2013年 第133年会日本薬学会 （横浜） ポスター 優秀発表賞受賞

組
織
委
員
長
松
木
則
夫
日
本
薬
学
会
第
一
三
三
年
会
平
成
二
十
五
年
三
月
三
十
日
表
賞
を
授
与
し
ま
す
よ
っ
て
こ
れ
を
表
彰
し
、
優
秀
発
を
行
い
ま
し
た
年
会
に
お
い
て
優
れ
た
研
究
発
表
あ
な
た
は
日
本
薬
学
会
第
一
三
三
南
状
知
尋
殿
優
秀
発
表
賞
質量分析計を用いた神経細胞接着分子 L1 (L1CAM) の
糖鎖修飾構造の解析
29pmC-215
Mass spectrometric characterization of the glycosylation sites and pattern of
neural cell adhesion molecule L1 expressed in murine brain
(徳島文理大学・香川薬学部・薬物治療学)
○ 南知尋, 渡邊正知, 伊藤康一
○ Chihiro Minami, Masatomo Watanabe, Kouichi Itoh
(Lab of Mol & Cell Neurosci,
Neurosci Kagawa Sch of Pharmaceutical Sci,
Sci Tokushima Bunri Univ.)
Univ )
要旨
L1CAM の糖鎖結合部位の同定
L1CAM tryptic fragments
1600
1800
2000
Intensitty (%)
S
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ
細胞膜
1600
1800
2000
COOH
100
100
80
80
IgG
IP: Rabbit pAb-L1CAM (pAb-L1Y3)
1st Ab: Goat pAb-human L1CAM
2nd Ab: anti-Goat IgG (HRP-labeled)
Detection: Supersignal West Pico
2200
IP: pAb-L1Y3
Detection: SYPRO Ruby staining
2400
m/z
糖ペプチドの精製
精製した L1CAM は、5％ SDS-PAGE にて分離後、トリプシンを用いゲル内で
消化した。トリプシン消化したペプチド断片は、Speed Vac で完全に乾燥させ、
Solution A (1-Butanol : Ethanol : DW = 4 : 1 : 1) 100 L にて再溶解した。再溶解
したサンプルに Sepharose CL-4B (SIGMA) 10 L を加え、室温で 1 時間激しく攪
拌した。Sepharose CL-4B に結合した糖ペプチドは、50% Ethanol 100 L にて抽
出した 。抽出した糖ペプチドは、Speed Vac にて乾燥させた後、DW 10 L にて
再溶解し質量分析用サンプルとした。
糖鎖の精製
糖鎖精製およびラベル化は、住友ベークライトの糖鎖精製キット BlotGlyco (プ
ロトコ ル 部改編) に準じた。精製した
ロトコール一部改編)
に準じた 精製した L1CAM は、トリプシンを用いたゲル内
は トリプシンを用いたゲル内
消化後、N 結合型糖鎖修飾消化酵素である PNGase F (5 Unit, Roche) を用いて糖
鎖を消化した (37℃, over night) 。糖鎖消化反応後、BlotGlyco ビーズ 50 L を添
加し、2% 酢酸/アセトニトリルにて糖鎖をビーズへ固相化した。固相化した糖鎖は、
500 mM 1-methyl-3-p-tolyltriazene (MTT) にてシアル酸のメチルエステル化処理
を行った後、 N-((Aminooxy)acetyl)tryptophanylarginine Methyl Ester (aoWR
(H) ) Hydrochloride により糖鎖の回収および糖鎖還元末端のラベル化を行った (図
3)。ラベル化された糖鎖は、NuTip Carbon (Glygen) にて濃縮・精製し、質量分
析用サンプルとした。
Molecular & Cellular Proteomics 4: 1977–1989, 2005.
