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プログラム・要旨集
生物物理関東地区研究会 プログラム・要旨集 会期：2012 年 3 月 5 日（月）・6 日（火） 会場：東京農工大学小金井キャンパス・140 周年記念会館 生物物理関東地区研究会（第 0 回生物物理関東支部研究会？）へのお誘い 研究者間の交流と学生のエンカレッジを目的として、生物物理の関東地区のメンバーを中心とした研 究会の開催を計画しています。将来的には生物物理関東支部の活動として認められる方向で、生物物理 学会の運営委員会で議論をしていただいています。 研究会のスタイルは、全員で 1 つの発表をじっくり聞くというものです。時間の短い A 発表と時間の 長い B 発表のどちらかを選ぶことが出来ます。ある程度まとまった話をじっくり議論したい場合は B 発 表を、予備的な話だが反応を見たいとか、学生のトレーニングの機会としたいなどの場合は A 発表を選 ぶのがよいかもしれません。もちろん、学生さんが B 発表に申し込んでいただくのも歓迎します。 賛同者リスト 発起人（五十音順）（5 名）：太田 善浩（東京農工大）、加藤 薫（産総研）、黒田 裕（東京農工大）、園山 正史 （群馬大）、由良 敬（お茶の水女子大） 事務局：東京農工大学・大学院工学研究院・生命工学専攻 太田善浩 日 Email: ohta ＠cc.tuat.ac.jp 時：3 月 5 日（月）10：10～・6 日（火）9：20～ (初日は第一発表 20 分前、二日目は 10 分前から受付を開始) 懇 親 会：3 月 5 日：17:30～19:30 場 所：東京農工大学小金井キャンパス・140 周年記念会館（エリプス）3 階会議室 参 加 費：事前申し込み 3000 円（学生 0 円）懇親会金額 3000 円（学生 2000 円） 当日申し込み 4000 円（学生 1000 円）懇親会金額 3000 円（学生 2000 円） 懇親会費は準備の関係 3 月 5 日 13：30 までにお支払い下さい それ以降ご参加の方は会場で懇親会費を頂きますので事前に連絡を下さい 参加資格：生物物理に興味がある人（生物物理の学会員であるかどうかは問いません） 参加者へのご案内 発表形式：日本語による口頭発表（外国の方は英語も可） 、液晶プロジェクター使用 A 発表:講演 7 分・質疑応答 3 分 B 発表：講演 15 分・質疑応答 10 分 以下の通りベルを鳴らします。タイムキーパーは座長が務めます。 ベル 1 回：講演時間終了、質疑応答開始 ベル 2 回：質疑応答終了 時間厳守で講演を進めてください。次に発表する方は前の発表が終わり次第、速やかにパソコンの 接続準備等をしてください。 各自パソコンをご持参ください。 パソコンを持ち込まれる際のご注意 ※会場のプロジェクターとお持ち込みのパソコンとの接続は D-sub15 ピンとなります。付属のコネクターが必 要な場合、お忘れなくご持参ください。 ※バッテリー切れに備え、必ず電源アダプターをお忘れなくご持参ください。 ※発表中にスクリーンセーバーや省電力モードにならないよう、設定してください。 パソコン側（メス） 接続ケーブル側（オス） 事務局で予備のパソコンを用意します。 （仕様：OS:Windows7／パワーポイント 2003）上記仕様に 対応するパワーポイント資料を USB にてご持参ください。 昼食はエリプス、大学生協食堂・パンショップがご利用になれます。 春休み営業です：エリプス 11：00～14：00、食堂 11：30～13：30 会場内に無線 LAN でインターネットの接続が可能です。 無線 LAN 接続に必要な ESSID、WEP キー、 認証 ID、パスワードは当日お知らせいたします。 注意事項 ※Windows7 で接続テスト済みです。それ以前の OS での動作は未確認です。 ※IEEE802.11b/g の規格で接続ができる必要があります。IEEE802.11a/n に対応していますが、外部アンテナ の設置の関係上利用できない場合があります。 ※ すべてのカードの接続検証は行っていません。一部無線 LAN カードが使用できない可能性があります。 ※無線 LAN アクセスサービスは、経路の暗号化がなされておりません。 交通及び会場のご案内 交通案内：JR 中 央 線 「 東 小 金 井 駅 」 下 車 、 徒 歩 約 10 分 住 所 ： 184-8588、 東 京 都 小 金 井 市 中 町 2-24-16 キャンパス案内：エリプス 3 階会議室 食堂・パン エリプス プログラム 3 月 5 日（月） 10：30～ 30～10： 10：35（ 35（5 分程度） ～生物物理関東地区研究会（第 ～生物物理関東地区研究会（第 0 回生物物理関東支部研究会？）へのお誘い～ 太田善浩（東京農工大学・大学院工学研究院・生命工学専攻） 座 長 由良 敬（お茶の水女子大学・生命情報学教育研究センター） 中村周吾（東京大学大学院・農学生命科学研究科・応用生命工学専攻） 【1AM1】 AM1】10： 10：35～ 35～12： 12：35 ① cross profile analysis により同定されたタンパク質セグメントの収斂（25 分） p. 1 富井健太郎(産業技術総合研究所) ② SAXS 法によるタンパク質立体構造の計算科学的解析（25 分） p. 1 森本康幹(東京薬科大学) ③ 高圧下における a アクチン構造安定性の理論的解析（25 分） p. 2 若井信彦（東京大学大学院・新領域創成科学研究科） ④ ロボット工学の手法を用いたタンパク質シミュレーション（10 分） p. 2 山守 優（東京大学大学院・新領域創成科） ⑤ 全原子量子化学計算法による、レチナールタンパク質の吸収波長制御メカニズムの解析（25 分） p. 3 林 智彦（東京工業大学院・生命理工学研究科・生体分子機能工学専攻） ⑥ 構造ドメインデータベースの作成およびその Web 提供（10 分） p. 3 梅澤祐貴（東京農工大・工学部・生命工学科） ～ 昼 座 長 食 ～ 加藤 薫（産業技術総合研究所） 瀧ノ上正浩（ 瀧ノ上正浩（東京工業大学大学院・総合理工学研究科知能システム科学専攻） 東京工業大学大学院・総合理工学研究科知能システム科学専攻） 【1PM1】 PM1】13：30～ 30～14：55 ① プロリン異性化酵素の散歩道（25 分） p. 4 伊倉貞吉（東京医科歯科大学） ② Cyclophilin D の活性阻害が細胞内薬物輸送に及ぼす影響（10 分） p. 4 四戸大介（東京農工大学・工学部・生命工学科） ③ Cyclophilin D が細胞のエネルギー代謝に及ぼす影響（10 分） p. 5 中里 眸（東京農工大学・工学部・生命工学科） ④ VanX の大腸菌溶菌活性を利用した新規スクリーニング法の開発（10 分） Wu Nan（東京農工大学・工学府・生命工学専攻） p. 5 ⑤ マイクロドロップレットアレイを用いた多剤排出トランスポーター遺伝子スクリニーング 法の開発（10 分） p. 6 雨澤広海（東京大学・工学部・応用化学科野地研究室） ⑥ トルク減少型変異体 F1 モーターにおける ATP 結合･解離及び ATP 加水分解･合成の平衡定 数の角度依存性（10 分） p. 6 小安司馬（東京大学・工学部・応用化学科・野地研究室） ⑦ UTP を基質としたときの F1-ATPase の回転運動（10 分） p. 7 新井秀信（東京大学・工学系研究科・応用化学・野地研究室） ～ 休 座 長 憩 ～ 吉村英恭（ 吉村英恭（明治大学） 明治大学） 園山正史（ 園山正史（群馬大学大学院・工学研究科・応用化学生物化学専攻） 群馬大学大学院・工学研究科・応用化学生物化学専攻） 【1PM2】 PM2】15：10～ 10～16：50 ① 酸化コレステロールが与えるリン脂質膜分子充填への影響（10 分） p. 7 星野達也（群馬大学大学院・工学研究科・応用化学生物化学専攻） ② High resolution Crystal structure of Dengue 3 envelope protein domain III (ED3) （10 分） p. 8 Montasir Elahi（東京農工大学・工学府・生命工学専攻） ③ 二次元結晶からのアクアグリセロポリン AQP3 の投影像（10 分） p. 8 光岡 薫（産業技術総合研究所・バイオメディシナル情報研究センター） ④ n-アルキル-β-グルコシドにより可溶化したバクテリオロドプシンの構造・安定性（10 分） p. 9 舟見顕彰（群馬大学大学院・工学研究科・応用化学生物化学専攻） ⑤ In-situ 光照射固体 NMR による光受容膜タンパク質の光中間体の捕捉とタンパク質構造変 化の解析（25 分） p. 9 内藤 晶（横浜国立大学・大学院工学研究院） ⑥ 天然変性タンパク質 p53 による標的タンパク質 CBP の分子認識（25 分） p.10 新井宗仁（東京大学大学院・総合文化研究科・広域科学専攻 生命環境科学系） ⑦ 抗体精製に向けた pH 感受性の高いリガンドタンパク質の設計（10 分） 塚本雅之（東京大学大学院・新領域創成科学研究科・メディカルゲノム専攻） 17：00～ 00～17：30 ～支部立ち上げに関する意見交換～ 支部立ち上げに関する意見交換～ 17：30～ 30～19：30 ～ 懇 親 会 ～ p.10 3 月 6 日（火） 座 長 大澤研二（ 大澤研二（群馬大学大学院・工学研究科応用化学・生物化学専攻） 群馬大学大学院・工学研究科応用化学・生物化学専攻） 赤沼哲史（ 赤沼哲史（東京薬科大学・生命科学部） 東京薬科大学・生命科学部） 【2AM1】 AM1】9：30～ 30～10：55 ① Contribution of individual amino acids to protein solubility using amino acid tag（10 分） p.11 Mohammed M. A. Khan（東京農工大学・工学府・生命工学専攻） ② 疎水性表面を持つタンパク質の溶解性の回復（10 分） p.11 八木創太（東京薬科大学・生命科学科） ③ タンパク質凝集後に生じる酸化的な修飾プロセスとその役割（10 分） p.12 三冨康司（慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） ④ ジスルフィド結合による SOD1 タンパク質の新たな凝集制御のメカニズム（10 分） p.12 東一圭祐（慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） ⑤ SOD タンパク質の活性化を担うジスルフィド結合導入のメカニズム（10 分） p.13 櫻井靖之（慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） ⑥ 限られたアミノ酸から安定なタンパク質が創れるか？