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熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System Title 肥満・糖尿病モデル動物における組織TNFα converting enzyme (TACE) 活性調節の解明 : 肥満発症とカロリー制 限の影響 Author(s) 川崎, 修二 Citation Issue date 2012-03-23 Type Thesis or Dissertation URL http://hdl.handle.net/2298/28554 Right 学位論文 Doctoral Thesis 肥満・糖尿病モデル動物における組織 TNF converting enzyme (TACE) 活性調節の解明 ‐肥満発症とカロリー制限の影響‐ (Investigation for the regulation of tissue TNF converting enzyme (TACE) activities in obese and diabetic animal models -The effects of the development of obesity and caloric restriction-) 川崎 修二 Shuji Kawasaki 熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻 代謝・循環情報医学エキスパート育成コース 指導教員 荒木 栄一 教授 熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻代謝内科学 2012 年 3 月 －目次－ 1. 要旨 ............................................................................................................... 5 2. 参考論文 ........................................................................................................ 7 2-(1) 関連論文 ................................................................................................ 7 2-(2) その他の論文 ......................................................................................... 7 3. 謝辞 ............................................................................................................... 9 4. 略語一覧 ...................................................................................................... 10 5. 研究の背景と目的 ........................................................................................ 13 5-(1) 肥満と糖尿病の疫学............................................................................. 13 5-(2) 2 型糖尿病の成因と病態 ....................................................................... 15 5-(3) インスリン抵抗性の分子機序 .............................................................. 18 5-(4) TNFとインスリン抵抗性 ................................................................... 22 5-(5) 慢性炎症とインスリン抵抗性 .............................................................. 24 5-(6) 内臓脂肪蓄積とインスリン抵抗性 ....................................................... 25 5-(7) TNF converting enzyme (TACE) ...................................................... 26 5-(7)-(A) TNF前駆体の切断・成熟 TNFの分泌機構.............................. 28 5-(7)-(B) TACE 活性の制御因子 ................................................................ 30 5-(7)-(C) TACE の免疫における役割 ......................................................... 30 5-(7)-(D) TACE とインスリン抵抗性・耐糖能 ........................................... 31 5-(8) 肥満・2 型糖尿病モデル動物 ............................................................... 32 5-(8)-(A) KK マウス ................................................................................... 32 5-(8)-(B) KK-Ay マウス .............................................................................. 32 5-(8)-(C) 高脂肪・高ショ糖食負荷マウス ................................................. 33 5-(9) 本研究の目的 ....................................................................................... 34 6. 実験方法 ...................................................................................................... 35 6-(1) 実験動物 .............................................................................................. 35 6-(2) 摂食への介入 ....................................................................................... 35 6-(2)-(A) KK マウスおよび KK-Ay マウス ................................................. 35 6-(2)-(B) C57BL/6 マウス .......................................................................... 36 6-(3) マウスへの薬剤投与............................................................................. 36 6-(3)-(A) マウスへの TNFの投与 ............................................................ 37 6-(3)-(B) JNK 阻害剤の投与 ...................................................................... 37 6-(4) 臓器サンプルの TACE 活性測定 .......................................................... 37 6-(5) ウェスタンブロット法による蛋白発現の解析 ..................................... 38 6-(5)-(A) 蛋白サンプルの調整 ................................................................... 38 6-(5)-(B) ウェスタンブロット法 ................................................................ 39 6-(6) 定量的リアルタイム PCR 法による mRNA 発現の解析 ...................... 40 6-(7) 血中および細胞膜の TNF濃度測定 ................................................... 41 6-(8) 統計学的解析 ....................................................................................... 42 7. 実験結果 ...................................................................................................... 43 7-(1) 高脂肪・高ショ糖食餌による代謝パラメータへの影響 ....................... 43 7-(2) カロリー制限による代謝パラメータへの影響 ..................................... 44 7-(3) 高脂肪・高ショ糖食およびカロリー制限の TACE 活性への影響 ........ 46 7-(4) TACE および TIMP3 mRNA 発現 ....................................................... 47 7-(5) 肝、骨格筋および内臓脂肪組織の TACE 蛋白発現 ............................. 49 7-(6) 内臓脂肪組織における TACE 発現およびストレスキナーゼ ............... 50 7-(7) 細胞膜上の pro-TNF切断と成熟 TNF放出 ...................................... 52 7-(8) TNF投与による TACE 活性・発現への影響 ...................................... 54 7-(9) JNK 阻害剤の TACE 活性・発現への影響 ........................................... 55 8. 考察 ............................................................................................................. 57 8-(1) TACE 発現と活性との関係................................................................... 57 8-(2) TACE 活性の臓器間の差異................................................................... 58 8-(3) TACE 活性化の誘導因子 ...................................................................... 59 8-(4) 肥満・糖尿病における TACE の役割................................................... 60 8-(5) 今後の展望 ........................................................................................... 61 9. 結語 ............................................................................................................. 62 10. 参考文献 .................................................................................................... 63 1. 要旨 【目的】Tumor necrosis factor (TNF) converting enzyme (TACE)は、TNF 前駆体の細胞外ドメインを切断、成熟 TNFを生成し、肥満や糖尿病における インスリン抵抗性に関与するが、肥満や糖尿病における TACE 活性制御機構は 不詳である。