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「ゆりかご」で育つがん細胞 - Thermo Fisher Scientific
ライフテクノロジーズ情報誌 NEXT 10 月号 2014 / October / No.27 P. 04 Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Lung Cancer Research Panel IonPGM™ & Ion Proton™ シーケンサ P. 06 GeneArt ® CRISPR Nuclease mRNA GeneArt ® CRISPR Strings™ DNA（U6またはT7プロモーター） P. 07 P. 09 Total Exosome Isolationシリーズ Mouse（ ICR ）Inactivated Embryonic Fibroblasts SILAC™ Flex 培地シリーズ P. 10 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer P. 12 EVOS ® イメージングシステムシリーズ P. 14 Countess ® Ⅱ FL自動細胞カウンター P. 15 CellTrace™ Far Red CellTracker™ Deep Red NEXT Interview 「 ゆりか ご」で 育 つ が ん 細 胞 がんの発生や進展を左右する微小環境の解明へ 大島 正伸 氏（金沢大学がん進展制御研究所腫瘍遺伝学研究分野教授・所長） Invitrogen™ Next_27.indd 1 Applied Biosystems® Gibco® Molecular Probes® Novex® Ambion® Ion Torrent™ 14/09/13 14:07 NEXT Interview page 02 「 ゆりか ご」で 育 つ が ん 細 胞 がんの発生や進展を左右する微小環境の解明へ 大島 正伸 氏 （金沢大学がん進展制御研究所腫瘍遺伝学研究分野教授 所長） 細胞内のがん遺伝子やがん抑制遺伝子の異常が蓄積することから引き起こされる「がん」。 近年、その発生には、遺伝子変異だけでなく、がん細胞を取り巻く「微小環境」が深く関与することが明らかになってきました。 遺伝子の変異を蓄積しつつあるがん細胞を育てる「ゆりかご」となる微小環境の正体とは ? 生体の防御システムを巧みに利用しつつ「ゆりかご」で成長するがん細胞を阻む手立ては ? モデル動物の開発を通し、個体全体からそのメカニズム解明に挑む大島正伸氏にお話を伺いました。 大島正伸（おおしま まさのぶ） 1988 年北海道大学大学院獣医学研究科（修士課程）卒業後、中外製薬探索研究所研究員、万有製薬つくば研究所研究員、 Merck Research Laboratories 研究員を経て、2000 年京都大学大学院医学研究科助教授、 2005 年金沢大学がん研究所教授、現在に至る（ 2010 年 研究所名称変更）。 Next_27.indd 2 14/09/13 14:07 page インタビュアー： ライフテクノロジーズサイエンスコミュニケーター 橋本裕子 03 炎症とがんの関係を探る です」。そ ん なエキ サイティングな 環 境 で、 モデルマウスの開発 様々なノックアウトマウス作 製を試 みます。 そして 1992 年 、大 島 氏に大きな 転 機が訪 「 胃 が ん 発 生 の 原 因 遺 伝 子 は いまだ 不 明 れます。新たにクローニングされた大腸が な 点 も ありま す が 、胃 が ん 組 織 で は 広く んの発生に関わるAPC 遺伝子のノックアウ W n t シグ ナ ル の 活 性 化 が 認 められて おり、 トマウスを作製し、腸の腫瘍の原因が APC そ の 主 要 な 発がん 経 路に位 置 すると考え 遺伝子の two-hit mutation だということ られて い ます 。私 た ち は 胃 粘 膜 特 異 的 に を示した の です。 「この マウスが 私 の 研 究 W n t シグナ ルを活 性 化 するモデ ルマウス 人生の原点」と、大島氏は振り返ります。 を 開 発しました 。この マウスは 、胃 粘 膜に 非 常に小さな 前がん 病 変が形 成されます がん細胞を育む、 が 、腫 瘍 の 形 成には 至りませ ん 。一 方 、炎 炎症という微小環境 症 物 質 で あるプロスタグランジン E 2 の 合 成 酵 素を活 性 化したトランスジェニックマ 「 APCノックアウトマウスの作製直後、アメ Gan マウスの胃がんの組織切片を蛍光染色した画 像。赤はがん組織（ E-cadherin を染色）、緑はマク ロファージ（ F4/80 を染色）。増殖したがん組織の間 質に多くのマクロファージの浸潤が見られる。 ウスは 、見 事に胃 炎を発 症します。驚 い た リカの 論 文で家 族 性 大 腸がん の 患 者に抗 ことに 、これらの マウスをか け 合 わ せ 、両 炎症薬を投与し続けると腫瘍が減っていく 方の変異を持つマウスでは、典型的な胃が という結 果に目が 留まりました 。そこで 炎 目して研究を進めています」と、大島氏。従 んが発 生するのです。ところがこのマウス 症 を 抑 制 するマウスを 作り、A P C の そ れ 来とは 異 なる仮 説 から炎 症とが ん の 関 係 を無菌で育てると胃炎は発症せず、胃がん と掛け合わせたんです。すると劇的に大腸 を突き止めようとしています。 の発生も顕著に抑制されます。つまり胃が がんの発生が抑えられました。この遺伝子 んの発生には、遺伝子変異だけでなく炎症 は、プロスタグランジン E 2 合成の律速酵素 今後の研究と 反応が関わることを明らかにしました」。大 である COX-2 をコードしており、がんの周 島 氏は胃がん の 発 生 過 程をモデ ル 化した りで発現は上がるものの、がん遺伝子では 若い研究者へのメッセージ ありませ ん 」。大 島 氏は現 在 の 研 究につな 「 す でに 四 半 世 紀 近くが ん の 研 究 を 続 け がるCOX-2との出会いを語ります。そこで てきましたが 、この 疾 患 は 奥 深く、な か な 次に胃粘膜特異的に COX-2 経路が活性化 か そ の 全 貌 を 明らかにしな いと思って い 明け暮れた日々 するマウスを作り、胃がんの発生について ます。将 来 的には、転 移・再 発をともなうス 研 究 を 開 始 することにしました 。ところが テージ I V の 進 展 が んを発 生 するマウスモ Gan マウスについて語ります。 ノックアウトマウス作製に 1988 年に獣医学部を卒業、その後分子生 この マウスの 胃には 炎 症 は 観 察 されるも デルを作って悪 性 化 機 構を研 究したり、組 物学に取り組みたい一心で、東京大学医科 の の 、腫 瘍は発 生しませ ん 。がんとの 関わ 織に潜 むがん 幹 細 胞と微 小 環 境 の 関 係を 学研究所で研究生活を開始した大島氏。半 りを明らかにするために、いくつものがん 明らかにして いきた い 」。大 島 氏 はこれか 年 後 には 製 薬 企 業 に 移 動し、厳しい 遺 伝 遺伝子変異マウスなどとかけ合わせたとこ らも精力的にがん研究を進めていくようで 子クロー ニングの 競 争 の 世 界に飛 び 込 み ろ、Wnt1 の 機 能 亢 進マウスとの 組 み 合わ す。 「がんは遺 伝 子 変 異が原 因で生じるた ます 。 「 そ の 頃 、分 子 生 物 学 研 究 の バイブ せで冒 頭 の G a n マウスが誕 生します。 「こ め、寿命が延びるほど増えていくのは仕方 ル 的 な 存 在 だったモレクロ（ M o le c u l a r のマウスの研究を通して、がんの周囲の炎 がないことです。ですが 5 年か 10 年かとい Cloning ）を何度も読み込んで実験してい 症はがん 細 胞を攻 撃するための 免 疫 反 応 う再 発 のスパンは、微 小 環 境をうまく制 御 ましたが、うまくいかないことも多く、様々 ではなく、がん細胞を維持し、育てるための することで延ばすことができるかもしれま な 工 夫を仲 間と考 えつ つ 手 探りで 研 究を 『 ゆりかご 』の 役 割を担うではな い かと考 せん。このアプローチから新たな予防や治 進めていました」と話します。そんな時、獣 えるようになりました 。特に微 小 環 境にお 療法へつなげたい」と続けます。 医というバックグラウンドに目をつけ、勃興 ける骨髄由来のマクロファージの働きに注 最後に若い研究者への一言です。 「流行に 期にあったノックアウトマウスの 開 発に取 左右されず、バックボーンになる技術をいく り組まな い かという誘 い が 舞 い 込 みます 。 つか持つことをお勧めします。私は若い頃 「 私 を 誘った 武 藤 誠 先 生 は 、アメリカで 長 に、病理学を徹底的に叩き込まれたことが、 い研究生活を送ってきており、非常に質の 後々大変役に立ちました」。多くの研究者が 良 い E S 細 胞を持 ち 帰って いました 。そ れ 挑むがん研究において、独自のアプローチ を使うと生殖細胞系列に変異が入ったキメ や概念で新たな「がん」の姿を描き出そうと ラがほぼ 100% 生まれることもありました。 する大島氏。そのベースを、複数のバックグ 一 般 的 な E S 細 胞 では 数 % か 多くても 2 0 ラウンドから多面的に対象を捉える力が支 ∼ 30 ％の産仔が生殖系列に入れば良い方 えているのかもしれません。 