Quantum Prep Plasmid Prep Kit - Bio-Rad

クイックガイド
Quick Guide
Quantum Prep Plasmid
所要
時間
約
Maxi
Prep Kit
あらかじめWash Buffer には95−100％EtOHを
1：1になるように（270ml）加えておきます。
90 分
■キット構成内容：
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Maxiprep Resuspension Solution ……………………………………………………165ml
Cell Lysis Solution …………………………………………………………………………250ml
Neutralization Solution……………………………………………………………………165ml
Quantum Prep Matrix ……………………………………………………………………110ml
Maxiprep Wash Buffer ……………………………………………………………………270ml
Maxiprep Spin Baskets ……………………………………………………………………10 本
5M NaCl …………………………………………………………………………………………5ml
■キット以外に必要な試薬： 95−100％エタノール／TE もしくは滅菌済超純水
操
集 菌
上清廃棄
作
手
順
100∼500mlを5000×gで5min遠心 TBや2×YT 8OD／ml→ 250ml
LB
4OD／ml→ 500ml
細胞ペレット
再懸濁
Cell Resuspension Solution 15ml 完全に再懸濁する。
アルカリ溶菌
Cell Lysis Solution 23ml
穏やかにチューブを転倒懸濁。
中 和
Neutralization Solution 15ml
穏やかに振り混ぜて懸濁。
5min以上放置せず次のステップへ。
遠心 8∼10000×g 20min
10分以上放置せず次のステップへ。
沈殿廃棄
吸 着
上清廃棄
洗 浄
上清廃棄
上清を回収
Quanturm Matrix 10ml
15-30sec穏やかに懸濁
遠心 3000×g 5min
Wash Buffer 25ml を加え懸濁
遠心 3000×g 3∼5min
沈殿物を取らないように十分気をつける。
マトリクスを完全に懸濁する。
懸濁は穏やかに行う。
スイングロータを使用してください。
50ml遠沈管に25mlスピンバスケット
を収める。必要であればアダプターリ
ングを使用する。
Wash Buffer 15ml を加え懸濁
スピンバスケット／遠沈管
へ懸濁液を入れる
スピンバスケットのフィルターを
傷つけないないように注意。
ふたはしない。
遠心 3000×g 5min
流出液廃棄
洗 浄
流出液廃棄
Wash Buffer 10ml
遠心 3000×g 5min
スピンバスケットを新しい遠沈管
へ移す
溶 出
滅菌水またはTE 5ml
70℃に温めて溶出することにより
遠心 3000×g 5min
よい収率が得られる。
必要であればEtOH沈殿を行う。
精製プラスミドDNA
※詳細は英文取扱説明書を参照してください。
Quantum Prep
プラスミドプレップキット
トラブルシューティング
問 題
考えられる原因 確認してください
Trouble Shooting
解決方法
ローコピー
プラスミド
ローコピープラス
ミドを使用していま
せんか？
濃厚培地を使用し、細胞量を増やしてくださ
い。もしくはハイコピープラスミドを使用
してみてください。
細胞数が
不十分
大腸菌のオーバー
ナイト培養していま
すか？
濃厚な培地を使用してください；培養時間、
容量を調節してください。OD 600 を測定し
OD ／ml を確認してください。
培養液が
古い
大腸菌はどのようなも
のを使用していますか?
単離した大腸菌を 37 ℃でオーバーナイト培
養し、培養後すぐに使用してください。
回収されて
いない
マトリクスに吸着さ
れているか確認する
溶出バッファー（dw か TE）を 70 ℃に温めて
溶出してください。溶出バッファー量を増や
す、あるいは 2回にして溶出してください。
ゲノムの
コンタミネーション
低から高分子量のス
メアがありますか？
溶菌後なるべく穏やかに懸濁してください。
培養液を減らしてください。
Endonuclease A
のコンタミネーション
低分子量のスメアが
ありますか？
洗浄ステップの回数を増やしてください。
ホスト株を変えてみてください。
細胞のオーバー
ロード；Cell
Resuspension
Solution の劣化
260／280＞2.0で
すか? 泳動した際、ゲ
ルに低分子量のバン
ドが見られますか?
オーバーロードを避けてください；新しい
CellResuspensionSolution を用いてくだ
さい。
（CellResuspensionSolution には
RNaseが含まれています）
タンパク質のコン 細胞構成タンパク
タミネーション
が混入している
260 ／280 ＜1.5
ですか？
クリアライセートを回収する際、白色の沈殿
が混入しないように気をつけてください。
スピンカラム
からマトリク
スが漏れる
キット指定の速度で遠心してください。rpm
遠 心 機 の 回 転 速 度 （revolutions per minute）への変換方法
（rpm）2 r
は速すぎませんか？ RCF（g）=（1.12×10-5 ）
r：ローターの中央からチューブの中央までの半径（cm）
回収率が
低い
スメアリング
RNA コンタ
ミネーション
スピンバスケット
の破損
遠心をした際マ
スピンバスケットへ
トリクスが遠心
のオーバーロード
機内に飛び散る
マトリクス＋クリア
ライセートの量が
多すぎませんか？
マトリクス＋クリアライセート懸濁液がスピ
ンカラムに入りきらない場合は遠心を 2 回に
分けて行なってください。
塩基配列が
決定出来ない
泳動によるバンドの
確認をしていますか?
260 ／280 比率測
定していますか？
培養のOD600 を確認してください。細胞の
オーバーロードを避けてください。
260／280比率を測定し、
260／280＜1.5 の場合はタンパク質、
260／280＞2.0 の場合はRNAが混入し
ている可能性があります。
精製度が不十分
日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社
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