Exosome–Streptavidin for Isolation/Detection

II.フローサイトメトリー解 析用
エキソームサブ
タイプの分画
Exosome –Streptavidin for
Isolation/Detection
（製品番号 10608D）
製品の概要
・Exosome–Streptavidin for Isolation/Detectionは、エキソソーム濃縮サンプルから、
さらに目的のタンパク質を膜表面に持つエキソソームサブタイプのみを分画・回収する試薬です。
・このプロトコールは、フローサイトメトリー解析用に最適化されていますが、ウェスタンブ
ロット解析、qRT-PCR解析、シーケンスなどのアプリケーションに利用することも可能です。
・Dynabeads® magnetic beads は、均一な超常磁性のポリスチレンビーズ（直径4.5μm）で、
表面にStreptavidinがコーティングされています。
前処理として標的とするエキソソーム膜タンパク質に対して特異的な抗体（ビオチン標識）
を用意し、Dynabeads® magnetic beadにコーティングする必要があります。
エキソソームサブタイプの回収方法は、抗体を結合したDynabeads® magnetic beadsを
エキソソーム濃縮サンプルに添加し、一晩インキュベートすることで、標的タンパク質を持つエキ
ソソームをビーズに結合させます。その後マグネットでビースを回収することで、標的タンパク
質を有する エキソソームサブタイプのみが分離・回収されます。
操作に必要な機 器・試 薬
-以下のご用意があるかを確認した上で実験をスタートしてください・Total Exosome Isolation（from cell culture）試薬（製品番号：4478359）を用いて
回収したエキソソーム濃縮サンプル
注意：現在、利用できるのは培養上清由来のエキソソーム濃縮サンプルのみです。
体液由来のエキソソーム濃縮サンプルはご利用いただけませんのでご注意ください
・ビオチン標識された抗体
注意：ビオチン標識された抗体がない場合、 FluoReporter ® Mini-biotin-XX
Protein Labeling Kit（製品番号：F-6347）等を用いて標識を行うことが可能です
・Assay Buffer（ PBS+0.1% BSA, 0.2μmフィルター滅菌済）
・DynaMag™-2（製品番号：12321D）または DynaMag™-5（製品番号：12303D）
Magnetic separators
・スクリューキャップ付き 2mL-チューブ（Sarstedt社、製品番号：72.664 など）
・HulaMixer ® Sample Mixer（製品番号：15920D）
II.フローサイトメトリー解 析用
エキソームサブ
タイプの分画
ビオチン標識抗体のDynabeads® magnetic beads
表面へのコーティング
ここでは 1 x 10 個のDynabeads ® magnetic beads（1mL）に対して、
4μgのビオチン標識抗体をコーティングするプロトコールを
紹介します。必要に応じてスケールアップやスケールダウンできます：
7
Exosome - Streptavidin for
Isolation/Detection
・スケールアップの場合：Dynabeads® magnetic beads の濃度を1 x 107∼108個 / mLに
増やす事が可能です。
・抗体濃度が低い場合（例:0.01mg /mL）
：抗体とビーズの結合のステップで、Assay
Buffer の添加量を減らし、ビーズ濃度が 1 x 107個 / mLになるように調製してください。
1
バイアル中のビーズをミックスし、均一にします。
Roller（ローラー式攪拌機）を用いた場合：10 分間以上
Vortexミキサーを用いた場合：30 秒間
2
1mLのビーズを、magnetic separatorにセット可能なチューブに分取します。
3
magnetic separatorにチューブをセットし、1分間インキュベートしてビーズが
チューブ壁面に集まったことを確認し、上清を除きます。
beads
Magnetic separator
DynaMag™-2（製品番号：12321D）
4
チューブを magnetic separator から外し、1mL- Assay bufferを添加し、
よくミックスします。
5
magnetic separatorにチューブをセットし、1分間インキュベートし、
ビーズがチューブ壁面に集まったことを確認し、上清を除きます。
6
チューブを magnetic separator から外し、1mL- Assay bufferを添加し、
