Pig-a アッセイ - 労働安全衛生総合研究所

｢ 労働安全衛生研究 ｣, Vol.7, No.2, pp.101-104, (2014)
技術解説
Pig-a アッセイ
－末梢血を用いるインビボ遺伝子突然変異評価系－ †
鈴　木　哲　矢 *1　王　瑞　生 *1
Pig-a (Phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class A) アッセイは，近年開発されたインビボで
遺伝毒性を調べるための方法であり，遺伝毒性のモニタリングツールとして動物実験で徐々に利用されるように
なってきている．Pig-a アッセイは，少量の末梢血とフローサイトメーターを用いて遺伝子突然変異の解析が可
能な手法であり，従来の Big Blue や gpt delta などの遺伝子突然変異検出用のレポーター遺伝子を組み込んだト
ランスジェニック動物を用いた遺伝子突然変異解析方法と比較して，解析を短時間で効率的に行うことができる．
また，解析に必要な血液サンプルは，動物の尾静脈より少量採血するだけで十分であり，実験動物を解剖する必
要がないため，経時的に長期間，遺伝子突然変異の推移を調べることができ，また，他の毒性実験に組み合わせ
て遺伝毒性の解析を行うことも可能である．本文では，Pig-a アッセイの原理，実験方法，利点及び欠点を述べ
ると共に，Pig-a アッセイの応用について述べる．
キーワード ：Pig-a アッセイ，遺伝子突然変異，インビボ遺伝毒性試験
1　はじめに
を染色し，細胞表面上のマーカータンパク質の量をフロー
遺伝毒性とは，遺伝情報を担う物質，すなわち DNA
サイトメーターにより解析することで，短時間で効率的
や染色体に変化を引き起こし，生体に悪影響を及ぼす毒
に遺伝子突然変異頻度を測定することができる方法であ
性のことであり，染色体異常誘発性や突然変異誘発性な
る．
どを包含する広い意味に用いられている．遺伝毒性は化
学物質の発がん性と関連する毒性であり，遺伝毒性が認
2　Pig-a アッセイの原理
められる発がん物質は，その発がん性に閾値がない，す
Pig-a アッセイとは，GPI アンカーの生合成に必要な
なわち，どんなに少量であっても発がんの可能性がある
N- アセチルグルコサミン転移酵素複合体の触媒サブユ
ものとして規制が行われるため，重要な毒性指標の一つ
ニットをコードしている Pig-a 遺伝子における変異を指
である．また，遺伝子突然変異はがんやその他の疾病の
標とした遺伝子突然変異の検出方法である．Pig-a 遺伝
病因に関わるので，遺伝毒性試験は，労働衛生管理のツー
子は，マウス及びラット，さらにはヒトにおいても保存
ルとしても重要である．
されている．これらの生物種において Pig-a 遺伝子は，X
動物個体における研究では，末梢血や骨髄を用いた染
染色体上に存在している．雄は，X 染色体を 1 本しか有
色体異常誘発性を調べるための小核試験が経済協力開発
しておらず，雌では，2 本ある X 染色体のうち 1 本は不
機構 (OECD) テストガイドラインに採択されており，遺
活性化されている．このように，Pig-a 遺伝子は，雌雄に
1)
伝毒性を調べる方法として使用されることが多い ．一
関わらず体細胞中では 1 遺伝子しか機能していないため，
方で，これまで遺伝子突然変異を動物個体で検出するに
この遺伝子に変異が生じると GPI アンカーの生合成を行
は Big Blue や gpt delta などの遺伝子突然変異を検出す
うことができなくなる．また，GPI アンカーの生合成に
るためのレポーター遺伝子が組み込まれた特殊なトラン
関わるその他の遺伝子は全て常染色体上にあり，完全に
スジェニック動物を必要としていた
2, 3)
．これらの試験は，
機能が失われるには，2 本ある染色体の両方で変異が起
解析操作が煩雑で結果が得られるまでに時間を要し，費
きる必要があるため，Pig-a 遺伝子の変異以外での GPI
用もかかるため，ファーストスクリーニングには向かな
