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RNA 精製・解析ツールセレクションガイド - Thermo Fisher Scientific
RNA 精製・解析ツール セレクションガイド produced by RNAエキスパート Ambion® RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 2 12/09/14 13:54 卓越した信頼性 RNAエキスパート Ambion® Confidence comes naturally Ambion®の製品ラインは、20年以上にわたって蓄積された、RNAに関する傑出 した専門知識に裏打ちされています。お客様の研究を効率化する革新的なキット や専門ツールは、品質の高い結果をもたらすことに、常に貢献しています。 • インタクトなRNAを最高純度で提供 • 最少量のサンプルからでも高いRNA収量を実現 • あらゆる種類のサンプルやアプリケーションに特化した最先端のテクノロジー 2 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 2 12/09/14 13:54 目 次 4 製品セレクションガイド 6 Total RNAの精製 12 mRNAの精製 14 遺伝子発現解析 18 miRNAの精製・解析 20 RNaseをコントロール 22 RNAの定量 3 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 3 12/09/14 13:54 製品セレクションガイド あらゆる種類のサンプルに対応できるRNA精製キット、試薬 PureLink® Pro 96 Total RNA Purification Kit ® Ambion の広範囲にわたるRNA精製キットをご選択頂け れば、原核生物、酵母、昆虫、植物または哺乳類細胞など、 ほとんどすべてのサンプルからRNAの精製が可能です。 RT-PCR、qPCR、マイクロアレイプロファイリング、そして RNAシーケンスなどのダウンストリームのあらゆる研究ア プリケーションで精度の高い実験結果を確実にする上で、 分解のないインタクトなRNAを高収量・高純度で調整する ことはとても重要です。 24サンプル以上 （High Throughput） Web ページ: 1–50サンプル （Low-Middle Throughput） Total RNA purification （P6） www.lifetechnologies.com/totalrna miRNA solutions （P18） www.lifetechnologies.com/mirvana Cells-to-CT™ kits （P14） www.lifetechnologies.com/cellstoct Single Cell-to-CT™ kits （P17） www.lifetechnologies.com/sc2ct NEW MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit PureLink® RNA Mini Kit MagMAX™ FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE 一般的 な 17サンプル以上 （High Throughput） 16サンプル以下 （Low Throughput） RNA purification products selection guide www.lifetechnologies.com/rnaselection Ambion® Technical Resources www.lifetechnologies.com/rnaexperts For every application, sample and RNA type www.lifetechnologies.com/rnapreps 4 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 4 12/09/14 13:54 PureLink® Pro 96 Total RNA Purification Kit ® TRIzol Plus RNA Purification System MagMAX™-96 for Microarrays Total RNA Isolation Kit Single Cell-to-CT™ Kit PureLink® RNA Mini Kit 24サンプル以上 （High Throughput） Single cell PureLink® Pro 96 Total RNA Purification Kit MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit Cells-to-CT™ kits 1–50サンプル （Low-Middle Throughput） TRIzol® Plus RNA Purification System MagMAX™ Total Nucleic Acid Isolation Kit 抽出困難な組織 （24サンプル以上） 24サンプル以上 （High Throughput） 1–50サンプル （Low Throughput） 複数細胞 10∼105 cells はい：リアルタイムPCR のみ使用 細菌 いいえ：リアルタイムPCR又は 他のアプリケーションで使用 or 酵母 組織 的 な組織 リアルタイムPCRにのみ使用？ 細胞 スタート ［サンプルタイプ の選択］ スモールスケール （500 µL以下） FFPE 血液 1–50サンプル （Low-Middle Throughput） LCM スモールRNA ラージスケール （3 mL以上） Single Cell-to-CT™ Kit PureLink® RNA Micro Kit mirVana™ miRNA Isolation Kit TRIzol® LS Reagent 24サンプル以上 （High Throughput） MagMAX™-96 Blood RNA Isolation Kit 全血 白血球 凍結 or 新鮮血 血液細胞内RNAの安定化、 または安定化済血液サンプル LeukoLOCK™ Kit PureLink® Total RNA Blood Kit Tempus® tubes MagMAX™ for Stabilized Blood Tubes kits Stabilized Blood-to-CT™ kits Tempus® kits 5 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 5 12/09/14 13:54 Total RNAの精製 ® PureLink RNA Mini Kit 細胞や組織からのシンプルなTotal RNA精製 PureLink® RNA Mini Kitは動物や植物、酵母、細菌、血液を含む広 範囲の細胞や組織からTotal RNAを迅速に精製するために設計され たキットです （表1）。PureLink® RNA Mini Kitは独自のシリカベース のスピンカラムシステム（図 1 ）を用いることで、フェノール等の危険 な試薬を必要とせずに、高品質のRNAを他社のキットよりもはるかに 高い収量で抽出します。RNAはRNaseフリー水に溶出されるので、 ダ ウンストリームのほとんどのアプリケーションですぐに使用すること ができます。 • 約20分で高品質のRNAを精製 • 危険な、あるいは毒性のある化学物質を未使用 • 最大1,000 µgのRNA収量 PureLink® テクノロジーはグアニジン・イソチオシアネートによる細 胞溶解と、シリカメンブレンのスピンカラムによる精製スピードや純 度、容易さを組み合わせたものです。このキットでは危険なフェノー ル・クロロホルム抽出、手間のかかる塩化セシウム遠心分離、塩化リ チウムまたはアルコールによる沈殿を必要とせず、約 20 分のシンプ ルなプロトコールで RNAを得られます。精製された高品質の RNA は、ゲノムDNAのコンタミを最小限にした状態で得られ、RT-PCRや qPCR、ノーザンブロッティング、cDNA合成、ヌクレアーゼ保護アッセ イなどのダウンストリームのアプリケーションですぐに使用すること ができます。 本キットはMini Kitで他社のMidi Kitレベルのサンプルを処理可能 で、高収量のTotal RNAを回収することができます （図2、表3）。 • 精製した高品質・高純度のRNAは、様々なダウンストリームの用途 に使用可能 表１ PureLink® RNA Mini Kitに適合したサンプルサイズ 図 1 標準スピンカラムテクノロジーを利用した PureLink® RNA Mini Kit 4 1 サンプルを RNA 溶解液に 溶解後ホモジナイズします カートリッジを 3回洗浄します サンプルタイプ サンプル量 動植物細胞 最大108細胞 動物組織 最大200 mg 植物組織 最大250 mg 全血 最大0.2 ml 酵母細胞 最大5 x 108細胞 細菌細胞 最大109細胞 SPIN 1,000 2 5 900 800 RNAをリカバリー チューブに回収します 700 RNA (µg) エタノールを加え、 よく混和します PureLink® RNA Mini Kit ® Qiagen Q社 RNARNeasy Midi Kit RNA Midi Kit Q社 RNA Mini Kit 600 500 400 300 200 3 100 0 25 サンプルをRNAスピン カートリッジに加えます 100 200 Tissue (mg) 図 2 PureLink® RNA Mini Kit: 200 mg 以下のスタートサンプルからの高収量 を用いて、 PureLink® RNA Mini Kit および Q 社 Kit（Mini、Midi） 25 mg、100 mg、200 mg のラッ SPIN ト肝臓組織から RNA を精製し（製造元のプロトコールに従って） 、Total RNA の収量の比較 を行ったところ、PureLink® RNA Mini Kit は Q 社の Midi Kit 以上の収量が得られた。 