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平成 25 年度 学位論文 マイタケをモデルとした食用
平 成 25 年 度 学位論文 マイタケをモデルとした食用きのこの 栽培工程における子実体生育機構 に関する研究 東京家政大学大学院 人間生活学総合研究科 人間生活学専攻 倉橋 指導教員 藤森 敦 文啓 准教授 論文概要 食用きのこは世界中で食され、特に日本の食卓に欠かせな い食材の一つとなっている。シイタケやマイタケ等の代表的 な食用きのこは、施設栽培が確立されているため年間を通し て安定的に提供されている。しかしながら、食用きのこの生 産現場における栽培環境条件の設定等は、生産者の長年の経 験や勘に基づいていることが多い。食用きのこ生産で行われ ている栽培方法について科学的な検証を行い、それを基に栽 培技術を再構築することで、さらなる生産の効率化や環境の 負荷低減等を成し遂げることができると考えている。その一 つの方策として、食用きのこの栽培工程で発現している遺伝 子を網羅的に解析することによって、各工程で重要な役割を 担っている遺伝子を特定し、その遺伝子の発現量を指標にし たマーカー支援型の栽培工程管理等が考えられる。 商業的に生産される食用きのこの多くは担子菌類に属する。 そ の 多 く は ハ ラ タ ケ 目 に 属 し 、ツ ク リ タ ケ（ マ ッ シ ュ ル ー ム ） やシイタケ、エノキタケ等の良く知られた種類がある。次い で、タマチョレイタケ目に属する種類が多く、マイタケやハ ナビラタケ、ブナハリタケ等がある。しかしながら、生産さ れる種類の多いハラタケ目のきのこを中心に遺伝子解析が行 われており、マイタケをはじめとするタマチョレイタケ目の 遺伝子解析はほとんど行われていない。そこで、産業上重要 な食用きのこであるマイタケをタマチョレイタケ目のモデル として、マーカー支援型の栽培工程管理の可能性について検 証した。 第一に、遺伝子解析が行える基盤を構築するためにマイタ ケの栽培工程で発現する全遺伝子の配列情報（トランスクリ プトーム）を、他の食用キノコとの種間比較をかねてエリン ギ及びブナシメジ、シイタケとともに第二世代型シークエン サーによって決定し、食用キノコのトランスクリプトームデ ータベースを構築した。その結果、マイタケ及びエリンギ、 ブ ナ シ メ ジ 、 シ イ タ ケ か ら そ れ ぞ れ 10,150 個 、 13,038 個 、 12,012 個 、 10,639 個 の 遺 伝 子 が 予 測 さ れ た 。 そ れ ぞ れ の 遺 伝 子の配列について公共データベースに登録されている遺伝子 と 相 同 性 の あ る 遺 伝 子 数 は マ イ タ ケ で 3 8 % 、エ リ ン ギ で 4 3 % 、 ブ ナ シ メ ジ で 42%、 シ イ タ ケ で 48%と 、 ハ ラ タ ケ 目 で あ る 3 種 が 40%以 上 で あ る の に 対 し て タ マ チ ョ レ イ タ ケ 目 の マ イ タ ケ は 38%と 低 か っ た 。 こ の こ と か ら 、 食 用 キ ノ コ の 全 体 の 遺 伝子情報の蓄積は不十分であり、なかでもマイタケは遺伝子 情報が不足していることが確認された。 マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 は 、「 培 養 工 程 」、「 芽 出 し 工 程 」、「 発 生 工程」の 3 つに大別することができる。このマイタケの栽培 工程について、構築したトランスクリプトームデータベース をもとに、マイタケ用のマイクロアレイを作製し、各工程で 発 現 す る 遺 伝 子 と そ の 発 現 パ タ ー ン を 取 得 し た 。そ の 中 か ら 、 熱 シ ョ ッ ク 蛋 白 質 9(Gf.HSP9)遺 伝 子 等 の 子 実 体 分 化 に 伴 っ て 発現量が増大する遺伝子群を見出した。このような遺伝子の 発現パターンは、栽培工程が順調に進んでいるかどうかをモ ニタリングするためのマーカーとして有用であると考えた。 さ ら に 、 Gf.HSP9 遺 伝 子 は 、 マ イ タ ケ の み な ら ず エ リ ン ギ 及 びブナシメジにおいてもそれらの子実体分化に伴って発現量 も上昇していた。このことは、本研究で得られたマイタケで 特定した子実体生育に関わる遺伝子情報は、その他の食用キ ノコ一般に有用であることを示している。 食用きのこ栽培における環境制御は、光、温度、湿度、ガ ス濃度、風速と多岐にわたる。光は、子実体生育開始のトリ ガーとして知られ、重要な環境因子の一つである。そこでマ イタケにおける光応答についての知見を深めるために、青色 光下と近紫外光下でマイタケの子実体分化・生育を行い、そ れらで発現している遺伝子の解析を行った。その結果、青色 光下と近紫外光下のいずれでも、子嚢菌のメラニン合成に関 わ る BMR1 遺 伝 子 の ホ モ ロ グ で あ り 転 写 因 子 を コ ー ド し て い る Gf.BMR1 遺 伝 子 の 発 現 が 強 く 誘 導 さ れ て い た 。青 色 光 下 と 近紫外光下のいずれも生育した子実体はメラニン含有量に比 例 し て 黒 く 着 色 し て い た 。 こ の こ と か ら 、 Gf.BMR1 遺 伝 子 の ように環境と表現型に関連する遺伝子の発現量をマーカーと することで、色や形などの経済形質を任意に制御することが 可能であることを示した。 正常な子実体生育の遺伝子解析だけでなく、突然変異によ る子実体生育不全株との比較を行うことで子実体生育に関与 する遺伝子を探索した。その結果、正常な子実体生育では発 現 が 低 く 抑 え ら れ て い る が 、 生 育 不 全 株 で は そ れ の 100 倍 以 上となる高発現を示していた、転写因子をコードしている酵 母 の CRZ1 遺 伝 子 の ホ モ ロ グ で あ る Gf.CRZ1 遺 伝 子 を 見 出 し た 。 Gf.CRZ1 遺 伝 子 は 、 子 実 体 生 育 不 全 株 の 種 菌 で も 高 発 現 し て お り 、G f . C R Z 1 遺 伝 子 の 発 現 量 を マ ー カ ー と す る こ と で 、 この不良形質を種菌の段階で選別することが可能となった。 つまり、遺伝子の発現量をマーカーとすることで優良種菌の 選別が可能であることを示した。 本研究により、伝子の発現量を指標にしたマーカー支援型 の栽培工程管理が可能であることを示した。今後は、工程管 理を行うための十分な数のマーカーを樹立することが課題で ある。さらに、本研究を進める過程でマイタケをはじめとす る食用キノコのトランスクリプトーム情報を整備するととも に、マイタケの栽培工程における大規模な遺伝子情報を提供 できるようになった。マイタケをはじめとする食用キノコの 子実体生育の分子メカニズムを解明していく過程で、意義あ る基盤情報になると考えている。 Summary of Thesis Edible mushrooms are eaten all over the world and are frequently used in Japanese cuisine. The major edible mushrooms in Japan, such as Lentinula edodes (shiitake) and Grifola f ro n d o s a (maitake), are mass -produced at mushroom production facilities. Howe ve r, i n m a n y c a se s t he e nvi r onm e nt a l c ondi t i ons u se d for mushroom cultivation are set based on the cultivators’ experience alone, without verification of their effectiveness. By experimentally determining and verifying the optimal environmental conditions for cultivating edible mushrooms, their production can be made more efficient and less environmentally impactful. One possible approach for verifying these conditions is marker-a ssisted mana gement of the cultivation process, as it allows for consideration of index gene expression le vels. Many edible mushrooms produced commercially belong to Ba si di om yc ot a . Wi t h i n this contains many well-known bisporus velutipes (common division, edible mushroom), (enokitake). Order L. the species edodes, Polyporales order Agaricales such as and Agaricus Flammulina contains edible m u s h r o o m s s u c h a s G . f ro n d o s a a s w e l l . Ho w e ve r, m o s t ge n e t i c a na l yse s of e di bl e m ushr oom s ha ve foc u se d m a i nl y on Aga ri c a l e s, a n d t h e r e a r e f e w s t u d i e s o n s p e c i e s i n P o l y p o r a l e s . I n t h i s s t u d y, we therefore examined in deta il the gene s expre ssed during the cultivation process and their e xpression patterns, with an aim to elucidate the molecular mechanisms of fruiting body d e ve l o p m e n t , u s i n g G . f ro n d o s a a s a m o d e l o r ga n i s m o f a n e d i b l e mushroom species in Polyporales. Fir st, because of a lack of published ge netic information, w e d e t e r m i n e d t h e t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c e s o f G . f ro n d o s a d u r i n g c u l t i v a t i o n u s i n g a s e c o n d - g e n e r a t i o n D N A s e q u e n c e r. We a l s o d e t e r m i n e d t h e t r a n s c r i p t o m e s o f P l e u ro t u s e r y n g i i , H y p s i z y g u s m a r m o re u s , a n d L . e d o d e s f o r c o m p r e h e n s i ve ge n e a n a l y s i s , which predicted genome sizes of 10,150, 13,038, 12,012, and 1 0 , 6 3 9 g e n e s f o r G . f r o n d o s a , P. e r y n g i i , H . m a r m o r e u s , a n d L . e d o d e s , r e s p e c t i v e l y. W h e n a B L A S T s e a r c h w a s p e r f o r m e d , 3 8 % , 4 3 % , 4 3 % , a n d 4 8 % o f t h e g e n e s f o r G . f r o n d o s a , P. e r y n g i i , H . m a r m o r e u s , a n d L . e d o d e s , r e s p e c t i v e l y, h a d s i g n i f i c a n t m a t c h e s in the database. These results show that information on the molecular biology of edible mushrooms is still lacking; p a r t i c u l a r l y f o r G . f ro n d o s a , w h i c h h a d t h e l e a s t a m o u n t o f deposited information. S e c o n d l y, w e i n v e s t i g a t e d t h e e x p r e s s e d g e n e s a n d t h e i r e x p r e s s i o n p a t t e r n s d u r i n g t h e G . f ro n d o s a c u l t i va t i o n p r o c e s s using a microarray created from the measured transcriptome i n f o r m a t i o n . T h e c u l t i va t i o n p r o c e s s f o r G . f ro n d o s a o c c u r s i n three parts: spa wn run, primordia development, and fruiting body differentiation. Spawn run is a necessary step in mushroom produc t i on be c a use suffi c i e nt m yc e l i um m u st be form e d pri o r t o fruiting body de velopment. To facilitate this production, enzymes related to wood degradation and some proteases associated with assimilation of cultur e medium components were highly expressed. In contrast, the expression levels of these gene s were lower in the primordia development and fruiting differentiation steps, repre senting a shift from ve getative to sexual reproduction. The ge nes coding for prote ins suc h as metalloproteases and heat shock protein 9 (HSP9) that are highly expressed in differentiation primordia steps de velopment were and identified. fruiting body gene s were These c onsi de re d t o be re l a t e d t o di ffe re nt i a t i on of t he frui t i n g bo d y; in p a rt i c ul a r, HSP9 homolog genes in P. eryngii and H. m a r m o re u s h a d t h e s a m e e x p r e s s i o n p a t t e r n i n e a c h s t e p o f t h e c u l t i va t i o n p r o c e s s a s d i d t h o s e i n G . f ro n d o s a . T h e s e r e s u l t s n o t o n l y p r o vi d e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e f r u i t i n g o f G . f ro n d o s a b u t also reveal the common mechanisms of fruiting body differentiation in edible mushrooms. Environmental factors to be controlled in edible mushroom c u l t i v a t i o n c o m p r i s e a w i d e v a r i e t y, s u c h a s l i g h t , t e m p e r a t u r e , h u m i d i t y, gas concentration, especially important differentiation in knowledge light on and environmental basidiomycetes. signaling in wind speed. factor for To add these Li ght is an fruiting body to the body of fungi, we therefore explored the genes related to light re sponse. As a re sult, we identified a putative transcription factor Gf.BMR1 that was expressed under blue light and near -ultra violet (NUV) light. This gene is a homolog of the melanin biosynthesis re gulation protein BMR1 in Bipolaris ory zae . This is the first inve stigation to demonstrate that the BMR1 of basidiomycetes, which is hom ol o gou s t o t he BMR 1 of a sc om yc e t e s, i s i nduc e d b y N UV light as in ascomycetes. understanding signaling the G. of These mechanism f ro n d o s a of results provide NUV light pathwa ys and and a clue blue contribute to for light the improvement of light conditions for mushroom production. We also investigated genes involved in fruiting body di ffe re nt i a t i on t hrou gh ge ne t i c a na l ysi s of not o nl y a nor m a l f r u i t i n g b o d y s t r a i n b u t a l s o f r u i t i n g b o d y m u t a n t s . We f o u n d that the Gf.CRZ1 gene was expressed more than 100 -fold in mutants than it was in the normal fruiting body strain. Therefore, this gene is likely silenced in normal fruiting body differentiation. In conclusion, this study developed information re garding the transcriptome of edible mushrooms and uncove red many gene s related to fruiting body differentiation. Continuation of this comparative analysis will provide more information for u n d e r s t a n d i n g f r u i t i n g b o d y d i ff e r e n t i a t i o n i n G . f ro n d o s a a n d will further contribu te to the improvement of edible mushroom production. In the future, it will be necessary to dissect the gene s identified in this paper using gene disruption overexpression assa ys to uncover their specific functions. and 平 成 25 年 度 学位論文 マイタケをモデルとした食用きのこの 栽培工程における子実体生育機構 に関する研究 東京家政大学大学院 人間生活学総合研究科 人間生活学専攻 倉橋 敦 指導教員 藤森 文啓 准教授 目次 マイタケをモデルとした食用きのこの栽培工程における 子実体生育機構に関する研究 目次 第 1 章 緒論 1.1. 研究の背景と目的・・・・・・・・・・・・・・・1 1.2. マイタケとその栽培工程について・・・・・・・・・6 1.2.1. マイタケの各部名称・・・・・・・・・・・・・6 1.2.2. マイタケの栽培工程・・・・・・・・・・・・・7 1.3. 論 文 の 構 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 11 参 考 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 13 第 2 章 食用きのこの栽培工程で発現するトランスクリプト ーム情報の取得 2.1. 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 16 2.2. 実 験 材 料 と 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 19 2.2.1. 菌 株 及 び 菌 糸 培 養 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 19 2.2.2. 栽 培 条 件 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 19 2.2.3. 全 RNA の 抽 出 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 20 2.2.4. mRNA の 網 羅 的 配 列 決 定 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 22 2.2.5. ORF 予 測 と ア ノ テ ー シ ョ ン ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 22 2.3. 結 果 と 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 28 2.3.1. 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー 454 に よ る mRNA シ ー ク エ ン シ ン グ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 28 i 目次 2.3.2. 2.4. ORF 予 測 と ア ノ テ ー シ ョ ン 解 析 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 30 ま と め ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 33 参 考 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 35 第 3 章 マイタケ栽培工程における発現遺伝子プロファイル の解析 3.1. 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 40 3.2. 実 験 材 料 と 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 42 3.2.1. 菌 株 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 42 3.2.2. 栽 培 条 件 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 42 3.2.3. マ イ ク ロ ア レ イ 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 42 3.2.4. ク ロ ー ニ ン グ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 43 3.2.5. 熱 シ ョ ッ ク ス ト レ ス ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 43 3.2.6. 定 量 PCR 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 43 3.2.7. 塩 基 配 列 解 析 と タ ン パ ク 質 モ デ リ ン グ ・ ・ ・ ・ ・ 44 3.3. 結 果 と 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 47 3.3.1. 培 養 工 程 で 高 発 現 す る 遺 伝 子 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 47 3.3.2. 芽 出 し 工 程 で 発 現 変 動 す る 遺 伝 子 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 50 3.3.3. 発 生 工 程 で 発 現 変 動 す る 遺 伝 子 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 53 3.3.4. マ イ タ ケ Gf.HSP9 遺 伝 子 の 全 長 ク ロ ー ニ ン グ ・・ 55 3.3.5. 食 用 き の こ に お け る Gf.HSP9 ホ モ ロ グ の 探 索 ・・ 58 3.3.6. 栽 培 工 程 中 に お け る HSP9 の 発 現 パ タ ー ン ・ ・ ・ 58 3.4. ま と め ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 89 参 考 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 93 ii 目次 第 4 章 マイタケ発生工程における光応答性遺伝子の探索 4.1. 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 101 4.2. 実 験 材 料 と 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 103 4.2.1. 菌 株 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 103 4.2.2. 栽 培 条 件 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 103 4.2.3. メ ラ ニ ン 量 の 測 定 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 103 4.2.4. マ イ ク ロ ア レ イ 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 104 4.2.5. 定 量 PCR 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 104 4.2.6. 塩 基 配 列 解 析 と タ ン パ ク 質 モ デ リ ン グ ・ ・ ・ ・ 106 4.3. 結 果 と 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 107 4.3.1. マイタケの菌傘発達における青色光と近紫外光の 効 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 107 4.3.2. 青色光と近紫外光による転写因子コード遺伝子 Gf.BMR1 の 誘 導 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 108 4.3.3. 4.4. G f . B M R 1 の 遺 伝 子 の 構 造 と 推 定 機 能 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 11 0 ま と め ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 118 参 考 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 120 第 5 章 マイタケの子実体生育不全株を用いた子実体分化に 関わる遺伝子の探索 5.1. 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 125 5.2. 実 験 材 料 と 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 127 5.2.1. 菌 株 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 127 5.2.2. 栽 培 条 件 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 127 5.2.3. マ イ ク ロ ア レ イ 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 127 iii 目次 5.2.4. ク ロ ー ニ ン グ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 127 5.2.5. 配 列 解 析 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 128 5.2.6. 定量 5.3. PCR 実 験 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 128 結 果 と 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 130 5.3.1. Gf-A1 株 で 差 示 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 群 ・ ・ ・ ・ 130 5.3.2. Gf-A4 株 で 差 示 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 群 ・ ・ ・ ・ 130 5.3.3. Gf-A1 株 及 び Gf-A4 株 に 共 通 す る 差 示 的 発 現 遺 伝 子 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 131 5.3.4. Gf.CRZ1 の 遺 伝 子 構 造 と そ の 機 能 の 予 測 ・ ・ ・ 132 5.3.4 遺伝子マーカーによる不良種菌選別方法の検 5.4. 133 ま と め ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 150 参 考 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 152 第 6 章 総 合 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 153 本 論 文 を 構 成 す る 学 術 論 文 及 び 学 会 発 表 等 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 161 用 語 説 明 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 165 謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 168 iv 第一章 緒論 第 1 章 1.1. 緒論 研究の背景と目的 食用きのこは、世界中で食され、特に日本の食卓に欠かせ ない食材の一つである。食用きのこは、生物学的には担子菌 類または子嚢菌類に属する菌類であり、食用とするのはそれ ら が 形 成 す る 子 実 体 で あ る 。、図 1 - 1 に 示 す よ う に 商 業 的 に 生 産されている食用きのこの多くは担子菌類に属する。中でも ハ ラ タ ケ 目 (Agaricales)[1] に 分 類 さ れ る 食 用 き の こ の 種 類 が 最も多く、よく知られているマッシュルーム (ツ ク リ タ ケ Agaricus bisporus)や シ イ タ ケ (Lentinula edodes)、 エ ノ キ タ ケ (Flammulina velutipes)等 が あ る 。 ハ ラ タ ケ 目 以 外 で は 、 タ マ チ ョ レ イ タ ケ 目 (Polyporales)[2] に 属 す る マ イ タ ケ (Grifola f ro n d o s a ) や ハ ナ ビ ラ タ ケ ( S p a r a s i s crispa) 、 キ ク ラ ゲ 目 (Auriculariales) の ア ラ ゲ キ ク ラ ゲ (Auricula auricular) な ど が ある。ハラタケ目のきのこは一般的に軟質で、明確に区別で き る 菌 柄 と 菌 傘 を 有 し 、胞 子 形 成 組 織 で あ る 子 実 層 托 は 襞（ ま たは管孔）状を呈する。一方、タマチョレイタケ目に属する きのこの多くは硬質で、菌柄と菌傘は明確に区別できず、胞 子形成組織である子実層托は管孔状を呈している。 食用きのこの生産は、露地栽培と施設栽培の二種類に大別 さ れ 、近 年 は 周 年 栽 培 が 可 能 な 施 設 栽 培 が 主 流 と な っ て い る 。 露地栽培における多くの食用きのこの発生時期は春または秋 で あ る が 、シ イ タ ケ 、エ ノ キ タ ケ 、ナ メ コ ( P h o l i o t a n a m e k o ) 、 マイタケ等の代表的な食用きのこは人工栽培技術が確立され 1 第一章 緒論 ているため周年栽培が可能な大規模施設栽培が主流となり年 間を通して安定的に提供されている。このように日本は、大 規模施設栽培による食用きのこ生産を安定的に行える技術を 有している。しかしながら、食用きのこの生産現場における 栽培環境条件の設定等は、生産者の長年の経験に基づいてい ることが多い。食用きのこ生産で行われている栽培方法につ いて科学的な検証を行い、それを基にした栽培技術を再構築 することで、さらなる生産の効率化や環境の負荷低減等を成 し 遂 げ る こ と が で き る と 考 え て い る 。そ の 一 つ の 方 策 と し て 、 食用きのこの栽培工程中に発現している遺伝子を網羅的に解 析することによって、各工程で重要な役割を担っている遺伝 子を特定し、それら遺伝子の発現量を指標にしたマーカー支 援 型 の 栽 培 工 程 管 理 等 が 考 え ら れ る （ 図 1 - 2 ）。 ま た 、 そ れ に 合わせて食用きのこの分子生物学的知見を深めることで、分 子 育 種 に よ る 菌 株 開 発 や マ ツ タ ケ ( Tr i c o h o l o m a m a t s u t a k e ) に 代表される植物（多くは樹木）との共生関係にあって栽培が 困難な菌根性食用きのこの人工栽培への応用が期待される。 