蛋白質核酸酵素:製薬企業におけるプロテオーム解析

解説
製薬企業におけるプロテオー ム解析
Walter
P.Blackstock・
西 村 俊 秀 ・藤 田 芳 司
プロテオームとは,ゲ ノムによって発現された蛋白質の完全なセットである。多くの遺
伝子が沈黙 しているように,す べての蛋白質がすべての細胞種で常時発現されているわけ
ではない。発現の数も1細 胞あたり数個から30,000個 のコピーと多様である。プロテオ
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ミクスは,蛋 白質発現,翻 訳後修飾や蛋白質相互作用を研究する有力な方法である。プロ
テオミクスを発現系と細胞マップの二面から考え,2次 元電気泳動法および質量分析の技
術とプロテオミクス,ゲ ノムデータベースが次世代の創薬にどのような役割を果たすかを
考察したい。
【プ ロ テオ ー ム】【発 現 プロ テオ ミクス 】【細 胞 マ ッ ププ ロ テオ ミク ス】
【2次 元 電 気 泳 動 法 】 【質 量 分 析 】 【ゲ ノ ム デー タ ベ ー ス 】 【
ハ イス ル ー プ ッ ト】
【ロ ボ ッ ト技 術 】
は じめ に 1998年5月,Perkin-Elmer社(PE,Norwalk,CT)とThe
Institute of Genomic
(TIGR,Rockville,MD)と
Genomics
Corporationを
お り,従 来 法 よ り格 段 に ス ピ ー ドが 向 上 す る こ と に な
Research
は ベ ンチ ャ ー 企 業Celera
つ く り,3年
間 で ヒ トゲ ノム
る。21世
紀 に お け る 生 物 学 や 創 薬 の プ ロ セ ス は,こ れ
らの 膨 大 な デ ー タ に よ っ て 重 大 な影 響 を 受 け る こ と は
確 実 で あ る。 遺 伝 子 の 予 想 リス トや オ ー プ ン リー デ ィ
の シ ー ク エ ン ス を 決 め る“ シ ョ ッ トガ ン” 読 み 取 り計
ン グ フ レ ー ム(open
画 を発 表 した1)。 公 的 プ ロ ジ ェ ク トでBAC順
づ くりには おの ず と限界 があ る。 ゲ ノムの解 読が進 む
序 づ けラ
reading
frame;ORF)*1の
目録
イ ブ ラ リー に よ っ て ヒ トゲ ノ ム の 系 統 的 な 読 み 取 り を
に つ れ,予
行 な っ て い た グ ル ー プ は,こ
の 発 表 で 大 き な衝 撃 を 受
られ て い な い こ と も わ か っ て き た 。 ほ とん どの 機 能 解
最 初 の完 全 な ゲ ノ ム シ ー ク エ
析 は 他 の 蛋 白 質 か ら の 類 推 で あ り,実 験 生 物 学 的 に 機
け た 。1995年
にTIGRが
ン ス をHaemophilus influenzae2)に
つ い て 決 め た が,
シ ョ ッ トガ ン”は そ の と き採 用 した 方 法 論 の 延 長 に
“あ
る。3年 後 の現 在 で は 全 世 界 で約100に
及 ぶ ゲ ノム プ ロ
ジ ェ ク トが 進 行 して い る。 そ の 内 訳 は,71の
12の 単 一 細 胞 真 核 生 物,そ
物 で あ る3)。TIGR-PEに
原 核 生 物,
して7つ
の複 合 細 胞 真 核 生
よれ ば,1日
あ た り100Mbp
想 蛋 白 質 コ ー ド領 域 の ほ ぼ 半 分 の機 能 が 知
能 が 同 定 され る の は 例 外 的 で あ る4)。こ の状 況 は,ヒ
ゲ ノ ム に つ い て も変 わ ら な い 。 細 胞 内 経 路,相
や 表 現 プ ロ フ ィー ル,ま
互作用
た 空 間 分 布 や 時 間 的 変 化 を含
め て 蛋 白 質 の 機 能 を 明 らか に す る こ と は,次 世 代 の 生
命 科 学 の 重 要 な 挑 戦 に な る。
(メ ガ 塩 基 対)の 粗 シ ー ク エ ン ス が 決 定 で き る と さ れ て
Walter
P.Blackstock,Biomolecular
Unit,Glaxo
Wellcome
Research
and
Development,Gunnels
Wood
Road,Stevenage,
Hertfordshire,UK
Toshihide
Research
Proteomics
2214
Nishimura,Yoshiji
Fujita,日
Laboratories,Wadai,Tsukuba,Ibaraki
in Pharmaceutical Industry
本 グ ラ ク ソ㈱ 筑 波 研 究 所(〒300-4247 300-4247,Japan]
ト
茨 城 県 つ くば 市 和 台43)[Nippon
Glaxo,Tsukuba
55
製薬企業 にお けるプロテオーム解析
す べ て に 回 答 す る こ と は で き な い だ ろ う。 プ ロ テ オ ミ
Ⅰ
.新 薬研究開発におけるコス ト
ク ス も こ の 回 答 を 得 る た め の ひ とつ の 試 み と考 え る べ
き あ る 。 この 理 由 は,単 純 な 事 実 と して す べ て 薬 の タ
新 薬 の 探 索 研 究 は,コ
(combinatorial
ン ビ ナ トリア ル ケ ミ ス トリー
chemistry),ハ
ー ゲ ッ トは ほ とん ど蛋 白 質 で あ る か らで あ る
イ ス ル ー プ ッ トス ク リ
ー ニ ン グ な どの ロ ボ ッ ト技 術 に よ り飛 躍 的 に 効 率 が 向
上 し,よ
Ⅱ
.プ
ロテオミクス
り選 択 的 な 化 合 物 を 迅 速 に見 つ け られ る よ う
に な っ た 。 一 方,既
プ ロ テ オ ー ム(proteome)は,ゲ
存 の膨 大 な ゲ ノ ム デ ー タ を有 効 に
ノ ム(genome)に
情 報 解 析 す る こ とで 新 し い 病 気 の タ ー ゲ ッ トも決 め ら
対 す る 蛋 白 質(protein)に