本研究では、肥満・糖尿病モデルにおける TACE 活性、発現、制 御機構を検討し、これらへのカロリー制限(caloric restriction; CR)の効果を評価 した。 【方法】1) 高脂肪・高ショ糖食(high fat and high sucrose diet; HF/HS)を 16 週間与えた C57BL/6 マウス(B6-HF/HS)を通常食群と比較、2) 遺伝性肥満・糖 尿病モデル KK-Ay マウスを、自由摂食群(ad libitum-feeding: Ay-AL)および摂 餌量を 4 g/day (8 週齢の Ay-AL の約 60%)に制限した CR 群(Ay-CR)に分け、4 週間飼育後に対照の KK マウス(KK-AL)と比較した。3) TNFを KK-AL に腹腔 内投与、4) c-Jun N-terminal kinase (JNK)阻害剤 SP600125 (SP)を Ay-AL に 腹腔内投与し、TACE への影響を検討した。 【結果】B6-HF/HS および Ay-AL は、各々の対照と比較して体重、HbA1c およ び血糖値が上昇し、TACE 活性は肝および骨格筋では不変、内臓脂肪組織 (visceral adipose tissue; VAT)で上昇した。Ay-CR の体重、HbA1c および血糖 値は KK-AL と同等まで減少し、TACE 活性は VAT のみで抑制された。Ay-AL の VAT にて TACE 蛋白発現、JNK および p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)のリン酸化が増強し、CR にて減少した。VAT の TNF発現および血中 TNF濃度は Ay-AL で上昇、CR にて減少した。TNF投与は TACE 活性を増 強、SP 投与は TACE 活性を抑制した。 【考察】肥満・糖尿病状態において、VAT の TACE 活性および血中 TNF濃度 が上昇した。TNF投与が TACE を活性化したことより、TACE によって生成 -5- された成熟 TNFは、さらに TACE 活性化を促すというポジティブフィードバ ックの存在が示唆され、この機序は肥満における VAT の慢性炎症の成因につな がる可能性がある。また、TACE 活性化の少なくとも一部に、JNK の関与が示 唆された。CR は TACE 活性化、炎症性シグナルおよび TNF生成を効果的に 阻害し、慢性炎症およびインスリン抵抗性の抑制に有用と考えられた。 【結論】肥満・糖尿病状態において、VAT は TACE が活性化されやすい臓器で あり、CR が TACE 活性を抑制することを示した。今後、TACE 活性化の分子 機序および TACE 阻害効果の検討を行うことが、インスリン抵抗性の新規治療 法につながる可能性がある。 -6- 2. 参考論文 2-(1) 関連論文 1. Shuji Kawasaki, Hiroyuki Motoshima, Satoko Hanatani, Yuki Takaki, Motoyuki Igata, Atsuyuki Tsutsumi, Takeshi Matsumura, Tatsuya Kondo, Takafumi Senokuchi, Norio Ishii, Hiroyuki Kinoshita, Kazuki Fukuda, Junji Kawashima, Seiya Shimoda, Takeshi Nishikawa, Eiichi Araki Regulation of TNF converting enzyme activity in visceral adipose tissue of obese mice. Biochem Biophys Res Commun. (in press) 2-(2) その他の論文 1. Norio Ishii, Takeshi Matsumura, Hiroyuki Kinoshita, Hiroyuki Motoshima, Kanou Kojima, Atsuyuki Tsutsumi, Shuji Kawasaki, Miyuki Yano, Takafumi Senokuchi, Tomoichiro Asano, Takeshi Nishikawa, and Eiichi Araki Activation of AMP-activated Protein Kinase Suppresses Oxidized Low-density Lipoprotein-induced Macrophage Proliferation J Biol Chem. 284: 34561–34569, 2009. 2. 本島寛之, 堤厚之, 川崎修二, 荒木栄一 インスリン抵抗性と RAS の関連を探る －シグナル伝達の立場から－ Angiotensin Research. 7: 26–32, 2010. -7- 3. Atsuyuki Tsutsumi, Hiroyuki Motoshima, Tatsuya Kondo, Shuji Kawasaki, Takeshi Matsumura, Satoko Hanatani, Motoyuki Igata, Norio Ishii, Hiroyuki Kinoshita, Junji Kawashima, Kayo Taketa, Noboru Furukawa, Kaku Tsuruzoe, Takeshi Nishikawa, Eiichi Araki Caloric restriction decreases ER stress in liver and adipose tissue in ob/ob mice. Biochem Biophys Res Commun. 404: 339–344, 2011. 4. 本島寛之、堤厚之、川崎修二、花谷聡子、荒木栄一 メタボリックシンドローム発症基盤としての脂肪細胞機能異常 アディポサイトカインとその役割 レジスチン、TNF-、PAI-1 日本臨床 69(-) (992), 225-230, 2011. 5. Takeshi Matsumura, Hiroyuki Kinoshita, Norio Ishii, Kazuki Fukuda, Hiroyuki Motoshima, Takafumi Senokuchi, Kayo Taketa, Shuji Kawasaki, Tomoko Nishimaki-Mogami, Teruo Kawada, Takeshi Nishikawa, Eiichi Araki Telmisartan Exerts Antiatherosclerotic Effects by Activating Peroxisome Proliferator-Activated Receptor- in Macrophages Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31: 1268–1275, 2011. -8- 3. 謝辞 本研究は、熊本大学大学院生命科学研究部代謝内科学分野において、荒木栄 一教授による御指導の下に行いました。研究の立案、実施、解釈等の多面にわ たり御指導、御助言を頂き、深く感謝致します。 本研究・実験の施行にあたり、熊本大学医学部附属病院代謝・内分泌内科、 本島寛之助教には、論文の作成から実験の細部に至るまで御指導、御助言を頂 きました。 熊本大学大学院生命科学研究部糖尿病分子病態解析学、西川武志准教授には、 貴重な御指導、御助言を頂きました。 また、熊本大学大学院生命科学研究部代謝内科学分野、前・技官の一ノ瀬賢 司氏および検査技師の佐藤美希氏には、主に実験の準備において御助言、御協 力を頂きました。 最後に、熊本大学大学院生命科学研究部代謝内科学分野のスタッフ、医員、 研究生、大学院生および事務補佐員の皆様にも御助言、御協力を頂きました。 皆様に心より感謝致します。 -9- 4. 略語一覧 ADAM; a disintegrin and metalloproteinase ADAMTS; a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs AL; Ad Libitum-feeding ANOVA; analysis of variance BMI; Body mass index cDNA; complementary deoxyribonucleic acid CR; caloric restriction DMEM; Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DNA; deoxyribonucleic acid EDTA; ethylene diamin tetraacetic acid EGF; epidermal growth factor EGTA; ethylene glycol tetraacetic acid ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay ER; endoplasmic reticulum ERDS; ER-associated degradation ERK; extracellular signal-regulated kinase FAD; flavin adenine dinucleotide FFA; free fatty acid FoxO; forkhead box, sub-group O FRET; Fluorescence resonance energy transfer GDH; glucose dehydrogenase GLUT; glucose transporter GS; glycogen synthase - 10 - HB-EGF; heparin-binding epidermal growth factor HEPES; 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid HF/HS; high-fat/high-sucrose diet IDF; International Diabetes Federation IKK; IB kinase IR; insulin receptor iRhom; inactive rhomboid IRS; insulin receptor substrate JNK; c-Jun N-terminal kinase LPS; lipopolysaccharide MAPK; mitogen-activated protein kinase MCP-1; monocyte chemoattractant protein-1 MMP; matrix metalloproteinase MTMMP; membrane type MMP mRNA; messenger ribonucleic acid mTOR; mammalian target of rapamycin NASH; non-alcholic steatohepatitis NF-B; nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells PAGE; polyacrylamide gel electrophoresis PBS; phosphate-buffered saline PCR; polymerase chain reaction PDK1; 3-phosphoinositide dependent kinase 1 PEG; polyethylene glycol PEPCK; phosphoenolpyruvate carboxykinase PH; pleckstrin homology - 11 - PI-3K; phosphoinositide-3 kinase PIP3; phpsphatidylinositol-3, 4, 5-triphosphate PKB; protein kinase B PKC; protein kinase C PMSF; phenylmethylsulfonyl fluoride PPAR; peroxisome proliferator-activated receptor PTB; phosphotyrosine binding RHBDF; rhomboid family member () Rheb; Ras homolog enriched in brain (RHEB) RNA; ribonucleic acid S6K; p70 S6 kinase SC; standard chow SDS; sodium dodecyl sulfate SREBP; sterol regulatory element binding protein SVMP; snake venom metalloproteinase TACE; TNF converting enzyme TBS; Tris buffered saline TIMP3; tissue inhibitor of metalloproteinase 3 TLR4; toll-like receptor 4 TNF; tumor necrosis factor alpha TSC2; tuberous sclerosis complex 2 VAT; visceral adipose tissue WHO; World Health Organization - 12 - 5. 研究の背景と目的 本章では、研究の背景と目的について述べる。