食用きのこの子実体生育に関する網羅的な遺伝子解析は、 世 界 第 一 位 の 生 産 量 の ツ ク リ タ ケ で 最 も 進 ん で お り [ 3 , 4 ] 、シ イ タ ケ [ 5 ] や エ ノ キ タ ケ [ 6 ] 等 が 続 く 状 況 で あ る が 、ま だ ま だ 不 十分な状況である。さらに、これらはいずれもハラタケ目で あり、マイタケをはじめとするタマチョレイタケ目の子実体 生育についての研究はほとんど行われていない。そこで、産 業応用上重要なマイタケをタマチョレイタケ目のモデルキノ コとして、その栽培工程における子実体生育機構の分子メカ 2 第一章 緒論 ニズムの解明を最終目標とし、本論文ではそのための基盤と なる遺伝子情報の整備を目的とし、マイタケの栽培工程で発 現する遺伝子とその発現パターンについて詳細に研究を行っ た。 3 第一章 緒論 図 1-1 人 工 栽 培 さ れ て い る 主 な 食 用 担 子 菌 類 き の こ の 分 類 食用きのこの食用部は、担子菌類ないしは子嚢菌類の子実 体であり、人工栽培が可能な食用このこの多くはハラタケ目 やタマチョレイタケ目、キクラゲ目の担子菌類に属する。本 論文の主な実験材料であるマイタケはタマチョレイタケ目に 属する。 4 第一章 緒論 図 1-2 食用きのこ栽培における工程管理の課題例 食 用 き の こ 栽 培 は 、経 験 と 勘 に よ っ て 構 築 さ れ て い る 部 分 が多くあり、科学的に体系化されているとは言えない。栽培 工程のモニタリングは、温度や湿度といった少ない指標のみ で管理されるため、経済的に不良な形質となることがある。 そこで、優良な形質となるときの遺伝子発現パターンをリフ ァレンスとして、そのような遺伝子発現パターンになるよう に栽培工程を先行管理することで優良な形質のきのこだけを 生産できるようになると考えている。 5 第一章 緒論 1.2. 1.2.1. マイタケとその栽培工程について マイタケの各部名称 本 論 文 に お け る マ イ タ ケ 子 実 体 の 各 部 名 称 は 、 図 1-3 に 示 すように、菌床は菌糸が蔓延している培地、菌蓋は菌床上部 に発達した子実体との境界部に存在する柔組織、菌茎は菌蓋 と菌柄を繋ぐ白色肉分、菌柄は菌茎と菌傘部を繋ぐ部分（管 孔 の 形 成 が 認 め ら れ な い こ と で 菌 傘 と 区 別 さ れ る ）、菌 傘 は 菌 柄 よ り 先 の 部 分 で 裏 面 に 管 孔 を 形 成 す る 部 分 を 示 す [7]。 図 1-3. マ イ タ ケ 菌 床 及 び 子 実 体 の 各 部 名 称 マイタケの菌床と子実体の各部名称を矢印で示す。 6 第一章 緒論 1.2.2. マイタケの栽培工程 マ イ タ ケ は 、 図 1-4 に 示 す よ う に 「 培 養 工 程 」 と 呼 ば れ る 菌糸伸長期間中に徐々に原基が形成され、 「 芽 出 し 操 作 」と 呼 ばれる培養温度の降下と光照射強度を上げることによって子 実 体 原 基 を 成 熟 さ せ る [ 8 ] 工 程 を 「 芽 出 し 工 程 」 と 呼 ぶ 。、 原 基 表 面 全 体 の 色 が 白 色 ( 図 1 -5 A, a) か ら 暗 黒 色 (b) へ の 変 化 が 認められると、栽培袋の上部を開封して原基から子実体への 分化生育を促す。この工程を「発生工程」と呼ぶ。栽培袋の 上 部 を 開 封 し て か ら 3-4 日 た つ と 滑 ら か で あ っ た 原 基 表 面 に 無 数 の 突 起 が 形 成 さ れ (c)、 こ れ が 伸 長 し て 菌 柄 と な り 、 さ ら に分岐し棒状に伸長しながら先端部が伸長展開していくこと で 、 菌 傘 を 形 成 す る (d)。 こ の 段 階 で は 菌 傘 の 裏 に は 管 孔 は 形 成されていないが、さらに子実体生育が進むと菌傘が十分に 展 開 し 、 裏 面 に 無 数 の 管 孔 が 形 成 さ れ る (e)。 食 用 き の こ で は ないが、マイタケと同様タマチョレイタケ目であるアミスギ タ ケ ( P o l y p o r u s a rc u l a r i u s ) [ 9 ] に お い て も 子 実 体 の 発 達 は 原 基 、 菌柄の伸長、菌傘の展開はの順序で進行する。ハラタケ目は 図 1 - 5 B に 示 す よ う に 、原 基 が 目 視 で 確 認 さ れ る と き に は 、既 に菌傘、菌柄と襞への分化は終っており、子実体の生育と分 化が同時進行するタマチョレイタケ目とは大きく異なる。本 論文では、子実体分化とは原基から菌柄、菌傘、管孔形成す る期間を指し、菌糸塊形成、原基形成、子実体分化を含む全 体の期間を子実体生育と呼称する。よって、子実体分化は栽 培工程における発生工程を限局的に指し、それを含む子実体 7 第一章 緒論 生育（栽培工程における培養工程の一部と芽出し工程、発生 工程）とを明確に区別して用いる。 8 第一章 緒論 図 1-4. マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 と 各 工 程 に お け る マ イ タ ケ 子 実 体生育の様子 上段にマイタケの栽培工程を、下段にそのときの子実体の 生育状況を示す。 「 培 養 工 程 」で 菌 糸 が 培 地 に 蔓 延 し 、菌 蓋 の 形成とともに徐々に菌蓋部上に原基の生育が進行し、 「芽出し 工 程 」と「 発 生 工 程 」で 子 実 体 の 生 育 分 化 が 急 速 に 進 行 す る 。 9 第一章 緒論 図 1-5. マ イ タ ケ の 子 実 体 分 化 の 様 子 A: マ イ タ ケ の 子 実 体 分 化 の 様 子 。 光 照 射 と 温 度 低 下 の 刺 激 に よ っ て 原 基 が 成 熟 し ( b ) 、菌 柄 の 伸 長 ( c ) に 続 い て 菌 傘 の 展 開 が 起 こ り 生 育 し て い く (d)。菌 傘 が 展 開 す る と 管 孔 の 形 成 が 進 行 す る (e)。 B: ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ の 子 実 体 分 化 の 様 子 。 原 基 形 成（ 図 中 pri m or di um d a y2 ）の と き に 菌 傘 、襞 及 び 菌 柄 が分化し、そのままのかたちで伸長していく。 10 第一章 緒論 1.3. 論文構成 タマチョレイタケ目の食用きのこ栽培における科学的知見 を広げるために、そのモデルとしてマイタケを用い、本論文 で は 図 1-6 に 示 す 構 成 の も と に マ イ タ ケ の 子 実 体 生 育 に 関 与 する遺伝子について研究を行った。本研究を始める段階にお いて公共データベースに登録されていたマイタケ遺伝子はわ ずか 8 個に過ぎず、有効な分子生物学的解析が行える状況に なかった。そこで、第一にマイタケの分子生物学的研究の基 盤構築として、近年普及してきた第二世代型シークエンサー を用いてマイタケ栽培工程で発現している遺伝子のの配列を 網羅的に決定し、トランスクリプトームデータベースを作成 し た（ 第 2 章 ）。こ の デ ー タ ベ ー ス か ら マ イ ク ロ ア レ イ を 作 製 し、マイタケの栽培工程で発現する遺伝子及びそのプロファ イルを取得し、子実体生育に関与する候補遺伝子の同定を行 っ た （ 第 3 章 ）。 マ イ タ ケ 栽 培 に お い て 光 、 温 度 、 湿 度 、 各 種 ガス濃度及び風速は重要な環境要因であるが、特に子実体誘 導に重要とされる光照射に着目し、光照射時に発現する遺伝 子 の 特 定 も 行 っ た （ 第 4 章 ）。 次 に 、 マ イ タ ケ の 正 常 発 生 株 か らだけでなく、子実体の生育不良を示す変異株の発現パター ン解析からも子実体生育に関与する候補遺伝子群の特定を行 っ た （ 第 5 章 ）。 最 後 に 総 合 考 察 と し 、 第 2 章 か ら 第 5 章 に お いて得られた成果を摘要し、今後の課題と展望について論じ た （ 第 6 章 ）。 11 第一章 緒論 図 1-6. 本 論 文 の 構 成 12 第一章 緒論 参考文献 1. 国 立 科 学 博 物 館 著 (2008). 菌 類 の 不 思 議 － 形 と は た ら き の驚異の多様性, 東海大学出版. 2 . H i b b e t t , D . S . , M . B i n d e r , J . F. B i s c h o f f , M . B l a c k w e l l , P. F. C a n n o n , O . E . E r i k s s o n , S . H u h n d o r f , T. J a m e s , P. M . K i r k , R . L ü c k i n g , T. Lumbsch , F. L u t z o n i , P. B . M a t h e n y, D . J . M c l a u g h l i n , M . J . P o w e l l , S . R e d h e a d , C . L . S c h o c h , J . W. S p a t a f o r a , J . A . S t a l p e r s , R . Vi l g a l y s , M . C . A i m e , A . A p t r o o t , R . B a u e r , D . B e g e r o w, G . L . B e n n y, L . A . C a s t l e b u r y, P. W. C r o u s , Y. - C . D a i , W. G a m s , D . M . G e i s e r , G . W. G r i f f i t h , C . Gueidan, D. L. Hawk swo rth, G. Hestmark, K. Hosaka, R. A. H u m b e r , K . H y d e , J . E . I r o n s i d e , U . K õ l j a l g , C . P. K u r t z m a n , K. -H. Lar ss on, R. Lichtwardt, J . Lon gcore, J . Miądliko ws ka, A. Mi l l e r, J.-M. Moncalvo, S. Mozle y-Standridge, F. O b e r w i n k l e r , E . P a r m a s t o , V. R e e b , J . D . R o g e r s , C . R o u x , L . R y v a r d e n , J . P. S a m p a i o , A . S c h ü ß l e r , J . S u g i y a m a , R . G . T h o r n , L . T i b e l l , W. A . U n t e r e i n e r , C . Wa l k e r , Z . Wa n g , A . We i r , M . We i ß , M . M . W h i t e , K . W i n k a , Y. - J . Ya o , a n d N . Zha n g (200 7). A hi ghe r -l e ve l ph yl o ge ne t i c c l a ssi fi c a t i on o f t he Fun gi . My c ol ogi c al R e se arc h 111 : 5 09 -54 7. 3 . M o r i n E , K o h l e r A , B a k e r A R , F o u l o n g n e - O r i o l M , L o m b a r d V, Na gy LG, Ohm R A, Pa t ysha k ul i ye va A, Brun A, Ae rt s A L, Baile y AM, Billette C, Coutinho PM, Deakin G, Doddapaneni H, Floudas D , Grimwood J , H ildén K, Küe s U , Labutti KM, L a p i d u s A , L i n d q u i s t E A , L u c a s S M , M u r a t C , R i l e y R W, 13 第一章 緒論 S a l a m o v A A , S c h m u t z J , S u b r a m a n i a n V, W ö s t e n H A , X u J , E a s t w o o d D C , F o s t e r G D , S o n n e n b e r g A S , C u l l e n D , d e Vr i e s R P, L u n d e l l T, H i b b e t t D S , H e n r i s s a t B , B u r t o n K S , K e r r i g a n RW, C h a l l e n M P, G r i g o r i e v I V, M a r t i n F ( 2 0 1 2 ) . G e n o m e sequence of the button mushroom Agaricus bisporus re veals mechanisms governing adaptation to a humic -rich ecological n i c h e . P ro c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s 1 0 9 : 17501-17506; doi: 10.1073/pnas.1206847109. 4. Pat yshakuli ye va A, Jurak E, Kohler A, Ba ker A, Battaglia E, d e B r u i j n W, B u r t o n K S , C h a l l e n M P, C o u t i n h o P M , E a s t w o o d D C , G r u b e n B S , M ä k e l ä M R , M a r t i n F, N a d a l M , v a n d e n Br i n k J , Wi e b e n ga A , Z h o u M , He n r i s s a t B, K a b e l M , Gr u p p e n H, de Vr i e s RP (2013). Carbohydrate utilization and metabolism is highly differe ntiated in Agaricus bisporus. B MC Ge no mi c s 14 : 663; doi :10 .1186 /1471 -2164 - 14 -663 . 5 . C h u m W W, N g K T, S h i h R S , A u C H , K w a n H S ( 2 0 0 8 ) . G e n e expression studies of the dikaryotic m yc e l i um and primordium of Lentinula edodes by serial analysis of gene Mycological expression. R e s e a rc h 11 2 : 950-964; doi.org/10.1016/j.mycres.2008.01.028. 6 . v a n P e e r A F, P a r k S Y, S h i n P G , J a n g K Y, Yo o Y B , P a r k Y J , L e e B M , S u n g G H , J a m e s T Y, K o n g W S ( 2 0 1 1 ) . C o m p a r a t i v e genomics of the mating -type loci of the mushroom Flammulina velutipes re veals widespread synteny and recent 14 第一章 緒論 PLos inversions. One 6: e22249; doi: 10.1371/journal.pone.0022249. 7. 庄 司 当 (1996). マ イ タ ケ － 栽 培 か ら 加 工 ・ 売 り 方 ま で . 農 山漁村文化協会. 8. 株 式 会 社 プ ラ ン ツ ワ ー ル ド (2010). 施 設 空 調 型 マ イ タ ケ 栽 培 の 最 新 技 術 , 最 新 き の こ 栽 培 技 術 2010 年 度 版 き の こ 年 鑑 別 冊 pp. 167 -174. 9. 堀 越 孝 雄 (1983). サ ル ノ コ シ カ ケ 類 の 子 実 体 生 育 . 植 物 と 自 然 17: 9-12 15 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 第 2 章 食用きのこの栽培工程で発現する トランスクリプトーム情報の取得 2.1. 序 論 ツクリタケ (Agaricus bisporus) [1] や シ イ タ ケ (Lentinula edodes) [2]な ど の ハ ラ タ ケ 目 (Agaricales) の 食 用 き の こ に お いては、ゲノム解読や発現遺伝子解析から遺伝子情報の蓄積 が 進 め ら れ て い る 。 一 方 、 タ マ チ ョ レ イ タ ケ 目 (Polyporales) の食用きのこに至っては、そのような遺伝子解析がほとんど おこなわれていない状況である。一般的に、網羅的な発現遺 伝 子 解 析 に は マ イ ク ロ ア レ イ 法 や SAGE 法 が よ く 用 い ら れ る が、マイクロアレイ法を行うにはゲノムまたはトランスクリ プ ト ー ム 情 報 が 、 SAGE 法 で は 数 十 bp ほ ど の 短 い DNA 断 片 を取り扱うために、効率的に発現遺伝子を同定するにはゲノ ム 情 報 が 不 可 欠 で あ る 。 2005 年 以 前 は 、 主 に 蛍 光 標 識 し た 4 種類のジデオキシヌクレオチドを使用するサンガー法による 配列決定が行われており、塩基配列の読み取り量が少なく、 ゲノムを解読するには莫大なコストを要したことから、ヒト [ 3 ] を は じ め と し て 、チ ン パ ン ジ ー [ 4 ] や マ ウ ス [ 5 ] 、ニ ワ ト リ [ 6 ] 、 フ グ [7]等 の い わ ゆ る モ デ ル 生 物 が 主 な 対 象 と な り 、そ の 多 く が国際コンソーシアムとしてゲノム解読が行われた。そのた め、非モデル生物における遺伝子解析は、マイクロアレイ法 などよりも網羅性が劣り、工程数の多いディファレンシャル ディスプレイ法やサプレッションサブトラクティブハイブリ ダイゼーション法などで差示的に発現する遺伝子を個別にク 16 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 ローニングして解析されることが多く、食用きのこについて も同様の状況であった。 し か し 2 0 0 5 年 以 降 、圧 倒 的 な 配 列 量 を 安 価 に 、し か も 短 時 間で得られるいわゆる次世代型シークエンサーが登場し、モ デル生物以外の生物のゲノム解読が著しく増加してきている。 担子菌類の形態形成の研究には平板培養等でも容易に子実体 を 形 成 す る ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ ( C o p r i n o p s i s c i n e re u s ) が 多 く 用 い ら れ [8]、子 実 体 生 育 に 関 与 す る 重 要 な 遺 伝 子 が い く つ か ク ロ ー ニ ン グ さ れ て い る [9,10]。 ま た 、 2003 年 に は 、 そ の ゲ ノム配列が公開され、遺伝子の網羅的な解析が進められてい る [11] 。 子 実 体 を 形 成 す る 担 子 菌 類 に お い て も 第 二 世 代 型 シ ークエンサーが登場後、菌根性のオオキツネタケ bicolor)[12] 、 木 材 不 朽 性 の ス エ ヒ ロ タ ケ (Laccaria (Schizophyllum commune)[13]、 腐 生 性 の ツ ク リ タ ケ [1]等 、 ゲ ノ ム 解 析 生 物 種 の数が他の生物と同様に急増してきている。しかし、その多 くは米国エネルギー省が先導している木材等の未利用資源か らのエネルギー生産技術開発を主眼とする研究のなかで行わ れており、食用きのこ生産技術開発を目的に行われている研 究 は 少 な い 。さ ら に 、ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ 、オ オ キ ツ ネ タ ケ 、 スエヒロタケ、ツクリタケなどはハラタケ目に属し、タマチ ョレイタケ目における研究はほとんど行われていない。 そこで本章では、タマチョレイタケ目の食用きのこ栽培の 科学的な解析と検証を行うに十分量の遺伝子情報を提供する ため、そのモデル生物をマイタケとして、その栽培工程で発 現する遺伝子を第二世代型シークエンサーによって網羅的に 17 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 決定した。本章の結果は、マイクロアレイ解析や遺伝子機能 の推定等次章以降の全ての基礎データとして重要な役割を担 う。 18 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 2.2. 実 験 材 料 と 方 法 2.2.1. 菌 株 及 び 菌 糸 培 養 方 法 本実験で使用したマイタケ、エリンギ、ブナシメジ及びシ イタケの菌株は、それぞれ 2 核菌糸で、株式会社雪国まいた け の 保 存 菌 株 で あ る M51、YU376、 YU606 及 び YU974 を そ れ ぞ れ 用 い た 。 い ず れ の 菌 株 も 液 体 培 養 は GMY 培 地 (1% g l u c o s e , 1 % M a l t e x t r a c t , 0 . 4 % Ye a s t e x t r a c t ) 、 平 板 培 養 は P D A 寒 天 培 地 (Difico, USA) を 用 い 、 2 週 間 、 2 5˚C 暗 黒 下 で 静 置 培養して得た菌糸体を実験に用いた。 2.2.2. 栽 培 方 法 マ イ タ ケ M51 は 、栽 培 用 袋 に 2900 g の オ ガ 粉 培 地 （ 30%広 葉 樹 オ ガ 粉 , 5 % コ ー ン ブ ラ ン , 6 5 % 水 w / w ）を 充 填 殺 菌 し た 培 地 に 植 菌 後 、3 0 日 間 2 5 ˚ C 暗 黒 下 で 培 養 し 、さ ら に 4 4 日 間 2 5 ˚ C で 9 時 間 点 灯 /15 時 間 消 灯 の 白 色 蛍 光 灯 下 で 培 養 し た 。 次 に 、 培 養 培 地 を 温 度 18˚C、 湿 度 95%、 12 時 間 点 灯 /12 時 間 消 灯 の 白色蛍光灯下で 6 日間の芽出し操作を行い、子実体原基誘導 を行った。その後培養培地の袋上部を開封し、それを芽出し 操 作 と 同 条 件 下 で 10 日 間 培 養 す る こ と で 子 実 体 原 基 か ら 子 実体を分化、生育させた。 エ リ ン ギ YU376 は 、 ス ギ オ ガ 粉 :コ ー ン コ ブ ミ ー ル :オ カ ラ :フ ス マ = 5.2:3.5:1.0:0.3 w/w に 混 合 し 、 水 分 量 を 68%に 調 製 し た も の を 850 ml き の こ 栽 培 プ ラ ス チ ッ ク ボ ト ル に 充 填 殺 菌 し た 培 地 に 植 菌 し 、 温 度 25˚C、 湿 度 70%、 暗 黒 下 で 35 日 間培養を行った。その後菌糸に覆われた培地表面全体を掻き 19 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 取 り 、ボ ト ル を 反 転 さ せ 、温 度 15˚C、湿 度 95%、12 時 間 点 灯 /12 時 間 消 灯 の 白 色 蛍 光 灯 下 で 10 日 間 子 実 体 原 基 誘 導 を 行 っ た。次に培養ボトルを正転させて子実体原基誘導と同条件下 で培養を行って、子実体を分化生育させた。 ブ ナ シ メ ジ YU606 は 、 ス ギ オ ガ 粉 フ ス マ 培 地 を 850 ml きのこ栽培プラスチックボトルに充填殺菌した培地に植菌し、 温 度 25˚C、 湿 度 65%、 暗 黒 下 で 90 日 間 培 養 を 行 っ た 。 そ の 後、培地表面を掻き取り、瓶口いっぱいまで注水、しばらく 放 置 し て か ら 培 地 表 面 に 溜 ま っ た 水 を 捨 て た も の を 温 度 15˚C、 湿 度 95%、 12 時 間 点 灯 /12 時 間 消 灯 の 白 色 蛍 光 灯 下 で 子 実 体 生育を行った。 シ イ タ ケ YU974 は 、 接 種 後 40 日 間 は 22˚C、 湿 度 65%、 暗 黒 下 に て 培 養 後 、 12 時 間 点 灯 /12 時 間 消 灯 の 白 色 蛍 光 灯 下 で さ ら に 3 0 日 間 培 養 し た 。次 に 栽 培 袋 か ら 菌 床 を 取 り 出 し て 菌 床 表 面 を 水 洗 し て 30 分 培 地 を 水 に 浸 漬 し 、 温 度 15˚C、 湿 度 95%、 12 時 間 点 灯 /12 時 間 消 灯 の 白 色 蛍 光 灯 下 で 培 養 し 、 子実体原基誘導、分化、生育させた。 2.2.3. 全 RNA の 抽 出 マ イ タ ケ は 、G M Y 液 体 培 地 、P D A 平 板 培 地 で 培 養 し た 菌 糸 体 、 2.2.2 で 述 べ た 栽 培 条 件 下 で 培 養 20 日 目 （ 括 弧 内 に 植 菌 日 を 1 日 目 と し 、植 菌 日 か ら の 日 数 を 記 す : 2 0 日 ）、3 0 日 目（ 3 0 日 ）、 5 0 日 目 （ 5 0 日 ） の そ れ ぞ れ の 菌 糸 、 芽 出 し 1 日 前 （ 7 4 日 ）、 芽 出 し 1 日 目 （ 7 5 日 ）、 6 日 目 （ 8 0 日 ） の そ れ ぞ れ の 子 実 体 原 基 形 成 部 位 、 子 実 体 生 育 1 日 目 （ 8 1 日 ）、 4 日 目 （ 8 3 20 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 日 ）、 7 日 目 （ 8 8 日 ）、 1 0 日 目 （ 9 1 日 ） の そ れ ぞ れ の 子 実 体 、 及 び 生 育 7 日 目 の 子 実 体 を 収 穫 し 、 そ れ を 100 g に 切 り 分 け パ ッ ク 詰 め し て 18˚C で 2 日 間 保 存 し た も の か ら そ れ ぞ れ 全 RNA を 抽 出 し た 。試 料 を 採 取 し た と き の マ イ タ ケ の 生 育 状 況 を 図 2-1 に 示 す 。 エ リ ン ギ は 、G M Y 液 体 培 地 、P D A 平 板 培 地 で 培 養 し た 菌 糸 、 栽 培 工 程 の 培 養 1 0 日 目（ 1 0 日 ）、2 0 日 目（ 2 0 日 ）、3 0 日 目（ 3 0 日 ）、 菌 掻 き 後 1 日 目 （ 3 1 日 ）、 6 日 目 （ 3 6 日 ）、 正 転 後 2 日 目 （ 3 9 日 ）、 6 日 目 （ 4 3 日 ）、 9 日 目 （ 4 6 日 ）、 子 実 体 生 育 6 日 目 の 子 実 体 を お お よ そ 100 g に な る よ う に パ ッ ク 詰 め し て 18˚C で 2 日 間 保 存 し た 10 の 異 な る サ ン プ ル か ら そ れ ぞ れ 全 RNA を 調 製 し た 。 各 サ ン プ ル の 状 態 を 図 2-2 に 示 す 。 ブ ナ シ メ ジ は 、G M Y 液 体 培 地 、P D A 平 板 培 地 で 培 養 し た 菌 糸 、 栽 培 工 程 の 培 養 3 0 日 目 （ 3 0 日 ）、 6 0 日 目 （ 6 0 日 ）、 9 0 日 目 （ 9 0 日 ）、 菌 掻 き 後 6 日 目 （ 9 6 日 ）、 1 1 日 目 （ 1 0 1 日 ）、 1 8 日 目 （ 1 0 8 日 ）、 2 1 日 目 （ 1 1 1 日 ）、 2 5 日 目 （ 1 1 5 日 ） と 菌 掻 き 後 21 日 目 の 子 実 体 を お お よ そ 100 g に な る よ う に パ ッ ク 詰 め し て 18˚C で 2 日 間 保 存 し た 11 の 異 な る サ ン プ ル か ら そ れ ぞ れ 全 RNA を 調 製 し た 。 各 サ ン プ ル の 状 態 を 図 2-3 に 示 す 。 シ イ タ ケ は 、G M Y 液 体 培 地 、P D A 平 板 培 地 で 培 養 し た 菌 糸 、 原 基 、 原 基 か ら 2 日 後 、 5 日 後 、 9 日 後 、 12 日 後 の 子 実 体 と 原 基 か ら 9 日 後 の 子 実 体 を お お よ そ 100 g に な る よ う に パ ッ ク 詰 め し て 18˚C で 2 日 間 保 存 し た 8 の 異 な る サ ン プ ル か ら そ れ ぞ れ 全 R N A を 調 製 し た 。各 サ ン プ ル の 状 態 を 図 2 - 4 に 示 す 。 21 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 各 試 料 か ら の R N A 抽 出 は 、液 体 窒 素 下 で 乳 鉢 と 乳 棒 を 用 い て 摩 砕 し た 試 料 か ら RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, German y) を 用 い て 取 扱 い 説 明 書 に 従 っ て 行 っ た 。 RNA 中 に 混 入 す る ゲ ノ ム D N A は 、T u r b o D N A - f r e e k i t ( L i f e Te c h n o l o g i e s , USA) を 用 い て 取 扱 い 説 明 書 に 従 っ て 除 去 し た 。 得 ら れ た RNA の 品 質 は 、 2100 バ イ オ ア ナ ラ イ ザ ー (Agilent Te c h n o l o g i e s , U S A ) を 用 い て 分 析 し 、 分 解 が 起 き て い な い こ とを確認した。 2.2.4. mRNA の 網 羅 的 配 列 決 定 マイタケ、エリンギ、ブナシメジ及びシイタケの培養日数 毎 に 採 取 し た 試 料 か ら そ れ ぞ れ 抽 出 し た 全 RNA 1 g を 生 物 の 種 類 ご と に 一 ま と め に 混 合 し た も の を 各 生 物 の mRNA の 網 羅 的 配 列 決 定 の た め の 材 料 と し た 。 次 に そ れ ら を TRIMMER cDNA normalization kit (Evrogen, Russia) で 均 一 な cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を 調 製 し 、 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー 454 GS FLX ( R o c h e , S w i t z e r l a n d ) に よ り D N A 断 片 配 列 決 定 を 行 っ た 。D N A 断 片 は 、 N e w b l e r a s s e m b l e r Ve r. 1 . 1 ( R o c h e ) に よ っ て ア セ ン ブ ルしてコンティグ形成を行った。これらの配列決定からコン テ ィ グ 形 成 は 、 株 式 会 社 ジ ナ リ ス (横 浜 , 日 本 )に 委 託 し て 行 った。 2.2.5. オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム (ORF)予 測 と ア ノ テ ー ション 22 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 得られたコンティグ中の塩基配列から開始コドンと終止コ ド ン を 含 む O R F の 予 測 は 、株 式 会 社 ジ ナ リ ス に 委 託 し て 行 っ た 。 ORF が 予 測 さ れ た コ ン テ ィ グ を 予 測 遺 伝 子 と し て 、 B L A S T P プ ロ グ ラ ム ( N C B I ) [ 1 4 ] 、e u K a r y o t i c O r t h o l o g o u s G r o u p s ( KOG) 分 類 [1 5] を 用 い て 相 同 性 遺 伝 子 の 検 索 と 機 能 分 類 を 行 っ た 。 各 遺 伝 子 の ア ノ テ ー シ ョ ン 付 け は B l a s t 2 G O Ve r. 2 . 4 . 0 [16]を 用 い て 行 い 、 蛋 白 質 モ チ ー フ 、 Gene Ontology 用 語 及 び EC 番 号 を 付 与 し た 。 23 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 図 2-1. 全 RNA 抽 出 に 用 い た マ イ タ ケ サ ン プ ル マ イ タ ケ の R N A 抽 出 の た め の 試 料 採 取 は 、植 菌 日 か ら 数 え て 培 養 工 程 に お い て 20 日 目 、 30 日 目 、 50 日 目 、 74 日 目 の 培 地 表 面 の 菌 叢 か ら 、 芽 出 し 工 程 に お い て は 75 日 目 、 80 日 目 の 子 実 体 原 基 か ら 発 生 工 程 に お い て は 81 日 目 、 83 日 目 、 88 日 目 、 91 日 目 の 子 実 体 か ら 、 平 板 培 養 と 液 体 培 養 そ れ ぞ れ の 菌 糸 か ら 、88 日 目 の 子 実 体 を 市 販 品 と 同 様 の 形 に 切 り 分 け 同 じ く ト レ ー 包 装 し て 18˚C で 2 日 間 保 存 し た も の （ 写 真 な し ） か ら そ れ ぞ れ RNA を 抽 出 し た 。 RNA の 配 列 決 定 に は 、 全 て の 採 取 試 料 か ら そ れ ぞ れ 1 g の 全 RNA を 混 合 し 一 ま と め に したものを用いた。 24 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 図 2-2. 全 RNA 抽 出 に 用 い た エ リ ン ギ サ ン プ ル エ リ ン ギ か ら は 、植 菌 日 か ら 数 え て 培 養 工 程 に お い て 1 0 日 目 、20 日 目 、30 日 目 の 培 地 表 面 の 菌 叢 か ら 、芽 出 し 工 程 に お い て は 31 日 目 の 菌 掻 き 表 面 の 菌 糸 体 、 発 生 工 程 に お い て は 36 日 目 、 39 日 目 、 43 日 目 、 46 日 目 の 原 基 ま た は 子 実 体 、 菌 糸 培 養 と し て 平 板 培 地 と 液 体 培 地 、子 実 体 保 存 と し て 1 8 ˚ C で 2 日間トレー容器で保存したもの（写真なし）からそれぞれ R N A を 抽 出 し た 。R N A の 配 列 決 定 に は 、全 て の 採 取 試 料 か ら そ れ ぞ れ 1 g の 全 RNA を 混 合 し 一 ま と め に し た も の を 用 い た。 25 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 図 2-3. 全 RNA 抽 出 に 用 い た ブ ナ シ メ ジ サ ン プ ル ブ ナ シ メ ジ か ら は 、植 菌 日 か ら 数 え て 培 養 工 程 に お い て 30 日 目 、60 日 目 、90 日 目 に お 培 地 表 面 の 菌 叢 、芽 出 し 工 程 に お い て は 96 日 目 の 菌 掻 き 表 面 の 菌 糸 体 、 発 生 工 程 に お い て は 1 0 1 日 目 、1 0 8 日 目 、1 1 1 日 目 、1 1 5 日 目 の 原 基 ま た は 子 実 体 、 菌 糸 培 養 と し て 平 板 培 地 と 液 体 培 地 、子 実 体 保 存 と し て 18˚C で 2 日 間 ト レ ー 容 器 で 保 存 し た も の（ 写 真 な し ）の 1 1 ス テ ー ジ か ら そ れ ぞ れ 全 RNA を 抽 出 し た 。 RNA の 配 列 決 定 に は 、 11 ス テ ー ジ そ れ ぞ れ の 1 g の 全 RN A を 混 合 し た も の を 用 い た。 26 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 図 2-4. 全 RNA 抽 出 に 用 い た シ イ タ ケ サ ン プ ル シイタケからは、原基と原基から 2 日目、5 日目、9 日目、 12 日 目 の 5 ス テ ー ジ 、 菌 糸 培 養 と し て 平 板 培 地 と 液 体 培 地 、 子 実 体 保 存 と し て 18˚C で 2 日 間 ト レ ー 容 器 で 保 存 し た も の （ 写 真 な し ） の 8 ス テ ー ジ か ら そ れ ぞ れ 全 RNA を 抽 出 し た 。 