Clomiphene citrate によるドジョウ (Misgurnus anguillicaudatus) の
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Clomiphene citrate によるドジョウ (Misgurnus anguillicaudatus) の
Title Author(s) Citation Issue Date Clomiphene citrateによるドジョウ(Misgurnus anguillicaudatus)の排卵促進について 上田, 宏; 高橋, 裕哉 北海道大學水産學部研究彙報 = BULLETIN OF THE FACULTY OF FISHERIES HOKKAIDO UNIVERSITY, 27(1): 1-5 1976-06 DOI Doc URL http://hdl.handle.net/2115/23577 Right Type bulletin Additional Information File Information 27(1)_P1-5.pdf Instructions for use Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP 北大水産業報 27( 1 ), 1 5 .1 9 7 6 . C lomiphenecitrateによるドジョウ (Misgurnusanguillicaudatus) の排卵促進について 上回 宏ホ・高橋裕哉* AccelerationofOvulationintheLoach ,Misgurnusanguillicaudαtus, bythe Treatmentwith Clomiphene Citrate HiroshiUEDA* andHiroyaTAKAHASHIホ Abstract Clomiphenec i もmぬ,晶.n o v u l a t i o ns t i m u l a t o ri nm晶m m 晶l i 乱n晶n i m a l s, hωbe 唱n shown t o be e f f e c t i v ei ni n d u c i n go v u l a t i o n泊 at e l e o s t,t h eg o l d f i s h . The 自e n ts t u d yd e m o n s t r a t e dt h a tt h edrugwasa l s oc 叩 乱 ,b l eo f8.Cc e l e r a t i n go v u l a ・ p r e もi o ni nmaturef e m a l e so ft h eI 0 8 . C h,Mis 伊 間 山 側g u i l l i c a u d a t 削 , ω, p t u r e dd u r i n g , 品p e r i t o n e a l l yi n もo t h e t h e i rb r e e d i n gp e r i o d . Clomiphene c i t r a t ei n j e c t e di n t r f i s ha tdo 醐 o f1晶.nd10μg J gbodyweighteverydaybroughtaboutt h eo n s e to f 飴 ,rt h es e c o n di n j e c , もi o n,and s u c c e s s i v e l yi n d u c 唱d a o v u l a t i o ni n some f i s ha f a r g eamount o fmaturee g g si na l lo ft h et r e a t e df i s h d e f i n i t ed i s c h a r g eo f晶 l o u r ぬ i n j e c t i o na tl a t e s t,t h er e s p o n 随 b e i n g o fboth d o s a g eg r o u p sa f t e rもhef r e l a t i v e l yu n i f o r mi nt h e10μgg r o u p . I n j e c t i o n so f0.6%s a l i n eo n l yd i d no も i n c i t eo v u l a t i o ni nanyo ft h ec o n t r o lf i s ht h r o u g h o u tt h ep e r i o do fもr e a t m e n t . p o n s e t oc J omiphene c i t r a t e也 t h el o a c h 叩 P価 r e d, The o v u l a t o r y陀s however,t o bei n c o m p l e 色ew henもe s 飴d抗 b othd