質量分析
サンプルを Focus plate (f 600 nm, SIMADZU) にアプライした後、Matrix とし
て 10 mg/mL 2,5- hydroxybenzoic acid (DHBA, SIGMA) in 0.1% TFA, 50%
CH3CN を 0.5 L 重層した。完全に風乾させた後、MALDI-TOF (AXIMA-CFR,
SIMADZU)、MALDI-QIT/TOF (AXIMA-QIT, SIMADZU) により質量分析を行った。質
量分析計のキャリブレーションは、10 pmol 副腎皮質刺激ホルモン (ACTH) と 10
pmol アンギオテンシン II (Ang II) にて行った。
質量分析計の測定条件を以下に示す。
Exp.Tech.;
Tuning mode: positive, Detection Mass Range: 100.0-5000.0.
Firing;
Power: 50-80, Focus Mass Range: Mid 750 or High 2k.
CID;
Resolution: Std, Isotopic Selection (~250) , CID Control: 150~250.
Peak Processing; Peak width: 1, Smoothing method: off,
Peak detection method: Threshold -25% Centroid.
2800
800
900
1000
1100
1200
m/z
Intensity (%)
162
1502.10
1340.10
1300
（ハイマンノース型）
★
1400
1500
1600
1700
Intensity (%)
162
162
162
203
162
203
162
★
1000.40
1851.64
2054.80
1486.64 1689.74
600
800
3000
1000
1200
1400
1600
m/z
1800
2000
（複合型）
2200
2400
2600
2800
2400
2600
2800
2600
2800
797.07
100
2601.90
★
146
203
162
162
162
203
203
1000.04
600
800
203
★
1689.07
1162.00
1324.03
1588.87
162
1892.19
2054.10
651.05
50
50
1000
1200
（複合型）
1400
1600
m/z
1800
2000
2200
(E) 2403.14 m/z の MS2 スペクトル
1600
1800
2000
2200
2400
m/z
2600
2800
3000
1468.68
★
1588.72
83 120
X10
203
162
162 162 162 162
1385.68
★
: N-acethylglucosamine
2115.87
2277.91
2439.85
2601.90
★
1791.71
: Mannose
200
400
600
800
1000
1200
MS3
1400
1600
m/z
y6
PYAN
2200
2400
2600
2800
473
FFPYANGTLSIR
473
484
400
500
700
MS3
900
m/z
FFPYANGTLSIR484
y4
1300
*
1400
*
y7+83
50
1500
300
400
500
600
700
800
900
1000
FFPYANGTLSIR484
y10+83
1100
1200
1300
1400
1500
1600
L1CAM の 糖 ペ プ チ ド は 、 糖 鎖 の 親 水 性 を 利 用 し た
Sepharose CL-4B を用いて精製濃縮した (C)。
糖ペプチド由来と思われるピーク
2601.90 m/z (★) の MS2 解析を行った
ところ、 右図に示すような、N 結合型
糖鎖結合に特徴的な 83 m/z と 120 m/z
間隔の環開裂ピークが認められた (D)。
GlcNAc
O
162
162
800
1000
1200
（複合型）
2200
2400
162
203
1400
203
203
162
203
146
2244.16
2095.14
2257.04 2460.14
1600
m/z
1800
2000
2200
203
162
2400
★
2600
2800
797.06
146
NH2
146
203
162
162
162
203
203
1000.09
1486.13
651.04
600
800
1000
1200
1400
1892.25
m/z
1800
2000
2200
2400
|
S
|
S
GlcNAc の環開裂
S