PureLink® RNA Mini Kitについての詳細は下記のウェブサイトをご覧ください。 www.lfetechnologies.com/rnamini 6 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 6 12/09/14 13:54 ® PureLink RNA Micro Kit 少量サンプルからトータルRNAを効率的に精製 PureLink® RNA Micro Kitは、LCMやFACSでソートされた細胞な どの少量サンプルからトータルRNAを効率的に精製できるシステム です。TRIzol® Reagentを組み合わせれば、最大10 mgまでの組織 にも対応可能です。 • 15分で最大100 µgのRNA収量 • 少量のサンプルからTotal RNAを回収可能 • 85％以上の回収率 表2 PureLink® RNA Micro Kit 様々なサンプルでの使用例 Total RNA Yield (ug) サンプルタイプ 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Sample 1 動物細胞 Cells HeLa サンプル量 収 量 5 × 105細胞 7.5 µg Sample 2 Sample 3 動物組織 Liver Spleen Kidney Brain Heart Testes HEK293 5 5 × 10 細胞 10 µg Rat liver 5 mg 17 µg Rat brain 5 mg 2 µg Rat spleen 5 mg 13.1 µg Rat heart 5 mg 1.8 µg Rat testes 5 mg 7.1 μg Rat Tissue 図 3 PureLink ™ RNA Micro Kit により、5mg の凍結されたラット組織から RNA 精製 RNA は 10μl に溶出された。 RNA 収量は、260nm で吸光測定。 表3 PureLink® シリーズの優れたパフォーマンス 仕様 PureLink® RNA Mini Kit Q社 Mini Kit Q社 Midi Kit PureLink® RNA Micro Kit Q社 Micro Kit サンプルサイズ 最大200 mgの組織 最大5 x 107細胞 0.5∼30 mgの組織 最大107細胞 20∼250 mgの組織 5 x 106∼1 x 108細胞 5 mg以下の組織 5 x 106未満の細胞 5 mg未満の組織 5 x 105未満の細胞 結合能 1,000 µg 100 µg 1,000 µg 100 µg 45 µg プロトコール時間 20分 20分 60分 15分 30∼40分 溶出容量 30∼100 µL 30∼100 µL 300∼500 µL 10∼12 µL 10∼14 µL Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 PureLink® RNA Mini Kit 10 preps 12183-020 50 preps 12183-018A 250 preps 12183-025 50 preps 12183-016 PureLink® RNA Micro Kit 7 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 7 12/09/14 13:54 Total RNAの精製 ® TRIzol Reagents 最も信頼され文献にも多数引用されている試薬 TRIzol® Reagentsはフェノールとグアニジン・イソチオシアネート の調製済み単相溶液で、DNA・タンパク質フリーなTotal RNAの精 製に適しています （表4）。この製品はChomczynski とSacchiによっ て開発されたシングルステップRNA精製法に改良を加えた方法に基 づいており、約１時間で抽出が完了します。 TRIzol® Reagentsはスタートサンプルの種類を問わず高品質でイ ンタクトなRNA精製試薬として最も信頼され、数千もの研究文献で 引用されています。 • 実績も多く信頼して使用できるRNA精製試薬 • 抽出困難なサンプルに対しても優れた溶解能を発揮 • 組織や細胞、血清、ウイルス、細菌それぞれに至適化された組成 TRIzol® Reagentsを用いたRNA精製法は、ヒト、動物、植物、または 細菌由来の少量の組織（50∼100 mg） や細胞（5 x106）、ならびに大 量の組織（1 g以上） や細胞（>107） に対して優れたパフォーマンスを ® 発揮します。またTRIzol Reagentのシンプルさは、多数のサンプル を同時に処理することを可能にします。全体の手順は約1時間で完了 し、TRIzol® Reagentで精製したTotal RNAにはタンパク質とDNA の混入がありません。 表4 TRIzol® Reagentsシリーズ サンプルの種類 製品名 サンプル量 組織・細胞 TRIzol® 100 mgの組織または107細胞あたり試薬1 mL 血清やウイルス調製液などの溶液 TRIzol® LS 5 x 106細胞あたり試薬0.75 mL 細菌 TRIzol® Max Bacterial RNA Isolation Kit 108の細菌細胞あたり Max Bacterial Enhancement Reagent 0.2 mL + TRIzol® Reagent 1 mL 有機溶媒を用いた抽出を行うケース 近年、RNA 精製用の手順の多くはシリカベースの スピンカラム法を利用しているため、有機溶媒によ る抽出操作を含みません。シリカベースのスピンカ ラム法は安全、迅速で簡単ですが、有機溶媒によ る抽出操作を取り入れた方法は、シリカベースのス ピンカラム法のみの場合と比べていくつかの重要 なメリットがあります。これは脾臓や膵臓などの抽 出困難な組織や RNase を多く含む組織を扱う場合 に特にあてはまります。 抽出困難な組織 RNA 抽出困難な組織とは、高純度で分解のない 有 機 溶 媒フリー のグア ニジン溶 解 液 中 で は、 インタクトな RNA の回収が難しい組織やホモジナ イズが難しい組織のことです。これらには内在性 RNase は再活性化されることがあります。 RNase を多く含む組織（脾臓や膵臓）、固く繊維 • 迅速で効率的なタンパク質の除去 を多く含む組織（結合組織、骨、歯、および固い • 脂肪などの生体分子の除去 腫瘍）、および脂肪を多く含む組織（脳や脂肪組織） • スケールアップが容易に可能 有機溶媒による抽出のメリット • ヌクレアーゼの恒久的な不活化 が含まれます。 Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 TRIzol® Reagent 100 mL 15596-026 200 mL 15596-018 100 mL 10296-010 200 mL 10296-028 TRIzol® Reagent 100mL + Enhancement Reagent 20mL 16096-020 TRIzol® Reagent 200mL + Enhancement Reagent 40mL 16096-040 TRIzol® LS Reagent TRIzol® Max Bacterial RNA Isolation kit 詳細については以下のウェブサイトをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/trizol 8 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 8 12/09/14 13:54 ® TRIzol Plus RNA Purification System TRIzol® Plus RNA Purification Systemは、繊維質または脂肪組織、 植物といった抽出困難なサンプルからでも、約 1 時間の操作で分解の ないインタクトなRNAを高純度・高収量で提供できます（図5、表5）。高 純度に精製されたTotal RNAはマイクロアレイ解析あるいはqPCRな どの高感度を必要とする遺伝子発現研究におけるアプリケーションに 適しています。 1,000 Total RNA収量（μg） 高感度を必要とするアプリケーションのためのRNA精製 TRIzol® Plus RNA Purification Systemは、TRIzol® Reagentの優 れた溶解能と、PureLink® RNA Mini Kitのシリカスピンカラムフォー マットの容易さとスピードをカップリングさせたキットです （図4）。 