尿路上皮がんにおける DNAメチル化異常とがん診断への応用

(
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尿路上皮がんにおける DNAメチル化異常とがん診断への応用
奈良県立医科大学分子病理学講座
千原良友
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る遺伝子発現異常に関与することが明らかになってきた。がん研究の分野ではエピジェネティ
ク異常を指標とした診断や治療への応用の試みが盛んである。
尿路上皮がんはがん細胞が尿中に存在するため，尿を用いた低侵襲な新しい診断法が期待され
ているが未だ臨床応用に十分な分子マーカーは存在しない。
本稿では， DNAメチル化を指標とした尿路上皮がん診断について述べる.
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はじめに
エピジェネテイクスは塩基配列の変化を伴わない遺伝
子制御機構であり，ゲノム上の多数の遺伝子を選択的に
活性化または不活性化することで細胞の発生，分化に重
取り組んできた.本稿ではわれわれの研究成果を中心に
尿路上皮がんにおける DNAメチル化異常と臨床応用の
可能性について概説する.
がんで認められる DNAメチル化異常
要な役割を担う.がんにおけるエピジェネテイクスの異
DNAメチル化は CpG部位(シトシン，グアニンの連続
常は多段階発がん過程のごく早期から認められ，多数の
配列)のシトシン 5位炭素原子にメチル基が付加される
異常が蓄積することで遺伝子異常を誘導することが報告
現象をいう. DNAメチル化は DNAメチル基転移酵素
されている. したがって，多段階発がん諸過程に生じる
によって調節される生理的，可逆的な反応、であり，遺伝
エピジェネティクス異常の解明は，がんの予防-診断・
子発現の調節を行う機構の一つであると考えられている.
治療への応用のみならず，がんの生物学的特性を明らか
時乳類のゲノム DNAでは全 CpG部位のうち約 80%が
にするという観点からも期待されている.
エピジェネティクスによる遺伝子制御機構は， 1)DNA
メチル化されている1) CpG部位が多く存在する領域は
LINE，SINEなどのレトロトランスポゾン由来の繰り返
メチルイじ， 2
)ヒストン修飾， 3
)ヌクレオソームポジショ
し配列であり，この領域に存在する CpG部位は生理的に
ンと，これらの相互作用によるクロマチン構造の変化に
メチル化されている.また，遺伝子プロモータ}領域に
よる調節，および 4
)マイクロ RNAによる調節に大別さ
は CpGアイランドと呼ばれる CpG部位が高頻度に出現
れる.とくに DNAメチル化異常は発がんの初期段階か
する領域があり，この CpG部位は生理的にはメチル化さ
ら高頻度に存在していること，微量の臨床試料から定量
) 遺伝子プロモーター領域に CpGアイラン
れていない 2
解析が簡便に行える等の理由から，がんを診断するマ」
ドが存在する遺伝子は，この領域の DNAメチル化状態
カーとして優れている.
は遺伝子の転写を制御している.
われわれは尿路上皮がんにおける DNAメチル化異常
がん組織における DNAメチル化異常は「ゲノム全体
の解析に尿中剥離細胞を用いた診断マーカーの開発に
の低メチル化と局所的な高メチル化」である. LINE，
(
1
3
6
)
千 原 良 友
SINEなどの繰り返し配列は全ゲノムの 40%以上を占め
領域の網羅的解析では，遺伝子発現に関与しないがん随
るため，これらの領域はがんにおいては一様に低メチル
伴牲の DNAメチル化異常が種々のがんで報告されてお
化を示し，ゲノム全体の低メチル化に寄与している.ゲ
り6) DNAメチル化異常を示標としたがんの存在診断，
ノムの低メチル化は染色体不安定性を来たし，リンパ腫
リスク診断および病態診断の臨床的有用性が検討されて
などの腫蕩発生を促進する 3) また，近年勝脱がんにお
いる.
