水洗浄および塩化カルシウム洗浄したコイ筋原繊維の形態観察および生

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水洗浄および塩化カルシウム洗浄したコイ筋原繊維の形
態観察および生化学的性状の変化
飛嶋, 千尋; 猪上, 徳雄; 信濃, 晴雄
北海道大學水産學部研究彙報 = BULLETIN OF THE
FACULTY OF FISHERIES HOKKAIDO UNIVERSITY,
40(1): 72-81
1989-02
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http://hdl.handle.net/2115/24021
Right
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bulletin
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40(1)_P72-81.pdf
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Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP
北大水産禁報
4
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水洗浄および塩化カルシウム洗浄したコイ筋原繊維の
形態観察および生化学的性状の変化
飛嶋千尋*・猪上徳雄材・信濃晴雄帥
LightMicroscopicObservationandBiochemicalPropertiesof
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DistilledWaterand/orCaCh Solution
ChihiroTOBISHIMA
ぺNorioINOUE** andHaruoSHINANO料
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魚肉ねり製品製造における落し身の洗浄(水晒し)は脱色，脱脂，脱臭の目的で行われるが同時
に製品の弾力形成を阻害するとされている水溶性タンパク質を除去1)する重要な工程でもあり，
その結果塩溶性タンパク質が相対的に増量しケ、ル形成能が強くなることが知られている九この
ような洗浄が筋原繊維タンパク質の構成成分におよぼす影響についてはいくつかの報告がある。
今野 3) は筋原繊維(以下 Mfと略記)について低濃度緩衝液で 5
-6回洗浄すると Mfは脱感作され
ることをみている。また，大谷ら 4) は貝類の Mfについても脱感作されることおよびアクチンが損
失(流出)することを確認している。
水晒し液に塩化カルシウムを加えた塩化カルシウム溶液による洗浄(カルシウム晒し)は，製
品の品質(特に弾力増強)に関係することが知られている 5)。また，塩化カルシウムの筋原繊維タ
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本文中では以下の略語を使用した。 EGTA，E七h
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飛嶋ら: 筋原繊維の水又は C
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ンパク質に対する影響については最近 2
，3の報告m をみるが，水晒しとカルシウム晒しの順序な
どについてはまだ十分な検討が行われていない。そこで本研究ではコイ Mfを使用し，蒸留水によ
る洗浄(ねり製品製造工程中の晒しとは異なるので本報告では洗浄と呼ぶ)を反復した時に Mf
にどのような影響があるかについて検討し，その影響に対するカルシウム洗浄の関連性を明らか
にすることを目的とした。
実験方法
Mfの調製
コイ C
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oの新鮮肉(背筋)から前報 8) と同様の方法で調製した。
洗浄の方法
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6M KCl緩衝液 (
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.
1
6M KCl-40m M T
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.
5
) に懸濁した Mfを
20，
000xg，20分間遠心分離して得た“沈殿 Mf" を供試した。水洗浄:沈殿 Mfに対して沈殿量の
9倍量の冷蒸留水を加え 5分間撹鉾混合したのち， 20，
000xg，20分間遠心分離して得た沈殿 Mfを
1回目の水洗浄 Mfとした。 2回目以降は 6倍量の冷蒸留水を加えて同様に遠心分離を反復し， 2
4回目の各水洗浄 Mfを得た。なお 3回目および 4回目における Mfは遠心分離により上澄液を分
離し得ない程度の膨潤をおこしたので，この場合には終濃度が O.IMとなるように KClを添加し
，1
0分間の遠心
て沈殿 Mfを得た。それぞれの水洗浄 Mfは 0.16MKCl緩衝液を使用し， 6ooxg
分離によって 3回洗浄を行い，最終的に 0
.
1
6M KCl緩衝液に均質に懸濁し以下の各測定に供し
た。塩化カルシウム溶液による洗浄(以下 Ca洗浄と略記): 0.1% CaCl，水溶液 (pH7
.
0
7
.
2
)を
使用し，水洗浄のときと同様に遠心分離法によって洗浄した。なお，水洗浄と Ca洗浄との関連性
を検討するために以下に記述した 4種類の洗浄方法により得た試料を供試した。
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)
1
) Ca洗浄のみを行ったもの (Cn*
2
) C品洗浄後に水洗浄を行ったもの
(Cn-Hnキ2
)
3
) 水洗浄後に Ca洗浄を行ったもの
(Hn-Cn
)
4
) 2
)の Ca洗浄後に 0
.