Next_27.indd 3 14/09/13 14:07 Ion Torrent™ page 04 次世代シーケンサによる肺がん研究のための融合遺伝子検出ツール ■ Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Lung Cancer Research Panel NEW! ▶ 融合遺伝子検出の仕組み 次世代シーケンサから得られた有用 な情 報を利 用し、迅 速に融 合 遺 伝 子 染色体 9 番 遺伝子 A 染色体 22 番 遺伝子 B を検出します。優れたイオントレント の Ion AmpliSeq™ テクノロジー 融合遺伝子 で複数のターゲット RNA を一度にア 融合転写産物 ンプリコンシーケンス。微量のサンプ ルから高感度に融合遺伝子を検出し cDNA ます。 アンプリコンライブラリー ▶ サンプルから融合転写産物検出までの流れ RNA 抽出 がんのサンプル Ion AmpliSeq™ RNA Panel Ion 318™ Chip 16 サンプル/チップ Ion PGM™ シーケンサ Ion Reporter™ ソフトウェア ● 肺がん研究に最適 ● 迅速かつハイスループット ALK 、RET 、ROS1 、NTRK の既知融合遺伝子を検出 する70 パターンの PCRプライマー設計 Ion 318™ Chip で 16 サンプル / ラン、Ion PI™ チッ プで 96 サンプル / ランのハイスループットかつ数時 サンプル量 500 pg 高品質トータルRNA 5-10ng FFPE 由来 RNA 間の迅速シーケンス ターゲット遺伝子 ALK, RET, ROS1, NTRK遺伝子の 70 パターンの融合転写産物および5 融合転写産物を逆転写 PCRした高品質なトータル ● 簡単操作のデータ解析 RNA500pg 、あるいは 5 ∼ 10ng の FFPE 由来 RNA 専用解析ソフトウェア Ion Reporter™ により、融合 プール数 1プール から融合遺伝子を検出 転写産物の検出パターンおよび頻度をビジュアルに アンプリコン数 85 アンプリコン ● 微量サンプルに対応 パネルデザイン 遺伝子のコントロール 表示 アンプリコンサイズ 平均 138bp サンプル数 16サンプル / Ion 318™ Chip 96サンプル / Ion PI™ Chip 製品名 サイズ 製品番号 Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Lung Cancer Research Panel 1プール × 1,125 反応 受託生産品 価格 Ion AmpliSeq™ RNA Library Kit 8 反応 4482335 ¥96,000 Ion 318™ Chip Kit v2（ 4 pack ） 4チップ 4484354 ¥200,000 ¥36,000 変異解析、CNV 、染色体異常、融合遺伝子検出までこの 1 台で ■ IonPGM™ & Ion Proton™ シーケンサ 目的合わせた Ion AmpliSeq™ アンプリコンシーケンステクノロジーを次世代シーケンサで 利用することで、微量の DNA/RNA から信頼性の高い結果が得られます。貴重なサンプルや FFPE 切片からでも、臨床研究に求められるリーズナブルなコストと卓越したワークフローで 様々な解析を実現します。 Next_27.indd 4 Ion PGM™ シーケンサ 製品名 サイズ 製品番号 Ion PGM™ システム テンプレート調製自動化システム付（ 2 年保証） 1式 PGM11-020S2 Ion Proton™ システム テンプレート調製自動化システム付（ 2 年保証） 1式 PROTON-020S2 Ion Proton™ シーケンサ 価格 ¥9,600,000 ¥29,800,000 14/09/13 14:07 page Applied Biosystems® 05 Technical Review デジタル P C R による 白 血 球 細 胞 の 融 合 遺 伝 子 の 絶 対 定 量 がん研究で大きな注目を集める融合遺伝子の検証において、従来のリアルタイム PCR 法では、融合遺伝子間の発現量を比較すること が困難でした。しかしデジタル PCR を使えば、PCR 効率の影響を受けずに絶対定量が行え、遺伝子間の発現量を容易に比較できます。 今回、白血病細胞株の RNA を用い、RNA シーケンスで融合遺伝子をスクリーニングした結果、新規融合遺伝子を含む複数の融合遺 伝子を検出しました。その中から4 種類の融合遺伝子の配列情報を基に特異的な TaqMan ® Assay を設計して、リアルタイム PCRと デジタル PCR で定量しました。その結果、デジタル PCR では、4 種類の定量が非常に簡単に行えることがわかりました。デジタル PCR の技術は、リファレンスサンプルや標準曲線を用いることなく、対象遺伝子の濃度や存在量を直接定量できるため、さまざまな分野で 活用が始まっています。 内在性コントロール ターゲット遺伝子 リアルタイム PCRとデジタル PCR によ る各融合遺伝子の発現量の比較 白血病細胞株K562由来のRNAを用 い 、R N A シ ー ケンスにより融 合 遺 伝 子 の B re a k p o i n t を含 む 配 列 情 報を取 得しまし た。その中から機能未知の融合遺伝子を含む、 4 種 類 の 融 合 遺 伝 子に特 異 的 な Ta q M a n ® Assay を設計し（図 1 ）、遺伝子間の発現量を 比較しました（図 2 、図 3 ）。 図 2．リアルタイムPCRによる比較 4 種類の遺伝子の発現解析をする場合、内在性コントロールの 18S rRNA（灰色の増幅曲線）との比較によって、ある程度定量でき ます。しかしさらに正確な解析には検量線を作成し、絶対定量する必要があります。 図 3.デジタル PCRによる比較 絶対値定量できるので、4 種類の遺伝子間の比較が容易に 行えます。 図 1． 融合遺伝子を検出する TaqMan ® Assay 設計例 Break point を含む領域に TaqMan ® Assay を設計し、 融合遺伝子を特異的に検出しました。 検出遺伝子数 RNA 遺伝子発現解析手法の比較 マイクロ RNA リアルタイム デジタル アレイ シーケンス PCR PCR 4 種類の代表的な RNA 遺伝子発現解析手法の比較を右の表に示します。 ○ ◎ △ × マイクロアレイによる発現解析は、既知の分子種を検出できますが、RNA 検出感度 △ ○ ◎ ◎ シーケンスのように新規分子種は検出できません。 データ精度 △ △ ○ ◎ リアルタイム PCR はサンプル間の相対定量を行う場合に広く用いられる 絶対定量 × △ ○ ◎ 方法ですが、PCR 効率に影響されることがあり、精密な存在量を測定する 新規分子種の検出 × ◎ × × 場合には、検量線を用いた絶対定量が必要となります。 遺伝子発現の 遺伝子発現の 相対定量 絶対定量 主な用途 既知分子種の 網羅的発現解析 新規分子種を 含んだ 網羅的発現解析 デジタル PCR は手間をかけずに、精度の高い絶対定量が行えます。検量 線用のリファレンスサンプルの用意が困難な場合など、特に威力を発揮す る技術です。 QuantStudio ® 3D デジタル PCR システム 100 台突破キャンペーン デジタル PCR は従来のリアルタイム PCR の限界を超える能力を提供する画期的な技術です。2013 年に発 売を開始した QuantStudio ® 3D デジタル PCR システムは、シンプルなワークフローと手頃なシステム価 格が大変好評で、国内導入台数 100 台を突破しています。これを記念して 2014 年 12 月 26 日までにご購入さ れたお客様に特製クッションをプレゼントします。 製品名 製品番号 QuantStudio ® 3D デジタル PCRシステム ProFlex™ PCRシステム付き QS3D-PF（ 2 年保証） 価格 ¥5,900,000 QuantStudio ® 3D デジタルPCR 本体、デュアルフラットブロックProFlex™ PCRシステム QuantStudio ® 3D ChipLoader、インスタレーション試薬、設置基本取扱説明 Next_27.indd 5 14/09/13 14:07 Invitrogen™ page 06 幹細胞、胚でのゲノム編集に最適な新製品登場 ■ GeneArt ® CRISPR Nuclease mRNA ■ GeneArt ® CRISPR Strings™ DNA（ U6またはT7プロモーター） NEW! CRISPR/Cas9 によるゲノム編集を構成する 2 つのエレメントをそれぞれ新発売。一 つは Cas9ヌクレアーゼを mRNA で、もう一つは gRNA 発現エレメントを U6 または T7 プロモーター付加二本鎖 DNA 断片の形式で提供します。これらのツールを共導入す ることで、クローニングにかかわる時間を短縮でき、複数ターゲットのゲノム編集や、 ト ランスフェクション効率の低い細胞や幹細胞、胚へのマイクロインジェクションも実現 します。 時間と手間の短縮 Ready-to-Transfect で従来のベクターへのクローニングを省 略。CRISPR Strings™ は標的サイトのデザインサービスもオプションで無償提供 複数ターゲットのゲノム編集 最大 4 つの CRISPR Strings™ を Nuclease mRNA とともに細胞導入することでマルチプレックスゲノム編集。コスト面でもより手軽に。 