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博士 （保健学） 学位論文 ヒト白血病細胞に対するスピルリナ抽出物
博士 （保健学） 学位論文 論文題目 ヒト白血病細胞に対するスピルリナ抽出物フィコシアニンの 分化誘導作用 Effect of Phycocyanin, one of the Extracts of Spirulina , on Differentiation of Human Myeloid Leukemia Cells 2010 年 指導教員 林 修 石井 恭子 ISHII, Kyoko 女子栄養大学 教授 要旨 骨 髄 幹 細 胞 は 、マ ク ロ フ ァ ー ジ や 顆 粒 球 な ど の 成 熟 細 胞 に 分 化 す る 性 質 を 持 つ 未 分 化 な 細 胞 で あ る 。し か し な が ら 、分 化 過 程 が ブ ロ ッ ク さ れ る な ど し て 正 常 な 増 殖 が 逸 脱 し た 場 合 、最 終 分 化 細 胞 に な る 前 に 細 胞 は 癌 化 、す な わ ち 白 血 病 化 す る 。こ れ ら 未 分 化 な 白 血 病 細 胞 に つ い て は 、 全 ト ラ ン ス 型 レ チ ノ イ ン 酸 ( AT R A ) 、 ビ タ ミ ン D 3 、 ホ ル ボ ル エ ス テ ル ( T PA ) の よ う な 化 学 物 質 等 に よ り 多 機 能 に 分 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。そ れ ら の ひ と つ で あ る β カ ロ テ ン の 代 謝 物 の AT R A は 、 急 性 前 骨 髄 球 性 白 血 病 細 胞 (APL)に 対 す る 治 療 の 一 つ 、 レ チ ノ イ ン 酸 療 法 と し て 導 入 さ れ て いる。 本 研 究 は 、藍 色 細 菌 に 属 す る ス ピ ル リ ナ ( S p i r u l i n a p l a t e n s i s ) の 抽 出 物 の 一 つ で あ る フ ィ コ シ ア ニ ン (Phyco; Phycocyanin) に 着 目 し た 。 フ ィ コ シ ア ニ ン は 、 ク ロ ロ フ ィ ル や β -カ ロ テ ン と と も に ス ピ ル リ ナ に 比 較 的 豊 富 に 含 ま れ る 270-kDa の 光 合 成 色 素 タ ン パ ク 質 で あ る 。ス ピ ル リ ナ 乾 燥 重 量 の 約 1 5 % を 占 め る 。6 1 5 nm に 強 い 最 大 吸 収 波 長 を 持 ち 、 主 に 、 食 品 や 化 粧 品 の 天 然 着 色 料 と し て 利 用 さ れ て い る 。近 年 、フ ィ コ シ ア ニ ン が 、抗 酸 化 作 用 や 抗 炎 症 作 用 、リ ン パ 球 の 活 性 化 、粘 膜 免 疫 シ ス テ ム の 機 能 を 高 める等の作用を持つことが明らかになってきた。しかしながら、 フィコシアニンの白血病細胞に対する分化誘導作用については 報 告 が 少 な い 。本 研 究 で は 、フ ィ コ シ ア ニ ン で 刺 激 し た ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) が 未 熟 な 白 血 病 細 胞 に 対 し て分化誘導能を持つか否か、およびその分化方向性を検討した。 1 用 い た 白 血 病 細 胞 は 、ヒ ト 単 球 性 白 血 病 細 胞 株 U 9 3 7 細 胞 ( 単 球 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 へ 分 化 )と 前 骨 髄 球 性 白 血 病 細 胞 株 HL-60 細 胞 (顆 粒 球 系 ま た は 単 球 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 へ 分 化 )で あ る 。 本 論 文 は U937 細 胞 と HL-60 細 胞 に 対 す る フ ィ コ シ ア ニ ン の 直 接 あ る い は 間 接 の 分 化 誘 導 効 果 に つ い て 比 較 検 討 し た 。分 化 誘 導 刺 激 に は 、フ ィ コ シ ア ニ ン で 刺 激 し た ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)を 用 い た 。被 験 者 か ら の 末 梢 血 採 血 に つ い て は 、香 川 栄 養 学 園 医 学 倫 理 委 員 会 の 承 認 を 得 ( 香 倫 委 第 11 3 号 ) 、 被 験 者 に 文 書・口 頭 に て 実 験 概 要 を 説 明 し た 後 、そ の 同 意 を 得 た 。 末 梢 血 単 核 球 の 分 離 お よ び そ れ ら の 培 養 に よ り 得 ら れ た P h y c o - C M を U 9 3 7 あ る い は H L - 6 0 細 胞 と と も に 培 養 後 、細 胞 数 の 測 定 、フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 法 を 用 い た 表 面 抗 原 の 検 索 、形 態 学 的 分 類 、細 胞 化 学 的 検 討 等 を 実 施 し 、分 化 誘 導 刺 激 に よ り ど の 方向にどの段階まで分化成熟しているかを検討した。この結果、 Phyco-CM は 、 U937 細 胞 に 対 し て 対 照 と し て 用 い た 無 刺 激 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 で あ る Cont-CM に 比 較 し て 細 胞 増 殖 の 抑 制 傾 向 を 示 し 、有 意 差 は み ら れ な い も の の 約 3 倍 の 細 胞 表 面 CD14 抗 原 の 発 現 お よ び 高 い エ ス テ ラ ー ゼ 活 性 を 示 し た 。 Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 は 、 形 態 学 的 観 察 に お い て も 約 57 % の 単 球 と マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 形 態 を 示 し た 。フ ィ コ シ ア ニ ン 単 独 刺 激では、細胞増殖については抑制よりもむしろ増加傾向を示し、 細 胞 表 面 CD14 抗 原 陽 性 細 胞 率 は 、 無 刺 激 Cont の 約 2 倍 で あ っ た 。形 態 学 的 分 類 で は 、成 熟 細 胞 へ の 分 化 は ほ と ん ど み ら れ な か っ た 。H L - 6 0 細 胞 に つ い て は 、い ず れ の 刺 激 に お い て も 細 胞 表 面 CD14 抗 原 の 陽 性 細 胞 率 は 低 く 、 こ れ ら の 値 は U937 細 胞 に 比 較 2 し て 低 値 で あ っ た 。 形 態 学 的 観 察 で は 、 Phyco-CM 刺 激 に よ り H L - 6 0 細 胞 は 単 球 系 と 顆 粒 球 系 細 胞 の 混 在 を 示 し た が 、顆 粒 球 系 細 胞 に お い て 陽 性 を 示 す 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 に つ い て は 、ほ と ん ど 陽 性 で あ っ た 。 フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 HL-60 細 胞 で は 、 形 態 学 的 観 察 に お け る 成 熟 細 胞 の 割 合 は 2 %で あ っ た 。 次 に 、 分 化 誘 導 後 の 各 細 胞 に Lipopolysaccharides (LPS)を 添 加 し 、自 然 免 疫 系 で 働 く マ ク ロ フ ァ ー ジ や 樹 状 細 胞 に お い て 病 原 体 を 認 識 し そ の 応 答 シ グ ナ ル を 伝 達 す る 働 き を し て い る To l l - l i k e r e c e p t o r 4 ( T L R 4 ) 発 現 の 有 無 を 推 測 す る た め に サ イ ト カ イ ン T N F - α 量 を 測 定 し た 。そ の 結 果 、P h y c o - C M は 、U 9 3 7 と HL-60 細 胞 の 両 方 に つ い て 、 分 化 誘 導 刺 激 後 の 培 養 上 清 中 TNFα 量 を 高 め た が 、L P S 刺 激 に 応 答 し た 有 意 な 増 加 は み ら れ な か っ た 。フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 で は U 9 3 7 、H L - 6 0 細 胞 と も に L P S の 添 加 に 関 係 な く TNF-α 量 は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た 。 以 上 の こ と か らフィコシアニンの未熟な白血病細胞に対する分化誘導作用は、 直 接 的 よ り も 間 接 的 に 働 き 、 Cont-CM よ り も フ ィ コ シ ア ニ ン で 刺 激 す る こ と で よ り 分 化 誘 導 作 用 を 高 め る こ と が 示 唆 さ れ た 。さ ら に 、 Phyco-CM 刺 激 後 の 細 胞 に お い て 、 特 に U937 細 胞 に お い て は 単 球 、マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 へ 分 化 誘 導 し た こ と が 示 唆 さ れ た が 、 こ れ ら 細 胞 の LPS 応 答 性 は 低 い か あ る い は 持 た な い こ と が示唆された。 Phyco-CM は 、 分 化 誘 導 因 子 と し て 、 高 濃 度 の IFN-γ お よ び GM-CSF を 含 有 し て い た 。 本 研 究 の 結 果 か ら 、 IFN- γ お よ び GM-CSF、 あ る い は そ れ ぞ れ が 、 U937 細 胞 と HL-60 細 胞 の 一 部 を単球、マクロファージ系へ分化したことが推測された。 3 以上の結果から、フィコシアニンは、リンパ球等に働きかけ、 白血病細胞のような未熟な細胞を正常な細胞へ分化するように 促す手助けをする可能性が示唆された。 4 目次 ヒ ト 白血 病 細胞 株 U937 細胞 およ び HL-60 細胞 にお よ ぼす フィ コシ ア ニ ン 刺 激ヒ ト 単核 球培 養上 清 (Phyco-CM)の分 化誘 導 作用 ············ 1 第1節 序論 ················································ 1 第2節 材料 と方 法 ·········································· 4 1. ヒ ト白 血 病細 胞 株 ······································· 4 1) U937 細胞 ············································· 4 2) HL-60 細胞 ············································ 4 2. フ ィコ シ アニ ン (Phyco; Phycocyanin) ···················· 5 3. ヒ ト末 梢 血単 核 球細 胞の 分 離 ····························· 6 4. フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)の 調 製 ······················································ 6 5. 