1
6M KCl緩衝液で洗浄し，続いて水洗浄を行ったもの
(
Cn
-Kn*3_Hn)
ATPase活性の測定には最終洗浄後， Mfを 0.16MKCl緩衝液で遠心分離 (600X2，1
0分間)によ
り 3回洗浄したものを使用した。 Ca洗浄および 0.16MKCl緩衝液による洗浄には毎回 Mf沈殿容
0倍量の溶液を用いた。
積の 1
形態観察
Mf懸濁液 1滴をスライドガラス上にのせカパーガラスを使用し，ニコン S-Ke型位
00倍で観察した。
相差顕微鏡を用い 4
ATPase活性の測定
Mg-，Ca-，および EDTA-ATPase活性は前報 8) と同様の方法で測定した。
Ca感受性の測定は今野らの方法 9) に準じて行った。測定条件は 0
.
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.
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)，2m MMg
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0
)
CaC12または 2mM EGTAを加え， 25Cで反応を行い生成した無機リン酸を比色定量した 1
0
品-ATPase活性の 3
5Cにおける失活速度恒数 (
k
C，
D) は室塚ら 11) の方法によって算出した。失活
0
曲線の一次反応プロットが二つの直線からなるときは初期の速い失活およびその後の遅い失活に
ついて，失活速度恒数をそれぞれん 1，ん2 とした。
SDS・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
WeberandOsbornの 方 法 1
2
)お よ び 闘 の 方 法 1
3
)に
1 Ca洗浄を n 回行ったことを示す。
吃 水 洗 浄 を n回行ったことを示す。
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0% ポリアクリノレアミドケソレで行った。染色ゲ ノ
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シ卜メーター (
明日香工業)に よ り ト レ ー ス し そ の 全 面 積 に 対 す る 各 ハ ン ド の 相 対 面 積 を 求 め
て相対含量とした 141。
膨潤度
Mf懸濁液 (
8-9mg
/ml
)40mlを遠心分離 (
20，
000xg，
20分間 )し，沈殿 Mfの容積を
.
1% CaC
l2水溶液による洗浄処理を行い 20，
000xg，
20分
求めた。この沈殿 Mfを蒸留水あるいは 0
間の遠心分離後の沈降容積を担u
定し，洗浄処理前の容積に対する容積比を膨潤度とした。
タンパク質はヒウレット法およびミクロケノレダ
iノレ法により定量した。 Caの定量は Yanag
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awaの方法 151で行った。
結果と考察
洗浄による形態変化
調製後の Mfは図 1にみられるように明瞭な横紋構造を有するサノレコメ
-3回水洗浄をおこなった直後にそれぞれ顕微鏡観察す
アとして観察された。このような Mfを 1
ると， 1回目の洗浄後で既に Mfの横紋構造を認め得ない程度の不鮮明な映像となっていた。この
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筋原繊維の水又は CaC
l2溶液による洗浄
水洗浄後の Mfを再び 0
.
1
6M KCl緩衝液で遠心分離による洗浄を行うと Mfは離水収縮をおこす
が，図 2にみられるように横紋構造は消失したままで，一見して凝塊状を呈していた。
Mfを水洗浄した時に横紋構造が認められなくなることは前報 8) と同様に水和膨潤によると考
えられる。このことは 3回以上の遠心分離操作によって沈降しないことからも裏付けられた。前
.
1
6M KCl緩衝液に透析することにより正
報 8) で採用した透析による方法では，膨潤した Mfを 0
.
1
6M KCl緩衝
常な横紋構造を有する Mfに復元したが，本実験での遠心分離による水洗浄では 0
液で洗浄してももはや水洗浄前の正常な像には復元しなかった。この両者の相違は，透析法が比
較的温和な脱塩条件であるのに対して，本実験で採用した遠心分離によるパッチ式洗浄操作はき
わめて過激な条件で、あるためと考えている。
次に Ca洗浄との関連で観察した結果を図 3，4に示した。これらからも明らかなように Ca洗浄
)，Ca洗浄を 2回行った後，水洗浄を 5回繰り返え
のみを行っても形態的変化は認められず(図 3
したもの (
C2-H5) についても横紋構造は明瞭に認めることができ，特に変化は観察できなかった
(
図4
)。一方，図には示さなかったが，最初に水洗浄を 2回行い，その後 Ca洗浄を 3回反復した
Mf(H2-C3) では横紋構造を認めることができず，図 1と同様に凝塊像となった。
水洗浄および Ca洗浄による ATPase活性の変化
コイアグトミオシン州および Mf
引を低濃
度緩衝液で洗浄を繰り返えすと，それらは脱感作されることが既に報告されている。ここでは水
洗浄と Ca洗浄によって ATPase活性がどのように変化するのか，また Ca感受性にも影響するか
どうかについて検討した。図 5に水洗浄反復に伴う ATPase活性の変化を示した。 Ca-ATPase活
性 (60mMおよび 0.5M KCl存在下)は 1