より幅 広 い 細 胞 や 胚 で の ゲノム 編 集 を 実 現 従 来 の ベクタ ー タイプに比 べ C a s 9 , gRNA 発現用のプロモーター制約がなくなり、幹細胞や胚でのゲノム編集が実現 G UA CG GC GC UA GC AA CG G A UUUU G AU UA U CG G GCA A A A A G UG A AU A UA A UA G UA U UA U GU C A A A G G C U A G UC C G U U A UC A A G Cas9 gRNA G C A U U UC G G U A UG C A U A UG A A U CG T A A A G CC A T A C G T A T A C T A C C G C A T T T C G G T A T G C A T A T G A NGG 標的配列 PAM 新 製 品 の も っと 詳 し い 解 説 & 実 験 デ ー タ 、 ゲノム編集の 基 礎を日本 語で分かりやすく解 説したセミナーはこちらから ↓ www.lifetechnologies.com/GenomeEditors User's Voice 鈴 木 英 明 氏（ 東 京 慈 恵 会 医 科 大 学 解 剖 学 講 座 講師） ゲノム編集を活用し、先天性異常の疾患遺伝子解析へ CRISPR のオフターゲットを Ion PGM™ シーケンサで正確に検証 先天性異常は、臨床所見だけでは判断が が ありました 。そこでまず は 実 際 の オン つかな い 症 例も多く、疾 患と関 連 する遺 ターゲットとオフターゲットの割合をきち 伝子変異を特定し病態を正しく理解する んと評 価しようと思ったの です」。ここで ことが重要となります。鈴木氏は、これま 使用したのが IoｎAmpliSeq™ テクノロ で症例検体から遺伝子配列を次世代シー ジーと Ion PGM™ シーケンサ 。鈴 木 氏 ケンサ で 解 析し、候 補 遺 伝 子を絞り込 む は、CRISPR システムで 2 遺伝子の 4 か所 アプローチを行ってきました。今後、その をターゲットに作 製したコンストラクトの 情報を基にゲノム編集で変異を導入した それぞれをヒト細胞に導入し、その 4 細胞 細 胞やモデル生 物を作 製し、そ の 解 析を 群でオンターゲットとオフターゲットを調 通して疾患発症の原因や治療へ役立てよ べることにしました。実際の解析個所は、4 うとしています。 つのターゲット配列及びターゲット配列に CRISPR による ゲノム編集とその評価 ゲノム編 集 の 方 法には、Z F N や TA L E N が ありま す が 、昨 年 初 め に C R I S P R が 登 場 すると、鈴 木 氏 はタ ー ゲット遺 伝 子 の デ ザ イン の 簡 便 さや 実 験 手 法 の 容 易 さに注 目 。すぐに試して みることに。 「た だし CRISPR にはオフターゲットの 心 配 Next_27.indd 6 検証結果と今後の活用について 「その結果、4 つのコンストラクトにおいて、 全体の 30 ∼ 60% の細胞で目的部位の欠 失を確認、0 ∼ 3% の割合でオフターゲット の欠失を検出しました」と鈴木氏。 「思った よりもオフターゲットがありましたね」とコ メントします。 「この 結 果を基に短 期 間で ゲノム編集可能な CRISPR や、正確性の 高い TALENというゲノム編集ツールを使 い分けていきたい」と話します。 3 塩基以内のミスマッチで類似する領域の 「 IonAmpliSeq™ テ 合計 40 カ所です。 クノロジーで 40 領 域をマ ルチプレックス PCR で一 度に増 幅し、ライブラリー 調 製 後、Ion PGM™ シーケンサで 40 領域す べてを一度にシーケンス、付属ソフトウェ アで解 析しました。細 胞 へコンストラクト 導入からオフターゲット評価まで 1 週間以 内で終了できました」と話します。 14/09/13 14:07 G A G C C A C G G U G A A A A A G U U C A page Invitrogen™ 07 さらに充実 ! エキソソーム解析のためのエキスパート試薬 ■ Total Exosome Isolation シリーズ NEW! 超遠心法と同等のインタクトなエキソソームを短時間で回収する試薬シリーズです。この度、高純度の CD9 、CD81 、Ep-CAM 陽性エキ ソソーム単離や、フローサイトメトリー解析用の Human CD9・CD81・Ep-CAM Isolation/Detection 試薬（全 6 製品）、ウエスタン解 析用の Anti-CD9, CD63, CD81 抗体（全 3 製品）を新たに発売しました。さらに発展するエキソソーム研究を効率よく進めるアイテム として、ぜひご活用ください。 ▶ エキソソーム単離から 解析へのワークフロー エキソソーム回収 ■ Total Exosome Isolation ● 各サンプルに対応した5 種類の専用試薬 ● 超遠心機を使わずに短時間でエキソソームを回収 ● 対応サンプルタイプ → 細胞培養上清、血清、血漿、尿、脳脊髄液、腹水、羊水、母乳、唾液 RNA とタンパク質の精製・解析 ■ Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit 同一サンプルからタンパク質とRNA を回収可能 ■ Exosome Immunoprecipitation 特定の抗原を持つエキソソームの単離・フロー解析 ■ Exosome-Human Isolation/Detection （ CD9, CD63, CD81, Ep-CAM） 高純度のCD9, CD63, CD81, Ep-CAM陽性細胞エキソソームを単離 磁気ビーズを利用した、わずか30 分のシンプルなプロトコール ■ Exosome-Streptavidin for Isolation/ ■ ウエスタン解析用抗体 Detection エキソソームマーカータンパク質のウエスタン解析用抗体 前濃縮したエキソソームから作業時間 1 時間以内に特定の抗原を 持つエキソソームを単離可能 製品名 エキソソームの蛍光標識 ■ SYTO ® RNASelect™ Green Fluorescent Cell Stain ■ BODIPY® TR ceramide エキソソーム中の RNA もしくはエキソソームの膜を蛍光標識 ■ Exosome Spin Columns（MW 3000） 蛍光標識したエキソソームの精製 サイズ 製品番号 価格 Total Exosome Isolation（細胞培養上清） 50 mL 4478359 ¥43,100 Total Exosome Isolation（血清） 6 mL 4478360 ¥39,900 Total Exosome Isolation（血漿） 6 mL 4484450 ¥42,000 Total Exosome Isolation（尿） 50 mL 4484452 ¥28,400 エキソソームの単離 Total Exosome Isolation（その他体液） 6 mL 4484453 ¥42,000 Exosome-Human CD63 Isolation/Detection（細胞培養上清） 3ｍL（約 30 prep/150 rxn） 10606D ¥42,000 Exosome-Human CD9 Isolation（細胞培養上清） NEW! 2mL（約 50 prep ） 10614D ¥60,900 Exosome-Human CD81 Isolation（細胞培養上清） NEW! 2mL（約 50 prep ） 10616D ¥60,900 Exosome-Human Ep-CAM Isolation（細胞培養上清） NEW! 2mL（約 50 prep ） 10618D ¥60,900 Exosome-Human CD9 Flow Detection（細胞培養上清） NEW! 2mL（約 100 rxn ） 10620D ¥27,300 Exosome-Human CD81 Flow Detection（細胞培養上清） NEW! 2mL（約 100 rxn ） 10622D ¥27,300 Exosome-Human Ep-CAM Flow Detection（細胞培養上清） 2mL（約 100 rxn ） 10624D ¥27,300 3mL（約 30 prep/150 rxn） 10608D ¥42,000 Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit 40 rxn 4478545 ¥39,900 Exosome Immunoprecipitation（ Protein A ）※ 1 mL 10610D ¥23,100 Exosome Immunoprecipitation（ Protein G ）※ 1 mL 10612D ¥23,100 NEW! Exosome-Streptavidin for Isolation/Detection※ エキソソームRNAやタンパク質の精製 エキソソームの蛍光標識 Exosome Spin Columns（ MW 3000 ） 30 カラム 4484449 ¥21,000 SYTO ® RNASelect™ Green Fluorescent Cell Stain 100 L S32703 ¥45,100 BODIPY ® TR Ceramide 250 g D7540 ¥45,100 Exosome Anti-CD9（ウエスタン解析） NEW! 0.2 mL 10626D ¥30,500 Exosome Anti-CD63（ウエスタン解析） NEW! 0.2 mL 10628D ¥30,500 Exosome Anti-CD81（ウエスタン解析） NEW! 0.2 mL 10630D ¥30,500 ウエスタン解析用抗体 ※ 別途目的に応じた抗体が必要になります。 ■ 製品についての詳しい情報はこちらから → www.lifetechnologies.com/exosomes Next_27.indd 7 14/09/13 14:07 Invitrogen™ page 08 User's Report / vol.03 大場雄介 氏（北海道大学大学院 医学研究科生理学講座細胞生理学分野 教授） FRET バイオセンサーによる分子標的医薬品の迅速な薬効評価法の開発へ Lipofectamine ® 3000 を使い、非小細胞性肺がん細胞に高効率・高生存率で遺伝子を導入 生物学にとって欠かせない技術となった蛍光バイオイメージング。北海 道大学の大場雄介氏は、分子標的医薬品の薬効評価法の開発等にこの 技術を応用しています。具体的には、細胞内のシグナル伝達をモニター するFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）バイオセンサーを細胞内に発現 させ、生きた細胞で薬効を評価したり、細胞の機能解析を進めています。 FRET バイオセンサーでキナーゼ活性をモニター FRET バイオセンサーのさらなる発展に向けて 「今後は、FRET バイオセンサー技術を他のがんへの薬効評価法として拡げ るとともに、薬剤耐性の細胞を単離し、基礎科学の観点からもその機序解明 に取り組みたい。将来的には、治療前から個々の患者さんに対する薬の有効 性を判定したり、治療中に薬剤耐性細胞の有無を検出することで、効果的な 治療を効率的に行う医療へとつなげていきたい」と大場氏。FRET を活用し た新技術が、個別化医療の実現や新たな治療法開発の一翼を担いそうです。 慢性骨髄性白血病（ chronic myeloid leukemia, CML ）の原因タンパ ク質である BCR-ABL はチロシンキ ナーゼ活 性を有し、細 胞 内で異 常な シグナル伝達を引き起こします。大場氏らは、2010 年に FRET を利用して BCR-ABL の活性を測定するバイオセンサー「 Pickles 」を開発しました。 Pickles は、基質となるCrkL の両端に2 つの蛍光タンパク質 CFPとYFP を 結合させたもの。CrkL がリン酸化されるとPickles の構造が変化し、両端 の CFPとYEP が近接して、CFP からYFP へエネルギー遷移が起き、検出さ れる波長が変化します。大場氏は、Pickles で BCR-ABL のキナーゼ活性 ［実験メモ］ 細胞種：ヒト肺がん細胞 細胞コンフルエンシー：60 -70% プロトコル：マニュアル通り 目的：FRET バイオセンサータンパク質の発現 をモニターすることで分子医薬品の薬効を迅速に評価できることを示しま した。さらに、非小細胞性肺がん細胞に対するチロシンキナーゼ阻害薬の薬 効評価に適用できないか研究を発展させています。 非小細胞性肺がん細胞へ効率よくトランスフェクション しかし非小細胞性肺がん細胞は、遺伝子の導入効率が低いことで知られてい ました。大場氏によると、 「様々なトランスフェクション試薬を試してみました が、他社製品での導入効率は 2 ∼ 3 ％、Lipofectamine ® 2000 でも 10 ％程度 でした。しかも遺伝子が導入できても細胞の生存率が低く、計画した実験をす べて行うことが難しい状況でした」。フローサイトメトリーで生きたままの細胞 を回収し、各種解析を行う大場氏にとって、導入効率と生存率は実験効率を左 右する重要な要因。そこで、新しい Lipofectamine ® 3000 を試すことに。3 種類の非小細胞性肺がん細胞で、導入効率・生存率がそれぞれ向上しました （図参照）。 「フローサイトメーターで分離後も、細胞が元気なのでいろいろ な解析ができます。また遺伝子導入時の条件検討が要らない点も良かったで す。これまでの試薬では細胞ごとに 5 ∼ 6 種類の条件検討を行っていましたが、 Lipofectamine ® 3000 は示されたプロトコールで十分に高い導入効率が得 られました。複数の細胞で比較するときも楽ですね」と大場氏。 トランスフェク トランスフェクションの比較 2 種 類 の L i p o fe c t a m i n e ® 試 薬 でトランスフェクション後 、フロー サ イトメー ターで生細胞を分取し（上段、黒枠ゲート内部分）、それぞれのトランスフェクショ ンにおける蛍 光 強 度（ F L 1 ）を測 定しました（ 下 段 、赤 ）。下 段 青 はコントロー ル 。 Lipofectamine ® 3000（右）は、Lipofectamine ® 2000（左）に比べ生存率が高く （ 15%から21%に増加）、導入効率も向上（ 5.7%から21%に増加） しました。 ションが困難な細胞を扱う研究に向いているとコメントします。 遺伝子導入が困難だった細胞を、導入可能へ ! ■ Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit NEW! ● 優れたパフォーマンス ── 導入困難な細胞から一般的な細胞まで、高い導入効率を実現 ● 細胞生存率の向上 ── 細胞に優しく、低毒性 ● 高い汎用性 ── 1 つの試薬で DNA 、RNA 、co-transfectionに対応 Next_27.indd 8 製品名 サイズ 製品番号 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 0.1 mL L3000001 ¥9,000 価格 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 0.75 mL L3000008 ¥64,500 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 1.5 mL L3000015 ¥97,000 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 1.5 mL × 5 L3000075 ¥430,000 Lipofectamine ® 3000 Transfection Kit 15 mL L3000150 ¥720,000 14/09/13 14:07 page Gibco® 09 iPS 細胞、ES 細胞のフィーダー培養に優れたコストパフォーマンス ! ■ Mouse（ ICR ）Inactivated Embryonic Fibroblasts NEW! ICR 系マウスの胚から分離し、培養、γ線照射で不活性化後に冷凍保存したマウス胚線維芽 細胞（ MEFs ）です。マウス及びヒトの胚性幹細胞（ ESC ）や誘導多能性幹細胞（ iPSCs ）を 培養する時に、一般的なフィーダー層として使います。 ● 融解後の生存率は 80% 以上 ● 細胞マーカー（ Oct4 ）の発現を確認済み 製品名 サイズ 製品番号 価格 Mouse（ ICR ）Inactivated Embryonic Fibroblasts 1 mL（ ≧2 × 10 6 cells ） A24903 ¥2,900 SILAC™ 用の Gibco™ 培地ラインナップ拡充で実験系もより幅広く! ■ SILAC™ Flex 培地シリーズ NEW! 安定同位体標識リジンまたはアルギニンでタンパク質を SILAC™ 標識するための培地で す。L- アルギニン不含、L-リジン不含、L- グルタミン不含の組成で、さらにフェノールレッ ド、グルコース不含です。 ［各培地の使用細胞］ ▶ RPMI：HeLa 、Jurkat 、MCF-7 、PC12 、PBMC 、astrocytes 、carcinomas ▶ DMEM：初代繊維芽細胞 , 神経 , グリア細胞 , HUVEC, smooth muscle cells 、 HeLa, 293 、Cos-7 、PC-12 ▶ Advanced DMEM/F-12：Jurkat 、WI-38 、SP2 、Vero 、MRC-5 ※ Advanced DMEM/F-12 は血清使用量を 50-90% 減らして使用可能 ※無菌性、エンドトキシン、pH 、浸透圧を試験済み 製品名 サイズ 製品番号 SILAC™ RPMI 1640 Flex Media 500 mL A2494201 ¥10,000 SILAC™ DMEM Flex Media 500 mL A2493901 ¥10,000 SILAC™ Advanced DMEM/F-12 Flex Media 500 mL A2494301 ¥11,600 SILAC™ RPMI 1640 Media 500 mL A2494401 ¥9,600 Glucose Solution 50 mL A2494001 ¥3,200 Gibco ® × LEGO ® のコラボ企画 第 2 弾 ! 価格 先着 300 名様限定 ! Gibco ®培地のキャップラベルシールで Ms.Huvec LEGO ®人形を手に入れよう! Gibco ® 培地のボトルキャップのラベルを 10 枚集め、専用台紙に貼り、台紙に記載している応募先までお送りください。 先着 300 名様に Gibco ®オリジナルの LEGO ® 人形をプレゼントします。 ［第 2 弾お申し込み締め切り］2014 年 12 月26 日（金）当日消印有効 キャンペーン詳細とお申込み用紙はこちらから → www.lifetechnologies.com/promo-clc Next_27.indd 9 14/09/13 14:07 Life Technologies™ page 10 BE THE FIRST. SEE IT. USE IT. LOVE IT. 最大 4 レーザー &14 色でレアイベントを迅速検出 ! ■ Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer まずは See it! がん研究にスピードを ! がんと闘うためのより良い治療法の開発には、基礎的な生物学的特徴を細胞レベルや分子レベ NEW! ルで深く理解することが重要です。特にがんの進行が最も早い段階を示す、独特でレアな細胞 現象を特定することは、多くのがん研究者の重大な課題です。新しい Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer は、がん研究におけるレアな末梢循環腫瘍細胞の特定精度を向上させ、 細胞周期の微細な異常を高い精度と感度で検出します。4レーザー、14 色でシステムを柔軟に カスタマイズでき、既存の実験プロトコールやラボの環境に合わせて、研究ニーズとともに成長 するフローサイトメーターです。 ● 最大 4レーザー、14 色検出可能なモジュール式（組み立てユニット） システムを採用 ● 独自のアコースティックフォーカシングテクノロジーで迅速にイベントを検出 ● 未経験者からベテランまで幅広いユーザー層が満足する使いやすいソフトウェアを搭載 ［資料請求・訪問依頼はこちらまで］ www.lifetechnologies.com/attune レーザー 励起 蛍光 共通色素 蛍光タンパク質 Violet 405 nm 440/50 Pacific Blue™ ECFP 512/25 Pacific Green™ 603/48 Pacific Orange™ 710/50 Qdot ® 705 NA FSC NA SSC** 530/30 FITC 574/26* Propidium iodide Blue 488 nm 695/40 Yellow Red 561 nm 638 nm 「 私 の ラ ボ の 主 要 な プ ロ ジェクト の ひと つ は 、自 然リンパ 球 の 新 た な タイプ の 説 明と機 能 的 分 析 です。この 細 胞 は 血 液 中 でも 組 織 でもきわめて 稀にしか 存 在して いませ ん 。そ のためフロー サイトメトリー 分 析は、Attune ® AcousticFocusing Cytometer を使っています。サンプル流 EGFP, Emerald GFP 速が速いため、遠心分離ステップが減らせ、 EYFP より多くの細胞を保持できレアイベントを より迅速に検出します。他の機器ではこの ® PerCP-Cy 5.5 ような研究は行えなかったでしょう」 ® 780/60 PE-Cy 7 583/22 PE RFP 620/15 PE-Texas Red ® Prof. David Cousins（University of Leicester） mCherry, tdTomato, DsRed, mStrawberry ® 695/40 PE-Cy 5.5 780/60 PE-Cy ® 7 660/20 APC 720/30 Alexa Fluor ® 700 780/60 APC-Alexa Fluor® 750 * イエローレーザーがない時はPEに使用 「非溶血 / 非洗浄」アプリケーションには、バイオレットの側方散 ** 側方散乱光はどのレーザーでも検出可能（デフォルトはブルーレーザー）。 乱光を推奨。 Next_27.indd 10 製品名 Lasers Laser color 蛍光チャネル数 製品番号 価格 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer 4 Blue, Red, Violet, Yellow 14 A24858 ¥19,950,000 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer 3 Blue, Violet, Yellow 11 A24859 ¥14,950,000 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer 3 Blue, Red, Violet 11 A24860 ¥14,950,000 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer 2 Blue, Yellow 7 A24861 ¥9,950,000 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer 2 Blue, Violet 8 A24862 ¥9,950,000 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer 2 Blue, Red 7 A24863 ¥9,950,000 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer 1 Blue 4 A24864 ¥6,000,000 14/09/13 14:07 page Life Technologies™ 11 アコースティックフォーカシングだから実現できる、スピードと感度の両立。 短時間で解析ができるため、よりよい状態でサンプルを維持し、正確に解析できます。まずは、見て、使って、お試しください。 解析例 1 Attune ® NxT Acoustic Focusing Cytometer による マウス制御性Ｔ細胞および樹状細胞のマルチパラメータ（ 10 カラー）分析 リンパ球は FS C / SS C パラメータ（ A 、左 ）を用 いてゲーティングし、以 降 の 分 析では B 2 2 0 発 現 細 胞を除きました（ A 、中 ）。B 2 2 0 – 、 CD45.2+ ゲート内で、CD3 の発現に基づいて T 細胞を分析しました（ A 、右）。CD3+ T 細胞を CD4または CD8 共受容体の発現に基づい て 2 つの集団に分けました（ B 、左）。CD4 T 細胞内で、転写因子 Foxp3 および細胞表面マーカー CD25（ IL-2Rα）を発現する抑制的な制 （ B 、右）。レアなプロフェッショナル抗原提示樹状細胞であるCD11c+ MHCII+ 集団を確認する 御性 T 細胞の亜集団が存在しています。 ために、CD3– 細胞を分離しました（ C 、左）。脾樹状細胞はさらにCD11b+ および CD8+ 樹状細胞サブセットに細分でき（ C 、右）、それぞれ が独自の抗原提示特性を有していました。 解析例 2 100 万個以上の生細胞を収集し、 マウス脾細胞の 0.2% に見られるレアな樹状細胞集団を検出 形質細胞様樹状細胞（ pDC ）は、ウイルスに反応して大量の I 型インターフェロンを産生す る特殊化した細胞集団であり、CD19–/B220high/CD317+ の免疫表現型を用いて特定 されます。マウス脾細胞の 4 色染色には CD19 PacificBlue™ 、CD317 Alexa Fluor ® 4 8 8 、C D 4 5 R / B 2 2 0 - P E ダイレクトコンジュゲ ートおよび SY TO X ® A A D v a n ce d ™ Dead Cell Stain を用いました。SYTOX ® AADvanced™ Dead Cell Stainを用いて 生細胞にゲートを設定し、次に CD19– 細胞のゲーティングを行いました。CD45R/B220 vs. CD317 の 2 パラメータプロットを使用して pDC を特定しました。その結果、500µL/ m i n の 収 集 速 度 、細 胞 濃 度 7 . 5 × 1 0 7 個 / m L で 合 計 1 3 0 万 個 の 細 胞 を 採 取しました 。 B220+/CD317+ の両者に対応する（右上の領域）細胞を形質細胞様樹状細胞として特定 しました。この細胞は CD19– 生細胞の 0.851% 、脾細胞全体の 0.194%に相当しました。 Next_27.indd 11 14/09/13 14:07 Life Technologies™ page 12 毎日の顕微鏡作業を気軽に、便利に、そして素早く! ■ EVOS ® イメージングシステムシリーズ “誰にでも、きれいな画像”をすぐに撮影できる、今までにない新世代のオールインワンデジタル顕微鏡シリーズです。明視野・位相差から 蛍光観察まで多様な 5 機種をラインアップ。研究のニーズにあわせてお選びください。 ● PC 、カメラ、顕微鏡を一体化 ● 場所を取らない、コンパクト設計 ● 使いやすいインターフェース ● スピーディーな LED 光源 ● 1クリックの簡単操作 ● 暗室設置なしで快適な蛍光観察 ● タイムラプス機能も搭載（ FL Auto,FL,XL ） 気軽です！ 便利です！ 素早い！ 暗室はもう古い ! モニターで共有しよう! 時短ポイントがたくさん ! 暗室を設置しなくても蛍光観察できます。しかも培 接 眼レンズなしでモニターに画 像を表 示するので、 すぐに起 動し使 える L E D 光 源を採 用 。立 ち 上 がり 養フードにも入るコンパクトさで、どんな場所でもす 複数の人とイメージを直接共有でき、すぐにディス が ス ピ ー ディー で 、余 計 な 時 間 が か かりま せ ん 。 ぐに気軽にイメージング可能。