れ る よ う に な っ て き た 。 これ ら ロ ボ ッ ト技 術 と遺 伝 子
にWilkinsが
研 究 に よ り,人 類 が 過 去100年
ら に プ ロ テ オ ミ ク ス(proteomics)と
以 上 か けてきた約450種
類 の 異 な っ た タ イ プ の 薬 が,今
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。
後10年
つ い て の 言 葉 と し て1995年
最 初 に 用 い た10)。短 い間 に この 言 葉 は,さ
ジ ェ ノ ミ ク ス(genomics)に
間 で4,000∼
な っ た 。 これ は
対 応 した もの で あ る。
5,000種 類 に な る とい わ れ て い る。1つ の 新 薬 を 市 場 に
Andersonの
出 す た め に5億
ドル 近 く の研 究 開発 コ ス トが か か る と
ス へ の 変 名 に よ っ て 何 らか の 資 金 が この 新 しい 学 問 に
皮 肉 め い た 見 方 で い え ば,「 プ ロテ オ ミク
も い わ れ て お り,今 後 は 開 発 コ ス ト削 減 に対 す る 圧 力
使 わ れ るべ き で あ る」 とい う意 図 を表 わ して い る と い
が 一 段 と強 くな る で あ ろ う5)。国 際的 な企 業 とい え ど も,
う11)。プ ロ テ オ ミ ク ス に 関 す る 最 近 の 著 書12)や 学 会 の
単 独 で12万
動 向 を見 る と,こ
ヒ ト遺 伝 子 を薬 の タ ーゲ ッ ト とす る こ とは
不 可 能 で あ り,そ の な か の有 望 な1,000∼3,000の
遺伝
子 が タ ー ゲ ッ トに な る で あ ろ う6)。TIGR-PEは,た
っ
た100∼300ヒ
Glaxo
∼30を
ト遺 伝 子 を特 許 化 す る意 志 を示 唆 した7)。
Wellcome社
で は,主 要 疾 患 の 有 望 遺 伝 子20
タ ー ゲ ッ ト と して い る。
の 呼 び 方 に は利 点 が あ る と考 え ら れ
て お り,用 語 と し て 定 着 す る と思 わ れ る 。
大 まか に い え ば,プ
ロ テ オ ミ ク ス は蛋 白質 の 性 質 に
関 す る大 規 模 研 究 と して 定 義 で きる。 蛋 白 質 の発 現 量,
翻 訳 後 修 飾(post-translational
modification)や
相互
作 用 な ど の 性 質 を 研 究 し,健 康 お よ び 発 病 状 態 に お い
12万 の ヒ ト遺 伝 子 か ら有 望 な 新 薬 ター ゲ ッ トを選 び
て 発 現 蛋 白 質 レベ ル で 何 が起 こっ て い る か,細 胞 ネ ッ
出 す こ と は,遺 伝 子 機 能 解 析 の 重 要 な課 題 の ひ とつ で
ト ワ ー ク や プ ロ セ ス な ど の 全 体 的 な生 物 学 的 情 報 が 得
あ る 。 この 機 能 検 索 の 考 え 方 は,今
ら れ る 。 また,プ
日 ま で 大 きな 成 功
ロテオ ミクスは 「
細 胞1つ
を 収 め て きた 生 物 学 の 還 元 論 的 な立 場*2に 合 わ な くな っ
も す べ て の 蛋 白 質 が ど う動 い て い る か?」
て きて い る。 い ま で も還 元 論 立 場 を堅 持 す る研 究 者8)も
に 答 え よ う と して い る。
い る が,ゲ
ノ ム 計 画 が,物
質 そ の もの で は な くプ ロセ
これ まで あ ま り関 連 が な か っ た2つ
にお いて
と い う問 題
の学 問の融 合 が
ス の ネ ッ トワ ー ク 的 意 味 が 生 物 学 に重 要 で あ る とい う
プ ロ テ オ ミク ス を可 能 に した 。 一 つ は ジ ェ ノ ミク ス で,
全 体 論 的 な 考 え へ の 道 を 示 して くれ る と い う研 究 者 も
と く に 日々 蓄 積 さ れ る ゲ ノ ム デ ー タ ベ ー ス で あ る 。 も
い る。 しか し,Bainsが
見 て い るよ うに9),還 元 論 者 が
こ と を簡 単 化 しす ぎ て い る と し て も,生 物 工 学 や 製 薬
う一 つ は 質 量 分 析(mass
spectrometry)で
あ り,蛋
白
質 を高 感 度 で 分 析 す る最 近 の 技 術 的 進 歩 は 目覚 ま しい。
企 業 に お け る そ の 有 効 性 は こ こ数 年 で な くな る と は 考
この 技 術 融 合 に よ り,未 知 蛋 白 質 に つ い て エ ドマ ン法
え られ な い 。
(Edman
sequencing)な
ど に よ り逐 次 的 に シ ー ク エ ン
ノ ム 計 画 か ら発 生 し て くる膨
ス を決 め る方 法 か ら,正 確 な 分 子 量 や ペ プ チ ドの シ ー
大 な デ ー タ と新 し く見 い だ さ れ て く る遺 伝 子 の機 能 が
クエ ンス タ グ よ り迅 速 に蛋 白質 を検 索 した り,も との 遺
ほ とん ど未 知 で あ る とい う二 重 の圧 力 を感 じて い る。 ま
伝 子 デ ー タ ベ ー ス を 同 定 す る方 法 に変 わ っ て きた13)。 と
た,ど
くに 重 要 な の は,質
世 界 中 の 研 究 者 は,ゲ
の よ うに し て12万
の 遺 伝 子群 か ら1,000∼3,000
量 分 析 か ら得 られ る デ ー タ が 発 現
の 有 望 な遺 伝 子 を 絞 り込 む か も大 きな 課 題 で あ る。 ど
配 列 タ グ(expressed
の よ う な実 験 系 や 情 報 解 析 技 術 を もっ て して も これ ら
け られ る こ と で あ る 。 ヒ ト遺 伝 子 デ ー タ の約95%は,
*1 終 止 コ ド ン の な い 比 較 的 長 いDNA配