アンカーの欠失は，非常にまれにしか起きない．このよ
い．近年，細胞膜表面タンパク質の結合に関与する GPI
うに Pig-a 遺伝子を指標とした遺伝子突然変異の解析は
(Glycosyl Phosphatidyl Inositol) アンカーの生合成に関
1
係する Pig-a 遺伝子の変異を指標とした遺伝子突然変異
信頼性が高い．GPI アンカーは，細胞膜表面に様々なタ
の検出系が開発され，野生型のラットやマウスにおいて
も末梢血や骨髄を用いて遺伝子突然変異を解析すること
が可能になった 4-9)．Pig-a アッセイは，化学物質にばく
露した動物から血液を少量採取し，蛍光標識抗体で細胞
† 原稿受付　2014年05月26日
† 原稿受理　2014年07月08日
J-STAGE Advance Published Date: August 31, 2014
*1 (独)労働安全衛生総合研究所　健康障害予防研究グループ
連絡先：〒214-8585　神奈川県川崎市多摩区長尾6-21-1
(独)労働安全衛生総合研究所健康障害予防研究グループ　鈴木哲矢*1
E-mail: [email protected]
図 1　Pig-a 遺伝子の変異による細胞膜表面からの GPI アン
カー結合タンパク質の喪失．CD24 は , 赤血球などに発現して
いる GPI アンカー結合たんぱく質の一つ .
102
ンパク質を繋ぎ止めておく役割を果たしており，Pig-a 遺
ターを用いて解析を行う ( 図 2)．
伝子に変異が生じることにより GPI アンカーの生合成が
はじめに，前方散乱光と側方散乱光のプロット上で単
行われなくなると膜表面より GPI アンカーを介して膜表
一細胞集団にゲートを設定 ( サンプル中の特定の細胞集
面上に繋ぎ止められていたタンパク質が失われることに
団をデータ上で解析対象として選択する操作 ) する．さ
なる．化学物質などにより Pig-a 遺伝子に変異が起きる
らに，抗 TER-119 抗体に標識されている PE の蛍光を指
と，その細胞は，細胞膜表面の GPI アンカー結合タンパ
標に，単一細胞集団の中から TER-119 陽性細胞集団に
ク質を喪失する ( 図 1)．赤血球の場合は，GPI アンカー
ゲートを設定する．次に，抗 CD24 抗体に標識されてい
結合タンパク質である CD24 や CD59 に対する蛍光標識
る FITC の蛍光を指標に，CD24 陰性の赤血球数をカウ
抗体で染色し，フローサイトメーターによってこれらの
ントし，CD24 陰性細胞数を TER-119 陽性細胞数で除す
GPI アンカー結合タンパク質が細胞膜表面に提示されて
ることにより Pig-a 遺伝子突然変異頻度を算出する．な
いる赤血球とされていない赤血球を識別することができ
お，ヒトやラットでは，GPI アンカー結合タンパクとし
る．赤血球全体のうちのこれらの表面マーカータンパク
て CD59 を指標として解析を行うことが多い 4,6,10,12)．ヒ
質が提示されていない赤血球を計数することにより遺伝
トの血液を使用した実験では，アッセイの厳密性を高め
子突然変異頻度を測定することができる．また，着目す
るために 2 種類以上の GPI アンカー結合たんぱく質を指
る細胞の特異的マーカーと GPI アンカーのマーカーに対
標として使用することが推奨されている 11)．
する抗体を用いることで，赤血球以外の血球系細胞でも
総赤血球よりも網状赤血球で解析するほうが化学物質
解析を行うことができる 6,10,11)．
にばく露後，早い段階で，感度よく遺伝子突然変異の変
化を検出できる 13)．また，Pig-a アッセイは，白血球や
3　マウスでの実験方法例
リンパ球でも実施されている 6,10,11)．白血球やリンパ球の
化学物質にばく露したマウスの尾静脈から少量 (10-20
ような核を有する細胞を用いることで，変異スペクトル
μL) の血液を採取し，抗血液凝固剤 (EDTA-2K やヘパリ
の解析を行うことができるが，赤血球と異なり，解析に
