ抗トランスフェリン（3,000 倍希釈）
二次抗体：HRP 標識抗ウサギ IgG（30,000 倍希釈）
検出：Amersham ECL Prime / Amersham ECL Plus
画像処理：ImageQuant LAS 4000mini（露光時間 3 分）
解析：ImageQuant TL 7.0 ソフトウェア
Time (min)
Amersham ECL Prime
2.5 ng
Amersham ECL Plus
4.9 pg 2.5 ng
9.8 pg
0
30
60
90
Amersham ECL Prime
120
2.5 ng
2.4 pg
150
Integrated Intensity (× 10 -4)
180
12000
図 5 Amersham ECL Prime 試薬の添加直後から 3 時間後までのシ
グナル強度を Amersham ECL Plus 試薬と比較しました。
10000
8000
6000
4000
2000
表1
0
0
0.5
1
1.5
2
Transferrin (ng)
2.5
3
Amersham ECL Plus
2.5 ng
試 薬 添 加 後 3 時 間 後 ま で の シ グ ナ ル 強 度。Amersham ECL
Prime および Amersham ECL Plus のいずれもバンド 4（トランスフェ
リン 0.312 ng、赤枠）に関して解析を行い、各時点での露光時間は 3
分としました。
9.8 pg
Integrated Intensity (× 10 -4)
測定時点
（反応●分後）
シグナル相対強度
（0 分後を 100 とする）
Amersham ECL
Prime
2000
1600
1200
800
400
0
0
0.5
1
1.5
2
Transferrin (ng)
2.5
3
図 4 ト ラ ン ス フ ェ リ ン を 2.5 ng か ら 段 階 的 に 2 倍 希 釈 し た 溶
液 を Amersham ECL Prime（ 上 図 ）お よ び Amersham ECL Plus（ 下
図）でウェスタンブロッティングにより検出しました。サンプルは
Amersham Hybond-P（PVDF）メンブレンにブロットし、画像解析に
は ImageQuant LAS 4000mini システムを使用しました。
Amersham ECL
Plus
0
100
100
30
76
29
60
61
15
90
42
7
120
32
5
150
24
3
180
19
2
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3
ECL Prime を使用すると、抗体の希釈倍率を高くして
も少量のタンパク質を検出することができます（図 6）。
ECL Prime を 10,000 倍希釈（一次抗体）および 50,000
倍希釈（二次抗体）で使用した場合と、ECL Plus を 3,000
倍希釈（一次抗体）および 30,000 倍希釈（二次抗体）
で使用した場合のシグナル強度および検出限界は同等
でした。
サンプル：NIH 3T3 細胞溶解液を総タンパク質量 10 μg から段階的に 2 倍希釈
した溶液
メンブレン：Amersham Hybond-P
ブロッキング試薬：5％ BSA の PBS-T 溶液
一次抗体：ウサギ抗βカテニン（3,000 ∼ 10,000 倍希釈）
二次抗体：HRP 標識抗ウサギ IgG（30,000 ∼ 50,000 倍希釈）
検出：Amersham ECL Prime / Amersham ECL Plus
画像処理：ImageQuant LAS 4000mini（一次抗体の希釈倍率が 3,000 または
5,000 倍のときは露光時間 5 分、7,000 または 10,000 倍のときは露光時間 7 分）
解析：ImageQuant TL 7.0 ソフトウェア
Ab dilution
Amersham ECL Prime
10 µg
Amersham ECL Plus
156 ng 10 µg
156 ng
Primary Secondary
1:3000 1:30 000
1:5000
1:30 000
1:7000
1:50 000
1:10 000 1:50 000
図 6 段階的に 2 倍希釈した NIH 3T3 全細胞溶解液中の β カテニン
を、ウサギ抗βカテニンおよび HRP 標識抗ウサギ IgG を用いてウェ
スタンブロッティングにより検出した結果を Amersham ECL Prime
および Amersham ECL Plus に関して比較しました。
製品との適合性
ECL Prime は、GE ヘルスケアが提供する Hybond-P メ
ンブレンなどのウェスタンブロッティング用製品とと
もに使用した場合に至滴化していますが、ウェスタン
ブロッティング実験で一般に使用される他の製品にも
対応しており、Hybond-ECL ニトロセルロースメンブ
レンだけでなく、ECL Prime 用として特に推奨されて
いない分子量マーカーやブロッキング試薬を使用した
場合にも良好な結果が期待できます。
4
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細胞溶解液中に含まれるさまざまな濃度の
ターゲットタンパク質の相対定量
ECL Prime をダイナミックレンジが広い ImageQuant
LAS 4000mini などの CCD イメージャー画像解析装置
と組み合せれば、同一ブロット上に存在するハウスキー
ピングタンパク質の濃度を標準化することによって、
ターゲットタンパク質を高い信頼性で相対定量可能で
す（図 7）。ハウスキーピングタンパク質の発現量をモ
ニターすることにより、各レーンに等量の全細胞溶解
液がアプライされたことを確認できます。
サンプル：NIH 3T3 細胞溶解液（総タンパク質量 10 μg、IFN-α 処理済みの細
胞と未処理の細胞がさまざまな比率で存在）または HeLa 細胞溶解液（アニソ
マイシン処理済みの細胞と未処理の細胞がさまざまな比率で存在）
メンブレン：Amersham Hybond-P
ブロッキング試薬：5％ BSA の PBS-T 溶液
一次抗体：ウサギ抗βカテニン（3,000 倍希釈）、マウス抗 pSTAT3（3,000 倍
希釈）またはマウス抗アクチン（3,000 倍希釈）