*2 生 命 の 全 体 が 物 理 学 と化 学 の 法 則 に 還 元 で き る と す る考 え 方 。 これ に つ い て は,Gatlin,L.L.:Information
System,Columbia
*3 PCR法
University
に 利 用 で き るcDNAク
列 。DNA2本
Press(1972)に
に は6つ
のORFが
sequence
tag;EST)*3と
結 びつ
可 能 で あ る。
Theory
and
the Living
も詳 しい 記 述 が あ る。
ロー ンの 短 い 配 列 。
2215
56
蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.43
No.15(1998)
この発 現 配 列 タ グ の 形 で す で に存 在 す るか らで あ る14)。
質 は ア フ ィニ テ ィ ー を利 用 して ほ とん ど 除 く こ とが で
き る が,人
Ⅲ
.プ ロテオミクスの技術的基礎
為 的 な コ ン タ ミネ ー シ ョ ンが な い よ う に細
心 の 注 意 が 求 め られ る。
さ ら に,多
1.2次
元 電 気 泳 動 法(2D-PAGE)
1975年
れ て お り,た
にO'Farrell15)とKlose16)は,蛋
白質 の等電
と え ば ゲ ル上 で 分 け られ た4,000の
質 の う ち 約1,000は
蛋白
も との 蛋 白 質 が 翻 訳 後 修 飾 や 分 解
点 と分 子 量 に基 づ い て ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル 上 で の
(proteolysis)を 受 けた もの で あ る と推 定 され て い る19)。
電 気 泳 動(electrophoresis)で
し た が っ て,質
分 離 で き る こ と を示 し
た。そ れ以 来,2D-PAGE(polyacrylamide
phoresis)は
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くの 蛋 白質 は グ リ コ シル 化 や リ ン酸 化 さ
gel electro-
細 胞 溶 解 液(cell lysate)の
量 分 析 の よ う な 手 段 に よ り翻 訳 後 修 飾
の 位 置 な ど を 同 定 す る必 要 が あ る。
よ うな 複 雑 な
画 像 解 析(image
analysis)は2Dゲ
ル 分析 の重要 な
混 合 物 か ら数 千 の 蛋 白質 を分 離 す る もっ と も有 効 な 方
要 素 で あ る。 現 時 点 で は そ の シ ス テ ム の 自動 化 が 課 題
法 とな っ て い る。 こ こ数 年 の 技 術 改 良 で,熟 練 した 人
で あ る。cDNAの
が 現 在 の大 き な ゲ ル(20×20cm)を
gene expression(DGE)*5の
用 い れ ば4,000∼
マ イ ク ロ ア レ イ に よ るdifferential
8,000の 蛋 白 質 を再 現 性 よ く分 離 で きる。 蛋 白質 を視 覚
ト とは 異 な っ て,2Dゲ
化 す るた め に,ク
大 きさ,形,ク
ー マ シ ー ブ リ リア ン トブ ル ー(CBB)
よ う に整 然 と し た ス ポ ッ
ル上 で は 蛋 白 質 ス ポ ッ トの位 置,
ラス タ リング の状 態 も一 様 で は ない 。 画
や 銀 で 染 色 す る 感 度 の よ い 方 法 が 用 い られ る。 他 の 方
像 解 析 の た め の ソ フ トは,一 般 に1週
法 と して,35S-メ
く らい を 扱 う よ う に し か で き て お らず,ま
チ オ ニ ン を 用 いた り,リ ン と結 合 して
発 色 さ せ る 方 法(phosphorimager)な
ど あ る が,ゲ
ル
ニ ュ ア ル 編 集(editing)し
間 で数個 のゲ ル
た いつ もマ
な け れ ば な ら な い 。 した が
上 の 移 動 度 を 変 え ず に 蛋 白 質 を選 択 的 に ラベ ル す る 方
っ て,編
法 と し て 蛍 光 染 色 法 が 最 近 使 わ れ は じめ て い る17)。
た り8時 間 もか か る た め,現 時 点 で はハ イ ス ル ー プ ッ
細 胞 内 の 蛋 白 質 の 発 現 量 に は か な りの 差 が あ る。 そ
の コ ピ ー 数 は,細
胞 あ た り数 十 の も の か ら3万
以 上 の もの と幅 が 広 い 。 後 者 は,し
よ ば れ,
ル の ほ と ん ど を 占 め る。 これ 以 外 に,
ルあ
ト分 析 に は 向 か な い。 画 像 認 識 の 新 し い ア ル ゴ リズ ム
が 必 要 と さ れ る ゆ え ん で あ る。
ば しば ハ ウ ス キ ー
ピ ン グ 蛋 白 質(“house-keeping”protein)*4と
全 懸 濁 液 の2Dゲ
コピー
集 し て ゲ ル に完 全 な注 釈 を 施 す の に1ゲ
発 現 蛋 白 質 を定 量 的 に画 像 解 析 す る こ と もプ ロ テ オ
ミ ク ス の 重 要 な 要 素 で あ る。 し か し な が ら,画 像 解 析
は そ の 蛋 白 質 が 何 で あ るか につ い て は 教 え て くれ な い 。
発 生 の あ る 時 期 に し か 発 現 し な い よ う調 節 を受 け る遺
最 近 ま で,比
伝 子 や,組
か け ら れ た り,ま た そ の 蛋 白質 の 同 定 が 疑 わ れ る場 合,
織特 異 的 に発現 す るもの もある。 これ らは
較 的 量 の 多 い蛋 白質 の み が エ ドマ ン法 に
一般 に低 い コピー数 を もつ蛋 白質 で
ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ法(western
よ り確 認 さ れ る だ け で あ った 。 これ らの 方 法 は い ず れ
,実 際 に は最 も興
味 をひ く。 した が っ て,よ
