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Inertsil シリーズ逆相系カラムのご紹介
LC Technical Note 50 Inertsil シリーズ逆相系カラムのご紹介 GL Sciences Inc. “Inertsil（イナートシル）”はジーエルサイエンス㈱が提供す るHPLCカラムとして多くのお客様にお使い頂いております。 拡大 逆相系のカラムは数多くのメーカーから、星の数ほどのカラ ムがリリースされておりますが、数が多すぎてどれを選べば 良いのかがわからないとの声も多数寄せられておりました。 今回は、その声にお答えし、逆相カラムの使い分けをカラム の選択性と疎水性相互作用の面からご説明します。 拡大 Inertsilの充填剤モデルを右図に、各カラムの特徴を下表 に示します。高純度球状シリカゲルの表面には、弱酸性官能 基であるシラノール（水酸基）が存在しております。そのシラ ノールを利用して機能性官能基を化学修飾しております。 下表に照らし合わせながら、以降のデータをご覧頂きたいと 思います。 （K.Suzuki） カラムの種類 官能基 細孔 OH 充填剤母体 高純度球状シリカゲル 化学修飾 OH OH シリカゲル表面 官能基を修飾した シリカゲル表面 特 徴 Inertsil ODS-3 ODS-2の後継カラムです。疎水性相互作用による保持が強く、クセの無 いODSカラムとして広く使用され評価の高いカラムです。 Inertsil ODS-SP 極性物質の保持はODS-3に類似し、疎水性相互作用による保持能を弱 めたカラムです。 Inertsil ODS-P ODS基をポリメリック様式に結合させた充填材で平面認識能に優れて います。 Inertsil ODS-EP ODS基の根元に極性官能基を導入したカラムです。極性化合物を保持 しやすい特徴があります。 Inertsil ODS-80A 細孔径が80Åと比較的小さいため、高理論段数が得られるという特徴 があります。 Inertsil ODS-2 Inertsil ODSの後継カラムとして発売したカラムです。現在でも多くの ユーザーに使用されているカラムです。 Inertsil ODS 初代ODSカラムです。細孔径100Åの多孔質球状シリカゲルにODS基 を化学修飾した汎用カラムとして登場しました。 Inertsil C8-3 ODS-3と同じ結合様式でオクチル基を導入したカラムで、ODS-3の分離 パターンを維持したまま、保持時間を約半分にすることができます。 Inertsil C4 Inertsilのアルキル基結合型カラムとしては最弱の疎水性相互作用をも つ、ブチル基を導入したカラムです。 Inertsil Ph-3 フェニル基を直接母体のシリカゲルに導入したカラムです。π結合によ る相互作用の特性を持っています。Phの後継カラムです。 Inertsil Ph プロピル基の末端にフェニル基を結合したカラムです。π結合だけでな く、アルキル鎖の疎水性相互作用が働きます。 Inertsil Diol O CH CH2 OH OH Inertsil CN-3 C N ジオール基を導入したカラムです。逆相カラムとしては、保持が弱いも のの水素結合による特徴的な挙動を示すカラムとして知られています。 Phカラムと同様にπ結合による相互作用を持ち、さらに特徴的な挙動を 示すカラムとして知られています。 GL Sciences LC Technical Note 比較条件 HPLC条件 ・ カラム ： Inertsil（イナートシル） 逆相カラム 逆相カラムの選択性と疎水性相互作用を比較 する条件を左に示しました。移動相はメタノール水系を使用し、カラムサイズはすべて同じもの、 同じ粒径のものを使用しました。 (5μm, 250 × 4.6 mm I.D.) ・ 溶離液 ： A) CH3OH B) H2O A/B= 70 / 30, v/v , 1.0 mL/min ・ 温度 ： 40 ℃ ・ 検出器 ： UV 254 nm ・ 注入量 ： 5 μL パターン比較のカラムと分類 ② Inertsil シリーズODS ① アルキル鎖比較 分離パターンを比較するカラムの分類として、 ・Inertsil ODS-3 ・Inertsil ODS-3 ・Inertsil C8-3 ・Inertsil ODS-SP ①アルキル鎖比較 ・Inertsil C4 ・Inertsil ODS-P ②Inertsil シリーズODS （母体シリカゲルが同じ） ・Inertsil ODS-EP ③Inertsil シリーズODS （母体シリカゲルが異なる） ④その他逆相カラム ③ Inertsil シリーズODS ④ その他逆相系Inertsil の4つに分け、それぞれを比較しました。 ・Inertsil ODS-3 ・Inertsil C4 ・Inertsil ODS-80A ・Inertsil Ph-3 ・Inertsil ODS-2 ・Inertsil Ph ・Inertsil ODS ・Inertsil Diol ・Inertsil CN-3 評価に使用した成分と構造式 O O N N HN O NH 1. Uracil 評価に使用した成分の構造式を左に示します。 塩基性物質や酸性物質、アルキルベンゼンや 多環芳香族化合物の分離の差から様々な分離 に及ぼす要因が明らかとなります。 O OH N N 2. Caffeine 3. Phenol 充填剤に使われるシリカゲル表面の弱酸性官 能基であるシラノールが多いほど、フェノール（3） に対してカフェイン（2）が遅れて溶出します※ 。 疎水性が強いカラムほどブチルベンゼン（4）に 対してアミルベンゼン（6）が遅れて溶出します。 平面認識能が高いカラムほどo-ターフェニル（5） に対してトリフェニレン（7）が遅れて溶出します。 4. Butylbenzene 5. o-Terphenyl 6. Amylbenzene 7. Triphenylene ※参考文献 K.Kimata,K.Iwaguchi,S.Onishi,K.Jinno,R.Eksteen,K.Hosoya, M.Araki,N.Tanaka,J.Chromatogr.Sci.1989,27,721-728 GL Sciences LC Technical Note ①アルキル鎖の違いによるパターン比較 Inertsilシリーズの直鎖アルキル基結合型のカラムス ペックと比較結果を示します。左側のクロマトが0-8min まで、右側に全体のクロマトを示しました。 カラム名 化学結合基 エンドキャップ 炭素量 ODS-3 オクタデシル基 あり 15% 母体シリカゲル（球状） 細孔径 表面積 純度 100Å 99.999% 450m2/g C8-3 オクチル基 あり 9% 100Å 450m2/g 99.999% C4 ブチル基 あり 7.5% 150Å 320m2/g 99.999% 充填剤の官能基である直鎖のアルキル基が短くな るほど疎水性相互作用が弱くなるため、ODS-3に比べ C8-3、C4とだんだんと保持が弱くなります。 1. Uracil 2. Caffeine 3. Phenol 4. Butylbenzene 5. o-Terphenyl 6. Amylbenzene 7. Triphenylene Inertsil ODS-3 溶離液を CH3OH/H2O = 70/30 から 80/20, v/vにすると・・・ 溶離液条件を変更することにより、全成分を完全分離できます が、評価をするための最適な条件で行いました。 2 7 13 2 5 6 4 0 1 10 20 3 5, 6 4 0 30 2 4 6 Time (min) 8 0 20 40 Time (min) 60 7 80 Inertsil C8-3 2 3 4 0 2 試料の疎水性が高く分析時 疎水性が高い成分に対し 間を縮めたい場合に有効！ て有効！ 7 1 4 6 Time (min) 8 0 Inertsil C4 20 6 5 40 Time (min) 60 80 60 80 7 2 4 56 1 3 0 2 4 6 Time (min) 8 0 20 40 Time (min) GL Sciences LC Technical Note ②Inertsil シリーズODSのパターン比較 Inertsil シリーズのODSカラムのスペックと比較結果 を示します。左側に0-8minまで、右側に全体のクロマト を示しました。すべて同じ母体のシリカゲルを使用して おり、Inertsil 3シリーズに属します。 これらの結果から、各ODSの特徴が見えてきます。 ODS-3は保持のバランスが良い、ODS-SPは極性成分 の保持はそのままで分析時間が短い、ODS-Pは平面 認識能に優れる、ODS-EPは特異的な分離挙動を示 すことがわかります。 ：バランスを兼ね備えた強い保持能を持つファース トチョイスODS。 ODS-SP ：シャープなピーク形状が得られる低炭素量ODS。 保持能や平面認識能がやや低めに設定。 ODS-P ：ポリメリック構造の高炭素量ODSのため、平面認 識能が非常に高い。 ODS-EP ：極性官能基導入ODSのためシラノールの影響は 少なく、極性官能基ならでは特異的な分離を示す。 