よくミックスします。
注意： 7 で添加するビオチン標識抗体の濃度が低く、添加する液量が多い場合、
ここで添加するAssay buffer 量を減らし、トータルで1mLになるようにします。
7
4μgのビオチン標識した抗体を添加し、よくミックスします。
8
30∼60 分間、室温でミックスしながらインキュベートします。
例：HulaMixer® Sample Mixer（製品番号：15920D）を使用した場合の設定条件
Speed：650rpm
9
magnetic separatorにチューブをセットし、1分間インキュベートし、
ビーズがチューブ壁面に集まったことを確認し、上清を除きます。
10
チューブを magnetic separator から外し、1mL- Assay bufferを添加し、
よくミックスします。
11
magnetic separatorにチューブをセットし、1分間インキュベートし、ビーズがチューブ
壁面に集まったことを確認し、上清を除きます。
∼ 11 のステップをさらに2回繰り返します。
12
10
13
1mL-Assay Bufferを添加し、ビーズ濃度を1 x 107個 / mLにします。
抗体を結合させたDynabeads ® magnetic beadsは Assay Buffer
（+ 0.02% sodium azide）に懸濁した状態で、2∼8 ℃で数カ月保存可能です。
注意：結合させた抗体の安定性に依存します
II.フローサイトメトリー解 析用
エキソームサブ
タイプの分画
エキソソームサブタイプの回収
20μL Dynabeads® magnetic beadsで回収する場合
抗体を結合させたDynabeads® magnetic beadsの確認
以下は、
“ビオチン標識抗体をDynabeads® magnetic beads表面へコーティング”
で調製
7
した抗体結合ビーズ（1 x 10 個 / mL）を20μL 用いた場合のプロトコールです。
注意：より大量のサンプルを処理する場合、スケールアップできますが、その他の試薬も
同様にスケールアップして操作してください。
エキソソーム濃縮サンプルの確認
Total Exosome Isolation試薬（from cell culture）製品番号：4478359 または超遠心
法を用いて回収したエキソソーム濃縮サンプル（pre-enriched exosome sample）を予
*1
め調製して置きます。
*1: 始めよう！エキソソーム研究 vol.2「パート１：エキソソームの濃縮・回収」を参照ください。
スタートサンプルとして用いるエキソソーム濃縮サンプル（pre-enriched exosome
sample）量は、タイトレーションを行って適切なスタート量の検討を行うことを
お勧めします。
本プロトコールではエキソソーム濃縮サンプルのトータルタンパク質量を指標としてタイト
レーションを行う方法を説明します。エキソソーム濃縮サンプル中には、きょう雑タンパク質
が混在していますが、細胞培養上清由来のサンプルには比較的少ないため、トータルタン
パク質量とエキソソーム量の相関性が得られます。
20μL Dynabeads® magnetic beadsを用いたエキソソームサブタイプの回収には、トータル
タンパク質量が 25μg分相当のエキソソーム濃縮サンプルを使用してください。この結果を
ベースとしてスタートサンプル量の最適化を行って頂きます。
1
Total Exosome Isolation試薬（from cell culture）製品番号：4478359 または超遠心法
で回収したペレットを 適当量のPBS bufferに懸濁します。
例：10mLの培養上清から回収したペレットを、200μLのbuffer に懸濁した
エキソソーム濃縮サンプル（50 倍濃縮）
2
タンパク質濃度を測定します。
参考：Qubit® 3.0 Fluorometer（製品番号：Q33216）とQubit® Protein Assay Kit
（製品番号：Q33211）の組合せで正確なタンパク質の定量が行えます。
3
25μg分のエキソソーム濃縮サンプルを新しいチューブに分取し、トータルの液量が
100μLになるように Assay Bufferを添加して調製します。
スタートサンプル量のタイトレーションを行う場合は、このステップで処理する
エキソソーム濃縮サンプル量を振ります。
サンプルの容量が100μLに満たない場合は、Assay Bufferを添加して全量が
100μLになるように調製します。添加量については以下の tableを参照ください。
エキソソーム濃縮サンプル
Assay Buffer
100μL
0 μL
50μL
50 μL
5μL
95μL