い2Dゲ
分 離 能 を も っ て お り,視
覚化 の方 法 も高感 度 で な け
れ ば な ら な い 。 ま た,定
量 には広い ダイ ナ ミック レン
ジ(理 想 的 に は強 度 で6桁)を
ル とは,非 常 に高 い
も ロ ー ス ル ー プ ッ トで,現
blotting)*6に
在 の プ ロ テ オ ミク ス に対 応
す る こ と は 困 難 で あ っ た。
もつ 必 要 が あ る。 この
ゲ ノ ム プ ロ ジ ェク トの 開 始 と ほ ぼ時 期 を 同 じ くして,
よ う に,一 見 古 くて 手 垢 の つ い た 技 術 と思 わ れ る 方 法
幸 運 に も質 量 分 析 の分 野 で も大 きな 進 展 が起 こった 。 と
に は,最
く に,マ
ト リ ッ ク ス レー ザ ー脱 離 イ オ ン化(matrix-
assisted
laser desorption/ionization;MALDI)*7と
先 端 の 厳 し い 技 術 条 件 と改 良 が 求 め られ て い
る。
2Dゲ
ル 自体 の 課 題 と して,膜 蛋 白 質 や 酸 性 蛋 白質 を
の せ る 場 合 に 困 難 が あ り,い
くつ か の 解 決 が 試 み ら れ
て い る18)。血 清 中 の アル ブ ミンな ど多 量 に存 在 す る蛋 白
飛 行 時 間 型(time-of-flight;TOF)*8質
っ たMALDI-TOF質
(nano-ES)*9質
量 分 析 と を使
量 分 析 とナ ノ エ レク トロス プ レー
量 分 析 の 出 現 に よ る と こ ろが 大 き い 。
*4 ほ と ん ど ま た は す べ て の細 胞 の機 能 に とっ て発 現 が必 須 な遺 伝 子 。
*5 数 万 個 の 遺 伝 子 が 高 密 度 に グ リ ッ ド化 さ れ た フ ィル ム を 用 い,試
料 由来RNAか
遺 伝 子 発 現 量 の変 化 をモ ニ タ ー す る 方 法。
*6 ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル 上 で蛋 白質 を分 子 量 に したが っ て分 画 した の ち,ニ
らの プ ロー ブ をハ イ ブ リダ イ ズす る こ とに よ って
トロセ ル ロ ー ス膜 に移 し,抗 体 で 検 出 す る方 法 。
*7 試 料 を シナ ピ ン酸 の よ う な レ ー ザ ー光 を吸 収 す る マ ト リッ ク ス と混 合 し,乾 燥 させ て結 晶 と し,マ
動 に よ るイ オ ン化 と レー ザ ー照 射 に よ る瞬 間 加 熱 に よ り,イ オ ン化 した 試 料 を 真 空 中 に導 く方 法 。
*8 質 量 数 を初 期 加 速 に よ る試 料 分 子 イ オ ン の飛 行 時 間 差 で分 析 す る 方 法 。
2216
ト リ ック スか らのエ ネ ルギ ー 移
57
製薬企業にお けるプロテオーム解析
ポ ッ トに は その 必 要 が な い。 ゲ
ル 中 の 蛋 白質 は,還 元 す る か
ア ル キ ル 化 した の ち,ト
リプ
シ ンな どで 消 化 分 解 し て ペ プ
チ ドの 混 合 物 とす る。
トリ プ シ ン 消 化 で は,ア
ギ ニ ン(R)と
ル
リ ジ ン(K)の
C末 端 側 で 切 断 が 起 こ り,C
末 端 酸 性 基 を残 し て 内 部 酸 性
残 基 を つ く ら な い。 こ の よ う
に きれ い な切 断 で あ るか ら,次
の ス テ ッ プで あ るnano-ES質
量 分 析 が しや す くな る 。 各 ス
ポ ッ トの 蛋 白 質 は ペ プ チ ドの
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混 合 物 と な る の で,容
と の 蛋 白 質 の1次
易に も
元構 造 を決
め る こ とが で き る。MALDITOFで
は,ペ プ チ ド混 合 物 の
お の お の の 分 子 量 を測 定 す る。
ソ フ ト上 で 同 じ分 解 酵 素(ト
リプ シ ンが 最 も一 般 的 で あ る)
を 用 い て“ 消 化” さ れ た 蛋 白
質 デ ー タベ ー スを検 索 す る。 こ
の よ う な ソ フ ト は市 販 さ れ て
い る。World
図1 (WWW)上
自動 化 され た プ ロテ オー ム解析 の概 略
Wide
Web
で も使 用 可 能 な無
料 ソ フ トが 利 用 で き る 。 そ の
い くつ か を表1に
2.ゲ
ルか らの 蛋 白質 の質 量分析 による同 定
MALDI-TOFとnano-ESの
量 を測 定 す る が,分
両 方 法 と も蛋 白質 分 子
子 量 の み で は シー ク エ ン ス を 同 定
す る に は不 充 分 で あ る。 蛋 白質 の 同 定 に は,ペ
示 す。原 理
的 に い え ば,酵
母 の よ う にゲ ノ ム が す べ て わ か っ て い
る も の で は,す
べ て の 蛋 白 質 と そ れ らの ト リプ シ ン消
化 物 で あ る ペ プ チ ドは 知 られ て お り,さ
らに 質 量 分 析
プチ ド
に よ る1次 元 構 造 の 解 析 は 必 要 な くな る 。 した が っ て,
の レベ ル で 行 な う こ とが よ り信 頼 で き る。 とい うの は,
ペ プ チ ドの 分 子 量 を正 確 に 測 定 す れ ば蛋 白質 を 同 定 で
蛋 白質 を分 解 し て 得 られ る3∼5種
きる。
のペ プ チ ドか ら デ ー
タ ベ ー ス に あ る 蛋 白質 を 曖 昧 さ な く照 合 で き る か らで
Mannは
最 初 に この 方 法 で溶 解 した 酵 母 細 胞 の2Dゲ
あ る20)。全 体 の 同 定 の プ ロセ ス を図1に 示 す。 ゲ ルの ス
ル 上 に検 出 され た150の 蛋 白質 を 同 定 した22)。その うち,
ポ ッ ト(ま た は1Dゲ
32はORFと