o s 乱g el e v e l s ,r e s u l t i n gi nt h e , 品r i a nweigh 旬 晶f 飴 rc Jo m i p h e n e a c c e l e r a t e do v u l 品 も ,i o na s occuη'enωofh i g h e rov comp 畠r e dw i t ht h o s e measured on t h ef i s ha f t e rt h e i rn a t u r a ls p a w n i n g . Aも a u t o p s y ,ac o n s i d e r a b l eamounto fmaturee g g swaso b s e r v e dt oremainu n o v u l a t e d mainlyi nt h ean 句r i o rr e g i o no fぬ. eo v a r i e so ft h ec l o m i p h e n e t r e 晶飴df i s h ,the r e t e n t i o no funovula ぬde g g sb e i n gmoreprominenti nt h ef i s ho ft h e10μggroup n s i d e r e dt or e f l e c tt h e thani nt h o s eo ft h e1μgg r o u p . Thephenomenonw品目 ω, 色他的,泊 t h en a t u r a lc o n d i , 色i o n ,t h em a t u r a t i o no fo v a r i 組 oocy もe si nt h e1 0 晶c h f a c p r o g r e s s e sfromt h ep o s ぬr i o randd o r s a lr e g i o n sもowardt h e品.nt e r i o rand v e n t r a l 日 o ft h e ov , 品r y . The 唱e f i n d i n g s soom もo s u g g e s も もh a t c l o m i p h e n e r e g i o n 屯t l l y, andt h u smayhavea c i t r a t emaya c tont h ef i s hmorem i l d l yandp h y s i o l o g i c 七i c a lv a l u ef o rもhea r t i f i c i a li n d u c t i o no fo v u l a t i o n than v a r i o u s h i g h e rp r a c p i t u i t a r yp r e p a r a t i o n sh e r e t o f o r eu s e di nf i s hp r o p a g a t i o n . 魚類の排卵の人為的誘導には,従来魚類の脳下垂体抽出物など各種の脳下垂体製品の投与が広く用 いられてきている。 ζ の方法はきわめて効果的ではあるが,投与量によって, また対象魚の成熟の度 Pに k f o r d&A t z l ) 参照)。また乙 合によって,未熟卵の排出や卵の過熟化などがひきお ζ され易い ( の場合に最も有効とされる魚類脳下垂体の利用についても,新鮮な脳下垂体を大量に用意することが 困難であるほか, その生殖腺刺激活性が魚の成熟度により異なる乙と叫生殖腺刺激ホルモンに種特 異性がある乙との,などの問題点がある。 事北海道大学水産学部淡水増殖主主講座 (La b O ' l 叫o r y0 1Fresh-WaterFish・Culture,Faculty0 1Fisheriω,HokkaidoUni官官r s i t y ) 北大水産業報 2 7 ( 1 ) . 1 9 7 6 . Clomipheneは非ステロイド系の合成抗雌性ホルモン物質 ( a n t i e s t r o g e n ) としてヒトを含む晴乳類 ta l .り は ζ の物質がキンギョ で排卵誘発に用いられているが, Pandey& Hoa刊 お よ び Pandeye C a r a s s i u sa u r a t u sでも排卵誘導作用をもつことを報告し,初めて硬骨魚の人為採卵 K 用いうる可能 性を示唆した。また B r e t o ne ta . 1り は clomipheneがコイ Cyprinusc a r p i oでも脳下垂体より生殖 腺刺激ホルモンの大量放出を導くことを明らかにしている。魚類の人為的な排卵誘導にそれ自体の脳 下垂体の機能昂進を利用する乙と,およびそれに c l o m i p h e n eなどの化学合成品を用いる乙とは,上 述した脳下垂体処理における難点の多くを消去するものといえようし, 水産増養殖の実際面でも大き な価値を有する t といたる可能性が大である。