II.フローサイトメトリー解 析用
エキソームサブ
タイプの分画
I. 抗体を結合させたDynabeads® magnetic beadsの調製
1
1日目
抗体を結合させたDynabeads® magnetic beads（1 x 107 個 / mL）中の
ビーズが均一になるようにミックスします
Roller（ローラー式攪拌機）を用いた場合：10 分間以上
Vortexミキサーを用いた場合：30 秒間
2
20μLのビーズを、magnetic separatorにセット可能なチューブに分取します。
3
ビーズ洗浄のため200μLのAssay Bufferを添加し、ミックスします。
4
magnetic separatorに
3
のチューブをセットし、1分間インキュベートしてビーズが
チューブ壁面に集まったことを確認し、上清を除きます。
II. エキソソーム濃縮サンプルからエキソソームサブタイプをビーズへ吸着
1
I-
4
のチューブを magnetic separator から外し、Assay bufferで調製した
エキソソーム濃縮サンプル（最終容量が100μLになるように調製済み）を添加し、
よくミックスします。
2
マイクロチューブミキサーにセットしてミックスしながら、2 ∼ 8 ℃で一晩（18∼22時間）
インキュベートします。
例）HulaMixer ® Sample Mixer（製品番号：15920D）を使用した場合の設定条件：
Speed：650rpm
III. ビーズに吸着した エキソソームサブタイプの回収
1
サンプルチューブを3∼5 秒間遠心し、チューブ壁についたサンプルを集めます。
2
300μL- Assay Bufferを添加し、ピペッティングで穏やかにミックスします
2日目
（ボルテックスミキサーは使わないこと）。
3
magnetic separator にチューブをセットして1分間置きます。ビーズが
チューブ壁面に集まったことを確認して、上清を除きます。
4
チューブを magnetic separator から外し、400μL – Assay Bufferを添加して
ピペッティングで穏やかにミックスします（ボルテックスミキサーは使わないこと）。
5
magnetic separator にチューブをセットして1分間置きます。ビーズがチューブ壁面に
集まったことを確認して、上清を除きます。
エキソソームサブタイプがビーズに結合した状態で回収されます。
ビーズに吸 着した状態のまま、フローサイトメトリー解 析用のサン
プル調製へ進みます。
回収したエキソソームの
フローサイトメトリー解析
オプション
・フローサイトメトリー解析ではバックグラウンド（Negative control）として、アイソタイプ・
コントロールを設定します。
アイソタイプコントロールには一次抗体反応が特異的であることを確認するために、ターゲット
一次抗体と、免疫動物、アイソタイプ、標識が同じものを選択します。
・染色反応には、III-
6
で回収したターゲットタンパク質陽性サンプル100μL 分を使用します。
・添加する染色用抗体は最適な SN 値（Signal to Noise ratio）が得られる濃度の至適化を行って
ください。
参考：抗体濃度の検証では、まず抗体販売元が1x 106 細胞を染色する際に推奨している
濃度をベースに行ってください。
ターゲットサンプルの調製
1
100μLのIII-
6
で回収したターゲット
アイソタイプコントロールの調製
1
タンパク質陽性サンプルを新しい
チューブに分取します。
2
ターゲットタンパク質抗体
100μLのIII-
6
で回収したターゲット
タンパク質陽性サンプルを新しい
チューブに分取します。
2
isotype control を加えミックスします。
（anti-human CD63-RPEなど）
を加えミックスします。
3
室温で45 ∼60 分間インキュベートします【オービタル（旋回式）シェーカーに
セットし、1000rpmでミックスした状態で】。
注意：遮光状態で処理してください。
4
300μLのAssay Bufferを添加し、ミックスします
（ボルテックスミキサーは使わないでください）。
5
magnetic separatorにチューブをセットし、1分間インキュベートし、ビーズがチューブ
壁面に集まったことを確認し、上清を除きます。
6
チューブをmagnetic separatorから外し、さらに
7
チューブをmagnetic separatorから外し、300μLのAssay Bufferを添加・
4
、 5 の洗浄操作を繰り返します。
ミックスし、フローサイトメトリー解析を行います。
注意：使用されるフローサイトメトリーに合わせてbuffer 量は加減してください