ル の バ ン ド)を 切 り出 し,エ
ン ドル フ チ ュ ー ブ か96ウ
(microtitre plate)に
ッペ
ェル の マ イ ク ロ プ レ ー ト
入 れ る。CBB染
除 い て お く。 た だ し,銀 染 色21)や35Sラ
色 は洗 って取 り
ベ ル され たス
して の み 知 られ て い る もの で あ った 。 さ ら
に,Mannは,1Dゲ
ルの ように蛋 白質の分 離が不 完全
で あ る よ うな 簡 単 な混 合 物 にお いて もMALDI-TOFが
使 え る こ とを 示 した23)。しか しな が ら,測 定 で きる 蛋 白
*9 試 料 を含 む 溶 液 を電 気 的 に大 気 中 で ス プ レ ー して イ オ ン 化 す る方 法(electrospray
ionization;ESI)の
の 出 口 内径 を もつ テ ィ ップ か らス プ レー し て ひ とつ ひ とつ の 蛋 白 質 多 価 イ オ ン をunfoldの
オ ン強 度 が 約20∼30分
ひ とつ で あ る が,約2μm
状 態 で 気 相 に導 く方法 。 そ の た め,イ
程 度 持 続 して詳 しい構 造 解 析 を 質 量 分 析 で行 な うの に適 し て い る。 ス プ レー され た 液 滴 が 細 か くか つ 揃 っ
て い る た め に 光 を 当 て る と虹 を示 すた め レ イ ン ボー ス プ レ ー と も よ ば れ る 。
2217
58
蛋 白質 核 酸 酵 素 表1 Vol.43
No.15(1998)
質 量 分 析 デ ー タ で 蛋 白 質 デ ー タ ベ ー ス を 検 索 で き る ソ フ トのWWWリ
質 の 範 囲 は完 全 で は な く,ま た 量 が 少 な くな れ ば測 定
タ ベ ー ス31)を 検 索 す る。 ヒ ッ トが 得 られ た ら,予 想 の
も困 難 で あ る とい う こ と を記 し てお きた い 。 しか し,こ
衝 突 分 解 ス ペ ク トル が 計 算 さ れ,実
のpeptide
ク トル と比 較 さ れ る。 ま た,他
mass
fingerprinting(PMF)法24)は
速 い 方 法 で あ る の で,自
非常 に
動 化 や ハ イ ス ル ー プ ッ トに は
都 合 が よ い とい え る。 多 くの ゲ ノム は い まだ 解 読 さ れ
て い な い の で,PMF法
Database Center for Life Science Online Service
ンク
が し ば し ば う ま くい か な い 。 同
様 に,ESTデ
ー タベ ー ス は誤 りや す い 。 また,PMF法
は 通 常ESTと
一 緒 に は使 わ れ な い。 この よ うな場 合 に
は,他
様 な 検 索 を 行 な い 正 確 さ を 高 め る。
この よ う な 質 量 分 析 の 方 法 を,タ
(tandem
mass
spectrometry)と
ンデム質 量分 析 法
かMS/MS法
とい
い*11,翻
訳 後 修 飾 の 解 析 に も非 常 に有 効 で あ る。 筆 者
ら は,神
経 変 性 疾 患(neurodegenerative
diseases)32)
に 特 徴 的 な タ ウ蛋 白 質 の リ ン酸 化 部 位 を決 め る の に こ
の 情 報 が 必 要 で あ る。
エ レ ク トロ ス プ レ ー,と
験 で 得 られ た ス ペ
の 消 化 ペ プ チ ドに も同
くにnano-ES25)は
ペ プチ ド
の 方 法 を よ く用 い て い る 。 リ ン酸 基(PO3-,m/z79)
と蛋 白質 の 両 方 を イ オ ン 化 す るの に 有 効 で あ る。 ト リ
を も つ 分 解 イ オ ン に着 目 し,こ の よ う な イ オ ン を生 じ
プ シ ン消 化 で 得 られ るペ プ チ ド は,そ のC末
る ペ プ チ ド の み を衝 突 分 解 させ 配 列 タ グ を 決 め る。 ポ
端 にア ル
ギ ニ ン また は リジ ン を もっ て い る の で,エ
プ レー で イ オ ン化 されN末
つ2価
端 とC末
レ ク トロ ス
端が正 の荷電 をも
イ オ ン と な る。 そ の よ うな イ オ ン を 質 量 分 析 計
内 で 選 び,ア
ル ゴ ン ガ ス と衝 突 させ る*10と ペ プ チ ド分
子 の 両 端 か らの 開 裂 が観 測 され る。C末
由 来 す る 分 解 イ オ ン はy"イ
で あ る。y"イ オ ン は,衝
端 か らの 開 裂 に
オ ン26)と い い,と
くに有 用
突 分 解 ス ペ ク トル に特 徴 的 で,
1∼5の 短 い 残 基 を 読 む の に用 い ら れ る。
18O/16O(1:1)の
オ ン は18Oで
PCR)の
chain
reaction;
よ う な 方 法 が 蛋 白 質 に 関 して は な い た め,ゲ
ル 上 で 分 離 され た 蛋 白 質 の量 は 重 要 で あ る。 し た が っ
て,感
度 の 高 い装 置 で 検 出 す る必 要 が あ る。 質 量 分 析
は 現 在 最 も感 度 の 高 い測 定 技 術 で あ る。
し か し な が ら,質 量 ス ペ ク トル の どの 質 量 領 域 に で
も存 在 す る,い わ ゆ る ケ ミカ ル ノ イ ズ の た め に装 置 本
来 の 感 度 に も制 限 が 生 じ る。 こ の よ うな ケ ミカ ル ノ イ
水 の 中で消化 す る と
,C末
ラベ ル さ れ るの でy"シ
リメ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応(polymerase
ズ は,最 初 の 試 料 の 取 り扱 い 方 に起 因 し て お り,ポ
端y"イ
リー ズ イ オ ン を正
リ
エ チ レ ン グ リ コー ル や ケ ラ チ ン に よ る コ ン タ ミ ネ ー シ
確 に 検 出 す る こ とが で き,自 動 解 析 が 可 能 とな る27,28)。