快適な実験環境を提 カッションへ進めます。一人よりも多くの目で見るこ 50,000 時間を超える光源寿命が消耗品のコストを 供します。 とで発見が加速します。 抑えます。 EVOS ®は、イメージングに使いやすさと便利さを提供します。ぜひデモ機で実感・体験してください。 デモ依頼、資料請求はウェブサイトからご登録いただけます。 www.lifetechnologies.com/EVOS Next_27.indd 12 14/09/13 14:07 page Life Technologies™ 13 Technical Review Arcturus XT ™ LCM System による 生きた細胞でのマイクロダイセクション 大滝真作（ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート） レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、スライドグラス上に調製した切片から、目的の細胞群を回収する技術です。 今回、Arcturus XT ™ LCM Systemを活用したマイクロダイセクションの応用技術として、 生きた細胞を回収する「ライブセルマイクロダイセクション」技術をご紹介します。 細胞をフレームメンブレンスライド上で 代 培 養 できます。また 、C e l l s - t o - CT この技術はセルソーティングと比較する 培養し、メンブレンに接着させます（図 1 ）。 Kits を活用すれば、回収した細胞を溶解 とスループット面では劣りますが、目的の 次にメンブレンの裏側からレーザーキャ 後、溶解液からそのまま逆転写反応を行 細 胞を顕 微 鏡 観 察 下で確 認しながら回 プチャーマイクロダイセクションで細 胞 えます。回収したシングルセルのゲノム 収できるメリットがあります（図 2 ）。また 群を切り取り回収します。 DNA を増 幅し、次 世 代シーケンサで変 不 用 な 細 胞を回 収した場 合は、U V レー 回 収した生 細 胞はトリプシン処 理 後 、継 異解析も可能です。 ザーを照射して殺せます。 フレームスライド MacroCap カバーガラス 回収前 PENメンブレン 2. スライド内に細 胞を撒き、 メンブレンに接 着したら、カ ド を準備。 バーガラスでふたをし、ひっく 3 . 目 的 の 細 胞 周 辺に M c ro Cap を置き、IRレーザーを照 射して MacroCap 表面のフィ り返して装置にセット。 ルムを接着させます。 明視野 1. ライブセルマイクロダイセ クション用のフレームスライ 回収した細胞 蛍光観察 図 2 ライブセルマイクロダイセクションによ 5. キャップを持ち上げて目的 る細胞の回収 の細胞を回収します 4 . U V レー ザ ー を 照 射して 、 図 1 ライブセルマイクロダイセクションの原理 Arcturus XT ™ 細胞周辺のメンブレンを切り 抜きます IR & UV レーザーベーシックシステム（製品番号 ARCTURUSXT-B ） User's Voice 三 枝 大 輔 氏（ 東 北 大 学 東 北 メディカ ル・メガ バ ンク 機 構 ゲノム 解 析 部 門 医 化 学 分 野 助 教 ） 微小細胞集団におけるリゾリン脂質濃度の超高感度測定系を開発 Arcturus XT ™ LCM System を用いてマウス脾臓切片から数百細胞を回収 脂質メディエーターとして注目されるリゾリン脂質。東北大学の Next_27.indd 13 が、数万の細胞集団を切り出すのが限界でした。Arcturus XT ™ 三枝大輔氏は、リゾリン脂質の超高感度測定系を構築し、わず LCM System は、切り取った細胞のみを上から拾いあげるの か数百の細胞からなる微小細胞集団中の濃度測定に成功しま で、数 百 の 細 胞でも確 実に切り出 せます。1 枚 の 切 片で十 分に した。この測定系を使うとリゾリン脂質の一種、 「スフィンゴシン 解析できるので、正確に効率よく研究を進められますね」と語り −1−リン酸（ S1P ）」を、血漿中では 10pmol/L 、組織切片中で ます。さらに高感度の測定系開発にも意欲的に取り組む三枝氏。 「当初使用した装置 は 50fmol/mg の微量でも測定できます。 ユーザーボイスをオンラインマガジンで公開中です。ぜひご覧 では、レーザーで細胞集団を切り落とし回収するタイプでした ください。→ www.lifetechnologies.com/NEXTmagazine 14/09/16 17:27 Life Technologies™ page 14 蛍光カウント機能を追加可能、新しくなったカウンテス ■ Countess ® Ⅱ FL 自動細胞カウンター NEW! 細胞数を迅速かつ正確に計測する自動細胞カウンターです。タッチスクリーンでの直観的 な操作、約 10 秒の正確な細胞数カウント、オートフォーカス機能による実験誤差の最小化。 操作にかかる手間を省きます。しかも取得したイメージ画像は画面に表示できるので、計測 が正確にできたかどうかを確認して次の実験に進めます。蛍光測定機能を追加でき、様々 な研究で活躍する一台です。 ［特長］ 簡 単：オートフォーカスとタッチスクリーンで簡単操作 安 心：取得した画像を見て、必要に応じてフォーカスを微調整 拡 張：GFP 、DAPI 、RFP などの蛍光測定を追加で搭載可能 迅 速：10 µL のサンプルを約 10 秒で測定 小 型：小スペースに設置可能（外形寸法（ W ）228.6mm×（ D ）139.7mm×（ H ）228.6mm ） 必要なライトキューブを追加して手軽に蛍光計測 正確に細胞数を計測 蛍光測定用のライトキューブを最大 2 台まで搭載でき、GFP ベクターの導入効率の測定や蛍光を用い さらに進歩したアルゴリズムにより、凝集した細胞の計測精度が向上しました。 た細胞の生死判定など、幅広いニーズに応えます。 さらなる機能向上へ、充実の関連製品 ライトキューブ 選べる2 種類のスライド 別 売りで D A P I 、G F P 、R F P 等 、様 々 な 波 長に対 応 するライト バイオハザードのリスクを抑える使い捨てタイプと、繰 キューブを提供しています。光源と蛍光フィルターが一体化したユ り返し使える専用のガラススライド（右写真）から、目的 ニットなので、装置への取り付けも簡単です。 に応じてお選びいただけます。 製品名 サイズ 製品番号 Countess ®Ⅱ FL Automated Cell Counter※ 1セット AMQAF1000 価格 Countess ® 専用スライド（ディスポーザブル式） 50 枚 C10228 ¥11,000 Countess ®Ⅱ FL 専用ガラススライド（ FL のみ対応） 1枚 A25750 ¥35,000 ¥550,000 カウント用スライド ライトキューブ（光源＋蛍光フィルター） 製品名 Excitatio（nm） Emission（nm） 対応蛍光色素 製品番号 EVOS ® Light Cube, DAPI 357/44 447/60 DAPI, Hoechst, BFP AMEP4650 ¥250,000 価格 EVOS ® Light Cube, GFP 470/22 510/42 GFP, Alexa Fluor® 488 SYBR ® Green, FITC AMEP4651 ¥250,000 EVOS ® Light Cube, RFP 531/40 593 /40 RFP, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Cy ® 3, DsRed, Rhodamine Red, dTomato AMEP4652 ¥250,000 ※蛍光測定機能をご使用いただくには、別売のライトキューブが必要です。 その他のライトキューブ情報はこちらから → www.lifetechnologies.com/EVOS Next_27.indd 14 14/09/13 14:07 page Molecular Probes® 15 CFSEと同等性能でレッドレーザー励起が可能 ■ CellTrace™ Far Red NEW! フローサイトメーター専用 細胞の世代解析用に in vitro と in vivo で標識追跡するため の試薬です。分裂に伴い希釈される色素の強度を指標に、世 代 数を追 跡します。追 跡できる世 代 数は、実 験に依 存します が、通常 7 ∼ 8 世代（細胞増殖 5 日後）まで追跡できます。レッド レーザーで励起する優れた試薬として、ブルーレーザー励起 の CFSE チャネルとは別のパラメーター測定ができ、実験の 幅が格段と広がります。 ［特長］ ● 633/635nm のレーザーで励起可能 ● 非常に明るく一定に細胞を染色 ● 各世代について別個のピーク CellTrace™ Far Redによる細胞の生体解析 ヒト、Tリンパ球細胞にCellTrace™ Far Red を添加し、5 日後に回収 ● 低毒性 ● 優れた細胞追跡能力 しました。フローサイトメーターで蛍光強度（横軸）と細胞数（縦軸）を 解析。6 世代以上の細胞を追跡できることが示されました。 製品名 サイズ 製品番号 価格 CellTrace™ Far Red Cell Proliferation Kit *for flow cytometry 1 キット C34564 ¥55,700 CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit *for flow cytometry 1 キット C34554 ¥31,500 CellTrace™ Violet Cell Proliferation Kit *for flow cytometry 1 キット C34557 ¥65,100 細胞運動や位置のモニタリングに最適 ! NEW! ■ CellTracker™ Deep Red 細胞運動や細胞の位置をモニターするため蛍光色素です。