ODS-3 オクタデシル基 あり 15% 母体シリカゲル（球状） 細孔径 表面積 純度 99.999% 100Å 450m2/g ODS-SP オクタデシル基 あり 8.5% 100Å 450m2/g 99.999% ODS-P オクタデシル基 なし 29% 100Å 450m2/g 99.999% ODS-EP オクタデシル基 なし 9% 100Å これらのODSカラムを目的の分析に応じて使い分け ることが完全分離への近道となります。 Inertsil ODS-3 ODS-3 カラム名 化学結合基 エンドキャップ 炭素量 450m /g 1 Inertsil を使うなら まずこのカラムから ファーストチョイス! 3 2 4 6 Time (min) 8 0 20 40 7 5, 6 4 60 Time (min) 80 100 Inertsil ODS-SP 2 疎水性成分の保持時間を短 くしたいときやODS-3で分離 が難しい場合に有効！ 7 1 3 4 0 2 4 6 Time (min) 8 0 5,6 20 40 60 Time (min) 80 100 Inertsil ODS-P 多環芳香族化合物や カロテノイドなど平面認識を 利用するときにチョイス！ 2, 3 1 4 0 2 4 6 Time (min) 8 0 20 7 5 6 40 60 Time (min) 80 100 Inertsil ODS-EP どのODSカラムでも分離 できず、どうしてもODSで分 離したい場合にチョイス！ 2 1 3 0 2 99.999% 1. Uracil 2. Caffeine 3. Phenol 4. Butylbenzene 5. o-Terphenyl 6. Amylbenzene 7. Triphenylene 2 0 2 4 6 Time (min) 4 8 0 20 6 40 7 5 60 Time (min) 80 100 GL Sciences LC Technical Note ③ Inertsil シリーズODSのパターン比較 母体の異なるInertsil シリーズODSカラムについて比 較を行いました。左側のクロマトが0-8minまで、右側に 全体のクロマトを示しました。 ODS、ODS-2、ODS-3になるにつれて保持が強くなっ ており、さらにシリカゲルの純度が向上していることが わかります。 炭素量 母体シリカゲル（球状） 細孔径 表面積 純度 100Å 99.999% 450m2/g カラム名 化学結合基 エンドキャップ ODS-3 オクタデシル基 あり 15% ODS-80A オクタデシル基 あり 17.5% 80Å 450m2/g 99.99% ODS-2 オクタデシル基 あり 18.5% 150Å 320m2/g 99.999% ODS オクタデシル基 あり 14% 100Å 350m2/g 99.9% 1. Uracil 2. Caffeine 3. Phenol 4. Butylbenzene 5. o-Terphenyl 6. Amylbenzene 7. Triphenylene Inertsil ODS-3 2 保持能が強い ファーストチョイスのODS 1 3 5, 6 4 0 2 4 6 Time (min) 8 0 20 40 Time (min) 60 7 80 Inertsil ODS-80A 2 細孔径をより小さくすること により高理論段数を実現！ 1 3 7 4 0 2 4 6 Time (min) 5 6 8 0 20 40 Time (min) 60 80 Inertsil ODS-2 シリカゲル純度の向上に より金属イオンの影響を受 けやすい化合物に有効！ 2 3 1 7 4 0 2 4 6 Time (min) 8 0 20 5 6 40 Time (min) 60 Inertsil ODS Inertsil初代ODSです。 まだまだ現役です。 2 1 7 3 4 0 2 80 4 6 Time (min) 8 0 20 5 6 40 Time (min) 60 80 GL Sciences LC Technical Note ④ その他Inertsil逆相カラムのパターン比較 その他の逆相系Inertsilシリーズのカラムスペックと 比較結果を示します。左側のクロマトが0-8minまで、 右側に全体のクロマトを示しました。参考としてInertsil C4のデータを添付しました。 DIOLカラムでは、親水性物質の保持が特徴的であり、 弱い保持能となっています。