さらに、環開裂に起因する 1385.68 m/z, 1468.68 m/z の MS3
解析を行った。1385.68 m/z (★) の MS3 解析データを基に
MASCOT 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、 L1CAM の
473FFPYANGTLSIR484 と同定された (E)。
次に、1468.68 m/z (★) の MS3 スペクトルを解析したところ、
y シリーズおよび b シリーズともに +83 の MS シフトが認めら
れ、 478Asn に N 結合型糖鎖が結合している事が明らかとなっ
が
が
た (F)。
細胞膜
以上より、L1CAM を構成する 5 番目の免疫グロブリン C2
様ドメイン構造内にある 478Asn に N 結合型糖鎖が結合してい
ることが明らかとなった。
|
★
（複合型）
2800
: Mannose (162)
: Galactose (162)
1664.4
★
100
S
: Fucose (146)
: N-glycolylneuraminic acid (307)
2257.1
S
GlcNAc
83
2600
: N-acetylglucosamine (203)
S
~Asn-X-Ser/Thr~
162
203
2403.11
2622.17
2257.16
2606.12
1688.99
1600
146
2095.13
(A) で検出された代表的な糖鎖ピークのうち、1664.4 m/z (★), 2216.8 m/z (★),
2257.1 m/z (★), 2403.1 m/z (★), 2606.1 m/z (★) および 2768.1 m/z (★) それぞ
れについて、AXIMA-QIT にて MS2 解析を行い、各スペクトルのピーク間隔とその
強度から、結合している糖鎖の種類と構造を推定した (B-G)。
S
CH2OH
O
2000
1690.06 1892.12
|
120
1800
L1CAM の糖鎖は BlotGlyco にて精製・ラベル化した。得られた糖鎖の質量を
AXIMA-CFRplus にて分析したところ、複数のピークが検出された (A)。
|
CH2OH
O
HO
環開裂
AcHN
162
S
O
AcHN
m/z
S
~~~
HO
1600
1000.11
600
50
0
y8+83
m/z
1400
X2
1600
★
0
200
203
651.03
★-H2O
473
b9+83
1200
50
484
b9
X2
y6
1000
★
2054.08
(G) 2768.08
2768 08 m/z の MS2スペクトル
y8 y7 y6 y5 y4
473
146
2241.18
1892.11
（複合型）
スペクトル
FFPYANGTLSIR
y5
PYAN+83
1200
203
797.08
146
0
★
1100
162
X2
y11
1000
203
1689.73
800
100
y8
800
203
★-H2O
y10
10
600
162
162
1000.09
600
100
300
162
(F) 2606.09 m/z の MS2スペクトル
X2
b9
162
2257.15
651.07
b9
y5
203
50
0
3000
y8 y7 y6 y5
PYA
0
200
2000
スペクトル
y7
50
1800
X2
146
NXS/T
環開裂
50
797.07
100
0
Intensity (%)
700
203
651.31
0
100
Intensity (%)
600
162
162
1178.02
(D) 2257.11 m/z の MS2 スペクトル
2600
2216.8
2606.1
1988.1
1892.6
1825.6
2403.1
★
2054.7
|
0
1000
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ
1500
★
★
2000
2768.1
2913.0
★
★
S
S
: Label (447.22)
50
S
2500
3075.3
3382.4
3000
m/z
3500
4000
糖鎖予想構造
COOH
MS2 解析によって同定された糖鎖構造（スペクトル上段, B-G）および予想された糖
鎖構造（スペクト下段）を AXIMA-CFRplus で検出したスペクトル (A) に帰属させた。
結論
☆糖鎖結合部位解析より
L1CAM を構成する 5 番目の免疫グロブリン C2 様ドメイン構造
内にある 478Asn に N 結合型糖鎖が結合している。
図 3 aoWRs によるオリゴサッカライドのラベル化反応。ヒドラゾン−オキシム交換反応により、