RNA の 配 列 決 定 に は 、 8 ス テ ー ジ そ れ ぞ れ の 1 g の 全 RNA を混合したものを用いた。 27 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 2.3. 結 果 と 考 察 2.3.1. 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー 454 に よ る mRNA シ ー ク エ ンシング マ イ タ ケ 、エ リ ン ギ 、ブ ナ シ メ ジ 及 び シ イ タ ケ の 平 板 培 養 、 液体培養、オガコ培養による菌糸体、オガコ培養から発生し た 子 実 体 原 基 、子 実 体 、市 販 形 態 で 包 装 保 存 し た 子 実 体 の 各 々 か ら 抽 出 し た 全 RNA に 含 ま れ る mRNA を 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー 454 で シ ョ ッ ト ガ ン シ ー ク エ ン シ ン グ し て 得 ら れ た リード数とアセンブルによって得られたコンティグ数を表 2-1 に 示 す 。 そ れ ぞ れ の 生 物 種 か ら 得 ら れ た リ ー ド 数 は 概 ね 50 万 リ ー ド で 、 総 塩 基 数 は 100 Mb 程 度 と 生 物 種 に よ る 差 は 認められなかった。このことから、今回シークエンシングし た生物種によるバラツキはなく、均質に配列決定ができたと 考えられた。リードアセンブルの結果得られた総コンティグ 数 は 2 万 5 千 個 程 度 で あ り 、 そ の う ち 0.5 kb 以 上 の ラ ー ジ コ ン テ ィ グ 数 は 、マ イ タ ケ で 6 , 8 3 9 個 、エ リ ン ギ で 9 , 4 7 4 個 、ブ ナ シ メ ジ で 7 , 8 4 9 個 、シ イ タ ケ で 8 , 4 7 5 個 で あ っ た 。コ ン テ ィ グ の 平 均 長 マ イ タ ケ で 0.88 kb、 エ リ ン ギ で 1.02 kb、 ブ ナ シ メ ジ で 0.95 kb、 シ イ タ ケ で 1.04 kb で あ っ た 。 最 大 コ ン テ ィ グ 長 は 、 マ イ タ ケ で 3.6 kb、 エ リ ン ギ で 5.1 kb、 ブ ナ シ メ ジ で 4.0 kb、 シ イ タ ケ で 3.5 kb が 得 ら れ た 。 マ イ タ ケ は 、 ラ ー ジコンティグ数が少なく、最大コンティグ長も本研究で調べ たキノコのなかでは他 3 種に比べて一番短くかつ短い断片も 多かったことから総コンティグにおける平均長が短くなった と 考 え ら れ た 。一 方 、エ リ ン ギ は ラ ー ジ コ ン テ ィ グ 数 が 多 く 、 28 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 最 大 コ ン テ ィ グ 長 も 5.1 kb と 他 3 種 よ り も 長 か っ た 。 し か し ながら、いずれの種においてもコンティグ平均長が、ゲノム 配 列 が 公 開 さ れ て い る ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ の mRNA 平 均 塩 基 長 1.39 kb と 比 較 し て 短 か っ た 。 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー 454 よ る ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム デ ー タ で は 、総 リ ー ド 数 4 8 6 , 0 4 3 、総 コ ン テ ィ グ 数 2 0 , 7 5 6 個 、 平 均 コ ン テ ィ グ 長 0.36 kb と い う エ ノ キ タ ケ の 報 告 が あ る [17]。 今回得られたマイタケ、エリンギ、ブナシメジ、シイタケの 4 種のトランスクリプトームデータの値は前述のエノキタケ の報告より高いことから、エノキタケを上回るデータ量が得 られた。よって、本研究のためにキノコから抽出精製した mRNA 総 体 の 網 羅 性 は 高 い こ と か ら 、 マ イ ク ロ ア レ イ に よ る トランスクリプトーム解析や遺伝子機能の推定を行うに十分 な配列情報がえられたものと判断した。 表 2-1. 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー 454 に よ る シ ー ク エ ン シ ン グとアセンブル 項目 マイタケ エリンギ ブナシメジ シイタケ 総リード数 514,000 539,000 534,000 539,000 総塩基数（Mb） 101 114 109 120 総コンティグ数 26,893 27,805 29,765 23,398 ラージコンティグ数（≧0.5 kb） 6,839 9,474 7,849 8,475 平均コンティグ長（kb） 0.88 1.02 0.95 1.04 最大コンティグ長（kb） 3,638 5,125 3,954 3,512 29 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 2.3.2 ORF 予 測 と ア ノ テ ー シ ョ ン 解 析 総コンティグから予測された開始コドンから終止コドンま で を 含 む 予 測 遺 伝 子 数 と BLAST 検 索 で 確 認 さ れ た 相 同 性 遺 伝 子 の 割 合 を 表 2-2 に 示 す 。 全 遺 伝 子 の 数 は 、 mRNA 数 が マ イ タ ケ で 1 0 , 1 5 0 個 、エ リ ン ギ で 1 3 , 0 3 8 個 、ブ ナ シ メ ジ で 1 2 , 0 1 2 個 、 シ イ タ ケ で 1 0 , 6 3 9 個 で あ る こ と か ら 、、 お お よ そ 1 万 個 と予測された。この全予測遺伝子の総塩基長はマイタケで約 12 Mb、 エ リ ン ギ で 約 16 Mb、 ブ ナ シ メ ジ で 約 14 Mb、 シ イ タ ケ で 約 14 Mb と な っ た 。 ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ [18]や ス エ ヒ ロ タ ケ [19]の ゲ ノ ム サ イ ズ は そ れ ぞ れ 36.3 Mb 及 び 38.5 Mb で あ る こ と か ら 、 こ れ ら 4 種 の ゲ ノ ム サ イ ズ も 35 Mb 程 度 で コ ー デ ィ ン グ 領 域 が 50%程 度 の 10 ～ 13 Mb と 見 積 も れ ば 、 4 種 の 全 予 測 遺 伝 子 の 総 塩 基 長 は ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ [18]や ス エ ヒ ロ タ ケ [19]の そ れ ら と 類 似 す る た め 、 前 述 の コ ン テ ィ グ 情 報と併せて本遺伝子予測は十分に網羅性が確保されたものと 考えられた。 予 測 し た 遺 伝 子 に つ い て 、 NCBI の 蛋 白 質 デ ー タ ベ ー ス （ B L A S T P ）で 相 同 性 遺 伝 子 の 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、マ イ タ ケ で 3 8 % 、エ リ ン ギ で 4 3 % 、ブ ナ シ メ ジ で 4 2 % 、シ イ タ ケ で 4 8 % の遺伝子で相同性が見つかった。残りの約 6 割についてはこ れまでに報告されている遺伝子との相同性がなく、食用きの この分子生物学的知見が不足していることを表している。 相同性のある遺伝子を、真核生物間で保存されるオルソロ グまたはパラログ蛋白質を特定する KOG 分 類 （ eu Kar yotic O r t h o l o g o u s G r o u p s の 略 ）を 行 っ た 結 果 を 表 2 - 3 に 示 す 。 K O G 30 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 分 類 は 、 1) information storage and proce ssing 、 2) cellular processes and signaling、3) metabolism、4) poorly characterized の 4 つ に 大 分 類 さ れ 、 さ ら に 25 に 小 分 類 さ れ る 。 KOG 分 類 さ れ た 遺 伝 子 数 は 、 マ イ タ ケ で 2,687 個 、 エ リ ン ギ で 3,926 個 、ブ ナ シ メ ジ で 3 , 2 6 8 個 、シ イ タ ケ で 4 , 1 0 6 個 で あ っ た 。こ の 結 果 は BLASTP に よ る 相 同 性 検 索 の 結 果 と 同 様 の 傾 向 と な っ た 。 マ イ タ ケ の B LAST P 検 索 に ヒ ッ ト し た 相 同 遺 伝 子 の 割 合 3 8 ％ と K O G 分 類 さ れ る 遺 伝 子 の 数 2 , 6 8 7 個 は 、と も に ハ ラ タケ目であるエリンギ、ブナシメジ及びシイタケのそれらと 比較して少ないことは、食用きのこ類の中でもタマチョレイ タケ目の分子生物学的知見がより少ないことを示している。 表 2-2. ORF 予 測 の 結 果 項目 マイタケ エリンギ ブナシメジ シイタケ 予測遺伝子総数 10,150 13,038 12,012 10,639 12 16 14 14 38% 43% 42% 48% 予測遺伝子の総塩基長（Mb） BLASTヒット 予測遺伝子総数とその塩基長の総和を予測遺伝子の総塩基 長 ( M b ) と し て 示 し た 。N C B I デ ー タ ベ ー ス で 登 録 さ れ て い る 全 遺伝子との相同性がある予測遺伝子数を B LAST ヒ ッ ト と し て 、 予 測 遺 伝 子 総 数 に 対 す る 割 合 で 示 し た 。 BLAST ヒ ッ ト の 割 合 は 、 マ イ タ ケ で 38%と エ リ ン ギ 、 ブ ナ シ メ ジ 及 び シ イ タ ケのそれよりも低かった。 31 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 表 2-3. ORF か ら 予 測 し た 遺 伝 子 の KOG に よ る 機 能 別 分 類 項目 マイタケ Information storage & Processing RNA processing & modification Transcription Replicaion Chromatin stracture & dynamics Translation, ribosomal structure and biogenesis エリンギ ブナシメジ シイタケ 遺伝子数 119 120 75 37 179 % 4.4 4.5 2.8 1.4 6.7 遺伝子数 180 181 147 64 246 % 4.6 4.6 3.7 1.6 6.3 遺伝子数 127 158 92 46 200 % 3.9 4.8 2.8 1.4 6.1 遺伝子数 168 169 112 68 254 % 4.1 4.1 2.7 1.7 6.2 Cellular processes & signaling Cell cycle control, cell division Nuclear structure Defence mechanism Signal trasnsduction mechanism Cell wall/membrance/envelope biogenesis Cell motility Cytoskelton Extracellular structure Intracellular traffking, secretion Posttranslational nodification 117 6 15 189 23 0 58 2 185 272 4.4 0.2 0.6 7.0 0.9 0.0 2.2 0.1 6.9 10.1 180 14 18 262 32 0 77 1 242 334 4.6 0.4 0.5 6.7 0.8 0.0 2.0 0.0 6.2 8.5 161 19 11 236 24 2 72 3 220 328 4.9 0.6 0.3 7.2 0.7 0.1 2.2 0.1 6.7 10.0 163 19 32 252 35 1 86 5 360 370 4.0 0.5 0.8 6.1 0.9 0.0 2.1 0.1 8.8 9.0 Metabolism Amino acid transport & metabolism Nucleotide transport & metabolism Coenzyme transport & metabolism Lipid transport & metabolism Carbohydrade transport & metabolism Inorganic ion transport & metabolism Energy production & conversion Secondary metabolites biosynthesis 134 55 43 171 122 51 167 110 5.0 2.0 1.6 6.4 4.5 1.9 6.2 4.1 196 74 69 278 188 89 237 169 5.0 1.9 1.8 7.1 4.8 2.3 6.0 4.3 169 72 59 209 167 66 183 146 5.2 2.2 1.8 6.4 5.1 2.0 5.6 4.5 203 80 66 265 221 72 242 194 4.9 1.9 1.6 6.5 5.4 1.8 5.9 4.7 Poorly characterized General function prediction only Function unknown 326 111 12.1 4.1 479 169 12.2 4.3 400 98 12.2 3.0 508 161 12.4 3.9 2687 100.0 3926 100.0 3268 100.0 4106 100.0 Total 予 測 遺 伝 子 総 数 に 対 し て KOG 分 類 に よ る 遺 伝 子 機 能 分 類 した表を示す。機能分類される遺伝子数がマイタケで 2,687 個と、エリンギ、ブナシメジ及びシイタケのそれと比べて低 かった。 32 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 2.4. ま と め 本章では、食用きのこ、特にタマチョレイタケ目のマイタ ケの分子生物学的解析を目的に、第二世代型シークエンサー を用いて、栽培工程を主としたトランスクリプトームデータ を得た。結論は、以下のように摘要される。 1 . 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー に よ っ て 、マ イ タ ケ 、エ リ ン ギ 、 ブナシメジ及びシイタケの栽培工程中に発現している遺 伝 子 断 片 を 網 羅 的 に 解 読 し た 結 果 、 そ れ ら の ORF 解 析 か ら 、 マ イ タ ケ か ら 10,150 遺 伝 子 、 エ リ ン ギ か ら 13,038 遺 伝 子 、ブ ナ シ メ ジ か ら 1 2 , 0 1 2 遺 伝 子 、シ イ タ ケ か ら 1 0 , 6 3 9 遺伝子を予測した。 2 . 各 食 用 き の こ か ら 予 測 さ れ た 遺 伝 子 の 総 塩 基 長 は 、そ れ ぞ れ マ イ タ ケ で 約 12 Mb、 エ リ ン ギ で 約 16 Mb、 ブ ナ シ メ ジ で 約 14 Mb、 シ イ タ ケ で 約 14 Mb と な っ た 。 ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨタケ等ゲノムが公開されているきのこから遺伝子の全 塩 基 長 が 1 0 ～ 1 3 M b 程 度 と 推 察 さ れ る た め 、本 研 究 か ら 得 られたトランスクリプトームデータは網羅性を十分にも っていると考えられた。 3. 予 測 遺 伝 子 の BLASTP 検 索 及 び KOG 分 類 さ れ た 遺 伝 子 の 数 は 既 知 の 生 物 種 の そ れ ら に 比 べ て 少 な い こ と か ら 、食 用 き の こ の 分 子 生 物 学 的 知 見 は 少 な く 、そ の 中 で も マ イ タ ケ 33 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 が属するタマチョレイタケ目はハラタケ目よりも遺伝子 情報が不足していることが明らかにできた。 以上のように、本章記述の成果によってマイタケの分子生 物学的解析を実施するために十分なトランスクリプトーム情 報を得ることができた。 34 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 参考文献 1 . 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The gen ome of Laccari a b i c o l o r p r o vi d e s i n s i gh t s i n t o m yc o r r h i za l s ym b i o s i s . N a t u re 452: 88 -92; doi: 10.1038/nature06556. 1 3 . O h m R A , d e J o n g J F, L u g o n e s L G , A e r t s A , K o t h e E , S t a j i c h JE, de Vr i e s Bartholome w R P, Record KA, E, Coutinho PM, Le vas seur A, Baker SE, Erdmann S, Fo wler TJ, G a t h m a n A C , L o m b a r d V, H e n r i s s a t B , K n a b e N , K ü e s U , L i l l y W W, Lind quist Raudaskoski M, E, Lucas Salamov S, A, Magnuson Schmutz J, J K, Piumi Schwarze F, F W, v a n K u y k PA , H o r t o n J S , G r i g o r i e v I V, W ö s t e n H A ( 2 0 1 0 ) . Ge nome commune. sequence N a t u re of the model mushroom Biotechnology 10.1038/nbt.1643. 38 28: Schizophyllum 957-963; doi: 第二章 トランスクリプトーム情報の取得 1 4 . T h o m p s o n J D , G i b s o n T J , P l e w n i a k F, J e a n m o u g i n F, H i g g i n s D G ( 1 9 9 7 ) . 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Bioinformatics 21: 3674-3676. 17. 石 黒 真 希 (2011). エ ノ キ タ ケ の ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 配 列データベースの構築とバイオマス変換酵素探索への応 用. 学位論文, 東京大学, 日本. 39 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 第 3 章 マイタケ栽培工程における 発現遺伝子プロファイルの解析 3.1. 序 論 本章では、第 1 章で提示した食用きのこ生産の課題のうち マイタケ栽培の工程管理を特定の遺伝子発現量を指標とした マーカー支援によって科学的に行うことを目標の一つとし、 その基盤情報としてマイタケの栽培の各工程で発現する遺伝 子を特定した。 第 2 章 で 取 得 し た マ イ タ ケ ( G r i f o l a f ro n d o s a ) の ト ラ ン ス クリプトーム情報からマイタケマイクロアレイを作製し、マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 で あ る 「 培 養 工 程 」、「 芽 出 し 工 程 」、 発 生 工 程」のそれぞれで発現上昇する、または発現抑制される遺伝 子をリスト化した。これまで食用きのこの栽培工程で発現す る遺伝子について全行程の連続的な解析行った例は、ハラタ ケ目の腐生性であるツクリタケ な く 、 シ イ タ ケ (Lentinula (Agaricus bisporus) [1] し か edodes) や ナ メ コ (Pholiota nameko)、 エ ノ キ タ ケ (Flammulina velutipes) 等 の 多 く の 種 類 が属する木材不朽性の食用きのこでは、工程の一部のみに留 まっている。また、マイタケの属するタマチョレイタケ目に 関しては全く報告がない。よって、マイタケの栽培工程全体 を通して発現遺伝子とその発現パターンを得ることは、食用 きのこ栽培としてのマイタケ栽培の工程管理のためのマーカ ー遺伝子の特定はもちろんのこと、マイタケをモデルとした タマチョレイタケ目キノコの子実体生育機構の解明のための 40 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 分子生物学的情報を得ることができる。さらに、第 2 章でマ イタケとともに取得したハラタケ目の食用キノコであるエリ ン ギ ( P l e u ro t u s e r y n g i i ) 、 ブ ナ シ メ ジ ( H y p s i z y g u s m a r m o re u s ) 及 び シ イ タ ケ (Lentinula edodes)の 栽 培 工 程 に お け る ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 情 報 と 比 較 す る こ と に よ っ て ,食 用 き の こ に 共 通な子実体生育機構やハラタケ目とタマチョレイタケ目に属 するキノコの子実体生育機構の差異を明らかにすることに繋 がると考えている。 41 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 3.2. 実 験 材 料 と 方 法 3.2.1. 菌 株 本実験で使用したマイタケの菌株は、第 2 章記載の菌株を 用いた。 3.2.2. 栽 培 条 件 本実験におけるマイタケの栽培方法は、第 2 章記載の方法 で行った。 3.2.3. マ イ ク ロ ア レ イ 実 験 マイタケカスタムマイクロアレイは、第 2 章で取得したマ イ タ ケ ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 情 報 を も と に 予 測 さ れ た 10,150 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 か ら 、ア レ イ 作 製 支 援 ソ フ ト ウ エ ア e - A r r a y ( A g i l e n t Te c h n o l o g i e s , U S A ) を 用 い て 8 × 1 5 k の フ ォ ー マ ッ ト で 設 計 し た 。 栽 培 工 程 発 現 遺 伝 子 解 析 の た め の RNA 抽 出 は 、 図 1 - 2 に 示 す よ う に マ イ タ ケ の 培 養 2 0 日 目 、7 4 日 目（ 芽 出 し 前 1 日 ）、 7 5 日 目 （ 芽 出 し 後 1 日 ）、 7 7 日 目 （ 同 3 日 ）、 8 0 日 目 （ 発 生 1 日 前 ）、 8 1 日 目 （ 発 生 1 日 ）、 8 3 日 目 （ 同 3 日 ）、 88 日 目 （ 同 8 日 ） の 各 々 の 4 個 の 培 養 培 地 か ら 別 々 に 採 取 し た菌体を用いて、採取した菌体ごとに第 2 章記載の方法で行 った。菌体採取部位は子実体生育に注目し、培養培地の上部 菌蓋、子実体原基、子実体からのみ行い、培地部分は含まな い 。 上 述 の 培 養 日 数 ご と に 抽 出 し た 4 つ の 独 立 し た RNA を 、 マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 に 供 し た 。 RNA か ら の cRNA 合 成 、 蛍 光 ラベリング、ハイブリダイゼーション、シグナルの検出は株 42 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 式会社バイオマトリクス研究所（千葉市, 日本）に委託して 行 っ た 。得 ら れ た マ イ ク ロ ア レ イ デ ー タ の 解 析 は 、G e n e S p r i n g G X 1 0 ( A g i l e n t Te c h n o l o g i e s ) を 用 い て 行 っ た 。 3.2.4. ク ロ ー ニ ン グ マイクロアレイ解析の結果、子実体生育に伴って発現量が 上 昇 す る 遺 伝 子 と し て Gf.HSP9 遺 伝 子 を 見 出 し た 。 Gf.HSP9 遺 伝 子 の 全 長 cDNA を ク ロ ー ニ ン グ す る た め に 、 5’ -及 び 3’ -RACE 法 を 行 っ た 。 R A C E 法 は 、 S M A RTe r R A C E c D N A A m p l i f i c a t i o n K i t ( C l o n t e c h , U S A ) を 用 い た 。R A C E に 用 い た プ ラ イ マ ー 配 列 は 、 表 3-1 に 示 し た 。 3.2.5. 熱 シ ョ ッ ク ス ト レ ス 一般的に熱ショック蛋白質は熱によって誘導されるため、 Gf.HSP9 遺 伝 子 が 熱 シ ョ ッ ク で 誘 導 さ れ る か を 確 認 す る た め に 熱 シ ョ ッ ク ス ト レ ス を 与 え た 。 マ イ タ ケ M51 を 50 mL の GPY 培 地 （ 2 % gl uc o se , 0.2 % ye a st e xt ra c t , 0.2% pol ype pt o ne , 0.05% MgSO2, 0.05% KH2PO4） を 入 れ た 200 mL 容 三 角 フ ラ ス コ に 植 菌 し 、 25˚C で 14 日 間 静 置 培 養 し た 。 熱 シ ョ ッ ク は こ の 培 養 物 を フ ラ ス コ ご と 、42˚C の ウ ォ ー タ ー バ ス に て 温 浴 し た 。温 浴 開 始 か ら 1 2 0 分 ま で 、3 0 分 ご と に サ ン プ リ ン グ し て 、 定 量 PCR に よ っ て Gf.HSP9 遺 伝 子 の 発 現 量 を 確 認 し た 。 3.2.6. 定 量 PCR 実 験 43 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル c D N A 合 成 は 、g D N A 除 去 し た 全 R N A を 鋳 型 に R e v e r T r a A c e q P C R RT K i t ( T O Y O B O , 日 本 ) を 用 い て 行 っ た 。 定 量 P C R は 、 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO, 日 本 )と Mx3000P R e a l - T i m e Q P C R S y s t e m ( A g i l e n t Te c h n o l o g i e s ) を 用 い て 行 っ た 。 P C R 条 件 は 、9 5 ˚ C で 1 分 間 初 期 熱 変 性 を し た 後 、9 5 ˚ C 1 5 秒 間 の 熱 変 性 、 62˚C30 秒 間 の 伸 長 反 応 の 40 サ イ ク ル と し た 。 相 対 定 量 は 、 2(-Delta Delta C(T))法 で 行 っ た 。 各 サ ン プ ル の 発 現量の標準化は、マイクロアレイ解析の結果、栽培工程全行 程 に 渡 っ て 恒 常 的 に 発 現 し て い た マ イ タ ケ の GAPDH 遺 伝 子 ( AB781111) の 発 現 量 を 内 部 標 準 と し て 行 っ た 。定 量 PCR に 用 い た プ ラ イ マ ー 配 列 は 、 表 3-1 に 示 し た 。 3.2.7. 塩 基 配 列 解 析 と 蛋 白 質 モ デ リ ン グ Gf.HSP9 蛋 白 質 の 分 子 量 推 定 は 、 compute pI/Mw tool [2] を 用 い た 。 2 次 構 造 の 予 測 は 、 consensus data mining (CDM) protein secondary structure prediction server [3] を 用 い た 。 塩 基配列アライメント及び蛋白質モデリングは、塩基配列アラ イ メ ン ト は 、 ClastalX を 用 い て 行 っ た [4]。 タ ン パ ク 質 モ チ ー フ の 検 索 は 、 Bla stp プ ロ グ ラ ム [5]を 用 い て 、 域 値 e value ≦ 1 ×10 -3、bi t sc ore ＞ 40 と し て NC BI デ ー タ ベ ー ス で 行 っ た 。タ ン パ ク 質 の 予 測 3 次 元 構 造 描 画 は 、 S WISS -MO DE L[ 6] を 用 い て 行 っ た 。 な お 、 以 下 遺 伝 子 は Times New Roman の イ タ リ ッ ク 体 の 英 数 字 で 、 そ の 産 物 で あ る 蛋 白 質 を 指 す と き は Times New Roman の ロ ー マ ン 体 の 英 数 字 で 表 し た 。 す な わ ち 、 44 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル Gf.HSP9 と 記 載 し て あ る と き は 遺 伝 子 を 、 Gf.HSP9 と 記 載 し て あ る と き は Gf.HSP9 の 産 物 で あ る 蛋 白 質 を 指 す 。 45 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 表 3-1. 本 章 で 用 い た プ ラ イ マ ー 配 列 Primer name Sequence (5’ to 3’) G f . H S P 9 - 5 R A C E - G S P C G A C A G C G T T C T T C AT C T T G Gf.HSP9-3RACE -GSP CCTGAGAGCCAGAAGTCCAC Gf.GAPDH-QPCR-F T G A A C G AT C C C T T C AT T G A C C Gf.GAPDH-QPCR-R A G ATA G G C T T G C C C T C A A C G Gf.HSP9-QPCR-F CCTGAGAGCCAGAAGTCCAC Gf.HSP9-QPCR-R C G A C A G C G T T C T T C AT C T T G Pe.28srRNA-QPCR-F C T C TA G T G C A G AT C T T G G T G G TA G P e . 2 8 s r R N A - Q P C R - R C C TAT C T C T TA G G AT C G A C T G A C C Pe.HSP9-QPCR-F T TAT C A A C G A C C AT G T C T G A C G Pe.HSP9-QPCR-F G ATA G A G T C T C C C AT G G A C T C G Hm . GAPDH-QPCR -F GACAAGT ACGACT CCAAGT AC ACC Hm . GAPDH-QPCR -R CTCATCAAACCCTCAACGAT ACC Hm . HSP9 -QPCR - F CTCTCAGAAGACTACCGTTGAACA Hm . HSP9 -QPCR - F ACTTTTCGCT GCT AGGCGT AAG for 5 ’ -及 び 3’ -RACE は ク ロ ー ニ ン グ の た め の RACE PCR に 用 い た プ ラ イ マ ー 配 列 を 示 し 、f o r q RT- P C R は 各 遺 伝 子 の 発 現量を解析するためのプライマー配列であることを示す。 46 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 3.3. 結 果 と 考 察 3.3.1. 培 養 工 程 で 高 発 現 す る 遺 伝 子 第 1 章 の 図 1-4 に 示 し た よ う に マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 は 、 2 つ の 環 境 刺 激 に よ っ て 分 け ら れ る 大 き く 3 つ の「 培 養 」 「芽出 し （ 原 基 の 充 実 ）」「 発 生 （ 子 実 体 分 化 ）」 の 工 程 と 、 さ ら に 培 養工程は「暗培養」と「明培養」の 2 つに分けることができ る。培養から原基（充実）形成誘導は、第一段階の環境刺激 として温度を下げて光強度を上げることによって行い、原基 から子実体の分化誘導は、第二の環境刺激として栽培袋を開 封して新鮮な空気を与えることによって行う。この 2 つの環 境刺激の前後それぞれにおける発現遺伝子とそのプロファイ ルに着目して、子実体生育に関与する遺伝子のスクリーニン グを行った。 第 一 に 、培 養 工 程 の 初 期 で 発 現 す る 遺 伝 子 の 特 定 を 行 っ た 。 培養工程は、子実体生育を行うために菌糸体量の充実を行う 重要な工程である。特に、培養工程初期では栽培培地の分解 利用に関連する遺伝子の発現が予測された。そこで、培養工 程 の 初 期 で あ る 培 養 20 日 目 と 後 期 で あ る 培 養 74 日 目 で 発 現 し て い る 遺 伝 子 の 発 現 量 を 比 較 し て （ 図 3 - 1 ）、 培 養 の 初 期 で 高 発 現 す る 遺 伝 子 9 9 個 を 特 定 し た（ 表 3 - 2 ）。そ の 中 に は 、マ イタケ菌糸による栽培培地中の炭素源及び窒素源の利用に関 与すると考えられる遺伝子群が多く含まれていた。栽培培地 は培養基質として広葉樹オガ粉、栄養物としてコーンブラン を用いているが、これらの主成分はセルロースやリグニン等 の植物性高分子多糖である。セルロースやヘミセルロース、 47 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル ペクチン等の植物性高分子多糖の分解に関与する酵素群は、 C a r b o h y d r a t e - a c t i v e e n z y m e s ( C A Z y m e s ) [ 7 ] と 呼 称 さ れ 、バ イ オ マスエネルギー利用の観点からよく研究されている。一般的 に木材は、セルロースを難分解性のリグニンが被っており、 腐朽を受けにくい。マイタケを含む白色不朽菌はこのリグニ ンを効率よく分解することができる生物であり、実際に培養 工程で培地中の木質基質のリグンニンの脱色や物理強度低下 から木質が分解されていく過程がはっきりと確認することが できる。マイタケの培養工程中からは、これらリグニン分解 及び植物性多糖分解に関わる遺伝子が高発現していた。リグ ニン分解に関与すると考えられる遺伝子としては、マンガン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ (mangane se peroxidase : MnP) と ラ ッ カ ー ゼ が そ れ ぞ れ 1 遺 伝 子 ず つ 高 発 現 し て い た （ 表 3-2 中 に 青 色 で 示 す ）。M n P は 、リ グ ニ ン 分 解 酵 素 と し て 木 質 分 解 で き る 担 子 菌で最もよく知られたリグニンの修飾に関わるペルオキシダ ー ゼ で あ る [8]。 ラ ッ カ ー ゼ は 、 フ ェ ノ ー ル 類 を 酸 化 す る フ ェ ノ ー ル オ キ シ ダ ー ゼ の 一 種 で あ り 、 MnP と と も に リ グ ニ ン に 分解に寄与するとされる。マイタケで液体培養中でもラッカ ー ゼ の 発 現 が 最 大 に な る こ と が 報 告 さ れ て い る [9]。