100 TRIzol® Plus RNA Purification System 10 Q社 Mini Kit • スピンカラム方式により最大1,000 µgのTotal RNAの精製が可能 1 • RNA抽出困難な組織も含めた全ての細胞、組織に使用可能 1 10 100 1,000 Starting material（mg） • 面倒なエタノール沈殿の操作を省略 図 5 TRIzol® Plus RNA Purification System は他社のキットよりも 高い収量を提供します ラット肝臓組織をサンプルとしてスタートサンプル量を振って、TRIzol® Plus RNA Purification System と Q 社キットの Total RNA 回収能の 比較を行いました。 TRIzol® Plus System はカラムの最大結合能 1,000 µg まで RNA を回 収できましたが、Q 社キットは 1/10 程度で回収量が頭打ちとなりました。 図 4 最適化されたプロトコール TRIzol® Reagent は細胞を溶解して細胞成分を可溶化する一方 で RNA の完全性を維持します。クロロホルム抽出に続く遠心分 離により、溶解物を RNA を含む水相と有機相に分離し、水相は エタノールとの混和後に RNA 結合用 PureLink® RNA ミニカ RNAを含む 水層を新しい チューブに移す TRIzol®試薬中で SPIN SPIN サンプルを ホモジナイズする ラムに移します。 夾雑物は徹底的な洗浄によって効率的に除去 クロロホルムを加え 遠心分離 し、高純度の RNA を RNase フリー水に溶出します。 エタノールを加えて よく混ぜる RNAスピンカートリッジに 洗浄 サンプルを加える RNaseフリー水を 加えて新しいチューブに RNAを溶出する 表5 TRIzol® Plus RNA Purification System 仕様比較 仕様 TRIzol® Plus RNA Purification System Q社 Reagent+ Mini Kit キット内容 TRIzol® Reagent 100 mL + スピンカラム50個 Q社Reagent 200 mL + スピンカラム50個 サンプルサイズ 最大200 mgの組織または108細胞 最大30 mgの組織または107細胞 サンプルの種類 あらゆる種類のサンプル、特に抽出困難なサンプル 脂肪を多く含む組織（脳、脂肪組織） 結合能 1,000 µg 100 µg 処理時間 45分 45分 溶出容量（サンプルサイズによります） 最少30 µL 30∼100 µL Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 TRIzol® Plus RNA Purification System 50 preps 12183-555 9 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 9 12/09/14 13:54 Total RNAの精製 MagMAX™ purification systems 高収量で不純物の少ない核酸抽出 細胞や組織由来の核酸、ならびに細胞フリーのサンプル由来のウ イルスRNAの単離において、磁気ビーズは多くの利点があります。 MagMAXTMキットファミリーは、種々なアプリケーションに対応し、ご 利用になるサンプルに適したキットを提供します。MagMAXTMキット は96ウェルフォーマット （図6） で利用でき、 より高いスループットを可 能にします。 図7は、MagMAXTMキットの105にわたるダイナミックレンジでの高い 再現性を伴うRNA精製能力を示しています。効率的な磁気ビーズテ クノロジーと低溶出容量により、精製とその後のリアルタイムRTPCR解析がわずか100個の細胞から可能となっています。 • シリカベースのスピンカラム法よりも効率的にRNAに結合 Slope = -3.7 ±0.1 R2 = 0.996 40 • より高く、より安定したRNA収量 1 30 25 ΔRn • わずか20∼50 µLのヌクレアーゼフリー水にRNAを溶出可能 Ct 35 • 磁気ビーズテクノロジーにより、フィルターの目詰まりを排除 20 103 0.1 104 105 106 Cell # 0.01 サンプル 1. 細胞を溶解 2. RNAに結合 0 10 20 30 40 Cycle 図 7 広範囲の細胞数からの Total RNA の回収 MagMAXTM-96 Total RNA Isolation Kit を用い 100 ∼ 2 x 106 個の細胞（K562）から RNA を 回収しました。操作は 8 反復（n=8）で行い、それぞれ溶出容量の 4％分を qRT-PCR（10 µL 反応系）に添加し、ヒト RNA Polymerase II mRNA の検出を行いました。各細胞数インプット における 8 反復（n=8）の Ct 値の CV は 3％未満でした。 3. 洗浄 4. RNAを溶出 図 6 The MagMAX ™ Isolation Kit プロトコール 10 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 10 12/09/14 13:54 表6 MagMAXTM Kits: 磁気ビーズを利用した核酸精製 遺伝子発現：細胞・組織 MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit MagMAX™-96 for Microarrays Total RNA Isolation Kit 細胞 最大2 x 106細胞 最大5 x 107細胞 組織 動物：最大5 mgの組織 植物：最大10 mgの組織 （ただし、Plant RNA Isolation Aid 使用のこと） 最大100 mgの組織 特長 • gDNAの除去目的でTURBO DNaseTM添加 • マイクロアレイ等の厳密なダウンストリームアプリケーション用に 有機溶媒抽出を採用 • 抽出困難なサンプルまたは大容量サンプルに最適 • 代替プロトコールの使用でmiRNAも精製可能 フォーマット 96ウェルプレート 96ウェルプレート 病原体の検出：ウイルス、細菌、細胞フリー培地、および血液 ウイルス （RNA・DNA） MagMAX™-96 Viral RNA Isolation Kit MagMAX™ Total Nucleic Acid Isolation Kit MagMAX™-96 Blood RNA Isolation Kit 50–400 µLまでのサンプル 175 µLまでの液体サンプル 300 mgまでの固体サンプル 50 µLまでの全血サンプル 175 µLまでの液体サンプル 300 mgまでの固体サンプル 細菌 （RNA・DNA） • 低濃度のウイルスを扱う際に最適 特長 • DNAも精製可能 • ジルコニアビーズを使った破砕により 溶解困難な病原体も溶解 • 多様なサンプルマトリックスに適合 • 血中または乳中の病原体（ウイルスおよび ある種の細菌）の検出用 • 50 µLの少量全血から利用可能 • gDNAも精製可能 フォーマット または チューブ （50回分） 96ウェルプレートの二種類 シングルチューブ 96ウェルプレート Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 ™ 96 rxns AM1830 ™ MagMAX -96 for Microarrays Total RNA Isolation Kit 96 rxns AM1839 MagMAX ™ -96 Viral RNA Isolation Kit 50 rxns AM1939 96 rxns AM1836 5 x 96 rxns AMB18365 MagMAX ™ Total Nucleic Acid Isolation Kit 100 rxns AM1840 MagMAX ™ -96 Blood RNA Isolation Kit 96 rxns AM1837 MagMAX -96 Total RNA Isolation Kit 技術的な資料、 ビデオ、 ソフトウェアのダウンロードは、以下のウェブサイトでご覧ください。 www.lifetechnologies.com/magmax 11 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 11 12/09/14 13:54 mRNAの精製 様々なアプローチとテクノロジー Total RNAからの濃縮とサンプルからの直接精製 細胞中に存在するTotal RNAからmRNAだけを分離することは困難 を伴うことがあります。種々のサンプルから最適な結果を得るため に、ライフテクノロジーズではmRNA精製用に二種類のアプローチ を提供しています。 オリゴ（dT）セルロース/スピンカラム法 • Poly（A）PuristTM KitならびにMicroPoly（A）PuristTM Kit ̶ rRNAを効率的に除去し、mRNAを濃縮するキットです。1回の 精製（約2時間） で十分なクオリティーのmRNAが回収できます。 • FastTrack® 2.0 mRNA Isolation Kit ̶ 細胞や組織からの直接のmRNAの精製、あるいはTotal RNAか らのmRNAの濃縮を可能にします。FastTrack® 2.0 mRNA Isolation Kitは少ない細胞や組織から直接mRNAを精製、あるいは 微量なTotal RNAからのmRNAの濃縮に適しています。 １ 調整済のTotal RNAプールからmRNAを濃縮回収 高感度な解析が可能に 2 サンプルから直接mRNAを精製 Total RNA精製ステップをスキップし、より短時間でmRNAを 精製 また、ライフテクノロジーズでは四種の異なるテクノロジー（オリゴ （ dT ）セルロース/スピンカラム法、オリゴ（ dT ）/ 磁気ビーズ法、コー ティング済みプレート、化学的方法） を提供しており、表7にはそれぞ れの用途にあったmRNA精製の製品を示しています。 オリゴ（dT）/磁気ビーズ法 • Poly（A）PuristTM MAG Kit ̶ Poly（A）PuristTM Kitと同じハイブリダイゼーションならびに洗 浄液を採用していますが、磁気ビーズの容易さ、 スピード、ならびに スケーラビリティが新たに加わりました。プロトコールはたった45 分です。また当キットでは8回分のラージスケール濃縮反応（最大1 mgのTotal RNAインプット）または80回分のスモールスケール濃 縮反応（最小30 µgのTotal RNAインプット） が行えます。 表7 mRNA精製用のアプローチとテクノロジー Total RNA 抽出後 効果的に mRNA を スピンカラム法 磁気ビーズ法 • Poly(A)Purist™ • MicroPoly(A)Purist™ • Poly (A) Purist™ MAG • Dynabeads® mRNA Purification • FastTrack® 2.0 mRNA Isolation • Dynabeads® mRNA DIRECT™ • FastTrack® MAG 濃縮 サンプルから直接 mRNA を精製 新しい試薬と至適化されたプロ トコールを組み合わせたオリゴ （ dT ）セルロースを、簡単なスピ ンカラム方式で使用することに より効率的なPoly（A）RNAの選 別を促進します プレートフォーマット 化学的方法 • MICROBExpress™ Bacterial mRNA Enrichment • mRNA Catcher™ PLUS カラム方 式に類 似して います 96ウェルプレートの特許表面処 精製された細菌のTotal RNAか が、磁気ビーズとの組み合わせ 理によりmRNAの精製を容易に ら95％以上のrRNAの除去を可 でより高度で迅速な処理とより し、自動化にも適しています 能にする新しいテクノロジー 高いスループットを可能にして います 12 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 12 12/09/14 13:54 • Dynabeads® mRNA Purification Kit for mRNA Purification from Total RNA Preps ̶ 精製されたTotal RNAからmRNAを通常15分で濃縮します。 また、最小5 µLでビーズからmRNAを溶出したり、あるいは溶出 せずに直接ビーズ上でcDNAの合成を行うといった柔軟性を可能 にしています。 プレートフォーマット • mRNA CatcherTM PLUS Kit ̶ 100 ng∼100 µgのTotal RNA、100個∼106個の哺乳類細胞、 最大4 mgの組織、 または40 µLの全血を処理することが可能で、 ウェルあたりの結合能は80 ngを超えます。 化学的方法 ® TM • Dynabeads mRNA DIRECT ̶ 各種サンプルの15分での溶解・濃縮が可能です。このメソッド には最小 5 µL でビーズからmRNAを溶出したり、あるいは溶出 せずに直接ビーズ上でcDNAの合成を行うオプションが含まれま す。 • FastTrack® MAG Kit • MICROBExpress TM Bacterial mRNA Enrichment ̶ 細菌のmRNAは真核細胞のmRNAに見られるポリＡテールを 欠いているため、 ごく最近まで細菌からmRNAを単離することは 実質不可能でした。 しかし、 このキットは大腸菌や他の細菌のTotal RNAから16Sと23SのrRNAを95%以上除去する新しいテクノロ ジーを採用し、mRNAの単離を可能にしています。 ̶ 細胞、組織からの溶解・mRNA濃縮またはTotal RNAからの濃縮 のみの操作をオリゴ（dT）磁気ビーズ法によりサポートしています。 FastTrack® MAG Micro mRNA Isolation Kitはより少ないイン プット （50 mg未満のTotal RNAや106未満の細胞、50 mg未満の 組織）用に、一方FastTrack® MAG Maxi mRNA Isolation Kitは より大きなインプット （2,000 µg未満のTotal RNAや5 x 107未満 の細胞、500 mg未満の組織）用に至適化されています。 Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 Poly(A)Purist Kit 6rxns AM1916 MicroPoly(A)Purist ™ Kit 20rxns AM1919 FastTrack® 2.0 mRNA Isolation Kit 6rxns K1593-02 18rxns K1593-03 Poly(A)Purist MAG Kit 1 kit AM1922 Dynabeads® mRNA Purification Kit 2mL 610-06 Dynabeads® mRNA DIRECT ™ Kit 5mL 610-11 10mL 610-12 Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit 2mL 610-21 FastTrack® MAG 96 mRNA Isolation Kit 2 × 96 preps K1580-96 FastTrack® MAG Maxi mRNA Isolation Kit 6 preps K1580-02 FastTrack MAG Micro mRNA Isolation Kit 12 preps K1580-01 mRNA Catcher ™ PLUS Kit 1 x 96 preps K1570-02 10 x 96 preps K1570-03 20rxns AM1905 ™ ™ ® ™ ® MICROBExpress ™ Bacterial mRNA Enrichment Kit 13 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 13 12/09/14 13:54 遺伝子発現解析 Cells-to-CT™ kits RNA精製不要なリアルタイムRT-PCRのためのオールインワンシステム Cells-to-CTTM Kitsは培養細胞を迅速かつ容易に処理してリアルタ イムRT-PCR の結果に導きます。画期的な細胞溶解とRNA 安定化 テクノロジーによりRNA精製の必要性はなくなり、サンプルを培養 プレート （96または384ウエル）内で直接処理できますので、取り扱 いが容易で、サンプルのロスまたは分注のミスの可能性を最小限に します。その結果、より高い感度と再現性をもたらします（図 11 、次 頁）。また、Cells-to-CTTM Kitsはサンプル調製だけでなく、至適化さ れた逆転写試薬やTaqMan®またはSYBR® GreenベースのPCRマス ターミックスを含むキットとして、完全にワークフロー化されています （表8） 。 表8 Cell-to-CTTM Kitsシリーズ TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ Kit TaqMan® PreAmp Cells-to-CT™ Kit TaqMan® Fast Cells-to-CT™ Kit 遺伝子発現解析 遺伝子発現解析 遺伝子発現解析 TaqMan® Gene Expression Master Mix TaqMan® PreAmp Reagents、 TaqMan® Gene Expression Master Mix TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix 結果を得るまでの時間 サンプル調製：7分 逆転写反応：60分 標準リアルタイムPCR：90分 サンプル調製：7分 逆転写反応：60分 プレ増幅と標準リアルタイムPCR： 150分 サンプル調製：7分 逆転写反応：60分 ファストリアルタイムPCR：35分 インプット細胞量 10∼100,000細胞 10∼100,000細胞 10∼100,000細胞 特長 • siRNA誘導遺伝子ノックダウンスク • 添付のPre-PCR試薬により微量サン Application （Kit付属の）PCR master mix リーニングや薬剤処理などさまざ プルに最適となっています まな条件下で発現が変動する遺伝 Pre-PCR反応によって最大100遺伝 子のスクリーニング、ならびに標準 • 子を同時増幅可能で、バイアスを伴わ 的な遺伝子発現アプリケーションに ずに均一に最大64倍まで増幅します 最適 • Fastモードでのリアルタイム PCR反応が可能。