乙のような見地から,本研究においては産卵期の成熟ド n g u i l l i c a u d a t u s雌を用いて ヲョウ Misgurnusa c l o m i p h e n ec i t r a t eによる排卵の誘導を試み, そ の効果の硬骨魚における普遍性を検討した。 稿をすすめるにあたり,北海道南部の野外におけるドラョウの成熟について種々の資料の御教示を いた t :いた北海道大学大学院水産学研究科安泰憲氏にあっく御礼申しあげる。また本研究 ft:用いた c l o m i p h e n ec i t r a t eの入手に際しての塩野義製薬株式会社の御好意K 深甚なる謝意を表する。なお, 本研究の一部は文部省科学研究費補助金によった ζ とを附記する。 材料と方法 本実験K用いたドヲョウ (Misgurnusa n g u i l l i c a u d a t u s )は1 9 7 5年 6月下旬に函館市近郊で採集 し本学部飼育室内の水槽に収容して,実験開始時まで自然水温, 自然光条件下で 1日 1回市販の養魚 用飼料を与えて飼育したものである。実験は同年 7月上旬I C行なった。実験開始にあたり全長 15.5t:分け,それぞれを別個の単独循環式ガラス水 18.4cm,体重 21.0-33.5gの成熟雌を各 5尾の 3群 f 槽にいれ,うち 2群を c l o m i p h e n e処理群,他の 1群を対照群として用いた。実験期間中の水温およ び光は自然条件とし,投餌は行わなかった。また乙の期間の水温変化は 17-22Cであった。 0 'gとなるよう f t : 処理には c l o m i p h e n ec i t r a t eの純末を 0.6%食塩水I C0.01mlあたり 1および 1 0l 'gを,他の 1群 I Cは1OI'gを 溶解したものを用いた。処理群のうち 1群には処理魚の体重 19当り 11 とより軽く麻酔した魚の腹腔内 f t:注射し, 翌朝腹部を軽く圧して排卵の有 1日1回午後I C,MS222f 無を検した。充分な排卵がみられぬ個体には同様の処理を継続して行なった。また対照群には, 体重 19あたり O.Olmlの 0.6%食塩水を腹腔内に注射した。充分な排卵をみせた処理魚は体長,体重を 計測した後断頭屠殺し,生殖腺を摘出計重後 Bouin-Hollande液で固定, 8 μ の連続切片とし, O e l a . f i e l d ' sh e m a t o x y l i nおよぴ e o s i nの 2重染色を施して組織学灼観察を行なった。対照群は実験開始の 4日後に屠殺して比較観察に供した。 実験結果および考察 成熟雌ドヲョウの c l o m i p h e n e処理の結果を要約して表1ft:示した。 5日間にわたる実験期間中, 生理食塩水のみの注射をうけた対照群の 5尾はいづれも排卵の徴候を全くみせなかった。しかし c l o m i p h e n e処理群では,初回注射の翌日には 11 'g群および1OI' g群のいづれにおいても排卵個体は なかったが,第 2回注射の翌日には両群のそれぞれ 2尾が腹部の軽い圧造によりおよそ 30-50個の l o m i p h e n e1阿 群 卵を排出し,排卵が既に開始された ζ とを示した。第 3回注射の翌日の検査では, c では ζ れらの 2尾を含む 3尾が,また1OI'g群では処理をうけた 5尾の全てが大量の卵を放出するこ 'g群のの乙りの 2尾は 3回の注射では少量の卵の排出をみせ とが確かめられた。また c l o m i p h e n e11 とは他個体と同様,大量の排卵をみせた。排卵された卵は, るのみであったが,第 4回注射の翌日 I とんどが透明度の高い外観上正常な熟卵であった。受精試験は行わなかったが, 骨魚用生理食塩水中で付活きれて明らかな囲卵腔形成をみせた。 - 2ー ほ ζ れらの卵は淡水硬 上回・高橋: ドジョウの排卵促進 各群の尾数が 5尾にすぎずやや例数に乏しいきらいはあるが, 対照個体が全く排卵をみせなかった のI L対し c l o m i p h e n e処理個体のすべてが顕著な排卵をみせた乙とから, c l o m i p h e n eがドヲョウにお lomipheneは非ステロイド系合 いて明らかな排卵誘発効果をもっと結論してよいように恩われる。 C h l o r o t r i a n i s e n eと化学的に類似した物質で,クエン酸塩の形で 1 9 6 1年頃より無排 成雌性ホルモンの c 卵症における排卵誘発剤として臨床的 I L用いられてきている。 Clomipheneが硬骨魚類においても同 様な効果をもっととは Pandey& Hoat のにより初めて明らかにきれた。彼らは 13-140Cの水温で 排卵を抑えた成熟キンギョ C a r a s s i u sa u r a t u s1 1 :体重 19あたり 1およびlO! ' gの c l o m i p h e n eを 1 日 1団連続投与して 4日目までに大多数の個体から受精可能な卵を得る乙とに成功した。 