糖 質 分 解 に 関 与 す る CAZy 分 類 の う ち 、 糖 質 を 加 水 分 解 す る 酵 素 群 を 糖 質 分 解 酵 素 （ Glycoside hydrolase : GH family） と し て 分 類 し ており、マイタケ培養工程では -グ ル カ ン 分 解 に 関 わ る と さ れ る GH3 が 3 遺 伝 子 、 セ ル ロ ー ス /ヘ ミ セ ル ロ ー ス /キ シ ラ ン の 分 解 に 関 わ る と さ れ る G H 5 が 3 遺 伝 子 、G H 1 0 が 1 遺 伝 子 、 キ チ ン 分 解 に 関 わ る と さ れ る GH18 が 1 遺 伝 子 、 ペ ク チ ン 分 48 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 解 に 関 わ る と さ れ る GH28 が 2 遺 伝 子 、 同 じ く ペ ク チ ン 分 解 に 関 わ る と さ れ る 炭 化 水 素 エ ス テ ラ ー ゼ (carbohydrate e s t e r a s e : C E f a m i l y に 属 す る C E 8 が 1 遺 伝 子 、a - L - ラ ム ノ シ ダ ー ゼ で あ る G H 7 8 が 1 遺 伝 子 、そ の 他 に も G H 4 7 や G H 5 1 、C E 1 5 と 数 多 く 高 発 現 し て い た 。 糖 転 移 に 関 与 す る 糖 転 移 酵 素 （ Gl ycoside tran sferase :GT fa mily は キ チ ン 分 解 に 関 わ る と さ れ る G T 2 が 1 遺 伝 子 高 発 現 し て い た（ 表 3 - 2 中 に 赤 色 で 示 す ）。 このように、マイタケの培養工程中では培地中の培養基質で あるオガ粉や栄養物であるコーンブラン中の植物性多糖を炭 素源として活用するために、多くのリグニン分解及び多糖分 解に関わる遺伝子が発現していることを確認し、その主要な 遺伝子を特定した。 さらに栽培工程中には、糸状菌に特徴的なハイドロフォー ビ ン (h ydr ophobi n) 遺 伝 子 で あ る hgf1 (Gf.HydA1) [10] と G f . H y d A 2 が 発 現 し て い た （ 表 3 - 2 中 に 緑 色 で 示 す ）。 ハ イ ド ロフォービンは低分子タンパク質で、親水的相互作用によっ て 菌 糸 や 子 実 体 の 形 態 形 成 に 関 与 し て い る と さ れ る [11] 。 シ イ タ ケ に お い て も ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン Le.hyd2 が 、 菌 糸 伸 長 時 に 特 異 的 に 発 現 す る こ と が 報 告 さ れ て い る [12]。 菌 糸 伸 長 時に、ハイドロフォービンが菌糸表面に親水性表面を形成す ることで培地基質であるオガ粉等に結合すると考えられる。 このように、培養工程初期で高発現する遺伝子群からは、 シイタケ等で報告されている培地分解や菌糸伸長に関わる遺 伝子がマイタケでも発現しており、同様の機構が働いている ことが示唆された。リグニンや高分子多糖の分解に関わる遺 49 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 伝子群は、その発現量を指標とすることで、マイタケに培地 をより効率的に分解させて高収量な子実体を得る環境条件設 定が行えると考えられ、ハイドロフォービン遺伝子の発現量 は培養工程において菌糸伸長が順調に進行しているかなどの 指標となることが期待でき、発現遺伝子を栽培工程管理のモ ニタリングツールとして開発するための重要な知見となった。 3.3.2. 芽 出 し 工 程 で 発 現 変 動 す る 遺 伝 子 培養の次は、一般的に「芽出し」と呼ばれ、培養中期から 後期にかけて徐々に形成されてくるマイタケ原基を低温ショ ックと培養工程よりも強い光を与える環境変化によって原基 を充実させる工程である。低温ショックと光照射は同時に行 われるが、この前後で発現が変動する遺伝子をマイクロアレ イ解析によって探索した。その結果、培養工程よりも芽出し 工程で 4 倍以上の発現差が得られた遺伝子は、発現上昇する 遺 伝 子 が 2 1 個 、発 現 抑 制 さ れ る 遺 伝 子 が 3 5 個 だ っ た（ 図 3 - 2 、 表 3 - 3 ）。 芽出しによって発現が上昇する遺伝子群には、低分子熱シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 G f . H S P 9 、い く つ か の タ ン パ ク 質 分 解 酵 素 、 シ ト ク ロ ム P450 な ど が 含 ま れ て い た 。 酵 母 の HSP9 は 、 そ の 遺 伝 子 発 現 は 増 殖 期 に は 検 出 さ れ な い が 、定 常 期 に な る と 1 0 0 倍 以 上 の 高 発 現 と な る こ と が 知 ら れ て い る [13,14]。 ま た 、 高 栄養の培地では発現しないが、最少培地では発現が高まるこ とも知られている。マイタケにおいても、培養中の発現量は 非 常 に 低 か っ た が 、芽 出 し 操 作 を 行 う こ と に よ っ て 11 .5 倍 と 50 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 著 し く 発 現 上 昇 し た （ 表 3 - 3 中 に 紫 色 で 示 す ）。 さ ら に 、 酵 母 の HSP9 は 、 サ イ ク リ ッ ク AMP (cAMP) に よ っ て 発 現 が 制 御 さ れ て い る 。 シ イ タ ケ や ウ シ グ ソ ヒ ト ヨ タ ケ (Coprinus m a c ro r h i z u s ) で は 、 c A M P は 原 基 誘 導 の ト リ ガ ー 物 質 と し て 報 告 さ れ て い る [15,16]。 培 地 中 に 含 ま れ る 炭 素 源 や 窒 素 源 の 量 低 下 は 、担 子 菌 の 子 実 体 生 育 に 至 る 要 因 の 一 つ と さ れ て お り 、 培養工程では低レベルに抑えられ、芽出し工程で強発現する Gf.HSP9 は 栄 養 菌 糸 生 長 か ら 性 生 殖 と し て の 子 実 体 生 育 へ の シフトを考える上で重要な分子となる可能性がある。芽出し 操作によって発現が上昇する遺伝子のうち、プロテアーゼを コードする遺伝子がもっと多く、金属プロテアーゼが 2 遺伝 子、アスパルティックプロテアーゼが 1 遺伝子の合計 3 遺伝 子 が あ っ た （ 表 3 - 3 中 に 橙 色 で 示 す ）。 子 実 体 生 育 に 伴 っ て プ ロテアーゼが発現上昇することはマイタケ以外の食用きのこ でも知られており、エノキタケでは金属プロテアーゼの阻害 剤であるタロぺプチンによって子実体生育が完全に阻害され、 金属プロテアーゼが子実体生育に直接的に関与すると報告さ れ て い る [17]。 シ ト ク ロ ム P 4 5 0 は 、化 合 物 代 謝 に お け る 水 酸 基 導 入 酵 素 と して広く知られているが、担子菌の原基形成に関与すると多 く の 種 で 報 告 さ れ て い る [18-21]。 ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ で は 、 シ ト ク ロ ム P450 を コ ー ド す る eln2 遺 伝 子 の 変 異 に よ っ て 菌 柄 の 伸 長 が 抑 止 さ れ た と 報 告 さ れ て い る [18]。 従 っ て 、 マ イ タケの芽出し操作によって発現が上昇するシトクロム 51 P450 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル も原基形成からそれに続く子実体分化に関与していると考え られる。 芽出し操作によって発現が低下する遺伝子はレクチンや熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 2 0 ( H S P 2 0 ) 遺 伝 子 、バ ク テ リ オ ロ ド プ シ ン 様 タ ン パ ク 質 （ 表 3-3 中 に 紫 色 で 示 す ） や セ ル ラ ー ゼ （ 表 3 - 3 中 に 赤 色 で 示 す ）が 含 ま れ て い た 。ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ の レ ク チ ン C g l 2 遺 伝 子 は マ イ タ ケ の レ ク チ ン と 同 様 に 、原 基 形 成 時 に は そ の 発 現 が 抑 制 さ れ る [22]。 よ っ て 、 こ れ ら の レ ク チンは菌糸伸長に重要であり、子実体生育時には抑制される と考えられる。 芽出し操作によって発現が抑制される遺伝子 で 最 も 多 か っ た の は HSP20 遺 伝 子 で あ り 、 4 種 が 含 ま れ た 。 HSP20 は 、 低 分 子 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 で あ り 、 多 く の サ ブ ユニットがオリゴマーを形成して、熱からタンパク質の凝集 を防ぎ、正しいタンパク質構造になるための折り畳みに関与 していることが知られている。マイタケの培養工程では芽出 し 工 程 や 子 実 体 生 育 工 程 よ り も 温 度 が 高 い た め 、 こ れ ら HSP20 が 活 発 に 働 い て お り 、 芽 出 し 工 程 で 温 度 が 低 下 し た た めに発現が抑制されたのではないかと考えた。バクテリオロ ドプシン様タンパク質は、いくつかの好塩性細菌で光依存的 な イ オ ン チ ャ ン ネ ル と し て 知 ら れ て い る が [23]、 カ ワ ラ タ ケ においてはペンタクロロフェノールによって誘導されること が 報 告 さ れ て お り [24]、 栽 培 培 地 中 の リ グ ニ ン 及 び フ ェ ノ ー ル系化合物分解への関与が考えられる。また、セルラーゼ遺 伝子の発現も培養工程中よりも低下していた。 52 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル このように、雰囲気温度の低下と光強度の上昇によって原 基形成を促進させる芽出し操作によって、プロテアーゼ、シ ト ク ロ ム P450 な ど マ イ タ ケ 以 外 の 食 用 き の こ で 子 実 体 生 育 に関与するとされる分子がマイタケにおいても発現上昇する こ と が 判 明 し た 。 抑 制 さ れ る 遺 伝 子 は 、 HSP20 や 植 物 性 高 分 子多糖など栽培培地分解にかかわるセルラーゼなどが含まれ、 これらは培養工程における栄養菌糸成長から性生殖のための 子実体生育への移行を示していると考えた。 3.3.3. 発 生 工 程 で 発 現 変 動 す る 遺 伝 子 芽操作によって原基形成を促進したのち、栽培袋の上部を開 封して子実体分化を促す。この操作前後で発現量が 4 倍以上 変 化 し た 遺 伝 子 は 187 個 で 、 芽 出 し 操 作 時 と 比 べ て 3.4 倍 と 大 幅 に 増 加 し た 。そ の う ち 、発 現 上 昇 す る 遺 伝 子 が 5 6 遺 伝 子 だ っ た（ 図 3 - 3 , 表 3 - 4 ）。こ の 中 に ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 G f . H y d B 1 が 含 ま れ （ 表 3 - 4 中 に 緑 色 で 示 す ）、 芽 出 し 及 び 子 実体分化誘導に呼応するように発現が誘導されていた。培養 工 程 中 で 発 現 が 高 か っ た ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 Gf.HydA1 及 び Gf.HydA2 は 、 子 実 体 分 化 の 工 程 で は 発 現 量 が 低くなっており、異なる挙動を示した。シイタケのハイドロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 Le.hyd1[25]及 び エ ノ キ タ ケ の Fv-hyd1[26] についても、子実体生育中に発現が上昇しており、マイタケ の ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 と 発 現 挙 動 が 一 致 し た 。よ っ て 、 このハイドロフォービン遺伝子は種間で子実体分化に共通の 役割を担っていると考えられた。しかしながら、マイタケの 53 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル ハイドロフォービンは、培養工程中で高発現の 2 遺伝子 Gf.HydA1、 Gf.HydA2 と 子 実 体 分 化 時 に 高 発 現 す る 1 遺 伝 子 Gf.HydB1 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 す る と 、非 常 に よ く 類 似 し て お り 、わ ず か な 違 い が 異 な る 役 割 を 与 え て い る と 考 え ら れ る 。 そ の 他 に 、G 2 減 数 分 裂 特 異 的 サ イ ク リ ン や ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼの発現量が上昇していた。子実体分化の過程では最終的に 胞子が形成される。子実体を形成できる菌糸は、菌糸中に異 なる 2 核を有する 2 核菌糸であるが、胞子が形成されるまで に 2 核の融合、減数分裂が行われ、これらの遺伝子はこの過 程で必要と考えた。 子 実 体 分 化 に 伴 っ て 発 現 量 が 低 下 す る 遺 伝 子 は 、 131 遺 伝 子 あ っ た 。 芽 出 し 工 程 か ら 引 き 続 き 発 現 量 が 減 少 す る HSP20 遺 伝 子 群 、 4 種 類 の セ ラ ト プ ラ タ ニ ン 様 タ ン パ ク 質 （ 表 3-4 中 に 紫 色 で 示 す ）、 プ ロ テ ア ー ゼ （ 表 3 - 4 中 に 橙 色 で 示 す ） と 多 く の CAZyme s（ 表 3-4 中 に 赤 色 で 示 す ） が 含 ま れ た 。 セ ラ ト プ ラ タ ニ ン は 、 子 嚢 菌 Ceratocystis palani の 細 胞 壁 に 局 在 す る 低 分 子 タ ン パ ク 質 で 、 植 物 へ の 感 染 に 関 与 す る [27,28]。 興味深いことに。マイタケにおいては 4 種類のセラトプラタ ニン様タンパク質ともに芽出し工程後期に発現が増加し、子 実体分化が開始されると急激に減少する。セラトプラタニン 様タンパク質の役割は不明であるがハイドロフォービンと同 様に低分子で親水的であることから、菌糸の伸長を助けるの と同じように子実体分化の構造変化に対応するのではないか と 考 え ら れ た 。プ ロ テ ア ー ゼ 3 遺 伝 子 と 多 く の C A Z y m e s 遺 伝 子の発現量の低下は、芽出し操作後に発現量が低下したセル 54 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル ラーゼと同様の理由で、培養工程中には栽培培地分解に必要 であったが、栄養菌糸成長から性生殖としての子実体分化に シフトすることで発現量が低下したと考えられた。発現量の 低 下 す る プ ロ テ ア ー ゼ は 、 プ ロ テ ア ー ゼ 分 類 （ MEROPS） に よ る セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ と S 8 プ ロ テ ア ー ゼ で あ り 、子 実 体 生 育に伴って発現が上昇する金属プロテアーゼ及びアスパルテ ィックプロテアーゼとは異なる。このことからセリンプロテ ア ー ゼ 及 び S8 プ ロ テ ア ー ゼ は 培 地 中 の タ ン パ ク 質 を 分 解 す ることによる窒素源獲得に重要であり、金属プロテアーゼ及 びアスパルティックプロテアーゼは子実体形成に重要である と考えた。このようにマイタケの栽培工程中で発現が変動す る遺伝子のうち、他の担子菌でも同様の工程で発現が変動し ている遺伝子を見出すことができた。これらの遺伝子は担子 菌に共通の子実体生育機構に関与していると考えられる。し かしながら、これまで栽培工程で発現する遺伝子の発現パタ ーンについて異なる食用きのこ種間で比較された例はほとん どない。そこで、本データが種間比較においても重要な知見 を提供する例として、マイタケの子実体生育に伴って発現量 が 上 昇 す る Gf.HSP9 に つ い て 、 エ リ ン ギ 、 ブ ナ シ メ ジ 及 び シ イ タ ケ の Gf.HSP9 ホ モ ロ グ 遺 伝 子 に つ い て も 各 栽 培 工 程 中 の 発現挙動を把握した。 3.3.4. マ イ タ ケ Gf.HSP9 遺 伝 子 の 全 長 ク ロ ー ニ ン グ 熱 シ ョ ッ ク 蛋 白 質 (heat shock protein: HSP) は 、 他 の 蛋 白 質 の正しいフォールディング等に関与する蛋白質で、多くの場 55 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 合分子量によって命名される。菌類に特徴的な HSP で あ る HSP9 /12 ( IPR0 07250) は 、 低 分 子 HSP で 9 kDa ま た は 12 kDa で あ る 。 低 分 子 HSP は 、 色 々 な 生 物 の 発 生 に 関 与 し て お り 、 厳 格 に 制 御 さ れ て い る [29] 。 出 芽 酵 母 （ Saccharomyces c e r e v i s i a e ）の H S P 1 2 は 、定 常 期 に 入 る と 1 0 0 倍 以 上 高 発 現 す る [13]。 さ ら に 、 HSP12 遺 伝 子 欠 失 変 異 体 の 解 析 か ら HSP12 は、熱ショックや酸化ストレスからの生存に重要であること が 報 告 さ れ て い る [30 ] 。 Sc hi z osa c c ha rom yc e s pom be の HS P9 、 Candida albicans の HSP12 に つ い て も 同 様 の 報 告 が な さ れ て い る [ 1 4 , 3 1 , 3 2 ] 。こ の よ う に 、 菌 類 H S P 9 / 1 2 は ス ト レ ス 適 応 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 。 HSP9/12 は 細 胞 膜 中 に あ っ て 細 胞 膜の流動性を増加させることによってストレスに応答してい る と 考 え ら れ て い る [33,34]。 こ の よ う な 報 告 か ら マ イ タ ケ の Gf.HSP9 遺 伝 子 は 他 の 食 用 き の こ に お い て も 保 存 さ れ て お り 、 マイタケと同様の発現挙動をとると予測した。そこで、それ ぞ れ の 食 用 き の こ に お け る Gf.HSP9 遺 伝 子 ホ モ ロ グ の 挙 動 を 明 ら か に す る た め に 、 ま ず Gf.HSP9 遺 伝 子 の キ ャ ラ ク タ ラ イ ズを行った。 インハウスゲノムデータベースに格納された DNA 配 列 情 報 を 基 に 、 RACE 法 を 行 っ て マ イ タ ケ の HSP9 遺 伝 子 の 全 長 cDNA の 配 列 を 決 定 し 、 Gf.HSP9 と 名 付 け た 。 全 長 cDNA は 417 bp で 、 5’ 非 翻 訳 領 域 が 67 bp、 3’ 非 翻 訳 領 域 が 95 bp と Poly A tail を 含 ん で い た 。 全 長 cDNA と マ イ タ ケ ゲ ノ ム 配 列 [ 3 5 ] の 比 較 か ら 、遺 伝 子 の 構 造 を 明 ら か に し 図 3 - 4 A に 示 し た 。 Gf.HSP9 遺 伝 子 は 、 ゲ ノ ム 上 に シ ン グ ル コ ピ ー で 存 在 し 、 4 56 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル つのエクソンと 3 つのイントロンから構成されていた。 G f . H S P 9 遺 伝 子 の ホ モ ロ グ で あ る 酵 母 S . c e re v i s i a e H S P 1 2 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に は 、 二 つ の 予 測 TATA ボ ッ ク ス と 二 つ の 熱 シ ョ ッ ク エ レ メ ン ト （ heat shock element: HSE ） の コ ン セ ン サ ス 配 列 で あ る CNNGAANNTTCNNGG が 存 在 す る [13]。 酵 母 S . p o m b e の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に は 、 TATA ボ ッ ク ス と 上 記 HSE と は 異 な る コ ン セ ン サ ス 配 列 の AGAAN の inve rted r e p e a t と 3 つ の ス ト レ ス 反 応 配 列 C C C C T（ も し く は A G G G G G ） (STRE)が 存 在 す る [31]。 Gf.HSP9 遺 伝 子 の 上 流 500 bp ま で に は 、 上 流 9 9 b p に TATA ボ ッ ク ス 様 配 列 、 4 2 9 b p 、 4 5 7 b p 上 流 に 2 つ の S T R E が 存 在 し た 。し か し な が ら 、2 つ の 酵 母 の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に み ら れ た HSE 配 列 に つ い て は 認 め ら れ な か っ た 。 Gf . HSP9 は 、 分 子 量 8.9 8 kDa と 推 定 さ れ 、 2 次 構 造 の 解 析 結 果 か ら 、 4 つ の ら せ ん 構 造 を 有 し た （ 図 3 - 4 B ）。 こ れ は G f . H S P 9 の ホ モ ロ グ で あ る S . c e re v i s i a e の H S P 1 2 も 同 じ 構 造 で あ っ た [36]。 HSP12 は こ の 4 つ の ら せ ん 構 造 で 脂 質 に 結 合 し [36]、 脂 質 シ ャ ペ ロ ン と し て 細 胞 膜 の 安 定 化 に 寄 与 し て い る [30]。 よ っ て 、 Gf.HSP9 に つ い て も HSP12 と 同 様 に 細 胞 膜 への結合活性を有していると考えられた。 S . c e re v i s i a e H S P 1 2 遺 伝 子 、 S . p o m b e H S P 9 遺 伝 子 は そ れ ぞ れ 37˚C で 40 分 も し く は 60 分 の 熱 シ ョ ッ ク に よ り 発 現 が 誘 導 さ れ る [13,14]。 C. albicans HSP12 遺 伝 子 で は 、 45˚C10 分 の 熱 シ ョ ッ ク で 発 現 が 誘 導 さ れ る [32]。 し か し な が ら 、 マ イ タ ケ に お い て は 42˚C120 分 ま で 発 現 量 を 調 査 し た が 、 誘 導 さ れ な か っ た 。 Gf.HSP9 遺 伝 子 は プ ロ モ ー タ ー 領 域 に HSE が 存 在 し 57 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル な い こ と と 4 2 ˚ C で 発 現 が 誘 導 さ れ な い こ と か ら（ 図 3 - 5 ）、熱 シ ョ ッ ク 単 体 に よ る 誘 導 は か か ら な い と 考 え ら れ た 。 C. a l b i c a n s で は 熱 以 外 に も 、二 酸 化 炭 素 濃 度 や p H の 変 化 に よ っ て 発 現 量 が 上 が る こ と が 報 告 さ れ て い る が [32]、 一 方 で 、 S. c e re v i s i a e で は 誘 導 さ れ な い [ 3 7 ] 。 こ の よ う に 、 生 物 種 に よ っ て HSP9/12 の 発 現 が 誘 導 さ れ る ス ト レ ス が 異 な る 可 能 性 が あ る。 3.3.5. 食 用 き の こ に お け る Gf.HSP9 遺 伝 子 ホ モ ロ グ の 探 索 マ イ タ ケ Gf.HSP9 の ホ モ ロ グ が 他 の 食 用 き の こ に 存 在 す る かどうかを探索するために、インハウストランスクリプトー ム デ ー タ ベ ー ス を 検 索 し た 。そ の 結 果 、エ リ ン ギ か ら P e . H S P 9 遺 伝 子 ( AB7 81108) 、 ブ ナ シ メ ジ か ら Hm.HSP9 遺 伝 子 ( A B 7 8 1 1 0 9 ) 、シ イ タ ケ L e . H S P 9 遺 伝 子 ( A B 7 8 1 1 1 0 ) を 同 定 し た 。 Gf.HSP9 の ア ミ ノ 酸 配 列 と の 相 同 性 を 比 較 し た と こ ろ 、 Pe. HSP9 と 6 2%、 Hm. HSP9 と 52%、 Le. HS P9 と 52% と こ の 食 用きのこ 4 種の間でよく保存されていた。アミノ酸配列のア ラ イ メ ン ト 比 較 を 図 3 - 6 A に 示 す 。G f . H S P 9 、P e . H S P 9 、H m . H S P 9 、 L e . H S P 9 の 三 次 元 構 造 を 予 測 す る と 、図 3 - 6 B に 示 す よ う に 非 常に類似した構造が予測された。さらに、マイタケ以外の HSP9 ホ モ ロ グ も Gf . HSP9 と 同 様 に 4 つ の ら せ ん 構 造 を 有 し て い た 。こ れ ら の 結 果 か ら 、H S P 9 ホ モ ロ グ は そ れ ぞ れ の 生 物 に おいて同じ働きをすると考えられた。 3.3.6. 栽 培 工 程 中 に お け る Gf.HSP9 の 発 現 パ タ ー ン 58 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル Gf.HSP9、Pe.HSP9、Hm.HSP9 遺 伝 子 の そ れ ぞ れ の 食 用 き の こ の 栽 培 工 程 に お け る 発 現 量 と そ の パ タ ー ン を 定 量 PCR に よ って解析した。その結果驚くべきことに、マイタケ、エリン ギ 、 ブ ナ シ メ ジ 全 て の HSP9 遺 伝 子 の 発 現 パ タ ー ン は 同 じ で あ っ た（ 図 3 - 7 ）。い ず れ も 培 養 工 程 で は 発 現 量 が 低 か っ た が 、 子実体分化が進むにつれて発現量が増加し、最終的には培養 工 程 と 比 較 し た 相 対 値 で マ イ タ ケ で 約 450 倍 、 エ リ ン ギ で 約 2 , 4 0 0 倍 、ブ ナ シ メ ジ で 約 3 0 倍 と な っ た 。シ イ タ ケ の L e . H S P 9 遺 伝 子 で は 、 Lon gS AGE 法 と 定 量 PCR に よ っ て 胞 子 形 成 前 後 で 発 現 量 が 上 昇 す る と 報 告 さ れ て い る の で [38]、 シ イ タ ケ に お い て も 同 様 の 発 現 パ タ ー ン で あ る と 予 想 さ れ る 。 C. albicans HSP12 遺 伝 子 を 過 剰 発 現 さ せ る と 、 細 胞 が 凝 集 す る 知 見 が あ る こ と か ら [32]、HSP9 は 子 実 体 の よ う な 大 型 の 構 造 を作るための細胞間接着に関与している可能性が考えられる。 こ の 可 能 性 を 検 証 す る た め に 、 Gf.HSP9 遺 伝 子 の 発 現 抑 制 株 を解析する必要がある。 アミノ酸配列及び推定三次元構造の類似性、栽培工程にお け る 発 現 パ タ ー ン の 類 似 性 か ら 、H S P 9 は 4 種 類 の 食 用 き の こ において子実体分化に関わる同じ機能を有していると考えら れた。特に、細胞間接着などの細胞間相互作用による安定化 して子実体分化に寄与している可能性が考えられた。それゆ え に 、H S P 9 遺 伝 子 は 栽 培 工 程 中 に お け る 子 実 体 発 生 を モ ニ タ リ ン グ す る た め の 有 用 な マ ー カ ー と な り え る 。 Gf.HSP9 遺 伝 子とそのホモログの解析から、マイタケの栽培工程中で発現 する遺伝子とその発現パターンの情報は、マイタケの子実体 59 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 生育機構解明や栽培工程管理のための情報としてだけでなく、 食用きのこの共通の子実体生育機構の解明のためにも重要な 情報となることを示した。 60 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 表 3-2. 培 養 工 程 初 期 で 高 発 現 し て い る 遺 伝 子 No. putative gene products organism similarity 1 ycac protein Tuber melanosporum 82 2 CBM1 containing protein Coprinopsis cinerea 72 3 unknown Coprinopsis cinerea 79 4 hydrophobin (Gf.HydA2) Phlebiopsis gigantea 75 5 salicylate hydroxylas e Postia placenta 80 6 voltage-gated potassium channel Coprinopsis cinerea 87 7 GH5, endo-1,4-b-glucanase Postia placenta 84 8 GH13, a-amylas e Schizophyllum commune 75 9 GH10, endo-1,4 -b-xylanase Postia placenta 79 10 unknown Postia placenta 82 11 unknown Laccaria bicolor 74 12 GH51, a-L-arabinofuranosidas e L. gongylophorus 59 13 unknown 14 aminotrans feras e Coprinopsis cinerea 69 15 GH18, chitinase Postia placenta 79 16 manganese superoxide dismutase P. chrysosporium 94 17 carboxypeptidas e cpds Schizophyllum commune 72 18 6-phosphogluconolactonas e Postia placenta 70 19 histidine acid phos phatas e Postia placenta 73 20 laccase Trametes versicolor 80 - 61 - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 21 unknown - 22 unknown Laccaria bicolor 95 23 GH47, 1,2 -a-mannosidas e Postia placenta 81 24 unknown - - 25 unknown - - 26 pq loop repeat protein M. perniciosa 86 27 unknown Postia placenta 81 28 unknown Postia placenta 82 29 acetoin dehydrogenase Postia placenta 70 30 unknown - - 31 unknown - - 32 unknown - - 33 manganese peroxidase Ceriporiopsis rivulosa 95 34 GT2 Laccaria bicolor 89 35 unknown 36 GH5, cellulase Postia placenta 80 37 2,4-dichlorophenol 6 -monooxygenas e Penicillium marneffei 51 38 unknown Postia placenta 85 39 acyl- oxidase Aspergillus oryzae 63 40 unknown - - 41 unknown - - 42 unknown M. perniciosa 53 43 fa mil y meth yltrans feras e S. hygroscopicus 75 44 unknown - 45 unknown Postia placenta - 62 - - 67 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 46 unknown Postia placenta 75 47 CE8, pectin methylesterase Sclerotinia sclerotiorum 68 48 small heat shock protein Coprinopsis cinerea 68 49 unknown - - 50 unknown - - 51 unknown - - 52 unknown Laccaria bicolor 70 53 short-chain deh ydrogenase reductase sdr Brevundimonas sp. 65 54 GH5, glucan 1,3 -b-glucosidas e Postia placenta 78 55 GH3, b-glucosidas e P. chrysosporium 84 56 unknown Postia placenta 59 57 alcohol deh ydrogenase Postia placenta 86 58 unknown M. perniciosa 71 59 unknown - - 60 unknown - - 61 GH3, 1,4-b-xylosidas e M. perniciosa 63 62 unknown Postia placenta 75 63 ketol-acid reductois omeras e Schizophyllum commune 95 64 unknown 65 unknown Laccaria bicolor 61 66 aldo-keto reductase puatative Postia placenta 76 67 alpha beta h ydrolase Postia placenta 72 68 major royal jell y protein Schizophyllum commune 69 69 GH28, endo-polygalacturonas e L. gongylophorus 82 70 aldo keto reductase Coprinopsis cinerea 83 - 63 - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル Ajellomyces capsulatus 52 unknown Postia placenta 76 73 GH78, alpha -l-rhamnosidas e Postia placenta 85 74 unknown Postia placenta 91 75 unknown - - 76 unknown - - 77 unknown T. camphoratus 81 78 unknown Postia placenta 64 79 CE15 Leptosphaeria maculans 79 80 unknown 81 unknown 82 unknown - - 83 unknown - - 84 short chain dehydrogenas e reductas e M. perniciosa 65 85 retinol dehydrogenase Postia placenta 62 86 flavonol s ynthase Postia placenta 85 87 vacuolar s orting protein Schizophyllum commune 69 88 hydroquinone glucos yltrans feras e Postia placenta 71 89 unknown Postia placenta 59 90 cytochrome p450 T. camphoratus 82 91 unknown Postia placenta 74 92 unknown Coprinopsis cinerea 51 93 unknown 94 Lipase M. perniciosa 66 95 Lipase Pleurotus sapidus 68 71 stress responsive 72 protein Postia placenta - 64 73 - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 96 carboxylesterase Pleurotus sapidus 70 97 GH3, b-glucosidas e Postia placenta 87 98 acetoin reductase M. perniciosa 68 99 HGFI (Gf.HydA1) Grifola frondosa 100 similarity は 、 NCBI デ ー タ ベ ー ス 中 で 最 も 類 似 し て い た 相 同 遺 伝 子 と の 相 同 性 割 合 を 示 し 、そ の 生 物 種 を o rga ni sm に 示 す 。 