BlotGlyco ビーズから固相化された糖鎖を再遊離させ、同時に糖鎖還元末端を aoWR (H) にてラベルする。
162
50
1468.81
y11 y10
図 2 抗L1CAM抗体による L1CAM の精製
マウス脳膜タンパク質分画 から抗
L1CAM 抗体 (pAb-L1Y3) を用いた免疫沈
降により L1CAM を精製した。得られた
L1CAM は 5% SDS-PAGE にて分離後、抗
L1CAM 抗体によるイムノブロット (A) お
よびSYPRO Ruby 染色 (B) にて検出した。
マウス脳神経細胞に発現する L1CAM は
分子量 210 kDa として検出される (A, B)。
またL1CAM は、3番目の FNⅢ様ドメイン
内で内因性の Plasmin や Neuropsin によ
り加水分解されるため、細胞外ドメインで
構成される 140 kDa の分子量を呈する (B)。
500
0
y10
140 kDa
L1CAM
162
797.37
糖ペプチド由来のピーク
(E) 1385.68 m/z の
IP: anti-L1CAM
203
146
(D) 2601.90 m/z の MS2 スペクトル
クト
図 1 L1CAM の 2 次構造
L1CAM の細胞外ドメインには、N 結合
型糖鎖修飾の予測配列 (Asn-X-Ser/Thr)
が 22 か所存在する ( )。
4000
100
2601.53
0
1400
Intensity (%)
フィブロネクチンⅢ
(FFNⅢ) 様
ドメ
メイン構造
|
3500
(C) 2216.77 m/z の MS2 スペクトル
3000
Intensity (%
%)
S
細胞内
領域
150
2800
2255.48
100
80 kDa
150
2600
2084.13
50
(F) 1468.68 m/z の
210 kDa
L1CAM
2400
Intensity (%)
|
S
210 kDa
250
2200
m/z
(C) Sepharose CL-4B で精製した糖ペプチドの MS スペクトル
S
203
0
400
Intensity (%)
|
S
Intensity (%)
S
3000
m/z
854.02
Intensity (%)
免疫グロブリン C2
(IgC2) 様ドメイン構造
|
140 kDa
細胞外
領域
S
2500
X5
2255.36
0
1400
|
2000
2768.1
★
★
651 06
651.06
50
2084.21
S
S
1500
100
Intensity (%)
Intensity (%)
50
100
250
0
1000
(B) Sepharose CL-4B 非吸着分画の MS スペクトル
S
2606.1
2403.1
★
448.02
0
1400
|
2257.1
(B) 1664.35 m/z の MS2 スペクトル
トリプシン消化ペプチド由来のピーク
S
2216.8
50
★
★
100
100
Mr
(kDa)
(B)
(A) L1CAM の Trypsin 消化断片の MS スペクトル
L1CAM の精製
12-16 週齢の雄雌マウス (ICR, 35-45 g) マウスより摘出した脳組織は、0.32 M
Sucrose を含む 3 mM HEPES-NaOH
HEPES NaOH (pH 7.3)
7 3) buffer にてホモジナイズ 後、細胞質
後 細胞質
分画 (上清) と膜分画 (沈査) とに分離した。得られた膜分画 (沈査) を、1% NP-40,
0.5% Sodium Deoxycholate を含む 20mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer にて可溶化し、
膜タンパク質分画とした。 L1CAM は、抗 L1CAM抗体 (pAb-L1Y3) を用いた免疫
沈降法により膜タンパク質分画中から精製した (図2)。
Mr Input
非吸着 溶出
(kDa) (25 g)
Ppt
Sepharose CL-4B
(4% 架橋アガロース)
L1CAM glycopeptides
方法
(B)
Intensity (%)
Sup
+
NH2
S
1664.4
★
100
(A)
背景と目的
IP: anti-L1CAM
(A) L1CAM の糖鎖の MS スペクトル
100
1984 年 Rathjen
R thj
と Schahner
S h h
によ て発見され
によって発見され
た神経細胞接着分子 L1 (L1CAM) は、6 個の免疫グ
ロブリン C2 (IgC2) 様ドメインと 5 個のフィブロ
ネクチンⅢ (FNⅢ) 様ドメインからなる細胞外領域、
1 回膜貫通領域および細胞内領域から構成される分
子量約 210 kDa の細胞接着分子である。また、細