ョ ン に 充 分 注 意 を払 う必 要 が あ る。 な ぜ な ら,こ
ペ プ チ ドの 分 子 量,N末
が し ば し ば 一 番 強 い シ グ ナ ル と して 見 え るか らで あ る。
端 お よびC末
端 衝突 開裂 スペ
れ ら
ク トル な どの 質 量 や 部 分 的 な シ ー ク エ ン ス の 情 報 か
ち な み に,こ
ら,ペ
の ケ ラ チ ン の 質 量 ス ペ ク トル を 容 易 に 区 別 で き る ほ ど
プ チ ド配 列 タ グ(peptide
sequence
tag;PST)
とい う 同 定 方 法 が 考 案 さ れ た29)。蛋 白 質 また はESTデ
ー タ ベ ー ス(dbEST)か
ク ス フ ァ イ ル をPSTで
329,000の
protein
熟 練 し て い る。
らつ く られ た デ ー タ イ ン デ ッ
検 索 す る。 こ の 方 法 で は,約
Ⅳ
.デ
ー タ ベ ース
非 冗 長 蛋 白質 デ ー タ ベ ー ス(non-redundant
database;nrdb)30)が
ま ず 検 索 され る 。 そ こ
で ヒ ッ トが 得 られ な い と き,約1,700,000のESTデ
*10 の分 野 の研 究 者 は ヒ トと ヒ ツ ジ(ウ ー ル)
希 ガ ス と の 衝 突 で イ オ ン 分 解 を さ せ る 方 法 を,衝
ー
プ ロテオ ミクスは感度 の高 い質 量分 析 とゲ ノム プロ
ジ ェ ク トの 膨 大 な デ ー タ ベ ー ス の 融 合 に よ っ て 可 能 と
突 励 起 分 解(collision-induced
dissociation;CID)と
よ び,MS/MSの
ひ と
つ の 方法 で あ る。
*11 イ オ ン化 室 で 生 成 した イオ ン種 を第1の
で 測 定 す る。 これ を,タ
2218
質 量 分 析 計 で 選 び,こ
ンデ ム また はMS/MSと
い う。
れ をCIDな
どの 方 法 で さ らに 分 解 さ せ,こ れ を第2の
質量分析計
59
製薬企業におけるプロテオーム解析
な っ た 。 ペ プ チ ドの 質 量 分 析 デー タベ ー ス や ペ プ チ ド
配 列 タ グ を検 索 す るた め の デ ー タ ベ ー ス イ ンデ ッ ク ス
V.発
現 プロテオミクスおよ び細胞マッププロテオミクス
の 作 成 に つ い て 前 節 で 少 し述 べ た 。 非 冗 長 蛋 白 質 の デ
ー タ ベ ー ス はExPASyサ
ー バ ー(Geneva
プ ロ テ オ ミク ス は い ま の と こ ろ そ れ ほ ど正 確 な 用 語
,Switzer-
land)か ら利 用 で き る30)。また,dbESTはNCBIサ
バ ー31)か ら利 用 で き る 。Glaxo
室 で は,イ
UKの
研究
ン デ ッ ク ス は毎 夜 作 成 さ れ,市 販 の ソ フ ト
(Protana,Odense,DK)で
WWW上
Wellcome
ー
検 索 を行 な っ て い るが,
で も多 くの適 当 な検 索 手 段 が あ る。 表1に
よ
く使 わ れ て い る もの を い くつ か 紹 介 し た 。 これ らの デ
ー タ ベ ー ス は 毎 夜 新 し い も の に 置 き換 え られ
EST検
るか も しれ な い の で,未
知 で あ る とい う こ とに は な ら
な い(G.Neubauer,EMBL,Heidelberg:私
デ ー タ ベ ー ス に ヒ ッ トが あれ ば,EST
Database Center for Life Science Online Service
,月 曜 に
索 で ヒ ッ トが な くて も次 の金 曜 に は ヒ ッ トが あ
で は な い 。 最 近,筆
者 らは この用語 の意 味 を もう少 し
正 確 に し よ う と試 み た35)。す なわ ち,プ
ま だ幼 児 期 に あ る 技 術 で,克
ロテ オ ミク ス は
服 し な け れ ば な らな い 多
くの 問 題 を抱 え て い る の で,こ
の 技 術 が も っ と も有 効
に使 わ れ る分 野 を開 拓 す る こ とが 重 要 で あ る。 そ こで,
プ ロ テ オ ミ ク ス を“ 発 現 プ ロ テ オ ミク ス(expression
proteomics)”
と“細 胞 マ ップ プ ロ テ オ ミク ス(cell-map
proteolnics)”
と に分 け る こ と を提 案 し た 。 これ ら は,
と もに製 薬 企 業 に直 接 関 連 が あ る。“発 現 プ ロテ オ ミ ク
信)。EST
ス” は新 薬 開 発 の 臨 床 研 究 や 毒 性 研 究 の 段 階 で の ひ と
Blast searchは
つ の マ ー カ ー を与 え る もの で あ り,“ 細 胞 内 マ ップ プ ロ
非 常 に 有 用 で あ る33)。
テ オ ミク ス” は新 薬 創 製 の タ ー ゲ ッ ト評 価 に用 い られ
デ ー タ ベ ー ス を使 っ た ひ とつ の 方 法 は,人
やコンピ
る もの と考 え て よ い 。
ュー タ に よ る い っ さい の説 明 を使 わ な い もの でYates34)
に よ っ て 開 発 さ れ た 。 そ の 方 法 は,生 のMS/MSデ
タ を 蛋 白 質 デ ー タ ベ ー スやESTデ
した6つ
ー
ータベース をもとに
の 骨 格 翻 訳 か ら理 論 的 に予 測 さ れ るMS/MS
デ ー タ と相 関 の ア ル ゴ リズ ム を 用 い て 比 較 す る も の で
あ る。 こ の ソ フ ト(SEQUEST,Finnigan,San
CA)は
Jose,
市 販 さ れ て お り,た い て い の質 量 分 析 計 で 測 定
さ れ た デ ー タ を 受 け入 れ る こ とが で き る。
1.発
現 プ ロテオ ミクス
これ は,2Dゲ
細 胞,体