ン等 ) と混合する．赤血球マーカーである
3 ࣐࢘ࢫ࡛ࡢᐇ㦂᪉ἲ౛TER-119 に対
3 ࣐࢘ࢫ࡛ࡢᐇ㦂᪉ἲ౛
するフィコエリスリン (PE) 標識抗体及び Pig-a 変異の
十分なサンプルを確保するためには，動物を解剖する必
要がある．
指標となる CD24 に対するフルオレセインイソチオシア
ネート (FITC) 標識抗体を混合し，冷暗所で 30 分間イン
4　既知変異原物質を用いた実際の解析
キュベートする．インキュベート後，リン酸緩衝生理食
強い変異原性を有するアルキル化剤であるエチルニト
塩水 (PBS) を加えて遠心し，抗体を除去し，細胞を PBS
ロソ尿素 (ENU) を用いて Pig-a アッセイの有用性を検
に再懸濁する．この細胞懸濁液についてフローサイトメー
証した．8 週齢の
B6C3F1 雄マウスを用い，ENU を 70
4 ᪤▱ኚ␗ཎ≀㉁ࢆ⏝࠸ࡓᐇ㝿ࡢゎᯒ
4 ᪤▱ኚ␗ཎ≀㉁ࢆ⏝࠸ࡓᐇ㝿ࡢゎᯒ
mg/kg で腹腔内投与した．投与後 2，3，4 週目に尾静脈
より採血を行い，Pig-a アッセイを行った．フローサイト
メーターにより TER-119 陽性を指標に赤血球にゲートを
設定し，そのうちの GPI アンカー結合タンパク質である
CD24 陰性の細胞数をカウントし，突然変異頻度を算出
した．
溶媒または ENU を投与したマウスの血液での解析結
果を図 3 に示す．溶媒対照群では，CD24 陰性の赤血球
がほとんど検出されないのに対して，ENU 投与群では
CD24 陰性の赤血球が増加していることがわかる．また，
ENU 投与群では 2-4 週にかけて Pig-a 遺伝子突然変異の
経時的な増加が見られた ( 図 4) ．
図 2　Pig-a アッセイの解析フローチャート．
図 3　溶媒対照群 (A) と ENU 投与群 (B) の CD24 陰性細胞の
比較．
「労働安全衛生研究」
103
色体異常誘発性を調べる小核試験や染色体異常試験など
の他の遺伝毒性の結果と合わせることにより，どのよう
な遺伝毒性影響があるか検討することができる．
7　おわりに
7 ࠾ࢃࡾ࡟
Pig-a アッセイは，産業化学物質の中長期的なばく露実
験を行う際の遺伝子突然変異の解析ツールとして利用で
きると考えられる．また，解剖の必要がないことや，他
の毒性試験に組み込み易いことから，使用動物数を減ら
すことができるため，実験動物に対する 3R (Replacement
[ 代替 ]，Reduction　[ 削減 ]，Refinement [ 改善 ]) の原
則からも有用な解析方法であるといえる．Pig-a アッセイ
図 4　ENU による Pig-a 遺伝子突然変異頻度の経時的変化．
は，比較的簡単かつ安価に実施することが可能なアッセ
5　Pig-a アッセイの利点及び欠点
5 Pig-a ࢔ࢵࢭ࢖ࡢ฼ⅬཬࡧḞⅬ
Pig-a アッセイは，実験動物を解剖することなく解析
イ方法であり，データ数はまだ少ないものの高い感受性
を行うことができるため，1 匹の動物で経時的に血液を
後，バリデーション研究が充分に行われれば，遺伝毒性
サンプリングし，突然変異頻度の推移を測定することが
の評価方法の一つとして非常に有用となるだろう．また，
できる．また，少量の血液 (10 μL 程度 ) で解析を行うこ
遺伝毒性発がん物質を取り扱う労働者の健康リスクの管
とができるため，長期の発がん実験や一般毒性試験など
理ツールとしても応用可能かもしれない．
と特異性を有することが報告されているため 4-6,13,18)，今
他の毒性研究に組み込み易く，他の生体影響と遺伝毒性
の関連を検討することができる．実際に，ラットで行う
文　献
一般毒性試験に遺伝毒性の解析を組み込むための研究が
1) OECD. Test guideline 474: OECD guideline for the testing
行われている 14-16)．また，染色体異常の指標である小核
ᩥErythrocyte
⊩
of chemicals. Mammalian
Micronucleus Test.