（10 分） p.13 島田真実（東京薬科大学・生命科学部） ⑦ 耐熱性酵素の設計と好熱菌酵素の低温高活性化（25 分） p.14 赤沼哲史（東京薬科大学・生命科学部） 座 長 古川良明（ 古川良明（慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） 慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） 光岡 薫（産業技術総合研究所・バイオメディシナル情報研究センター） 産業技術総合研究所・バイオメディシナル情報研究センター） 【2AM2】 AM2】11：10～ 10～12：25 ① ミトコンドリアの密集による ATP 合成の効率化（10 分） p.14 吉松大輝（東京農工大学・工学部・生命工学科） ② ミトコンドリアの内部密度と膜電位の相関（10 分） p.15 兼松啓太（東京農工大学・工学府・生命工学専攻） ③ 蛍光色素一分子による pH 測定（10 分） p.15 安川純平（東京大学・工学部・応用化学科 4 年） ④ 人工脂質二重膜に再構成した FoF1-ATP 合成酵素による輸送される H+の検出（10 分） p.16 紀 十男（東京大学・工学部・応用化学科野地研究室） ⑤ 細胞融合によるバクテリアゲノム導入の試み（10 分） p.16 十河孝夫（東京大学・工学部・応用化学科） ⑥ 生細胞における ErbB 蛋白質ネットワークの網羅的解析（25 分） 白 燦基（理化学研究所・佐甲細胞情報研究室） ～ 昼 食 ～ p.17 座 長 新井宗仁（ 新井宗仁（東京大学大学院・総合文化研究科・広域科学専攻・生命環境科学系） 東京大学大学院・総合文化研究科・広域科学専攻・生命環境科学系） 内藤 晶（横浜国立大学・大学院工学研究院） 横浜国立大学・大学院工学研究院） 【2PM1】 PM1】13：20～ 20～15：00 ① 老化による海馬ステロイドホルモン系・受容体の変化（25 分） p.17 若林正彦（東京大学大学院・総合文化研究科/理学系研究科） ② チャコウラナメクジ嗅覚神経系に見られる時空間活動パターンとその非線形解析（10 分） p.18 浜崎雄太（日本大学大学院・総合基礎科学研究科・相関理化学専攻） ③ チャコウラナメクジ嗅覚中枢の長期活動ダイナミクス（10 分） p.18 田中 裕一（日本大学大学院・理工学研究科・物理学専攻） ④ 性ホルモンによる海馬神経シナプスの伝達制御の電気生理学的解析（25 分） p.19 長谷川賢卓（東京大学大学院・総合文化研究科/理学系研究科） ⑤ 心筋細胞における収縮自励振動特性の研究（10 分） p.19 新谷 正嶺（早稲田大学・先進理工学研究科・石渡研究室） ⑥ フェリチンを用いたナノ粒子の配列法の開発（10 分） p.20 荻村 史佳（明治大学） ⑦ フェリチンを用いたカーボンナノチューブ金属触媒の作製（10 分） p.20 伊藤 誠一郎（明治大学） ～ 休 座 長 憩 ～ 田端和仁（東京大学・大学院工学系研究科・応用 田端和仁（東京大学・大学院工学系研究科・応用化学専攻） （東京大学・大学院工学系研究科・応用化学専攻） 今井清博（ 今井清博（法政大学・生命科学部・生命機能学科） 法政大学・生命科学部・生命機能学科） 【2PM2】 PM2】15：15～ 15～16：30 ① フェリチンを用いた磁性ナノ粒子の作製（10 分） p.21 引地祐介（明治大学） ② 球状たんぱく質を用いた蛍光体ナノ粒子の作製（25 分） p.21 原田知明（明治大学） ③ 不安定な二次構造が DNA のハイブリダイゼーション反応速度に及ぼす影響（10 分） p.22 畑 宏明（東京大学大学院・理学系研究科） ④ ALS 原因タンパク質 TDP-43 における RNA 結合ドメインの機能探索（10 分） p.22 鈴木 陽（慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） ⑤ 硬骨魚類由来の祖先型ヘモグロビン遺伝子の設計・合成および発現（10 分） p.23 梶原弘毅（法政大学・大学院・工学研究科・生命機能学専攻） ⑥ ヤツメウナギの祖先型ヘモグロビン遺伝子(node25)の発現系構築（10 分） 幕 晋一（法政大学・大学院・工学研究科・生命機能学専攻） ～ 終 了 ～ p.23 【1AM1】座長：由良 敬、中村周吾 3 月 5 日（月）10：30～12：30 座 長 由良 敬（お茶の水女子大学・生命情報学教育研究センター） 中村周吾（東京大学大学院・農学生命科学研究科・応用生命工学専攻） AM1】 10： 30～ 12： 】10 ：30 ～12 ：30 【1AM1 ① cross profile analysis により同定されたタンパク質セグメントの収斂進化 ○ 富井健太郎 1、澤田義人 2、本田真也 2 1 産総研・生命情報、2 産総研・バイオメディカル 類似(類縁)タンパク質に特徴的なアミノ酸配列のパターンは、配列情報や立体構造情報などを利用して 構築されるプロファイルとして表現可能である。近年、配列情報のみから作成されたプロファイルを利 用することで、構造類似タンパク質の検索も可能であることが明らかになった(プロファイル-プロファ イルアラインメント)。 このことから、配列ベースのプロファイルにも構造情報が含まれていることが示唆される。一方、古く は例えば超二次構造予測などに、立体構造情報に基づくプロファイルが用いられてきた。こうした2種類 のプロファイルを比較(cross profile analysis)し、その共通点を抽出することで、配列ベースのプロフ ァイルに含まれる構造情報を同定することが可能になるのではないかと考えた。そのために、タンパク 質断片構造のデータベースProSegにより提供される構造情報に基づくプロファイルと立体構造既知の タンパク質の配列ベースのプロファイルの網羅的比較を、われわれが開発したプロファイル-プロファイ ルアラインメント法FORTEを用いて行った。その結果、全く異なる種類のタンパク質に共通する、安定 したβ-ヘアピン様の構造形成能を有する短い領域の同定に成功した。 ② SAXS 法によるタンパク質立体構造の計算科学的解析 ○森本康幹 1、小島正樹 1 1 東京薬大・院・生命科学 X 線小角散乱（SAXS）法は溶液中のタンパク質の構造情報を得られる手法であり、対象分子の分子 量に制限がなく、また迅速かつ簡便であることから様々なタンパク質の構造解析に用いることができる。 一方で、本手法により得られる構造情報は少なく、単独で立体構造を決定することは不可能であると言 われてきた。 本研究は、SAXS 法の与える構造情報（SAXS 構造情報）がどのような量および質であるのか、また タンパク質が立体構造を形成する際に本質的に必要な情報とはどのようなものであるかを明らかにし、 SAXS 法の特徴を活かした新規立体構造決定方法論を開発することを目的としている。具体的には SAXS 法と同様に溶液中の構造情報を与える NMR データを種々の分類で抽出し、それを SAXS データ と統合して構造計算を行うことにより、両構造情報間での相補性の検討を進めてきた。その結果、SAXS 構造情報は三次構造を規定する構造情報をかなりの程度有していることが明らかとなり、二次構造を規 定する構造情報と組み合わせることにより、アミノ酸残基レベルの粗視化構造を構築することに成功し た。 1 【1AM1】座長：由良 敬、中村周吾 3 月 5 日（月）10：30～12：30 ③ 高圧下におけるα 高圧下におけるαアクチン構造安定性の理論的解析 ○若井信彦 1、竹村和浩 2、森田貴己 3、北尾彰朗 2,4 1 東大・院・新領域，2IMCB, 東大，3 中央水産研，4JST, CREST 筋繊維の主構成要素であるαアクチンは様々な細胞機能において重要な役割を有し，単量体αアクチンは ATP の加水分解を伴いフィラメントを形成する．一般にαアクチンのアミノ酸配列の保存性は非常に高 く，生物種による違いが少ないことが知られている．深海魚のαアクチンは Q137K/V54A または Q137K/L67P に特異的な置換を有する．この Q137K の置換は活性部位付近に位置し，圧力耐性に貢献 していると考えられている．高圧における残基置換の影響は実験で観察されているが，圧力耐性の詳細 なメカニズムは明らかでない．このため，単量体αアクチンに対する圧力影響を分子動力学シミュレー ションで解析した．その結果，深海魚のαアクチンは非深海魚に比べて塩橋の総数が多い傾向にあった． さらに，深海魚に特異的な K137 と ATP の間に塩橋が存在し，高圧において ATP が活性部位から解離 するのを防ぐと考えられる．また，深海魚の塩橋は二次構造間や異なるサブドメイン間を結ぶものが多 く存在し，圧力耐性に貢献すると推測される． ④ ロボット工学の手法を用いたタンパク質シミュレーション ○山守 優 1、竹村 和浩 2 北尾 彰朗１ 1 東京大・院・新領域創成科学、2 東京大・分生研 背景：タンパク質の分子動力学においては、扱いたい現象とシミュレーション可能な時間スケールのギ ャップが問題となる。 目的：本研究は、自由度を二面角に限定することでの MD におけるタイムステップ（最小の時間刻み） の拡大とロボット工学で開発された Articulated-Body Algorithm (ABA) を用いた運動方程式の高速 解法によって、タンパク質のシミュレーションを効率よく行う方法の開発を目的とする。 方法：本研究の特徴として、従来は末端固定の系を扱う方法であった ABA を拡張し末端にも自由度を 付与した Freed-end ABA にし、これによって、複数鎖を扱うことも可能となった。 結果：上記に基づき、力場 Amber 、ECEPP を読み、NVE 一定の条件、NVT 一定の条件でタンパク 質のシミュレーションを行うプログラムを開発し、妥当性や性能の検討をした。20 種のアミノ酸ジペ プチドを対象に得られたスペクトルを二面角空間での基準振動解析の結果と比較し、両者が一致すると いう結果を得、妥当性を確認した。現在、5fs 程度のタイムステップを可能とする力場のチューニング を行っている。 考察：今後、シミュレーションをより大規模化・効率化するよう all-atom Go –model の導入を行い、 本研究の成果を用いた応用を行う。 2 【1AM1】座長：由良 敬、中村周吾 3 月 5 日（月）10：30～12：30 ⑤ 全原子量子化学計算法による、レチナールタンパク質の吸収波長制御メカニズムの解析 ○林智彦 1、松浦東 2、佐藤博之 2、櫻井実 1 1 東工大バイオセンター、2 富士通研 レチナールタンパク質の吸収波長制御メカニズムの解明は、分子生物学的にも計算化学的にも重要な 問題として知られている。タンパク質のような巨大分子の吸収波長計算では、色素部分を量子化学計算 法（QM）で計算し、それ以外の大部分を分子力学的な手法（MM）で近似する QM/MM 法が主流であ る。しかしこの手法では、領域間の電子移動を考慮できず、また、領域の分割方法に任意性があるなど の問題点がある。この問題を解決するためには、数千原子のタンパク質をまるごと QM 法で計算する手 法の開発が必要不可欠である。本研究では、我々の開発したタンパク質全原子を考慮可能な INDO/S-CIS 法を用いて、古細菌のレチナールタンパク質のであるバクテリオロドプシン（bR）の吸収極大（λmax） を計算した。