表 中 、 ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 を 緑 色 、 CAZymes に 分 類される糖質分解関連酵素遺伝子を赤色、リグニン分解関連 酵素遺伝子を青色のハイライトで示す。 65 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 表 3-3. 芽 出 し 工 程 で 培 養 工 程 と 比 較 し て 発 現 変 動 す る 遺伝子 発現上昇した遺伝子群 No. FC Putative Gene Products Organism 1 11.5 HSP9 2 10.5 unknown 3 8.6 extracellular protease Grif ola Frondosa 100 4 8.5 glutathione s-trans feras e Laccaria bicolor 76 5 8.2 deu t er ol ys in m35 m e ta ll op r ot ea s e S. commune 73 6 7.5 unknown Laccaria bicolor 56 7 7.3 aspartic peptidase a1 Irpex Lacteus 88 8 6.8 unknown - - 9 6.4 unknown - - 10 6.1 phen ylalanine ammonium lyas e S. commune 71 11 5.3 aldehyde dehydrogenase S. commune 63 12 4.9 dna-binding protein Gibberella zeae 54 13 4.5 unknown - - 14 4.3 unknown - - 15 4.3 unknown - - 16 4.2 unknown - - Coprinopsis cinerea - 66 Similarity 84 - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 17 4.2 unknown - - 18 4.2 unknown S. commune 61 19 4.2 ribonucleotide reductase S. commune 97 20 4.1 ribonucleotide reductase Coprinopsis cinerea 93 21 4.1 cytochrome p45 0 N. niveotomentosa 87 発現抑制された遺伝子群 No. FC Putative Gene Products Organism Similarity 1 10.9 lectin - - 2 10.9 HSP20 S. commune 70 3 9.0 HSP20 S. commune 81 4 7.1 class v chitinase Aspergillus clavatus 51 5 7.1 pyridoxal reductas e Coprinopsis cinerea 74 6 6.9 unknown 7 6.1 HSP20 Laccaria bicolor 63 8 6.1 glutamyl-trna amidotrans ferase Postia placenta 76 9 5.3 unknown - - 10 4.9 unknown - - 11 4.8 unknown - - - 67 - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル Coprinopsis cinerea 12 4.7 HSP20 13 4.7 unknown - - 14 4.7 unknown - - 15 4.6 unknown - - 16 4.6 unknown - - 17 4.5 unknown S. commune 18 4.5 unknown - 19 4.5 unknown 20 4.3 unknown - - 21 4.3 unknown - - 22 4.3 unknown - - 23 4.2 unknown - - 24 4.2 unknown - - 25 4.2 unknown M. perniciosa 75 26 4.1 bacterialrhodopsin-like protein Trametes versicolor 78 27 4.1 macrolid e-b indin g protein fkb p12 Postia placenta 92 28 4.1 unknown - - 29 4.1 unknown - - 30 4.1 GH27, alpha -galactos idas e P. chrysosporium 85 31 4.1 unknown Conexibacter woesei 64 32 4.1 endo-1,4-beta-d-glucanase Polyporus arcularius 85 33 4.0 unknown - - 34 4.0 unknown - - Conexibacter woesei 68 68 71 58 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル similarity は 、 NCBI デ ー タ ベ ー ス 中 で 最 も 類 似 し て い た 相 同 遺 伝 子 と の 相 同 性 割 合 を 示 し 、そ の 生 物 種 を o rga ni sm に 示 す 。 FC は 、 培 養 工 程 と 比 較 し た と き に 、 芽 出 し 工 程 で の 発 現 量 差（ 倍 ）を 示 す 。ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 を 緑 色 、C A Z y m e s に分類される糖質分解関連酵素遺伝子を赤色、リグニン分解 関連酵素遺伝子を青色、蛋白質分解酵素遺伝子を橙色、熱シ ョック蛋白質及びレクチンを紫色のハイライトで示す。 69 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 表 3-4. 発 生 工 程 で 芽 出 し 工 程 と 比 較 し て 発 現 変 動 す る 遺伝子 発現上昇した遺伝子群 No. FC 1 20.8 2 Putative Gene Products Organism Similarity unknown - - 19.9 unknown - - 3 12.9 unknown - - 4 9.9 unknown 5 9.1 hydrophobin 6 8.2 7 Postia placenta 77 Coprinopsis cinerea 71 g2 mitotic-specific cyclin 3 Laccaria bicolor 76 8.1 phospholipid s ynthase M. perniciosa 92 8 8.1 unknown - - 9 7.5 unknown - - 10 7.5 unknown - - 11 7.4 unknown - - 12 7.3 unknown - - 13 7.3 unknown 14 7.2 unknown 15 7.1 cytochrome c peroxidas e 16 7.1 unknown Gf.HydB1 Coprinopsis cinerea Coprinopsis cinerea - 70 87 92 - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル - 17 6.9 unknown 18 6.4 hmg box-containing protein 19 6.3 unknown 20 6.2 unknown 21 6.0 unknown 22 6.0 aldehyde dehydrogenase S. commune 63 23 5.9 2-oxoisovalerate dehydrogenas e P. graminis 76 24 5.9 unknown Laccaria bicolor 56 25 5.5 peroxidas e C. disseminatus 72 26 5.3 unknown 27 4.9 ribonucleotide reductase Coprinopsis cinerea 93 28 4.9 ribonucleotide reductas e S. commune 97 29 4.8 aspartic peptidase a1 Irpex Lacteus 88 30 4.8 protein Laccaria bicolor 52 31 4.7 unknown 32 4.5 dna topois omeras e ii Coprinopsis cinerea 33 4.4 small nuclear ribonucleoprotein Postia placenta 34 4.4 oxaloacetate acet ylhydrolas e S. commune 35 4.3 unknown - - 36 4.3 unknown - - 37 4.3 reticulum calcium atpase Coprinopsis cinerea 85 38 4.2 unknown M. perniciosa 67 39 4.2 wd repeat -containing protein Coprinopsis cinerea 68 40 4.2 oxaloacetate acet ylhydrolas e Coprinopsis cinerea 98 41 4.2 dihydrodipicolinate s ynthetase Laccaria bicolor 87 Laccaria bicolor M. perniciosa - - - 71 75 81 - - 64 100 95 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 42 4.2 aden yl yl -sulfa te kinas e Coprinopsis cinerea 87 43 4.1 oxidoreductase A. capsulatus 74 44 4.1 hydroxymethylglutaryl -s ynthase Laccaria bicolor 73 45 4.1 unknown - - 46 4.1 unknown - - 47 4.1 unknown S. commune 62 48 4.1 unknown Laccaria bicolor 58 49 4.1 unknown Laccaria bicolor 47 50 4.1 methyltrans ferase Laccaria bicolor 80 51 4.1 unknown - - 52 4.1 unknown - - 53 4.0 unknown Bacillus sp. 54 4.0 unknown - - 55 4.0 unknown - - 56 4.0 dna-binding protein Gibberella zeae 47 54 発現抑制された遺伝子群 Similarit No. FC Putative Gene Products Organism y 72 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 1 99.0 unknown 2 87.9 unknown 3 48.2 4 Postia placenta 67 - - cerato-platanin Nectria haematococca 75 41.5 proteas e s8 tripeptid yl peptidase Postia placenta 70 5 41.4 cerato-platanin Postia placenta 68 6 40.4 unknown Postia placenta 70 7 29.5 unknown Coprinopsis cinerea 78 8 23.2 phosphopyruvate hydratase Laccaria bicolor 88 9 22.8 HSP20 S. commune 81 10 20.8 cerato-platanin Laccaria bicolor 85 11 17.2 proteas e s8 tripeptid yl peptidase Postia placenta 75 12 16.0 bacterialrhodopsin-like protein Trametes versicolor 78 13 15.0 unknown - - 14 12.5 unknown - - 15 11.9 unknown Nectria haematococca 72 16 11.9 unknown A. dermatitidis 57 17 11.3 unknown Postia placenta 78 18 11.3 unknown 19 10.3 HSP20 S. commune 70 20 10.1 alpha-galactosidas e P. chrysosporium 85 21 9.4 tyrosinas e G. graminicola 46 22 9.4 unknown 23 9.3 acetoin reductase 24 9.1 unknown - - 25 9.0 unknown - - - M. perniciosa 73 - 68 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 26 8.8 unknown Conexibacter woesei 58 27 8.7 gmc oxidoreductase S. commune 88 28 8.6 HSP20 S. commune 58 29 7.7 unknown 30 7.7 unknown 31 7.5 unknown 32 7.5 cerato-platanin 33 7.4 unknown - - 34 7.4 unknown - - 35 7.2 serine protease Grifola frondosa 36 7.1 gmc oxidoreductase S. commune 76 37 7.1 unknown Conexibacter woesei 64 38 7.1 alcohol deh ydrogenase Postia placenta 75 39 6.7 HSP20 Laccaria bicolor 63 40 6.6 unknown - - 41 6.6 unknown - - 42 6.6 unknown Coprinopsis cinerea 43 43 6.5 unknown Laccaria bicolor 70 44 6.5 unknown S. commune 72 45 6.4 cyclohydrolas e Coprinopsis cinerea 70 46 6.3 unknown - - 47 6.3 unknown - - 48 6.2 unknown - - 49 6.2 unknown - - 50 6.2 unknown S. commune Coprinopsis cinerea T. camphoratus 74 57 70 100 74 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 51 6.2 unknown - 52 6.1 alpha beta hydrolas e fold protein M. perniciosa 47 53 6.1 protein-er retention-related Laccaria bicolor 82 54 6.1 unknown - - 55 6.1 unknown - - 56 6.1 short-chain deh ydrogenase 57 6.0 unknown - - 58 5.9 unknown - - 59 5.9 d-amino acid 60 5.8 unknown 61 5.8 cycloheximide res istance Pyrenophora tritici 59 62 5.6 unknown M. perniciosa 77 63 5.6 unknown 64 5.6 3-ketoacyl-acyl reductase Laccaria bicolor 65 65 5.5 mitochondrial hypoxia protein Postia placenta 82 66 5.3 unknown Postia placenta 88 67 5.3 unknown 68 5.3 glycoside hydrolase family 31 Postia placenta 67 69 5.2 unknown Laccaria bicolor 73 70 5.1 aldehyde dehydrogenase Postia placenta 82 71 5.1 unknown - - 72 5.1 unknown - - 73 5.1 unknown - - 74 5.1 HSP20 M. perniciosa 87 75 5.0 unknown Postia placenta 51 M. perniciosa S. commune - - - 75 - 55 69 - - - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル Coprinopsis cinerea 76 5.0 pyridoxal reductas e 77 4.9 unknown 78 4.9 glycoside hydrolase family 79 79 4.8 unknown - - 80 4.8 unknown - - 81 4.8 unknown - - 82 4.7 unknown 83 4.7 unknown 84 4.7 glycos yl h ydrolase family 8 8 Postia placenta 83 85 4.7 apc amino acid permease Postia placenta 82 86 4.7 unknown - - 87 4.6 unknown - - 88 4.6 pectin esteras e fa mil y protein S. commune 77 89 4.6 gtp cyclohydrolas e-2 S. commune 80 90 4.6 unknown - - 91 4.6 unknown - - 92 4.6 abc transporter Coprinopsis cinerea 71 93 4.6 glycoside hydrolase family 18 Laccaria bicolor 85 94 4.5 unknown Laccaria bicolor 52 95 4.5 unknown 96 4.5 unknown 97 4.5 unknown - - 98 4.5 unknown - - 99 4.5 unknown - - 100 4.4 unknown - - Laccaria bicolor Laccaria bicolor - Postia placenta 76 74 72 82 - 73 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 101 4.4 unknown - - 102 4.4 unknown - - 103 4.4 short-chain deh ydrogenase Coprinopsis cinerea 79 104 4.4 rho gtpase activating protein 22 Coprinopsis cinerea 61 105 4.3 serine protease Aspergillus oryzae 47 106 4.3 unknown - - 107 4.3 unknown - - 108 4.3 unknown - - 109 4.3 response regulator receiver 110 4.3 unknown 111 4.2 unknown 112 4.2 unknown - - 113 4.2 unknown - - 114 4.2 unknown - - 115 4.2 unknown - - 116 4.2 unknown - - 117 4.2 unknown - - 118 4.2 unknown - - 119 4.2 thaumatin-like protein Lentinula edodes 79 120 4.2 alpha-l-rhamnosidas e Postia placenta 85 121 4.1 universal stress protein Postia placenta 94 122 4.1 unknown - - 123 4.1 unknown - - 124 4.1 homos erine o-acet yltrans feras e 125 4.1 unknown Laccaria bicolor Coprinopsis cinerea Bradyrhizobium sp. - 77 98 61 63 - 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル Aspergillus niger 126 4.1 glycoside hydrolase family 95 127 4.1 unknown - - 128 4.1 unknown - - 129 4.0 glycoside hydrolase family 3 130 4.0 unknown - - 131 4.0 unknown - - P. chrysosporium 83 84 similarity は 、 NCBI デ ー タ ベ ー ス 中 で 最 も 類 似 し て い た 相 同 遺 伝 子 と の 相 同 性 割 合 を 示 し 、そ の 生 物 種 を o rga ni sm に 示 す 。 FC は 、 芽 出 し 工 程 と 比 較 し た と き に 、 発 生 工 程 で の 発 現 量差（倍）を示す。ハイドロフォービン遺伝子及びセラタプ ラ タ ニ ン 様 蛋 白 質 遺 伝 子 を 緑 色 、 C AZ ym e s に 分 類 さ れ る 糖 質 分解関連酵素遺伝子を赤色、リグニン分解関連酵素遺伝子を 青色、蛋白質分解酵素遺伝子を橙色、熱ショック蛋白質及び レクチンを紫色のハイライトで示す。 78 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-1. マ イ タ ケ 栽 培 の 培 養 工 程 で 高 発 現 す る 遺伝子群の抽出 培養工程で高発現する遺伝子を抽出するために、培養初期 と (1 : 植 菌 20 日 目 )と 培 養 終 了 時（ 2 : 植 菌 74 日 目 ）の 遺 伝 子 の 発 現 量 を 比 較 し 、 培 養 初 期 で 高 発 現 で あ る 遺 伝 子 を 99 個 、 低 発 現 で あ る 遺 伝 子 を 110 個 見 出 し た 。 高 発 現 な 遺 伝 子 の う ち 、 機 能 推 定 で き る Gene ont olog y ( GO) 用 語 が 付 与 さ れ た 遺 伝 子 は 5 3 個（ 5 4 % ）、機 能 未 知 で あ る が 既 に N C B I 公 共 デ ー タ ベースに登録のある配列とのホモロジーがある遺伝子が 23 個 （ 2 3 % ）、 新 規 遺 伝 子 が 2 3 個 （ 2 3 % ） で あ っ た 。 一 方 、 培 養 後 期 よ り も 培 養 初 期 で 発 現 が 低 い 遺 伝 子 は 110 個 見 出 さ れ 、 機 能 推 定 で き る GO 用 語 が 付 与 さ れ た 遺 伝 子 は 3 4 個 （ 3 1 % ）、 機 能 未 知 で あ る が 既 に N C B I 公 共 デ ー タ ベ ー ス 79 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル に 登 録 の あ る 配 列 と の ホ モ ロ ジ ー が あ る 遺 伝 子 が 2 2 個（ 2 0 % ）、 新 規 遺 伝 子 が 54 個 （ 49%） で あ っ た 。 80 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-2. マ イ タ ケ 栽 培 の 芽 出 し 工 程 で 培 養 工 程 と 比 較 し て 発 現変動する遺伝子群の抽出 芽出し工程で発現する遺伝子とその発現パターンを抽出す る た め に 、培 養 工 程 ( 1 : 植 菌 2 0 日 目 , 2 : 7 4 日 目 ) と 芽 出 し 工 程 （ 3: 植 菌 75 日 目 , 4: 77 日 目 , 5: 80 日 目 ） の 遺 伝 子 の 発 現 量 を 比 較 し 、芽 出 し 工 程 で 高 発 現 で あ る 遺 伝 子 を 2 1 個 、発 現 が 抑 制 さ れ る 遺 伝 子 を 35 個 見 出 し た 。 高 発 現 な 遺 伝 子 の う ち 、 機 能 推 定 で き る Ge ne ontolo g y ( GO) 用 語 が 付 与 さ れ た 遺 伝 子 は 1 1 個（ 5 2 % ）、機 能 未 知 で あ る が 既 に N C B I 公 共 デ ー タ ベ ー スに登録のある配列とのホモロジーがある遺伝子が 2 個 （ 1 0 % ）、 新 規 遺 伝 子 が 8 個 （ 3 8 % ） で あ っ た 。 一 方 、培 養 工 程 よ り も 芽 出 し 工 程 で 発 現 が 低 い 遺 伝 子 は 35 個 見 出 さ れ 、 機 能 推 定 で き る GO 用 語 が 付 与 さ れ た 遺 伝 子 は 1 3 個 （ 3 7 % ）、 機 能 未 知 で あ る が 既 に N C B I 公 共 デ ー タ ベ ー ス 81 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル に 登 録 の あ る 配 列 と の ホ モ ロ ジ ー が あ る 遺 伝 子 が 4 個（ 1 1 % ）、 新 規 遺 伝 子 が 18 個 （ 51%） で あ っ た 。 82 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-3. マ イ タ ケ 栽 培 の 発 生 工 程 で 芽 出 し 工 程 と 比 較 し て 発 現変動する遺伝子群の抽出 発生工程で発現する遺伝子とその発現パターンを抽出する た め に 、芽 出 し 工 程（ 3 : 植 菌 7 5 日 目 , 4 : 7 7 日 目 , 5 : 8 0 日 目 ） と 発 生 工 程 （ 6: 植 菌 81 日 目 , 7: 83 日 目 , 8: 88 日 目 ） の 遺 伝 子 の 発 現 量 を 比 較 し 、発 生 工 程 で 高 発 現 で あ る 遺 伝 子 を 5 6 個 、 低 発 現 で あ る 遺 伝 子 を 131 個 見 出 し た 。 高 発 現 な 遺 伝 子 の う ち 、 機 能 推 定 で き る Gene ont olog y ( GO) 用 語 が 付 与 さ れ た 遺 伝 子 は 2 3 個（ 4 1 % ）、機 能 未 知 で あ る が 既 に N C B I 公 共 デ ー タ ベースに登録のある配列とのホモロジーがある遺伝子が 10 個 （ 1 8 % ）、 新 規 遺 伝 子 が 2 3 個 （ 4 1 % ） で あ っ た 。 一 方 、芽 出 し 工 程 よ り も 発 生 工 程 で 発 現 が 低 い 遺 伝 子 は 1 3 1 個 見 出 さ れ 、 機 能 推 定 で き る GO 用 語 が 付 与 さ れ た 遺 伝 子 は 83 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 4 8 個 （ 3 7 % ）、 機 能 未 知 で あ る が 既 に N C B I 公 共 デ ー タ ベ ー ス に 登 録 の あ る 配 列 と の ホ モ ロ ジ ー が あ る 遺 伝 子 が 2 1 個（ 1 6 % ）、 新 規 遺 伝 子 が 63 個 （ 47%） で あ っ た 。 84 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-4. Gf.HSP9 の 構 造 A : G f . H S P 9 遺 伝 子 の 構 造 。白 抜 き の 部 分 は 、非 翻 訳 領 域 を 、 黒 塗 り の 部 分 は エ ク ソ ン を 示 す 。AT G 開 始 コ ド ン の 5 0 0 b p 上 流 部 分 に は 、TATA ボ ッ ク ス 様 配 列 ( TATA ) と ス ト レ ス レ ス ポ ン ス エ レ メ ン ト (STRE)が 2 つ 予 測 さ れ た 。 B: Gf . HSP9 蛋 白 質の予測 2 次構造。 85 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-5. 熱 シ ョ ッ ク に よ る Gf.HSP9 mRNA の 発 現 量 変 化 25˚C 培 養 か ら 42˚C 温 浴 に 移 す 前 (0 min)と 移 し た 後 (30, 60, 90, 120 min)の Gf.HSP9 の mRNA 量 の 経 時 変 動 。 86 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-6. HSP9 蛋 白 質 の 比 較 A: Gf . HSP 9 、 Pe. HS P9、 Hm. H SP9 、 Le. HS P9 の ア ミ ノ 酸 配 列 の 比 較 と 、 B : 予 測 三 次 元 構 造 の 比 較 。い ず れ の 食 用 き の こ の HSP9 も ア ミ ノ 酸 配 列 の 一 次 元 構 造 及 び 予 測 三 次 元 構 造 と も に高度に保存されていた。 87 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-7. キ ノ コ 栽 培 工 程 に お け る HSP9 遺 伝 子 の 発 現 挙 動 マ イ タ ケ の Gf.HSP9（ ● ） の 発 現 挙 量 は 、 植 菌 後 20 日 、 50 日 、7 4 日 、7 5 日 、8 0 日 、8 4 日 で 測 定 し た 。エ リ ン ギ の P e . H S P 9 （ ○ ）の 発 現 量 は 、植 菌 後 1 0 日 、2 0 日 、3 0 日 、3 6 日 、3 9 日 、 4 6 日 で 測 定 し た 。ブ ナ シ メ ジ の H m . H S P 9 （ ■ ）の 発 現 量 は 、 植 菌 後 30 日 、 60 日 、 90 日 、 101 日 、 108 日 、 111 日 で 測 定 し た。 い ず れ の 食 用 き の こ の HSP9 遺 伝 子 も そ れ ぞ れ の 栽 培 工 程 において子実体生育に伴って発現量が急増していた。 88 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 3.4. ま と め 本章では、マイタケの栽培工程で発現する遺伝子とその発 現プロファイルを特定するために、第 2 章で整備したトラン スクリプトーム情報から作製したマイクロアレイを用いて遺 伝子の発現度合を調べ、その結果を基に解析を行った。その 結論は、次のように摘要される。 1. マ イ タ ケ の 培 養 工 程 で 高 発 現 し て い た 99 遺 伝 子 を 公 共 の 遺 伝 子 デ ー タ ー ベ ー ス か ら 同 定 す る と と も に 、そ れ ら の 機 能 を 推 定 し た 。マ イ タ ケ は 培 養 工 程 で は 、培 地 成 分 の 分 解 を 通 し て 炭 素 源 と し て の 栄 養 を 獲 得 す る た め に 、リ グ ニ ン 分 解 に 関 与 す る F O Ly m e s 、 糖 質 分 解 に 関 与 す る C A Z y m e s が 多 く 発 現 し て お り 、窒 素 源 獲 得 に は タ ン パ ク 質 分 解 酵 素 が 発 現 し て い た 。ま た 、菌 糸 伸 長 に 関 与 す る 2 種 類 の ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子（ G f . H y d A 1 , G f . H y d A 2 ）を 特 定 し た 。 2. マ イ タ ケ の 子 実 体 原 基 分 化・生 育 促 進 を 行 う 芽 出 し 工 程 で は、培養工程と比較して発現が上昇していた遺伝子を 21 個 、 発 現 が 抑 制 さ れ て い た 遺 伝 子 を 34 個 特 定 し 、 そ れ ら の う ち 4 倍 以 上 発 現 量 が 変 化 し た 遺 伝 子 は 55 遺 伝 子 あ っ た 。そ れ ら の な か に は 、担 子 菌 で は 子 実 体 生 育 に 伴 っ て 発 現上昇することから子実体生育に関与しているとされる、 低 分 子 熱 シ ョ ッ ク タ ン パ ク 質 で あ る HSP9 や プ ロ テ ア ー ゼ 、 シ ト ク ロ ム P450 な ど の 遺 伝 子 が 含 ま れ て い た 。 発 現 が 抑 制 さ れ て い た 遺 伝 子 は 、H S P 2 0 や セ ル ラ ー ゼ な ど が 含 ま れ 、 89 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル これらは培養工程における栄養菌糸成長から生殖生長と なる子実体生育への移行を示していると考えられた。 3. 子 実 体 分 化 の 工 程 で は 、 芽 出 し 工 程 と 比 較 し て 発 現 量 が 4 倍 以 上 変 化 し て い た 遺 伝 子 で は 1 8 7 個 あ り 、発 現 が 上 昇 し て い た 遺 伝 子 を 5 6 個 、発 現 が 抑 制 さ れ て い た 遺 伝 子 を 1 3 1 個 特 定 で き た 。発 現 が 上 昇 し て い た 遺 伝 子 の な か に は 、子 実 体 分 化 に 関 与 す る ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子（ G f . H y d B 1 ） や 、胞 子 形 成 に 関 与 す る と 考 え ら れ る 遺 伝 子 が 含 ま れ て い た 。発 現 が 減 少 し て い た 遺 伝 子 は 、栽 培 培 地 の 利 用 に 関 与 す る CAZymes 遺 伝 子 が 数 多 く 含 ま れ 、 栄 養 菌 糸 成 長 か ら 子実体生育への移行がより進んでいることを分子生物学 的 に も 示 し て い た （ 図 3 - 8 ）。 4 . マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 中 で 発 現 が 変 動 す る 遺 伝 子 の う ち 、子 実体生育に伴って発現量が上昇する低分子熱ショックタ ン パ ク 質 を コ ー ド す る HSP9 遺 伝 子 等 を 見 出 し た 。 こ の よ うな子実体生育に関与する遺伝子の発現挙動をマーカー と す る こ と に よ っ て 、栽 培 工 程 が 正 常 に 進 行 し て い る か ど うかを管理することができると期待できる。 5. さ ら に 、 Gf.HSP9 の ホ モ ロ グ 解 析 か ら エ リ ン ギ 、 ブ ナ シ メ ジ 、 シ イ タ ケ に お い て も HSP9 ホ モ ロ グ を 見 出 し 、 遺 伝 子 配列のみならず発現パターンも保存されていたことから、 マイタケの栽培工程中で発現する遺伝子とその発現パタ 90 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル ー ン の 情 報 は 、マ イ タ ケ の 子 実 体 生 育 機 構 解 明 や 栽 培 工 程 管 理 の た め の 情 報 と し て だ け で な く 、食 用 き の こ の の 共 通 の子実体生育機構の解明のためにも重要な情報となるこ とを示すことができた。 第 2 章で明らかにしたように、マイタケの栽培工程のトラ ンスクリプトーム解析から得た予測遺伝子の約 6 割が機能未 知であったことから、本研究で得られた遺伝子の大半は機能 未知である。よって今後は、これらの遺伝子が担っている役 割を遺伝子改変等による機能解析から一つ一つ明らかにする 必要がある。 91 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 図 3-8. マ イ タ ケ 栽 培 工 程 で 発 現 す る 遺 伝 子 と そ の 発 現 プ ロ ファイル 本章で明らかにしたマイタケ栽培工程中で発現する主要な 遺 伝 子 群 と そ の 発 現 挙 動 を 、「 培 養 工 程 」、 「 芽 出 し 工 程 」、「 発 生工程」について模式的に示した。上向きの赤矢印は遺伝子 発現の上昇を、下向きの青矢印は発現遺伝子の抑制を示す。 92 第三章 マイタケの発現遺伝子プロファイル 参考文献 1 . 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Cataloging and profiling genes expressed in Lentinula edodes fruiting body Lo n gS AGE. by Fungal massive cDNA Genetics and pyrosequencing Biology ht t p :/ /dx.d oi .org/10. 