いて Met遺伝子の発現上昇と Met特異的 LINE1の低メ
尿路上皮がんにおける DNAメチル化異常
チル化との関連が報告されたがペゲノム全体に存在す
る繰り返し配列のメチル化異常とがん関連遺伝子群との
尿路上皮がんに生じる DNAメチル化異常の解析も
関係は明らかになっていない.一方， CpGアイランドの
様々ながん関連遺伝子群のプロモーター領域の解析に始
16，MLH1，E
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高メチル化は下流に位置する p
まり，遺伝子発現，悪性度，予後との関連が多方面から
など主ながん抑制遺伝子の発現低下を来すためへ種々
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報告されてきた.例えば，勝目光上皮内がん (
のがんで積極的に研究が行われてきた.正常細胞では発
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)においては，細胞間接着分子である E
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現している遺伝子を例にみると，その遺伝子はがん化に
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nのプロモーター領域が高頻度にメチル化され遺伝
向かうにつれプロモーター領域のメチル化が蓄積され，
子発現が低下する.その結果，がん細胞は容易に尿中に
ついには遺伝子がサイレンシングされる (
F
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)
. がん
剥離し，高率に尿細胞診で診断可能である 7) また，正
化に向かう細胞では異常メチル化が蓄積されるが，病理
常尿路上皮で発現している ABO遺伝子は，勝脱がんで
学的に正常で遺伝子発現も正常である前がん状態(前が
は染色体欠失とメチル化の 2ヒットによって発現が消失
ん病変とは異なる)が存在する.エピジェネティクスを用
し，これまで染色体欠失だけでは説明できなかった ABO
いたがん診断の最大のメリットはこの前がん状態を識別
遺伝子発現異常の原因が明らかになった 8) この報告で
しうることにある.マイクロアレイ等を用いた全ゲノム
は腸脱異形成では遺伝子発現は保たれていたが，勝脱異
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千 原 良 友
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NMIBCにのみ低メチル化を認めた (
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)の活性が上昇し 9) 遺伝子発現異常の
結果から，担がん尿路上皮には既に勝脱がんに生じる
前段階での DNAメチル化異常が指摘された
DNAメチル化異常が生じており，勝JlJ'eがん発がん過程に
また尿路
上皮がんの既存リスクとしての喫煙と RUNX3の高メチ
おけるエピジェネティック f
i
巴l
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f
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tが示された.
ル化の関連性が報告された 10) このように尿路上皮がん
NMIBCと MIBCの異常メチル化領域が異なることから，
における DNAメチル化異常は泌尿器科医が臨床で遭遇
両者の発がんには異なった遺伝子が関与することが示唆
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lな事象を分子生物学的に説明する興
する c
さj
守した.
味深いツールとなった.
DNAメチル化を示標とした尿路上皮がん診断
尿路上皮がんは同時性異時性の多中心性発生が最大の
尿路上皮がんに生じる DNAメチル化異常をがん診断
特徴である.内視鏡的切除で治癒可能な非筋層浸潤性勝
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目光がん (NMIBC:Nonm
に応用する試みも多い.とくに尿路上皮がんは尿中剥離
は高頻度に再発し，一部は筋層浸潤性がん (MIBC)へ進
細胞としてがん細胞や前がん状態の細胞が存在し，また
展するため厳重な経過観察が必要である.この一因とし
これらの細胞由来の DNAが尿中に(浮遊または溶解し
F
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巴l
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て担がん尿路上皮に“がん発生の素地 (
て)存在すると考えられるため，尿を用いた低侵襲な診断
形成されると考えられている.F
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tは前がん状態
法の開発が期待されている.
に相当し，既にメチル化異常が認められると考えられる.
診断マーカーとしてのターゲットは必ずしも遺伝子発
現には関与しないがん随伴性の DNAメチル化異常に言
N
)，担がん尿路上皮 (CN)と
われわれは正常尿路上皮 (
T
)計 1
3
6サンプルを対象として，I1
各深遠度の跨脱がん (
able1に定量的メチル化解析を
及されることも多い. T
luminaGoldenGateassayを用いた全ゲノム領域の網羅
用いて行われた報告を示す.がん組織を対象にした報告
ベ X染色体を除いた
では l遺伝子のメチル化異常から高特異度の結果が得ら
的メチル化解析を行った (
F
i
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.