まず、5-(1)では肥満と糖尿病 の疫学について述べる。5-(2)では 2 型糖尿病の成因と病態について、5-(3)では インスリン抵抗性の分子機序について、5-(4)では TNFとインスリン抵抗性に ついて、5-(5)では慢性炎症とインスリン抵抗性について、5-(6)では内臓脂肪蓄 積とインスリン抵抗性について、5-(7)では TNF converting enzyme (TACE) について、5-(8)では肥満・2 型糖尿病モデル動物について述べる。最後の 5-(9) では本研究の目的について述べる。 5-(1) 肥満と糖尿病の疫学 肥満度の判定には、body mass index (BMI; 体重 (kg) / [身長 (m)]2) が国際 的に広く用いられている。World Health Organization (WHO; 世界保健機関) は、BMI 25 以上を過体重 (overweight)、30 以上を肥満 (obesity) と定義して いる。WHO によると、世界において肥満の成人は 1995 年には 2 億人、2000 年には 3 億人以上に増加し、2008 年には肥満の成人は 5 億人以上、過体重の成 人まで含めると 14 億人以上とされている。世界的に肥満が蔓延している状況に 対して、WHO は the global obesity epidemic または”globesity”という言葉を用 いて警鐘を鳴らしている (1,2)。 厚生労働省の平成 22 年の国民健康・栄養調査によると、本邦における 20 歳 以上の肥満者(BMI ≧ 25)の割合は、男性 30.4 %、女性 21.1 %であった。肥満 及びやせの者の割合の年次推移(20 歳以上)を見ると、男性の肥満者の割合は 10 数年で増えている。女性の場合は 40～60 歳代において肥満者の割合は減少して おり、20 歳代においては低体重(やせ)が増加傾向になっている(図 1)。 - 13 - 図1 肥満及びやせの者の割合の年次推移(20 歳以上) (厚生労働省 平成 22 年国 民健康・栄養調査より) ※20 歳代女性やせの者の割合は、移動平均により平滑化した結果から作成。移 動平均：グラフ上の結果のばらつきを少なくするため、各年次結果の前後の年 次結果を足し合わせ、計 3 年分を平均化したもの。ただし、平成 22 年について は単年の結果である。 国際糖尿病連合(IDF; International Diabetes Federation)によると、2011 年 に世界の糖尿病患者は 3 億 6,600 万人に上ると推定されており、有効な対策が 施されなければ 2030 年までに世界の糖尿病患者は 5 億 5,200 万人に増加し、成 人の 10 人に 1 人が糖尿病になると予測されている。 厚生労働省の平成 19 年の国民健康・栄養調査によると、本邦における成人で、 糖尿病が強く疑われる人(HbA1c (JDS)値が 6.1%以上、または、質問票で現在糖 尿病の治療を受けていると答えた人)は約 890 万人、糖尿病の可能性を否定でき ない人(HbA1c (JDS)値が 5.6%以上、6.1%未満の人)は約 1,320 万人、合わせて 約 2,210 万人の成人が耐糖能異常を持つと推計されており、その数は急速に増 加している(図 2)。また、平成 22 年の国民健康・栄養調査では、30 歳以上で糖 尿病が強く疑われる者の割合は、男性 17.4% (平成 14 年、13.7%)、女性 9.6% (平 成 14 年 7.0%)と、男女ともに増加している。 - 14 - 図 2 「糖尿病が強く疑われる人」、「糖尿病の可能性を否定できない人」の推計 (厚生労働省 平成 19 年国民健康・栄養調査より) (1) 「糖尿病が強く疑われる人」とは、HbA1c (JDS)値が 6.1%以上、または、 質問票で現在糖尿病の治療を受けていると答えた人である。(2) 「糖尿病の可能 性を否定できない人」とは、HbA1c (JDS)値が 5.6%以上、6.1%未満で、(1)以 外の人である。 本邦において、伝統的な低脂肪・低エネルギーの和食中心から欧米化した洋 食中心の食生活に変化していったこと、ファストフードやスナック菓子の摂 取・外食の機会が増え、1 日あたりの摂取エネルギーにおける脂質の割合が増加 したこと、自家用車の登録台数の伸びが示すように、運動不足になりやすい便 利で豊かな社会などといったライフスタイルの変化が、肥満や糖尿病の増加に つながっていると考えられる。 5-(2) 2 型糖尿病の成因と病態 血糖値の制御は、中枢神経系や内分泌系によって精密に制御されており、特 - 15 - に血糖低下作用を持つホルモンであるインスリンが中心的な役割を果たしてい る。食物摂取後、腸管より吸収されたブドウ糖は膵細胞からのインスリン分泌 を促し、肝臓ではグリコーゲン合成を促進するとともに、糖新生を抑制、骨格 筋では糖取り込みおよびグリコーゲン合成を促進、脂肪組織では糖取り込みを 促進するとともに脂肪分解を抑制する。これらの作用により、腸管より吸収さ れたブドウ糖は肝臓、骨格筋、脂肪組織に取り込まれ、血糖値が正常に保たれ る(図 3)。 図 3 インスリン作用の模式図 インスリンは、肝臓ではグリコーゲン合成を促進するとともに、糖新生を抑制、 骨格筋では糖取り込みおよびグリコーゲン合成を促進、脂肪組織では糖取り込 みを促進するとともに脂肪分解を抑制する。 糖尿病とは、インスリン作用の不足による慢性の高血糖状態を主徴とする代 謝疾患群である。本疾患群でインスリン作用が不足する機序は、膵細胞からの インスリン分泌低下(絶対的または相対的)と、組織のインスリン抵抗性増大であ る。本疾患群の中で 2 型糖尿病とは、インスリン分泌低下やインスリン抵抗性 をきたす素因を含む複数の遺伝因子に、過食、運動不足、肥満、ストレスなど - 16 - の環境因子および加齢が加わり発症する糖尿病である。2 型糖尿病には、インス リン分泌低下を主体とするものと、インスリン抵抗性が主体で、それにインス リンの相対的不足を伴うものなどがある。 環境因子や遺伝因子によってインスリン分泌低下やインスリン抵抗性増大が 起こると、個体としてインスリン作用不足が生じ、血糖値が一過性に上昇する。 高血糖はそれ自体がインスリンの分泌能低下やインスリン抵抗性増大を引き起 こし(糖毒性)、さらにインスリン作用不足・血糖上昇を促すという悪循環が形成 され、慢性的な高血糖が発症、悪化すると考えられている(図 4)。 図 4 2 型糖尿病の病態 高血糖による糖毒性はインスリン分泌低下およびインスリン抵抗性をまねき、 さらなる血糖上昇を促進するという悪循環を引き起こす。 - 17 - インスリン抵抗性はインスリン分泌障害と並んで糖尿病発症に重要な因子で あり、遺伝的素因と後天的な環境因子の両者が関与すると考えられる。遺伝的 な要素には未解明の部分が多く残されているが、インスリン受容体から最終的 な糖代謝の発現にいたる間での作用伝達に携わる様々な蛋白の発現量の変化や 機能、構造の異常が、インスリン抵抗性の原因となるものと予想される。イン スリン受容体異常症のように、単一の遺伝子異常で高度なインスリン作用障害 を来たし、糖尿病をもたらすものも存在するが、2 型糖尿病の大半は複数の遺伝 子が発症に関与すると予想されている。一方、近年の糖尿病患者数の増加は、 このような遺伝的背景が急速に変化したのではなく、環境因子によるインスリ ン抵抗性の増大によって導かれたものである。すなわち、文明の発達に伴う運 動量の減少や食生活の欧米化、肥満の増大、ストレスの増加や高齢化などが引 き金となって、インスリン抵抗性の要素が増大していると考えられている。 5-(3) インスリン抵抗性の分子機序 インスリンはインスリン受容体(insulin receptor; IR)に結合してそのチロシ ンキナーゼ活性を亢進させ、IR の基質である insulin receptor substrate-1 (IRS-1)や IRS-2 などの IRS 蛋白のチロシンリン酸化を促す。インスリンの多く の生理作用を媒介するものとしては、phosphoinositide-3 kinase (PI-3K)経路が ある。 PI-3K 調節サブユニット p85 はその SH2 ドメインを介してチロシンリン酸化 された IRS 蛋白に結合する。p85 は触媒サブユニット p110 の活性を抑制してい るが、IRS 蛋白に結合すると抑制が解除され、PI-3K 活性が亢進し、膜近傍で phosphatidylinositol-3, 4, 5-triphosphate (PIP3)を産生する。次いで、PIP3 と の 親 和 性 を 持 つ pleckstrin homology (PH) ド メ イ ン を 有 す る - 18 - 3-phosphoinositide dependent kinase 1 (PDK1)とその下流の Akt は、細胞膜近 傍で産生された PIP3 と結合し、PKD1 と Akt が細胞膜近傍に集簇する。その状 態で、セリン・スレオニンキナーゼである PDK1 は Akt をリン酸化、活性化さ せる。インスリンによって活性化された Akt は、tuberous sclerosis complex 2 (TSC2)をリン酸化して Ras homolog enriched in brain (Rheb)-GTPase の活性 を抑制することで mammalian target of rapamycin (mTOR)を活性化し、蛋白 合成や細胞のサイズの増大などを促進する (3)。PI-3K/Akt の活性化により、脂 肪細胞における脂肪酸の分解抑制作用、脂肪細胞や骨格筋細胞における glucose tranceporter 4 (GLUT4)の細胞内プールから細胞膜への移行促進を介した糖取 込み促進作用、骨格筋におけるグリコーゲン合成酵素(GS; glycogen synthase) の活性化を介したグリコーゲン合成促進作用、肝臓にて糖新生をつかさどる phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)などの発現を抑制しグリコーゲ ン合成を促進して肝臓からの糖放出を抑制する作用、同じく肝臓にて脂肪酸の 燃焼を抑制して合成を促進させる作用などが、インスリン依存性に増強する。 IRS のレベルでのインスリンシグナル調節機構として重要と考えられている のは、IRS 蛋白のセリン・スレオニンリン酸化と IRS 蛋白量の減少の 2 つのメ カニズムである。 IRS-1 や IRS-2 には、チロシン残基のほかに、種々のセリン・スレオニンキ ナーゼの基質となりうるセリン残基が多数存在する。肥満などのインスリン抵 抗性の病態では、IRS-1 のセリンリン酸化が亢進することにより IRS-1 蛋白の 三次元構造が変化し、IRS-1 の IR への結合が阻害されることで IRS-1 のチロシ ンリン酸化が抑制される。White らは、IR と IRS 蛋白が結合する部位である phosphotyrosine binding (PTB)ドメインの近傍にある Ser307 が、ストレス応 答性 MAP キナーゼである c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1)によってリン酸化 されると報告している (4)。JNK1 は、インスリン抵抗性を惹起するアディポカ - 19 - インとして重要と考えられている TNFやインスリン自身によっても活性化さ れる(図 5）。 Reduced IR association Enhanced IRS1 degradation NH2 PH Reduced PI3-kinase assosiation PTB IRS-1 PI3K binding sites 307 S 608 Y JNK FFA 612 S 628 Y mTOR Insulin COOH 632 S S6K1 TNF 図 5 IRS-1 のセリンリン酸化部位とインスリン抵抗性 FFA、insulin、TNFは JNK、mTOR、S6K1 を介して IRS-1 のセリン残基を リン酸化し、チロシンリン酸化を抑制することでインスリン抵抗性が引き起こ される。 肥満の際には、free fatty acid (FFA)が増加することもインスリン抵抗性を増 悪させると言われているが、Yu らは FFA が IB kinase (IKK)を活性化して、 IRS 蛋白のセリンリン酸化を増加させることが原因であると報告している (5)。 また、Um らは S6 キナーゼ 1 (p70 S6 kinase 1; S6K1)が IRS-1 の Ser307、636、 639 をリン酸化してインスリンによるチロシンリン酸化を抑制することを報告 している (6)。すなわち、インスリンシグナルにおいて、IRS-1 → PI3K → mTORC1 → S6K1 → IRS-1 というネガティブフィードバックループを形成し ている。ところが、mTORC1/S6K1 経路はインスリンとは独立に過栄養によっ ても活性化されるため、肥満状態ではインスリン作用が減弱しても S6K1 活性 は維持され、IRS-1 のセリンリン酸化の恒常的上昇を招きインスリン抵抗性の更 - 20 - なる悪化を生じていると考えられる(図 6)。 