Gn-RH 製剤を用いた経膣採卵法の検討

Gn-RH 製剤を用いた経膣採卵法の検討
尾形 康弘１） 日高 健雅１） 松重 忠美１） 堀内 俊孝２） （受付：平成１
８年５月３
１日）
Investigation using gonadotropin-releasing hormone on transvaginal
ultrasound-guided follicular aspiration in cattle.
YASUHIRO OGATA １）, TAKEMASA HIDAKA １）, TADAMI MATUSHIGE １）,
and TOSITAKA HORIUCHI ２）
１）Hiroshima Prefectural Livestock Technology Research Center
584, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023
２）Hiroshima Prefectural University
562, Nanatuka-cho, Shobara, Hiroshima 727-0023
SUMMARY
We examined the efficiency of Gn-RH treatment in synchronizing follicular wave emergence as a
pretreatment for transvaginal ultrasound-guided follicular aspiration, which increases the number of
follicles and the quality.
After Gn-RH is given, the number of follicles increases, and follicle size is maximal 48hrs before
ovum pick-up.
This time is the most suitable for ovum pick-up.
Gn-RH is produced from fertirellin acetate, which can increase the number of follicles.
The quality of the ovum collected by ovum pick-up is good.
In summary, the results of our study indicated that a suitable timing for Gn-RH injection as a
pretreatment is 48hrs before ovum pick-up.
要 約
今回，我々は，性腺刺激ホルモン放出ホルモンを利用して，優勢卵胞を人為的に排卵させ，卵
胞波を誘起することで，経膣採卵時の卵胞数増加と卵子の品質向上に効果があるか検討を行った．
Gn-RH製剤を投与後４
８時間目が，卵胞数が最も増加し，平均卵胞径も最も大きくなることが確
認され，この時期が経膣採卵に適している．
Gn-RH製剤のうち，酢酸フェルチレリン製剤の方が効果的に卵子数を増加させ，採取される卵
子数と品質が良好であった．
以上のことから，経膣採卵４
８時間前の Gn-RH 製剤投与が有効であることが示された．
１）広島県立畜産技術センター（〒７２７‐００２３ 広島県庄原市七塚町５８
４）
２）県立広島大学 （〒７
２７‐００２３ 広島県庄原市七塚町５６
２）
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広島県獣医学会雑誌 №２
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時間）
，２
４，４
８及び７
２時間後の卵胞数と卵胞の長径を超音
序 文
波画像診断装置で観察した．
牛体外受精胚を作出するために，超音波画像診断装置
実験２
を用いて，生きた牛から反復して卵巣内卵子を採取する，
現在，市販されている代表的な２種類の Gn-RH 製剤，
１）
経膣採卵法
酢酸フェルチレリン製剤（商品名ボンサーク注 第一製
が利用されている．
経膣採卵時の未成熟卵子の採取個数を増加させるため，
２，３）
優勢卵胞の除去
４，５）
や低単位の卵胞刺激ホルモン
の
投与などが行われているが効果的な方法は確立されてい
薬）
２００μg/頭と酢酸ブセレリン製剤（商品名 エストマー