2
a
)
1
3
7
0カ所の CpG部位のうち， N と比較して T において
れている.一方，尿を対象とした報告では高感度，高特
3
2カ
有意に高メチル化を示した CpG部位は NMIBC:1
異度を得るためには複数のマーカーの組み合わせが必要
所
， MIBC:526カ所であった.一方，低メチル化を認め
となる.またターゲット遺伝子も一定の見解を得ない.
8
8カ所， MIBC:3
1
1カ所であ
た CpG部位は NMIBC:4
これは尿試料の解析がいかに困難であるかを示している
った. CNにおいては 1
6
9カ所に高メチル化， 1
9カ所に
尿中 DNAは微量である上に様々な細胞のコンタミネ
低メチル化 CpG部位を認めた.NMIBCと MIBCの比較
ーションとそれらの細胞白来のものが存在し，また尿自
では，1¥心HBCに認めた高メチル化領域は MIBCにおいて
体による変性を生じる. DNAメチル化マーカ)はがん
0
8カ所の CpG部位は MIBC
も共通に認められた.また， 3
早期の変化を検出可能であるが， DNAメチル化は環境
にのみ高メチル化を認め， 2
1
7カ 所 の CpG部 位 で
因子や炎症等でも生じる可逆的な変化であること，組織
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尿路上皮がんにおける DNAメチル化異常とがん診断への応用
特異的にメチル化状態が異なることから，がん特異的な
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1
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第 2段階では異なるサンプルセットを用いて P
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メチル化を検出することが困難になるというジレンマが
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e法による候補 CpG部位の定量解析を行った.各
ある
CpG部位のメチル化頻度にカットオフ値を設定した.こ
われわれはこれらの欠点を解消するために一連の研究
8
3
.
2
%
のテストセットにおいて各遺伝子単独では，感度 (
をデザインした (
F
i
g
.
3
)
. 十分な試料を得るため，また
9
4.4%)，特異度 (
8
4.
4%
-100%)， AUC(0.850
.
9
7
)の正確
人種聞の B
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a
sを考慮し，海外を含む多施設共同研究とし
さで勝脱がん診断が可能であった.さらにこれらの組み
た 第一段階は前述の網羅的解析による尿路上皮がん特
合わせ用いてヒストグラムを作成した (
F
i
g
.
4
a
)
. このヒ
異的に DNAメチル化を生じる CpG部位の同定であり，
ストグラムを用いて 1
3遺伝子中 7カ所以上の CpG部位
目
この結果から 2
3遺伝子上の 3
0カ所の CpG部位を選出し
で異常メチル化を認める組織をがんと規定すると感度
た(
T
a
b
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)
.これらの遺伝子群は尿路上皮がんにおいて
9
4
.
3
%，特異度 9
7
.
8
%の正確さで勝脱がん診断が可能で
はこれまでメチル化異常の報告がない遺伝子群であった.
あった(存在診断).同様に別の遺伝子の組み合わせでは
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第 3段階は尿路上皮がんを有する患者尿と健常者尿を用
に候補遺伝子を絞り，検出感度を上げる定量系を確立す
いた比較で，先の存在診断の遺伝子群を用いて感度
る必要がある.
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ーカーの担う役割は大きい .DNAメチル化はがん細胞に
特異度ともに満足できる結果を得るためには 1
3遺伝子
生じる分子生物学的変化の一面にすぎないが，がんにお
が必要であった.ヒストグラムに示すように個々のマー
ける様々な異常に関連し，異常にアプローチする有効な
カーを比較すると尿中がん細胞の検出感度はがん組織よ
手段の一つである.エピジェネテイクスの解析法は急速
りはるかに低下する.現在，第 4段階として腸脱がん症
に進行しており，日常臨床に活用される日も近いと思わ
例の術後経時的尿を前向きに解析する研究を進めている.
れる.
尿路上皮がんにおける DNAメチル化異常とがん診断への応用
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