標準リアルタ イムPCR反応時間の40％まで 時間短縮（注：Fastモード用の機 器が必要です） Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT ™ Kit 40rxns（100PCRs） 4399002 100rxns（500PCRs） AM1728 400rxns（2,000PCRs） AM1729 40rxns（500PCRs） 4387299 TaqMan Fast Cells-to-CT Kit 100rxns（500PCRs） 4399003 TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT ™ Kit 100rxns（500PCRs） 4391848 Power SYBR® Green Cells-to-CT ™ Kit 40rxns（100PCRs） 4402953 100rxns（500PCRs） 4402954 400rxns（2,000PCRs） 4402955 TaqMan® PreAmp Cells-to-CT ™ Kit ® ™ 14 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 14 12/09/14 13:54 7–10 min total 5x 5' 3' 3' 5' cDNA 5' 3' 1. 細胞溶解 3' mRNA 5' RT primer 3. リアルタイムPCR 2. 逆転写（RT） 1 細胞をPBSで洗浄 2 溶解液を加え、混和後5分間インキュベート 3 停止液を加え、混和後2分間インキュベート 1 溶解物とRTマスターミックスを混和 １ リアルタイムPCRマスターミックスとcDNAを混和 2 RTサーマルサイクラーで65分間のランを行います 2 標準あるいはファストリアルタイムPCR装置内で PCRのランを行います 図 8 Cells-to-CTTM Kit プロトコール TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit Power SYBR® Green Cells-to-CT™ Kit Fast SYBR® Green Cells-to-CT™ Kit Stabilized Blood-to-CT™ Single Cell-to-CT™ miRNA 解析 遺伝子発現解析 遺伝子発現解析 遺伝子発現解析 遺伝子発現解析 TaqMan® Universal PCR Master Mix Power SYBR® Green PCR Master Mix Fast SYBR® Green Master Mix — TaqMan® Gene Expression Master Mix サンプル調製：10分 逆転写反応：60分 標準リアルタイムPCR： 90分 サンプル調製：7分 逆転写反応：60分 標準リアルタイムPCR： 90分 サンプル調製：7分 逆転写反応：60分 ファストリアルタイムPCR： 35分 サンプル調製：60分以内 サンプル調整：7分 10∼100,000細胞 10∼100,000細胞 10∼100,000細胞 500 µL の安定化した血液 1∼10細胞 サンプル • TaqMan® Micro RNA Assaysと組み合わせて使 • 広範囲のプライマーセット で検証済み 用すれば、 より優れた結果 が得られます • Fastモードでのリアルタ • Total RNA（miRNA を含む） を精製せずに イムPCR反応が可能。標 安定化した血液サンプ 準リアルタイムPCR反応 時間の40％まで時間短縮 ル（PAXgene®または （注：Fastモード用の機器 TempusTM Blood RNA が必要です） Tubes）から検出します • 単一細胞からのリアルタイ ムRT-PCR用にあらかじめ 至適化されたワークフロー • 単一細胞の解析のための最 大限の感度 • 代替法に比べてより優れた パフォーマンスと再現性 Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 Fast SYBR® Green Cells-to-CT ™ Kit 100rxns（500PCRs） 4402956 400rxns（2,000PCRs） 4402957 Stabilized Blood-to-CT ™ Nucleic Acid Preparation Kit for qPCR (PAXgene® or Tempus ™ Blood RNA Tubes) 50rxns 4449079 Stabilized Blood-to-CT ™ Nucleic Acid Preparation Kit for qPCR (PAXgene® Blood RNA Tubes) 200rxns 4449082 Stabilized Blood-to-CT ™ Nucleic Acid Preparation Kit for qPCR (Tempus ™ Blood RNA Tubes) 200rxns 4449080 Ambion® Single Cell-to-CT™ Kit 50rxns 4458237 400rxns 4458236 Cells-to-CT ™ familyについてのテクニカルノート、技術的な資料、ビデオなどは、下記ウェブサイトをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/cellstoct 15 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 15 12/09/14 13:54 遺伝子発現解析 Cells-to-CT™ kits RNA精製と同等の性能 Cells-to-CTキットに採用されている逆転写酵素は、きょう雑物の多 Cells-to-CT™ Lysate Purified RNA CT Value い細胞ライセートのままでも効率よく反応するように最適化されて います。Cells-to-CTのワークフロー（図8） を用いれば、 リアルタイム RT-PCRのもつ感度や特異性を失うことなく、精製RNAサンプルを 用いる場合と同等の性能が得られます （図9）。 Log (# of cells per preparation) また精製工程におけるRNAの品質や収量へのバイアスが無いため、 安定した再現性のあるデータが得られます （図10）。 Panel A. 18S rRNA Cells-to-CT™ CTs CT Value Cells-to-CT™ Lysate Purified RNA Log (# of cells per preparation) Panel B. GAPDH CT Value Cells-to-CT™ Lysate Purified RNA Purified RNA CTs Log (# of cells per preparation) Panel C. ACTB 図 9 Cells-to-CT ™ Kit で調製したライセートを使ったリアルタイム RT-PCR の再現性 図 10 Cells-to-CT ™ Kit による細胞ライセートは精製した RNA よりむしろ良いパフォーマンス HeLa 細胞から精製したトータル RNA と、Cell-to-CT Kit で調製したライセートを用いて、 128 種類の TaqMan® Gene Expression Assays で増幅して比較しました。 Cell-to-CT Kit で調製したライセートから得られた CT 値は、精製ＲＮＡから得られた数値とほ を示す このデータから、Cell-to-CT Kit を用いた方法は、従来の精製ＲＮＡからのリアルタイム RT- Ｐ 10 ∼ 100,000 個の HeLa 細胞由来の ライセート、あるいは精製した RNA を逆転写し、TaqMan® Gene Expression Master Mix と混合し、TaqMan® Human Endogenous Control Arrays で検証しました。 Panel A~C は、Endogenous Control Arrays に搭載されている 16 遺伝子のうち、3 つの遺伝 ＣＲと同等の良好な結果が得られる事が確認されました。 子での結果を示しています。 ぼ同じでした。 ビデオ「Ambion® Cells-to-C TTM で短時間にリアルタイム定量PCR へ！」も是非ご覧ください。 アクセスはこちらから⇒ 精製RNA 傾き＝-3.69、R2 = 1.00 33 またはYouTubeで「Ambion Cells」で検索 TaqMan® Gene Expression Cells-to-CTTM Kit 傾き＝-3.36、R2 = 0.99 31 A社 29 傾き＝-3.89、R2 = 1.00 Q社 傾き＝-3.96、R2 = 0.99 Ct 27 25 23 図 11 TaqMan® Gene Expression Cells-to-CTTM Kit と他社製品の感度の比較 Hela 細胞（100 ∼ 10,000）から従来の RNA 精製法、TaqMan® Gene Expression Cells-to-CTTM Kit のプロトコー ル、または Q 社および A 社の他の細胞溶解法を用いて RNA を調製しました。逆転写反応は各キットで推奨され る最大量のサンプルインプットを含み、リアルタイム PCR は PPIA に対する TaqMan® Gene Expression Assay を用いて 3 反復で行いました。結果、Cells-to-CTTM Kit では、他社の細胞溶解法の Kit と比較し、はるかに高 い感度を示し、精製 RNA を用いた場合とほぼ同等のパフォーマンスを示しました。