A B IR Y-p Y-p Y-p Y-p ERKs JNKs Y-p IRS-1 mTOR 高インスリン血症 サイトカイン ストレス FFA Y-p PI3K IKK PKC S6K PKC S6K PKB チロシンリン酸化 p-S p-S IRS-1 p-S Y-p ネガティブフィードバックループ Y-p p-S IRS-1 Y-p Y-p ポジティブフィードバックループ 正常なインスリンシグナル mTOR JNKs ERKs セリンリン酸化 p-S p-S p-S p-S IRS-1 p-S p-S セリン・スレオニンキナーゼの活性 インスリン抵抗性 図 6 インスリンシグナル調節とインスリン抵抗性 (A) インスリンは IR に結合してそのチロシンキナーゼ活性を亢進させ、IR の基 質である IRS 蛋白のチロシンリン酸化を促し、下流にシグナルを伝達する。ま た、シグナル伝達において mTOR、JNK、ERK などを介したセリンリン酸化に よるネガティブフィードバックループを形成している。(B) 肥満などのインスリ ン抵抗性状態では、高インスリン血症、炎症惹起性サイトカインなどがこれら の経路を活性化させ、セリン・スレオニンキナーゼを活性化することでインス リン抵抗性が惹起される。 一方、肥満などのインスリン抵抗性の際には、IRS 蛋白の減少が起きている ことが知られている。IRS-1 の減少はユビキチン化による蛋白分解が主であり、 IRS-2 の減少は肝臓では mRNA の減少が主要な原因であると考えられている。 IRS-2 mRNA の発現調節には、forkhead box, sub-group O (FoxO)と sterol regulatory element binding protein (SREBP)という 2 つの転写因子が拮抗的に 働いていることが最近明らかになっている (7)。FoxO は IRS-2 遺伝子のプロモ - 21 - ーターに結合してその転写を亢進させるが、インスリンによって活性化された Akt によりリン酸化を受けて核外に排除され、IRS-2 遺伝子の転写が低下する。 また、インスリンによって発現が上昇する SREBP は、FoxO の IRS-2 遺伝子プ ロモーターへの結合を阻害することによって、IRS-2 の転写を抑制する。したが って、正常状態では絶食時にインスリン値が下がり作用が減弱することによっ て FoxO の核内への移行と IRS-2 遺伝子プロモーターへの結合が高まり、IRS-2 蛋白が増加する。一方、摂食後にはインスリン値が高まって作用が増強して、 FoxO が核外へ排除され、また SREBP による阻害も増強し、IRS-2 量が減少す るという、一種のインスリン作用の自動スイッチオフのシステムを形成してい ると考えられる。ところが、肥満などのインスリン抵抗性の状態ではインスリ ン作用が低下しているにも関わらず、空腹時にも SREBP の発現が減少せず IRS-2 の上昇が起きないため、一層インスリン感受性の低下を招くという悪循環 に陥っている。 5-(4) TNFとインスリン抵抗性 TNFはマウスの腫瘍に対して出血性壊死を誘発させる因子として 1975 年に 単離され、1985 年にヒト TNF遺伝子がクローニングされた (8)。ヒト TNF は 233 アミノ酸残基から成る膜結合型の蛋白である TNF前駆体 (pro-TNF、 分子量 25 kDa) として産生されるが、C 末端側である細胞外ドメインが切断を 受けて分泌型 TNF (157 アミノ酸残基、分子量 17 kDa) へと成熟する。分泌 型 TNFは 51 kDa のホモ 3 量体を形成して血液中を循環する。TNFは活性化 されたマクロファージ、単球のみならず、T 細胞、Natural Killer 細胞、Kupffer 細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞といった様々な細胞から産生され る。TNFは細胞接着分子の発現やアポトーシスの誘導、炎症メディエーターや - 22 - 形質細胞による抗体産生を介して感染防御や抗腫瘍作用に寄与するが、過剰な 発現は関節リウマチに代表される自己免疫疾患や播種性血管内凝固症候群とい った様々な疾患・病態の発症・増悪を招く。 1993 年、Hotamisligil らにより TNFが直接的にインスリン抵抗性を惹起す ることが初めて報告された。肥満モデル動物では脂肪組織の TNF発現が上昇 しており、TNFの中和抗体はインスリン抵抗性を軽減させる (9)。ヒトにおい ても、インスリン抵抗性を有する肥満や糖尿病患者では脂肪組織での TNF発 現や血中濃度が上昇していることが報告されている (10,11)。TNFノックアウ トマウスは、高脂肪食負荷によるインスリン抵抗性が起こりにくい。また、肥 満モデルマウスである ob/ob マウスに対し、2 種の TNF受容体 (TNF-R; TNF-R1 および TNF-R2) 両者をノックアウト (TNF-R KO) するとインスリン 抵抗性が軽減する (12)。その一方で、高脂肪食あるいは高脂肪・高ショ糖食を 負荷した TNF-R KO マウスでは、逆にインスリン抵抗性が悪化している (13,14)。 特に 2009 年の Pamir らの報告では、高脂肪・高ショ糖食負荷において TNF-R KO マウスは野生型よりも肥満を呈し、二次的なインスリン抵抗性が惹起される ことから、TNF-R は肥満によるインスリン抵抗性には必須ではなく、肥満を抑 制するという生理的役割を持つと考察している (14)。これらの報告は、TNF とインスリン抵抗性の関与を示すと同時に、肥満やインスリン抵抗性における TNFシグナルあるいはインスリン抵抗性そのものの複雑性を物語っている。 TNFがインスリン抵抗性を引き起こす機序としては、遊離脂肪酸の上昇 (12,15,16)、GLUT4 発現低下 (12,17,18)、IRS-1 発現低下 (18)、peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)の発現低下・機能障害 (16,19)、IRS-1 のセリンリン酸化 (20,21) などが提唱されている。 - 23 - 5-(5) 慢性炎症とインスリン抵抗性 メタボリックシンドロームは内臓脂肪蓄積を基盤とし、高血糖、高血圧、脂 質異常症という各病態を構成要素とする症候群として理解されている (22)。メ タボリックシンドロームの基盤病態として全身の慢性炎症が注目されている。 肥満の脂肪組織では、脂肪細胞の肥大化のみならず脂肪組織へのマクロファー ジ浸潤が起こり、慢性炎症状態となっている (23)。また、このような過栄養状 態では脂肪肝を引き起こし、さらに炎症細胞の浸潤が起ると non-alcholic steatohepatitis (NASH)へと進行する。このように、肥満は脂肪組織や肝臓にお ける炎症とみなすことができる。 炎症性サイトカインが産生されると、細胞内ではセリン・スレオニンキナー ゼカスケードが活性化され、IRS-1 や IRS-2 の IR との相互作用部位に位置する セリンリン酸化が起こる。前述のように、IR および IRS がセリンリン酸化を受 けると、受容体と基質との相互作用が低下し、インスリン抵抗性が発現すると 考えられる。 肥満により脂肪組織の炎症が誘導される機序として細胞内ストレス仮説が提 唱されている。すなわち、過食などで過剰な脂肪酸やグルコースが流入すると、 脂肪細胞がこれを処理する過程で細胞内に小胞体ストレスや酸化ストレスが誘 導 さ れ 、 そ の 結 果 、 JNK 経 路 や IKK/ nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-B) 経路が活性化される ためと考えられている。また、肥満で増加した FFA も toll-like receptor 4 (TLR4) を介して炎症性経路を活性化する。このような炎症性カスケードにより、脂肪 細胞から monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)などのケモカインが分 泌され、単球走化性作用により、血中から脂肪組織へと単球を中心とした炎症 細胞が誘導され、成熟マクロファージへと分化しているものと推測されている。 - 24 - 脂肪組織で活性化されたマクロファージは更に TNF、IL-1、IL-6 といったサ イトカインや MCP-1 を中心とするケモカインを活発に放出し、脂肪組織への更 なる炎症細胞の浸潤を促進する (24,25) (図 7)。 図 7 肥満における脂肪組織の慢性炎症モデル 肥満に伴い、脂肪細胞の肥大化が起こると、脂肪細胞あるいは前脂肪細胞から MCP-1 や TNFといったケモカインやサイトカインが分泌される。それに引き 続き脂肪組織への単球の遊走とマクロファージへの分化が起こり、マクロファ ージは更に MCP-1 などのケモカインや TNF、IL-6 などのサイトカインを放 出し、脂肪組織への更なる単球の誘導を引き起こす。 5-(6) 内臓脂肪蓄積とインスリン抵抗性 脂肪組織での中性脂肪から FFA への分解はインスリンによって抑制されてい るが、内臓脂肪が蓄積するとインスリン抵抗性となり、その抑制が十分にかか らず、中性脂肪の FFA への分解が増大する。内臓脂肪組織から産生された大量 の遊離脂肪酸は門脈を介し肝へ流入し、肝細胞に取り込まれ、脂肪肝を引き起 - 25 - こす。 脂肪肝では食後の肝糖取り込み率が低下し、更に空腹時の肝糖放出率が増加 するため、体循環への糖流出が増加する。これは再び膵細胞からのインスリン 分泌を促し、さらなる内臓脂肪の蓄積や肝における脂肪蓄積が促進され、イン スリン抵抗性を増大させるという悪循環を招く (図 8)。 過栄養 運動不足 内臓脂肪の蓄積 ブドウ糖流入過多 遊離脂肪酸↑ インスリン分泌亢進 肝における 脂肪蓄積 肝糖取り込み率↓ 食後高血糖 肝糖放出率↑ 空腹時高血糖 図 8 内臓脂肪蓄積によるインスリン抵抗性 脂肪肝では糖取り込みが減少し、血糖上昇によりインスリン分泌が亢進するた め、さらなる内臓脂肪や肝における脂肪蓄積を助長する。 5-(7) TNF converting enzyme (TACE) 824 アミノ酸残基から成るヒト TACE は、1997 年に細胞膜から TNFを放出 させる酵素として 2 つのグループによってクローニングされた (26,27)。TACE は A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) family に属し、ADAM17 と も呼ばれる。 ADAM family は、matrix metalloproteinase (MMP)、membrane type MMP (MTMMP)、a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) および snake venom metalloproteinase (SVMP) といった他の metalloproteinase と 相 同 性 の あ る ド メ イ ン 構 造 (prodomain お よ び - 26 - metalloproteinase domain) を有する (図 9) (28)。prodomain は活性を負に制 御し、metalloproteinase domain は活性部位である。不活性型の MMP は、 prodomain のシステイン残基から伸びるチオール基と、活性中心の亜鉛イオン との静電気的結合により、prodomain と metalloproteinase domain が分子内で 複合体を形成している。この静電気的結合が外れて活性中心が表面に露出する ことで MMP は活性型となる。この制御機構は cysteine switch と呼ばれている (29)。TACE も cysteine switch によって活性が制御されていると考えられてい る(図 10)。 図 9 ADAM、MMP、SVMP および ADAMTS の構造 (文献(28)より抜粋) ADAM、MMP、SVMP および ADAMTS は、活性を負に制御する prodomain および活性部位である metalloproteinase domain という共通の構造を持つ。 - 27 - (A) 図 10 (B) TACE のドメイン構造と cystein switch による TACE の活性制御 (A) prodomain のシステイン残基から伸びるチオール基と、活性中心の亜鉛イオ ンとの静電気的結合により、prodomain と metalloproteinase domain が分子内 で複合体を形成することで TACE の活性は抑制されている。(B) prodomain が 切断を受け、活性中心との静電気的結合が外れることで、活性中心が表面に露 出すると TACE は活性型となる。 5-(7)-(A) TNF前駆体の切断・成熟 TNFの分泌機構 前述のように、TACE の活性は cysteine switch によって制御されていると考 えられている。まず、TACE は不活性型の蛋白として翻訳される。不活性型の TACE は、小胞体からゴルジへと移行する間に糖鎖修飾を受け、ゴルジ内の furin というプロテアーゼによって N 末端側の prodomain が切断されることで活性型 となる。この過程は protein kinase C (PKC)や mitogen-activated protein kinase (MAPK)シグナルなどにより促進される(図 11A) (30–33)。活性型となっ た TACE は細胞膜へと移行し、pro-TNFの細胞外ドメイン (Ala 76-Val 77) を 切断して成熟 TNFを放出させる。放出された TNFは細胞膜上の TNF - 28 - receptor に結合し、細胞内シグナルが伝達される(図 11B)。 図 11 TACE の構造、活性化および TNF放出 (A) 不活性型の TACE は、prodomain と metalloproteinase domain が分子内で 複合体を形成している。