CN-3は保持が弱いものの 立体認識能が高い結果が得られていますが、こちらも π結合による相互作用だと考えられます。 すべてのカラムにおいてC4とほぼ同じ保持能かそれ 以下の保持を示しました。Ph-3は多環芳香族化合物 に対して、π電子による相互作用が働いていることが わかります。Phはプロピル基に結合している分、Ph-3 より疎水性相互作用が働いていることがわかります。 C4 ブチル基 あり 7.5% 母体シリカゲル（球状） 細孔径 表面積 純度 99.999% 150Å 320m2/g Ph-3 フェニル基 なし 10% 100Å 450m2/g 99.999% Ph フェニル基 あり 10% 150Å 320m2/g 99.999% DIOL ジオール基 なし 20% 100Å 450m2/g 99.999% CN-3 シアノプロピル基 なし 14% 100Å 450m2/g 99.999% カラム名 化学結合基 エンドキャップ 炭素量 1. Uracil 2. Caffeine 3. Phenol 4. Butylbenzene 5. o-Terphenyl 6. Amylbenzene 7. Triphenylene 7 Inertsil C4 2 0 4 3 1 2 4 Time (min) 0 20 π結合による相互作用が強力！ ベンゼン環や2重結合を持つ 成分の分離に最適！ 7 4 1 3 6 5 2 2 Time (min) 4 Inertsil Ph 0 10 Time (min) 20 π結合による相互作用と 疎水性相互作用も併せ 持つカラムです。 2 4 1 0 6 10 Time (min) Inertsil Ph-3 0 5 6 7 5 3 2 Time (min) 4 0 10 Time (min) 20 Inertsil DIOL 3, 4, 6 水素結合による相互作用 によって親水性物質の 保持に影響します。 7 5 5 2 1 0 2 Time (min) 0 4 10 Time (min) 7 Inertsil CN-3 46 46 π結合による相互作用も 備えつつ、特異的な保持 挙動を示します。 5 2 1 0 20 3 2 Time (min) 4 0 10 Time (min) 20 GL Sciences LC Technical Note まとめ 下図に疎水性相互作用と平面認識能に対する保持 力の関係を示しました。このように Inertsil シリーズは、 様々な分析に適用できるように幅広いラインナップを 取り揃えております。 例えばFig.1より、ファーストチョイスの「ODS-3」で条件 を変更しても分離が困難な場合において、疎水性相互 作用にて分離するには「ODS-SP」を選択、平面認識能 を利用には「ODS-P」という選択ができます。 疎水性相互作用は、ブチルベンゼンとアミルベンゼ ンの分離度、平面認識能は、o-ターフェニルとトリフェ ニレンの分離度、保持力は、アミルベンゼンの保持時 間を参考としました。 参考としてFig.2に各カラムメーカーのODSカラムの分 布を示しました。 疎水性相互作用 による分離度 ※ ただし、条件により分布は変わることがありますので、 目安としてご利用ください。 平面認識能 による分離度 ODS-SP ODS-80A ODS-P ODS-2 ODS-P ODS ODS-EP ODS-3 ODS-EP C8-3 C4 DIOL Ph CN-3 C4 ODS-80A ODS-2 Ph-3 ODS Ph-3 ODS-3 Ph ODS-SP C8-3 CN-3 DIOL 保持力 保持力 Fig.1 Inertsilシリーズの分布モデル 疎水性相互作用 による分離度 平面認識能 による分離度 ZORBAX Eclipse XDB-C18 ODS-SP AQUASIL C18 ODS-P ODS-EP L-Column LUNA C18(2) SunFire C18 CAPCELL PAK C18 MGⅡ Symmetry C18 ODS-80A AQUASIL C18 Ace5 C18 Hypersil BDS-C18 Atlantis dC18 Synergi Hydro-RP ODS-2 Synergi Fusion-RP Gemini C18 ODS-P Hypersil BDS-C18 ODS Ace5 C18 ZORBAX Eclipse XDB-C18 ODS-2 ODS-80A CAPCELL PAK C18 MGⅡ Synergi Hydro-RP Gemini C18 ODS XTerra MS C18 ODS-EP ODS-SP Synergi Max-RP L-Column