また微量細胞のレンジ（10 ∼ 100 細胞）では精製 RNA より高感度でばらつきの少ない結果を示しています。 21 19 17 15 10E2 10E3 10E4 10E5 対数（溶解反応あたりの細胞数） 16 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 16 12/09/14 13:54 Single Cell-to-CT™ Kit 単一細胞解析のためのツール 多くの細胞からの遺伝子発現結果では、単一細胞内に生じる微妙で 重要な変化までの探求には限界があります。一方では生物システム の複雑さをより理解するためには、単一細胞解析を行なわなければ なりません。 • 細胞サンプルからリアルタイムRT-PCR解析までわずか5ステップ で完了できるシンプルなプロトコール • 単一細胞解析で最大の感度（図13） • 従来の精製法やボイル法より優れた感度と再現性（図14） Ambion® Single Cell-to-CT™ Kitは、1-10細胞の遺伝子発現解析 用の完全に検証されたワークフローです （図12）。 1. 細胞溶解 1. 10μｌの Single Cell Solution に 1‐10 細胞を加えます。 2. 室温で 5 分インキュベートします。 2. 反応停止 1. 1μｌの Stop Solution を加えます。 2. 室温で 2 分インキュベートします。 3. 逆転写（RT） 4. プレ増幅 1. 4-5μｌの RT Mix を加えます。 2. 25℃で 10 分、42℃で 60 分、 85℃で 5 分インキュベートします。 1. 11μｌの PreAmp Mix を加えます。 2. 95℃で 10 分の後、95℃で 15 秒、 60℃で 4 分で PCR をおこないます。 5. リアルタイムPCR 1. Preamplified した産物を 1：20 で希釈しリアルタイム PCR を おこないます。 図 12 Ambion® Single Cell-to-CT ™ Kit プロトコール Single Cell-to-CT™ Kitの優れた感度と再現性 図 13 Single Cell-to-CT ™ Kit の感度と再現性 100 細胞サンプル コントロールと比較すると、単一細胞相当のサンプルでは、理想的な直線 性と感度を示しています（6.8 の CT 差）。個々の単一細胞は固有の細胞多様性と生物学的変 化により大きな変動性を示します。 従来の精製法やボイル法と比較し、 単一細胞解析の感度と再現性に優れています 図 14 従来の精製やボイル法より優れています 10 細胞をサンプルとし、以下の方法で細胞を調製しました。 1. Single Cell Lysis Buffer で溶解（25℃で 5 分） 2. PBS 中で凍結 / 融解を 5 回処理 3. PBS または RT バッファー中でボイル（95 ℃で 10 分） 各ライセートを逆転写で cDNA を調製し、さらに 14 サイクルの Pre-Amplification 処理、 B2M、GAPDH、HPRT1、TGFB1 のアッセイを行いました。生物学的レプリケートを 5 個設定し、 平均の CT 値を示しています。 17 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 17 12/09/14 13:54 miRNAの精製・解析 miRNA 解析ツール miRNAおよびSmall RNAの効率的な抽出 マイクロRNA（miRNA） は、進化的に保存された短いnon-codingの RNA（∼22塩基）で、発生、細胞増殖、分化、ならびに細胞周期におい て重要な調節因子として働くことが報告されています。mRNA回収 用に開発されたシリカベースのスピンカラム法では、miRNAなどの Small RNAを効率的に回収できません。そのためmiRNA回収には、 特別に最適化された方法を用いる必要があります。 ライフテクノロジーズのmiRNA回収用に開発された精製キットおよ び細胞溶解からリアルタイムRT-PCRによる解析用システム・解析 キット （表9） を用いた場合、以下のメリットが得られます。 • 低分子RNA（200 nt未満）の定量的回収 • 操作によるバイアスなくSmall RNAを回収 mirVana™ miRNA Isolation Kit • 低分子 RNAを含むTotal RNA の効率的な精製用、ならびにダウ ンストリームでの解析における感度の向上のための低分子 RNA （ 200 nt 未満）の濃縮用。迅速で容易な手順はmiRNA 、siRNA 、 shRNA、ならびにsnRNAの解析に最適で、あらゆる種類の細胞お よび組織に適合します。 • 用いるサンプルタイプによって至適化された製品を選択可能 表9 各種サンプルからのmiRNA精製キット mirVana™ miRNA Isolation Kit ü サンプルの種類 低分子 RNA および miRNA を含む Total RNA mirVana™ PARIS™ Kit ü DNA ü タンパク質 テクノロジー 迅速な酸性フェノール・クロロホルム抽出とシリカベー スのスピンカラムによる精製 細胞破砕バッファーと酸性フェノールクロロホルム 抽出法ならびにシリカベースのスピンカラムによる 精製の組み合わせ インプットサンプル量 103∼107細胞または0.5∼250 mgの組織 100∼ 107の培養細胞または最大100 mgの組織 特長 • miRNAプロファイリング実験や他の遺伝子発現ア • シンプルに30分間で済む手順 プリケーションに最適 • mRNA 、miRNA、およびsiRNAをタンパク質レベ • 培養細胞や組織（高濃度のリボヌクレアーゼが存在 する組織を含む） からの迅速で容易な低分子RNAの 精製 ルと関連付けるのに最適 • オプションに含まれる低分子RNAの濃縮操作によ りダウンストリームでの解析における感度の向上 が可能 • 血清・血しょうなどの液体サンプルからのSmall RNAの精製も可能 Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 mirVana ™ miRNA Isolation Kit 40 rxns AM1560 mirVana ™ PARIS ™ Kit 40 rxns AM1556 18 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 18 12/09/14 13:54 TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE Tissues • RNA精製を行わない培養細胞から直接miRNAの発現解析が可 能。プロトコールには10 ∼ 100,000 個の培養細胞から始める簡 単な 10 分間のサンプル調製手順が採用されています。キットに はリアルタイムRT-PCR用試薬も含まれ、TaqMan® MicroRNA Assays（別売り）での解析用に検証されたシステムです。 • FFPE 組織からのマイクロRNAを含む全核酸の精製用。RNA の 精製にovernightのProteinaseK処理は不要。 （一日で脱パラフィ ン処理からリアルタイムRT-PCRまでの処理を行うことができま す。）未固定組織の50%以上の収量が可能です。 TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit MagMAX™-96 for Microarrays Total RNA Isolation Kit ü RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE Tissues ü ü ü 有機溶媒試薬による細胞の溶解とその後の磁気 ビーズによる精製 Cells-to-CTTM Kitによる細胞溶解とオプションとし 脱パラフィン、プロテアーゼ消化、およびグラスファ てDNase処理 イバーフィルターによる精製 最大5 x 106 細胞または最大100 mgの組織 10∼100,000細胞 最大4枚の20 µm厚切片 • 高度で一貫した結果 • リアルタイムRT-PCR用 • FFPE組織からのマイクロRNAを含む全核酸の精 • ハイスループットに適したRNAの精製 • TaqMan® MicroRNA Assaysとの併用で • 競合キットに比べてより少ない操作時間 製用に至適化 • RNAの分離にovernightのProteinasek処理は不 要。 （一日で脱パラフィン処理からRT-PCRまでの 処理を行うことが可能）未固定組織の50%以上の より優れた結果 • 低分子RNAの回収用に改良されたプロトコール 収量が可能 • リアルタイムRT-PCRおよびPCR、変異スクリーニ ングおよびマイクロアレイ解析用 Ordering information 製品名 MagMAX ™ -96 for Microarrays Total RNA Isolation Kit ® ™ TaqMan MicroRNA Cells-to-CT Kit RecoverAll ™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE Tissues サイズ 製品番号 96 rxns AM1839 100 rxns (500 PCRs) 4391848 400 rxns (2,000 PCRs) 4391996 40 rxns AM1975 19 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 19 12/09/14 13:54 RNaseをコントロール Ambion® RNA Essentials Products Ordering information どこにでも存在する頑強なRNase対策 RNaseは非常に安定したタンパク質で、凍結・解凍のサイクルの繰り 製品名 返しやオートクレーブ処理後でも活性を保持しています。