PKC や MAPK シグナルなどにより、furin による prodomain の切断および細胞膜へ移行が促進され、TACE は活性型となる。 (B) 活性型の TACE は pro-TNFの細胞外ドメインを切断し、成熟 TNFを放 出する。放出された TNFは細胞膜上の TNF receptor に結合し、細胞内シグナ ルが伝達される。 - 29 - 5-(7)-(B) TACE 活性の制御因子 TACE は pro-TNF だ け で な く 、 amyloid precursor protein (APP) や epidermal growth factor receptor (EGFR) ligands、IL-6 receptor などの様々 な膜蛋白を基質として切断することが分かっている (28)。 異 な る 細 胞 や 組 織 、 あ る い は 環 境 下 に お い て 、 PKC や p38 MAPK 、 extracellular signal-regulated kinase (ERK)などの経路が TACE 活性化を誘導 する他、活性酸素種 (reactive oxygen species; ROS)や小胞体ストレスなどによ る TACE 活性化が報告されている (34)。 また、tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (TIMP3)は、TACE の活性ドメ インと直接結合して TACE 活性を阻害する (35,36)。TIMP は分子量 2～3 万の 蛋白質で、MMP や ADAM family と直接結合してそれらの活性を抑制する分子 であり、哺乳類では TIMP1 から TIMP4 の 4 種類が報告されている。ほとんど の MMP は、4 種類の TIMP いずれとも結合する。一方、ADAM と TIMP の結 合は特異性が高く、ADAM の種類によって結合する TIMP の種類が異なり、4 種の TIMP いずれとも結合しない ADAM も存在する。ADAM family に属する TACE は、4 種類の TIMP のうち TIMP3 とのみ結合する。 5-(7)-(C) TACE の免疫における役割 Rhomboid family member (RHBDF) はロンボイドプロテアーゼ・ファミリ ーであり、膜内プロテアーゼの一つである。ロンボイドプロテアーゼは、原核 生物から真核生物までの広い範囲の生物種に分布し、その役割は多様で生物種 ごとに異なる。2007 年、新しい小胞体 (endoplasmic reticulum; ER) 蛋白であ る inactive rhomboid (iRhom)が同定された (37)。iRhom はプロテアーゼ活性 を持たない rhomboid-like family であり、ショウジョウバエの iRhom は ER 内 で epidermal growth factor (EGF) ligands に 作 用 し 、 ER-associated - 30 - degradation (ERAD) へと導くことが分かった (38)。哺乳類では iRhom1 と iRhom2 の 2 種類が同定されているが、それらの生理的役割は不明であった。 2012 年、iRhom2 ノックアウトマウスの解析により、iRhom2 は TACE と複 合体を形成し、TACE を小胞体からゴルジへ移行させる機能を持つことが証明 された (32,33)。iRhom2 ノックアウトマウスでは、TACE のゴルジへの移行お よびプロセシングが起きないため、TACE 活性が消失する。このマウスでは、 成熟 TNFの生成および血中への放出がほぼ消失し、lipopolysaccharide (LPS) の腹腔内投与によるショックに抵抗性を示す一方で、細菌感染に対して脆弱で ある。これらから、TACE は免疫応答や炎症反応の誘導において中心的な役割 を果たしていることが示唆される。 5-(7)-(D) TACE とインスリン抵抗性・耐糖能 TACE とインスリン抵抗性・耐糖能の関与についてはいくつかの報告がなさ れている。TACE 活性の阻害能を有する内因因子である TIMP3 のヘテロノック アウトマウスでは、TACE 活性が適切に抑制されず、過剰な TNFを介して血 管障害やインスリン抵抗性が促進される (39)。また、TACE 活性の阻害能を有 するメタロプロテアーゼ阻害薬の投与が耐糖能を改善することが報告されてい る (39–41)。さらに、TACE のヘテロノックアウトマウスやコンディショナル ノックアウトマウスでは、高脂肪食による肥満およびインスリン抵抗性発症が 抑制されることが示されている (42,43)。 これらの報告から、TACE はインスリン抵抗性に関与することが予想される が、TACE のノックアウトマウスの報告では肥満が抑制されたことによる二次 的なインスリン抵抗性改善の可能性もある。肥満や糖尿病の発症・進展におい て、TACE の制御機構や、TACE がどの臓器でどのような役割を担うかについ ては結論が得られていない。 - 31 - 5-(8) 肥満・2 型糖尿病モデル動物 肥満・2 型糖尿病モデルは、2 型糖尿病の発症や病態進展における生理、生化 学および病理学的変化を理解する上で重要な知見を与え、ひいては糖尿病治療 の発展にも大きく貢献している。 本節では、本研究に用いた肥満・2 型糖尿病モデル動物について述べる。 5-(8)-(A) KK マウス 埼玉県春日部地方で医学研究用実験動物として生産されていた K グループと 呼ばれるマウスのなかで、毛色遺伝子座の多形により生ずる様々な毛色変異を もとに沢山の近交系を育成したうちのアルビノ系が KK マウスである (44)。 1962 年、名古屋大学の中村三雄氏によって KK マウスが糖尿病を自然発症する ことが明らかとなった (45)。KK マウスの全個体が糖尿病を発症するわけでは ないが、遺伝的には糖尿病素因を持っており、餌の形状・組成・栄養価、週齢、 摂食量などの体重に影響を及ぼす因子が加わることで高血糖が顕在化すること が分かり、肥満が高血糖発症の一義的役割を果たしている (46,47)。 5-(8)-(B) KK-Ay マウス KK マウスの遺伝形質はポリジーンであり、多様な背景を発症要因とするヒト の 2 型糖尿病に類似性が高いが、前述のように全個体が糖尿病を発症するわけ ではない。KK マウスに肥満遺伝子 Ay を導入し、KK マウスより早期かつ重度 に肥満・高血糖を発現する 2 型糖尿病モデルとして改良されたのが KK-Ay マウ スである。agouti 遺伝子座の優性突然変異遺伝子である Ay 遺伝子は、第 2 染色 体に位置し、肥満・高血糖、体毛色、ホモ致死といった多面性を持つ遺伝子で - 32 - ある (44,48)。 視床下部において、-MSH (melanocyte-stimulating hormone) はメラノコ ルチン 4 受容体 (MC4-R; melanocortin-4 receptor) を介して摂食を抑制する。 一方、agouti-related protein (AgRP) は MC4-R のアンタゴニストとして作用 し、摂食を亢進させる。agouti 蛋白は毛根のみに発現し、-MSH の作用を抑制 して毛色を黄色に決定するが、KK-Ay マウスでは視床下部において異所性に agouti 蛋白が発現しており、MC4-R を介して過食が惹起されると考えられてい る。 5-(8)-(C) 高脂肪・高ショ糖食負荷マウス 食事による肥満の研究において、高脂肪食を与えたマウスが用いられている。 正常マウスに高脂肪食を負荷すると、個体としての耐糖能悪化はそれほど認め ないものの、脂肪細胞の増加・肥大化、高インスリン血症、肝や脂肪組織での 脂質産生の低下、筋でのグルコース酸化障害、インスリン感受性の低下を認め る (49)。また、高脂肪・高ショ糖食を与えたマウスも肥満・糖尿病の研究に用 いられる。正常耐糖能の C57BL/6 マウスに高脂肪・高ショ糖食を与えると、単 純な高脂肪食に比べて高度に内臓脂肪の蓄積、高インスリン血症が促進される (50)。ヒトの現代社会における食生活を考慮すると、単純な高脂肪食よりも、高 脂肪・高ショ糖食のほうがヒトの肥満・2 型糖尿病の発症要因に類似性が高いと 考えられる。 - 33 - 5-(9) 本研究の目的 肥満は、糖尿病、高血圧および脂質異常症の共通した原因であり、肥満によ り肥大した脂肪細胞は、TNFや遊離脂肪酸などの様々な炎症惹起性因子を放出 する。TNFは様々な機序を介してインスリン抵抗性を惹起することが報告され ており、TACE を介した成熟 TNFの放出はインスリン抵抗性の惹起に重要で あると予想される。しかし、肥満および糖尿病状態における組織の TACE 活性 やその制御機構については未だ不詳な点が多い。これらを解明することは糖尿 病の発症機序あるいは新たな治療法について重要な知見を与えると考えられる。 また、肥満の根本的治療には摂食量および身体活動量の適正化が重要であるが、 カロリー制限が TACE に与える影響についても不明である。 そこで、本研究では肥満・糖尿病モデルのインスリン感受性組織における TACE 発現・活性の変化、制御機構について検討した。また、カロリー制限に よる肥満の是正が TACE 発現・活性に与える影響について解析した。 - 34 - 6. 実験方法 6-(1) 実験動物 動物実験は、熊本大学動物実験等に関する規則および動物実験資源局 (Institute of Laboratory Animal Resources：ILAR) ガイドラインに準じて行っ た。熊本大学生命資源研究・支援センターにて specific pathogen-free (SPF) の 環境下で、人工照明を 12 時間の明暗周期で管理し、水は不断給与できる環境と した。 実験動物は 5 週齢の雄の KK マウス、KK-Ay マウスおよび C57BL/6 マウス を購入し、後述の摂食への介入開始まで最低 1 週間以上、通常食餌 (CLEA Rodent Diet CE-2、カロリー比：炭水化物 59.1%、蛋白質 28.9%、脂質 12.0%、 日本クレア株式会社、東京) を不断給与できる環境で個別に飼育した。全てのマ ウスは日本クレア株式会社より購入した。 6-(2) 摂食への介入 6-(2)-(A) KK マウスおよび KK-Ay マウス 6 週齢の KK-Ay マウスを、自由摂食群 (ad libitum-feeding: Ay-AL) とカロ リー制限群 (caloric restriction: Ay-CR) に無作為に振り分けた。自由摂食群は、 通常食餌を不断給与できる環境にて個別に飼育した。カロリー制限群では、過 食による肥満および糖尿病を予防するため、通常食餌を 4 g/day (8 週齢の Ay-AL の約 60%) に制限して給与し、個別に飼育した。 Ay-AL の対照として、6 週齢の KK マウスを自由摂食群 (KK-AL) として通 常食餌を不断給与できる環境にて個別に飼育した。 - 35 - 以上の 3 群いずれにおいても、水は不断給与の環境にて飼育し、10 週齢まで の 4 週間飼育した後、後述の実験に用いた。 摂食への介入効果を判定するため、摂餌量、体重、解剖所見、HbA1c、16 時 間絶食後および再摂餌 3 時間後の血糖値について比較・検討を行った。血糖値 および HbA1c は尾静脈血を用いて測定した。血糖値は、グルテスト Neo (株式 会社三和化学研究所、愛知) を用いた FAD-GDH 酵素電極法にて測定した。 HbA1c は、DCA 2000 システム (シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティク ス株式会社、東京) を用いたラテックス免疫凝集阻害法にて測定した。 6-(2)-(B) C57BL/6 マウス 14 週齢の正常耐糖能モデル C57BL/6 マウスを、通常食群 (standard chow: B6-SC) と高脂肪・高ショ糖食群 (high-fat/high-sucrose diet: B6-HF/HS) に無 作為に振り分けた。 通常食群は、通常食餌を不断給与できる環境にて個別に飼育した。高脂肪・ 高ショ糖食群では、高脂肪・高ショ糖食 (F2HFHSD、ショ糖 20%含有、カロ リー比：炭水化物 28.3%、蛋白質 17.2%、脂質 54.5%、ケービーティーオリエ ンタル株式会社、佐賀) を不断給与できる環境にて個別に飼育した。 いずれの群においても、水は不断給与の環境にて飼育し、26 週齢までの 12 週間飼育した後、後述の実験に用いた。 高脂肪・高ショ糖食負荷の効果を判定するため、体重、HbA1c、16 時間絶食 後および再摂餌 3 時間後の血糖値について比較・検討を行った。 6-(3) マウスへの薬剤投与 - 36 - 6-(3)-(A) マウスへの TNFの投与 Recombinant mouse TNF (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) を phosphate-buffered saline (PBS) に溶解後、通常食餌を自由摂食させた 10 週 齢の KK マウスに対し、臓器摘出の 24 時間および 8 時間前に 100 g/kg にて腹 腔内投与した。対照群には、vehicle として PBS を同様に腹腔内投与した。 6-(3)-(B) JNK 阻害剤の投与 JNK 阻害剤 SP600125 (Calbiochem, San Diego, CA) を 40% polyethylene glycol (PEG)/PBS に溶解後、通常食餌を自由摂食させた 10 週齢の KK-Ay マウ スに対し、臓器摘出の 24 時間および 8 時間前に 30 mg/kg にて腹腔内投与した。 