分 化誘 導 作用 の 測 定 ····································· 7 1) 陽 性 対照 ·············································· 7 1)-1 ホル ボ ルエ ス テル (PMA) ····························· 7 1)-2 全ト ラ ンス 型 レチ ノイ ン 酸 (ATRA) ···················· 7 2) 分 化 誘導 ·············································· 7 3) 細 胞 増殖 およ び 生存 率の 測 定 ··························· 8 4) フ ロ ーサ イト メ トリ ー (FCM; Flow cytometric)法を 用 いた 細 胞表 面抗 原 の測 定 ······································ 8 5) 形 態 学的 分析 ········································· 10 6) 細 胞 化学 的検 討 ······································· 11 6)-1 非特 異 的お よ び特 異的 エ ステ ラー ゼ染 色 ·············· 11 6)-2 Nitro bule tetrazolium (NBT) 還 元能 試験 ············ 11 i 6. Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 と HL-60 細 胞 に お け る Lipopolysaccharides (LPS)応答 性 ······················· 12 1) オ プ ソニ ン処 理 latex beads (opsonin-treated LB)貪食 能 · 12 2) Phyco-CM 刺激 U937、 HL-60 細胞の TNF-α 量産 生 ······ 13 7. フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サ イト カイ ン の検 出 ···································· 13 1) ヒ ト 末梢 血単 核 球浮 遊液 試 料の 細胞 分類 ················ 13 2) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サ イト カイ ン の検 出 ····································· 14 8. 統 計解 析 ·············································· 15 第3節 1. 結果 ··············································· 15 分 化誘 導 作用 ·········································· 15 1) 増 殖 曲線 およ び 生存 率 ································· 15 2) FCM 法 によ る細 胞表 面抗 原 の測 定 ······················ 15 3) 形 態 学的 変化 ········································· 18 4) 細 胞 化学 的変 化 ······································· 19 2. Phyco-CM 刺激 U937 細胞と HL-60 細胞 にお ける LPS 応答 性 ··················································· 20 1) opsonin-treated LB 貪食 能 ····························· 20 2) Phyco-CM 刺激 U937、 HL-60 細胞の TNF-α 量産 生 ······ 20 3. フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) 中 サイ トカ イ ンの 検出 ··································· 21 1) ヒ ト 単核 球浮 遊 液試 料の 細 胞分 類 ······················ 21 2) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) 中 サイ トカ イ ンの 検出 ··································· 21 ii 3) ヒ ト 末梢 血単 核 球培 養上 清 試料 (Phyco-CM、Cont-CM)中サ イ トカ イン と 分類 細胞 との 関連 ··························· 21 第4節 考察 ··············································· 22 図 表 ························································· 33 謝 辞 ························································· 54 参 考 文献 ····················································· 55 iii ヒ ト 白 血 病細 胞 株 U937 細 胞お よ び HL-60 細 胞に お よ ぼす フィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒト 単 核 球 培養 上 清 の分 化 誘 導 作用 第1節 序論 骨 髄 幹 細 胞は 、 マク ロフ ァ ー ジや 顆 粒 球 など の 成 熟細 胞 に 分 化す る 性 質 を 持 つ 未分 化 な 細 胞で あ る 。し か し な がら 、 分 化過 程 が ブ ロッ ク され る な ど し て正 常 な 増 殖が 逸 脱 した 場 合 、 最終 分 化 細胞 に な る 前に 細 胞は 癌 化 、す な わち 白 血 病化 す る 1) 。 