その結果、 Conical Tubes (15 mL) (racked) 機器や実験台の表面や溶液からRNaseを除去するには強力な化学 Conical Tubes (50 mL) (racked) 的方法が必要になります。RNAの精製を確実に行うには以下の三つ Nuclease-Free Water (not DEPC-treated) (1 x 500 mL) の方法が有効です。 1 常にRNaseフリーのチップ、チューブ、および溶液を使用する DEPC-Treated Water (1 x 100 mL) サイズ 製品番号 500 tubes AM12500 200 tubes AM12501 500 mL AM9930 100 mL AM9915G 2 精製を開始する前に全ての表面の除染を行う RNase-free Tip と Tube 3 内在性RNaseからサンプルを守る RNase-free Microfuge Tubes 1,000 本 x 0.5 mL AM12300 RNase-free Microfuge Tubes 500 本 x 1.5 mL AM12400 RNase-free Microfuge Tubes 500 本 x 2.0 mL AM12425 Non-stick RNase-free Microfuge Tubes 500 本 x 0.5 mL AM12350 Non-stick RNase-free Microfuge Tubes 250 本 x 1.5 mL AM12450 Non-stick RNase-free Microfuge Tubes 250 本 x 2.0 mL AM12475 Elution Tubes 100 本 x 2.0 mL AM12480 RNase-free Tips, 200 μL Size 10 箱 (8 x 12 本/箱) AM12650 RNase-free Tips, 1000 μL Size 10 箱 (100 本/箱) AM12660 Barrier (Filter) Tips, 1 mL Size 10 箱 (100 本/箱) AM12665 Barrier (Filter) Tips, 200 μL Size 10 箱 (8 x 12 本/箱) AM12655 Barrier (Filter) Tips, 100 μL Size 10 箱 (8 x 12 本/箱) AM12648 Barrier (Filter) Tips, 20 μL Size 10 箱 (8 x 12 本/箱) AM12645 Barrier (Filter) Tips, 10 μL Size -Pipetman® 10 箱 (8 x 12 本/箱) AM12640 Barrier (Filter) Tips, 10 μL Size -Eppendorf® 10 箱 (8 x 12 本/箱) AM12635 Thin-walled, Dome Cap, RNase-free PCR Tubes 1,000 本 x 0.5 mL AM12250 Thin-walled, Frosted Lid, RNase-free PCR Tubes 1,000 本 x 0.5 mL AM12275 Thin-walled, Frosted Lid, RNase-free PCR Tubes 1,000 本 x 0.2 mL AM12225 厳密なテストに裏打ちされた品質 ライフテクノロジーズのさまざまな種類のチップとチューブは、それ ぞれのロットごとに感度の高いテストを行ない、RNaseとDNaseのコ ンタミが存在しない状態、nuclease-freeであることが保証されてい ます。nucleaseのコンタミを確かめるために、各ロットから抜き出し た複数のマイクロチューブにRIで標識したRNAを入れ、37℃で14∼ 16時間インキュベートした後、これらを電気泳動して、オートラジオグ ラフィーで分析しています。 これらの全てのチューブは高温のウォーターバスで使用してもキャッ プが開いてしまうことがありません。 表面の除染 RNA の精製を始める前にベンチトップやピペット、ガラス器具など、 ベンチトップ装置を含む全ての表面を表面除染剤で処理する必要 があります。ライフテクノロジーズでは、RNaseZap ® Solution 、 RNaseZap ® Wipes 、ElectroZap TM Solution 、ならびにRNase AWAY® Reagentなどの表面除染用製品を提供しています。これらは 実験室のあらゆる表面からRNaseのコンタミネーションを除去する のに効果があることが証明されています。 RNaseZap® SolutionはRNaseを不活性化する三種の異なる化学 p® eZ a as RNaseZap® Solution RN 製品 B ル A 製品 コン トロ ー l/ H Ma ind rke III rs 薬剤を組み合わせたものです。処理する表面にスプレーし、ヌクレ アーゼフリー水でリンスするだけで簡単にRNaseを除去できます。 ウェットティッシュタイプで便利なRNaseZap® Wipesもあります。 28S rRNA RNaseZap® Solution (1 bottle) 250 mL AM9780 RNaseZap® Solution (6 bottles) 6 x 250 mL AM9782 4L AM9784 100 枚 AM9786 3 x 100 枚 AM9788 ® RNaseZap Solution (1 box) 18S rRNA RNaseZap® Wipe RNase 汚染除去用の製品比較結果 RNaseZap® Wipes ® RNaseZap Wipes Refill 20 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 20 12/09/14 13:54 内在性RNaseに対する防御（RNA安定化） 遺伝子発現解析を行う上では、高品質でインタクトなRNAを得ること は基本的なステップですが、 しばしば最もクリティカルなステップでも あります。高品質のRNAを精製するには、組織は採取直後に処理して 瞬間凍結するか、適切な保存用試薬中に処理し、サンプル中のRNA をインタクトな状態で安定化させて保存する必要があります。 ご存知ですか？ RNAlater ® Solutionは、 次のようなところでも活躍しています: • スペースシャトルで無重力条件化で植物と動物の成長に関する研究 のため宇宙と地球の間を行き来しました。 • 温泉から採取される環境サンプルのcDNAライブラリー作成のため 中国に送られました。 ライフテクノロジーズでは採取時や採取後のRNAの完全性を安定化 させ保存することに特化してデザインされた製品も提供しています。 • テロメアの長さを測定する老化関連研究に用いられています。 RNAlater ®：組織中のRNAを安定化 • 科学者がスキューバダイビング時に携帯し、サンゴ礁から採取した RNAの保存に使用しました。 • サンプル収集が簡単: RNaseを迅速に不活化し、組織や細胞内のRNAを安 定化 • 37℃で1日、25℃で1週間、4℃で1ヶ月、-20℃なら長期間RNAが安定 • 診療所では、患者の組織や血液のサンプルから得られたRNAを保 存するため、病院では外科生検サンプルからRNAを回収するために 使用されています。 • 液体窒素などでのサンプル凍結が不要 RNAlater ®-ICE：凍結保存した組織中のRNAを安定化 さまざまなアプリケーションに使えるRNAlater ® Solution RNAlater Solutionは、さまざまな哺乳動物組織、血液、植物、バクテ リア、Xenopus、魚類、Drosophilaでテストされています。RNAlater Solutionは、以下の目的に適しています。 • RNAを分解させずに凍結組織を解凍 • 凍結組織を新鮮な組織サンプルと同様な処理が可能 （液体窒素中での粉砕は不要） • RNA分離前に室温で簡単に分割、計量ができる • RNaseを多量に含む組織におけるRNAの保護 • フリーザーの故障や停電から組織サンプルを保護 • 経時変化をみる為にさまざまなタイムポイントで収集したサンプ RNA Storange Solution：RNA保存用溶液 • 0.1mµ EDTA、TE Bufferよりも安定性が向上 ルをまとめて処理する場合 • 後日マイクロダイセクション処理するための組織保存 • 動物の臓器などを切り分けるのに時間がかかる場合のRNAの安 37° Cで 一日 臓 肝 臓 臓 腎 脾 臓 肝 臓 脾 定化 4° Cで 室温で 一週間 一ヶ月間 臓 腎 臓 肝 臓 脾 • すぐにRNA分離できない場所でのサンプル収集 臓 • 一晩かかる、室温や氷上でのサンプル輸送 腎 – p53 製品名 サイズ 製品番号 RNAlater® Solution 100 mL AM7020 ® 500 mL AM7021 ® 50 x 1.5 mL AM7022 ® RNAlater Solution 20 x 5 mL AM7023 RNAlater® Solution 250 mL AM7024 RNAlater® -ICE Solution 25 mL AM7030 RNAlater® -ICE Solution 10 × 25 mL 4427575 RNAlater Solution ® – GAPDH RNAlater Solution RNAlater Solution – p53 – GAPDH ® 図 15 RNAlater 溶液で処理した組織由来の RNA のノーザンブロット 切り離した組織を約 5 倍量の RNAlater ® 溶液に室温で浸漬し、一部を 37℃で一日、室温（25℃） で一週間、または 4℃で一ヶ月間保存しました。