P andey e ta l .のは引き続き,乙の c l o m i p h e n eによる排卵誘導が処理魚の脳下垂体よりの生殖腺刺激ホルモン (GTH)放出の促進の結果であるととを報じた。最近 B r e t o ne ta l .のは,キンギョで試みられたと同 ζ とを 実証している。本研究においてドジョウに投与した c l o m i p h e n eの量は,上記のキンギョおよびコイ l o m i p h e n eがコイ C y p r i n u sc a : r 戸oにおいても GTHの一過性の大量放出を惹起する じ量の c での結果を参照して定めたものであって,魚体重 19あたり 1ないし 1 0 ! ' gの腹腔内注射は, ド~ョ ウの排卵誘発にも充分有効であるし,きらに他魚種での排卵テスト l とも規準量として用いられ得るも のと考えられる。 T a b l e1 . R例 l t so ft r e a t m e n to fm仰 r ef e m a l el O r J A hw i t hd i f f e r 側 t d o s 回 o fc l 側 i p h e n ec i t r a t e . Tre 叫m ent No.of f i s h も 倒t e d Clomiphene 1μg/g 5 ・ 10μg/g 5 * キ * 事 料 肺移 5 乱t i n g No.o fo v u l f i s he a c hday 事$ 。 。 。。 ( 2 ) 3 ( 2 ) ( 2 ) 5 2 Meanbody w e i g h t乱も autopsy ( r a n g e ) g Meangonad w e i g h t乱t autopsy ( r a n g e ) g 2 3 . 6 ) ( 2 0 .0 3 0 .1 2 5 . 4 (20~ 7 3 0 .8 ) 2 1 .9 ( 1 9 . 5 2 5 . 6 ) 。 1 .9 ( 1 .2 3 . 0 ) 2 . 6 ( 1 . 6 3 . 3 ) 3 . 4 ( 2 . 8 4 . 4 ) Mean Gsr* ( r a n g e ) 8 . 0 ( 6 . 0 1 1 . 2 ) 1 0 . 3 ( 7 . 7 1 1 . 5 ) 1 5 . 6 ( 1 3 . 5 1 8 . 8 ) Gsr,g o n o s o m a t i ci n d e x( g o n a dw e i g h t / b o d yw e i g h tx 1 0 0 ) . Nu m e r a l si nparenthωesi n d i ω t et h enumbero ff i s hd i s p l a y i n go v u l a t i o no f 品 s m a l l 品mounto fe 宮g s . C o n t r o lf i s hwerei n j e c t e di . p .w i t h0.6%随 l i n e帥 chd a y . 道南地方におけるドクョウの産卵期は 6月から 8月t とかけてであるが, 最盛期の 7月 I L野外で採集 G S I, 生殖腺重量/体重 x100)は 13-15であり, きれた成熟来産卵雌の成熟度指数 ( の 8, 9月の個体の GSIは 4前後である ζ 5 . 6であって, おいて実験終了時に屠殺した対照群の GSIは平均 1 段階にある ζ また産卵期後 とが多い(矛,未発表)。表 11とみられるよう K,本研究に ζ れらの卵巣が産卵期の高い成熟 とは組織学的にも確められた。一方 c l o m i p h e n e処理群の GSIは , 比較的均一な反応を みせた 1 0 ! ' g群で平均 1 0 . 3,反応の個体差のより大きかった 1 ! ' g群で平均 8 . 0であった。 理個体の開腹時の所見では, !J鴨前部に相当量の大型肝が残存しており, ζ れら処 乙れが特 K 10μg群の各個 体に著しかった。組織学的にもとれらの卵巣内に残存する熟卵の数が自然産卵個体におけるよりも多 かった。 ド少ョウでは卵巣後部・背部の卯が前部・腹部のそれよりも早く成熟し 7), また脳下垂体ホルモン 処理による卵巣卵の成熟も事喋後部より中部・前部へとすすむ 8) 乙とが知られており, c l o m i p h e n e処 - 3- 北大水産業報 2 7 ( 1 ) . 1 9 7 6 . 理ドクョウ I とみられた卵巣の状態は, ζ の卵巣卵の成熟進行の部位差を反映するもののように思われ る。熟卵の残存が 1阿によりもlOf'gにおいて大量であった ζ とは, コイでの c l o m i p h e n e投与が l O f 'g/gよりも 1開 /gでより一定した GTH放出を導くという B r e t o ne ta l .