こ れ ら 未分 化 な 白血 病 細 胞 につ い て は、 全 ト ラ ン ス型 レ チ ノ イン 酸 、 ビ タミ ン D 3 (1α , 25-dihydroxyvitamin D 3 )、 ホル ボ ル エス テル (TPA; 12- o -tetradecanoyl phorbol-13 acetate) の よ う な 化学 物 質 等 によ り 多 機能 に 分 化 する こ と が報 告 さ れ てい る 2, 3) 。 そ れ ら の ひと つ で あ るβ カ ロ テン の 代 謝 物の ATRA は、急 性 前骨 髄 球性 白 血 病 細 胞 (APL)に 対す る 治 療の 一 つ、レチ ノ イ ン酸 療 法 と して 導 入 さ れ て い る 。白 血 病細 胞に は 分 化能 が あ り 、in vitro だ け で なく 、in vivo (白 血 病 患 者 )に お い て も 成 熟 細 胞 に 分 化 し 得 る 能 力 は 持 つ 。 1981 年 に in vitro で APL 細 胞 の み が ATRA に 反 応 し 、 最 終 分 化 (Terminal differentiated cell)する こ と が報 告 さ れ た 4) 。そ の 後 、 1991 年 に Chen ら 5) に より ATRA が 重大 な 副 作用 も なく APL 患 者の 80 ％ 以 上を 単 独 で 分 化 誘 導 し、 寛 解 導 入に 成 功 した こ と が 示さ れ た 。こ の 報 告 によ り 白血 病 が 分 化 誘導 に よ っ て治 療 で きる こ と が 示さ れ た 。 本 研 究 で は、スピ ル リナ 抽 出 物の 一 つ で あり 、クロ ロ フィ ル やβ -カ ロ テ ン と と も に 比 較 的 豊 富 に 含 ま れ る 270-kDa の 光 合 成 色 素 タ ン パ ク 質 フ ィ コ シ アニ ン (Phyco; Phycocyanin)に 着目 し た 。フ ィ コ シ アニ ン は 、 ス ピ ル リ ナ乾 燥 重 量 の約 15 %を 占 める 1 6, 7) 。 615 nm に 強い 最大 吸 収 波 長を持ち、主に、食品や化粧品の天然着色料として利用されている。 Shinohara ら 8) は 、 植物 性 の 食品 と し て 利用 さ れ てい る サ イ ココ ッ カス や ス ピ ル リナ な ど の 好熱 性 藍 藻類 の 抽 出 液が ヒ ト 由来 の リ ン パ芽 球 様細 胞 な ど の 増殖 を 促 進 し、 そ の 活性 の 中 心 が光 合 成 色素 の フ ィ コシ ア ニン タ ン パ ク であ る こ と を明 ら か にし た 。 健 康補 助 食 品と し て 市 販さ れ てい る ス ピ ル リナ の 成 分 のひ と つ であ る フ ィ コシ ア ニ ンや 食 品 で ある 野 菜等 の 成 分 な どが 、 未 分 化の 白 血 病細 胞 に 対 して 分 化 誘導 す る こ とに よ り、 発 が ん 防 止や 成 熟 細 胞へ の 分 化促 進 を 期 待で き る 。Kobori ら 9, 10) は 、ホ ウ レ ン 草 抽出 液 中 の 高分 子 画 分が ヒ ト 白 血病 細 胞 の形 態 変 化 を誘 導 し細 胞 を マ ク ロフ ァ ー ジ へ分 化 誘 導す る こ と や、 ホ ウ レン 草 の 非 透析 物 によ る 前 骨 髄 球 性 白 血 病 細 胞 HL-60 細 胞 の 単 球 へ の 分 化 お よ び ヒ ト 単 球 性 白 血 病 細胞 U937 細 胞の 単 球 /マク ロ フ ァー ジ 系 への 分 化 に つい て 示 して いる。 一 方 、Chiao ら 11) は 、ヒ ト 末 梢血 リ ンパ 球培 養 上 清 (CM; lymphocyte conditioned medium)が、 前 骨 髄球 性 白 血病 細 胞株 HL-60 細胞 を 単 球 、 マ ク ロ フ ァー ジ 様 細 胞へ 分 化 させ る こ と を示 し た 。こ の 報 告 によ れ ば、 30 %CM 加 RPMI 培 地と と も に培 養 し た HL-60 細 胞 の 28 %が 3 日 目 で 、 96 %が 8 日 目 でマ ク ロフ ァ ー ジ様 形 態 を 示し て い る。また U937 細胞 に つ い て も 、リ ン パ 球 の産 生 す るサ イ ト カ イン に よ り活 性 化 マ クロ フ ァー ジ に 分 化 する こ と が 知ら れ て いる 12) 。こ の分 化 成 熟の 要 因 と して 、活 性 化 T リ ンパ 球 に より CM 中に 放 出 され た 成熟 因 子 の存 在 を 示 唆し て い る 。 動 物 実 験 にお い て 、 熱水 抽 出 物、 フ ィ コ シア ニ ン 、細 胞 壁 成 分の 各 スピ ル リ ナ 試 料を 5 週 間 摂取 し た マウ ス の 末 梢血 液 に おい て 、好 中球 と リ ン パ 球 割 合 の増 加 が 観 察さ れ た 13) 。ま た 、フィ コ シ アニ ン と 他 のス ピ ルリ ナ 抽 出 物 を含 む 飼 料 を摂 取 さ せた マ ウ ス にお い て 、骨 髄 細 胞 の増 加 作用 2 と 脾 臓 細 胞を 培 養 し て得 た 上 清に よ る コ ロニ ー 形 成活 性 の 誘 導作 用 が報 告 さ れ て いる 14, 15) 。これ ら の こと か ら、スピ ル リ ナ成 分 が 骨 髄細 胞 の よ う な 未 熟 な細 胞 を 成 熟細 胞 に 分化 誘 導 す るこ と が 期待 さ れ る が、 そ の報 告 は 少 な い。 フ ィ コ シア ニ ン でヒ ト 末 梢 血単 核 球 細胞 を 刺 激 する こ とに よ り 、 リ ン パ 球 等 を 活 性 化 し 、 CM 中 の 成 熟 因 子 の 産 生 を 促 進 し 、 CM と 同 等 あ るい は そ れ 以上 に 未 熟な 白 血 病 細胞 の 分 化を 促 進 す るこ と が期 待できる。 