1016 /j .f gb .2011.01. 009 100 48: and 359–369; 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 第 4 章 マイタケ発生工程における光応答性遺伝子の探索 4.1. 序 論 光は、担子菌の子実体生育に重要な環境因子の一つとして 認 知 さ れ て い る 。C o p ri n o p si s 種 で は 光 と 子 実 体 分 化 の 関 係 が よ く 研 究 さ れ て い る [1,2]。 ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ (Coprinopsis c i n e re u s ) で は 、 連 続 暗 黒 で は 菌 柄 が 伸 長 す る だ け で 菌 傘 が 形 成 さ れ な い dark stipe と い う 形 態 と な る [3]。 マ イ タ ケ に お い ても赤色光などの長波長域では菌傘が展開しないが、青色光 下 で 栽 培 す る と 菌 傘 は 展 開 す る [4] 。 ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ の d a r k s t i p e 変 異 体 の 解 析 か ら ア カ パ ン カ ビ ( N e u ro s p o r a c r a s s a ) の 青 色 光 受 容 体 white collar-1 蛋 白 質 の ホ モ ロ グ で あ る Dst1 蛋白質が単離されている。このように、光、特に青色光は子 実体分化のうち菌傘の形成に重要である。アカパンカビは子 嚢菌の光生物学のモデル生物として、青色光の受容伝達機構 がよく研究されている [5] 。 そ の 一 方 で 、 担 子 菌 で は white collar 蛋 白 質 の ホ モ ロ グ の 報 告 は 多 数 あ る も の の [6-8]、 子 嚢 菌ほど光の受容伝達機構は分かっていない。 ま た 、 ア カ ヒ ダ ワ カ フ サ タ ケ (Hebeloma vinosophyllum )の 実 験から近紫外光も子実体生育に有効であることが報告されて い る [9]。 食 用 き の こ 栽 培 に お い て は 、 マ イ タ ケ の 菌 傘 の 色 を 濃 く す る 効 果 が 報 告 さ れ て い る [10]。 こ の よ う に 、 青 色 光 と 近紫外光は子実体生育において影響力が異なっている。しか しながら、近紫外光については子嚢菌、担子菌ともに受容体 101 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 が見つかっておらず、そのシグナル伝達機構は不明なままで ある。 マイタケでは、前述にあるように赤色光は菌柄伸長を、青 色 光 は 菌 傘 展 開 を 、近 紫 外 光 は 菌 傘 着 色 を 促 進 す る こ と か ら 、 光はマイタケの栽培においてはで子実体生育工程で品質に大 き な 影 響 を 及 ぼ す 重 要 な 環 境 因 子 で あ る 。そ こ で 本 研 究 で は 、 第 3 章のマイタケの栽培工程全体に渡る解析に引き続いて子 実体生育に重要な環境因子である光とそれに応答する遺伝子 を特定することを目的に、青色光下と近紫外光下でマイタケ の子実体分化を行い、マイクロアレイ解析によって光応答性 遺伝子を特定した。 102 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 4.2. 実 験 材 料 と 方 法 4.2.1. 菌 株 本 実 験 で 使 用 し た マ イ タ ケ の 菌 株 は 、第 2 章 記 載 の M 5 1 を 用いた。 4.2.2. 栽 培 条 件 本 実 験 に お け る マ イ タ ケ M51 の 栽 培 方 法 は 、 培 養 工 程 は 、 第 2 章 記 載 の 方 法 で 行 っ た 。 芽 出 し 工 程 は 、 温 度 18˚C、 湿 度 9 5 % 、1 日 の 点 灯 サ イ ク ル が 1 2 時 間 点 灯 / 1 2 時 間 消 灯 の 白 色 蛍 光灯下で 6 日間行い、発生工程における光条件を同一にする ため 1 日連続暗黒とした。子実体分化は光刺激を与えないた め に 赤 色 光 下 で 素 早 く 栽 培 袋 を 開 封 し 、 1) 連 続 暗 黒 、 2)青 色 光 は 4 6 3 n m の 青 色 L E D（ N I C H I A , 日 本 ）、 3 ) 近 紫 外 光 は 3 5 2 nm を ピ ー ク 波 長 と す る 近 紫 外 蛍 光 管 F L 4 0 S / B L（ 東 芝 ラ イ テ ッ ク , 日 本 ） の 3 種 類 の 光 源 下 で そ れ ぞ れ 行 っ た 。 青 色 LED 及 び 近 紫 外 蛍 光 管 の 放 射 束 密 度 は 、 spectrodiometer PS-200 ( A p o g e e i n s t r u m e n t s , U S A ) で 計 測 し 、そ れ ぞ れ 1 . 5 W / m 2 と 1 . 3 W/m2 で あ っ た 。 子 実 体 は 、 そ れ ぞ れ の 光 源 下 で 1 日 の 点 灯 サ イ ク ル が 12 時 間 点 灯 /12 時 間 消 灯 で 10 日 間 栽 培 し て 収 穫 し た （ 図 4 - 1 , A ）。 4.2.3. メ ラ ニ ン 量 の 測 定 マ イ タ ケ 菌 傘 の メ ラ ニ ン 量 は 、 室 谷 ら の 方 法 [11 ] を 改 変 し た 方 法 を 用 い た 。 発 生 10 日 後 の 子 実 体 か ら 30 g の 菌 傘 を と り、マルチブレンダー（貝印, 日本）を用いてホモジナイズ 103 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 し た 。ホ モ ジ ナ イ ズ さ れ た 菌 傘 1 0 g を 5 0 m L 容 の 遠 心 チ ュ ー ブ に 秤 取 り 、 20 分 間 沸 騰 水 中 で 加 熱 し た 。 加 熱 し た サ ン プ ル は 4˚C で 30 分 間 冷 却 し 、12,000 g、4˚C で 20 分 間 遠 心 分 離 を 行った。上澄に等量の 2 N 水酸化ナトリウム水溶液を加えて 混 和 し た 後 、 30 分 間 沸 騰 水 中 で 加 熱 し た 。 脂 質 を 取 り 除 く た めに、等量のクロロホルムを添加してボルテックスを用いて 激 し く 混 和 し た 。 10,000 g、 25˚C で 10 分 間 遠 心 分 離 を 行 い 、 上 澄 の 5 4 0 n m の 吸 光 度 を I m m u n o M i n i N J - 2 3 0 0（ I n t e r M e d , 日 本）を用いて計測した。 4.2.4. マ イ ク ロ ア レ イ 実 験 全 RNA は 、 発 生 工 程 で 栽 培 袋 を 開 封 し 、 連 続 暗 黒 、 青 色 LE D 光 、 近 紫 外 光 照 射 を 開 始 し て か ら 0 分 、10 分 、30 分 、60 分 の 原 基 か ら 抽 出 し た 。全 R N A の 抽 出 方 法 は 、第 2 章 記 載 の 方 法 で 行 っ た 。 抽 出 さ れ た 全 RNA は 、 TURBO DNA-free kit ( L i f e Te c h n o l o g i e s , U S A ) を 用 い て 混 入 す る g D N A を 除 去 し た 。 マ イ ク ロ ア レ イ は 、 マ イ タ ケ ゲ ノ ム 配 列 [12]か ら 予 測 さ れ た 遺 伝 子 モ デ ル 16,097 個 か ら 第 3 章 に 記 載 の 方 法 で 13,537 プ ロ ー ブ を 搭 載 し た カ ス タ ム マ イ ク ロ ア レ イ を 作 製 し た 。 cRNA 合成、蛍光ラベリング、ハイブリダイゼーション、シグナル の検出は、株式会社バイオマトリクス研究所に委託して行っ た 。 マ イ ク ロ ア レ イ デ ー タ の 解 析 は 、 Ge ne Spri n g GX11 ( A g i l e n t Te c h n o l o g i e s ) を 用 い て 行 っ た 。 4.2.5. 定 量 PCR 実 験 104 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 c D N A 合 成 は 、4 . 2 . 4 . マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 で 調 製 し た g D N A 除 去 し た 全 R N A を 鋳 型 に R e v e r T r a A c e q P C R RT K i t ( T O Y O B O , 日 本 )を 用 い て 行 っ た 。 定 量 PCR は 、 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO, 日 本 ) と Mx3000P Real -Time QPCR S y s t e m ( A g i l e n t Te c h n o l o g i e s ) を 用 い て 行 っ た 。 P C R 条 件 は 、 95˚C で 1 分 間 初 期 熱 変 性 を し た 後 、 95˚C15 秒 間 の 熱 変 性 、 62˚C30 秒 間 の 伸 長 反 応 の 40 サ イ ク ル と し た 。 相 対 定 量 は 、 2 ( - D e l t a D e l t a C ( T ) ) 法 [ 1 3 ] で 行 っ た 。各 サ ン プ ル の 発 現 量 の 標 準 化 は 、マ イ タ ケ の G f . G A P D H 遺 伝 子 ( A B 7 8 1 1 1 1 ) の 発 現 量 を 内 部 標 準 と し て 行 っ た 。定 量 P C R に 用 い た プ ラ イ マ ー 配 列 を 表 4-1 に 示 し た 。 定 量 PCR は そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 に つ い て 、 各 試 験 区 あ た り 3 個 体 か ら そ れ ぞ れ 調 製 し た RNA に つ い て 別 々 に 計 測 し た 。発 現 量 の 経 時 変 化 は 、光 照 射 前 ( 0 分 ) の 時 の 発 現 量を 1 倍として表した。 表 4-1. 本 章 で 用 い た 定 量 PCR 用 プ ラ イ マ ー Primer name Sequence Gf.GAPDH-QPCR-F 5 ’ - T G A A C G AT C C C T T C AT T G A C C - 3 ’ G f . G A P D H - Q P C R - R 5 ’ - A G ATA G G C T T G C C C T C A A C G - 3 ’ Gf.BMR1-QPCR-F 5 ’ - C T G T C A A C T T T C C G T C C AT C TATA C - 3 ’ Gf.BMR1-QPCR-R 5 ’ - G G G TATA C T C C T G G G C ATA C ATA - 3 ’ 105 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 4.2.6. 塩 基 配 列 解 析 と タ ン パ ク 質 モ デ リ ン グ 塩 基 配 列 ア ラ イ メ ン ト は 、C l a s t a l X を 用 い て 行 っ た [ 1 4 ] 。タ ン パ ク 質 モ チ ー フ の 検 索 は 、B l a s t p プ ロ グ ラ ム [ 1 5 ] を 用 い て 、 域 値 e v a l u e ≦ 1 × 1 0 - 3 、b i t s c o r e ＞ 4 0 と し て N C B I デ ー タ ベ ー ス で 行 っ た 。 タ ン パ ク 質 の 予 測 SWIS S -M ODE L[1 6] を 用 い て 行 っ た 。 106 3 次 元 構 造 描 画 は 、 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 4.3. 結 果 と 考 察 4.3.1. マ イ タ ケ の 菌 傘 発 達 に お け る 青 色 光 と 近 紫 外 光 の 効 果 一般にシイタケ等菌傘が褐色～黒色を呈するのはメラニン によるといわれているので、マイタケでは近紫外光により菌 傘 の 暗 黒 度 合 が 増 す と い う 佐 藤 ら の 報 告 [10]の 確 認 を す べ く 、 連続暗黒、青色光及び近紫外光の下で各々育てたマイタケ子 実 体 の 菌 傘 の 黒 色 度 合 と そ れ に 含 ま れ る メ ラ ニ ン 量 を 540 nm ( A540) の 吸 光 度 で 調 べ た 。 連 続 暗 黒 、 青 色 光 、 及 び 近 紫 外 光 の 下 で 生 育 さ せ て 10 日 目 に 収 穫 し た 子 実 体 を 図 4-1B に 、 そ れ ら の A 5 4 0 の 値 に よ る メ ラ ニ ン 量 を 図 4 - 1 C に 示 し た 。近 紫 外光下で生育した子実体の菌傘の色は、青色光のそれよりも 濃く、連続暗黒下のそれは、黄白色だった。近紫外光下にお け る A 5 4 0 の 値 は 、青 色 光 下 の 2 . 4 倍 高 か っ た 。そ の 値 は 目 視 に よ る 暗 黒 度 合 と 一 致 し て い た こ と か ら 、A 5 4 0 は マ イ タ ケ の 菌 傘 の 色 を 表 す 良 い 指 標 で あ る と と も に 、。マ イ タ ケ の 菌 傘 の 黒色はメラニンであり、近紫外光下では生成が促進されるこ とが明らかとなった。本結果は近紫外光によってマイタケの 菌傘が濃色になるという佐藤らの報告を確認するとともに、 そ れ が メ ラ ニ ン 含 有 量 の 差 異 に よ る こ と を 示 し た 。植 物 で は 、 ブ ド ウ [17] や サ ク ラ ン ボ [18] の 果 実 の 色 度 合 は 果 皮 に 含 ま れ るアントシアニン量の差異によるとともに、近紫外光がそれ を著しく増加させることが報告されている。商業栽培におけ る果実の外観からの品質評価指標の一つである色度合は、一 般には濃色が好まれることから、近紫外光は果実の品質向上 に必要である。マイタケにおいても商業取引では菌傘の色が 107 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 濃いものが好まれることから、マイタケ栽培においても近紫 外光は品質を良くするうえで有用であることが明らかとなっ た。 次に、菌傘の展開について観察した。連続暗黒下で発生さ せた子実体は、着色が起こらず黄白色を呈し、鹿の角状とな り菌傘の発達展開は認められなかった。この結果は、ネナガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ [3] や ブ ナ シ メ ジ (Hypsizygus m a r m o re u s ) [19,20]で 報 告 さ れ て い る 結 果 と 同 様 で あ っ た 。 近 紫 外 光 下 で 発生生育させた子実体の菌傘は良く展開し、菌傘の長径は青 色 光 下 で 発 生 さ せ た 子 実 体 の 2 倍 大 き か っ た （ 図 4 - 1 D ）。 こ の結果は、マイタケでは近紫外光は青色光よりも菌傘の展開 を促進させる効果があることを示していた。このように、マ イタケでは、近紫外光は菌傘の着色を促進させるばかりでな く、菌傘の展開においても促進効果のある波長域であること を明らかにした。 4.3.2. 青 色 光 と 近 紫 外 光 に よ る 転 写 因 子 コ ー ド 遺 伝 子 Gf.BMR1 の 誘 導 子実体分化生育初期に青色光と近紫外光で誘導される遺伝子、 特に転写因子を探索するため、前述の連続暗黒、青色光、近 紫外光の 3 つの条件下で発現する遺伝子をマイクロアレイに よる網羅的解析結果の比較から特定した。マイタケには、ア カ パ ン カ ビ の 青 色 光 受 容 体 の ホ モ ロ グ 遺 伝 子 と し て Gf.WC-1 遺 伝 子 (AB828668) 及 び Gf.WC-2 遺 伝 子 (AB828670) が 存 在 す ることを見出したので、それらの発現量が光刺激によって変 108 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 動するものと思われたが、マイタケでは発現量の違いは認め られなかった。この理由は、マイタケ栽培では芽出し工程は 白 色 蛍 光 灯 下 で 行 わ れ る こ と か ら 、次 の 発 生 工 程 で は 既 に W C 蛋白質が発現していて光を受容できる状態にあったためと考 えられた。次に我々は、連続暗黒下と比較して青色光下と近 紫外光下で発現量が高い光に関連する遺伝子を探索した。そ の結果、 唯一、 転写因 子を コードす る Gf.BMR1 ( Grifola f ro n d o s a B M R 1 h o m o l o g) 遺 伝 子 を 見 出 し た 。 マ イ ク ロ ア レ イ に お け る Gf.BMR1 遺 伝 子 の 発 現 挙 動 の 再 現 性 を 確 認 す る た め に 、そ こ で 4 . 2 . 5 で 述 べ た 方 法 に 従 っ て 連 続 暗黒下、青色光下及び近紫外光下子実体を発生させたマイタ ケ の Gf.BMR1 遺 伝 子 の 発 現 量 を 定 量 PCR で 測 定 し た 。 G f . B M R 1 遺 伝 子 の 発 現 量 は 、光 照 射 後 3 0 分 ま で は 暗 黒 条 件 を 含めていずれの光条件下でも照射開始前と変わらないだけで な く 、 光 条 件 に よ る 差 異 も 認 め ら れ な か っ た が 、 光 照 射 後 60 分経過すると暗黒条件下のものには変化が認められなかった の に 対 し て 、青 色 光 と 近 紫 外 光 と も に 光 照 射 前 か ら 3 0 分 経 過 ま で の も の に 比 較 し て 約 1 0 倍 も 増 加 し て い た 。こ の こ と か ら 、 マイクロアレイによる発現遺伝子の網羅的解析から得られた Gf.BMR1 遺 伝 子 は 青 色 光 と 近 紫 外 光 に よ っ て 発 現 が 誘 導 さ れ る と い う こ と が 確 か で あ る こ と が わ か っ た （ 図 4 - 2 ）。 し か し ながら、近紫外光下で生育させたマイタケ子実体の菌傘は色 が濃く径が大きいのに対して、明らかに青色光下のそれはは 近紫外光下のものと明確に区別できる程色が薄く径が小さか っ た こ と か ら 、子 実 体 の 外 観 は Gf.BMR1 遺 伝 子 の 発 現 量 か ら 109 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 想定された、両者ともに外観に著しい差異が認められないと 考えられたことと合致するものではなかった。このことは、 マ イ タ ケ の Gf.BMR1 遺 伝 子 は 青 色 光 と 近 紫 外 光 の ど ち ら に お いても誘導されるが、子実体、特に菌傘の形態形成における 近 紫 外 光 の 作 用 は 、 Gf.BMR1 蛋 白 質 単 独 で は な く 他 の 未 同 定 である近紫外光誘導性の蛋白質が関与していることを示唆す るものと考えられた。 4.3.3. Gf.BMR1 の 遺 伝 子 の 構 造 と 機 能 Gf.BMR1 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 か ら 推 定 さ れ た タ ン パ ク 質 の １ 次 構 造 を 図 4 - 3 A に 示 し た 。G f . B M R 1 蛋 白 質 は 、2 つ の C y s 2 H i s 2 zinc finge r domain と 1 つ の Zn(II)Cys6 binuclear claster domain を 有 し て い た 。 Gf. BMR1 蛋 白 質 の ホ モ ロ グ を NCBI の 蛋 白 質 デ ー タ ベ ー ス か ら 検 索 し た と こ ろ 、 子 嚢 菌 に 属 す る 、 Colletotrichum lagenarium の CMR1 蛋 白 質 、 Magnaporthe grisea の PIG1 蛋 白 質 、 Bipo laris ory zae の BMR1 蛋 白 質 が 見 い だ さ れ た [21 ,22]が 、 Gf . BMR1 蛋 白 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 は そ れ ら と の 相 同 性 が 低 く 、B M R 1 蛋 白 質 で 2 3 % 、P I G 1 蛋 白 質 で 2 6 % 、 CMR1 蛋 白 質 で 28%で あ っ た 。 し か し な が ら 、 Gf.BMR1 の N 末 端 側 に は こ れ ら ホ モ ロ グ の そ れ と 同 じ よ う に 二 種 類 の DNA 結 合 モ チ ー フ 、 C ys2 Hi s2 zinc finger domain2 つ と Z n ( I I ) C y s 6 b i n u c l e a r c l a s t e r d o m a i n 1 つ を 有 し て い た（ 図 4 - 3 A ）。 こ れ ら 二 種 類 の DNA 結 合 モ チ ー フ に お け る Gf.BMR1 蛋 白 質 の 相 同 性 は 、B M R 1 蛋 白 質 で 3 4 % 、P I G 1 蛋 白 質 で 3 4 % 、C M R 1 110 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 蛋 白 質 と 33%と 他 の 領 域 の そ れ ら よ り も 高 か っ た 。 こ こ で 特 徴 的 な の は 、 Gf.BMR1 蛋 白 質 を 含 む こ れ ら ホ モ ロ グ で は そ れ ぞ れ の DNA 結 合 モ チ ー フ 中 の シ ス テ イ ン 残 基 と ヒ ス チ ジ ン 残 基 は 、 高 度 に 保 存 さ れ て い た （ 図 4 - 3 B ）。 さ ら に 、こ れ ら ホ モ ロ グ 遺 伝 子 は 、近 紫 外 光 で 誘 導 さ れ る [ 2 2 ] 。 こ れ ら の 結 果 は Gf.BMR1 遺 伝 子 の 挙 動 と 同 じ で あ っ た 。 B. oryzae の BMR1 遺 伝 子 の 過 剰 発 現 実 験 で は 、 メ ラ ニ ン 生 合 成 に 関 与 す る dehydratase polyketide (SCD1) 及 synthase 1,3,8- び (PKS1) 、 scytalone t r i h y d ro x y n a p h t h a l e n e r e d u c t a s e ( T H R 1 ) の 3 遺 伝 子 の 発 現 量 が 上 昇 し 、野 生 株 よ り も コ ロ ニ ー の 色 が 濃 く な る こ と が 報 告 さ れ て い る [ 2 2 ] 。B M R 1 遺 伝子の欠失実験では、菌糸におけるメラニン合成能力が失わ れ た 。 こ の よ う に 、 BMR1 蛋 白 質 は こ れ ら 子 嚢 菌 の 種 に お い て メ ラ ニ ン 合 成 に 必 須 な 遺 伝 子 で あ る 。 SWISS-MODEL に よ っ て 予 測 し た Gf.BMR1 と BMR1 蛋 白 質 の DNA 結 合 モ チ ー フ 近 傍 の 3 次 元 構 造 は 、図 4 - 3 C に 示 し た よ う に 非 常 に 類 似 し て いた。このことから、これら蛋白質は標的遺伝子のプロモー ター内の類似配列に結合する可能性がある。しかしながら、 S C D 1 と T H R 1 遺 伝 子 は 子 嚢 菌 特 有 の 遺 伝 子 と 考 え ら れ 、マ イ タ ケ ゲ ノ ム 配 列 か ら は 見 い だ せ な か っ た 。一 方 で 、 P K S 1 遺 伝 子のホモログ遺伝子である Gf.PKS1 遺 伝 子 (AB288671) を マ イ タ ケ ゲ ノ ム 配 列 か ら 同 定 し た 。 Gf.PKS1 蛋 白 質 は 、 -ke t oa c yl s ynt ha se m ot i f 、 de hdra t a se 、 a c yl t ra n sfe ra se m ot i f 、 2 つ の a c yl c a rri e r prot e i n m ot i f と t hi oe st e ra se m ot i f を 有 し て い た 。P K S 1 蛋 白 質 は d e h d r a t a s e 以 外 の モ チ ー フ を 有 し て い た 111 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 [23]。 近 い 将 来 、 Gf.BMR1 が Gf.PKS1 の 発 現 を 介 し て メ ラ ニ ン生合成に関与しているかどうかを検討する予定であり、そ の た め に Gf.BMR1 と Gf.PKS1 遺 伝 子 の 欠 失 変 異 体 の 作 製 を 進 め て い る（ 図 4 - 4 に マ イ タ ケ の 予 想 メ ラ ニ ン 合 成 経 路 を 示 す ）。 光シグナル伝達の上流は、光受容体である。青色光受容体 white collar 1 及 び 2 は 子 嚢 菌 で あ る ア カ パ ン カ ビ で よ く 研 究 さ れ て い る の は 本 章 序 論 で 触 れ た 。 子 嚢 菌 B. oryzae も white collar 1 及 び 2 の ホ モ ロ グ で あ る B LR1 蛋 白 質 [ 24]及 び BLR 2 蛋 白 質 [25]を 有 し て い る 。 BLR1 遺 伝 子 の 欠 失 変 異 体 は 、 メ ラニン生合成遺伝子の発現が認められるため、未同定の近紫 外光受容体の存在の可能性が示唆されている。これまでの解 析結果から、マイタケにおいても未同定の近紫外光受容体が 存 在 す る と 考 え ら れ た こ と か ら 、 Gf.BMR1 遺 伝 子 が 青 色 光 ま たは近紫外光で発現誘導されるかどうかは確認する必要があ る 。 現 在 そ の た め の Gf.WC 遺 伝 子 の 欠 失 変 異 体 の 作 製 を 進 め ている。 本 研 究 は 、 担 子 菌 に 子 嚢 菌 の メ ラ ニ ン 合 成 に 関 わ る BMR1 蛋白質ホモログの存在を明らかにした初めての報告である。 マイタケ栽培の発生工程の光照射管理条件は、子実体菌傘の 着色度合がメラニン含有量が多いほど濃くなり、それには G f . B M R 1 蛋 白 質 の 関 与 が 示 唆 さ れ た の で 、今 後 G f . B M R 1 遺 伝 子を基点に解析していくことで、光刺激によるシグナル伝達 機構のマイタケ子実体分化・生育過程における役割が明らか に な る も の と 期 待 さ れ る 。 ま た 、 そ の 過 程 で 見 出 さ れ る Gf.BMR1 遺 伝 子 以 外 の 光 誘 導 性 遺 伝 子 の 発 現 は 食 用 き の こ 栽 112 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 培における光条件の検討に有用なマーカー遺伝子となりうる ので、食用きのこ生産にとって重要な知見となる。 113 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 図 4-1. 青 色 光 と 近 紫 外 光 の 子 実 体 に 対 す る 影 響 A : 芽 出 し 工 程 と 発 生 工 程 に お け る 光 照 射 条 件 の 模 式 図 。矢 印 の 色 が 光 照 射 条 件 を 示 す 。白 色 蛍 光 灯（ 白 ）、連 続 暗 黒（ 黒 ）、 青 色 L E D （ 青 ）、 近 紫 外 光 （ 紫 ）。 B : 各 光 条 件 で 1 0 日 間 発 生 さ せ た 子 実 体 の 様 子 （ ス ケ ー ル バ ー 1 0 c m ）。 C : 菌 傘 色 の 指 標 と し て の 540 nm の 吸 光 度 。 D: 菌 傘 長 径 に 対 す る 光 照 射 条 件 の 効 果 。径 は 、菌 傘 の 長 径 を 示 す 。子 実 体 あ た り 30 枚 の 菌 傘を測定し、3 個の平均値を示す。 114 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 図 4-2. 光 照 射 に 対 す る Gf.BMR1 遺 伝 子 の 発 現 量 子 実 体 発 生 工 程 に お け る 連 続 暗 黒 （ 黒 ）、 青 色 L E D （ 青 ）、 近 紫 外 光 （ 紫 ） 照 射 後 （ 10 min, 30 min, 60 min） の 照 射 前 （ 0 min） を 1 と し た と き の Gf.BMR1 の 相 対 発 現 量 を 示 す 。 連 続 暗 黒 下 で は 0、 10、 30、 60 分 の 発 現 量 に 差 は な い 。 一 方 、 青 色 光 と 近 紫 外 光 で は 30 分 ま で は 連 続 暗 黒 と 発 現 量 に 差 は な い が 、 照 射 60 分 後 で は 照 射 前 と 比 較 し て 約 10 倍 と 著 し く 発 現上昇していた。 115 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 図 4-3. Gf.BMR1 と そ の ホ モ ロ グ の 比 較 A: Gf.BMR1 と そ の ホ モ ロ グ の 1 次 構 造 に お け る DNA 結 合 モ チ ー フ の 位 置 。B : G f . B M R 1 と そ の ホ モ ロ グ に 保 存 さ れ て い る Cys2 Hi s2 zinc -fin ge r domai n と Zn( II) Cys6 binuclear cluster の 配 列 比 較 。 黒 色 の 逆 三 角 形 は 保 存 さ れ て い る Cys 残 基 を 、 白抜きの 逆三角 形は 保存さ れてい る Hi s 残 基 を 示 す 。 C: Gf.BMR1 と BMR1 の DNA 結 合 モ チ ー フ の 予 測 3 次 元 構 造 の 比 較 。 亜 鉛 イ オ ン を 銀 の 球 体 で 表 す 。 図 A-C か ら Gf. BMR1 とそのホモログの構造が、よく類似していた。 116 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 図 4-4. マ イ タ ケ で 予 想 さ れ る メ ラ ニ ン 合 成 経 路 紫の矢印で報告されている、もしくは本研究で明らかとな った経路を示し、紫の点線矢印で未同定の経路を示す。 117 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 4.4. ま と め 本章では、マイタケ栽培において収穫物である子実体の生 育に重要な影響を及ぼす光とそれに応答する遺伝子を探索す るために、連続暗黒、青色光、近紫外光の下で子実体を生育 させ、光応答に関する遺伝子をマイクロアレイによって探索 した。その結論は、次のように適用される。 1 . 近 紫 外 光 は 、マ イ タ ケ 子 実 体 菌 傘 の 黒 色 化 と 菌 傘 の 展 開 を 促 進 す る 効 果 が あ っ た 。菌 傘 の 黒 色 が 濃 い ほ ど を メ ラ ニ ン 量 で 比 較 す る と 青 色 L E D の そ れ と 比 べ て 2 . 4 倍 、菌 傘径は 2 倍大きくなった。 2 . マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 の 結 果 、青 色 光 と 近 紫 外 光 の い ず れ に お い て も 、転 写 因 子 を コ ー ド す る G f . B M R 1 遺 伝 子 の 発 現が強く誘導されていた。 3 . し か し な が ら 、青 色 光 と 近 紫 外 光 と の 間 で 子 実 体 菌 傘 の 黒色化の程度と菌傘の長径が著しく異なっていたのに 対して青色光と近紫外光によって誘導される Gf.BMR1 遺 伝 子 の 発 現 量 に 差 異 は 認 め ら れ な か っ た の で 、そ れ ら の 形 質 は Gf.BMR1 遺 伝 子 単 独 で は な く 別 の 近 紫 外 光 に よって誘導される遺伝子も関与していることが示唆さ れた。 118 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 4 . 本 章 に 述 べ た 研 究 結 果 は 、担 子 菌 類 に 子 嚢 菌 類 の メ ラ ニ ン 合 成 に 関 わ る BMR1 ホ モ ロ グ が 存 在 す る こ と を 示 し た 初 め て の 報 告 で あ る 。マ イ タ ケ 栽 培 の 発 生 工 程 の 光 照 射 管 理 条 件 は 、子 実 体 菌 傘 の 着 色 度 合 が メ ラ ニ ン 含 有 量 が 多 い ほ ど 濃 く な り 、 そ れ に は Gf. BMR1 蛋 白 質 の 関 与 が 示 唆 さ れ た の で 、今 後 G f . B M R 1 遺 伝 子 を 基 点 に 解 析 し て い く こ と で 、マ イ タ ケ 子 実 体 分 化・ 生 育 過 程 に お け る 光刺激によるシグナル伝達機構の役割を明らかにしう る。 5. こ の よ う な 遺 伝 子 を マ ー カ ー と す る こ と で マ イ タ ケ の 色や傘の形を望む品質にする環境制御が可能になると 期待される。 119 第四章 子実体分化における光応答性遺伝子の探索 参考文献 1 . Ts u s u è YM (1969). Experimental control of fruit -body f o r m a t i o n i n C o p r i n u s m a c ro h i z u s . D e v e l o p m e n t , g ro w t h a n d d i f f e re n t i a t i o n 11 : 1 6 4 -7 8 . 2 . 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FDH1 -QPCR - F1 T C G C G G A C T TAT C A AT G C T G Gf. FDH1 -QPCR -R1 C A G C G AT G G C T T C C T T G T C Gf. AQP1 -QPCR - F1 C G C A AT G TA A G C T C C C A G G A C Gf.AQP1-QPCR-R1 T C T C AT C G T C T G C T C C T C C A C Gf. GAPDH-QPCR - F2 C A A C C T T G A C G A ATA C G A C T C G f . G A P D H - Q P C R - R 2 C C T C G A C G ATA C C G A A G T T G Gf.CRZ1-5’RACE C A C A G C A C T G G A A G A C AT G AT G T T G Gf.CRZ1-3’RACE A AT T C T C A C C C C G T G AT C A C Gf. FDH1 -5’R ACE G A A G T G C T T G A G G A G AT C A G C AT T G Gf. FDH1 -3’R ACE C TA C T C C G G TA C G A C T C T G G AT G Gf. AQP1 -full - F1 T C G A A C C A C T C G TA C AT T C A G G Gf.AQP1-full -R1 T T T C C C C G T G A G C A C A A AT T C C 129 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 5.3. 結 果 と 考 察 5.3.1. Gf-A1 株 で 差 示 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 群 マイタケの子実体分化に関連する遺伝子を探索するために、 原 基 か ら 子 実 体 分 化 が 進 行 し な い Gf-A1 株 と 正 常 に 子 実 体 が 生 育 す る Gf-N2 株 で 発 現 し て い る 遺 伝 子 を マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 に よ っ て 比 較 し た 。 そ の 結 果 、 Gf-A1 株 で Gf-N2 株 と 比 較 し て 2 倍 以 上 差 示 的 に 発 現 し て い た 遺 伝 子 は 、4 9 個 あ っ た（ 表 5 - 2 ）。 