Symmetry C18 LUNA C18(2) XTerra MS C18 ZORBAX Bonus-RP ODS-3 ZORBAX Bonus-RP Synergi Fusion-RP 保持力 Fig.2 各社ODSカラムの分布モデル SunFire C18 Atlantis dC18 ODS-3 Synergi Max-RP 保持力 GL Sciences LC Technical Note 最後に・・・ ここまで、疎水性相互作用と平面認識能の観点か ら話を進めてきましたが、他にもシリカゲルの純度や その金属量、エンドキャップの有無によるシラノールの 影響など様々な要因もまたピーク形状や保持時間に 影響します。最後に、ピリジンとフェノールの分析、ギ 酸と酢酸の分析を例にご紹介します。使用したカラム は、ファーストチョイスの「ODS-3」と「ODS-SP」と他社 カラムです。 ピリジン/フェノールの分析 分離分析に問題が発生した場合には、弊社カスタ マーサポートセンター、またはお近くの営業所まで、お 気軽にご連絡下さい。また、弊社ホームページにも HPLCに関する情報が掲載されておりますので、ぜひご 活用ください。 http://www.gls.co.jp/hplc.html 1.Pyridine 2.Phenol HPLC条件 ・ カラム ： 250 x 4.6 mm I.D. ・ 溶離液 ： CH3OH / H2O = 30 / 70, v/v , 1.0mL/min ・ 温度 ： 40℃ ・ 検出器 ： UV 254 nm シリカゲル表面のシラノールにより塩基性化合物（ピリジン）吸着が起こる充填剤があります。 ピークが逆転するほど 不安定 1 1 2 2 2 1 2 2 2 2 1 1 1 1 0 10 Time (min) 20 0 10 Time (min) ODS-3 200 10 Time (min) 20 0 他社カラムA ODS-SP ギ酸/酢酸の分析 10 Time (min) 20 0 10 Time (min) 20 0 他社カラムC 他社カラムB 10 Time (min) 他社カラムD 1.Formic acid 2.Acetic acid 1 1 1 2 2 2 1 2 2 1 2 2 20 他社カラムE 1 2 0 10 Time (min) HPLC条件 ・ カラム ： 250 x 4.6 mm I.D. ・ 溶離液 ： 0.1% H3PO4, 1.0mL/min ・ 温度 ： 40℃ ・ 検出器 ： UV 210 nm カルボン酸のような酸性化合物が吸着しテーリングする充填剤があります。 1 20 0 4 6 8 Time (min) 10 0 ODS-3 2 4 6 8 Time (min) ODS-SP 10 0 2 4 6 8 Time (min) 他社カラムA 10 0 2 4 6 8 Time (min) 他社カラムB 10 0 2 4 6 8 Time (min) 他社カラムC 0 2 4 6 8 Time (min) 他社カラムD 0 2 4 6 8 Time (min) 10 他社カラムE ホームページはこちらから・・・ http://www.gls.co.jp/hplc.html 〒163-1130 東京都新宿区西新宿6丁目22番1号 新宿スクエアタワー30F TEL.03(5323)6611 FAX.03(5323)6622 TEL.03(5323)6611 TEL.06(6357)5060 TEL.024(533)2244 TEL.029(858)3700 TEL.043(248)2441 TEL.048(667)1611 TEL.045(475)1144 TEL.052(931)1761 TEL.082(233)1101 TEL.092(291)5200 FAX.03(5323)6622 FAX.06(6357)4580 FAX.024(536)1518 FAX.029(858)3780 FAX.043(248)2485 FAX.048(667)1656 FAX.045(475)1145 FAX.052(931)1814 FAX.082(233)1110 FAX.092(291)2552 ｶｽﾀﾏｰｻﾎﾟｰﾄｾﾝﾀｰ T E L . 0 4 ( 2 9 3 4 ) 1 1 0 0 FAX.04(2934)3361 東 大 東 筑 千 北 横 名 広 九 京 営 業 阪 支 北 営 業 波 営 業 葉 営 業 関 東 営 業 浜 営 業 古 屋 営 業 島 営 業 州 営 業 部 店 所 所 所 所 所 所 所 所 ジーエルサイエンス LC テクニカルノート