本 研 究 は 、ス ピ ルリ ナの 抽 出 物の 一 つ で ある フ ィ コシ ア ニ ン で刺 激 し た ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)の 未 熟 な 白 血 病 細 胞 に 対 す る 分 化 誘導 能 の 有 無と そ の 分化 方 向 性 を検 討 し たも の で あ る。 細 胞の 分 化 に つ いて 検 討 す るう え で 重要 な こ と は、 増 殖 が抑 え ら れ てい る か、 最 終 分 化 細 胞 (Terminal differentiated cell)に 特 異 的 な 機 能 が 発 現 し て い る か 否 か、 で あ る 。 Phyco-CM 刺 激 U937、 HL-60 細 胞を 用い て 、 分 化 誘 導 に 関す る 実 験 項目 (表 1.)、すな わ ち細 胞 数 の測 定、フ ロー サ イ ト メ ト リ ー 法を 用 い た 表面 抗 原 の検 索 、 形 態学 的 分 類、 細 胞 化 学的 検 討を 実 施 し 、 分化 誘 導 刺 激に よ り どの 方 向 に どの 段 階 まで 分 化 し てい る かを 推 測 し た 。 同 時 に、 分 化誘 導 後 の 各 細胞 に Lipopolysaccharides (LPS) を 添 加 し 、自 然 免 疫 系で 働 く マク ロ フ ァ ージ や 樹 状細 胞 に お いて 病 原体 を 認 識 し そ の 応 答 シ グ ナ ル を 伝 達 す る 働 き を し て い る Toll-like receptor 発現 の 有 無 を推 測 す るた め に サ イト カ イン TNF-α 量を 測 定し た 。 さ ら に、 Phyco-CM 中 の U937、 HL-60 細 胞 に 対す る 分 化誘 導 因 子 の 存 在 に つい て 検 索 する た め に、 Phyco-CM 中 サ イト カ イン の測 定 を 行 い 、 フ ィ コシ ア ニ ン のリ ン パ 球等 に 対 す る活 性 に つい て 検 討 した 。 3 第2節 材料と方法 １ ． ヒ ト 白血 病 細 胞 株 1) U937 細 胞 U937 細胞 株 (JCRB9021)は 、ヒ ュ ー マン サイ エ ン ス研 究 資 源 バン ク (財 団 法 人 ヒ ュー マ ン サ イエ ン ス 振興 財 団 、大阪 )よ り入 手 した 。U937 細 胞 は 、 単 球 性白 血 病 細 胞で 、 組 織球 性 リ ン パ腫 患 者 の胸 水 か ら 得ら れ 、ウ プ サ ラ 大 学の Sundstrom と Nilsson に よ って 1976 年に 樹 立 され た 16) 。 単 球 様 細 胞 の 形 態 を 示 し 、 リ ゾ チ ー ム 産 生 、 フ ッ 化 ナ ト リ ウ ム (NaF)に よ っ て わ ずか に し か 阻害 さ れ ない 非 特 異 的エ ス テ ラー ゼ 活 性 を保 持 し、 Fc 受 容 体お よ び C3 受容 体 陽 性で あ る こ とが 知 ら れて い る。ファ ゴ サ イ ト ー シ ス (貪 食 )も 観 察さ れ る 。リ ン パ 球 の産 生 す るサ イ ト カ イン に よ り 、 U937 細 胞は 活 性化 マク ロ フ ァー ジ に 分 化す る こ とが 知 ら れ てい る 表 面 免 疫 グロ ブ リ ン 、ア ル カ リ性 ホ ス フ ァタ ー ゼ など は 陰 性 であ る 12) 。 17) 2) HL-60 細胞 HL-60 細 胞 株 (JCRB0085)は 、 ヒ ュ ー マ ン サ イ エ ン ス研 究 資 源 バ ンク (財 団 法 人 ヒ ュ ー マ ン サ イ エ ン ス 振 興 財 団 、 大 阪 )よ り 入 手 し た 。 前 骨 髄 球 性 白 血 病 細 胞 で 、 急 性 前 骨 髄 性 白 血 病 細 胞 (APL)の 患 者 の 末 梢 血 か ら 得 ら れ 、 アメ リ カ 国 立ガ ン 研 究所 の Gallo グル ー プ によ っ て 1979 年 に 樹 立 さ れた 18) 。前 骨 髄球 様 細 胞が 90%以 上を 占 め、若 干の 骨 髄芽 球・顆 粒 球 様 細 胞が み ら れ る 。HL-60 細胞 は 、用い る 分 化誘 導 物 質 によ り 、顆 粒 球 な い し単 球 ・ マ クロ フ ァ ージ 様 細 胞 の二 方 向 性を 示す 19) 。 継 代 培 養 に つ い て は 、 300 mg/mL L-Glutamine 、 2,000 mg/mL NaHCO 3 、100 U/mL penicillin、 100 g/mL streptomycin お よび 10%不 活 性 化 ウ シ胎 児 血 清 (FBS; fetal bovine serum, GIBCO Lab., NY)を 添加 4 し た RPMI-1640 メ ディ ウ ム (日 研 生物 医学 研 究 所、 京 都 ) (RPMI-FBS) を 用 い た 。 細 胞 保 存 液 セ ル バ ン カ ー (十 慈 科 学 工 業 株 式 会 社 )に 懸 濁 し 、 −80℃ フ リ ーザ ー 内 に保 存 し てあ る U937 お よ び HL-60 細 胞 各 1 mL を 溶 解 後 、RPMI-FBS を 10 mL 加 えた 培 養フ ラ ス コ (25 cm 2 flask, 住 友 ベ ー ク ラ イ ト社 )に入 れ、37℃、5%CO 2 イ ンキ ュ ベ ータ ー に て 培養 し た。3 ∼ 4 日 に 一度 の 割合 で、 2∼ 3 mL の細 胞浮 遊 液を 8 mL の 新鮮 な 培 地に 移 す こ と によ っ て 継 代培 養 し た。 ２ ． フ ィ コシ ア ニ ン (Phyco; Phycocyanin) ス ピ ル リ ナ ( Spirulina platensis )の 乾燥 菌体 か ら 50 mM リ ン酸 緩 衝 液 (pH 6.0)に て 20℃ 、16 時間 抽 出し 、フ ィ コシ ア ニ ン粗 抽 出 物 を得 た 13) 。 こ の 粗 抽 出物 10g を 30 mM リ ン 酸カ リウ ム 緩 衝液 (pH 6.0) 250 mL に 溶 解 し 、 4 %フ ィ コ シ ア ニ ン 粗 抽 出 物 溶 液 と し た 。 