その結果、タンパク質によるレチナールシッフ塩基の λmax のシフトを、0.04 eV 以内の精 度で再現するとともに、励起に伴う色素-タンパク質間の電子移動が重要であることを初めて見出した。 本発表では、226 個の一残基変異体の計算結果を元に、bR の吸収波長制御メカニズムについて議論する。 ⑥ 構造ドメインデータベースの作成およびその Web 提供 ○梅澤 祐貴、蝦名鉄平、黒田裕 東京農工大学工学府生命工学専攻 生物学的に重要なタンパク質は多くの場合、構造的・機能的単位であるドメインを複数含むことが知 られている。ドメインの中でも独立して構造を持つ「構造ドメイン」は単独で発現・精製が可能なため、 近年においてはまず計算的手法により構造ドメイン領域を予測し、構造ドメインに分割して解析の効率 化を図ることがしばしば行われている。構造ドメインの予測において学習データとなる構造ドメインデ ータは不可欠であるが、現存するドメインデータベースである SCOP や CATH は構造の独立性に特化して いない。 そこで本研究では、SCOP や CATH で定義されたドメイン中、独立して構造を形成する構造ドメインの みを集計した「構造ドメインデータベース」を作成した。データベースの作成には、ドメイン間の(1) 主鎖間の水素結合数、(2)側鎖が関与する水素結合数、(3)疎水性クラスター数を原子座標から定量的に 評価し、相互作用数がある基準値より小さいドメインが独立して構造を形成すると考えた。 基準値を求める際に、SCOP や CATH で定義されているドメインで単独で構造が PDB に登録されているた め独立した構造体であることが証明されている構造ドメイン（本研究では AFD と呼称する）と、構造が 発表されていない NonAFD に分類した。各相互作用の個数を系統的に変化させた結果、 「水素結合（主鎖） 5 個以下、水素結合（主鎖-側鎖）10 個以下、水素結合（側鎖-側鎖）7 個以下、疎水性クラスター8 個以 下」の条件で AFD と NonAFD の分類感度が最大となったため、この値を構造ドメインの定義に用いた。以 上、SCOP に登録されている 37035 ドメイン中、14356 個が本研究によって構造ドメインであると定義さ れた。その 14356 構造ドメイン中 5129（35％）個においては構造が PDB に登録されている AFD であり、 構造ドメインであると証明されていた （SCOP ドメインにおいては、 僅か 16%程度が AFD に対応していた） 。 3 【1AM1】座長：由良 敬、中村周吾 3 月 5 日（月）10：30～12：30 一方、残りの 9227 ドメインにおいても単独で構造を形成する可能性が高いことが本研究で示された。以 上の定義を満たすドメインを選出して構造ドメインデータベースを作成した。 本研究で作成したデータベースは既存のものより構造の独立性に特化しているものであり、これを Web 上で提供することで構造ドメイン予測手法の予測効率向上への貢献が期待される。 座 長 加藤 薫（産業技術総合研究所） 瀧ノ上正浩（ 瀧ノ上正浩（東京工業大学大学院・総合理工学研究科知能システム科学専攻） 東京工業大学大学院・総合理工学研究科知能システム科学専攻） PM1】 30～ 】13：30 ～14：55 【1PM1 ① プロリン異性化酵素の散歩道 ◯伊倉貞吉 東京医科歯科大学 プロリン異性化酵素は、X-Pro のシス-トランス異性化反応で触媒活性を示すタンパク質である。原核 生物から高等生物にいたるまで、あまねく存在することが知られているが、その生体内の実際の機能に ついては謎が多い。現在までにわかっていること、わかっていないことなど、実験などの裏付けの有無 などにも言及して、参加の皆様にご紹介したい。 ② Cyclophilin Cyclophilin D の活性阻害が細胞内薬物輸送に及ぼす影響 ○四戸大介、岩崎あすか、後藤真理奈、太田善浩 東京農工大学・工学部・生命工学科 ミトコンドリアが障害を受けると細胞内 ATP 濃度が低下し、細胞の機能障害が生じる。ま たミトコンドリアは細胞死誘導因子を保持しているため、ミトコンドリアが障害を受けて 細胞死誘導因子を放出すると細胞死が誘導される。これらのことからミトコンドリアは細 胞死を考える上で重要なオルガネラであると考えられている。Cyclophilin D(CypD)はミトコンドリア マトリックスに存在するプロリン異性化酵素であり、その欠損は細胞に薬物誘導性の細胞死に対する耐 性をもたらすことが報告されていた。この耐性を持つ理由として単離ミトコンドリアではその薬物に対 する耐性をもつことが報告されている。しかし細胞が耐性を持つ理由として、薬物のミトコンドリアへ の届きやすさも検討される必要がある。我々は CypD の PPIase 活性が持続的に阻害された細胞では Calcein-AM がリソソームなどの膜系に回収されやすく、ミトコンドリアに届きにくいことを見出した。 この結果は CypD が阻害された細胞ではある種の薬物がミトコンドリアに届きにくくなっている可能性 を示唆するものである。 4 【1PM1】座長：加藤 薫、瀧ノ上正浩 3 月 5 日（月）13：30～14：55 ③ Cyclophilin D が細胞のエネルギー代謝に及ぼす影響 ○中里 眸 桝口 卓摩 大崎 光 太田 善浩 東京農工大学・工学部・生命工学科 ATP は細胞内のエネルギー代謝において大切なエネルギー運搬体である。ATP が枯渇すると細胞の 活動力は低下し、やがて細胞死の１種であるネクローシスへ向かっていくことが知られている。それゆ え ATP の主な産生元であるミトコンドリアは、細胞死の調節を担う重要なオルガネラとして注目され ている。ミトコンドリアマトリックス内のプロリン異性化活性を有する Cyclophilin D (Cyp D) と呼ば れるシャペロン様タンパクは、ネクローシスを促進することで知られている。我々の過去の実験で Cyp D 酵素活性正常細胞では酵素活性欠損細胞と比較して細胞内 ATP 量が少ないことが確認された。しか し、Cyp D がどのようにして細胞内 ATP 量の低下に寄与するのか、そのメカニズムは分かっていなか った。そこで我々は ATP の産生に着目し、その中心である解糖系と電子伝達系の働きについて考察す るため、乳酸生成速度と酸素消費速度の計測を行なった。現在はその解析中で、Cyp D 酵素活性の違い で乳酸の生成速度に一部優位な差が出たが、ATP 産生量に影響を与えるものかは、まだ分かっていない。 ④ VanX の大腸菌溶菌活性を利用した新規スクリーニング法の開発 ○Wu Nan、上岡 哲矢、黒田 裕 東京農工大学工学府生命工学専攻、〒184-8588、東京都小金井市中町 2-24-16 近年、タンパク質を改変するためにランダム変異を導入した変異体のスクリー二ングを行うことは不 可欠な方法となっている。しかし、スクリーニングには、目的タンパク質の活性を測定するために機械 的・化学的な手法で大腸菌を破砕し変異体タンパク質を菌体から抽出することが必要である。しかし、 多数のサンプル数を処理するスクリーニングにおいて、従来の菌破砕法は、容易で安価な手法とは言え ない。 VanX は、バンコマイシン耐性遺伝子酵素群 VanA 酵素群のひとつで D-Ala-D-Ala を加水分解する。我々 は最近、VanX による D-Ala-D-Ala の加水分解により、ムレインモノマー同士間の架橋が行われずペプチ ドグリカン層の伸張が滞り、大腸菌が溶菌することを解明した。さらに、大腸菌が溶菌する際に菌体内 のタンパク質が培地に漏出することを観測した。本研究では、VanX による大腸菌の溶菌活性を利用して 目的の組換えタンパク質である GFP（緑色蛍光タンパク質）を大腸菌体外に漏出させる手法を開発し、 超音波破砕を必要としないスクリーニング法への応用を目指した。 本研究では、GFP と VanX の遺伝子を抗生物質耐性が異なるベクターに挿入し、両ベクターを大腸菌に 共に形質転換し、VanX と目的タンパク質を共発現させた。培養液の上清画分から目的タンパク質である GFP を回収、精製し、従来の方法で得られた GFP と同等の蛍光活性を有することを確認した。機械的・ 化学的細胞破砕を必要としない組換えタンパク質の従来の抽出法として、分泌シグナルの利用が考えら れるが、VanX を用いた本手法では、新しい発現系を構築する必要がなく、既存の発現ベクターを用いる ことができる点も特長である。現在、この手法を Gaussia Luciferase に応用し、汎用性を検証すると同 時にスクリーニングへの応用の可能性を検討している。 5 【1PM1】座長：加藤 薫、瀧ノ上正浩 3 月 5 日（月）13：30～14：55 ⑤ マイクロドロップレットアレイを用いた多剤排出トランスポーター遺伝子スクリニーング法の開発 ○雨澤広海 1、飯野亮太 2、葉山浩平 3、西野邦彦 3、山口明人 3、松本佳巳 3、野地博行 2 1 東京大・工学部、2 東京大・院・工学系研究科、3 大阪大・産業科学研究所 大腸菌は薬剤を細胞外に排出するトランスポーターシステムを細胞膜に保有している。以前我々はマイ クロ流路と蛍光発生基質 FDG を用いた排出活性アッセイを開発し、野生株、ΔacrB（内膜トランスポ ーター欠損株） 、ΔtolC（外膜チャネル欠損株）に適用した（Matsumoto et al 2011 PLoS ONE） 。本研 究ではマイクロ流路の代わりに直径 10 µm のマイクロドロップレットアレイを用い、大腸菌 1 細胞での アッセイを行った。マイクロ流路での実験と同様に、野生株では菌と培地の両方が暗く、ΔacrB では FDG の流入と分解で生成されたフルオレセインの排出により菌と培地が蛍光を発し、ΔtolC ではフル オレセインの蓄積により菌のみが蛍光を発するという結果を得た。 また ΔtolC 株に形質転換により tolC 遺伝子を導入し、薬剤排出能が回復して野生株の様に光らなくなることを確認した。これにより、遺伝 子発現により表現系が変化した菌を顕微鏡下でスクリーニング可能であると考えられる。今後は形質転 換で tolC を発現させ薬剤排出能を回復させた株と tolC 遺伝子を導入しない株を混合し顕微鏡で観察し て光らない菌を回収し、tolC 遺伝子を保有しているかを PCR により確認する予定である。 ⑥ トルク減少型変異体 F1 モーターにおける ATP 結合･解離及び ATP 加水分解･合成の平衡定数の角度 依存性 ○小安司馬 1、渡邉力也 1、谷川原瑞恵 2、野地博行 1 1 東大・工、2 阪大・生命機能 F1 モーターは ATP 加水分解を駆動力として回転するタンパク質分子モーターである。先行研究によ り、加水分解の各反応素過程で反応速度及び平衡定数が回転角度に応じて変化することが判明した。そ れにより各反応素過程の平衡定数の角度依存性から、その素過程のトルクへの寄与を推算することは出 来たものの、その関係の実験的な検証は為されていない。一方で、固定子と回転子の間で強く相互作用 する DELSEED 領域と呼ばれる部位の残基をグリシンにすることで、野生型 F1 に対して反応速度は変 化せずトルクが約半減する変異体 F1 が谷川原によって発見された。