こ れ ら の 遺 伝 子 で B L A S T 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、 3 2 遺 伝 子 に B LAS T ヒ ッ ト が あ っ て 遺 伝 子 オ ン ト ロ ジ ー ( GO) 用 語 が 付 与 さ れ 、 5 遺 伝 子 に B LA ST ヒ ッ ト が あ る も の の GO 用 語 が 付 与 さ れ ず 、 残 り 12 遺 伝 子 は BLAST ヒ ッ ト が な く GO 用 語 も 付 与 さ れ ず 機 能 未 知 で あ っ た （ 図 5 - 2 A ）。 機 能 が 推 定 で き た 32 遺 伝 子 の 中 で も 特 に 、 zing-finger 型 転 写 因 子 ( g f r 0 1 g 0 8 1 4 ) 、a l p h a b e t a h y d r o l a s e ( g f r 0 1 g 7 8 1 9 ) 、2 つ の a l c o h o l oxidase (gfr01g3268, ( g f r 0 1 g 11 4 6 ) 、 gfr01g1016) 、 NAD-dependent c ynamide formate hydratase deh ydroge nase ( g f r 0 1 g 0 0 2 3 ) の 遺 伝 子 発 現 量（ 表 5 - 2 中 、赤 色 で 示 す ）は G f - N 2 株 の そ れ ら に 比 較 し て 100 倍 を 超 え る 高 い 発 現 量 を 示 し て い た。 5.3.2. Gf-A4 株 で 差 示 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 群 Gf-A4 株 で は 、 Gf-N2 株 と 比 較 し て 2 倍 以 上 差 示 的 に 発 現 し て い た 遺 伝 子 は 、 6 9 個 あ っ た （ 表 5 - 3 ）。 こ れ ら の 遺 伝 子 で BLAST 検 索 行 っ た と こ ろ 、 37 遺 伝 子 は BLAST ヒ ッ ト が あ っ て GO 用 語 が 付 与 さ れ 、 9 遺 伝 子 は BLAST ヒ ッ ト が あ る も の 130 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 の GO 用 語 付 与 な し 、 残 り 23 遺 伝 子 で BLAST ヒ ッ ト が な く G O 用 語 も 付 与 さ れ ず 全 く の 機 能 未 知 で あ っ た （ 図 5 - 2 A ）。 Gf -A4 株 は Gf-A1 株 と は 異 な り Gf-N2 株 に 比 較 し て 100 倍 以 上高く発現していた遺伝子は見られなかった。その中で最も 発 現 量 に 差 が あ っ た 遺 伝 子 は 、 Gf-A1 株 と 同 じ く zinc -finger 型 転 写 因 子 を コ ー ド す る gfr01g0814（ 酵 母 S. cere visiae の C R Z 1 遺 伝 子 の ホ モ ロ グ と し て G f . C R Z 1 遺 伝 子 と 命 名 ）で あ っ た （ 表 5-3 中 、 青 色 で 示 す ） が 、 そ の 発 現 量 は Gf-N2 株 の 31 倍 で 、 Gf -A1 株 の 211 倍 で あ っ た の に 比 較 し て 著 し く 低 か っ た 。 し か し な が ら 、 Gf-N2 株 と 差 示 的 発 現 を 示 し た 遺 伝 子 数 は Gf -A4 株 が 69 個 と Gf -A1 株 の 49 個 よ り 多 か っ た 。 5.3.3. Gf-A1 株 及 び Gf-A4 株 に 共 通 す る 差 示 的 発 現 遺 伝 子 Gf -A1 株 及 び Gf-A4 株 で Gf -N2 株 と 比 較 し て 差 示 的 に 発 現 し て い た 遺 伝 子 2 4 個（ 図 5 - 2 B 、表 5 - 4 ）の 発 現 パ タ ー ン を 図 5 - 3 に 示 す 。 こ れ ら の 遺 伝 子 は Gf-A1 株 に お け る 発 現 パ タ ー ン の 類 似 性 に よ っ て 、グ ル ー プ A か ら D ま で の 4 群 に 分 け ら れ た 。 グ ル ー プ A は gfr01g0814 の よ う に 恒 常 的 に 高 発 現 し て い た 遺 伝 子 群 、 グ ル ー プ B は g f r 0 1 g 11 6 1 の よ う に 植 菌 後 8 2 日 か ら 86 日 に か け て 高 発 現 し て い た 遺 伝 子 群 、 グ ル ー プ C は Gf-A1 株 と Gf-A4 株 で 同 じ 発 現 パ タ ー ン を 示 し て い た 遺 伝 子 群 、 グ ループ D は前述のどのグループにも属さない遺伝子群ではあ ったが、その多くは子実体生育に伴って高発現していたが Gf-A4 で 86 日 目 に は Gf-N2 株 と 同 じ 発 現 量 に ま で 減 少 し て い た。 131 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 グ ル ー プ A か ら D に 属 す る い ず れ の 遺 伝 子 も Gf-N2 株 の そ れ ら に 対 し て 高 発 現 し て い た こ と か ら 、 Gf -N2 株 の よ う に 子 実体が正常に生育するにはこれらの遺伝子の発現が抑制され る べ き で あ る と 考 え ら れ た 。 ま た 、 Gf-A1 株 と Gf -A4 株 と で 共通する差示的発現遺伝子であっても、その発現量は大きく こ と な り 、 Gf-A1 株 の ほ と ん ど の 遺 伝 子 が Gf-A4 株 の そ れ ら に対して高発現であった。このことから、正常な子実体生育 に お い て 抑 制 さ れ る べ き 遺 伝 子 が 、 Gf-A1 株 で は Gf-A4 株 よ り過剰に発現していたため子実体生育が全く進行しなかった と 考 え ら れ た 。 さ ら に 、 Gf-A4 株 で は グ ル ー プ D の 遺 伝 子 群 の 発 現 量 が 86 日 で は Gf-N2 株 の そ れ ら と 同 じ 量 に ま で 減 少 し ていたことにより、表現型として菌柄は伸長するがそれに伴 う菌傘の分化・展開不全が起きている。このことからグルー プ D の遺伝子は菌傘分化発達に関与していると考えられた。 しかし、それぞれの遺伝子に付与されたアノテーションから だけでは子実体生育への関与を正確に予測することは難しい。 将来的に、これら遺伝子の破壊や強制発現系を構築して子実 体生育への影響を直接観察する必要がある。 5.3.4. Gf.CRZ1(gfr01g0814)の 遺 伝 子 構 造 と そ の 機 能 の 予 測 g f r 0 1 g 0 8 1 4 は 、酵 母 S . c e r e v i s i a e の C R Z 1 の ホ モ ロ グ で あ り 、 Gf.CRZ1 と 名 付 け た 。 こ れ は 、 Gf-A1 株 及 び Gf-A4 株 に 共 通 す る 差 示 的 発 現 遺 伝 子 2 4 個 の 内 、唯 一 転 写 因 子 を コ ー ド す る 遺 伝 子 で あ っ た 。こ の こ と か ら 、 Gf.CRZ1 が 他 の 23 遺 伝 子 の 発現量を転写制御し、その結果として子実体生育不全を引き 132 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 起 こ し た 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 酵 母 S . c e re v i s i a e の C R Z1 p は c a r c i n e u r i n - d e p e n d e n t に 制 御 さ れ て い る 蛋 白 質 で あ り 、酵 母 の 1 , 3 - - D - g l u c a n s y n t h a s e F K S 2 等 の 発 現 を 制 御 し 、高 濃 度 C a 2 + 、 Nn2+、 Na+や 細 胞 壁 ダ メ ー ジ へ の 耐 性 に 関 与 し て い る [1,2]。 酵 母 Crz1p は 、 calcinurine に よ っ て 脱 リ ン 酸 化 を 受 け て 核 内 に 移 行 し 、 標 的 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る [3]。 インハウスゲノムデータベースに格納された DNA 配 列 情 報 を 基 に 全 長 cDNA の 配 列 を 決 定 し 、 Gf.CRZ1 の 遺 伝 子 構 造 を 明 ら か に し た 。G f . C R Z 1 遺 伝 子 は 、5 つ の エ ク ソ ン と 4 つ の イ ン ト ロ ン か ら 成 り 、 345 残 基 の ア ミ ノ 酸 か ら な る 蛋 白 質 を コ ー ド し て い た （ 図 5 - 4 A ）。 ま た 、 C 末 端 側 に 3 つ の C 2 H 2 型 の Z i n c - f i n g e r d o m a i n が 認 め ら れ た （ 図 5 - 4 B ）。 そ の う ち 2 つ の z i n c - f i n g e r d o m a i n ( I 及 び I I ) は 、一 般 的 な - h e l i x と a n t i p a r a l l e l -sheet 構 造 を 有 し て い た 。 し か し な が ら 、 も う ひ と つ の z i n c - f i n g e r d o m a i n ( I I I ) は 、a n t i p a r a l l e l - s h e e t 構 造 を 有 し て い な か っ た 。 こ の 構 造 は 、 酵 母 Crz1p と 同 一 で あ っ た 。 し か し な が ら 、 Crz1p が 有 し て い る serine -rich re gion (SRR) と calcineurine -dockin g site を Gf.CRZ1 は 欠 い て お り 、 Gf. CRZ1 は calcineurine に よ る 制 御 を 受 け て い な い 可 能 性 が 考 え ら れ た 。将 来 的 に 、 G f . C R Z 1 蛋 白 質 が 他 の 2 3 遺 伝 子 を 制 御 し て い る か ど う か を 確 認 す る た め に 、 Gf-N2 株 に Gf.CRZ1 遺 伝 子 を 強 制 発 現 さ せ る こ と に よ っ て 23 遺 伝 子 の 発 現 が 変 化 す る か どうかを確かめる必要がある。 5.3.5. 遺 伝 子 マ ー カ ー に よ る 不 良 種 菌 選 別 方 法 の 検 討 133 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 前 述 の 解 析 に よ っ て G f . C R Z 1 遺 伝 子 が 、G f - A 1 株 及 び G f - A 4 株 の 子 実 体 分 化 ・ 生 育 段 階 で Gf-N2 株 よ り も 有 意 に 高 発 現 し ていることを明らかにした。しかしながら、マイタケの栽培 工程は前述したように培養工程、芽出し工程、発生工程を併 せ て 9 0 日 間 ほ ど か か り 、子 実 体 が 発 生 す る 段 階 で 不 良 が 判 明 するとそれまでの栽培にかかるコストと製品の販売機会の損 失となり、大きな損害となる。よって、栽培を開始する前の 種菌の段階で不良となるような種菌を排除することが望まれ る 。 そ こ で 、 Gf.CRZ1 遺 伝 子 の よ う に 子 実 体 分 化 ・ 生 育 時 に 高発現となっている遺伝子の発現量をマーカーとして種菌の 段 階 で 、 Gf-N2 株 、 Gf-A1 株 及 び Gf-A4 株 を 見 分 け る こ と が で き る か を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 図 5-5 に 示 す よ う に 、 種 菌 に お け る Gf.CRZ1 遺 伝 子 の 発 現 量 を 定 量 PCR で 調 査 し た と こ ろ 、 Gf -N2 株 を 1 と し た と き に 、 Gf-A1 株 で 86 倍 、 Gf-A4 株 で 4 倍 と 有 意 に 高 く な っ て お り 、 Gf.CRZ1 遺 伝 子 の 発 現 量 を マ ー カ ー と し て Gf -A1 株 及 び Gf-A4 株 を Gf-N2 株 と 見 分 け る ことができた。 134 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 図 5 - 1 . マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 に 用 い た G f - N 2 株 、G f - A 1 株 及 び Gf-A4 株 Gf -N2 株 、 Gf-A1 株 及 び Gf - A4 株 の 植 菌 後 8 0 日 か ら 8 9 日 ま で の 子 実 体 分 化 ・ 生 育 過 程 を 示 し た 。培 養 8 1 日 目 で 栽 培 袋 上 部 を 開 封 し て 、子 実 体 分 化 を 促 し た 。G f - N 2 株 と 比 較 し て 、 Gf -A1 株 は 原 基 か ら 子 実 体 生 育 が 全 く 進 行 し な か っ た が 、 Gf-A4 は 子 実 体 分 化 ・ 生 育 は 遅 れ 菌 傘 の 分 化 ・ 展 開 が 不 全 で あ っ た 。 マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 に は 、 80 日 、 82 日 、 84 日 及 び 86 日 の 原 基 及 び 子 実 体 を 用 い て 、発 現 遺 伝 子 及 び そ の 発 現 量 の比較を行った。 135 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 図 5-2.マ イ タ ケ 栽 培 発 生 工 程 で 子 実 体 生 育 正 常 株 （ Gf-N2） と 生 育 不 全 株 （ Gf-A4） と で 発 現 差 の あ っ た 遺 伝 子 数 A: Gf -N2 株 と 比 較 し て Gf -A1 株 、 Gf -A4 株 そ れ ぞ れ で 差 示 的 に 発 現 し て い た 遺 伝 子 数 を 示 す 。 B: Gf -A1 株 と Gf -A4 株 で 差 示 的 に 発 現 し て い た 遺 伝 子 群 の う ち 、共 通 す る 遺 伝 子 は 24 個あった。 136 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 （次頁に続く） 137 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 図 5-3 . Gf -A1 株 と Gf -A4 株 で 共 通 し て 差 示 的 に 発 現 し て い た 24 遺 伝 子 G f - A 1 株（ ■ ）、G f - A 4 株（ □ ）の 発 現 パ タ ー ン 。発 現 差 は 、 Gf-N2 株 （ ● ） の 発 現 量 を 1 と し て 算 出 。 グ ル ー プ A： 恒 常 的 に 高 発 現 し て い た 遺 伝 子 群 、 グ ル ー プ B： 植 菌 後 8 2 日 か ら 8 6 日 に か け て 高 発 現 し て い た 遺 伝 子 群 グ ル ー プ C ：Gf - A1 株 と Gf -A4 株 で 同 じ 発 現 パ タ ー ン を 示 し た 遺 伝 子 群 、 グ ル ー プ D： 子 実 体 生 育 に 伴 っ て 高 発 現 し た 遺 伝 子 群 。 138 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 図 5-4. Gf.CRZ1 の 構 造 A : G f . C R Z 1 の 遺 伝 子 構 造 。 U T R : 非 翻 訳 領 域 、 AT G : 開 始 コ ド ン 位 置 、 TA G : 終 止 コ ド ン 位 置 、 P o l y A s i t e : 全 長 c D N A か ら 特 定 し た Pol y A 付 加 位 置 。 黒 箱 の 部 分 は エ ク ソ ン を 示 す 。 B : G f . C R Z 1 と 酵 母 C r z 1 の 1 次 蛋 白 質 構 造 。S R R : s e r i n e - r i c h 領 域 、 PIISIQ: calcineurine 結 合 モ チ ー フ と zinc -finger domain を 示 す 。 139 3 つ の C2 H2 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 図 5-5. 種 菌 に お け る Gf.CRZ1 遺 伝 子 の 発 現 量 マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 と Gf -A1 株 及 び Gf -A4 株 で 子 実 体 分 化 ・ 生 育 時 に 高 発 現 に な っ て い た Gf.CRZ1 遺 伝 子 の そ れ ぞ れ の 種 菌 に お け る 発 現 量 を バ ー グ ラ フ で 示 す 。 Gf-N2 株 に お け る Gf.CR Z1 遺 伝 子 の 発 現 量 を 1 と し た と き に 、 Gf-A1 株 で は 86 倍 、 Gf -A4 株 で は 4 倍 有 意 に 高 か っ た 。 こ の こ と か ら 、 Gf.CRZ1 遺 伝 子 の 発 現 量 を 調 べ る こ と で 、 種 菌 段 階 で Gf-A1 及 び Gf -A4 株 を 排 除 で き る こ と が 可 能 と な っ た 。 140 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 表 5-2. Gf -N 2 株 と 比 較 し て Gf-A1 株 で 発 現 差 の あ る 遺 伝 子 群 vs Gf-N2 fold changes No. Gene ID Putative gene product 80 d 82 d 84 d 86 d 142 211 199 144 1 g fr0 1g0814 C ys 2 His 2 z in c fing e r pr ot ein 2 g fr0 1g1161 hypothetical protein 7 - 3 4 3 g fr0 1g7819 alpha beta -hydrolas e 6 169 319 226 4 g fr0 1g3268 alcohol oxidas e 5 5 56 185 5 g fr0 1g6743 hypothetical protein 5 - - - 6 g fr0 1g1016 alcohol oxidas e 5 5 56 111 7 g fr0 1g2975 glycerol kinas e 4 7 5 4 8 g fr0 1g1146 cyanamide hydratas e 4 71 124 129 9 g fr0 1g9127 perforin 3 39 46 36 10 g fr0 1g9332 meth ylt rans ferase (ICM T) 3 8 19 18 11 g fr0 1g6012 cytochrome p450 3 12 24 19 12 g fr0 1g3974 cytochrome p450 3 10 26 42 13 g fr0 1g9585 hexos e transporter 2 29 39 32 14 g fr0 1g0023 formate dehydrogenas e 2 13 51 140 15 g fr0 1g0918 formate nitrite transporter 2 6 16 30 16 g fr0 1g9987 transporter 2 8 6 6 17 g fr0 1g6998 general substrate transporter 2 6 9 8 18 g fr0 1g1188 aquaporin-like protein 2 7 11 20 19 g fr0 1g1125 hypothetical protein 2 7 12 14 20 g fr0 1g2510 glycoside hydrolase 29 - 16 60 67 141 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 21 g fr0 1g0163 d-lactonohydrolas e - 9 37 45 22 g fr0 1g0921 transporter - 17 24 30 23 g fr0 1g2250 hypothetical protein - 8 21 29 24 g fr0 1g1631 unknown function (DUF1768) - 6 14 27 25 g fr0 1g4139 ER retention -related protein - 14 16 26 26 g fr0 1g3684 glycoside hydrolase 16 - 38 31 26 27 g fr0 1g3839 fructosamine kinase - 10 18 20 28 g fr0 1g4887 glycoside hydrolase 31 - 6 11 17 29 g fr0 1g7631 DnaJ - 6 7 17 30 g fr0 1g2241 hypothetical protein - 6 5 17 31 g fr0 1g0550 general substrate transporter - 6 16 15 32 g fr0 1g9356 CsbD - 13 40 15 33 g fr0 1g7422 alpha-galactosidas e - 7 18 13 34 g fr0 1g2573 glycoside hydrolase 3 - 11 11 12 35 g fr0 1g0984 general substrate transporter - 6 12 12 36 g fr0 1g9343 transporter - 6 8 12 37 g fr0 1g3053 peptidase s28 - 13 13 10 38 g fr0 1g9968 pectin lyas e-like protein - - - 10 39 g fr0 1g0020 transporter - 6 8 9 40 g fr0 1g1001 8 urod -like protein - 5 13 8 41 g fr0 1g6753 glycoside hydrolas 28 - 8 16 8 42 g fr0 1g2843 unknown function - 9 14 8 43 g fr0 1g0540 glycoside hydrolase 3 p - 6 8 8 44 g fr0 1g1687 ptr2 - 6 8 7 45 g fr0 1g6965 general substrate transporter - 7 8 7 142 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 46 g fr0 1g7523 vitamin b6 bios ynthesis - 5 9 7 47 g fr0 1g5906 glycoside hydrolase 92 - 5 8 6 48 g fr0 1g1177 mitochondrion protein - 3 4 3 49 g fr0 1g6178 transporter - - 2 3 Gf-N2 株 と 比 較 し て Gf-A1 株 で 発 現 差 の あ る 遺 伝 子 を 遺 伝 子 番 号 と 予 測 さ れ る 機 能 を 示 し 、 図 5-1 で 示 し た 栽 培 日 数 で の Gf -N2 株 と 比 較 し た と き の Gf-A1 株 に お け る 相 対 発 現 量 を 示 す 。 赤 色 は 、 い ず れ か の 栽 培 日 数 で 発 現 差 が Gf-N2 と 比 較 し て 100 倍 以 上 差 が あ っ た 遺 伝 子 を 示 す 。 143 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 表 5-3. Gf -N 2 株 と 比 較 し て Gf-A4 株 で 発 現 差 の あ る 遺 伝 子 群 vs Gf-N2 fold changes No. Gene ID Putative gene product 80 d 82 d 84 d 86 d 1 g fr0 1g1161 hypothetical protein 6 2 3 10 2 g fr0 1g0949 unknown function 5 6 5 5 3 g fr0 1g4454 glycoside hydrolase 3 4 9 14 - 4 g fr0 1g3268 alcohol oxidas e 4 10 8 9 5 g fr0 1g1016 alcohol oxidas e 4 10 5 5 6 g fr0 1g1146 cyanamide hydratas e 4 27 18 8 7 g fr0 1g0814 C ys 2 His 2 z in c fing e r pr ot ein 3 31 19 36 8 g fr0 1g2510 glycoside hydrolase 29 3 6 11 3 9 g fr0 1g9813 unknown function 3 3 13 15 10 g fr0 1g9127 perforin 3 14 9 6 11 g fr0 1g4930 subtilisin-like protein 3 7 3 7 12 g fr0 1g3691 fa d nad -p-b inding p rotein 3 - 4 5 13 g fr0 1g2116 monooxygenase 3 6 3 4 14 g fr0 1g9332 meth ylt rans ferase (ICM T) 2 4 5 4 15 g fr0 1g3530 unknown function 2 - 3 5 16 g fr0 1g0163 d-lactonohydrolas e 2 5 15 7 17 g fr0 1g3345 protein kinas e 2 3 7 3 18 g fr0 1g8870 methyltrans ferase 2 3 7 3 19 g fr0 1g3974 cytochrome p450 2 8 13 10 20 g fr0 1g5433 unknown function 2 - 2 11 144 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 21 g fr0 1g9356 CsbD - 7 7 - 22 g fr0 1g1381 enolase - - 5 - 23 g fr0 1g1234 glycoside hydrolase 95 - 5 5 - 24 g fr0 1g1001 8 urod -like protein - 3 4 - 25 g fr0 1g1912 unknown function - 7 4 - 26 g fr0 1g7422 alpha-galactosidas e - 5 4 - 27 g fr0 1g3980 glycoside hydrolase 79 - 5 3 - 28 g fr0 1g5893 amino acid transporter - 5 3 - 29 g fr0 1g3053 peptidase s28 - 5 3 - 30 g fr0 1g0023 formate dehydrogenas e - 7 22 29 31 g fr0 1g0061 unknown function - 11 17 23 32 g fr0 1g2915 unknown function - 6 13 16 33 g fr0 1g9744 unknown function - - 3 15 34 g fr0 1g8759 glycoside hydrolase 92 - 5 4 10 35 g fr0 1g0277 catalase - 3 4 10 36 g fr0 1g3671 unknown function - 2 5 9 37 g fr0 1g9412 unknown function - 3 5 8 38 g fr0 1g3544 pep tidas e fa mily s4 1 - 2 - 6 39 g fr0 1g7895 carbohydrate esterase - 2 2 6 40 g fr0 1g3082 pep tidas e fa mily s4 1 - 2 - 6 41 g fr0 1g1188 aquaporin-like protein - 4 4 6 42 g fr0 1g3692 unknown function - - 4 6 43 g fr0 1g8270 unknown function - 4 3 5 44 g fr0 1g0478 unknown function - 3 3 5 45 g fr0 1g9915 acetamidase - - 4 5 16 145 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 46 g fr0 1g2811 unknown function - 2 - 5 47 g fr0 1g3159 unknown function - 3 3 5 48 g fr0 1g1964 unknown function - 2 - 5 49 g fr0 1g1631 unknown function (DUF1768) - 4 7 5 50 g fr0 1g4919 unknown function - 2 3 5 51 g fr0 1g4003 fa d nad -bin ding protein - 3 3 5 52 g fr0 1g4460 unknown function - 3 - 5 53 g fr0 1g2241 hypothetical protein - 4 2 4 54 g fr0 1g0675 unknown function - 4 6 4 55 g fr0 1g9040 unknown function - 6 4 4 56 g fr0 1g4887 glycoside hydrolase 31 - 4 6 4 57 g fr0 1g2250 hypothetical protein - 3 5 4 58 g fr0 1g6511 unknown function - 3 5 4 59 g fr0 1g3012 alpha beta -hydrolas e - 4 5 4 60 g fr0 1g4139 ER retention -related protein - 7 7 4 61 g fr0 1g7924 glycoside hydrolase 2 - 3 5 3 62 g fr0 1g3839 fructosamine kinase - 6 7 3 63 g fr0 1g3465 unknown function - 3 5 3 64 g fr0 1g8511 unknown function - 2 6 3 65 g fr0 1g1125 hypothetical protein - 4 7 3 66 g fr0 1g0114 unknown function - 4 4 3 67 g fr0 1g4627 lectin 2a - - 5 3 68 g fr0 1g9968 pectin lyas e-like protein - 5 5 2 69 g fr0 1g7466 heat shock protein HSP20 - - 6 2 146 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 Gf-N2 株 と 比 較 し て Gf-A4 株 で 発 現 差 の あ る 遺 伝 子 を 遺 伝 子 番 号 と 予 測 さ れ る 機 能 を 示 し 、 図 5-1 で 示 し た 栽 培 日 数 で の Gf -N2 株 と 比 較 し た と き の Gf-A4 株 に お け る 相 対 発 現 量 を 示 す 。表 中 、青 色 は 、発 現 差 の あ っ た 69 遺 伝 子 の な か で 最 も 差があった遺伝子を示す。 147 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 表 5-4. Gf-N2 株 比 較 し て 、 Gf-A1 と Gf-A4 株 で 共 通 し て 発 現 差のある遺伝子群 Number of No. Gene ID Putative gene products Group GOs 1 g fr0 1g0814 C ys 2 His 2 z in c fing e r pr ot ein 12 A 2 g fr0 1g1161 hypothetical protein 1 B 3 g fr0 1g0023 nad-dependent formate dehydrogenas e 9 C 4 g fr0 1g1188 aquaporin-like protein 7 C 5 g fr0 1g2241 hypothetical protein 0 C 6 g fr0 1g2510 glycoside hydrolase family 29 protein 6 D 7 g fr0 1g3268 alcohol oxidas e 6 D 8 gfr01g10018 urod -like protein 4 D 9 g fr0 1g3974 cytochrome p450 3 D 10 g fr0 1g9968 pectin lyas e-like protein 3 D 11 g fr0 1g7422 alpha-galactosidas e 3 D 12 g fr0 1g9332 meth ylt rans ferase (ICM T) 3 D 13 g fr0 1g3053 peptidase s28 2 D 14 g fr0 1g3839 fructosamine kinase 2 D 15 g fr0 1g4887 glycoside hydrolase family 31 protein 1 D 16 g fr0 1g0163 d-lactonohydrolas e-like protein 1 D 17 g fr0 1g4139 ER retention -related protein 1 D 18 g fr0 1g1146 cyanamide hydratas e 1 D 19 g fr0 1g1016 alcohol oxidas e 1 D 148 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 20 g fr0 1g2250 hypothetical protein 0 D 21 g fr0 1g1125 hypothetical protein 0 D 22 g fr0 1g9127 perforin 0 D 23 g fr0 1g9356 CsbD domain -containing protein 0 D 24 g fr0 1g1631 unknown function (DUF1768) 0 D Gf-N2 株 と 比 較 し て Gf-A1 株 と Gf-A4 株 で 共 通 し て 発 現 差 の あ っ た 2 4 遺 伝 子 と そ の 予 測 機 能 、遺 伝 子 オ ン ト ロ ジ ー 用 語 の 付 与 数 を 示 す 。 グ ル ー プ は 図 5-3 で 示 す 発 現 パ タ ー ン に よ る分類群を示す。 149 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 5.4. ま と め 本 章 で は 、 子 実 体 生 育 不 全 株 で あ る Gf -A1 株 及 び Gf-A4 株 と 正 常 に 子 実 体 生 育 が 起 こ る Gf-N2 株 の 遺 伝 子 発 現 を 比 較 す ることによって、子実体生育に関わる遺伝子群の同定を試み た。その結論は次のように、摘要される。 1. Gf -A1 株 は 49 遺 伝 子 、 Gf -A4 株 は 69 遺 伝 子 で Gf -N2 株 と 比 較 し て 発 現 挙 動 が 異 な る と と も に 、そ の 発 現 量 も 高 か っ た 。よ っ て 、子 実 体 生 育 時 に お い て は 発 現 抑 制 さ れ る べ き 遺 伝 子 が 発 現 し て い る た め 、両 株 は 子 実 体 生 育 不 全 に な る と考えられた。 2. 上 述 の 遺 伝 子 中 24 遺 伝 子 が Gf-A1 株 と Gf-A4 株 で 共 通 し て 発 現 が 高 く 、な か で も 転 写 因 子 を コ ー ド す る G f . C R Z 1 遺 伝子が両株ともに最も高い値をしていた。このことから、 Gf.CRZ1 遺 伝 子 を 除 く 両 株 に 共 通 し て 発 現 が 高 か っ た 23 遺 伝 子 は 、転 写 因 子 G f . C R Z 1 遺 伝 子 に よ る 制 御 を 受 け て い る可能性が考えられた。 3. Gf -A1 株 と Gf -A4 株 で 共 通 し て Gf-N2 株 よ り 高 か っ た 24 遺 伝 子 の う ち 19 遺 伝 子 （ グ ル ー プ D） は 、 培 養 86 日 目 以 降 Gf-A1 株 は そ れ ら の 発 現 量 が 高 発 現 の ま ま で あ っ た が 、 Gf-A4 株 で は そ れ が Gf-N2 株 の そ れ ら と 同 程 度 に ま で 減 少 し て い た 。 