対照群には、vehicle として 40% PEG/PBS を同様に腹腔内投与した。 6-(4) 臓器サンプルの TACE 活性測定 TACE 活性は、蛍光共鳴エネルギー移動 (Fluorescence resonance energy transfer; FRET) を応用した SensoLyteTM 520 TACE Activity Assay Kit (AnaSpec, San Jose, CA) を使用し、添付文書に従って測定した。 TACE によって認識・切断されるペプチド配列を有する QXLTM520/5-FAM FRET peptide を基質として用いており、切断されていない基質ではドナーであ る 5-FAM とアクセプターである QXLTM520 が近接している。この状態では 5-FAM が励起されても FRET により励起エネルギーが QXLTM520 に移動する ため、5-FAM からの蛍光放射は抑制されている。 TACE により基質である FRET peptide が切断されると、5-FAM と QXLTM520 との距離が離れて FRET が生じ ず、5-FAM からの蛍光を検出できるようになるため、TACE 活性を定量的に測 定できる (図 12)。 - 37 - 6-(5)-(A) にて後述する方法と同様に臓器の蛋白溶解液を作製し、添付の Assay Buffer にて蛋白濃度 0.3 mg/ml に調整した蛋白溶解液と、調整した QXLTM520/5-FAM FRET peptide 溶液を 96-well microplate にて 50 l ずつ混 合、37°C で 60 分間反応させた後、fluorescence microplate reader (Fluoroskan Ascent FL; Thermo Fisher Scientific Inc.) にて測定した。 図 12 FRET を応用した TACE 活性測定原理 5-FAM が励起されても FRET により励起エネルギーが QXLTM520 に移動する ため、5-FAM からの蛍光放射は抑制されている。TACE により FRET peptide が切断されると、5-FAM と QXLTM520 との距離が離れて FRET が起こらなく なり、5-FAM からの蛍光を検出できるようになる。 6-(5) ウェスタンブロット法による蛋白発現の解析 6-(5)-(A) 蛋白サンプルの調整 10 ml あたり 1 錠の cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) を加えた lysis buffer A (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM Na4P2O7・10H2O, 20 mM NaF, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 10 M PMSF, 1% Triton X, pH 7.4) を使用し、臓 - 38 - 器をホモジナイズ後、4°C、15,000 rpm、25 分間の遠心分離を施行し、上清を 蛋白溶解液として使用した。蛋白溶解液の蛋白濃度は、Coomasie brilliant blue (CBB) G250 を用いた Bradford 色素結合法 (Bio-Rad protein assay reagent, Bio-Rad, Hercules, CA) にて吸光度計を用いて測定した。 蛋白溶解液に適量の lysis buffer A および 5×sample buffer (250 mM Tris-HCl (pH8.8), 5% SDS, 50% sucrose, 250 mM dithiothreitol, bromophenol blue (BPB) にて色付け) を加え、最終蛋白濃度が 1 mg/ml になるように調整、 95°C で 5 分 間 処 理 し 、 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)用の蛋白サンプルとした。 6-(5)-(B) ウェスタンブロット法 サンプル毎に蛋白 30 g を用いて SDS-PAGE を行い、ニトロセルロース膜に 転写した。転写されたニトロセルロース膜を TBS-T (Tris buffered saline (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl) with 0.05% Tween-20) にて 5 分×3 回洗浄し、 5%スキムミルクを含む TBS-T にてブロッキング (室温、60 分)、一次抗体反応 (4°C、overnight)および二次抗体反応 (室温、60 分) を行った。一次抗体反応後 および二次抗体反応後には TBS-T にて 5 分×4 回洗浄を行った。その後、 chemiluminescent HRP substrate 溶液 (ImmobilonTM Western, Millipore, Billerica, MA) を反応させ、発光を Light Capture II (アトー株式会社、東京) に て撮影した。定量は NIH image analyser にて解析を行った。以下に、用いた一 次抗体および二次抗体を示す。 一次抗体 TACE (H-300) antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) Antibody (Cell Signaling Technology, - 39 - Beverly, MA) Phospho-p38 MAP Kinase (Thr180/Tyr182) Antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) Phospho-p44/42(ERK1/2) (Thr202/Tyr204) Antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) Anti--Tubulin Antibody (Upstate (Millipore), Billerica, MA). 二次抗体 goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) goat anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 6-(6) 定量的リアルタイム PCR 法による mRNA 発現の解析 組織片 100 mg あたり 1 ml の Sepasol®-RNA I Super G (27%フェノール含有、 ナカライテスク株式会社、京都) にてホモジナイズ後、1.5 ml チューブに移し、 室温にて 5 分静置した。クロロホルムを 200 l 加えて十分混和し、2~3 分間室 温にて静置、4°C、15,000 rpm にて 15 分間遠心分離し、上層の水層を別の 1.5 ml チューブに移した。500 l のイソプロパノールを加えて十分混和し、室温に 10 分間静置、4°C、15,000 rpm にて 10 分間遠心分離することで RNA をペレット 化した。上清を取り除いた後、1 ml の 75%エタノールと置換し、4°C、15,000 rpm にて 5 分間遠心分離して RNA を再度ペレット化した。上清を取り除きペレット を軽く風乾した後、dd H2O に溶解し、分光測定法で RNA 濃度を測定した。 ReverTra Ace® qPCR RT Kit (東洋紡株式会社、大阪) を用いた逆転写反応によ り、1 g の total RNA から cDNA を合成した。 合成された cDNA と LightCycler® FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) を用いてリアルタイム PCR を行い、 - 40 - mRNA 発現量を定量した。内部コントロールとして 18S ribosomal RNA を定 量し、各々の mRNA 量を補正した。以下に使用したプライマーを示す。 18S (fwd) 5’-AGTCCCTGCCCTTTGTACACA-3’ 18S (rev) 5’-CGATCCGAGGGCCTCACTA-3’ TACE (fwd) 5’-GTACGTCGATGCAGAGCAAA-3’ TACE (rev) 5’-AAACCAGAACAGACCCAACG-3’ TIMP3 (fwd) 5’-AAACATCTGCCTGGGTTCAG-3’ TIMP3 (fwd) 5’-CAAGCTTCCAGCCAAACTTC-3’ TNF (fwd) 5’-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3’ TNF (rev) 5’-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3’ 6-(7) 血中および細胞膜の TNF濃度測定 血中および細胞膜の TNF濃度は、マウス TNFを特異的に認識するモノク ローナル抗体を用いた enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 法にて 測定した。TNF- Mouse ELISA Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) を使用し、添 付文書に従って測定した。 細胞膜の精製には超遠心分離法を用いた (51)。臓器を Triton-X 不含の lysis buffer B (50 mM HEPES, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 10 M PMSF, pH 7.4) にてホモジナイズ、4°C、1,000 g で 10 分間遠 心し、核画分をペレット化した。その上清を超遠心分離(4°C 、100,000 g、60 分)し、細胞質画分である上清を取り除き、ペレットを 1% Triton-X 含有の lysis buffer A (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM Na4P2O7・10H2O, 20 mM - 41 - NaF, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 10 M PMSF, 1% Triton X, pH 7.4) にて懸濁して細胞膜のサンプルとした。サンプルの蛋白濃度を 0.1 mg/ml に調整して TNF濃度を測定、蛋白濃度で補正した。 6-(8) 統計学的解析 数値は平均値±標準偏差 (standard deviation; SD) にて表記した。3 群間以上 の比較には、一元配置分散分析法 (one-way analysis of variance; one-way ANOVA) にて検定した。2 群間の比較に関しては student’s t-test にて有意差を 検定した。いずれも p < 0.05 の際に統計学的に有意と判断した。 - 42 - 7. 実験結果 7-(1) 高脂肪・高ショ糖食餌による代謝パラメータへの影響 B6-SC B6-HF/HS 体重 (g) 摂餌介入前 23.8 ± 0.7 23.6 ± 0.6 摂餌介入後 28.3 ± 0.9 36.2 ± 0.8 * 摂餌介入前 4.1 ± 0.1 4.2 ± 0.2 摂餌介入後 4.2 ± 0.2 5.0 ± 0.2 * 摂餌介入前 65.4 ± 6.7 67.8 ± 摂餌介入後 76.8 ± 8.1 HbA1c (%) 空腹時血糖値 (mg/dl) 6.0 124.5 ± 10.8 * 食後血糖値 (mg/dl) 摂餌介入前 106.6 ± 11.3 105.2 ± 10.4 摂餌介入後 118.0 ± 10.3 181.8 ± 13.1 * 表 1 高脂肪・高ショ糖食餌による代謝パラメータへの影響 C57BL/6 マウス(B6)に通常食餌(SC)または高脂肪・高ショ糖食餌(HF/HS)を 12 週間給餌・飼育した後、各代謝パラメータを測定した。結果は平均値±標準偏差、 * P < 0.01 vs B6-SC。 正常耐糖能モデル C57BL/6 マウスへの高脂肪・高ショ糖食餌(HF/HS)負荷の 効果を検討した(表 1)。 摂餌介入前には、体重、HbA1c、空腹時および食後血糖値において 2 群間に 差を認めなかった。 飼育 12 週間後、通常食餌群(B6-SC)では、摂餌介入前と比較して体重の増加 のみを認め、HbA1c、空腹時および食後血糖値には変化を認めなかった。一方、 HF/HS を負荷した群(B6-HF/HS)では、摂餌介入前と比較して体重、HbA1c、 空腹時および食後血糖値の全てが有意に上昇した。 - 43 - 飼育 12 週間後の代謝パラメータを 2 群間で比較すると、B6-SC と比較して B6-HF/HS の体重、HbA1c、空腹時および食後血糖値の全てが有意に上昇した。 7-(2) カロリー制限による代謝パラメータへの影響 自由摂食の状態での KK マウス(KK-AL)の摂餌量は、観察期間を通じてほぼ 一定(4.8～4.9±0.1～0.2 g/day)であった。自由摂食の KK-Ay マウス(Ay-AL)で は、摂餌量が 5.6±0.3 g/day から 6.9±0.1 g/day まで増加した。観察期間を通 じて、Ay-AL では摂餌量が KK-AL よりも多かった (図 13A)。 