本研究では、その変異体 F1 を用い て ATP 結合･解離及び ATP 加水分解･合成の平衡定数の角度依存性を調べている。ATP 結合･解離につ いては、ATP 結合速度定数の角度依存性は野生型 F1 と変わらないが、ATP 解離速度定数の角度依存性 が大きく失われていた。その結果、平衡定数の傾きが小さくなり、ATP 結合過程で発生するトルクが減 少したことが明らかとなった。現在は ATP 加水分解･合成について検証を進めており、その最新の状況 も合わせて報告する。 6 【1PM1】座長：加藤 薫、瀧ノ上正浩 3 月 5 日（月）13：30～14：55 ⑦ UTP を基質としたときの F1F1-ATPase の回転運動 ○新井秀信 1、渡邉力也 1、野地博行 1 1 東大院・工 F1-ATPase(F1)は、ATP の加水分解を駆動力として回転するタンパク質分子モーターである。先行研究 によって、様々な基質を利用して F1 の加水分解活性と回転運動の相関関係が調べられた。加水分解活性 のある基質を利用した場合、F1 の回転運動は観察されたが、唯一 UTP を基質とした時の回転運動は現 在まで確認されていなかった。本研究では、UTP に混入している ATP の影響を排除し、UTP を加水分 解して駆動される F1 の回転運動の観察に成功したので報告する。磁気ビーズを回転プローブとし 1 分子 観察をしたところ、F1 が UTP を加水分解して反時計方向に回転する様子が観察された。また、様々な UTP 濃度条件下で F1 の回転速度を計測しミカエリスメンテンカーブを作成したところ、F1 への UTP の結合速度が konUTP=2.3x104 M-1s-1 であった。この値は、多分子計測による計測結果とほぼ一致してお り、ATP の結合速度の約 1000 分の 1 であった。現在、UTP の加水分解を駆動力とした回転運動の基本 的な性質を理解するため、回転トルクの大きさや加水分解速度の計測を行っている。 座 長 吉村英恭（ 吉村英恭（明治大学） 明治大学） 園山正史（ 園山正史（群馬大学大学院・工学研究科・応用化学生物化学専攻） 群馬大学大学院・工学研究科・応用化学生物化学専攻） PM2】 10～ 】15：10 ～16：50 【1PM2 ① 酸化コレステロールが与えるリン脂質膜分子充填への影響 ○星野達也 1・引間孝明 2・高田昌樹 2・小林俊秀 3・高橋 浩 1 (1：群大工・院・応化生化、2：理研・Spring-8、3：理研・和光) 生体膜中のコレステロール(Chol)は、酸化により酸化 Chol に変質する。酸化 Chol の一部は疾病との関 連が指摘されており、分子機構の解明が求められている。 本研究では、酸化部位の異なる酸化 Chol、7β-hydroxycholesterol(7β-OH)と 25-hydroxycholesterol(25-OH）の、モデル生体膜であるリン脂質 dipalmitoyl phosphatidylcholine(DPPC)膜への影響の違いを調べた。 蛍光分光測定により、Chol と 7β-OH の DPPC 膜の流動性への影響を評価し、さらに DPPC/Chol と DPPC/7β-OH の系に対して浮沈法による体積測定を行い、X 線回折法による膜厚の測定を DPPC/25-OH の系も加えて行った。 実験結果、流動性は 7β-OH 混合膜の方が Chol 混合膜に比べ高いことが示唆されたが、体積に差は認 められなかった。膜厚は Chol 混合膜より 7β-OH 混合膜の方が薄くなり、25-OH 混合膜の厚さはそれ らの中間であった。以上の結果から、7β-OH 混合膜は Chol 混合膜に比べ側方で広がり、厚さ方向で縮 むことで、体積を保ち DPPC 分子間距離を広げていると考えられる。 流動性の増大はこの分子間距離の広がりによるものと推測される。25-OH 混合膜の体積測定を予定して おり、酸化部位による違いを考察したいと考えている。 7 【1PM2】座長：吉村英恭、園山正史 3 月 5 日（月）15：10～16：50 ② High resolution Crystal structure of Dengue 3 envelope protein domain III (ED3) Montasir Elahi 1, Mohamad M. Islam1, Keiichi Noguchi2, Masafumi Yohda1 and Yutaka Kuroda1* 1 Department of Biotechnology and Life Sciences, Graduate School of Engineering, and 2 Instrumentation Analysis Center, Tokyo University of Agriculture and Technology. Dengue viruses are the causal agent of the deadly disease dengue fever. Dengue viruses are classified into four serotypes (DEN1, DEN2, DEN3, and DEN4) and effective drug or vaccine has yet to be developed. The third domain of the envelope protein (ED3) contains the epitope regions as well as attachment sites to the target cell. ED3 exhibits high structural similarities among the serotypes and is responsible for serotypes cross reactivity. Here, we report the 1.8 Å X-ray crystal structure of a bacterially expressed ED3 of DEN3. The structure showed high similarity with the ED3 of other serotypes. The main chain RMSDs ranged from 0.57Å to 1.11Å. Additionally, the main chain structure of the isolated ED3 was very close to the previously reported ED3 structure determined in the whole Envelope protein context (PDB:1UZG), with a main chain RMSD of 0.63 Å. However, ED3’s first beta-sheet (β-1), which was only 3 residues long in the isolated ED3 structure, is 10 residues long in the whole envelope protein structure. A similar phenomenon is also noticeable in DEN1. This discrepancy indicates that domain isolation can introduce minute but significant local structure deformation. Since β-1 overlaps with the epitope region, we predict that recognition by monoclonal antibody to ED3 could be affected by domain isolation. We hope that such structural information will provide a better understanding of the mechanism of ED3-antibody interaction, and help the designing of effective drugs or vaccines against dengue infection. ③ 二次元結晶からのアクアグリセロポリン AQP3 の投影像 刑部伸彦 1、○光岡薫 2 1 一般社団法人バイオ情報化コンソーシアム、2 独立行政法人産業技術総合研究所 二次元結晶を用いた電子線結晶構造解析は、膜タンパク質の高分解能の構造を決定できる方法の一つ であり、タンパク質が脂質二重層中にあることから、天然の状態に近い構造が得られることが期待でき る。そのような電子線結晶構造解析に応用できる二次元結晶化を、水チャネルである AQP ファミリー の一つである AQP3 という膜タンパク質について試みた。水チャネルには主に水のみを通すアクアポリ ンと、水以外にグリセロールなどの小分子も透過するアクアグリセロポリンがあることが知られており、 AQP3 はヒトの皮膚などに局在するアクアグリセロポリンである。その二次元結晶化の結果、電子回折 が得られるような結晶を得ることができたので、その投影像を計算し、他のアクアグリセロポリンと同 様に、水のみを通すチャネルより大きな透過経路があることを示唆する結果を得た。また、その結晶の 再現性を向上するために行った AQP3 の熱安定性に関する測定結果も示し、AQP3 の二次元結晶化に関 する知見について述べる。 8 【1PM2】座長：吉村英恭、園山正史 3 月 5 日（月）15：10～16：50 ④ n-アルキルアルキル-β-グルコシドにより可溶化したバクテリオロドプシンの構造・安定性 〇舟見 顕彰 1・園山 正史 1（群馬大・院工） 膜タンパク質の研究では、界面活性剤により膜タンパク質を可溶化し、その後人工脂質二重膜に再構成 する手法が広く用いられる。しかし、用いる界面活性剤によっては可溶化の段階でタンパク質を変性さ せてしまうことも多い。実際、n-オクチル-β-グルコシド(OG)を用いて、膜タンパク質バクテリオロド プシン(bR)を可溶化した向井らによる研究では、OG 可溶化 bR は天然状態と比べて安定性が著しく低下 することが報告されている。 本研究では、アルキル鎖長の異なる 3 種類の n-アルキル-β-グルコシド界面活性剤を用いて bR を可溶 化し、界面活性剤の構造と可溶化 bR の安定性の相関を調べた。 暗中および光照射下における可溶化 bR の変性挙動を比較したところ、アルキル鎖長が長くなるにつれ て変性速度定数が小さくなることがわかった。しかし、CD 測定により得られた bR の構造やヒドロキシ ルアミンを用いた分子内部への水分子の侵入具合に大きな差は見られなかった。さらに、光サイクルの 挙動を観測すると、基底状態の回復に 2 つの成分が見られ、アルキル鎖長が短くなるほどその傾向が顕 著であった。当日、その詳細を報告する予定である。 ⑤ InIn-situ 光照射固体 NMR NMR による光受容膜タンパク質の光中間体の捕捉とタンパク質構造変化の解析 ○内藤 晶１、友永雄也１、日高徹郎１、川村 出１、須藤雄気２、和田昭盛３、沖津貴志３、加茂直樹４ １ 横浜国大・院工、２名古屋大・院理、３神戸薬大、４松山大・薬 フォボロドプシン（ppR）(センサリーロドプシン II）は負の光走性を示す光受容膜タンパク質であり、 トランスデューサー(pHtrII)と２：２複合体を形成する。光に応答してレチナールの異性化がおこり、 K-中間体に励起後、L-, M-, O-中間体を経て、基底状態（G-状態）に戻る光反応回路を示す。この中で、 M-中間体が信号伝達状態であるので、M-中間体でのタンパク質の構造、運動性、相互作用変化を観測す ることが、このタンパク質の信号伝達機構を明らかにする上で、重要である。本研究では In-situ 光照 射固体 NMR 装置を開発し、この光受容膜タンパク質の M-中間体状態を捕捉すること試み、次にその中間 体状態でのタンパク質の構造、運動、相互作用変化の観測を試みた。520 nm の LED 光を ppR および ppR/pHtrII 複合体に連続照射して、NMR スペクトルを観測した結果、-20℃では 80%が G-状態から M-中 間体に転移した。このとき、M-中間体は単一ではなく、少なくとも３種類以上の多重状態であることが 判明した。タンパク質の[1-13C]Tyr174 の 13C NMR 信号の観測から、タンパク質側の構造も多重構造であ ることが判明した。この M-中間体における構造多様性が信号伝達状態として重要であることが考えられ る。 9 【1PM2】座長：吉村英恭、園山正史 3 月 5 日（月）15：10～16：50 ⑥ 天然変性タンパク質 p53 による標的タンパク質 CBP の分子認識 ○新井宗仁 1,2,3、Josephine C. Ferreon1、Peter E. Wright1 1The Scripps Research Institute、2 東大・総合文化、3 科学技術振興機構 さきがけ 天然変性タンパク質は、様々な標的分子を認識できるという promiscuous な特徴を持つ。我々は、が ん抑制因子 p53 の天然変性領域にある AD1 と AD2 領域が、転写コアクチベータ CBP の TAZ2 ドメイ ンと結合して形成する複合体構造を NMR 滴定法によって調べた。その結果、TAZ2 上には２ヶ所の AD1 結合部位が存在していた。また、AD2 結合部位も AD1 結合部位と一致していたが、AD2 のほうが強く 結合していた。これらの結果は、天然変性タンパク質による分子認識は、特異性が低いことを示唆して いる。さらに、AD2 と TAZ2 結合の反応速度を、NMR ピークの線形解析から求めたところ、結合速度 は 1.7 × 1010 M-1 s-1 であった。この値は、これまでに知られているタンパク質間結合反応速度の中で最 速であり、ほぼ拡散律速限界である。これは、AD2 と TAZ2 間に極めて強い静電相互作用が働くためと 考えられる。一般に天然変性タンパク質が変性した構造をとるのは、荷電残基が多いことに起因する。 したがって、結合速度が速いことは、天然変性タンパク質に本来的に備わっている性質と考えられる。 ⑦ 抗体精製に向けた pH 感受性の高いリガンドタンパク質の設計 ○塚本雅之 1）、大石郁子 2)、松丸裕之 2)、渡邊秀樹 2)、本田真也 1）2) 1)東大院・新領域 2)産総研・バイオメディカル 抗体医薬品製造プロセスにおける分離・製造工程の技術革新が、医薬品製造における安全性・信頼性 の向上には重要であると考える。 本研究では、ヒト免疫グロブリン(Ig)G1 抗体に対する天然型プロテイン A の B ドメイン（PAB）の相 互作用を改変させた変異型 PAB の構造設計することを目的とする。 天然型 PAB が IgG1 抗体と結合した複合体の X 線結晶構造解析データを用いて、相互作用界面にある PAB のアミノ酸変異導入部位を決定した。変異導入は、変異導入するアミノ酸自身とヒスチジンをコー ドするようにして、変異型 PAB の DNA 配列ライブラリーを構築した。そして、変異型 PAB の IgG1 に 対する結合力が pH 変化に対して天然型より感受性が高いものをファージ・ディスプレイ法を用いてス クリーニングし、DNA 配列を決定した。DNA 配列決定した変異型 PAB を発現・精製する条件を検討し、 精製した数種類の変異型 PAB と IgG1 との相互作用を速度論、アフィニティ・カラム実験、および設計 に用いた X 線結晶構造解析データから考察し、pH 感受性変換を目的とした本設計手法の妥当性につい て検討した。 10 【2AM1】座長：大澤研二、赤沼哲史 3 月 6 日（火） 9：30～10：55 座 長 大澤研二（ 大澤研二（群馬大学大学院・工学研究科応用化学・生物化学専攻） 群馬大学大学院・工学研究科応用化学・生物化学専攻） 赤沼哲史（ 赤沼哲史（東京薬科大学・生命科学部） 東京薬科大学・生命科学部） AM1】 30～ 】9：30 ～10：55 【2AM1 ① Contribution of individual amino acids to protein solubility using amino acid tag ○Mohammed Monsur Alam Khan, Mohammad Monirul Islam, Yutaka Kuroda* Tokyo University of Agriculture and Technology. The contribution of a particular amino acid to protein solubility can depend on its physiochemical properties, location within the protein structure and its interaction with surrounding amino acids. In our previous study we observed that short peptide tags remain fully extended from the target protein and influence protein solubility without interfering the native structure, function and thermodynamics of target protein. Here we report the contribution of individual amino acid on protein solubility using short artificial poly amino acid tag. We added short poly amino acid tag made of a single amino acid type to the C terminus of a model protein simplified bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) and measured the influence of tag on BPTI`s solubility. The effect of tags on the model protein solubility was dependent on both amino acid type and length of amino acids tags. For example, a 5-Lys tag increased protein solubility over 10 folds whereas a 5-Arg tag increased solubility rather modestly (by 5 folds). On the other hand, a 5-Ile tag significantly decreased protein solubility. Regarding length-dependency, the influence of tag containing 5 amino acid residues was much higher than that of 3 and 1 amino acid containing tag. Finally, we report the time dependence of protein aggregation. ② 疎水性表面を持つタンパク質の溶解性の回復 ○八木創太 1、福田真己 1、松本茜 1、赤沼哲史 1、山岸明彦 1 1 東京薬科大学・院・生命科学科 本研究ではヘリックスバンドルタンパク質表面の疎水性アミノ酸による凝集を電荷アミノ酸によって 抑制させ、疎水性表面を持つタンパク質でも可溶性の維持が可能であるかを検討した。同じ電荷を持つ アミノ酸同士では静電的な反発が起こることから、疎水性面近傍に電荷アミノ酸を導入することで疎水 性同士での相互作用が働かず凝集の抑制が期待される。本実験ではヘリックスバンドルタンパク質とし て超好熱菌 Sulfolobus tokodaii 由来の二量体タンパク質 Sulerythrin を用いた。このタンパク質の外側 の２本のαヘリックスに疎水性アミノ酸であるロイシンを６個導入することで疎水性面を持った変異体 6L を作製した。そして疎水性面の側に負電荷を持つグルタミン酸を５個導入した変異体 6LE を作製し た。6L は可溶化することなく凝集し沈殿した。しかし 6LE は可溶性を示した。しかしゲルろ過クロマ トグラフィーで解析したところダイマー以上の構造を形成していることが示された。このことから電荷 アミノ酸により疎水性面を持ったタンパク質ではある程度可溶が回復できることが分かった。 11 【2AM1】座長：大澤研二、赤沼哲史 3 月 6 日（火） 9：30～10：55 ③ タンパク質凝集後に生じる酸化的な修飾プロセスとその役割 ○三冨 康司 1、古川 良明 1 1 慶應義塾大学・理工学部 生命機構化学研究室 タンパク質の不溶性凝集は、多くの神経変性疾患における主要な病理変化として観察される。凝集体 の構成タンパク質には様々な化学修飾が施されることがあり、タンパク質凝集の制御因子として頻繁に 議論されている。しかし、化学修飾がタンパク質の凝集プロセスにどのように関わっているのか、その 役割が明確となっている例は非常に数少ない。そこで本研究では、ハンチントン病に見られる変異ハン チンチン（HTT）凝集体に着目し、タンパク質凝集における化学修飾の新たな役割について検討した。ま ず、精製した変異 HTT タンパク質から不溶性凝集体を作製し、質量分析法を応用することで、メチオニ ン残基が酸化されていることを初めて見出した。メチオニン残基の酸化は、変異 HTT が凝集した後にの み進行し、野生型 HTT には生じない修飾プロセスであることが分かった。さらに、光散乱解析や電子顕 微鏡観察を行うことで、HTT 凝集体のサイズがメチオニン酸化に伴って増大することが明らかとなった。 つまり、化学修飾はタンパク質の凝集後にも生じるプロセスであり、凝集体間の相互作用を制御しうる 因子であることが示唆される。 ④ ジスルフィド結合による SOD1 タンパク質の新たな凝集制御のメカニズム ○東一 圭祐 1、古川 良明 1 1 慶應大・理工・生命機構化学 筋萎縮性側索硬化症（ALS）は筋肉の萎縮と筋力低下を伴う神経変性疾患の一種で、最も主要な病因遺 伝子として Cu, Zn-superoxide dismutase（sod1）が報告されている。SOD1 タンパク質は、銅・亜鉛イ オンを結合し、分子内にジスルフィド（S-S）結合を形成することで活性化する抗酸化酵素であるが、sod1 遺伝子に変異を有する ALS 患者の脊髄には、変異 SOD1 からなる不溶性の封入体が観察される。変異 SOD1 の凝集が疾患の発症や進行に果たす役割は未だに明らかでないものの、タンパク質構造の安定化に寄与 する S-S 結合形成は、 SOD1 の不溶性凝集を制御する重要な因子となる可能性がある。 そこで本研究では、 SOD1 凝集における分子内 S-S 結合の役割について検討を行った。その結果、変異 SOD1 は S-S 結合の有 無に寄らず不溶性凝集体を形成できることが明らかとなったものの、SOD1 凝集体の性質や形成メカニズ ムは S-S 結合の有無によって異なることが分かった。今後、モデルマウスなどを用いて、ALS 発症に関 わる SOD1 凝集体を特定し、その形成メカニズムを明らかにする計画である。 12 【2AM1】座長：大澤研二、赤沼哲史 3 月 6 日（火） 9：30～10：55 ⑤ SOD タンパク質の活性化を担うジスルフィド結合導入のメカニズム ○櫻井 靖之 1、古川 良明 1 1 慶應大・理工・生命機構化学 Cu, Zn-superoxide dismutase（SOD）はスーパーオキサイドの不均化を触媒する抗酸化酵素であり、 その活性を発現するには銅イオンの結合と分子内ジスルフィド（S-S）結合の形成が必要である。SOD は、CCS と呼ばれる銅シャペロンによって特異的に認識され、銅イオン及び S-S 結合の供給・導入を受 ける。しかし、CCS に対応する遺伝子を持たない生物も数多く報告されており、CCS に依存しない SOD 活性化経路の存在が示唆される。本研究では、CCS を持たない大腸菌をモデルとすることで、CCS 非 依存的な SOD 活性化経路の解明を目指している。 大腸菌のペリプラズムには、タンパク質への S-S 結合導入酵素である DsbA が存在する。そこで、ペ リプラズム特有の酸化的環境を試験管内に再現し、SOD における S-S 結合形成を電気泳動法により追跡 したところ、DsbA を添加することで S-S 結合形成が加速されることが分かった。よって、大腸菌の SOD がペリプラズムに局在していることからも、SOD 活性は DsbA による S-S 結合形成により制御されてい ることが示唆される。 ⑥ 限られたアミノ酸から安定なタンパク質が創れるか？ ○島田真実 1、赤沼哲史、山岸明彦 1 東薬大・生命 本研究では、アミノ酸の種類を減らしても、ある程度の機能と安定性を保ったタンパク質を構築する ことが可能であるかの実験的な検証を行った。分子系統解析から推定されたアミノ酸配列を持つ古細菌 共通祖先型ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(NDK_Arc1)のアミノ酸組成を、20 種類から減らした単純化 型酵素の構築を試みた。まず、NDK_Arc1 の保存性の高くない M,Q,K,Y,N を他のアミノ酸に置換した Arc1_s1 を作製して、解析を行った結果、Arc1_s1 は Arc1 と同程度の熱安定性と酵素活性を保持してい た。次に、保存性の高い部位も含めて M,Q,K,Y,N 全てを他のアミノ酸に置換した改変体 Arc1_s2 を構 築して解析を行ったところ、Arc1_s2 は高い熱安定性を保持していたが触媒活性は大きく低下した。さ らに、NDK_Arc1 から 1 種類のアミノ酸を減らした 1 アミノ酸単純化型変異体を作製し、減らしたアミ ノ酸が安定性と活性に与える影響の評価も行っているので、その結果も併せて報告する。 13 【2AM1】座長：大澤研二、赤沼哲史 3 月 6 日（火） 9：30～10：55 ⑦ 酵素の温度適応化：好熱菌酵素の低温高活性化と祖先型設計による耐熱性酵素の創出 ○赤沼哲史、徳永千尋、下田有希子、二宮拓也、中島慶樹、山口美奈子、横堀伸一、山岸明彦 東薬大・生命 好熱菌酵素は高い耐熱性を持つ反面、低温、常温では活性が小さい場合が多い。我々はランダム変異 と選択によって低温での活性が上昇した好熱菌由来イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（IPMDH）の変 異体を獲得してきたが、そのうちのいくつかは、補酵素 NAD のアデニン環と相互作用する脂肪族側鎖 を持つアミノ酸が他の疎水性アミノ酸に置換した変異体であった。また、IPMDH のアデニン環と相互 作用する他のアミノ酸、および、IPMDH 以外の好熱菌由来脱水素酵素も、同種のアミノ酸置換によっ て低温高活性化することを明らかにした。補酵素のアデニン環と結合する脂肪族アミノ酸の置換が、好 熱菌由来脱水素酵素の低温高活性化のための general な設計法なのかもしれない。 一方、進化系統解析により推定した祖先型アミノ酸配列を持つ酵素の作製もおこなった。配列全長を、 推定された祖先型アミノ酸で構築した DNA ジャイレース由来 ATPase ドメインとヌクレオシド二リン 酸キナーゼを作製したところ、両者とも好熱菌または超好熱菌並みの耐熱性を有しており、祖先型設計 法が耐熱性酵素を創出する有効な方法であることが示された。 座 長 古川良明（ 古川良明（慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） 慶應義塾大学・理工学部・生命機構化学研究室） 光岡 薫（産業技術総合研究所・バイオメディシナル情報研究センター 産業技術総合研究所・バイオメディシナル情報研究センター） イオメディシナル情報研究センター） ①【2ミトコンドリアの密集による ATP 合成の効率化 AM2】 AM2】11：10～ 10～12：25 ① ミトコンドリアの密集による ATP 合成の効率化 ○吉松 大輝 太田 善浩 東京農工大学・工学部・生命工学科 化学浸透共役とは生物が生体内で作り出したエネルギーを利用して膜外にイオンをくみ出し、膜電位や イオン濃度勾配としてエネルギーを貯蔵・利用する仕組みである。葉緑体やミトコンドリアなどの器官 は、この仕組みを利用していることが知られている。このような器官は密集すると汲み出したイオンを 共有できるので、効率的なエネルギー利用を行っている可能性が考えられる。そこで本研究では様々な 密度でミトコンドリアをポリスチレンディッシュに吸着させ、ミトコンドリア一つ当たりの ATP 合成量、 膜電位の大きさなどを比較した。膜電位の大きさは膜電位感受性蛍光色素で染色した個々のミトコンド リアを蛍光顕微鏡で観察し調べた。現在は解析中であるが、ミトコンドリアを密集させるとミトコンド リアが分極し、ATP 合成速度が増加することを示唆するデータが得られている。一方、プロトン汲み上 げを伴わない ATP 合成の速度は密度の上昇と共に大きく減少した。この結果は、化学浸透共役を利用し た ATP 合成は密集により効率化される可能性を示唆している。 14 【2AM2】座長：古川良明、光岡 薫 3 月 6 日（火）11：10～12：25 ② ミトコンドリアの内部密度と膜電位の相関 ○兼松啓太、長谷田圭亮、太田善浩 東京農工大学・大学院工学府・生命工学専攻 ミトコンドリアの機能は、内膜に形成される膜電位と密接な関わりがある。1 個の細胞内で個々のミ トコンドリアの膜電位を比較すると、様々な膜電位を持ったミトコンドリアが存在する。この膜電位の 多様性には、個々のミトコンドリアがおかれる細胞内環境と、そのミトコンドリア自体の性質の両方が 寄与していると考えられている。細胞内ミトコンドリアの活性調節機構に関する従来の研究は、ミトコ ンドリアの置かれる細胞内環境の変動に着目して行われてきた。本研究では、ミトコンドリアの伸び縮 み等に伴う内部密度の変化が活性に及ぼす影響を調べることを目的として、ミトコンドリアの内部密度 と膜電位の大きさの相関を調べた。内部密度は改良した位相変調型微分干渉顕微鏡により、位相差を計 測して評価し、膜電位は膜電位感受性蛍光色素を用いて評価した。用いた試料は培養神経細胞株 IMR-32 と、単離ブタ心筋ミトコンドリアである。その結果、神経突起を観察すると、ミトコンドリアの内部密 度と膜電位の間に有意な相関は見られなかった。一方単離ミトコンドリアでは有意な相関が得られた。 これらの意義について、議論したい。 ③ 蛍光色素一分子による pH 測定 ○安川純平 1 1 東京大学・工学部・応用化学科 破骨細胞によるプロトン放出やプロトンポンプによる細胞膜を介在したプロトン輸送、あるいは腫瘍細 胞の表面など生体内において局所的に pH が変化している例は多くみられる。このような局所的な pH 変化を観察することは、その機能を知る上で極めて重要である。本研究では、一分子観察の手法を用い て局所的 pH 変化の定量的測定法を開発することを目的とした。pH 変化の検出には、pH 感受性蛍光色 素 pHrodo を用いる。pHrodo は pH の低下に対応して蛍光強度が増加するローダミン由来の蛍光色素 であり、一分子レベルでの蛍光観察が可能である。一分子観察することで、色素一分子の領域に対応す る極微少領域の pH 変化を定量的に測定できるようになると考えられる。現在のところ、pHrodo の pH に対する蛍光強度の応答について検討を行っている。具体的には、バルクにおいて pHrodo の pKa を求 めると同時に、pHrodo をガラス上に固定し、蛍光強度の時間変化を pH 毎に一分子観察をし、定量的 解析を行っている。 15 【2AM2】座長：古川良明、光岡 薫 3 月 6 日（火）11：10～12：25 ④ 人工脂質二重膜に再構成した FoF1-ATP 合成酵素による輸送される H+の検出 ○紀十男 1、田端和仁 1、野地博行 1 1 東京大学・工学部・応用化学科 膜タンパク質である FoF1-ATP 合成酵素は膜中にあり H+運ぶ役割を果たす Fo 部位と膜から突き出しヌ クレオチドと結合する F1 部位からなる。FoF1 は膜間の電位差および H+濃度勾配を用いて ADP と Pi か ら ATP を合成する。一方で ATP 存在下では ATP を加水分解し、膜間で H+輸送を行う。本研究では人 工脂質二重膜に再構成した FoF1 を用い、一分子レベルでの H+輸送のイメージングを目指す。具体的に は、ATP 存在下で脂質二重膜上に固定した FoF1 を蛍光で確認し、FoF1 の H+輸送にともない誘起される pH 変化の検出には、pH 感受性色素である pHrodo を用いる。pHrodo は pH 低下に対応して蛍光強度 が増加する分子であり、これにより局所的な pH 変化を観測できると考えられる。