細胞膜を自由に透過し、一度細胞内に入ると非可逆的な反応で、蛍光色素は 非透過性となります。そのため生細胞に安定に保持され、隣接細胞には移らず、娘細胞のみに移ります。 CellTracker™ Deep Red の創傷治癒解析への適用 新 生 児 ヒト 皮 膚 繊 維 芽 細 胞 を コ ンフ ル エ ントま で 増 殖 後 、L C I S （ L i ve C e l l I m a g i n g S o l u t i o n – A 1 4 2 9 1 DJ ）中で、1 µ M の CellTracker™ Deep Red で 30 分間標識しました。LCIS を除去し、 培地を細胞に添加後、細胞単層にひっかき傷をつけ、傷全体を EVOS ® Auto FL のスキャン機能で画像化しました。治癒過程をモニターする ために、同じ領域を、24 および 48 時間後に再スキャン。新鮮な傷の最 初のスキャンは、傷領域（ 7.25 × 10 6 µm 2 ）を計算するために、EVOS ® Auto FL の測定機能で解析しています。傷の両側の細胞が損傷部位 傷エリア＝7.25×10 6 µm 2 へ移動する様子をモニターできました。 Next_27.indd 15 製品名 サイズ 製品番号 価格 CellTracker™ Deep Red 20 x 15 µg C34565 ¥49,400 14/09/13 14:08 Invitrogen™ page 16 The high-yield Expi293™ transient expression system meets the NEW! 困難な膜タンパク質の発現を実現 高収量の一過性タンパク質発現システム Expi293™ MembranePro™ Expression Syste 膜 タン パク 質 は 、多くの 細 胞 プロセスに 関 わ る 重 要 な 構 成 要 素 で あり 、基 礎 研 究 や 新 薬 開 発 の 鍵 と な る タ ー ゲット で す 。しかし、このような 重 要 なタンパク質 で ある G P C R やトランスポ ー タ ー 、接 着 分 子 、イオン チャン ネ ル お よびウイ ル ス 外 皮タンパク質 は、研 究に十 分 な 量 や 質 を確 保 することが 難しい 場 合 が 多 々 あり ま す 。そ の た め 、イ ン タ クト な 構 造 を 保 ち 、正しい 方 向 で 配 置 さ れ た 、機 能 を 有 する膜タンパク質を高 収 量で回 収する発 現システム へ の 要 望 は 非 常 に強 い も の でした 。この 必 要 性 に応 えるた めに私 た ちは、MembranePro™ Functional Protein Expression Systemと、哺乳 図 1．Expi293 システム によるタンパク質発現 ヒトエリスロポエチン（ EPO ）、Crypto 、およびヒト IgG を FreeStyle™ 293 Expression System（■）とExpi293™Expression System（■）で発現させ、比較しました。タンパク質 の発現は、1mL 、30mL および 1L の培養液中で行い、タンパク質の回収は遺伝子導入後 5 日か ら7 日後に行いました。それぞれの収量はすべて、1L の培養液当たりのタンパク質量（ mg ）で示 しています（ mg/L ）。 類細胞を用いる高収量の一過性タンパク 質発現システム Expi293™ Expression 膜タンパク質発現プラスミド S y s t e m を 組 み 合 わ せ 、E x p i 2 9 3 ™ MembranePro™ Expression Systemを開発しました。 ＋ Expi293™ Expression System は、既 存 の 一 過 性 発 現 法 の 中で、最も高 収 量 の トランスフェクション MembranePro™ 試薬 ＋ ExpiFectamine™ 293トランスフェクション試薬 Expi293F™ 浮遊培養 タンパク質回収が可能で、迅速かつスケー ル調整可能なシステムです。本システムで は、他の培養系に比べて 2 ∼ 10 倍以上のタ 細胞を除去 ンパク質の発現が可能です。これまでに複 数のタンパク質において、1リットルあたり 1 グラムを超える発現量が確認されていま す（図 1 ）。 優れたタンパク質収量を支えるExpi293™ Expression System の鍵となる特徴は、 増 殖 能 が 高 い E x p i 2 9 3 F ™ 細 胞を高 密 度で培 養できる栄 養 豊 富な Expi293™ E x p r e s s i o n M e d i u m 、なら び に 高 密度培養条件での使用に特別に設計 発現 単離された VLP VLPを沈殿 図 2．Expi™293 MembranePro™ のワークフロー Expi293™ Expression Medium 中で、ExpiFectamine™ 293 試薬を用いる推奨プロ トコ ー ルに従 い 、M e m b r a n e P ro ™ 試 薬と目 的 の 膜 タンパク質 を 発 現 するプラスミドを トランスフェクションから48 時間以上後に、遠心分離により培 Expi293F™ 細胞に導入します。 養液から細胞および細胞残骸を除去し、清澄化した培養上清に含まれるVLP を沈殿させ、それを PBSに再懸濁することにより目的の膜タンパク質を含む VLPを回収することができます。 さ れ た 新し いト ラン スフェクション 試 薬 Next_27.indd 16 14/09/13 14:08 page Invitrogen™ 17 Technical Review eets the challenge of difficult to express membrane proteins ssion System Chiou Henry（ Sr.Product Maneger at Thermofisher Scientific ） ExpiFectamine™ 293 およびエンハン り込ませて回収します。これにより、膜タン と MembranePro™ 技術を組み合わせ サ ー 試 薬によって実 現する一 過 性 発 現で パク質は、ナノ脂質粒子中にネイティブな ています。付着細胞を使う従来の発現シス す。すべてのコンポーネントが協力的に機 状態のまま高密度で保持されます。VLP は テムよりも膜タンパク質の収量が 20 倍以 能することにより、発現量が相加的に増加 培養液から容易に回収できるため、膜画分 上に増加し、膜画分に比べて VLP 表面に最 します。 から回収する従来法のワークフローよりも 高で 30 倍濃度の膜タンパク質を保持でき 少ない労力で済みます（図 2 ）。 ます（図 3 ）。これら2 つの技術を組み合わせ MembranePro™ 技術では、自己集合し て細胞表面から排出されたウイルス様粒子 （ VLP ）に過剰発現した膜タンパク質を取 ることにより、困難な膜タンパク質発現を Expi293™ MembranePro™ Expression System は、高発現 Expi293™ system 膜画分 実現する解決法を提供できます。 MembranePro™ VLP Expi293™ MembranePro™ VLP 膜画分 MembranePro™ VLP Expi293™ MembranePro™ VLP タンパク質収量（ µg/µL ） − 0.063 2.79 収量の増加倍数 − 1 44 結合定数（ Kd ） 0.708 nM 0.93 nM 1.06 nM 7.184 39.68 30.08 − 5.5 4.2 特異的結合 Bmax（ pg ligand/mg protein ） VLP 表面の GPCR 濃度倍数 図 3．Expi293™ MembranePro™ Expression System による β2 アドレナリン受容体の発現 GPCR β2 アドレナリン受容体（β2Ar ）の産生について、付着系 293FT 細胞への導入後に膜画分として回収する従来法、同じく付着系の 293FT 細胞を用いた標準的な MembranePro™ プロトコー ル、あるいは Expi293™ と MembranePro™ を併用した Expi293™ MembranePro™ Expression System プロトコールによる方法で比較しました。VLP 量は、標準的なブラッドフォード法で決定しました。膜画分と比較した VLP 上の GPCR の濃縮倍率は、特異的な結合の Bmax 値の比較に基づいて算出しました。MembranePro™ 技術を用いてセロトニン 5HT1a GPCR を発現 させることにより、VLP 上の受容体濃度が 30 倍に増加しました（データ未掲載）。 Next_27.indd 17 製品名 サイズ 製品番号 価格 Expi293™ MembranePro™ Expression Kit 10 反応 A25869 ¥183,800 Expi293™ MembranePro™ Expression Kit 100 反応 A25870 ¥1,449,000 14/09/13 14:08 Life Technologies™ page 18 い つ 行 く ? どうす る ? 