ル や画 像 解 析 をお もな手 段 として 組 織,
液 で の 蛋 白 質 発 現 に お け る総 体 的 な 変 化 を 定
量 的 に研 究 す る 。 欧 州,豪
は,細
州 や 米 国 の い くつ か の 会 社
胞 や 組 織 試 料 を 調 製 し て1週
間 に数百 の ゲル を
電 気 泳 動 に か け る こ とが で き る 。 臨 床 研 究 の現 場 で の
ゲ ル の 使 用 に つ いて は,Hochstrasser36)の
プ ロ テ オ ミ ク ス が 効 率 よ く機 能 す る か ど うか は,蛋
解説 がある。
Celisは 尿 中 に 膀 胱 癌 の マ ー カ ー を見 つ け るた め に発 現
白質 の 分 離 や 同 定 が 自 動 化 され るか ど うか に か か っ て
プ ロテ オ ミク ス を使 っ て い る37)。Mose-Lasennは,正
い る 。2Dゲ
常 細 胞 と糖 尿 病 の ラ ン ゲ ル ハ ン ス島 細 胞 群 に あ るβ 細
ル を 自動 で 電 気 泳 動 す る こ とは可 能 で あ る
し(Anderson:私
信),多
くの グ ル ー プ は,ゲ ル か ら ス
胞 を 比 較 し て お り38),マ ー カ ー とな る と考 え られ る い く
ポ ッ トを切 り出 し,酵 素 消 化 し,質 量 分 析 計 へ 導 入 す
つ か の 蛋 白 質 を 発 現 す る糖 尿 病 遺 伝 子 の 位 置 を突 き 止
る ロ ボ ッ トを 開 発 し て い る。 そ の状 況 は,ま
め た 。 毒 性 研 究 の 領 域 で は,マ
度 が 遅 く自 動 化 の 程 度 も低 い 。 また,1塩
だ まだ速
基(base)あ
ウスの肝 臓 にお い てペ
ル オ キ シ ソ ー ム様 β 酸 化 に 対 応 す る蛋 白 質 発 現 の 変 化
た り5ド ル 以 上 で あ っ た と きの 初 期 の ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ
が あ り,こ れ を ひ き起 こ す一 群 の ペ ル オ キ シ ソ ー ム 促
ク ト に よ く似 て い る。 い ま や ゲ ノ ム の 各 研 究 機 関 は
進 因 子 が 発 見 さ れ た39)。 また,Anderson40)は,2Dゲ
Megabaseの
ル の 解 析 か ら得 られ た 蛋 白 質 発 現 とDGEの
ハ イ ス ル ー プ ッ トを もって お り,コ ス トも
対 応 す るデ
1塩 基 あ た り1ド ル 以 下 に な り,さ ら に コス トが 下 が る
ー タ を 比 較 して お り,メ
と思 わ れ る。 これ は,画
プ ッ ト(蛋 白 質)と の 相 関 が 乏 しい こ と を 示 し て い る 。
期 的 な 技 術 革 新 で は な く,む
ッ セ ー ジ(mRNA)と
アウ ト
し ろ既 存 の 読 み 取 り技 術 の 逐 次 的 な 改 良 に よ っ て達 成
そ の 対 応 が1:1で
さ れ た 。 も っ と 多 くの 研 究 者 も し く は製 薬 企 業 が プ ロ
と現 在 考 え て い る。 メ ッセ ー ジの 生 成 物 を 扱 う こ と よ
テ オ ミ ク ス を行 な う よ う に な る と,ハ イ ス ル ー プ ッ ト
りメ ッ セ ー ジ を 扱 う こ とが 現 在 強 調 さ れ て い る が,分
や 蛋 白 質 の 同 定 に か か る コ ス トも同様 に改 善 さ れ て い
子 生 物 研 究 者 が た だ単 に手 持 ち の 道 具 の う ち で は ま だ
く こ と に な る だ ろ う。
な け れ ば な らな い とい う理 由 は な い
ま し な もの だ と考 えて い る こ とを よ く反 映 して い る。 し
か し な が ら,よ り正 確 で 定 量 的 な研 究 を行 な う に は,蛋
白 質 の レ ベ ル で 仕 事 を す る こ とが 望 ま しい 。
2219
60
蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.43
No.15(1998)
ム の6,200蛋
メ ッセ ー ジ の レ ベ ル で は よ くわ か って い る し,DGE
白 質 に つ い て現 在 行 なわ れ て い る45)。この
は 信 頼 で き る方 法 と し て 確 立 して い る,と い うか も し
方 法 は 対 の相 互 作 用(pairwise
れ ない 。 科 学 者 が トラ ンスク リプ トーム(transcriptome)
る も の で,全
研究す
で は な くて プ ロ テ オ ー ム の レベ ル で研 究 を行 な う こ と
白質 が 核 の 中 に入 っ て フ ォ ー ル ドす る必 要 が あ る 。 こ
を望 む な ら,そ の 技 術 は も う手 の とど くと こ ろ に あ り,
の 技 術 は そ れ で もハ イ ス ル ー プ ッ ト技 術 と して 確 立 し
ま た そ の 使 い勝 手 とい う意 味 で は す で に ひ け を取 ら な
て お り,質 量 分 析 を用 い る 方 法 に と っ て は 分 析 上 非 常
い。
に 好 都 合 で あ る。 ち な み に,蛋
テ ィ ー 精 製 は1回
2.細
胞 マ ップ プ ロテオ ミクス
白質複 合体 の ア フ ィニ
だ け行 な わ れ て い る 。 ゲ ノ ム の 分 野
で の い ま の や り方 を 適 用 す れ ば,大
これ は,細 胞 内 で の 蛋 白質 相 互 作 用 の場 所 や 時 間 変
化 に関 す る情 報 を得 る た め に,蛋
Database Center for Life Science Online Service
interaction)を
体 の 複 合 体 そ の もの で は な い 。 ま た,蛋
白質複合 体 を系統 的
スケ ール遺伝 子 タ
ギ ン グ お よ び標 準 精 製 条 件 化 や ハ イ ス ル ー プ ッ ト質 量
