柑橘のヘスペリジン

マニュアル参考様式 Ver.1
食品中の健康機能性成分の分析法マニュアル
平 成 22年 3月 作 成
四国地域イノベーション創出協議会
地 域 食 品 ･健 康 分 科 会 編
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柑橘のヘスペリジン
作成者：愛媛県産業技術研究所
食品産業技術センター主任研究員
主任研究員
大野一仁
笹山新生
１ .柑 橘 に つ い て
１．１ 概要
四 国 は 全 国 有 数 の 柑 橘 生 産 地 域 で あ る 。柑 橘 栽 培 に 適 し た 温 暖 な 気 候 風 土 を 背 景 に 、
多くの種類の柑橘が栽培されている。
愛 媛 県 に お い て は 、温 州 ミ カ ン が 戦 後 特 に 昭 和 30 年 代 ～ 40 年 代 に か け て 需 要 の 拡 大
に 適 応 し て 、栽 培 面 積・生 産 量 が 急 増 し 、昭 和 43 年 に は 、全 国 １ 位 の 生 産 量 を 誇 っ た 。
その後、需要の低迷もあり生産量は減少したが、現在でも和歌山についで全国２位の
生 産 量 を 有 す る 。そ の 他 、イ ヨ カ ン（ 全 国 1 位 ）、夏 ミ カ ン（ 全 国 2 位 ）、ハ ッ サ ク（ 全
国 ３ 位 ）、 ネ ー ブ ル （ 全 国 4 位 ）、 ポ ン カ ン 、 清 見 、 不 知 火 、 河 内 晩 柑 等 種 々 の 柑 橘 が
栽培されている。また、徳島県ではスダチ（全国 1 位）、高知県ではユズ（全国 1 位）
が生産されそれぞれ地域の重要な特産果実となっている。
これらの柑橘は生果として販売されているだけではなく、加工品としても利用され
ている。地元の加工業者が、特産柑橘類を原料として、果汁、シラップ漬、果皮加工
品、菓子素材、ジャム類等多品種の加工品を製造している。これまでは、製品の品質
（外観や食味、香りがよいこと、つまり、収穫直後の生果実に近い製品開発）に力が
注がれてきた。しかし、消費者の健康志向を背景に、柑橘類に含まれている健康維持
に役立つ成分（たとえば、β－クリプトキサンチン、ノビレチンやヘスペリジン等）
の機能性や作用機構が解明され、これらの成分を生かした商品が開発され、柑橘加工
品製造業者も柑橘の機能性成分を生かした商品作りへの関心が高まってきている。
１．２ 食品あるいは含有成分の機能性
柑 橘 類 の 機 能 性 成 分 と し て 、フ ラ ボ ノ イ ド 、テ ル ペ ン 、リ モ ノ イ ド 、カ ロ テ ノ イ ド 、
クマリン等が含まれている。最近の研究によってそれらの機能性が明らかになってき
ており、柑橘類の有効性が消費者にも注目されている。
フラボノイドは、一般的に、ルチンやケルセチンのような野菜・果実に一般的に見
られるもの、ヘスペリジンやナリンギンのような柑橘特有のフラバノン、柑橘特有で
ポリメトキシル基を有するポリメトキシフラボンの３種類に分類される。柑橘を特徴
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マニュアル参考様式 Ver.1
づけるフラボノイドは、フラバノンとポリメトキシフラボンである。
柑橘中ではフラバノンが多く含まれているが、その中でもヘスペリジンは温州ミカ
ン 可 食 部 に 100g中 に 100mgオ ー ダ ー で 含 ま れ て お り 、糖 類 、ク エ ン 酸 に 次 ぐ 主 要 成 分 と
なっている。ヘスペリジンはこれまで、温州ミカンシラップ漬、温州ミカン果汁製品
の白濁物質として知られていた。これは、水に対する溶解性が低いためで、加工直後
は溶解していたヘスペリジンが経時的に針状結晶を成形して析出することから、加工
上は除去するべき成分で、ヘスペリジン分解酵素やメチルセルロースの添加等が実用
化され、白濁防止が図られている。