海 外 留 学 Title Name アメリカで学んだ 効率よく研究ができる環境と、 自分の考えをはっきり言う文化 宮川 剛 氏（藤田保健衛生大学総合医科学研究所システム医科学研究部門 Number 09 教授） 遺伝子改変マウスを使い精神疾患のメカニズム解明に挑んで 究体制のデザインが効率いいのです」と実感します。この時の いる宮 川 剛 氏 。ポスドク時 代を含め 5 年 弱 留 学したアメリカで 経験は、帰国後携わっている脳科学の研究プロジェクトの運営 は、マサチューセッツ工科大学（ MIT ）の利根川進氏のラボなど 「いか 3ヶ所で PI のステータスやマネージャーも経験しました。 体制にも生かされているといいます。その後、バンダービルト大 学分子神経科学センターに移りマウス行動実験施設の立ち上げ に効率よくするかに頭を使っているのがアメリカ。また議論を メンバーとして PIを経験。のんびりとした田舎での研究には満足 楽しんで、自分の意見をはっきり言えるようになります」と海外 していましたが、そんな中、ラボにかかってきた 1 本の電話がそ 留学を勧めます。 の後の研究生活を変えました。 「リスクをとれ ! 遺伝子改変マウスの行動解析で精神疾患を研究 そうじゃないと研究者は面白くない」 宮川氏は現在、これまで困難と考えられていた疾患モデルマウ 「利根川進ですが」と電話の主は名前を告げ、共同研究をしない スを使い、特定の遺伝子がノックアウトされると脳の神経細胞の かと打診。その後 1 年ほど共同で研究をしたのち、今度は利根川 一部が未熟になり、統合失調症様の症状を示すことを突き止め 「ボス 氏は宮川氏にMIT の自分のラボに来ないかと誘いました。 ました。この研究は、MIT 留学時代の利根川氏らとの共同研究 トンのような研究の中心地に飛び込むのもよさそう」と移るこ から継続しています。もともと、 「自分は研究者になる」と考えて とに。予算もスタッフも多いビッグラボで「インパクトファクター いたという宮川氏。未知のことが多い分野として心理学を専攻。 「ひとりひとり 15 以外は論文ではない」という厳しさの一方で、 「神経科学的なアプローチで心理学を研究することに、目から が自分のプロジェクトを持って主体的に研究をします。入ると研 鱗が落ちました」という二木宏明研究室（東京大学からのちに理 究計画を立案するため、最初の 3 ∼ 6ヶ月は何も実験をせずに議 化学研究所脳科学総合研究センターに移籍）に入りました。そこ 論をしたり考えたりする人も多く、一つの研究に 10 年かけて取 で遺伝子改変マウスの行動異常の解析から遺伝子の働きを調 り組むこともできる研究室でした」 （ 宮川氏）という充実した環境。 べる研究を開始します。 「利根川研はとにかく優秀な人ばかりでした。議論をしても面白 研究体制のデザインが効率的なアメリカのラボ 二木研究室に 7 年在籍し、そろそろ海外留学をしたいと、当時広 まり始めていたインターネットで留学先を探し、 「ウェブフォー ムから応募した」という宮川氏。ポスドクとして最初に在籍した のは National Institute of Mental Health（ NIMH ）の Jacqueline Crawley 博士（以下ジャッキー）のラボ。ポスドク が 2 ∼ 3 人の小さなラボでしたが、そこで「分業が進んでいて、効 率よく実験をやってデータを出し、論文を出すことが印象的。研 い」と大きな刺激に。ただ、念入りに考えて準備をして実験に挑 んでも結果が出ずに研究の世界を去っていく人もいます。 「利 根川先生は『リスクをとれ、そうじゃないと研究者は面白くない 』 とおっしゃっていました」 （ 宮川氏）。 自分の意見をしっかり言い、主体的に選ぼう 活 発に議 論を交わす研 究 文 化 の 中で、留 学 前 以 上に自分 の 意 見をしっかりと述べるようになったという宮川氏。 「海外留学は お勧めです。色々なラボがありますが、どこを選択するかも重要。 自分に合うラボへ移る人もいます。また特に大学院から留学す ることを勧めます。私が行ったアメリカの大学院では、院生が極 めて手厚い教育を受けていました」とアドバイスします。 1993 年東京大学文学部心理学科卒業、1997 年東京大学大学院人文社会系研究科にて博 士（心理学， 東京大学）取得後、理化学研究所研究員、米国国立精神衛生研究所ポスドク研 究員、バンダービルト大学助教授、マサチューセッツ工科大学主任研究員を経て、2003 年 バンダービルド大学での研究生活 Next_27.indd 18 誕生日のサプライズパーティに家族で参加 京都大学医学研究科助教授、2007 年より現職。 14/09/13 14:08 page Life Technologies™ 19 ライフサイエンスにかかわるすべての研究者に新しい出会いの場を提供する「 NEXT FORUM 」。 今年も東京・六本木のニコファーレを舞台に、その模様を全国にリアルタイム配信します。テーマ は「生命の根源に迫る最先端リサーチ」。ゲノム編集・再生医学・がん研究の最前線で活躍する研 究者のレクチャーと、注目の若手研究者や起業家を交えたトークセッション、さらに研究者川柳コ メルマガ新規登録キャンペーン 新しく弊社メルマガに登録された方から抽 ンテストも。テレビなどで人気の MCとともに、素敵なサイエンスナイトをお届けします。 選で、 「実験医学（羊土社）」の半年間の定 10 月 24 日（金）18 時より、ニコファーレから生中継 ! 総計 30 名様にプレゼント! 詳細は、 「 NEXT FORUM 2014 」特設サイトから 講演者 山本 卓 氏（広島大学理学研究科教授） MC 津田 大介 氏（ジャーナリスト） 谷口 秀樹 氏（横浜市立大学医学研究科教授） 石田 紗英子 氏（フリーキャスター） 期 購 読もしくは増 刊 号（ゲノム編 集 等 ）を 締め切り： 2014 年 11 月30 日 総計 30 名に 「実験医学」誌 プレゼント! 藤田 恭之 氏（北海道大学遺伝子病制御研究所教授） ヤングプレゼンター 柴藤 亮介 氏（株式会社エデュケーショナル・デザイン代表取締役社長） 「 NEXT FORUM 2014 」特設サイト： www.lifetechnologies.com/nextforum2014 今村 公紀 氏（京都大学霊長類研究所助教） Next_27.indd 19 14/09/13 14:08 INFORMATION 2014 / October / No.27 iPS 細胞研究に挑戦 ! 高校生向け「 Gibco ® 夏休み特別講座 iPS 細胞実験教室」 夏休み最後の 2 日間、12 人の高校生が、当社ラボで iPS 細胞研究 の画像に目が釘付けに。 「実験操作が楽しくてしょうがない」と嬉 に挑戦しました。1 日目は、繊維芽細胞に山中因子を含む 5 遺伝子 しそうな女子高生、 「 iPS 細胞のコロニーが上手にピックアップで のベクターを導入。2 日目はその観察や、すでに iPS 化した細胞を きるようになった」と自慢げな男子高校生など。楽しくて、充実の 2 マーカーで蛍光染色したり、iPS 細胞のコロニーをピックアップし 日間でした。参加者の中から、将来のノーベル賞受賞者が生まれ て継代する実験です。皆ブルーに染めた iPS 細胞の大きな核や、 ることを楽しみにしています ! 緑のアルカリフォスファターゼ活性、赤く輝くTRA-1 タンパク質 抽選で QUOカード プレゼント ! NEXT 10 月号はいかがでしたか ? 特集は、ヒトの胃がん発生過程を再現するモデルマウス「 Gan マウス」開発者の大島正伸氏です。個体でのがん研究から、がんと微小環 境の関係を解き明かそうとしています。そして Lipofectamine ® 3000 で研究を加速させた北海道大学の大場氏、ゲノム編集の効率を 次世代シーケンサで評価した慈恵医大の鈴木氏のご研究など、多くの方に役立つ情報を掲載。また EVOS ® 顕微鏡の良さをマンガで表 現してみました。ぜひ皆様のご感想をお聞かせください ! 抽選で 10 名様にQuoカード（ 2000 円分）をプレゼントします。 アンケートはこちらから → www.surveymonkey.com/s/NEXT27 photographs: ryouichi morikawa（p.02-03） art direction & design: masami furuta（opportune design） 販売店 公式 Facebook ページ&Twitterもチェック! facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN ● 記載価格は 2014 年 10 月現在の価格です。● 消費税は含まれていません。● 価格は予告なしに変更する場合がありますので あらかじめご了承ください。● 最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の “製品価格と在庫の検索” でご確認いた だけます。● 研究用にのみ使用できます。● 診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。● 記載の社名および製品 名は、弊社または各社の商標または登録商標です。● 販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. © 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. 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