そ こ に 、 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 20 %濃度 にな る よ うに 加 え、沈殿 し た タン パ ク 質 を 7,000 rpm、 30 分間 遠 心分 離 し た。 こ の 上清 に さ ら に硫 酸 ア ンモ ニ ウ ム を 60 %にな る よ う に 加え 、 7,000 rpm、30 分 間遠 心 分離 し 、 タン パ ク 質 を沈 殿 さ せ た 。 こ の タン パ ク 質 沈殿 物 に はフ ィ コ シ アニ ン を 含む 。 こ れ をリ ン 酸カ リ ウ ム 緩 衝液 に 再 度 溶解 、 透 析し 硫 酸 ア ンモ ニ ウ ムを 除 去 し た。 透 析内 液 は 、 DEAE-セ ル ロ ー ス -DE-52 イ オ ン 交 換 カ ラ ム クロ マ ト グ ラ フ ィー に か け て 0.1M KCl 溶出 画 分 を採 取 し た 。こ の 溶 出画 分 に つ いて 、 再度 硫 酸 ア ン モニ ウ ム と 透析 を 繰 り返 し、純 度 80 %以 上 の フィ コシ ア ニ ンを 得 た 。フ ィ コシ ア ニ ン粗 抽 出物 10 g か ら 0.6 g の精 製 品 が 得ら れ た 。こ の 標 品は DIC 株 式 会社 よ り 供与 さ れ た 。こ の フィ コ シア ニ ン粉 末を PBS (-)に て 10 mg/mL 濃 度に な る よう に 溶 解 した 後 、 0.45 μ m pore size デ ィ ス ク フ ィル タ ー に て濾 過 滅 菌し 、ス ト ック 液 と した 。実 験 には PBS (-) に て 適 宜 希釈 し た も のを 用 い た。 な お 、 本研 究 で 用い た フ ィ コシ ア ニン 5 に つ い て は、 開 環 テ トラ ピ ロ ール 構 造 を 持ち 、 A 環で タ ン パ ク質 サ ブユ ニ ッ ト と 共有 結 合 し てい る 1 量体 の フィ コシ ア ニ ンが 、 3 個 会合 し 3 量 体 を 形 成 し て い る C-フ ィ コ シ ア ニ ン (分 子 量 138,000) 20, 21) で あ る (図 1.)。 ３ ． ヒ ト 末梢 血 単 核 球細 胞 の 分離 無 菌 的 に 採取 し た 健 常者 7 名か ら 得た 末 梢血 を 、PBS (-)にて 2 倍希 釈 し 、 リ ン パ球 比 重 分 離液 (比 重 1.077 g/mL、 NYCOMED) 5 mL に 重層 し 、 遠 心 (800g、30 分) 分離 し て 分 離液 と 血漿 の 間 にあ る 単 核 球層 を 回 収 し て ヒ ト末 梢 血 単 核球 細 胞 (PBMCs; peripheral blood mononuclear cells)を 得た 。PBMCs 層に 0.83 %塩化 ア ンモ ニ ウ ム・トリ ス 緩衝 液 を 加 え 、 赤 血 球を 除 去 し た後 、 PBS (-)で 遠 心洗 浄 し 、 RPMI-FBS にて 各 被 験 者 の PBMCs 1×10 6 cells/mL 浮 遊液 を調 製 し た。 被 験 者 か らの 末 梢 血 採取 に つ いて は 、香 川栄 養 学 園医 学 倫 理 委員 会 の 承 認 を 得 (香倫 委第 113 号 )、被 験 者に 文 書・口頭 に て実 験 概 要を 説 明 し た 後 、 そ の同 意 を 得 た。 ４ ． フ ィ コシ ア ニ ン 刺激 ヒ ト 単核 球 培 養 上清 試 料 (Phyco-CM)の 調 製 上 述 ３ ． で得 た ヒ ト 単核 球 浮 遊液 (1×10 6 cells/mL)を 、 24 ウェ ル マ イ ク ロ プ レー ト (24-well culture plate、 CORNING、 Cat. No. 3526)1 ウ ェ ル あ たり 1 mL ずつ 播 種 し、 2 mg/mL フィ コ シ アニ ン を 0.1 mL ず つ 添 加 して 37℃ 、5 %CO 2 条 件下 にて 7 日間 培 養 した 後 、培 養上 清 試 料 (Phyco-CM)を得 た 。比 較対 照 と して 単 核球 浮 遊 液に RPMI-FBS 0.1 mL を 添 加 し 、 培 養 上 清 試 料 (Cont-CM)を 得 た 。 各 ウ ェ ル の 単 核 球 培 養 上 清 試 料 は 、0.45μm pore size ディ ス クフ ィ ルタ ー (IWAKI GLASS、Code 2053-025)に て細 胞 除去 と と もに 濾 過 滅 菌し た (図 2.)。こ の もの は、使 用 時 ま で −80℃保 存 と した 。 6 ５ ． 分 化 誘導 作 用 の 測定 1) 陽性 対 照 陽 性 対 照 とし て 次 の 試薬 を 用 いた 。 1)-1 ホル ボ ル エス テ ル (PMA; phorbol-12-myristate-13-acetate 、 和 光 純 薬 工 業 、 No. 545-00261) ホ ル ボ ル エス テ ル (PMA)は、 分 子式 C 35 H 55 O 8 、 分子 量 616.84、水 難 溶 性 、 有 機溶 媒 に 可 溶の 無 色 物質 で あ る 。 1 mg を dimethyl sulfoxide (DMSO) 1mL に 溶 解し て ス トッ ク 溶 液 とし た 。 この も の を RPMI-FBS に て 500 倍 希 釈 し て 2 μ g/mL 濃 度 で 用い た 。 1)-2 全ト ラ ン ス型 レ チノ イ ン 酸 (ATRA; all- trans retinoic acid、 SIGMA、 No. R-2625) 全 ト ラ ン ス型 レ チ ノ イン 酸 は 、分 子式 C 2 H 28 O 2 、分 子量 300.44、脂 溶 性 、黄 色粉 末 物質 で ある 。15 mg を 純 ア ルコ ー ル 10 mL に 溶解 し て 5 mM ス ト ッ ク 溶 液 と し 、 こ れ を 適 宜 純 ア ル コ ー ル に て 1 mM と し て 用 い た 。 