のの報告にてらして興 味ある現象であるが, ドヲョウの排卵誘導において 1f 'gがより有効であるか否かの判定は今後の検 討にまたねばならない。 1 0' fgでは,排卵が 1' fgにおけるよりも早められる可能性があるし,また排 卵をみせた個体にさらに c l o m i p h e n e投与を継続する ζ とにより熟卵の完全な排卵を促しうるかもし れないからである。 ドヲョウの排卵促進に同種の脳下垂体 3ないし 4個分の懸濁液を用いた場合,処理魚の成熟状態が 良好であれば, 28-30oCの水温では腹腔内単一注射後 13-14時聞に排卵がみられるというの。 とれ に比して本研究での c l o m i p h e n e処理の場合,排卵開始の最初の徴候は 1μg,1 0f 'gの 両 群 で 第 2回 注射の翌日,即ち初回注射の 2日後の検査で,また大量排卵が第 3回注射ののちにみられ, また排卵 反応は 1f 'g群での個体差がより大であった。本研究での処理期間の水温が上記よりも低かった ζ とも 一因となりえようが, c l o m i p h e n eが排卵fL即効的ではない ζ とはキンギョでも知られているのので, ζ れは内因性の GTH放出を介してなされる c l o m i p h e n e誘導排卵の一般的傾向かもしれない。 とれ 1 : に関連して興味がもたれるのは,コイに投与した 1' fg/gの c l o m i p h e n eが単一注射後 60時間前後 1 対照値の 1 0倍を ζ える著しい GTHの分泌を促したという B r e t o ne ta l .りの報告である。 もしド ラョウ 1 1:於ても c l o m i p h e n efL対する反応がコイと同様であるとすれば c l o m i p h e n eの単一注射によ っても,およそ 3日後fL排卵を導きうる可能性があろう。しかし,前述のように完全な排卵を導くた めには,特i ヒドラョウのように卵巣卵の成熟の進行が部位差をみせる場合には,本研究で用いたよう な反復注射が,より生理的な反応を起させるのに適切のように恩われる。 脳下垂体抽出物ないし製剤による排卵刺激は, その投与量や対象魚の成熟の度合によって住々にし て未熟卵の排出や過熱現象をともない易くり, ドヲョウでの同処理もその例外ではない 9)。 ζ の点 c l o m i p h e n eの内因性 GTHの放出刺激による排卵は,その進行が緩徐ではあるが生理的な排卵t とより 近い状態のものと考えられる。 Clomipheneの投与適量が魚種l とより異なるか否か, また対象魚成熟 度の適切範囲がどの程度であるかなど,さらに検討を要する点はあるが,化学合成物である c l o m i p h e n e ! o m i p h e n e処理が魚類の採 はその使用が簡便であり, GTHの種特異性3) の問題もないので,将来 c 卵に従来の脳下垂体処理にかわるより好適な手段として用いられうる可能性が充分あろう。 なお, c l o m i p 4 e n eの作用機序に関しては,乙の物質が適正少量では視床下部一脳下垂体レベルでの 雌性ホルモンの n e g a t i v ef e e d b a c k効果による GTH放出抑制を措抗的fL阻止するという抗雌性ホル とより,脳下垂体より GTH放出を誘発する モン作用 t ζ とが晴乳類で明らかにされており 10),キンギ r e t o ne ta l .のもコイで c l o m i p h e n eの ョでの排卵刺激についても同様の機序が暗示されている 11)0 B 同様な効果を示唆しているが,彼ちは c l o m i p h e n eによる GTH放出が処理コイの性を問わず, それらの成熟度とも無関係にみとめられると述べている。 ζ の乙とは魚類における また c l o m i p h e n eの作 用機序について若干の問題を提起するとともに魚類の種苗生産への c l o m i p h e n eの利用をすすめるう えにも充分考慮すべき点のように恩われる。 要 約 キンギョでしられている c l o m i p h e n ec i t r a t eの排卵誘発効果を産卵期のドラョウ Misgurnusa n 'gおよび 1 0何 年 体 重 の c l o m i p h e n eを 1日 l団連日 g u i l l i c a u d a t u sの成熟雌を用いて検討した。 1f 陶Z 導かれた。生理食塩水を同様にして投与 腹腔内に注射した場合,第 3回注射ののちに明らかな排9 した対照群には排貯が全くみとめられなかった。 ζ の排卵促進は 1f 'g群fL比してlOf'g群でより顕著 であったが,卵巣内fL末排卵の熱卵の残存もより著しかった。方法にさらに検討を加える必要はあろ -4- 上回・高橋: ドジョウの排卵促進 うが, c l o m i p h e n e処理は従来の脳下垂体処理にかわる方法として,硬骨魚の排卵の人為的促進に用い うる可能性が高いと恩われる。 