ところが、フラボノイドの機能性に関する研究が進展し、ヘスペリジンに血圧降下
作用、抗アレルギー作用、脂質代謝改善作用、骨代謝改善作用等が相次いで報告され
て、健康維持の面から注目されている。
最 近 で は 、 ヘ ス ペ リ ジ ン に 糖 を 転 移 さ せ て 水 溶 性 を 向 上 （ 約 10万 倍 ） さ せ 、 吸 収 効
率を著しく向上させた製品も開発され、食品への利用も実用化している。
さらに、ビタミンＰ、抗酸化剤等として、食品添加物としても利用されている。
柑橘シラップ漬中の白色物質
の顕微鏡写真
（針状結晶の主成分は、ヘスペリジン）
温州ミカン
写真１－１
ヘスペリジンを豊富に含む温州ミカンと加工品中の結晶物
１．２．１ ヘスペリジン食品を含む食品
ヘスペリジンは柑橘類特有に含まれるフラボノイドで、ブンタン、グレープフルー
ツ等を除くほとんどの柑橘全般に広く含まれており、特に果皮での含量が高い。
したがって、柑橘及びその加工品には豊富に含まれている。
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＜引用・参考文献＞
1.矢 野 昌 充 ： 果 実 類 の 生 理 機 能 ， 農 業 お よ び 園 芸 ， 74,113-118(1999)．
2.矢 野 昌 充 ： 地 域 農 産 物 の 品 質 ・ 機 能 性 成 分 総 覧 ， 315-318(2000)．
3. 町 田 浩 一 、 上 田 篠 二 、 佐 藤 継 男 、 大 沢 啓 助 、 安 藤 隆 一 朗 、 久 道 周 次 ： 東 北 薬 科 大
学 研 究 年 報 ， 32， 135-142(1985)．
4. 松 田 英 秋 、矢 野 眞 紀 、久 保 道 徳 、飯 沼 宗 和 、大 山 雅 義 、水 野 瑞 夫：薬 学 雑 誌 ，111，
193-198（ 1991） ．
5.関 谷 敬 三 ： 化 学 と 生 物 , 44 (7), 434-435(2006)．
6. 杉 浦 実 ： 化 学 と 生 物 , 46 (7), 446-447(2008)．
２．ヘスペリジンについての説明
柑 橘 類 に 含 ま れ る フ ラ ボ ノ ン は 、 ヘ ス ペ リ ジ ン （ Hesperidin） 、 ナ リ ン ギ ン
（ Naringin） 、 ナ リ ル チ ン （ Narirutin） 、 ネ オ ポ ン シ リ ン （ Neoponcirin） で い ず
れも配糖体といわれる、糖が結合した化合物である。
フラバノンのうち、ヘスペリジンは、無味無臭で柑橘の風味に影響を与えること
はないのに対して、ナリンギンは、ナツミカン、ブンタン、ハッサク、グレープフ
ル ー ツ 等 に 含 ま れ る 苦 味 成 分 で 、果 汁 中 で は 濃 度 30mg/100mg が 苦 味 を 感 じ る 限 界 と
な っ て い る が 、 ナ ツ ミ カ ン 果 肉 中 の 濃 度 は 、 50～ 90mg/100g の も の が 多 い 。
Narirutin (NRT): R=rutinose, R1=R2=H
Naringin (NRG): R=neohesperidose, R1=R2=H
Hesperidin (HSP): R=rutinose, R1=OH, R 2=Me
Neopo nci rin (NPO): R=rutinose, R 1 =H, R 2 =Me
図２－１
ヘスペリジン及び主要なフラバノンの構造式
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３. 定量分析の方法について
柑橘類及びその加工品の機能性を知る上で必要なフラボノイドであるヘスペリジン、
及び柑橘に含まれるフラボノイド配糖体（ナリルチン、ナリンギン）を、同時に高速
液体クロマトグラフィーにより定量する方法を述べる。
３．１ 準備する器具など