3回にわたる洗浄によって変化は認められなかった。
Mg-ATPase活性も同様にほとんど変化はみられなかったが， 3回目の水洗浄で約 10%上昇する
こともあった。一方， EDTA-ATPωe活性は洗浄回数が増すにしたがって，比活性の増大すること
が認められた。これはミオシンとアクチンの結合の弱まった可能性 1引を支持する結果であった。
次に水洗浄と Ca洗浄の併用による変化について検討した。図 6に水洗浄と Ca洗浄の組み合わ
一一
せによる各種 ATPase活性値を示した。 Ca-ATPase活性 (60mMおよび 0.5MKCl存在下)はし、
ずれの洗浄処理によっても変化は認められなかった。 EDTA-ATPase活性は水洗浄により上昇し，
一//
この水洗浄処理によって一旦上昇した EDTA-ATPase活性は，その後の Ca洗浄によって元に戻
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らなかった (H2-C3)。一方， Ca洗浄のみをおこなった場合 (C3) および Ca洗浄後に水洗浄した場
合 (C2-H3) には EDTA-ATPase活性の上昇は認められなかった。また， Mg-ATPase活性は水洗浄
と Ca洗浄の組み合わせで 20-30%の上昇を認めた。
Mfの Ca感受性を比較した結果を表 1に示した。洗浄前に 75.5%であったものが水洗浄回数の
増加とともに徐々に低下し，水洗浄 4回目では 8.2%になり明らかに脱感作されたことを示した
(
表1
)。また表には示していないが Ca洗浄を先行した場合 (C2-H3) の Ca感受性は 56.6%であ
り，水洗浄を先行した場合 (H2-C3) は 25.9%で Ca洗浄を先行した時のほうが高い Ca感受性を
保持していた。
このように水洗浄の反復によってみられた EDTA-ATPase活性の上昇および Ca感受性の低下
減少傾向は， Ca洗浄を先に行うことによって抑制されることが明らかとなった。
3
.
41
洗浄による MfCa-ATPase活 性 の 熱 失 活 様 式 の 変 化 洗 浄 に よ り コ イ ミ オ シ ン B!7)や Mf
7
6
飛嶋ら: 筋原繊維の水又は C
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こでは水洗浄あるいは Ca洗浄処理した Mfを用いて 35C における Ca-ATPase活性の熱失活曲
線から検討した。図 7に失活曲線の一次反応プロットを示した。洗浄前の Mfは一次反応式に従う
単一直線で示され，その失活速度恒数(ん)は 8
.
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-5S-1 であった。一方，水洗浄 3回後のも
のでは最初に速やかで，次いで緩やかな失活を示し，いずれも一次反応式に従う直線で表わすこ
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このことは水洗浄の反復によってミオシンと結合しているアクチン量が相対的に減少した可能性
を示すもので従来の報告叫に照らし合わせて考えるとアクチンの流出を強く支持する結果であっ
)はコイ Mfを 2m M T
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8・
maleate緩衝液 (pH7
.
5
) で洗浄する実験において Caた。大谷ら 4
ATPωeの 35"Cにおける熱失活によってアグチンの流出を確認していないが，本実験の蒸留水に
よる洗浄では明らかに 2段階の変性様式を示した。このような違いがみられた原因として，洗浄
に用いた溶液の違い(緩衝液と蒸留水)および筋原繊維調製法の違い(本実験では Tritonx100
を使用しており，さらに洗浄回数も多 L、)にあるのではなし、かと考えている。
水洗浄と Ca洗浄を組み合わせた時の 35"Cでの失活速度恒数
(
k
) を表 2
D あ る い は ん l と ん2
に示した。洗浄前 (Ho) および Ca洗浄を先行した Mf(C2
-H，
と C2
-H2
)では単一直線で示され
る一次反応式に従って失活した。これに対して水洗浄のみ (H2) および Ca洗浄に先だって水洗
浄を行った Mf(H2
-C，
と H2
-C2
)では速やかな失活とそれに続く緩やかな失活を示し，それぞれ
一次反応式に従う 2段階の失活様式で表わされた。このように水洗浄を先行した時には 2段階で
失活が進行することから，前述したようにアクチンの流出を支持する結果が得られ， Ca洗浄を先
行した場合には，アクチンの流出に対して抑制的に作用していることが示された。
水 洗 浄 Mfの SDS・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
水洗浄前および 3回水洗浄を行った
Mfについて SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い，そのトレース図より Mfの各構成タ
ンパク質の組成比を求めたのが表 3である。
トロポミオシンおよびトロポニンの調節系タンパク
質区分の損失は 64-67%と大きい値を示し，またアクチン区分が約 28%の損失を示した。大谷
A
c
) とミオシン重鎖
ら叫が Mfか ら ア ク チ ン 損 失 を 知 る た め の 指 標 と し て 用 い た ア ク チ ン (
(HC) の比 (AcjHC) を求めたところ，水洗浄前後で 0.
