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エス・クロン(S-Clone) クローニングメデューム CM-B
** 2016 年 7 月改訂 * 2012 年 4 月改訂 生体外用研究試薬 ○ 使用例 1. HATセレクション ミエローマ細胞1に対し、脾細胞5の割合で融合した場合の HATセレクション、クローニング用無血清培地 エス・クロン(S-Clone) クローニングメデューム CM-B 一例を示す。 1) 本培地にHAまたはHATを加える。 HATセレクション用培地として用いるときは、ヒポキサンチン、 アミノプテリンを下記の濃度で加える。 ヒポキサンチン100μmol/L（13.6mg/L） 〔開発の経緯及び特徴〕 アミノプテリン0.4μmol/L（0.176mg/L） エス・クロン（S‐Clone）クローニングメデュームCM‐Bは、マウス 本培地には、チミジンがあらかじめ加えられているので、更 に加える必要はないが、市販のHAT濃縮液を規定量加えて ハイブリドーマのHATセレクション、クローニング用として開発された も性能に差はない。 画期的な高性能の専用培地である。 2) 1. FBS（ウシ胎児血清）を全く使用しないHATセレクションとクロ ーニングを可 能 にした。しかも、抗 体 産 生 ハイブリドーマの になるよう本培地に懸濁させる。 3) 4) まき込み後、1週間位は1～3日毎に培地交換を行う。 その後は可視コロニーが現れるまで、3～7日毎に培地の 2. これまで黙視されていた抗体非産生ハイブリドーマの増殖を 追加または交換を行なう。 優先的に支持するという、FBSの負の影響がないために、増殖 の弱い抗体産生ハイブリドーマの淘汰、消滅を激減させること 2）で調整した細胞浮遊液を培養プレートにまき込む。 96ウェルマイクロプレートの場合：0.05～0.1mL/ウェル 出 現 率 、増 殖 性 能 とも従 来 法 （RPMI1640＋FBS）を上 回 る。 （主要文献） 融合後の細胞を、脾細胞換算1×10 6 Cells/mLの細胞密度 （培地交換は半分を吸引除去し、その分を追加してもよい。） 5) 可視コロニーを確認後、抗体スクリーニングを行う。 となり、目的のハイブリドーマに遭遇する確率が飛躍的に高く なった。 3. 増殖性の弱いハイブリドーマに対しても強力にコロニー形成を 促す。 4. 従来法よりも低密度でHATセレクションが可能である。 （1×10 5 ～2×10 4 Cells／ウェル：96ウェルマイクロプレート 使用時） 5. フィーダーセル（支持細胞）を用いずにクローニングが可能で ある。 6. 目的のハイブリドーマがこれまでより短期間に入手できるので、 時間や経費を大幅に節約することができる。 * 〔本質〕 1. 基礎培地 2. クローニング 1） 抗体陽性ウェルのハイブリドーマを本培地で100Cells/mL、 10Cells/mL、5Cells/mLの3段階の密度に調整する。 2） 96ウェルマイクロプレートを横方向に使用し、1）で調整した 各密度の細胞浮遊液をウェルに0.1mLずつ加えていく。 （図参照） イ 上から1段、2段の計24ウェルを、10Cells/0.1mL/ウェル の条件 ロ 上から3 段、4 段、5 段の計36ウェルを、1Cells/0.1mL/ ウェルの条件 ハ 上から6 段、7 段、8 段の計36ウェルを0.5Cells/ 0.1mL/ウェルの条件でまき込む。 3） 可視コロニーが確認された後、直ちにスクリーニングを行う。 （注：クローニングでは、培地の追加、交換は行わないこと。 わずかに改変したRPMI1640、ダルベッコMEM、ハムF-12の また、コロニーの細胞数が少ない場合も、スクリーニングを行 混合成分からなる液体培地。 うこと。） 2. 添加剤 ホルモン成長因子（大腸菌または酵母組換体インスリン、トランス フェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、2‐メルカプトエ タノール、ハイブリドーマ増殖因子）を含むヘペス緩衝液。 3. ウシアルブミン10％溶液 4） 必要により、同様の方法で2次スクリーニングを行う。 5） 必要に応じて、上記クローニングの操作を繰り返す。 （図）ハイブリドーマのクローニングの一例 まき込み条件 ウシ血清アルブミンを 10％含む溶液。 10 cells／0.1mL／ウエル 〔使用方法〕 ○ 培地の調製法 基礎培地1ビン（500mL）に添加剤1ビン（10mL）とウシアルブ ミン10％溶液1ビン（5mL）を無菌的に加える。 1 cells／0.1mL／ウエル 0.5 cells／0.1mL／ウエル **〔使用上又は取扱い上の注意〕 1. 本製品を使用すると融合後のコロニー形成（増殖）が速いの で2×10 6 Cells/mL以上の細胞密度ではまき込まない。 エーディア株式会社 カスタマーサポートセンター 〒101‐0032 東京都千代田区岩本町 1‐10‐6 フリーダイヤル: 0120-921-207 （高密度でまいた場合、培地成分の消費が著しいため、コロ ニー形成が抑制されることがある。） 2. 添加剤は、2‐メルカプトエタノール0.0005％を含む。 3. 添加剤は、濃縮液のため冷蔵保存中に沈殿を生じることが あるので、よく攪拌して基礎培地に添加する。 4. 添加剤を加えた後の培地の濾過は避ける。細胞の種類に よっては増殖が低下する。 5. 本製品には、抗菌剤及び抗カビ剤は含まれていない。必要 ならば、適宜抗菌剤、抗カビ剤を添加して使用する。 抗菌・抗カビ剤の使用例 抗菌剤：ゲンタマイシン（50μg/mL） 抗カビ剤：アンホテリシンB（0.25μg/mL） 6. 調製後の培地は、2～10℃保存で3カ月の安定性を認めて いるが、できるだけ早く使用すること。 7. 廃棄する場合には、許可を受けた専門の産業廃棄物処理 業者に処理を委託すること。 （注）ご使用に際しては、「エス・クロン クローニングメデューム CM‐B」の安全データシート（SDS）もご参照ください。下記の ホームページよりダウンロードできます。 ［URL：http://www.eidia.co.jp］ 〔貯法及び有効期間〕 ・2～10℃保存、冷凍を避ける。 ・有効期間は、製造後1年6カ月（使用期限を外箱に表示） 〔包装内容〕 SS8000 エス・クロン クローニングメデュームCM‐B ・基礎培地 ・添加剤 ・ウシアルブミン10％溶液 500mL×1 10mL×1 製造販売元 5mL×1 〔主要文献〕 エスクロン資料集 〔参考文献〕 ① Köhler, G. and Milstein, C., : Nature, 256, 495（1975） ② 単クローン抗体－ハイブリドーマとELISA－ 講談社 ③ 細胞成長因子－Growth Factors－ 朝倉書店 ④ 細胞成長因子partⅡ 朝倉書店 ⑤ 動物細胞利用実用化マニュアル リアライズ社 〔商品情報お問い合わせ先〕 製造元 コージンバイオ株式会社 埼玉県坂戸市千代田 5-1-3