こ の と き 、 Gf-A1 株 は 子 実 体 原 基 の 形 成 は 認 め ら れ る が そ れ 以 降 の 子 実 体 の 分 化・生 育 が 認 め ら れ な か っ 150 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 た の に 対 し て 、 Gf-A4 株 は 子 実 体 原 基 か ら 菌 柄 の 分 化 生 育 ま で は 認 め ら れ た が 菌 傘 の 分 化 展 開 に ま で は 至 ら ず 、本 研 究においても冒頭で述べた両株の子実体形成不全の特徴 を 表 し て い た 。こ の こ と か ら 、グ ル ー プ D に 属 す る 遺 伝 子 群は菌傘の分化生育に関与している可能性が考えられた。 4 . 本 研 究 は 、マ イ タ ケ の 子 実 体 生 育 不 全 株 を 用 い て マ イ タ ケ の子実体形成過程における遺伝子発現を調べた最初のも の で あ る 。本 研 究 成 果 は 、担 子 菌 類 タ マ チ ョ レ イ タ ケ 目 き のこの子実体生育に関与する候補遺伝子群の情報を提供 す る と と も に 、こ れ を 基 に 解 析 を 続 け る こ と で 担 子 菌 類 き のこの子実体生育機構の解明と食用きのこ生産技術開発 に寄与するものである。 5. Gf.CRZ1 遺 伝 子 の 発 現 量 を Gf-N2 株 、 Gf-A1 株 及 び Gf-A4 株 の 種 菌 段 階 で 調 べ た と こ ろ 、 Gf-N2 株 に お け る 発 現 量 を 1 と し た と き に G f - A 1 株 で は 8 6 倍 、G f - A 4 株 で は 4 倍 と 有 意 に 高 発 現 だ っ た 。 こ の こ と か ら 、 Gf.CRZ1 遺 伝 子 の よ う に正常株と異なる発現パターンを示す遺伝子をマーカー と す る こ と で 、使 用 す る 種 菌 の 選 別 が 可 能 で あ る こ と を 示 した。 151 第五章 マイタケ子実体生育不全株の解析 参考文献 1. Matheos D P, Kin gsbu r y TJ, Ah san US, Cunningham KW ( 1 9 9 7 ) . Tc n 1 p / C r z 1 p , a c a l c i n e u r i n - d e p e n d e n t t r a n s c r i p t i o n factor that differentially S a c c h a ro m y c e s c e re v i s i a e . regulates Genes gene and expression Development in 11: 3445-3458. 2. St a t hopoul o s AM, C ye rt MS (1 997). Ca l c i ne uri n a c t s t hrou gh the CRZ1/TCN1 -encoded transcription factor to regulate gene e xpre ssi on i n ye a st . Ge ne s & De v e l opme nt 11 : 343 2 -344 4. 3 . S t a t h o p o u l o s - G e r o n t i d e s A , G u o J J , C y e r t M S ( 1 9 9 9 ) . Ye a s t calcineurin regulates nuclear localization of the Crz1p transcription factor through dephosphorylation. Genes and Development 13: 798 -803. 152 第六章 総合考察 第 6 章 総合考察 食用に供されるきのこのうち、シイタケやナメコ、エノキ タケ、マイタケといったいくつかの種類は、人工栽培技術が 確立されている。近年は、施設栽培が主流となっており、年 間を通して安定的に提供されている。しかしながら、食用き のこの生産現場における栽培環境条件の設定等は、生産者の 長年の経験に基づいていることが多い。食用きのこ生産で行 われている栽培方法について科学的な検証を行い、それを基 にした栽培技術を再構築することで、さらなる生産の効率化 や環境の負荷低減等を成し遂げることができると考えている。 その一つの方策として、食用きのこの栽培工程中に発現して いる遺伝子を網羅的に解析することによって、各工程で重要 な役割を担っている遺伝子を特定し、それら遺伝子の発現量 を指標にしたマーカー支援型の栽培工程管理等が考えられる。 そのためには遺伝情報の整備が必要であるが、現状はツクリ タケやシイタケ等のいくつかのハラタケ目で行われているに すぎず、担子菌の中でハラタケ目に次いで人工栽培されてい るきのこが多く属するタマチョレイタケ目についてはほとん ど行われていない。 そこで本研究では、食用きのこの栽培工程における子実 体生育における分子メカニズムの解明を最終目的とし、シイ タケ等のハラタケ目食用キノコと同じように生産販売はされ ているがそための技術の礎となる基礎科学的研究が未だ少な いタマチョレイタケ目のモデル食用きのことしてマイタケを 153 第六章 総合考察 選び、その栽培工程で発現する遺伝子情報の把握を行った。 そ し て 、 特 に 顕 著 な 発 現 変 化 が 認 め ら れ た Gf.BMR1 と Gf.CRZ1 、Gf.HSP9 遺 伝 子 に つ い て は 詳 細 に 解 析 し 、そ の 機 能 について推察した。その結果、以下の結論が得られた。 (1) 第 二 世 代 型 シ ー ク エ ン サ ー を 用 い て マ イ タ ケ 、エ リ ン ギ 、 ブナシメジ及びシイタケの 4種の食用きのこ栽培工程で発 現 し て い る 遺 伝 子 断 片 を 網 羅 的 に 配 列 決 定 し 、い ず れ の 種 類 に お い て も 総 塩 基 長 100 Mb 程 度 の ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 情 報 が 得 ら れ た 。こ れ ら か ら 遺 伝 子 予 測 を 行 い 、マ イ タ ケ か ら 10,150 遺 伝 子 、 エ リ ン ギ か ら 13,038 遺 伝 子 、 ブ ナ シ メ ジ か ら 12,012 遺 伝 子 、 シ イ タ ケ か ら 10,639 遺 伝 子 を 推 定 し た 。予 測 遺 伝 子 の 全 塩 基 長 は 、マ イ タ ケ で 約 1 2 M b 、 エ リ ン ギ で 約 16 Mb、 ブ ナ シ メ ジ で 約 14 Mb、 シ イ タ ケ で 約 1 4 M b と な り 、ゲ ノ ム が 公 開 さ れ て い る ネ ナ ガ ノ ヒ ト ヨ タ ケ 等 か ら 推 察 さ れ る 遺 伝 子 の 全 塩 基 長 が 10～ 13 Mb 程 度 と 予 測 さ れ た た め 、本 デ ー タ は 網 羅 性 が 十 分 に 確 保 さ れ た 情 報 量 を 備 え て い る と 考 え ら れ た 。し か し な が ら 、こ れ ら の な か で ア ノ テ ー シ ョ ン が 付 与 さ れ た 割 合 は 40%程 度 に と ど ま っ た こ と か ら 、食 用 き の こ の 分 子 生 物 学 的 知 見 は 未 だ 不 十 分 で あ る 。特 に マ イ タ ケ の 割 合 は 3 8 % と 4 種 の 食 用 き の こ の う ち で 最 も 低 く 、タ マ チ ョ レ イ タ ケ 目 は ハ ラ タ ケ 目 よ り も 遺 伝 子 情 報 が 不 足 し て お り 、タ マ チ ョ レ イ タ ケ 目の分子生物学的研究を進める意義を示すものであった。 154 第六章 総合考察 (2) マイタケの栽培工程における発現遺伝子とそのプロフ ァ イ ル を 取 得 す る た め 、先 述 の ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 情 報 を基に作成したマイクロアレイを用いて栽培工程に沿っ て発現している遺伝子の種類とその挙動を経時的に調べ、 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、培 養 工 程 初 期 に 高 発 現 し て い た 遺 伝 子 99 個 あ り 、 そ の 多 く は 木 材 腐 朽 菌 で あ る 担 子 菌 が 木質成 分を 資化 して いく う えで必 要と 考え られ ている C A Z y m e s や F O Ly m e s に 属 す る 遺 伝 子 で あ っ た 。 こ れ は 、 マイタケは栽培工程初期に菌糸を培地内外に蔓延らせよ う と し て い る 様 相 を 反 映 し て い る も の と 考 え ら れ た 。ま た 、 担子菌や子嚢菌で一般的に菌糸培養中に発現していると い わ れ て い る ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 に つ い て も 、マ イ タケ栽培培養工程初期には高発現していたことを確認し た 。芽 出 し 工 程 で は 、芽 出 し 操 作 前 と 比 較 し て 芽 出 し 操 作 後 に 発 現 が 、 4 倍 以 上 上 昇 し て い た 遺 伝 子 を 21 個 、 1/4 減 少 し て い た 遺 伝 子 を 34 個 同 定 し た 。 こ れ ら に は 他 の 担 子 菌でも子実体生育に伴って発現すると報告されている金 属 プ ロ テ ア ー ゼ や シ ト ク ロ ム p450 等 が 含 ま れ て い た 。 こ れ ら の こ と は 、き の こ 栽 培 で は 一 般 に 芽 出 し 工 程 に お け る 操作は栄養成長から生殖生長へ移行させるための方法と い わ れ て い る こ と を 、遺 伝 子 発 現 挙 動 か ら も 裏 付 け る も の と考えられた。 発 生 工 程 で は 、発 生 操 作 前 と 比 較 し て 発 生 操 作 後 に 4 倍 以 上 発 現 上 昇 し て い た 遺 伝 子 を 5 6 個 、1 / 4 に 減 少 し て い た 155 第六章 総合考察 遺 伝 子 を 131 個 同 定 し た 。こ れ ら に は 、マ イ タ ケ 以 外 の 食 用きのこで今までに子実体生育への関与が報告されてい る ハ イ ド ロ フ ォ ー ビ ン 遺 伝 子 等 も あ れ ば 、こ れ ま で に 子 実 体 生 育 と の 関 連 が 報 告 さ れ て い な い HSP9 遺 伝 子 、 HSP20 遺 伝 子 、セ ラ ト プ ラ タ ニ ン 様 蛋 白 質 な ど の 低 分 子 タ ン パ ク 質関連遺伝子等があった。 特 に こ れ ま で に 子 実 体 生 育 と の 関 連 の 報 告 が な い HSP9 遺 伝 子 は 、本 研 究 で 調 べ た マ イ タ ケ 、エ リ ン ギ 、ブ ナ シ メ ジ の 全 て に 存 在 し て い た だ け で な く 、そ れ ら の 子 実 体 生 育 過 程 に 沿 っ た 発 現 挙 動 が 同 じ で あ っ た 。し た が っ て 、H S P 9 遺 伝 子 は 、担 子 菌 類 に お い て は 子 実 体 生 育 過 程 で 共 通 の 機 能を担っているものと考えられた。またこれらの知見は、 HSP9 遺 伝 子 の 担 子 菌 に お け る 最 初 の 報 告 で あ る 。 (3) 食用きのこ栽培における環境制御は、光、温度、湿度、 ガ ス 濃 度 、風 速 と 多 岐 に わ た る 。光 は 、子 実 体 生 育 開 始 の 誘 導 因 子 と し て 知 ら れ 、重 要 な 環 境 因 子 の 一 つ で あ る 。そ こでマイタケにおける光応答についての知見を深めるた め に 、青 色 光 下 と 近 紫 外 光 下 で マ イ タ ケ の 子 実 体 分 化 ・ 生 育 を 行 い 、経 時 的 に 発 現 し て い る 遺 伝 子 を マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い て 調 べ 、そ の 挙 動 の 解 析 を 行 っ た 。マ イ タ ケ は 、近 紫 外 光 下 で は 、青 色 光 下 に 比 べ て 菌 傘 の 黒 色 化 と 傘 径 が 大 き く な る と い わ れ て い る こ と が 確 認 で き た 。ま た 、近 紫 外 光 下 の 菌 傘 に 含 ま れ る メ ラ ニ ン 含 有 量 を 540nm の 吸 光 度 で 調 べ た と こ ろ 、 青 色 光 下 の そ れ と 比 べ て 2.4 倍 多 く 、 肉 156 第六章 総合考察 眼による色度合を裏付けた。マイクロアレイ解析の結果、 青色光下と近紫外光下のいずれにおいても発現が強く誘 導されていた転写因子をコードしている子嚢菌のメラニ ン 合 成 に 関 わ る BMR1 遺 伝 子 の ホ モ ロ グ と な る Gf.BMR1 遺 伝 子 を 見 出 し た 。し か し な が ら 、青 色 光 下 と 近 紫 外 光 下 に よ っ て 誘 導 さ れ て い た Gf.BMR1 遺 伝 子 の 発 現 量 は 同 じ で あ っ た た め 、青 色 光 下 よ り 近 紫 外 光 下 で 生 育 さ せ た マ イ タ ケの方が菌傘の黒色化及び菌傘径が大きくなっていた効 果 に つ い て は Gf.BMR1 蛋 白 質 単 独 で は な く 、 そ の 他 の 未 同 定 蛋 白 質 が 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。本 研 究 か ら 発 生 操 作 に よ っ て 原 基 表 面 が 黒 色（ メ ラ ニ ン ）化 す る の に Gf.BMR1 蛋 白 質 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ 、 G f . B M R 1 遺 伝 子 を 基 点 に 解 析 し て い く こ と で 、マ イ タ ケ 子 実 体 分 化 の 開 始 、特 に 光 刺 激 に よ る シ グ ナ ル 伝 達 機 構 が 明 ら か に な る と 期 待 さ れ る 。な お 、本 報 告 は 子 嚢 菌 の メ ラ ニ ン 合 成 に 関 わ る BMR1 ホ モ ロ グ に 関 す る 担 子 菌 で の 初 め ての報告である。 (4) 正常な子実体生育における発現遺伝子とそのプロファ イ ル に 続 き 、其 れ と 同 様 に 調 べ た 子 実 体 生 育 不 全 株 で あ る Gf-A1 株 及 び Gf-A4 株 を 用 い て 子 実 体 生 育 に 関 与 す る 遺 伝 子 を 探 索 し た 。子 実 体 生 育 が 正 常 に 進 行 し て い た G f - N 2 株 と 比 較 し て 、 Gf-A1 株 で は 49 遺 伝 子 、 Gf-A4 株 で は 69 遺 伝 子 で 発 現 挙 動 が 異 な り 、し か も そ れ ら は 全 て 高 発 現 で あ っ た 。よ っ て 、正 常 な 子 実 体 生 育 時 に お い て は 発 現 抑 制 さ 157 第六章 総合考察 れ る べ き 遺 伝 子 が 発 現 し て い た た め 、子 実 体 生 育 不 全 に な っ て い る と 考 え ら れ た 。Gf -A1 株 と Gf -A4 株 で 見 出 さ れ た 遺 伝 子 の う ち 、2 4 遺 伝 子 は 共 通 で あ り 、さ ら に そ の 中 か ら 両 株 と も に 最 も 高 く 発 現 し て い た 酵 母 S . c e re v i s i a e の 転 写 因 子 CRZ1 の ホ モ ロ グ と な る Gf.CRZ1 遺 伝 子 が 見 い だ さ れ 、 こ の 転 写 因 子 の 挙 動 と 他 の 23 遺 伝 子 の 挙 動 と が 類 似 し て い た こ と か ら 、 こ の 23 遺 伝 子 は 転 写 因 子 Gf.CRZ1 の 制 御 下 に あ る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 共 通 す る 24 遺 伝 子 を 発 現 挙動によって分類したうちのグループ D に属した遺伝子 は 、G f - A 1 株 で は 8 6 日 目 も 高 発 現 を 維 持 し て い た が 、G f - A 4 株 で は Gf-N2 株 の そ れ ら と 同 じ 程 度 ま で 発 現 が 減 少 し て い た 。 そ の 時 の マ イ タ ケ 子 実 体 の 表 現 型 は 、 Gf -A1 株 は 原 基 の ま ま で 止 ま っ て い た の に 対 し 、 Gf -A4 で は 菌 傘 の 形 成 不 全 で は あ る も の の 菌 柄 の 発 達 は み ら れ た 。こ の こ と か ら 、 グループ D に属する遺伝子群は菌傘形成に関与している 可 能 性 が 考 え ら れ た 。本 研 究 は 、マ イ タ ケ の 子 実 体 生 育 不 全 を 用 い た 最 初 の 大 規 模 遺 伝 子 解 析 に つ い て で あ る 。本 研 究 成 果 は 、第 3 章 及 び 第 4 章 と は 異 な っ た 視 点 か ら 子 実 体 生育に関与する候補遺伝子群の子実体の形態形成におけ る役割に関する手がかりとなる情報を提供するものであ った。 (5) 以 上 の よ う に 、本 論 文 は マ イ タ ケ を は じ め と す る 食 用 き のこの栽培工程に沿って発現しているトランスクリプト ー ム 情 報 を 整 備 す る と と も に 、マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 の 解 析 158 第六章 総合考察 及び子実体生育不全株を用いた解析からマイタケの子実 体 生 育 に 関 与 す る 遺 伝 子 を 網 羅 的 に 特 定 す る と と も に 、大 規 模 な 遺 伝 子 情 報 を 収 集 す る こ と が で き た 。そ の 中 か ら マ イタケの栽培工程下で子実体生育に伴って発現が上昇す る Gf.HSP9 遺 伝 子 が ホ モ ロ グ と し て ハ ラ タ ケ 目 食 用 キ ノ コにも存在するとともにその発現挙動も同じであったこ と か ら 、マ イ タ ケ の 遺 伝 子 情 報 が そ の 他 の 食 用 き の こ を 含 む担子菌類の子実体生育の分子機構を解明していくうえ で も 重 要 な 知 見 と な る こ と を 示 し た 。本 論 文 で は 、マ イ タ ケ の 栽 培 工 程 に お け る 発 現 遺 伝 子 情 報 を リ ス ト 化 し 、今 後 マイタケの子実体生育の分子メカニズムを解明していく 過 程 に お い て 、本 論 文 の 成 果 は 意 義 あ る 基 盤 情 報 に な る と 考 え て い る 。今 後 は 、本 論 文 で 得 ら れ た 子 実 体 生 育 に 関 与 す る 遺 伝 子 群 を 、遺 伝 子 破 壊 や 遺 伝 子 導 入 と い っ た 遺 伝 子 組 み 換 え に よ る 機 能 解 析 を 行 っ て 、そ れ ぞ れ の 子 実 体 生 育 のなかにおける役割を明らかにしていくことで子実体生 育機構の解明を進めていきたい。 (6) 産 業 応 用 上 と し て は 、子 実 体 生 育 と 発 現 量 と が 相 関 の あ る Gf.HSP9 遺 伝 子 の よ う な 遺 伝 子 を モ ニ タ リ ン グ す る こ と に よ っ て 、正 常 に 栽 培 が 進 行 し て い る か ど う か の 工 程 管 理が可能であることを示し（特許出願番号 P 1 0 - 0 9 4 5 ）、 Gf.CRZ1 遺 伝 子 の よ う な 正 常 と 異 な る 発 現 挙 動 を を 示 す 遺 伝 子 を モ ニ タ リ ン グ す る こ と に よ っ て 、生 産 に 使 用 す る 159 第六章 総合考察 種菌の 選別 が可 能で ある こ とを示 した （特 許出 願番号 P 1 1 - 0 5 1 5 ）。 (7) 以 上 の よ う に 、分 子 生 物 学 的 解 析 は 科 学 的 な 工 程 管 理 の 一 助 と な る こ と を 示 し た 。裁 判 現 場 で 本 格 的 に 活 用 し て い く た め に 、こ の よ う な 有 用 な 遺 伝 子 マ ー カ ー を 増 や し て い くことが今後の課題である。 160 本論文を構成する学術論文及び学会発表 本論文を構成する学術論文及び学会発表 学術論文（査読付） ( 1 ) K u r a h a s h i A , F u j i m o r i F, N i s h i b o r i K ( 2 0 1 2 ) . A n a l y s i s o f Ge ne Expression Profiles during cultivation of Grifola f r o n d o s a . T h e B u l l e t i n o f To k y o K a s e i U n i v e r s i t y 5 2 : 1 7 – 3 2 . (2) Kura ha shi A, Sato M, Nishib ori K, Fu jimori F (2 014). Hea t shock protein 9 mRNA expression increases during fruiting b o d y d i ff e r e n t i a t i o n i n G r i f o l a f ro n d o s a a n d o t h e r e d i b l e Mycoscience mushrooms. 55: 98-102; http://dx.doi.org/10.1016/j.myc.2013.06.001 . ( 3 ) K u r a h a s h i A , S a t o M , K o b a y a s h i T, N i s h i b o r i K , F u j i m o r i F (2014). Homologous genes, P e . p l e u ro t o l y s i n A and P e . o s t re o l y s i n , a r e b o t h s p e c i f i c a l l y a n d h i g h l y e x p r e s s e d i n p r i m o r d i a a n d yo u n g f r u i t i n g b o d i e s o f P l e u ro t u s e r y n g i i . Mycoscience 55: 113 -117; http://dx.doi.org/10.1016/j.myc.2013.06.005 . (4) Kurahashi A, Sato M, Nishibori K, Fujimori F (2014). Identification of different ially expressed ge nes in fruiting b o d y m u t a n t s o f G r i f o l a f r o n d o s a . T h e B u l l e t i n o f To k y o Kasei University 54: 23-33. 161 本論文を構成する学術論文及び学会発表 参考文献 K u r a h a s h i A , S h i m o d a T, S a t o M , F u j i m o r i F, H i r a m a J , Nishibori K. A transcription factor Gf.BMR1 in Grifola f ro n d o s a , t h e h o m o l o g o f B M R 1 i n B i p o l a r i s o r y z a e , w a s strongly induced by near-ultra violet and blue light . Submitte d to Mycoscience. 国内学会発表 ( 1 ) K u r a h a s h i A , S a t o M , K i n o s h i t a M , F u j i m o r i F, N i s h i b o r i K , 2009. Molecular biological approaches to exploring m e c ha ni sm s of frui t bod y for m a t i on of t he ba si di om yc e t ous edible mushroom. 第 32 回 日 本 分 子 生 物 学 会 年 会 （ 横 浜 ） . (2) 倉 橋 敦 , 佐 藤 真 之 , 木 下 み ほ こ , 西 堀 耕 三 , 藤 森 文 啓 , 2010. マ イ タ ケ の 子 実 体 発 達 メ カ ニ ズ ム 解 明 に 向 け た ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 解 析 . 日 本 農 芸 化 学 会 2010 年 度 大 会 （東京）. (3) 倉 橋 敦 , 佐 藤 真 之 , 木 下 み ほ こ , 西 堀 耕 三 , 藤 森 文 啓 , 2010. マ イ タ ケ 栽 培 に お け る 生 育 工 程 中 の 子 実 体 分 化 停 止変異株（分化停止株）を用いたマイクロアレイ解析. 日 本 き の こ 学 会 第 14 回 大 会 （ 東 京 ） . (4) 倉 橋 敦 , 佐 藤 真 之 , 木 下 み ほ こ , 西 堀 耕 三 , 藤 森 文 啓 , 2010. マ イ タ ケ 子 実 体 分 化 停 止 株 の 発 現 遺 伝 子 解 析 . 第 33 回日本分子生物学会年会（神戸）. (5) 倉 橋 敦 , 2011. 食 用 き の こ の ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム 解 析 . 第 173 回 生 存 圏 シ ン ポ ジ ウ ム （ 京 都 ） . 162 本論文を構成する学術論文及び学会発表 (6) 倉 橋 敦 , 佐 藤 真 之 , 三 浦 慎 也 , 牧 野 義 明 , 藤 森 文 啓 , 西 堀 耕 三 , 2011. 発 現 遺 伝 子 は 、 き の こ 栽 培 工 程 管 理 の 指 標 マ ー カ ー た り う る か . 日 本 き の こ 学 会 第 15 回 大 会 （ 長 野 ） . (7) 倉 橋 敦 , 佐 藤 真 之 , 西 堀 耕 三 , 藤 森 文 啓 , 2011. マ イ タ ケ を モデルとしたキノコ栽培へのゲノミクスアプローチ. 日 本 菌 学 会 第 55 回 大 会 （ 北 海 道 ） . (8) Kurahashi A, Sato M, Nishibori K, Fujimori F, 2011. Ge nomics Approach for Edible Mu shroom Culti vation . 第 3 4 回日本分子生物学会年会（横浜）. (9) 倉 橋 敦 , 下 田 隆 史 , 平 間 淳 司 , 西 堀 耕 三 , 2012. 青 色 光 刺 激に生体電位変動メカニズム解明のためのマイクロアレ イ 解 析 . 日 本 き の こ 学 会 第 16 回 大 会 （ 東 京 ） . (10) 倉橋敦, 下田隆史, 佐藤真之, 藤森文啓, 平間淳司, 西 堀 耕 三 , 2 0 1 3 . マ イ タ ケ は 、近 紫 外 光 が 見 え る . 第 13 回 糸 状菌分子生物学コンファレンス（筑波）. (11) K u r a h a s h i A , S a t o M , K o b a y a s h i T, F u j i m o r i F, N i s h i b o r i K, 2013. Mammalian cell membrane -binding protein function s d u r i n g p r i m o r d i a d e ve l o p m e n t i n P l e u ro t u s e r y n g i i . 第 3 6 回 日本分子生物学会年会（神戸）. 国際学会発表 Kurahashi A, Sato M, Nishibori K, Fujimori F, 2011. Ge n o m i c s A p p r o a c h f o r G r i f o l a f ro n d o s a ( M a i t a k e m u s h r o o m ) Cultivation. International Union of Microbiological Societies 2011 Con gre ss （ 北 海 道 ） . 163 本論文を構成する学術論文及び学会発表 特許出願 (1) 発 明 者 倉 橋 敦 , 藤 森 文 啓 , 佐 藤 真 之 , 西 堀 耕 三 . 発 明 の 名 称 キノコの菌体選別方法及びキット. 特許出願整理番号 P10-0945 (2) 発 明 者 倉 橋 敦 , 藤 森 文 啓 , 佐 藤 真 之 , 三 浦 慎 也 , 牧 野 義 明 , 西堀耕三. 発明の名称 キノコの栽培期間決定方法及び キ ッ ト . 特 許 出 願 整 理 番 号 P 11 -0 515 164 用語説明 用語説明 用語 説明 子 実 体 とは、菌 類 が胞 子 形 成 のために作 る構 造 物 で、 子実体 大 型 のものを総 称 して「きのこ」と呼 ぶ。 子 実 層 托 と は 、子 実 体 の 菌 傘 裏 側 に 形 成 さ れ る 襞 子実層托 や管孔を総称する。 植 物 （主 に樹 木 ）の根 と共 生 関 係 を形 成 する菌 のこと を、菌 根 性 菌 と総 称 する。そのうち、きのこを形 成 する菌 菌根性菌 根 性 菌 を、菌 根 性 きのこと呼 ぶ。マツタケやホンシメジ等 が含 まれる。 逐 次 DNA 合 成 /光 検 出 法 を用 いた超 並 列 シークエンシ 第 二 世 代 型 シー ング法 を行 うシークエンサーを第 二 世 代 型 と呼 ぶ。第 一 クエンサー 世 代 型 シークエンサーと比 較 して、100 ~ 1000 倍 程 度 の配 列 決 定 能 力 がある。 トランスクリプトー 特 定 の状 況 下 において細 胞 中 に存 在 する全 ての mRNA ム の総 体 。 多 数 の測 定 対 象 となる遺 伝 子 をガラス等 の基 盤 に固 定 化 したもので、蛍 光 等 によって検 出 する。マイクロアレ マイクロアレイ イを用 いることで、1 度 に多 数 の遺 伝 子 の発 現 量 を検 出 することができる。 165 用語説明 Ser ia l Ana lys is o f G e ne E xpr e ss io n の 略 。 マイク ロア レイと同 じく多 数 の遺 伝 子 の発 現 状 況 を把 握 するため SAGE の方 法 であるが、DNA シークエンシングによって検 出 す る。 木 材 を不 朽 させる腐 生 菌 のうち、特 に木 材 に含 まれる 難 分 解 性 のリグニン、セルロース、ヘミセルロースを分 解 木材不朽性菌 する能 力 のある菌 を指 す。シイタケやマイタケ等 多 くの食 用 きのこが含 まれる。 生 物 遺 体 や老 廃 物 など生 きていない有 機 素 材 を栄 養 腐生菌 源 とする菌 の総 称 。食 用 きのこでは、稲 わらや堆 肥 を培 養 基 材 として用 いるツクリタケなどを指 す。 菌 糸 とは、菌 類 の体 を構 成 する糸 状 の構 造 であり、酵 菌糸 母 などの単 細 胞 状 態 の菌 類 に対 して、菌 糸 を形 成 する 体 細 胞 状 態 の菌 類 を糸 状 菌 と総 称 する。 主 として担 子 菌 類 に見 られる菌 糸 の状 態 で、菌 糸 細 胞 2 核菌糸 に二 つの核 が存 在 する。子 実 体 を形 成 する菌 糸 は、2 核 菌 糸 である。 菌 床 とは、オガコなどの木 質 基 材 に栄 養 物 を混 合 した 菌床 食 用 きのこ用 の培 養 培 地 を指 す。 コンティグとは、ショットガンシークエンシングで読 まれた コンティグ DNA 断 片 配 列 を 重 ね合 わせてできるコンセ ンサス配 列 で構 成 される DNA 断 片 配 列 群 を指 す。 コンティグを形 成 するために DNA 断 片 配 列 を重 ね合 わ アセンブル せてコンセンサス配 列 を組 み立 てること。 166 用語説明 オープンリーディ オープンリーディングフレーム (ORF) とは、DNA または ングフレーム RNA 配 列 が タ ン パ ク 質 に 翻 訳 さ れ る 可 能 性 が あ る 塩 (ORF) 基 配 列 を指 す。 遺 伝 子 配 列 から、公 共 データベース等 に登 録 されている アノテーション 類 似 遺 伝 子 の情 報 などから、その遺 伝 子 に付 与 された 予 測 機 能 などの情 報 のこと。 遺 伝 子 オントロジーとは、生 物 学 的 概 念 を記 述 するため 遺 伝 子 オントロ の、共 通 の語 彙 を策 定 しようとするプロジェクトであり、こ ジー ( ge ne o nt o lo g y) のプロジェクトで定 義 された用 語 は GO 用 語 と呼 ばれ、生 物 種 横 断 的 な解 析 を可 能 にする。 遺 伝 子 重 複 によって生 じた 2 つの遺 伝 子 のそれぞれを パラログ パラログと呼 び、両 遺 伝 子 の関 係 をパラログな関 係 と呼 ぶ。 異 なる生 物 種 間 に存 在 する相 同 な機 能 をもった遺 伝 子 オルソログ をオルソログと呼 び、種 分 化 の過 程 で生 じた遺 伝 子 を指 す。 蛋 白 質 のアミノ酸 配 列 や遺 伝 子 の塩 基 配 列 が類 似 し ホモログ ている遺 伝 子 のことを総 称 し、パラログやオルソログを含 む。 167 謝辞 謝辞 本研究は、著者が株式会社雪国まいたけから株式会社ハイ ファジェネシスに派遣され、東京家政大学家政学部環境教育 学科生物工学研究室に赴任中に、同大学藤森文啓准教授と雪 国まいたけの西堀耕三研究推進役の指導の下に行ったもので す 。藤 森 准 教 授 に は 、研 究 員 と し て の 受 け 入 れ か ら 研 究 計 画 、 実験、本論文作成及び主査に至るまで熱心なご指導をいただ きました。また、研究者との交流の場をいくつも設けていた だき、多くの人脈を形成できたことは研究者人生において何 物にも代え難いものであり、深く感謝申し上げます。 西堀耕三研究推進役には、著者が雪国まいたけに入社し、 社会人として右も左もわからない状態から社会人としての振 る舞い、企業研究者としの心得、これまで全く扱ったことの ない「きのこ」の実験についてなど数多くのことを学ばせて いただき、今日の私があります。特に、本論文を作成できた の は 、ひ と え に 西 堀 研 究 推 進 役 の ご 理 解 が あ っ て の こ と で す 。 ここに深く感謝を申し上げます。 本論文を構成する原著論文の多くは、実験の実施にあたり 雪国まいたけの佐藤真之氏の多大なる協力を得たことを記す と と も に 心 よ り 感 謝 を 申 し 上 げ ま す 。 二 人 で 夜 遅 く ま で RNA を調製したのが、つい先日のように思いだされます。 独立行政法人理化学研究所 小林脂質生物学研究室の小林 俊秀主任研究員、金沢工業大学の平間淳司教授には共同研究 168 謝辞 を通じて多くのご指導とご助言を賜り、本論文を作成するこ とができました。深く感謝を申し上げます。 研究補助として、研究をサポートしてくれた木下みほこ氏 にも心より感謝申し上げます。 著者が所属する雪国まいたけ研究開発室の諸氏、派遣先で あるハイファジェネシスの皆様、生物工学研究室学部学生の 皆様にもご協力いただきました。関係諸氏に感謝申し上げま す。 本論文は、審査委員として東京家政大学人間生活学専攻の 岩田力教授、森田幸雄教授、大西淳之准教授、玉川大学の奥 田徹教授に多くのご指導・助言をいただき、より質の高いも のにすることができました。心より感謝申し上げます。株式 会社ハイファジェネシス代表取締役社長でもある奥田教授に は、同社派遣中から今日に至るまでお世話になっており、重 ねて感謝申し上げます。 そして、研究者としていままで続けられてきたのは、やは り 大 学 ・ 大 学 院 で の 静 岡 県 立 大 学 教 授 の 竹 石 桂 一 先 生（ 現 静 岡 県 立 大 学 名 誉 教 授 ）、助 手 の 堀 江 信 之 先 生（ 現 静 岡 英 和 学 院 大学教授）のご指導と通算 3 年間のラボライフがあってのこ とです。あの 3 年間、本当に充実した学生生活を送ることが できました。その経験と教えていただいたこと全てが今の自 分を形成していると、ことあるごとに実感しております。改 めて深い感謝の意を、ここに示します。 最後になりますが、実験で帰宅が夜遅くになる中、二人の 子育てを任せきりにし、派遣と帰社に伴う 2 度の引っ越しな 169 謝辞 ど多大な労をかけたにもかかわらず、どのような状況におい ても応援してくれた妻みゆきに、そして本論文作成中にはあ まり遊んであげられず、我慢を強いてしまった長男瑠之介と 二男陽之進の協力に心から感謝します。 本研究は、次に記します外部研究資金により一部実施されま した。ここに記して感謝の意を表します。 独立行政法人 科学技術振興機構（第 4 章が該当） 研 究 成 果 展 開 事 業 (A-STEP) 研 究 成 果 最 適 展 開 支 援 プ ロ グ ラ ム 課 題 番 号 AS2311606E 170