ル注 川崎三鷹製薬）２０μ g/ 頭を投与して，経膣採卵成
績に対する影響を比較した．
ない．
成 績
今回我々は，経膣採卵前に牛に性腺刺激ホルモン放出
ホルモン（Gn-RH）製剤を投与することで，新たな卵胞
実験１
波を誘起し，その後に発育する小卵胞の数を増加させ，採
Gn-RH 投与後の卵胞数の推移は，投与直後２
２.４±２.６
卵個数の増加や卵子の品質を向上させることが可能であ
個，２
４時間後２
１.４±２.２個，
４
８時間後２
５.１±２.５個及び７
２
るか実験を行った．
時間後２
４.９±１.６個であった．
材料と方法
当センター及び県立広島大学に繋養されている黒毛和
種経産牛７頭を用いて行った．
経膣採卵は，超音波画像診断装置（アロカ社 S S D １
２０
０）に経膣穿刺用コンベックス探触子（アロカ社UHT９１０
６-７.５）を装着し，ダブルルーメンニードル（クック
社 K-OPSD-１７６０）及び卵子吸引システム（クック社 KMAR-５１１
５）を用いて行った．
生体内卵子の回収は３％ウシ胎児血清（FCS）及び１.８
図１ Gn-RH 投与後の卵胞数の変化
ユニット/mlのヘパリンを添加した乳酸加リンゲル液を用
いた．
卵子吸引は吸引圧１１
５mmHg，吸引速度０.１０ml/min の
Gn-RH投与後の卵胞径の推移は，無処置のもので，投
条件で卵胞液を吸引した．
与直後３.２±２.４mm，２
４時間後４.０±２.５mm，４
８時間後
卵胞数やその大きさは，ビデオテープで録画したもの
３.８±１.６mm 及び７
２時間後３.８±２.４mm であった．Gn-
を再生してモニター上で確認した．
RH 投与区では，投与直後３.７±２.１mm，２４時間後４.１±
採取した未成熟卵子は，顆粒層細胞の付着状態や卵細
２.５mm，４
８時間後４.４±１.７mm 及び７２時間後３.９±１.７
胞質の形態，色調によって Grade Ⅰ∼Ⅳに区分した．
mm であった．
実験１
実験２
Gn-RH（酢酸フェルチレリン製剤２００μg/ 頭）投与後の
投与したGn-RH製剤の種類が，４
８時間後の卵巣内卵胞
卵巣内の卵胞数推移について検討を行った．投与直後
（０
数に与える影響については，無処置区２
５.４±４.５個，酢酸
表１ 採取卵子の品質区分
区分
ＧⅠ
卵子の状態
顆粒層細胞が４層以上存在
ＧⅡ
顆粒層細胞が１∼３層存在
ＧⅢ
顆粒層細胞の付着が１／３以下
ＧⅣ
裸化，変性，顆粒層細胞が膨化
表２ Gn-RH製剤投与後の卵胞径の推移
試験区
供試頭数
Gn-RH投与
無処置
１０
１０
０ｈ
３.７±２.１
３.２±２.４
２４ｈ
４.１±２.５
４.０±２.５
４８ｈ
７２ｈ
ｂ
３.９±１.７
ａ
３.８±２.４
４.４±１.７
３.８±１.６
※異符号間に有意差あり（ｐ＜０.０５）
表３ 投与したGn-RH製剤が経膣採卵に与える影響
試 験 区
供試頭数
卵胞数±S.E.
採卵数±S.E.
酢酸ブセレリン製剤
１０
２７.３±４.５
２３.７±４.８
酢酸フェルチレリン製剤
１０
３０.５±３.８
２７.８±３.７
無 処 置
１０
２５.４±４.５
１８.６±５.４
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表４ 投与したGn-RH製剤が卵巣内卵子の品質に与える影響
供試頭数 採取個数
酢酸ブセレリン製剤
１０
２３７
酢酸フェルチレリン製剤
１０
２７８
無 処 置
１０
１８６
ＧⅠ（％） ＧⅡ（％） ＧⅢ（％） ＧⅣ（％）
３８
４２
９５
６２
（１６.０） （１７.７） （４０.１） （２６.２）
３１
６５
１４３
３９
（１１.２） （２３.４） （５１.４） （１４.０）
２１
３９
８９
３７
（１１.３） （２１.０） （４７.８） （１９.９）
４８時間後には更に４∼５ mm
の卵胞が多くなり，逆に８
mm 以上の大きな卵胞が無く
なる．このことはGn-RH製剤
により，優勢卵胞が排卵もし
くは黄体化し，新しくリク
ルートされた卵胞が発育して
きた１２） と考えられる．そし
ブセレリン区２７.３±４.５個及び酢酸フェルチレリン区
て，７２時間後には，卵胞径が２ mm と５ mm を中心に２
３
０.５±３.８個であった．
峰性に増加してくる．
経膣採卵によって採取された卵子数は，無処置区１
８.６
±５.４個，酢酸ブセレリン区２３.７±４.８個及び酢酸フェル
チレリン区２
７.８±３.７個であった．