体重については、4 週間の飼育後、KK-AL では 23.2±0.9 g から 32.0±1.1 g へ、Ay-AL では 29.6±0.7 g から 41.5±1.6 g へ増加した。観察期間を通じて、 Ay-AL では体重が KK-AL よりも大きかった (図 13B)。4 週間の飼育後、Ay-AL では KK-AL よりも多くの精巣周囲脂肪が蓄積していた(図 13C)。 図 13 カロリー制限による体重、内臓脂肪量への効果 自由摂食させた KK マウス(KK-AL)、KK-Ay マウス(Ay-AL)および摂餌量を 4 g/day に制限した KK-Ay マウス(Ay-CR)の摂餌量 (A)、および体重の推移(B)。 * P < 0.01 vs KK-AL、# P < 0.01 vs Ay-AL。 (次ページに続く) - 44 - 図 13 (前ページからの続き) 4 週間の摂食介入後の解剖所見(C)。 HbA1c および血糖値については、摂餌介入前、Ay-AL では KK-AL と比較し て空腹時および食後血糖値が上昇していたが、HbA1c に有意差は無かった。4 週間の飼育後、飼育前と比較して KK-AL では血糖値に有意な変化はなかったが、 Ay-AL では食後血糖値が有意に上昇した。KK-AL と比較して、Ay-AL では HbA1c、空腹時および食後血糖値の全てが有意に上昇した (表 2)。 過食による体重増加を是正するため、摂餌量を 4 g/day (8 週齢の Ay-AL の約 60%)に制限した KK-Ay マウス(Ay-CR)では、摂餌介入から 1 週間後には KK-AL と同等まで体重が減少し、以後も KK-AL と同等の体重で推移した (図 13B)。4 週間の摂餌介入後、Ay-CR の精巣周囲脂肪は Ay-AL と比較して少なく(図 13C)、 Ay-CR の HbA1c、空腹時および食後血糖値は Ay-AL と比較して有意に減少し、 KK-AL と同等であった (表 2)。 - 45 - KK-AL Ay-AL Ay-CR HbA1c (%) 摂餌介入前 3.9 ± 0.2 3.8 ± 0.1 3.9 ± 0.2 摂餌介入後 5.0 ± 0.1 7.6 ± 0.3 * 4.9 ± 0.1 # 摂餌介入前 67.8 ± 7.2 95.8 ± 5.7 * 94.5 ± 7.0 * 摂餌介入後 69.5 ± 6.0 98.0 ± 8.8 * 70.3 ± 5.7 # 空腹時血糖値 (mg/dl) 食後血糖値 (mg/dl) 摂餌介入前 138.2 ± 22.1 183.3 ± 48.9 * 178.8 ± 41.9 * 摂餌介入後 136.8 ± 19.5 392.0 ± 50.1 * 123.3 ± 10.8 # 表 2 カロリー制限による代謝パラメータへの影響 自由摂食させた KK マウス(KK-AL)、KK-Ay マウス(Ay-AL)および摂餌量を 4 g/day に制限した KK-Ay マウス(Ay-CR)を 4 週間飼育し、HbA1c および血糖値 を測定した。結果は平均値±標準偏差、* P < 0.01 vs KK-AL、# P < 0.01 vs Ay-AL。 7-(3) 高脂肪・高ショ糖食およびカロリー制限の TACE 活性への影響 肥満・糖尿病状態における肝、骨格筋および内臓脂肪組織(visceral adipose tissue; VAT)の TACE 活性を測定した。高脂肪・高ショ糖食負荷の C57BL/6 マ ウス(B6-HF/HS)では、通常食群(B6-SC)と比較して、VAT の TACE 活性が 2.7 倍に上昇した (図 14A)。一方、肝および骨格筋では TACE 活性に有意な変化を 認めなかった。 次に、肥満・糖尿病モデル KK-Ay マウスについて TACE 活性を検討した。自 由摂食の KK-Ay マウス(Ay-AL)の VAT では、自由摂食の KK マウス(KK-AL)の VAT と比較して TACE 活性が 3.3 倍に上昇した (図 14B)。B6-HF/HS での検討 と同様、肝および骨格筋では TACE 活性に有意な変化を認めなかった。 また、いずれのモデルにおいても、骨格筋では肝および VAT と比較して TACE 活性が低かった。 カロリー制限を行った KK-Ay マウス(Ay-CR)では、VAT の TACE 活性が - 46 - Ay-AL と比較して 62%減少した(図 14B)。この減少効果は肝および骨格筋のい ずれにおいても認めなかった。 図 14 肝、骨格筋および内臓脂肪組織の TACE 活性 (A) 12 週間、通常食餌(SC)または高脂肪・高ショ糖食餌(HF/HS)を与えた C57BL/6 マウス(B6-SC および B6-HF/HS)の TACE 活性。(B) 4 週間、通常食 餌を自由摂食させた KK マウス(KK-AL)、KK-Ay マウス(Ay-AL)および 4 g/day に摂食制限した KK-Ay マウス(Ay-CR)の TACE 活性。結果は平均値±標準偏差、 * P < 0.01。 7-(4) TACE および TIMP3 mRNA 発現 TACE 活性の制御機構を検討するため、肝、骨格筋および VAT の TACE mRNA 発現を検討した。高脂肪・高ショ糖食負荷マウス(B6-HF/HS)の VAT では、通 常食群(B6-SC)の VAT と比較して TACE mRNA 発現が 2.3 倍に上昇した。また、 B6-HF/HS の肝では、B6-SC の肝と比較して TACE mRNA 発現が 1.5 倍に上昇 した。骨格筋の TACE mRNA 発現には変化が無かった(図 15A)。 次に、肥満・糖尿病モデル KK-Ay マウスについて TACE mRNA 発現を検討 した。自由摂食の KK-Ay マウス(Ay-AL)の VAT では、自由摂食の KK マウス (KK-AL)の VAT と比較して TACE mRNA 発現が 2.4 倍高値であった。また、 - 47 - Ay-AL の肝では、KK-AL の肝と比較して TACE mRNA 発現が 2.0 倍高値であ った。B6-HF/HS での検討と同様に、骨格筋では TACE mRNA 発現に変化は無 かった(図 15B)。 カロリー制限を行った KK-Ay マウス(Ay-CR)では、VAT の TACE mRNA 発 現は Ay-AL と比較して 37%少なかった。この減少効果は肝および骨格筋では認 めなかった(図 15B)。 図 15 TACE および TIMP3 mRNA 発現 (A) 12 週間、通常食餌(SC)または高脂肪・高ショ糖食餌(HF/HS)を与えた C57BL/6 マウス(B6-SC または B6-HF/HS)の TACE mRNA 発現。(B) 4 週間、 通常食餌を自由摂食させた KK マウス(KK-AL)、KK-Ay マウス(Ay-AL)および 4 g/day に摂食制限した KK-Ay マウス(Ay-CR)の TACE mRNA 発現。(C) KK-AL、 Ay-AL および Ay-CR の VAT における TIMP3 mRNA 発現。結果は平均値±標準 偏差、* P < 0.05。 - 48 - さらに、VAT において、TACE 活性の阻害能を有する内因因子である TIMP3 の mRNA 発現を検討した。Ay-AL の VAT では、KK-AL と比較して TIMP3 mRNA 発現が 47%少なかった。カロリー制限を行った KK-Ay マウス(Ay-CR) では、Ay-AL と比較して 2.6 倍高値であった(図 15C)。 7-(5) 肝、骨格筋および内臓脂肪組織の TACE 蛋白発現 TACE 蛋白の発現を KK-AL、Ay-AL および Ay-CR の各臓器で比較検討した。 Ay-AL の VAT では、proform (135 kDa)と mature form (95 kDa)の 2 つのバン ドが検出された。VAT と比較して、肝の TACE 蛋白の発現は少なく、骨格筋に おいては TACE 蛋白のバンドが検出されなかった (図 16A)。 肝において KK-AL、Ay-AL および Ay-CR の TACE 蛋白を比較すると、いず れの群においても有意差を認めなかった (図 16B, C)。 図 16 肝、骨格筋および内臓脂肪組織の TACE 蛋白発現 (A) Ay-AL の肝、骨格筋および VAT の TACE 蛋白発現。 (B and C) KK-AL、Ay-AL および Ay-CR の肝における TACE 蛋白発現(B)、および定量結果(C)。 (次ページに続く) - 49 - 図 16 (前ページからの続き) (D and E) 骨格筋の蛋白 200 µg を抗 TACE 抗体を用いて免疫沈降を行い、 TACE にてブロット(D)、および定量結果(E)。結果は平均値±標準偏差、* P < 0.05。 図 16A で示したように、30 µg の蛋白サンプルを用いたウェスタンブロット では骨格筋の TACE 蛋白のバンドが検出されなかったため、200 µg の骨格筋の 蛋白を抗 TACE 抗体を用いて免疫沈降を行い、TACE 蛋白を濃縮した後にウェ スタンブロットを行った。その結果、骨格筋での TACE 蛋白は肝および VAT と は分子量が異なること(proform; 110 kDa、mature form; 90 kDa)、marure form の方が強く検出されること、KK-AL、Ay-AL および Ay-CR の 3 群間において TACE 蛋白発現量に有意差を認めないことが判明した (図 16D, E)。 7-(6) 内臓脂肪組織における TACE 発現およびストレスキナーゼ TACE 活性および発現は、VAT における変化が顕著であったことから、VAT における TACE 活性・発現の制御機構についてさらに検討を行った。 KK-AL と比較し、Ay-AL の VAT では TACE 蛋白が高発現であった (proform: 2.1 倍、mature form: 9.8 倍)。一方、Ay-CR では Ay-AL と比較して proform は 21%、mature form は 67%発現が少なかった (図 17A, B)。 次に、ストレスキナーゼである JNK、p38 MAPK および ERK について検討 - 50 - した。KK-AL と比較し、Ay-AL では JNK のリン酸化が 1.9 倍、p38 MAPK の リン酸化が 2.2 倍高値であった。一方、Ay-CR では、Ay-AL と比較して JNK の リン酸化は 51%、p38 MAPK のリン酸化は 30%少なかった。ERK のリン酸化 については有意差を認めなかった(図 17A, B)。 高脂肪・高ショ糖食を負荷した C57BL/6 マウス(B6-HF/HS)においてもほぼ 同様の結果を得た。通常食群(B6-SC)と比較して、B6-HF/HS では TACE 蛋白 が高発現(proform: 2.6 倍、mature form: 3.2 倍)し、JNK のリン酸化が 2.7 倍、 p38 MAPK のリン酸化が 2.8 倍高く、ERK のリン酸化は有意差を認めなかった (図 18A, B)。 図 17 カロリー制限による TACE 発現およびストレスキナーゼへの影響 KK-AL、Ay-AL および Ay-CR の VAT における TACE 蛋白発現、JNK、p38 MAPK および ERK のリン酸化(A)、および定量結果(B)。結果は平均値±標準偏 差、* P < 0.05。 - 51 - 図 18 高脂肪・高ショ糖食による TACE 発現およびストレスキナーゼへの影響 B6-SC および B6-HF/HS の VAT における TACE 蛋白発現、JNK、p38 MAPK および ERK のリン酸化(A)、および定量結果(B)。結果は平均値±標準偏差、* P < 0.05。 7-(7) 細胞膜上の pro-TNF切断と成熟 TNF放出 TACE による成熟 TNFの生成および血中への放出が、肥満・糖尿病状態ま たはカロリー制限によってどのように変化するかを検討した。 血中 TNF濃度は、Ay-AL では KK-AL の 2.4 倍高く、この上昇はカロリー制 限(Ay-CR)によって抑制された(図 19A)。 VAT における TNF mRNA 発現を検討すると、Ay-AL では KK-AL の 2.5 倍 高く、この上昇はカロリー制限(Ay-CR)によって抑制された (図 19B)。 一方、VAT の細胞膜上に存在する TNF蛋白を定量すると、KK-AL、Ay-AL および Ay-CR のいずれの群においても有意差を認めなかった (図 19C)。 - 52 - 図 19 カロリー制限による TNF放出への影響 (A) KK-AL、Ay-AL および Ay-CR における血中 TNF濃度。(B) VAT の TNF mRNA 発現。(C) VAT の細胞膜中の TNF量を定量し、総蛋白量で補正。結果 は平均値±標準偏差、* P < 0.05。 以上の結果より、Ay-AL の VAT における TNF発現は KK-AL と比較して上 昇しているにも関わらず、細胞膜上には KK-AL と同等の TNFしか存在してい ない理由は、肥満・糖尿病状態によって TACE が活性化され、細胞膜上の TNF が TACE により速やかに切断を受けて血中へと放出されるためと考えられた。 一方、カロリー制限によって VAT における TNF発現が Ay-AL と比較して抑 制されたにも関わらず、細胞膜上には Ay-AL と同等の TNFが存在する理由は、 カロリー制限によって TACE の活性が抑制され、TNFの細胞膜上から血中へ の放出が抑制されるためと考えられた。 - 53 - 7-(8) TNF投与による TACE 活性・発現への影響 口腔扁平上皮癌由来細胞株において、TNF刺激が TACE を活性化すること が報告されている (52)。脂肪組織や脂肪細胞において、TNFによって TACE が活性化されるのかは明らかとされていない。そこで、外来性に投与した TNF が in vivo 条件下にて TACE を活性化しうるかを検討した。 図 20 TNF投与による TACE 発現・活性、ストレスキナーゼへの影響 10 週齢の KK マウスに TNFまたは溶媒(vehicle)を腹腔内投与した。(A) VAT の TACE 活性。(B) VAT の TACE mRNA 発現。(C and D) TACE 蛋白発現、JNK、 p38 MAPK および ERK のリン酸化(C)、および定量結果(D)。結果は平均値±標 準偏差、*P < 0.05。 - 54 - TNFを腹腔内投与した KK マウスの VAT では、vehicle 投与群と比較して TACE 活性が 4.7 倍、TACE mRNA が 2.9 倍に上昇した(図 20A, B)。 VAT での TACE 蛋白発現、JNK、p38 MAPK および ERK のリン酸化を検討 すると、TNF投与により、TACE proform は 3.0 倍、mature form は 2.2 倍、 JNK のリン酸化は 2.6 倍、p38 MAPK のリン酸化は 2.2 倍に上昇した(図 20C, D)。 肥満・糖尿病モデルでの検討と同様に、ERK リン酸化には変化を認めなかった。 7-(9) JNK 阻害剤の TACE 活性・発現への影響 肥満・糖尿病モデルの VAT における JNK シグナルの亢進が、TACE 活性化 に寄与している可能性を検討するため、KK-Ay マウスに JNK 阻害薬 SP600125 (SP)を腹腔内投与した。 SP を腹腔内投与した KK-Ay マウスの VAT では、vehicle 投与群と比較して TACE 活性が 51%減少した (図 21A)。一方、TACE mRNA 発現には変化を認め なかった(図 21B)。 ウェスタンブロットにて VAT における JNK、p38 MAPK および ERK のリン 酸化を検討すると、SP 投与群では、vehicle 投与群と比較して JNK のリン酸化 が 41%減少し、p38 MAPK および ERK のリン酸化には有意な変化を認めなか った。さらに、TACE 蛋白発現については、proform には変化を認めないもの の、mature form の顕著な減少(82%)を認めた (図 9C, D)。 - 55 - 図 21 JNK 阻害剤による TACE 発現・活性、ストレスキナーゼへの影響 10 週齢の KK-Ay マウスに JNK 阻害剤 SP600125 (SP)または溶媒(vehicle)を腹 腔内投与した。(A) VAT の TACE 活性。(B) VAT の TACE mRNA 発現。(C and D) TACE 蛋白発現、JNK、p38 MAPK および ERK のリン酸化(C)、および定 量結果(D)。結果は平均値±標準偏差、*P < 0.05。 - 56 - 8. 考察 肥満・糖尿病モデルの VAT にて TACE 活性が増強、血中 TNF濃度が上昇し、 カロリー制限にて抑制された。一方、肝および骨格筋においては TACE 活性に 変化を認めなかった。さらに、TNFはストレス応答性シグナル、TACE 活性を 増強した。TACE 活性化により生成された成熟 TNFが、更なる TACE 活性化 を促すポジティブフィードバックの存在が示唆され、慢性炎症につながってい る可能性がある。カロリー制限は TACE 活性、ストレス応答性シグナルおよび TNF生成を効果的に阻害し、慢性炎症およびインスリン抵抗性の抑制に有用と 考えられた。 8-(1) TACE 発現と活性との関係 不活性型として生成された TACE (proform)は、小胞体からゴルジへと移行す る間に糖鎖修飾を受け、ゴルジ内の furin というプロテアーゼによって N 末端 側の prodomain が切断されることで活性型(mature form)となる (30–33)。 これと合致して、肥満・糖尿病モデル KK-Ay マウスの内 VAT では、TACE の mature form の発現上昇が大きく上昇し、高い TACE 活性を示した。カロリ ー制限は proform の蛋白発現も抑制するが、特に mature form の蛋白発現を大 きく減少させた結果、TACE 活性が抑制されたと考えられる。一方、proform 発 現に対するカロリー制限の影響は小さく、21%の減少にとどまった。カロリー 制限の TACE mRNA 発現への影響(37%の減少)と比較して、proform 発現への 影響は小さく、カロリー制限は TACE の proform から mature form への成熟を 阻害している可能性が高いと考えられた。Ay-AL において、mature form への 成熟が亢進している機序、カロリー制限により mature form への成熟が阻害さ - 57 - れる機序については、今後の検討が必要である。 KK-Ay マウスの肝においては、TACE mRNA 発現が上昇しているにも関わら ず、TACE 活性には反映されなかった。これは、肝の TACE mRNA および蛋白 発現量が VAT に比べて少ないこと、proform に比べて mature form の発現が少 ないことが関係する可能性がある。本研究では、肝での TIMP3 発現や活性につ いては未検討であり、今後解析を進める予定である。 骨格筋では、他臓器と同等の TACE mRNA 発現を認めるにも関わらず、通常 のウェスタンブロットでは検出できないほど蛋白発現量が少なく、これが TACE 活性の低さにつながっていると考えられた。臓器間で TACE mRNA 発現と蛋白 発現に乖離があることより、TACE 蛋白のプロセシング、修飾、分解などの蛋 白の翻訳後過程において骨格筋組織特異的な蛋白発現調節機序が存在すること が示唆された。 TACE 活性の阻害能を有する内因因子である TIMP3 の発現は、KK-Ay マウ スの VAT にて低下し、カロリー制限にて上昇していた。TACE 蛋白発現量が必 ずしも TACE 活性と比例しない理由は、TIMP3 の発現・活性を含めたさらなる 検討で明らかになるかもしれない。 JNK 阻害剤は、VAT の TACE mRNA 発現に影響することなく TACE 活性を 抑制した。また、TACE mature form の発現のみを強く抑制した。これは、JNK シグナルが TACE 発現のみならず、TACE 蛋白翻訳後のプロセシングおよび活 性化に関与することを示唆する。 8-(2) TACE 活性の臓器間の差異 肥満・糖尿病モデルあるいは高脂肪食負荷マウスの VAT における TACE 発 現・活性についての報告はいくつかある (51,53–55)。今回の検討では、肥満・ - 58 - 糖尿病状態によって TACE 活性が上昇したのは VAT のみで、肝および骨格筋に は変化が無かった。これは、既報とは異なる新しい知見である。 Xu らによると、12 週齢の肥満モデルマウス ob/ob マウスの VAT では、TACE mRNA 発現が上昇しているにも関わらず、TACE 活性は減少していた (51)。そ の一方、Fiorentino の報告では、正常耐糖能モデル C57BL/6 マウスに 20 週間 高脂肪食を与えると、肝、骨格筋および VAT いずれにおいても TACE 活性が上 昇するとある (55)。これらの報告と今回の検討に生じた違いの理由は明確では ないが、実験環境および方法、与えた餌(既報の高脂肪食に対し、今回は高脂肪・ 高ショ糖食)、マウスの種、飼育期間などの違いが影響しているかもしれない。 臓器間で異なる未知の TACE 制御機構が存在する可能性もあるので、さらなる 研究の蓄積が求められる。 しかしながら今回の検討では、肥満・糖尿病モデルである KK-Ay マウスと、 正常耐糖能の C57BL/6 マウスへの高脂肪・高ショ糖食負荷モデルの両方を用い て実験を行っており、両者ともに VAT のみで TACE 活性が上昇し、肝および骨 格筋では変化が無いという結果を得た。さらには、カロリー制限によって TACE 活性が減少したのも VAT のみであった。これは、VAT が TACE 活性化の誘導を 受けやすい臓器であることを強く示唆し、言い換えると、VAT では肥満・糖尿 病の発症・進展の早い段階から TACE 活性化が起こっていると考えられる。今 回の実験系において、肥満・糖尿病状態がさらに長い期間に及べば、VAT のみ ならず肝および骨格筋においても TACE 活性が上昇するかもしれない。 8-(3) TACE 活性化の誘導因子 TACE 活性化、膜蛋白の切断を誘導する因子として、ERK や p38 MAPK の 関与が報告されている (34,56–59)。近年、Xu らは、乳癌由来細胞において TACE - 59 - が細胞膜上で二量体として存在し、その状態では TIMP3 と結合して TACE 活 性が抑制されていると報告した。それによると、ERK や p38 MAPK シグナル は TACE を二量体から単量体へと変化させ、TIMP3 が解離することで TACE 活性が上昇する(36)。JNK と TACE の関与についてはほとんど報告が無いが、 Kenchappa らによると、交感神経ニューロンにおいて JNK は TACE の発現を 増強させる(60)。 今回、肥満・糖尿病状態の VAT にて JNK、p38 MAPK シグナルが上昇、こ れらの上昇がカロリー制限により抑制され、TACE 活性の変化と同様の変化を していることを示した。さらに、JNK 阻害薬の投与により TACE 活性が抑制さ れたことから、TACE 活性化に少なくとも一部は JNK が寄与することが示唆さ れた。今後、JNK や p38 MAPK を含めたストレスキナーゼの阻害実験やノッ クダウンにより、これらの分子が肥満・糖尿病状態の VAT においても TACE の 活性化に寄与するか、さらに検討する必要がある。 8-(4) 肥満・糖尿病における TACE の役割 肥満や糖尿病におけるインスリン抵抗性の基盤病態として、全身(特に VAT) の慢性炎症反応が注目されている。8-(2)で考察したように、VAT は TACE 活性 の誘導を受けやすい組織であることが示唆され、5-(7)-(C)で前述したように TACE が成熟 TNFの産生を介した炎症反応の誘導に中心的な役割を担ってい ることを合わせて考えると、肥満・糖尿病の発症・進展における VAT の炎症反 応およびインスリン抵抗性の惹起においても TACE が深く関与すると考えられ る。 さらに、今回、TNFの腹腔内投与がストレス応答性シグナルや、TACE 発現・ 活性化を誘導することを示した。TACE 活性化により生成された成熟 TNFは、 - 60 - さらなる TACE 活性化を促すというポジティブフィードバックが存在し、肥 満・糖尿病における慢性炎症反応の形成に大きく寄与している可能性がある。 8-(5) 今後の展望 肥満の脂肪組織では、成熟脂肪細胞の増殖・肥大化だけでなく、血管新生や 細胞外基質の増加、マクロファージの浸潤といった、脂肪組織リモデリングと もいうべき形態学的変化を認める。このような状態では、TNFや IL-6 といっ た炎症性サイトカインの産生が亢進し、アディポネクチンに代表される抗炎症 性サイトカインの産生が減少している (61)。リモデリングにおける細胞外基質 の分解には、様々なメタロプロテアーゼの関与が考えられる。 TACE は pro-TNFだけでなく、heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF)など、非常に多くの膜蛋白を基質として切断することが分かっている (28)。TACE ホモノックアウトマウスは、心肺発達障害や上皮組織成熟障害とい った HB-EGF のノックアウトマウスと似た表現型を示し、周産期致死である (62)。TACE のヘテロノックアウトマウスやコンディショナルノックアウトマウ スでは、高脂肪食による肥満が抑制されることが示されている (42,43)。これら の現象は、脂肪組織の増大やリモデリングにも TACE が関与することを示唆し ている。 このように、TACE は炎症反応惹起因子としてだけでなく、非常に多くの役 割を担っている可能性がある。また、TACE だけでなく他の様々なメタロプロ テアーゼが、肥満における脂肪組織のリモデリングや慢性炎症の形成に関与す るかもしれない。TACE を含めた様々なメタロプロテアーゼの酵素活性、細胞 外基質の分解能、基質の同定を検討することで、肥満・糖尿病の発症・進展に おける基盤病態にさらなる知見をもたらすと考える。 - 61 - 9. 結語 本研究は、肥満・糖尿病状態で VAT が TACE の発現・活性化の誘導を受けや すい組織である可能性を示した。また、カロリー制限は TACE 活性、ストレス 応答性シグナルおよび TNF生成を効果的に阻害し、慢性炎症およびインスリ ン抵抗性の抑制に有用と考えられた。 本研究の結果および、これまでに明らかとされている TACE 阻害剤の抗糖尿 病作用や TACE ノックアウトマウスの表現型を考え合わせると、TACE 活性化 や TACE 発現制御の分子生物学的機序を解明することで、インスリン抵抗性、 肥満、および糖尿病の新規治療法確立につながる可能性がある。 - 62 - 10. 参考文献 1. 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