2) 分化 誘 導 25 cm 2 flask に て 3 日間 前 培 養し た U937 あ る い は HL-60 細 胞を 集 め て 、 遠 心 、洗 浄 後 、 RPMI-FBS に て 0.5×10 6 cells/mL 浮 遊 液と し た 。 24 ウェ ル マイ ク ロ プレ ー ト 1 ウ ェ ルあ たり U937 ある い は HL-60 細 胞 懸 濁 液 を 1 mL ず つ 分注 し 、 37℃、 5 %CO 2 イ ン キュ ベ ー タ ーに て 3 日 間 分 化 誘 導 刺 激 し た 。 す な わ ち 、 ① 無 刺 激 対 照 (Cont) 群 と し て RPMI-FBS を 0.1 mL/well、 ② 比較 対 照 群と し て フィ コ シ ア ニン 無 刺 激 単 核 球 培養 上 清 (Cont-CM)を 0.1 mL/well、 ③実 験 試 料 群 と し て フィ コ シ ア ニ ン 刺激 単 核 球 培養 上 清 (Phyco-CM)を 0.1 mL/well、 ④ 陽性 対 照 群 と し て PMA 2μ g/mL あ る い は ATRA 1mM を そ れぞ れ 10μ L/well 加 え 7 た 。 分 化 誘導 刺 激 後 、各 ウ ェ ル中 の 細 胞 をそ れ ぞ れ小 試 験 管 に回 収 し、 PBS (-)にて 遠 心 洗 浄 (1,300 rpm、 5 分 )後 、 各分 化 誘導 作用 の 測 定に 用 い た (図 3.)。 3）細 胞 増 殖お よ び 生存 率 の 測定 2）に 従 い 、分 化 誘 導刺 激 後 に回 収 し 、 PBS (-)にて 遠 心洗 浄し た 細 胞 の 一 部 を 用い て 、 そ れぞ れ の 分化 誘 導 刺 激細 胞 に おけ る 細 胞 数の 算 定及 び 生 存 率 の算 出を 0.25 %ト リパ ン ブ ルー 染色 液 を 用い て 行 っ た 。分 化 誘 導 刺 激 後 、 1、2、3、4、5、7 日 目に 細 胞を 回 収 し、 生 細 胞 (無染 色 )、 死 細 胞 (青 染 色 )を ビ ル ケ ル チ ュ ル ク の 計 算 盤 に て 計 数 し 、 細 胞 生 存 率 (%)を算 出 し た 。同 時に 細 胞 数を 算 出 し た 。な お 、細 胞回 収 時に 24 ウ ェ ル マ イ ク ロプ レ ー ト への 付 着 が見 ら れ た 細胞 に つ いて は 、 セ ルス ク レイ パ ー (CELL SCRAPER、TPP®、 Cat. No. 99002)を 用い て 回 収し た 。 4) フロ ー サ イト メ トリ ー (FCM; Flow cytometric)法を 用 いた 細 胞 表 面 抗 原 の 測定 蛍 光 抗 体 染色 に つ い ては 以 下 のも の を 用 いた 。 細 胞表 面 抗原 につ い て は 、 分 化 誘導 刺 激 後 の各 細 胞 がど ち ら の 方向 に ど の段 階 ま で 分化 誘 導さ れ て い る か推 測 す る ため に 骨 髄系 細 胞 の 成熟 過 程 と表 面 抗 原 の発 現 を参 考 に 選 択 した 22 ) (図 4.)。 ＜U937 細 胞、 HL-60 細胞 共 通＞ 蛍光 標 識 モノ ク ロ ナ ール 抗 体 ： ・ 抗 CD11b-FITC (IO Test、 IM0530、 Clone; BEAR1、 mouse IgG1) ・ 抗 CD15-PE (BD Pharmingen、 555402, Clone; HI98、 mouse IgM κ) ・抗 CD14-FITC (IO Test、IM0645U、Clone; RMO52、mouse IgG2a) 蛍光 標 識 アイ ソ タ イ プコ ン ト ロー ル ： 8 ・mouse IgG2a-FITC (Cyto-stat、6603855、Clone; 7T4-1F5、mouse IgG2a) ・mouse IgG1-FITC (IO Test、PN IM0639、Clone; 679.1Mc7、mouse IgG1) ＜ HL-60 細 胞の み ＞ 蛍光 標 識 モノ ク ロ ナ ール 抗 体 ・ 抗 CD66b-FITC (IO Test、 IM0531、 Clone; 80H3、 mouse IgG1κ ) 蛍光 標 識 アイ ソ タ イ プコ ン ト ロー ル ： ・mouse IgG1-FITC (IO Test、PN IM0639、Clone; 679.1Mc7、mouse IgG1) 蛍 光 抗 体 染色 に つ い ては 、 以 下の 通 り 実 施し た 。 3 日 間 分化 誘導 刺 激 し た U937 あ る いは HL-60 細胞 は 、回 収 、洗 浄 後、 2∼ 3×10 6 cells/mL に 調 製 し 、各 蛍 光 抗 体染 色 に 用い た 。 す なわ ち 、 CD11b と CD66b 抗 原 陽 性 細 胞 を測 定 す る ため に 、洗浄 後の U937 ある いは HL-60 細胞 (2∼3 ×10 6 cells/mL)各 0.1 mL と、 抗 CD11b 抗体 あ る いは 抗 CD66b 抗体 を そ れ ぞ れ 別 の プ ラ ス チ ッ ク 製 試 験 管 (12mmφ×75mm; BECKMAN COULTER)に 15μ L ずつ 添 加し 、4℃ 、30 分間 遮 光し て イ ンキ ュ ベ ート し た 。PBS (-)に て 洗 浄後 、懸濁 し、測 定 試料 と し た。アイ ソ タイ プ コ ン ト ロ ー ル につ い て も 同様 に 蛍 光抗 体 染 色 を行 い 、 刺激 ご と に 用意 し たコ ン ト ロ ー ル試 料 を 用 いて デ ー タ取 得 時 の 閾値 を 決 めた 。 CD15 抗 原 を測 定 す るた め に、洗 浄後 の U937 ある いは HL-60 細胞 (2 ∼ 3×10 6 cells/mL)各 0.1 mL に 、 2 %正常 ヒ ト 血清 (AB 型 ) (Human Serum AB、 GEMINI、No. 100-512)を 添加 し 、 30 分 間 室 温に て イ ンキ ュ ベ ー ト した 。