採取された卵子の品質区分は，無処理区でＧⅠ１
１.３％
（２１/１８６個）
，ＧⅡ２
１.０％（３
９/１８６個）
，ＧⅢ４７.８％（８９
/１
８６個）及びＧⅣは，１９.９％（３７/１
８６個）であった．酢
酸ブセレリン区は，ＧⅠ１
６.０％（３
８/２３７個）
，ＧⅡ１
７.７
％（４２/２３７個），ＧⅢ４０.１％（９５/２３７個）及びＧⅣは，
２
６.２％（６２/２
３７個）であった．酢酸フェルチレリン区は，
ＧⅠ１
１.２％（３
１/２
７８個）
，ＧⅡ２３.４％（６５/２７８個）
，ＧⅢ
５
１.４％（１４３/２７８個）及びＧⅣは，１
４.０％（３９/２
７８個）で
あった．
図２ Gn-RH 投与後の卵胞長径の分布
考 察
これらのことから，経膣採卵を行うためには，４
８時間
経膣採卵は，供卵牛の性周期に関わらず，週１∼２回
前のGn-RH製剤の投与が卵胞数とその大きさ共に適して
６，７）
の頻度で卵胞内卵子を採取できる
．また，妊娠初期の
いると考えられる．
牛８）や繁殖障害牛９）からも卵子が採取できるなど大きな
実験１の結果をふまえ，現在市販されているGn-RH製
メリットがある技術である．
剤のうち，酢酸フェルチレリンと酢酸ブセレリンを含む
超音波画像診断装置の獣医学領域への導入によって卵
製剤のうちどちらが経膣採卵の前処置剤として適してい
巣内の卵胞の消長が解明されており，卵胞波が発情周期
るか調査した結果，卵巣内の卵胞数は，フェルチレリン
１０）
中に２∼３回存在することも分かってきた
製剤が３
０.５±３.８個とブセレリン製剤よりも平均３.２個多
．
Gn-RH製剤を投与後の卵巣内卵胞数の推移は，２
４時間
く，無処置のものよりも５.１個多くなっていた．
後には，優勢卵胞が排卵されるため２
１.４±２.２個と投与前
このことは，ブセレリン製剤は半減期が長く持続的作
より１個程度減少していた．このことは，Gn-RH投与後
用と高いFSH-RH作用がある１３）のに対し，半減期が短い
２
４∼３
２時間で優勢卵胞が排卵し，その後新しい卵胞波が
フェルチレリン製剤は，LHサージを誘発することに向い
１１）
誘起されるという報告
ていると考えられる．
と一致している．
４
８時間後には，新しい卵胞波によって卵巣内の卵胞数
今回の目的である優勢卵胞を排卵させ，その後の小卵
が２
５.１±２.５個と増加していたが，７
２時間後には，優勢卵
胞をリクルートするには，徐放性の製剤より，一過性の
胞が選択されはじめるために減少していた．
フェルチレリン製剤が優れていると考えられる．
卵胞の長径は，４
８時間後に４.４±１.６mmで最大となり，
Gn-RH投与の効果により卵巣内小卵胞が増加し，実際
無処置区より有意に大きくなっていた．今回利用した超
の経膣採卵でも，フェルチレリン製剤の採卵数が平均
音波診断装置は２ mm 程度の卵胞からモニター上で確認
２７.８±３.７個と，ブセレリン製剤よりも４.１個，無処置の
できるが，実際の経膣採卵を行う場合には４∼５ mm の
時より，９.２個多く，Gn-RH投与により，卵巣内の小卵胞
卵胞径があると吸引作業が効率的に行うことができる．
が増加し，それにより，採卵される卵子数も増加するこ
卵胞長径の推移も，Gn-RH製剤処置前では，２∼３mm
とが確認された．
の卵胞が多くみられると同時に８ mm 以上の卵胞も数個
採取された未成熟卵子は，体外受精等に利用できる．Ｇ
存在している．Gn-RH製剤処置２
４時間後には，３∼４mm
Ⅰ∼ＧⅢがフェルチレリン製剤で８
６.０％と最も高く，ブ
の卵胞が多くなってくる．これは，優勢卵胞が排卵され
セレリン区はＧⅠの比率が１６.０％と最も高くなったが，
ることで，新しい卵胞波が動き出していると考えられる．
逆にＧⅣの比率も２
６.２％と高くなり，バラツキが大きく
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in-vitro embryo production in cattle pre-treated with
FSH, progestogen and estradiol, Theriogenology, 45,
355 (1995)
５）Goto. K. et al. : Evalution of once-versus twice-weekly
transvaginal ultrasound-guided follicular oocyte aspiration with or without FSH stimulation from the same