文 献 1 ) P i c k f o r d ,G.E.andAtz,J.W.( 1 9 5 7 ) . TheP h y s i o l 勾 yo ft h eP i t u i t a r yG l ando fF i s h e s . 6 1 3 p . N.Y. Zoo l .S o c .,NewY o r k . ,r r ,W.A.andHobson,B.M.( 1 9 6 4 ) . E n d o c r i n ec o n t r o lo ft h es e x u a lc y c l ei nt h e 2 ) B乱 l e u r o n e c t e sp l a t e s s a( Lふ I V . Go n a o d o t r o p i ca c t i v i t yo ft h ep i t u i 拘置y p l a c i e,P g l a n d . Ge 叫. C omp.E . 叫d o c r i ' 略 。1 .4,60 86 1 3 . 七 on,B .,B i l l 町d ,R . 晶ndJ品I 晶b e r t,B .( 1 9 7 3 ) . S p e c i f i c i 飴 d ' a c 七i o ne tr e l a t i o n s 3 ) Bre i m m u n o l o g i q u e sd e shormonesgon 晶d o t r o p e sde q u e l q u e st e l e o 自飴e n s . An 叫.B i o l . Anim.B i o c h .B i o p h y s .13,3 4 7 3 6 2 . 4 ) P阻 dey, S .andHo 晶r , W.S. ( 1 9 7 2 ) . I n d u c t i o no fo v u l a t i o ni ng o l d 畳ぬ byc l o m i p h e n e c i t r , 品t e . C a n .J . Zω ,1 .50,1 6 7 9 1 6 8 0 . 5 ) Pandey ,S .,Sぬ c e y ,N . and Hoar ,W .S. ( 1 9 7 3 ) . Mode o fa c t i o no fc l o m i p h e n e i もr a t ei ni n d u c i n go v u l a t i o no fg o l d f i s h .Ca 叫 .J .Z o o l .51,1 3 1 5 1 3 1 6 . .,J 晶 ,l a b e r t,B .晶ndFos もi e r,A .( 1 9 7 5 ) . I n d u c t i o nded e c h a r g e 自 g o n a d o t r o p 倒 6 ) B r e t o n,B h y p o p h y s a i r e sc h e zl aC a r p e( C y p r i 乱闘 C 由r p i oL . )al ' 品 ,i d educ i t r a 句 d ec i s c l o m i e n .σ ' o m p .E符d o c r i n o l .25,4 0 0 4 0 4 . p h e n e . G 1 9 5 2 ) . ドジョウ卵巣の成熟温程 I L就いて.第 1報.天然産ドジョウの卵巣の成 7 ) 久保田善二郎 ( 熟過程.農水研報 2,3 5 3 9 . 8 ) 藤田 E ・字野寛・八i!A嶋郎・久保田巻二郎 ( 1 9 4 8 ) . 脳下垂体ホルモン I L依るドジョウの採 3,25ι258. 卵1 < :就いて・日水誌 1 9 ) 小林弘・山林勇 ( 1 9 5 7 ) . ドジョウの放卵促進1 < :及ぼす同種ドジョウの脳下垂体の影響.魚 ,170-176. 雑 6 1 0 ) Roy ,S .,G r e e n b l a t t,R . B .andMahesh,V.B. ( 1 9 6 4 ) . E f f e c t so fc l o m i p h e n e on もhe p h y s i o l o g yo fr e p r o d u c t i o ni nt h er a t .I I . I t 渇 O聞もr o g e n i c 晶nda n t i o e s t r o g e 凶o a c t i o n s . A c t aE . 叫d o c r i n o l .47,6 5 7 6 6 8 . 1 1 ) Pandey ,S . andS t a c e y,N. ( 1 9 7 5 ) . A n t i e 自t r o g e n i c脚色i o no fc l o m i p h e n ec i t r a t ei n g o l d f i s h .C a n .J .Z∞1 .53,1 0 2-1 0 3 . 。 -5-