こうして FoF1 一分子 の存在と、その H+輸送をイメージングすることが、本研究の目標である。 現在のところ、H+輸送に伴う pHrodo の蛍光変化を検出できるか検討を行っている。すなわち、pHrodo をガラス上に固定し、大量に FoF1 を再構成した脂質二重膜をガラス上におしつけ ATP 有りと無しの条 件で蛍光強度に変化がみられるかを観察している。今後システムを改良していくとともに、一分子レベ ルの観察を目指したい。 ⑤ 細胞融合によるバクテリアゲノム導入の試み ○十河孝夫 1、田端和仁 1、野地博行 1 1 東京大学・工学部・応用化学科 既存の微生物には数千の遺伝子が存在し、目的のタンパク質のみを生産する効率は低い。生産効率の向 上のために、生存のためのゲノムと目的のタンパク質のみを発現させるゲノムだけを持つ微生物を生産 できればよいが、ゲノムを欠失させていく既存の方法では、操作できるゲノムの位置や範囲の制限によ り実現が困難である。そのため、本研究ではゲノムを分解した大腸菌に外部から人工ゲノムを持った別 の細胞を融合させ、ゲノム交換を行うことを最終目標として、バクテリアのゲノム入れ替えに関する検 討を行う。これまでの結果、宿主のゲノムを取り除くために大腸菌内で制限酵素 SacⅠの発現系を構築 し、バクテリア同士を電気融合させる装置を製作した。1µm 程度の大きさの大腸菌同士を任意に取り扱 うのは困難なため、宿主大腸菌を 10µm 程度まで巨大化させた。巨大化大腸菌で SacⅠ発現系が機能す るか検証を行ったところ、一定時間までは SacⅠが発現し、巨大化大腸菌のゲノムが切断されているこ とが確認された。現在は、ゲノムに GFP 遺伝子を挿入した別種の大腸菌との融合を試みている。 16 【2AM2】座長：古川良明、光岡 薫 3 月 6 日（火）11：10～12：25 ⑥ 生細胞における ErbB 蛋白質ネットワークの網羅的解析 ○白 燦基 1、佐伯夕子 2、廣島 通夫 1、岡田 眞理子 2、佐甲靖志 1 1 理化学研究所・ASI・佐甲細胞情報研究室、2 理化学研究所・RCAI・細胞システムモデル化チーム 細胞の生理的運命を決める情報伝達システム等細胞内の化学反応系は多要素・多反応の極めて複雑な ものであり、反応系が発現するダイナミクスの由来を理解するには、システムバイオロジーの手法が必 須である。ところが計算機中に反応ネットワークを構成するために必要ないろいろな細胞内反応系の構 成要素や要素間の関係(活性化や不活性化、複合体形成など)といった定性的情報が急速に蓄積されてい るのに対し、蛋白質ネットワーク中の素反応記述に必要な反応キネティクスやダイナミクスの定量は大 幅に遅れている。 これらの現状を克服するため本研究では ErbB 受容体とその補助因子らによって構成される蛋白質ネ ットワークに注目し、蛍光相関分光法および単一分子イメージングを用いて関与する因子らの時空間的 なダイナミクスパラメータ(濃度、並進拡散係数、結合解離反応速度定数、解離定数)を生細胞で直接定 量化する手法を確立したいと考えた。現在まで生細胞に置いて EGFP(ErbB1)受容体をはじめとする補 助因子ら(15 種類)のダイナミクスパラメータの定量化に成功し、シグナル伝達過程を素反応レベルで時 空間的に評価出来ることが示唆された。 座 長 新井宗仁（ 新井宗仁（東京大学大学院・総合文化研究科・広域科学専攻・生命環境科学系） 東京大学大学院・総合文化研究科・広域科学専攻・生命環境科学系） 内藤 晶（横浜国立大学・大学院工学研究院） 横浜国立大学・大学院工学研究院） PM1】 20～ 】13：20 ～15：00 【2PM1 ① 老化による海馬の性ステロイド合成系の変化 老化による海馬の性ステロイド合成系の変化 ○若林正彦 東京大学総合文化研究科広域科学専攻 老化によって、記憶・学習などの認知機能が低下することはよく知られている。だがその根拠となる 事象は定かではないのが現状である。また、最近は性ホルモンと認知機能の関係が注目されているが、 老化によって精巣・卵巣などの内分泌器官から脳に運ばれる性ホルモンの低下が、認知機能の低下に関 与しているというのが従来の考え方であった。しかし、本研究室の先行研究により、海馬内では、性ス テロイドを独自に合成しており、その働きが注目されている。本研究では、海馬が合成する性ステロイ ドに着目し、老化によってどのような影響が現れるのかを調べた。 若齢として 3 ヶ月齢、老齢として 24 ヶ月齢のオスラットの海馬を使用し、比較した。その結果、性ス テロイド合成系では、P450(17α)、17β-HSD3、5α-reductase2 がいずれも発現量が減少した。性ステロ イド受容体では、男性ホルモン受容体である AR と、女性ホルモン受容体である ERβ がいずれも発現量 が減少した。また、性ステロイド濃度では、男性ホルモンであるテストステロン、ジヒドロテストステ ロンが激減し、女性ホルモンであるエストラジオールも減少した。 この結果により、老化によって海馬内の性ステロイド合成系の発現量が減少することが、海馬内の性 ステロイド濃度の減少に関与していることが示唆された。また、海馬内性ステロイド濃度の減少と性ス テロイド受容体の発現量の減少が、記憶・学習などの海馬機能の低下に関与することも示唆された。 17 【2PM1】座長：新井宗仁、内藤 晶 3 月 6 日（火）13：20～15：00 ② チャコウラナメクジ嗅覚神経系に見られる時空間活動パターンとその非線形解析 ○浜崎雄太、斎藤稔 日大・院・総合基礎科学 本研究では、匂い刺激によって生じるチャコウラナメクジの嗅覚中枢の神経活動の変化を電気生理的 手法および膜電位イメージングによって調べた。チャコウラナメクジの嗅覚受容器は嗅上皮と呼ばれ 大・小触角の先端に存在している。匂い情報は嗅上皮で神経活動に変換され、嗅覚中枢神経節である前 脳葉に伝達される。最初に、触角に匂い刺激を行い、これによって生じる前脳葉の神経活動（局所場電 位(Local Field Potential; LFP)）の変化を、ガラス電極を用いた細胞外電位測定により調べた。そして、 得られた時系列データに対してウェーブレット解析を行った。その結果、広く分散していた LFP の周波 数成分が、忌避性の匂い刺激後はいくつかの周波数に集中するようになり、結果としてエントロピーの 減少が見られた。また、このときの前脳葉全体の時空間活動パターンを、膜電位イメージングを用いて 調べたところ、前脳葉の先端部と基部に存在していた LFP の位相差が匂い刺激後に解消し、前脳葉全体 の神経活動が同期していく様子が捉えられた。 ③ チャコウラナメクジ嗅覚中枢の長期活動ダイナミクス ○田中裕一 1、加藤巧弥 1、小松﨑良将 2 1 日本大・院・理工学、2 日本大・理工・物理 背景 神経回路における相互作用・同期活動の解析は、複雑な神経機能の理解に重要である．陸生軟体動物 ナメクジの嗅覚神経系には，高度に発達した前脳葉と呼ばれる脳部位があり，規則的な神経回路を持つ． この前脳葉では，特徴的な周期活動が見られ，前脳葉表面から局所場電位(LFP)として記録できる．その 周波数はほぼ一定であるが，匂い刺激を与えられたとき、その大きさが変わる． 目的 本研究で，この前脳葉神経回路網に生じる LFP 振動活動の長期活動ダイナミクスを調べ、その特性を 見出すことを目的とした． 方法 チャコウラナメクジの触覚-脳神経標本を培養液に浸し，前脳葉の細胞外電位を長時間(~3 時間)スパイ ク振動活動を計測した(周波数: 0.5~0.6Hz)．このスパイク間隔の長期活動ダイナミクスを解析するため に，心拍や脳波の時系列の長期相関特性を解析する手法である Detrended Fluctuation Analysis(DFA) を用いた． 結果・考察 この結果，101.5 < n <102 付近を境に、異なるスケーリング指数(短時間スケール~0.7，長時間スケール ~1.2)によって特徴付けられることがわかった． 18 【2PM1】座長：新井宗仁、内藤 晶 3 月 6 日（火）13：20～15：00 ④ 性ホルモンによる海馬神経シナプスの伝達制御の電気生理学的解析 ○長谷川賢卓 東京大学大学院 長期増強(LTP: long-term potentiation)はシナプス間の情報伝達効率が長期に亘り増強される現象であり、 記憶の素過程の候補として考えられている。 哺乳類のアクチビン A は性腺や下垂体などで合成される性ホルモンと知られており、近年の研究から海馬でも、 アクチビン A やその受容体が存在することがわかった。しかし、LTP を誘導するシータバースト刺激(TBS)では、ア クチビン A による LTP への増強効果は見られなかった。 そこで、weak-TBS により誘導した weak-LTP に対するアクチビン A の作用効果を調べることとした。 その結果、TBS ではなく、weak-TBS を用いることでアクチビン A による LTP への増強効果を世界で始めて示す ことができた。さらに、アクチビンAが weak-LTP への効果を示すための細胞内情報伝達系を特定した。アクチビン A の LTP への作用経路を特定した研究はこれまでにない。 また、weak-TBS で誘導した LTP へのアクチビン A による効果を阻害剤実験による解析した結果、アクチビン A の LTP への作用はアクチビン A→アクチビン受容体→MAPK/ERK→NR2B リン酸化という細胞内情報伝達経路 を介していることがわかった。 ⑤ 心筋細胞における収縮自励振動特性の研究 ○新谷正嶺 1、大山廣太郎 1、栗原敏 2、福田紀男 2、石渡信一 1,3 （1 早大・物理 2 慈恵医大・細胞生理、3 早大・WABIOS） アクトミオシンと心臓という臓器の中間階層に位置付けられる心筋収縮系は、階層相応の機能性を備 えていると期待される。事実筋原線維は、定常的な収縮の中間活性化条件下で、各サルコメアが収縮と 弛緩を繰り返す自発振動状態(SPOC)となって動的安定性を保つ。我々は、細胞レベルで発現する筋収縮 系の機能を検討するため、ラットの心筋細胞に対し、Z 線への AcGFP の発現、細胞内への Fluo4 の導入 を行い、サルコメアの長さ変化と細胞内 Ca2+濃度の同時計測を行った。この系において、電気刺激応答 による筋小胞体からの Ca2+放出に伴うサルコメア収縮を計測したところ、4Hz 以上の生理的高頻度刺激 で収縮変動時間のバラつきが無くなり、連続振動状態となった。一方、細胞内 Ca2+濃度制御によりサル コメアの収縮振動(Cell-SPOC)を惹起したところ、振動数が振幅依存的に 1~5Hz とばらついた。しかし 4－5Hz の振動波形が、電気刺激で見られた振動波形と合致した。このことは、生理的振動におけるサル コメア振動が、Ca2+非依存的な、筋収縮系に備わった特性であることを示唆している。 19 【2PM1】座長：新井宗仁、内藤 晶 3 月 6 日（火）13：20～15：00 ⑥ フェリチンを用いたナノ粒子の配列法の開発 ○荻村史佳、吉村英恭 明治大学理工学部物理学科 近年、コンピューター等の電子機器は急激に発展をしており、半導体素子などのナノサイズでの微細 化が求められている。