試験と同時に行うことにより，より広範に遺伝毒性を調
1997. Paris: Organisation for Economic Cooperation and
べることが可能となる．また，Big Blue や gpt delta な
Development.
どの特殊なトランスジェニック動物を使用することなく
2) Kohler SW, Provost GS, Kretz PL, Fieck A, Sorge JA, Short
アッセイできる．一方で，トランスジェニック動物を利
JM. The use of transgenic mice for short-term, in vivo
用した試験系は，すべての組織を対象に変異原性を調べ
mutagenicity testing. Genetic analysis, techniques and
ることができるのに対して，Pig-a アッセイは，血液系
applications. 1990; 7: 212-218.
の細胞，特に赤血球を利用して解析する方法が確立され
3) Nohmi T, Katoh M, Suzuki H, Matsui M, Yamada M,
てきており，他の細胞や組織での解析を行う方法は未確
Watanabe M, et al. A new transgenic mouse mutagenesis
立のため，今のところ造血系での影響しか調べることが
test system using Spi- and 6-thioguanine selections.
できない．そのため，実際の発がんの標的臓器における
変異原性を調べることが難しい．また，核を持たない赤
Environ. Mol. Mutagen. 1996; 28: 465-470.
4) Bryce SM, Bemis JC, Dertinger SD. In vivo mutation
血球で解析を行う場合は，突然変異スペクトルの解析は，
assay based on the endogenous Pig-a locus. Environ. Mol.
ほぼ不可能である．
Mutagen. 2008; 49: 256-264.
5) Dobrovolsky VN, Boctor SY, Twaddle NC, Doerge DR,
6　労働衛生分野での Pig-a アッセイの応用
6 ປാ⾨⏕ศ㔝࡛ࡢ Pig-a ࢔ࢵࢭ࢖ࡢᛂ⏝
ラットやマウスなどを用いた動物実験では，解剖する
Bishop ME, Manjanatha MG, et al. Flow cytometric
ことなく遺伝子突然変異の解析が行え，また，反復ばく
erythroid-specific antibody: application of the method for
detection of Pig-A mutant red blood cells using an
，例えば労働現
evaluating the in vivo genotoxicity of methylphenidate in
場で扱われる有機溶剤やナノ材料などを長期間ばく露し
adolescent rats. Environ. Mol. Mutagen. 2010; 51: 138-145.
ながら，経時的に遺伝子突然変異の推移を調べることが
6) Miura D, Dobrovolsky VN, Kasahara Y, Katsuura Y,
できる．さらには，他の毒性実験と組み合わせることも
Heflich RH. Development of an in vivo gene mutation
簡便であるため，一度の実験でより多くの毒性情報を得
assay using the endogenous Pig-A gene: I. Flow cytometric
ることができる．また，種々の生体防御因子などの遺伝
detection of CD59-negative peripheral red blood cells and
子欠損マウスを用いて解析を行うことで，遺伝毒性の発
CD48-negative spleen T-cells from the rat. Environ. Mol.
現メカニズムの解明にも役立つであろう．さらに，ヒト
Mutagen. 2008; 49: 614-621.