43から 0
.
3
2に低下していた。水洗浄によ
る同様の実験を 4回繰り返えして行ったが，同様の結果が得られた。このように Ca感受性の低下
や Ca-ATPωe活性の熱失活様式の変化から推測した調節系タンパク質やアクチンの損失を SDSポリアクリノレアミドゲ、ノレ電気泳動によっても確認することができた。
膨潤度およびタンパク質の溶出
Mfを蒸留水で透析した時に著しい水和膨潤をおこすことを
-78-
飛嶋ら: 筋原繊維の水又は CaCl2溶液による洗浄
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前報 BIで報告した。ここでは水洗浄と Oa洗浄との組み合わせによる膨潤度の変化について検討す
るとともに遠心分離後の上澄液に溶出するタンパク質も定量した。膨潤度の測定結果を表 Hこ示
した。洗浄処理前の Mfの膨潤度 1に対して，水洗浄 2回目では約 7の膨潤度を示した。水洗浄 2
回に続いて Oa洗浄を行うと (H2-02)，膨潤度は 1以下となった。 C品洗浄後の膨潤度が 1以下に
なるのは，従来から知られているように離水を促進するため lBI (保水力が低下するため 1吋 で あ
ると考えている。これに対して Oa洗浄を先行すると (
0
2
-H5
)，膨潤度は少し低下し， 5回反復し
ても約 3
.
7で、水洗浄のみの時のような著しい膨潤は認められなかった。しかし， Oa洗浄後に 0
.
1
6
-H3
)
，膨潤性は回復し 2
M KCJ-Tris• HOl (pH7
.
5
) で 3回洗浄してから水洗浄を行うと (02-K3
回目の水洗浄で膨潤度は約 7を示した。 3回目の水洗浄では水洗浄のみのときのように著しく水
和膨潤し，遠心分離によって沈殿区分は認められなかった。水洗浄による膨潤は Oa洗浄を先に行
うことによって抑制することができ，このことは形態観察の項で述べた横紋構造を保持していた
結果とよく対応するものであった。
膨潤度測定の時と同様の処理を行い，その時の遠心分離上澄液に溶出するタンパク質量を定量
したところ(表には示していなし、)， H2
-02で 5.89%，O2
-H2で 1
.59%，O2
-K3
H2で 5.80%であっ
た
。 H2
-02と 02-K3
-H2においてタンパク質溶出量の 82-92%は第 2回目の水洗浄時に溶出した。
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このことは膨潤度の結果ともよく対応していた。そして熱失活様式の変化および SDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を考え併わせると，膨潤をおこす程度にまで達した Mfはタンパク
質の一部を溶出し易い状態にあることを示唆している。
カルシウム量の変化
次 に Caの量的変化について検討した結果を表 5に 示 し た 。 水 洗 浄 で は
Caが除去され難く，低イオン強度の溶液で容易に除去されることがわかる。この結果に基づき前
項で示した膨潤度について考えてみると， Ca洗浄後の水洗浄で著しい膨潤が認められなかったの
は Caが残存するためであり，また Ca洗浄と水洗浄の聞に低イオン強度の溶液で洗浄すると Ca
は除かれ，
したがって Mfは膨潤し易くなったためで、あることがうまく説明できる。
福見 191 は脱イオン水を用い，スケトウダラ肉を洗浄した時. Ca溶出量の少ないことを報告して
おり，さらに 0.1%食塩水を用いて洗浄した場合 20) Caと Mgは効果的に溶出することをみてい
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は 3C において子牛肉から 0-3.7%の食塩水によって溶出される Ca量
る
。 BermanandSwift
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を定量し，塩濃度の高いほうが Ca溶出量の多いことを報告している。このような生体中に存在す
る Caと 本 実 験 の よ う に あ と か ら 添 加 に よ っ て タ ン パ ク 質 表 面 に 静 電 的 に 結 合 し た Ca221 とを同
一視することには無理があるかも知れないが，生体内に遊離状態で存在する Caを考える場合，今
回の実験結果はこれら既報の結果を支持するものといえる。
以上のことから，水洗浄によって Mfは 水 和 膨 潤 を お こ し ミ オ シ ン と ア ク チ ン の 結 合 が 弱 め ら
れ，この時アクチンなど一部のタンパク質の流出を生ずるが， Ca洗浄はこのような現象に対し抑
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文 献
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