分 析 を 用 い る こ と に よ り並 行 し て多 くの 仕 事 が で き る
か つ大 ス ケ ー ル で研 究 す る もの と定 義 で き る。 現 在,新
よ う な“ 工 業 化” が 可 能 とな り,細 胞 マ ッ プ を も っ と
し く見 つ か った 蛋 白 質 の 機 能 を 調 べ る の に 多 くの 時 間
効 率 よ く構 築 で き る。 こ う して 得 られ た デ ー タ をKEGG
と技 術 が 使 わ れ て お り,こ れ が 創 薬 に お け る障 害 とな
(Kyoto
っ て い る 。 前 述 し た よ うに,1,000∼3,000の
Encyclopedia
of Genes and Genomes)46)の
よう
新 薬 のタ
な 経 路 デ ー タ ベ ー ス に入 れ た り,適 当 な 視 覚 化 の 道 具
ー ゲ ッ トを ヒ ト遺 伝 子 か ら見 つ け だ す の は大 き な 挑 戦
を作 成 す る こ と に よ り,細 胞 に存 在 す る 蛋 白 質 の 相 互
で あ る。 特 定 の 蛋 白 質 の機 能 を調 べ る う え で,細
作 用 ネ ッ トワ ー ク を理 解 す る う え で 非 常 に 価 値 の あ る
胞内
の そ の 蛋 白 質 が 存 在 す る場 所 で そ れ と会 合 して い る蛋
白 質(蛋
白 質 パ ー トナ ー)を
同 定 す る こ とや,刺
手 段 を生 物 研 究 者 に 与 え る こ と に な ろ う 。
激に
よ りひ き起 こ さ れ る会 合 の状 態 な どの パ ラ メ ー タ ー の
変 化 を 調 べ る こ と で 多 くの こ とが 推 定 さ れ る。
過 去2年
の 間 で も っ と も成 功 し た領 域 は,鍵
お わ り に プ ロ テ オ ミ ク ス は で き て か ら5年
とな る
経 っ て お らず,乗
ほ ど しか
り越 え な け れ ば な ら な い い くっ か の
細 胞 間 相 互 作 用 に か か わ る一 連 の 蛋 白 質 を 同 定 す る こ
技 術 的 課 題 が あ る。 しか しな が ら,自 動 化 の 改 良,よ
とで,Mannと
り感 度 が 高 い 質 量 分 析 や よ り集 約 度 の 高 い ソ フ トが 出
そ の グ ルー プ が上 記 の 方 法 を 用 い た 。 と
くに そ の よ う な例 と し て はFLICE(a
homologous
ICE/CED-3-likeプ
novel
FADD-
ロ テア ーゼ)41)とIKK
(大 マ ル チ 蛋 白質 複 合 体,IκB
kinase)42)な
ど,ま た ス
て くれ ば,蛋
て,そ
白 質 発 現 や 蛋 白質 相 互 作 用 の 研 究 に お い
の ハ イ ス ル ー プ ッ トが 格 段 に加 速 化 さ れ る こ と
は初 期 の 結 果 か ら も確 信 さ れ,勇
気 づ け られ る。 筆 者
プ ラ イ ソー ム 複 合 体43)の コ ン ポ ー ネ ン トの 同定 な どが
ら は,こ
あ る。MannとLamond44)の
技 術 を必 要 と し な い と考 え る*13。 今 後,ゲ
考 え 方 を拡 張 す るな らば,
の よ う な こ とが 可 能 に な る に は と くに 新 し い
ノム 読 み 取
タ ー ゲ ッ ト蛋 白 質 の 遺 伝 子 シー ク エ ン ス を検 出 し や す
りの 自動 化 に 考 案 され た 多 くの ロ ボ ッ トが 改 良 さ れ て
い 他 の も の で タ ギ ン グ(tagging)し
使 わ れ る で あ ろ う。 い ま や い くつ か の 会 社 が 発 現 プ ロ
画(sub-cell
fractionation)と
(affinity purification)を
て お い て,細
胞分
ア フ ィニ テ ィー精 製
用 い て細 胞 内 で の 蛋 白 質 分 布
を見 る と い う系 統 的 な 方 法 が 推 奨 さ れ る。
ア フ ィニ テ ィ ー 精 製 と質 量 分 析 と を組 み 合 わ せ る こ
と で,細
胞 内 で の 複 合 体 マ ッ プ が 作 成 で き る。 今 後,
徐 々 に この 方 法 が 進 展 し て“ 機 械 と して の細 胞” を構
テ オ ミ ク ス の ビ ジ ネ ス に挑 戦 し て い る が,細
胞 マ ップ
プ ロ テ オ ミ ク ス も遅 れ を と ら な い こ と をせ つ に願 う も
の で あ る。
最 後 に,本 稿 を ま とめ るに あ た っ て原 稿 の校 正 お よ び貴 重 な助
言 を して い た だ い た,日 本 グ ラ ク ソ㈱ 筑 波 研 究 所 化 学 部 の輿 石 敏
夫 主 任 研 究 員 と鈴 木 涼 子 研 究 員 に深 く感 謝 い た し ま す。
成 し て い る複 合 体 の ネ ッ トワー ク 的 な相 互 作 用 が も っ
と深 く理 解 され るよ うにな る。 概 念 的 に似 た 試 み が,前
記 のtwo-hybridシ
*12 ス テ ム*12を 用 い て 酵 母 プ ロ テオ ー
蛋 白 質 複 合 検 出 シ ステ ム の こ と。
*13 新 しい 技術 が 必 要 な い に して も,標 的 蛋 白質 を そ れ と強 い ア フ ィニ テ ィ ー を もつ分 子 で ハ イ ブ リダ イ ズ した ビー ズ を用 い る プ ロ
テ オ ミ クス(bead
proteomics)や,2次
分 析 計 に 導 こ う とい う考 え方(micro-tip
2220
元 電 気 泳 動 ゲ ル の 代 わ りに マ イ ク ロ チ ップ上 で泳 動 させ か つ 消 化 反 応 を させ て 直 接 質 量
proteomics.)も
出て きている。
61
製薬企業にお けるプロテ オー ム解析
文
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