しかし、現在の半導体作製に用いられているフォトリソグラフィー法では、まも なく微細化に限界が来ると予想されている。そこで、外径 13nm、内径 7nm の球殻構造をもつフェリチ ンタンパク質を用いてナノ粒子を作製し、二次元的に規則正しく配列することで、半導体素子を作製す る方法を試みている。フェリチンの内部にナノ粒子を形成させることで粒子の大きさが内径の 7nm に制 限される。フェリチンを二次元的に配列させることによりナノ粒子の規則的な配列を作り、高密度に集 積した半導体素子を作成することができる。 二次元配列を行う方法としては、すでに多くの成功例があるタンパク質変性膜法が知られている。と ころが、この方法では金属を架橋にし、フェリチンを配列しているため、二次元配列が行えても架橋に 使用した金属が基盤上に残ってしまうという欠点がある。そのため、本研究では酸化鉄のナノ粒子を形 成したフェリチンを用いて、シリコン基盤上に直接配列させる方法を模索した。 ⑦ フェリチンを用いたカーボンナノチューブ金属触媒の作製 ○伊藤誠一郎 1、吉村英恭 2 1 明治大 カーボンナノチューブを密に規則正しく作製するにあたって触媒となる金属の粒径の制御や配列が重要 である。本研究では球状のタンパク質フェリチンを用いることによってこの課題に取り組んだ。フェリ チンとは外径 13 nm、内径 7 nm の内側に空洞を持つタンパク質で、その空洞に金属のナノ粒子を形成 する性質を持つ。さらにフェリチン同士は六方細密に配列する性質も併せ持つ。これらの性質により粒 径の揃った金属ナノ粒子として白金ナノ粒子を作成し、規則正しく配列することを目的としている。白 金ナノ粒子を作成するに際して以下の条件を用いた。100 mM リン酸バッファー(pH 8.0)、0.5 mg/ml fer0、2 mM K2PtCl4、2.6 mM チオ尿素。これらを 4 ℃の条件下で 24 時間反応させることによりフェ リチンの内部に粒径の揃った硫化白金ナノ粒子を作成する事が出来た。しかし白金ナノ粒子を内包して いるフェリチンの数が非常に少ないため、粒子を含むフェリチンの数を増やすことが今後の課題となっ ている。また同時に配列するために不純な物質を取り除くことも課題となっている。 20 【2PM2】座長：今井清博、田端和仁 3 月 6 日（火）15：15～16：30 座 長 今井清博（ 今井清博（法政大学・生命科学部・生命機能学科） 法政大学・生命科学部・生命機能学科） 田端和仁（東京大学・大学院工学系研究科・応用 田端和仁（東京大学・大学院工学系研究科・応用化学専攻） （東京大学・大学院工学系研究科・応用化学専攻） PM2】 15～ 】15：15 ～16：30 【2PM2 ① フェリチンを用いた磁性ナノ粒子の作製 ○引地祐介 1、吉村英恭 2 1 明治大学 ハードディスクなどに使われている磁気記録媒体の面記録密度を向上するにはより小さな磁性粒子を作 製し、それらを高密度に二次元配列することが必要となっている。フェリチンとは直径 13 nm の球状タ ンパク質で内部に 7 nm の空洞を持っている。特徴として①イオンチャネルから金属イオンを取り込み内 部の空洞に金属のコアを形成する、②自己集合して六方最密に二次元配列する、の二つが挙げられる。 この二つの特徴を利用すると、内部に磁性粒子を形成しているフェリチンを二次元配列することで面記 録密度 2.3 Tbit/in2 の磁気記録媒体を作製することが可能となる。 磁気記録媒体としては最小 2.2 nm まで強磁性体となる SmCo5 を用いることとした。 pH6.5(PIPES)中のフェリチンに Sm(NO3)3 を加えてフェリチン内部に Sm 粒子を作製し、さらに pH8(HEPES)中で Sm 内包フェリチンに CoSO4 を加えることで Sm-Co 内包フェリチンを作製した。し かし、現在 Sm-Co 内包フェリチンの形成率は 5 %以下であることから率を向上する事が課題となってい る。さらにフェリチン内に形成されている粒子は Sm と Co の酸化混合物であるため SmCo5 の状態にす るために焼結することが必要となる。 ② 球状たんぱく質を用いた蛍光体ナノ粒子の作製 ○原田知明 1、吉村英恭 1 1 明治大学 蛍光体ナノ粒子は、白色 LED、ディスプレイ、分子マーカーとしての応用が期待されています。白色 LED で使用されている蛍光体粒子は光の波長よりも大きいため、後方への散乱が発生し、取り出し効率の減 少が問題になっています。そこで、波長よりも小さい蛍光体ナノ粒子を用いることにより、この問題を 解決することができると考えられています。そこで多種のミネラリゼーションに成功している、7 nm の 空洞内を持つ球状たんぱく質フェリチンを使用し、その空洞内に均一な蛍光体ナノ粒子の作成を試みま した。また、蛍光体ナノ粒子内包フェリチン表面に、遺伝子操作によるペプチドを修飾することにより、 分子マーカーとして使用できる。そこで、赤色蛍光体である Eu3+ をドープした Y2O3、緑色蛍光体であ る Tb3+をドープした Y2O3 の作成を目的としている。作成されたナノ粒子は、透過型電子顕微鏡により、 フェリチン空洞内に形成されていることが確認された。また、エネルギー分散型 X 線分析により、それ ぞれの元素の特異的ピークが確認された。これらのナノ粒子を焼成することにより、赤色と緑色の蛍光 が確認された。 21 【2PM2】座長：今井清博、田端和仁 3 月 6 日（火）15：15～16：30 ③ 不安定な二次構造が DNA のハイブリダイゼーション反応速度に及ぼす影響 ○畑宏明 1、北島哲郎 2、陶山明 2 1 東大・院・理、2 東大・院・総合文化 ハイブリダイゼーション反応速度は核酸の配列に大きく依存する。このメカニズムの詳細は未だ明ら かにされておらず、配列から反応速度を予測することが現状では困難である。このメカニズムには核酸 配列の長さや熱力学的安定性、二次構造など多くの要因が関与しており、その解明を困難にしている。 これに対し我々は長さと熱安定性が均一な DNA 配列を数多く合成し、一定の実験条件下でそのハイブリ ダイゼーション速度を測定・比較することで、二次構造の影響のみを取り出し解析を進めてきた。今回 我々は DNA 配列から予測される二次構造の中でも、 ランダムコイル構造よりも不安定なものに注目し、 これらがハイブリダイゼーション反応速度に大きく影響することを明らかにした。さらに、そのメカニ ズムを説明する反応モデルを構築した。このモデルから予測されるハイブリダイゼーション反応速度は、 実験結果ととてもよい相関を示した。本発表では上記の実験結果、ならびに反応モデルについて報告す る。 ④ ALS 原因タンパク質 TDPTDP-43 における RNA 結合ドメインの機能探索 ○鈴木 陽 1、古川 良明 1 1 慶應大・理工・生命機構化学 筋萎縮性側索硬化症（ALS）は神経変性疾患の一種であり、主要な病理学的所見として、病変部位であ る脊髄への不溶性封入体の蓄積が挙げられる。孤発性 ALS に見られるほぼ全ての封入体には、TDP-43 タンパク質が含まれていることが報告されており、それ以来 TDP-43 の凝集に伴う機能異常が ALS の発 症に重要ではないかと考えられている。しかし、ALS の発症に関わる TDP-43 の生理機能については未 だ明らかとなっていない。 TDP-43 には 2 つの構造ドメイン（RRM1、RRM2）が存在し、RRM1 は UG 繰り返し配列と特異的に 結合してスプライシングなどを制御する機能を備えていることが分かっている。 一方で、 RRM2 は RRM1 と同様の RNA 認識モチーフを有しているものの、RNA を結合できるのかはこれまでに定かではない。 そこで本研究では、大腸菌を利用することでタンパク質-RNA 間相互作用を評価し、RRM1 と同様に RRM2 にも RNA 結合機能が備わっていることを明らかにした。 よって TDP-43 は、 RRM2 における RNA 結合を通じて、何らかの生理機能を発揮している可能性があり、現在さらなる検討を行っている。 22 【2PM2】座長：今井清博、田端和仁 3 月 6 日（火）15：15～16：30 ⑤ 硬骨魚類由来の祖先型ヘモグロビン遺伝子の設計・合成および発現 硬骨魚類由来の祖先型ヘモグロビン遺伝子の設計・合成および発現 ○梶原 弘毅 1 松尾 高稔 2 長井 幸史 2 中川 太郎 3 今井 清博 1，2 1 法政大学・院・工学研究科生命機能学専攻、2 法政大学マイクロ・ナノテクノロジー研究センター、3 長浜バイオ大学・バイオサイエンス学科 [背景・目的] 魚類由来ヘモグロビン(Hb)は、陸上生物の祖先的な Hb であり、多くの脊椎動物由来 Hb と同じ機能を持 つ。本研究では、Hb の分子進化において硬骨魚類由来 Hb に特徴的な Root 効果をはじめ、協同機構に 関する新たな知見を得ることを目的とした。 [方法] 作成した最尤系統樹をもとに硬骨魚類由来の祖先型 Hb に相当する分岐点 ancfαおよび ancfβのアミノ 酸配列を推定した。各アミノ酸配列を用いて祖先型 Hb 遺伝子を設計した。そして大腸菌を宿主とした祖 先型 Hb 遺伝子の発現型プラスミドを構築し、形質転換体の取得を試みた。 なお得られた各形質転換体は、 各種祖先型 Hb 遺伝子の発現実験及び産生した組換え型 ancfαおよび ancfβタンパク質の精製を試みた。 また両タンパク質精製品を用いた吸収スペクトル測定および等電点電気泳動も合わせて行った。 [結果・考察] 今回行った各実験結果より、産生した組換え型 ancfαおよび ancfβタンパク質は、ともに約 14kDa の 大きさを示したヘムタンパク質であり、複合体を形成することが示唆された。 ⑥ ヤツメウナギの祖先型ヘモグロビン遺伝子( ヤツメウナギの祖先型ヘモグロビン遺伝子(node25)の発現系構築 ○幕 晋一 1、松尾 高稔 2、長井 幸史 2、中川 太郎 3、今井 清博 1,2 1 法政大学・院・工学研究科・生命機能学専攻、2 法政大学・マイクロ・ナノテクノロジー研究センタ ー、3 長浜バイオ大学・バイオサイエンス学科、 【背景・目的】 ヤツメウナギなどの円口類ヘモグロビン(Hb）は、Oxy 型の場合は単量体を、Deoxy 型の場合は、二量体 および四量体構造をとることが報告されている。本研究では、現存する脊椎動物において最古種とされ る円口類の中のヤツメウナギ Hb の祖先型 Hb を設計・合成し、脊椎動物 Hb が分子進化の過程において獲 得した酸素結合協同作用の起源について新たな知見を得ることを目的とした。 【方法】 作成した最尤系統樹をもとにヤツメウナギの祖先型 Hb に相当する分岐点 node25 のアミノ酸配列を推定 した。このアミノ酸配列を用いて Node25 遺伝子を設計した。さらに大腸菌を宿主とした Node25 遺伝子 の発現型プラスミド(pET-Node25)を構築し、形質転換体を取得した。Node25 遺伝子の発現により生産し た祖先型 Hb の粗精製品の吸収スペクトルを測定した。 【結果・考察】 産生した組み換え型 Node25 タンパク質は、約 14kDa の大きさを示し、ヘムを有したホロタンパク質が存 在することを明らかにした。 23