（上部パネルのゲルの）p53 および GAPDH RNAlater®-ICE Solution のプローブとのハイブリダイゼーションを行ったノーザンブロッティングの結果は、RNAlater ® RNA Strage Solution 溶液で処理し異なる温度で保存した組織（下部パネル）から単離した RNA の完全性を示して THE RNA Strange Solution 10 tubes AM7000 THE RNA Strange Solution 50 mL AM7001 います。組織には高い内在性 RNase 濃度で知られる脾臓が含まれていることに注目してくだ さい。 21 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 21 12/09/14 13:54 RNAの定量 Qubit® 2.0 Fluorometer 少量サンプルや高度なワークフローの実験に Qubit®2.0 Fluorometerは、高感度、高精度の測定が可能で、少量の 貴重なサンプルや高度なワークフローの実験をサポートします。 • 貴重で実験処理が難しいサンプル。低濃度で少量のDNA、RNA、 タンパク質測定 • 高額なダウンストリームの実験。正確な測定を必要とするシーケン シング、 リアルタイムRT-PCR(qPCR) • 成果まで長期間必要なトランスフェクション • 複雑なサンプル準備を必要とするレーザーマイクロダイセクション Qubit® 2.0 Fluorometerは、専用に設計されたMolecular Probes® の色素を用いた蛍光定量テクノロジーを利用しています。これらの蛍 光色素は特異的な標的分子に結合したときにのみ蛍光シグナルを発 し、遊離のヌクレオチドあるいは分解した核酸の存在下においても同 様です。Qubit®の蛍光による定量は、DNAとRNAの最も特異的で感 度の高い定量を低濃度においても可能にします。 図 17 Qubit®2.0 Fluorometer の精度実験 0.01 から 10ng/μL に希釈された 10 replicates of lambda DNA を Qubit® DNA HS Assay kit を使用し標準的なプロトコールに従ってアッセイし Qubit® 2.0 Fluorometer で測定しまし た。その結果を同様のサンプルを測定した汎用 Spectrophotometer と比較しました。 • 高い特異性 ̶ Qubit®の蛍光による定量（図17） では、DNA、RNAあるいはタ ンパク質に結合した時にのみ蛍光を発する色素を含んだQubit® アッセイ試薬（表10） が使用されます。 • 高感度 ̶ Qubit®アッセイキットは、単一の被検体の非常に低いインプット レベル（10 pg/µL DNAおよび12.5 µg/mLタンパク質）でも高い 感度を示します • シンプル ̶ 直感的なフォーマットで、定量結果をさらに容易に、より早く得 られます。 図 16 The Qubit® Fluorometric Quantitation System 22 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 22 12/09/14 13:54 すべてのアッセイチューブを 2-3 秒 ボルテックスします。 室温で 2 分（Protein Assay は 15 分） インキュベートします。 Qubit®2.0 でチューブを測定します。 ® ® 図 18 Qubit® アッセイキットプロトコール Qubit®2.0Fluorometer にて定量 表10 Qubit®アッセイキットのアッセイ範囲 キット アッセイ範囲 スタートサンプル濃度 Qubit® dsDNA HS Assay 0.2–100 ng 10 pg ∼ 100 ng/µL ® 2–1,000 ng 100 pg ∼ 1 µg/µL ® Qubit ssDNA Assay 1–200 ng 50 pg ∼ 200 ng/µL Qubit® RNA Assay 5–100 ng 250 pg ∼ 100 ng/µL Qubit RNA BR Assay 20–1,000 ng 1 ng ∼ 1 µg/µL Qubit® Protein Assay* 0.25–5 µg 12.5 µg ∼ 5 mg/mL Qubit dsDNA BR Assay ® ® ＊ Qubit Protein Assayはあらゆる還元試薬と適合性があります。 0.01% SDS （サンプル中濃度１％ （アッセイに2 µLのサンプルを使用する場合）） とは適合性がありますが、他の界面活性剤とは適合しません。 Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 Qubit® 2.0 Fluorometer — Q32866 Qubit® 2.0 Quantitation Starter Kit 1 Kit Q32871 Qubit 2.0 Quantitation Lab Starter Kit 1 Kit Q32872 Qubit® dsDNA BR Assay Kit 100 assays Q32850 500 assays Q32853 ® ® Qubit dsDNA HS Assay Kit 100 assays Q32851 500 assays Q32854 Qubit® ssDNA Assay Kit 100 assays Q10212 Qubit® RNA Assay Kit 100 assays Q32852 500 assays Q32855 ® Qubit RNA BR Assay Kit Qubit® Protein Assay Kit Qubit® Assay Tubes 100 assays Q10210 500 assays Q10211 100 assays Q33211 500 assays Q33212 500 tubes Q32856 Qubit®各製品の詳細は、以下のウェブサイトからご覧ください。 www.lifetechnologies.com/qubit 23 RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 23 12/09/14 13:54 公式 Facebook ページもチェック ! facebook.com/LifeTechnologiesJapan ライフテクノロジーズジャパン株式会社 本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 TEL.03-6832-9300 FAX. 03-6832-9580 大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 TEL.06-6339-8165 FAX. 06-6339-8138 コールセンター テクニカルサポート オーダーサポート カスタムプライマーについて サービスラボ 営業部 販売店 0120-650591（携帯からでもご利用いただけます） 0120-477-392 FAX：0120-477-120 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9584 TEL：03-6832-6980 FAX：03-6832-9585 TEL：03-5753-3006 FAX：03-5753-3007 TEL：03-6832-9300 FAX：03-6832-9580 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用はできません。 記載の社名および製品名は弊社または各社の商標または登録商標です。 The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. TRIzol is a registered trademark of Molecular Research Center, Inc. 記載価格は2012年4月現在の価格です。消費税は含まれていません。価格は予告なく変更する場合がありますので、予めご了承ください。 © 2012, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. Printed in Japan. AMB126-A1209OB 販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC www.lifetechnologies.com RNA_Brochure_2012JPCS55_0913.indd 1 12/09/14 13:54