露により突然変異が蓄積していくため
17)
の血液サンプルでも解析することができるので 10,12)，化
7) Kimoto T, Suzuki K, Kobayashi XM, Dobrovolsky VN,
学物質を扱う労働現場におけるヒトの遺伝毒性のモニタ
Heflich RH, Miura D, et al. Manifestation of Pig-a mutant
リングにも応用可能である．また，初期の DNA 損傷性
bone marrow erythroids and peripheral blood erythrocytes
を調べるコメットアッセイや不定期 DNA 合成試験，染
in mice treated with N-ethyl-N-nitrosourea: direct
Vol. 7, No.2, pp.101-104, (2014)
104
sequencing of Pig-a cDNA from bone marrow cells direct
mutation assay: measuring rat Pig-a mutant bone marrow
sequencing of Pig-a cDNA from bone marrow cells negative
erythroids and a high throughput assay for mutant
for GPI-anchored protein expression. Mutat. Res. 2011;
peripheral blood reticulocytes, Environ. Mol. Mutagen.
723: 36-42.
2011; 52: 774-783.
8) Phonethepswath S, Bryce SM, Bemis JC, Dertinger
14) Dertinger SD, Phonethepswath S, Franklin D, Weller P,
SD. Erythrocyte-based Pig-a gene mutation assay:
Torous DK, Bryce SM, et al. Integration of mutation and
demonstration of cross-species potential. Mutat. Res. 2008;
chromosomal damage endpoints into 28-day repeat dose
657: 122-126.
toxicology studies. Toxicol. Sci. 2010; 115: 401-411.
9) Horibata K, Ukai A, Kimoto T, Suzuki T, Kamoshita N,
15) Shi J, Krsmanovic L, Bruce S, Kelly T, Paranjpe M, Szabo
Masumura K, et al. Evaluation of in vivo genotoxicity
K, et al. Assessment of genotoxicity induced by 7,12-dime
induced by N-ethyl-N-nitrosourea, benzo[a]pyrene, and
thylbenz(a)anthracene or diethylnitrosamine in the Pig-a,
4-nitroquinoline-1-oxide in the Pig-a and gpt assays.
micronucleus and Comet assays integrated into 28-day
Environ. Mol. Mutagen. 2013; 54: 747-754.
repeat dose studies. Environ. Mol. Mutagen. 2011; 52:
10) Araten DJ, Nafa K, Pakdeesuwan K, Luzzatto L. Clonal
711-720.
populations of hematopoietic cells with paroxysmal
16) Stankowski LF, Jr., Roberts DJ, Chen H, Lawlor T, McKeon
nocturnal hemoglobinuria genotype and phenotype are
M, Murli H, et al. Integration of Pig-a, micronucleus,
present in normal individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
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mutation rate and of mutagenic agents in vivo. Mutat. Res.
2010; 705: 3-10.
Environmental and molecular mutagenesis. 2011; 52:
738-747.
17) Miura D, Dobrovolsky VN, Kimoto T, Kasahara Y, Heflich
RH. Accumulation and persistence of Pig-A mutant
12) Dobrovolsky VN, Elespuru RK, Bigger CA, Robison TW,
peripheral red blood cells following treatment of rats with
Heflich RH. Monitoring humans for somatic mutation in
single and split doses of N-ethyl-N-nitrosourea. Mutat.
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Res. 2009; 677: 86-92.
18) Phonethepswath S, Franklin D, Torous DK, Bryce SM,
13) Kimoto T, Chikura S, Suzuki K, Kobayashi XM, Itano
Bemis JC, Raja S, et al. Pig-a mutation: kinetics in rat
Y, Horibata K, Honma M, Dobrovolsky VN, Heflich RH,
erythrocytes following exposure to five prototypical
Miura D, Kasahara Y. Further development of the rat Pig-a
mutagens. Toxicol. Sci. 2010; 114: 59-70.
「労働安全衛生研究」