1.超 音 波 発 生 器
2.遠 心 分 離 機
3.磨 砕 装 置
4.ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー
5.200ml 容 ビ ー カ ー
6.固 相 抽 出 器 具 （ ボ ン ド エ ル ー ト C18 HF、 500mg／ 3mL（ ﾊﾞﾘｱﾝ製 ） ）
7.5ml 容 メ ス フ ラ ス コ
8. 試 料 濾 過 用 メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー (親 水 性 テ フ ロ ン 膜 を 使 用 し た も の 、ポ ア サ イ
ズ O.20μ m、 25mm 径 ： Ｄ Ｉ Ｓ Ｍ Ｉ Ｃ 、 25HP020AN、 ｱﾄﾞﾊﾞﾝﾃｯｸ社 製 )
9. ２ 液 グ ラ ジ ェ ン ト の 出 来 る 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ シ ス テ ム 、 紫 外 検 出 器 、 カ
ラ ム 恒 温 槽 (40℃ が 保 て る も の )が 必 須
10.C 18 逆 相 カ ラ ム (YMC-Pack Pro C18、 S-5,4.6×150mm、 ㈱ Ｙ Ｍ Ｃ 製 )
[試 薬 ]
1.リ ン 酸 （ 試 薬 特 級 ）
2.ア セ ト ニ ト リ ル (HPLC 用 )
3.メ チ ル ア ル コ ー ル (試 薬 特 級 )
4.ジ メ チ ル ス ル フ ォ キ シ ド (DMSO) (試 薬 特 級 )
5.ヘ ス ペ リ ジ ン 標 品 (HPLC 用 、 フ ナ コ シ ㈱ )
ヘ ス ペ リ ジ ン 標 品 原 液 は 、 各 々 10mg/10mlの 濃 度 に な る よ う に 精 秤 し て 抽 出 溶 媒
（ メ タ ノ ー ル ／ ジ メ チ ル ス ル フ ォ キ シ ド (DMSO)の １ ： １ 混 液 ） で 溶 解 す る 。 こ こ
の 原 液 を 抽 出 溶 媒 で 希 釈 し て 、 20mg/100ml、 50 mg/100ml、 100 mg/100mlの 標 品 溶 液
を 調 製 し 、 ネ ジ 付 き 褐 色 サ ン プ ル ビ ン に 入 れ 、 － 20℃ 以 下 で 冷 凍 保 存 す る 。
なお、他のフラボノイド配糖体（ナリルチン、ナリンギン）についても同様に調
製する。
３．２ 分析用試料の前処理・調製方法
(試 料 の 抽 出 法 は 野 方 ら の 方 法 1 ) に 若 干 改 変 を 加 え た も の で 、 ポ リ メ ト キ シ フ ラ ボ ン と
同様である。）
（１）凍結乾燥粉末試料の調製
① 試 料 約 0.1g を 15ml 容 遠 沈 管 に 精 秤 す る 。
② 抽 出 溶 媒 5ml を 加 え て 、 遠 沈 管 を 超 音 波 発 生 装 置 に 浸 漬 し て 5 分 間 超 音 波 処 理 を
す る 。 そ の ま ま 、 30 分 ～ 1 時 間 放 置 す る 。
③ 遠 心 分 離 （ 10,000rpm-10min） を 行 う 。
④ 上 澄 を 200ml 容 ビ ー カ ー に と る 。
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⑤ 沈 澱 に 抽 出 溶 媒 1ml を 加 え て 、 ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー で 混 合 す る 。
⑥ 遠 心 分 離 （ 10,000rpm-5min） を 行 う 。
⑦ 上 澄 を ④ の ビ ー カ ー に と り 、沈 澱 に 抽 出 溶 媒 1ml を 加 え て 再 び 沈 澱 か ら 抽 出 す る 。
⑧ 遠 心 分 離 （ 10,000rpm-5min） を 行 い 、 上 澄 を ④ の ビ ー カ ー に と る 。