cows, J Reprd Dev., 41, 303-309 (1995)
６）Gibbons. J. R. et al. Effects of once-versus twiceweekly transvaginal follicular aspiration on bovine
oocyte
recovery
and
embryo
development,
Theriogenology, 42, 405-419 (1994)
写真１ 経膣採卵で採取された牛未成熟卵子
７）谷本保幸ら：超音波ガイドによるウシ卵子の経膣採
卵と成績 , 家畜繁殖技術会誌，１５，１８１−１
８５（１９９４）
８）Meintjes, M. et al. : Transvaginal aspiration of bovine
なった．
以上のことを総合すると，フェルチレリン製剤による，
oocytes from hormone-terated pregnant beef cattle for
前処置のほうが回収される卵子数を増加させ，品質向上
IVF, Theriogenology, 39, 226 (1993)
９）坂口慎一ら：超音波診断装置を利用した繁殖不適和
にも効果があることが分かった．
同じGn-RH製剤でも酢酸ブセレリン製剤は，卵子数は
牛からの連続経膣採卵，日本胚移植学雑誌，
９
４−１
０
１，
増加させるが卵子の品質は，良好なものとそうでないも
１７（１９９５）
１０）Ginther, O. J. et al, : Temporal associations among
のに分かれてしまう可能性があることが示唆された．
ovarian events in cattle during oestrus cycles with two
文 献
and three follicular waves, J. Reprod. Fert, 87, 223-230
１）Pieterse, M.C. et al. : Transvaginal ultrasound guided
follicular aspiration of bovine oocytes, Theriogenology,
(1989)
１
１）Pursley. J. et al. : Synchronization of ovulstion in dairy
cows using PGF2 α and GnRH, Theriogenology, 44,
35, 19-24 (1991)
２）Simon, L. et al. : Repeated bovine oocyte collection
by means of a permanently rinsed ultrasound guided
915-923 (1995)
１２）Stubbings, R, B. and Walton, J. S. : Effect of ultrasonically-guided follicle aspiration on estrous cycle
aspiration unit, Theriogenology, 39, 312 (1993)
３）Chaubal. S. A., : Comparsion of different transvaginal
and
and embryo production over a 10-week period in
follicular
dynamics
in
holstein
cows,
Theriogenology, 43, 705-712 (1995)
ovum pick-up protocols to optimise oocyte retrieval
１３）Chenault, J. R, et al. : LH and FSH response of Holstein heifers to fertirelin acetate, gonadorelin and
cows, Thriogenology, 65, 1631-1648 (2006)
４）Goodhand, K. L. et al. : In-vivo oocyte recovery and
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buserelin, Theriogenology, 34, 81-89 (1990)