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PERFLOW® SortによるヒトiPS細胞のシングルセルソーティング

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PERFLOW® SortによるヒトiPS細胞のシングルセルソーティング
PERFLOW® SortによるヒトiPS細胞のシングルセルソーティング
ヒトiPS細胞のモノクローン化を目的とし、シングルセルソー
ティングを試みました。古河電工製 Perflow Sort (Fig.1)
によるソーティング後、継代増幅培養した結果、シングルセル
由来のモノクローンヒトiPS細胞を得ることに成功しました。
【背景】
ヒトiPS細胞及びES細胞は物理的ダメージに弱く、シングルセルの継代では高頻度
にアポトーシスを起こすことが知られています。Rock 阻害剤等により継代時の細
胞生存率は向上してきたものの、通常は小さな細胞塊(クランプ)の状態で継代が
行われています。幹細胞の研究において多能性を厳密に証明するには、モノクロー
ナルであることが必須です。しかしながら、コロニーピックアップで樹立された
iPS細胞は、モノクローナリティーが保証されておらず、シングルセルソートによ
るヒトiPS細胞のモノクローン化が必要です。
Perflow Sort は、ダメージレスソーティングを特徴としており、マイルドに培養
プレートへシングルセルソーティングすることが可能であることから、ヒトiPS細
胞のモノクローン化のための強力なツールとなり得ることが期待されます。
(独)国立がん研究センター研究所 石川哲也 先生のご指導のもと、Perflow Sortの
シングルソート機能でヒトiPS細胞のモノクローン化を試みました。
【細胞】
ヒトiPS細胞のアポトーシスを防ぐため、ソーテイング1時間前にY27632(ROCK
阻害剤)を添加しました。
【方法】
iPS細胞のコロニーをトリプシンでディッシュから剥して、遠心洗浄後、シングル
セルで培地に懸濁した。蛍光標識マーカーを用いずに透過光(FS)と側方散乱光(SS)
のみでアナライズを行いました。ターゲット細胞は培地を分注した96ウェルプ
レートにソーティングされました。ソーティング後は培地交換を行い、培養、形態
観察を行いました。
【結果】
6ウェルプレートに継代後、増幅培養した結果、 4ウェル(96ウェルプレート上の
A2, C12, G2, H10)のシングルセルを由来とする4クローンのヒトiPS細胞の樹
立に成功しました。Fig.2にH10ウェル由来のモノクローンヒトiPS細胞を示します。
Fig.1: PERFLOW® Sort
世界最小クラスのセルソーター。
ダメージレスセルソーティングを
特徴とします。
Fig.2: シングルソーティングされたヒト
iPS細胞
Perflow Sort でシングルセルソーティン
グ後、継代増幅培養されたヒトiPS細胞
コロニーの写真
(独)国立がん研究センター 研究所
石川 哲也 先生 ご提供
ソートした細胞とデータの関連付け
ソーティング後の細胞が、ドットプロットの
どこにプロットされていたか確認すること
が可能です。
ソートされた細胞の内容表示
各ウェルに入った細胞の履歴について
データを表示します。シングルソート
されているか確認することができます。
【総括・PERFLOWの利点】
幹細胞でも不均一性があることが知られており、モノクローン化が求められてい
ます。今回ヒトiPS細胞のダメージレスシングルセルソーティングの成功により、
モノクローン化の確立へ大きく前進することが期待されます。
更に、アナライズでは、ソーティングした細胞がドットプロット中のどのプロッ
トに由来するか関連づけも可能ですので(Fig.3, Supplementary data)、特定の
マーカーが無い細胞の認識指標として利用することや由来細胞の同定への強力な
ツールとなることが期待されます。
Fig.3:ソーティング結果とアナライズデータとの関連付けの例
Fig.2写真のクローンがG4のゲートにプロットされ、H10ウェルにシングルセル
ソーティングされたことを示しています。
残りの3クローンについては、裏面のSupplementary data 参照。
Supplementary data
Perflow Sort によってシングルセルソーティングされたヒトiPS細胞、ドットプロットのどこにプロットされていたかを示しています。
今回得られた4クローンについてのデータを示します。
A2
C12
G2
H10
■ お問合せ先
バイオサイエンスグループ
URL http:www.bio-lab.jp/
TEL 06-6447-8633
E-mail [email protected]
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