⑨ 上 澄 を 併 せ た 抽 出 液 に 、 溶 媒 濃 度 が 10%に な る よ う に 蒸 留 水 を 加 え る 。
⑩ メ タ ノ ー ル 3ml， 10%メ タ ノ ー ル 6mlで 順 次 コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し た 固 層 抽 出（ ボ ン
ド エ ル ー ト HF(C18,500mg)） に サ ン プ ル を 通 液 す る 。
⑪ 10%メ タ ノ ー ル 15mlで 洗 浄 後 、 抽 出 溶 媒 5mlで 溶 出 し 、 5mlに 定 容 す る 。
⑫調製した溶液をＨＰＬＣに注入して分析する。
（２）生鮮試料の調製
① 試 料 約 0.5gを 精 秤 し て ガ ラ ス 製 遠 沈 管 に と る 。
② 抽 出 溶 媒 10mlを 加 え て で 磨 砕 装 置 で 均 質 化 す る 。
③ 超 音 波 発 生 装 置 に し て 同 様 に 振 盪 し て 5分 間 超 音 波 処 理 を す る 。
④ こ れ か ら 溶 媒 を 5mlと り 、 以 下 、 凍 結 乾 燥 粉 末 試 料 と 同 様 に 抽 出 ・ 調 製 す る 。
（３）果汁・果肉（さじょう）試料の調製
① 果 汁 は そ の ま ま 、 果 肉 は ホ モ ジ ナ イ ズ 後 試 料 約 3 gを 15ml容 遠 沈 管 に 精 秤 す る 。
② 遠 心 分 離 （ 10,000rpm-10min） を 行 う 。
③ 上 澄 を 200ml容 ビ ー カ ー に と る 。沈 殿 は さ ら に 抽 出 溶 媒 1mlで 2回 超 音 波 処 理 に よ り
抽出し遠心分離して、各上澄と合わせ抽出液とする。以下、凍結乾燥粉末試料と
同様に抽出・調製する。
３ ． ３ HPLC に よ る 分 析 方 法
３ ． ３ ． １ 「 グ ラ ジ エ ン ト タ イ プ HPLC 装 置 の 場 合 」
（１）移動相の調製
移 動 相 A 及 び 移 動 相 B を ア セ ト ニ ト リ ル (HPLC 用 )、 超 純 水 、 リ ン 酸 を 用 い て 以 下
のように調製する。
A 液 ： ア セ ト ニ ト リ ル -10mM リ ン 酸 (20+80、 v/v)
B 液 ： ア セ ト ニ ト リ ル -10mM リ ン 酸 (70+30、 v/v)
(こ の 際 10nM リ ン 酸 は あ ら か じ め 調 製 し て お く 。 )
（２）分析条件
① 検出器、恒温槽、溶媒の流量等の条件は以下の通りとする。
検 出 波 長 :285n m
恒 温 槽 :40℃
流 量 :移 動 相 A、 移 動 相 B の 合 計 で 毎 分 0.6ml
試 料 注 入 量 ： 10μ ｌ
② 移 動 相 溶 媒 の 混 合 比 (グ ラ ジ エ ン ト )は 以 下 の よ う に 調 整 す る 。
0 分 か ら 20 分
:A 液 100%を 保 つ 。
20 分 か ら 25 分 :2 5 分 の 時 点 で B 液 の 割 合 が 40%に な る よ う に 、 B 液 の 割 合 を
直線的に増加する。
25 分 か ら 40 分 :A 液 60%、 B 液 40%の 状 態 を 保 つ 。
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4O 分 か ら 45 分 : 45 分 の 時 点 で B 液 の 割 合 が 100%に な る よ う に 、B 液 の 割 合 を
直線に増加する。
45 分 か ら 55 分 :A 液 0%、
%、 B 液 100%の 状 態 を 保 つ 。
: 60 分 の 時 点 で A 液 の 割 合 が 100%に な る よ う に 、B 液 の 割 合 を
55 分 か ら 60 分 :60