胞外領域には 22 箇所の N 結合型糖鎖修飾部位が予
測されている (図 1)。
神経細胞特異的に発現する L1CAM は、ホモフィ
リックあるいはヘテロフィリックな結合を介して、
細胞接着・細胞移動・軸索伸長・軸索線維束形成な
ど脳の高次構造形成過程において重要な役割を担う
(Fields and Itoh, Trends Neurosci, 1996)。それゆ
え、L1CAM の機能・発現異常 (IgC2 様ドメイン領
域におけるミスセンス変異によるホモフィリック結
合能の欠損や FNⅢ様ドメイン領域におけるミス
合能の欠損や、FNⅢ様ドメイン領域におけるミス
センス変異によるフォールディング異常) は、水頭
症などの重篤な脳神経疾患を引き起こす。
細胞接着分子の糖鎖修飾構造は、細胞間の相互作
用など分子機能の発現に重要な役割を担う。しかし
L1CAM は、糖鎖修飾構造の詳細が未だ不明なため、
糖鎖を介した L1CAM機能的多様性はこれまでほと
んど報告されていない。
そこで本研究では、脳内に発現する L1CAM の糖
鎖結合部位および糖鎖修飾構造の同定を目的とした。
(A)
L1CAM の糖鎖修飾構造の同定
結果
【目的】神経細胞特異的に発現する神経細胞接着分子 L1 (L1CAM) は、細胞接
着・細胞移動・軸索伸長・軸索線維束形成など脳の高次構造形成過程において重
要な役割を担う。その機能調節には L1CAM の糖鎖修飾構造の関与が示唆されて
いるが、詳細な構造は未だ不明である。そこで本研究では、質量分析計を用い、
L1CAM の糖鎖修飾部位および糖鎖修飾構造の同定を目的とした。
【方法】1. 糖鎖結合部位の同定: マウス脳ホモジネートから免疫沈降により
L1CAMを精製した。糖鎖を含む L1CAM ペプチドは、トリプシンにて消化後
Sepharose CL-4B を用いて精製した。糖鎖結合部位は、MALDI-TOF (AXIMACFRplus), MALDI-QIT/TOF (AXIMA-QIT) にて解析した。2. 糖鎖構造の同定: L1CAM
の糖鎖は、Peptide-N-glycosidase F にて消化後、BlotGlyco (住友ベークライト)
にて還元末端をラベル化し精製した。精製した糖鎖の構造は、質量分析計にて解
析した
析した。
【結果及び考察】1. 糖鎖結合部位: 精製した糖ペプチドの MS2 解析を行ったとこ
ろ、N 結合型糖に特徴的な環開裂ピークが認められた。次に、コアペプチドの
MS3 解析を行い MASCOT 検索を行ったところ、L1CAM 473FFPYANGTLSIR484 とし
て同定された。さらに、コア+83m/z の MS3スペクトルを解析したところ、y イオ
ンおよび b イオンともに環開裂に起因するシグナルシフトが認められた。以上よ
り、免疫グロブリン C2 様ドメイン構造内にある Asn478 に N 結合型糖鎖が結合
していることが明らかとなった。2. 糖鎖構造: 精製した糖鎖の MS2 解析より、マ
ウス脳内に発現する L1CAM は複数の複合型糖鎖とハイマンノース型糖鎖によっ
て多様な翻訳後修飾を受けていることが明らかとなった。本知見より、L1CAM 糖
鎖構造の詳細なプロセシング過程および関連する酵素群が推測可能となり、今後
の糖鎖構造解析に有用な情報をもたらすことが期待された。
小胞体
1988.1
ゴルジ
1825.6
ゴルジ
マンノシ
ダーゼ IB
ゴルジ
マンノシ
ダーゼ IC
細胞膜
1664.4
1892.6
GlcNAc
転移
酵素 I
ゴルジ
マンノシ
ダーゼ II
GlcNAc
転移
酵素 II
☆糖鎖修飾構造解析より
L1CAM は、複数種類の複合型糖鎖, ハイマンノース型糖鎖によっ
て多様な糖鎖修飾を受けている。
ガラクトース
転移酵素
同定された糖鎖情報から、L1CAM 糖鎖構造の詳細なプロセシン
グ過程および関連する酵素群を図 4 に予想した 。これらは今後糖鎖
構造解析に有用な情報をもたらすことが期待される。
また、今回、ゴルジ体に存在すると考えられるハイマンノース型
糖鎖構造を有する L1CAM が検出された。このことは、L1CAM の
機能と糖鎖プロセシングとの関連性を解明する上で、重要な知見と
なることが期待される。
2054.7
2216.3
2257.1
2403.1
2606.1
2768.1
2913.0
3075.3
3382.4
GlcNAc
転移
酵素 II
フコース
転移酵素
GlcNAc
転移
酵素 II
図 4 L1CAM の N 結合型糖鎖修飾における
プロセシング予想図
今回同定された糖鎖構造と MS ピーク間
隔より予想される糖鎖構造情報をもとに、
L1CAM の糖鎖プロセシング及び動態を予
測した。
ガラクトース フコース
転移酵素
転移酵素
シアル酸
転移酵素