二次抗体：HRP 標識抗ウサギ IgG（30,000 倍希釈）または HRP 標識抗マウス
IgG（30,000 倍希釈）
検出：Amersham ECL Prime
画像処理：ImageQuant LAS 4000mini（βカテニンは露光時間 3 分、アクチン
は露光時間 1 分）
解析：ImageQuant TL 7.0 ソフトウェア
β- catenin
pSTAT3
Actin
(houskeeping
protein)
Actin
(houskeeping
protein)
β- catenin
Expression relative to actin
抗体の節約
pSTAT3
2.5
1.4
2
1.2
1
1.5
0.8
1
0.6
0.4
0.5
0.2
0
0
1
2
3
4
Lysate sample
5
1
3
4
2
Lysate sample
5
図 7 （A）5 種 類 の NIH 3T3 細 胞 溶 解 液 中 に 含 ま れ る βカ テ ニ ン
および（B）5 種類の HeLa 細胞溶解液中に含まれる Tyr705- リン酸
化 STAT3（pSTAT3）のウェスタンブロッティング検出。同一の細胞
溶解液中に含まれるアクチン濃度を 1 枚のブロット上で標準化す
ることによってターゲットタンパク質を相対定量しました。目視で
はβカテニン量が同じに見えますが、Amersham ECL Prime および
ImageQuant LAS 4000mini を用いた解析ではタンパク質濃度が明ら
かに異なることがわかります。
微量のリン酸化タンパク質の検出
STAT3 は黒色腫の進行および宿主免疫に関与する転写
活性化因子です。STAT3 は、細胞を IFN-α などの特定
のサイトカインで処理したときに起こる特異的チロシ
ン残基のリン酸化によって活性化されます。
IFN-α で 処 理 し た HeLa 細 胞 溶 解 液 を 総 タ ン パ ク 質
量 12.5 μg か ら 段 階 的 に 2 倍 希 釈 し た 溶 液 を 用 い て
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、Hybond-P
メ ン ブ レ ン に ブ ロ ッ ト し ま し た。 特 異 抗 体 に
よる処理後に Amersham ECL Prime と反応させ、リン
酸化された STAT3 を検出しました（図 8）。
– Control
サンプル：IFN-αで処理した HeLa 細胞溶解液を総タンパク質量 12.5 μg から
段階的に 2 倍希釈した溶液
メンブレン：Amersham Hybond-P
ブロッキング試薬：5％ BSA の PBS-T 溶液
一次抗体：マウスモノクローナル抗 pSTAT3（Tyr705）
（3,000 倍希釈）
二次抗体：HRP 標識抗マウス IgG（30,000 倍希釈）
検出：Amersham ECL Prime / Amersham ECL Plus
画像処理：ImageQuant LAS 4000mini（露光時間 5 分）
解析：ImageQuant TL 7.0 ソフトウェア
12.5 µg
98 ng
Amersham ECL Prime
Amersham ECL Plus
図8
IFN-αで処理した HeLa 細胞溶解液中に含まれる pSTAT3 の
Amersham ECL Prime および Amersham ECL Plus によるウェスタン
ブロッティング検出。Amersham ECL Prime では Amersham ECL Plus
と比べてより強いシグナルが得られるため、タンパク質検出感度が
向上しています。コントロールのレーンには未処理細胞の溶解液（総
タンパク質量 6.25 μg）をアプライしました。
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■ ECL Prime ご注文情報
製品名
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent
New
包装
コード番号
2
for 1,000 cm membrane
RPN2232
包装
コード番号
※ 2011 年 1 月中旬発売予定。
※ 化学蛍光検出には対応しておりません。
■ 関連製品
製品名
試薬
ECL Prime Blocking Reagent
40 g
RPN418
10 sheets
RPN2020F
1 ml
NA933-1ML
New
Hybond-P（20 × 20 cm）
Anti-Human IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep
＊
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey
＊
1 ml
NA934-1ML
250 µl
RPN800E
25 gel loadings
RPN810
ImageQuant LAS 4000mini システム
1式
問合せ
ImageQuant LAS 4000 システム
1式
問合せ
ImageQuant LAS 4010 システム
1式
問合せ
Full-Range Rainbow Molecular Weight Markers
ECL DualVue Western Blotting Markers
画像解析装置
＊ この抗体の力価は IgG に対してのみ評価を行っています。IgG 以外のクラス（IgM, IgE, IgA など）に対しても弱い反応性を示す可能性がありますが、IgG 以外の検出には適し
ていません。
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掲載されている価格は 2010 年 12 月現在の希望小売価格です（表示価格には消費税は含まれておりません）
。希望小売価格は単なる参考価格であり、弊社販売代理店が自主的に設定する販売価格を何ら
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いる社名や製品名は、各社の商標または登録商標です。お問い合わせに際してお客さまよりいただいた情報は、お客さまへの回答、弊社サービスの向上、弊社からのご連絡のために利用させていただく
場合があります。
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