直線に減少する。
初 期 の 状 態 (A 液 100%、B 液 0%)に 戻 し て か ら 10 分 以 上 お い て か ら 次 の 試 料 を
分析する。
（３）定性及び定量
① 分離された物質の定性は保持時間により行う。
② 定量は標準試料を用いた、内標を用いない絶対検量線法による。通常はクロマ
ト グ ラ ム の 面 積 か ら 計 算 す る が 、微 量 物 質 の 場 合 は ピ ー ク 高 を 用 い る 方 が 精 度 良
く 定 量 出 来 る 場 合 も あ る の で 、計 算 に 用 い る 装 置 の 特 性 に 注 意 を 払 っ て 選 択 す る
ことが必要である。
４．分析例
４ ． １ グ ラ ジ エ ン ト タ イ プ HPLC 装 置 に よ る 分 析 例 と 定 量 分 析 結 果
分 離 さ れ た 物 質 は 保 持 時 間 か ら (標 準 物 質 と 比 べ )特 定 す る 。 定 量 に は 標 準 試 料 を 用
い、クロマトグラムのピーク面積から濃度を算出する。以下に典型的なクロマトグラ
フを図に示す。
ヘスペリジン
ナリルチン
ネオポンシリン
図４．１－１
温州ミカン果汁のクロマトグラフ
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５．食品の分析結果例
上記手法を用いて、柑橘の部位別、柑橘加工品中のヘスペリジン等の定量分析を行
った。その結果を下記表に示す。
表５－１
供
試
品
柑橘類及び加工品の定量結果
性
状
ナリルチン
ナリンギン
ヘスペリジン
（ mg/1 00g）
（ mg /100g ）
（ mg /100g）
イヨカン果皮
生鮮
53
ND
1,250
イヨカンじょうのう膜
生鮮
88
ND
372
イヨカンさじょう
生鮮
20
ND
351
温州ミカン果皮
乾燥粉末
1,460
ND
6,730
不知火果皮
乾燥粉末
872
ND
4,290
甘夏果皮
乾燥粉末
267
6,800
77
河内晩柑果皮
乾燥粉末
809
3, 770
ND
日向夏果皮
乾燥粉末
1,240
ND
2,010
温州ミカン果汁
瓶詰
2 29
ND
426
清見果汁
瓶詰
ND
365
イヨカンマーマレード
瓶詰
189
ND
542
ミカン果皮乾燥粉末
瓶詰
2,290
ND
7,550
ｷﾞｬﾊﾞ富 化 ミ カ ン ﾋﾟｭｰﾚｰ
袋詰
707
ND
1,100
ｷﾞｬﾊﾞ 富 化 ミ カ ン 残 渣
袋詰
1,290
ND
3,930
85
Ｎ Ｄ （ 検 出 せ ず ： 1mg/100g 以 下 ）
（＊注意）なおこの測定結果は数多くの柑橘及び加工品のうちの一例であり、一般の分析
結果ではない。
６．分析上の留意、注意点
ヘスペリジンは、比較的安定性は高いものの、試料調製・分析にあたっては、抽出
試 料 を 褐 色 ビ ン に 入 れ て 、 で き れ ば － 20℃ 以 下 で 冷 凍 貯 蔵 す る こ と が 望 ま し い 。
７．その他
特になし。
８．定量法に関する引用・参考文献
1. Yoichi Nogata,Hideaki Ohta,Koh-Ich Yoza,Mar k Berhow and Shin Hasegawa ：
J.Chromatogr.， 667， 59-66(1994)．
2. Nogata Y , Sakamoto K , Shiratsuchi H , Ishii T , Yano M , Ohta H .： Biosci
Biotechnol Biochem. ， 70(1)， 178-192(2006)．
3. 門 家 重 治 、明 賀 久 弥 、児 玉 雅 信 、松 本 恭 郎：愛 媛 県 工 業 系 研 究 報 告 書 ，39，31-36(2001).
―以上―
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