PBS (-)に て 洗 浄 後、抗 CD15 抗体を 15μ L 添 加し 、4℃ 、 30 分間 遮 光し て イ ンキ ュ ベ ート し た 。洗浄 後 、懸濁 し 、測 定 試料 と し た。 9 閾 値 を 決 める た め の アイ ソ タ イプ コ ン ト ロー ル に つい て は、測定 時、PE 標 識 mouse IgM 抗 体が 市 販 され て い な かっ た 。 従っ て 、 分 化誘 導 刺激 に よ り 発 現が 推 測 さ れる Fc レ セ プ ター (FcR)の影 響 を 除く こ と、IgG よ り IgM で 作 ら れ た 抗 体 の 方 が 抗 原 の 凝 集 が 強 い こ と か ら 非 特 異 結 合 の 無 い 状 態 で 測 定 す る た め に 、 抗 体 を 添 加 す る 前 に 正 常 ヒ ト 血 清 (AB 型 ) を 添 加 し た。 閾 値 に つい て は 、刺 激 ご と に無 染 色 の細 胞 を 用 いて 設 定し た。 CD14 抗 原 の測 定 に つい て は 、最 初 に 洗 浄後 の U937 あ るい は HL-60 細 胞 (2∼3×10 6 cells/mL)各 0.1 mL に 、 3%正 常 マウ ス 血 清 (Normal Mouse Serum、WAKO、No.146-06551)を添 加 し、マ ウス IgG2a に 対す る Fc レセ プ ター を 塞ぎ 非 特 異的 結 合 の 無い 状 態 とし た 。次 に 、抗 CD14 抗 体 を 各 試験 管に 15μL 添 加 し 、4℃ 、30 分間 遮 光し て イ ンキ ュ ベ ート し た 。 洗 浄後 、 懸 濁 し、 測 定 試料 と し た 。ア イ ソ タイ プ コ ン トロ ー ルに つ い て も 同様 に 蛍 光 抗体 染 色 を行 い 、 刺 激ご と に 用意 し た コ ント ロ ール 試 料 を 用 いて デ ー タ 取得 時 の 閾値 を 決 め た。 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 法 は 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー (FCM; EPICS® ALTRA™、Beckman Coulter, Inc.、Fullerton、CA)を 用い て検 出 し た。 各 表 面 抗 原の 陽 性 に つい て は 、閾 値 を 越 えた 蛍 光 強度 を 持 つ 細胞 を 陽性 細 胞 と し た。 シ ン グ ルあ る い はダ ブ ル パ ラメ ー タ ーの ヒ ス ト グラ ム は、 ロ グ ス ケ ール を 用 い て示 し た 。デ ー タは 、各 試 料 あた り 5,000 個中 の 陽 性 細 胞 数 およ び 蛍 光 強度 で 表 した 。 5) 形態 学 的 分析 分 化 誘 導 刺激 した U937 および HL-60 細胞 は 、PBS(-)に て 遠心 、洗 浄 後 、2.5×10 5 cells/mL に調 製 し た。 そ の細 胞 懸 濁液 0.2 mL をサ イ トス ピ ン (Shandon Southern Products、Cheshire、England)に て 300 rpm、 10 10 分間 遠 心し て ス ライ ド 標 本と し た。乾燥 後、メ イ グリ ュ ンワ ル ド 液お よ び ギ ム ザ染 色 液 (武藤 化 学 、東 京 )を 用い て 染 色を 行 っ た 。細胞 形 態に つ い て は 、 光 学 顕 微 鏡 下 で 次 の 分 類 に 従 い 、 細 胞 の 成 熟 過 程 を 、 U937 細 胞 に つ い て は 、 1) 単 芽 球 、 2) 前 単 球 、 3) 単 球 、 4) マ ク ロ フ ァ ー ジ の 4 つ に分 類 した (図 5.)。 HL-60 細胞 につ い て は、 1) 芽 球、 2) 中 間 、 3) 成熟 の 3 つに 分 類し た 。 分 類 1)の 芽球 細 胞 は、 骨 髄 芽 球と 単 芽 球を 含 み 、2)の 中間 に つ いて は、前 骨 髄球 と 骨髄 球 を、3)の 成 熟 につ い て は、 後 骨 髄 球 と桿 状 核 球 およ び 分 葉核 球 を 含 んで い る (図 6.)。 6) 細胞 化 学 的検 討 6)-1 非 特 異 的お よ び特 異 的 エス テ ラ ー ゼ染 色 5)で PBS (-)に て 2.5×10 5 cells/mL に 調 製し た 細 胞懸 濁 液 0.2 mL を、 サ イ ト ス ピン にて 300 rpm、10 分 間 遠 心 して 別 に スラ イ ド 標 本を 作 製 し た 。 乾 燥 後 、 U937 細 胞 に つ い て は 、 単 球 系 細 胞 に 強 い 反 応 性 を 示 す α -naphtyl acetate を 基 質 と す る 非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 (NSE; non specific esterase、 武藤 化 学 、東 京 )を 行っ た 。 HL-60 細 胞に つ い ては 、 非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 と 骨 髄 系 細 胞 に 強 い 反 応 性 を 示 す naphthyl AS-D chloroacetate (3-hydroxy 2-naphtoic- o -toluidide chloroacetate) を 基 質 と する 特 異 的 エス テ ラ ーゼ 染 色 (SE; specific esterase、武藤 化 学 、 東 京 ) を 用 いた 二 重 染色 を 行 った 。NSE 陽 性細 胞 は、細 胞 質内 に 暗 赤色 の 顆 粒 を 持 ち 、 SE 陽 性 細 胞 は 、 同 じ く 青 い 顆 粒 を 持 つ 。 染 色 後 の 細 胞 は 、400 倍 で 鏡 検し 、200 個細 胞 中 の陽 性細 胞 数 を計 数 し、陰性 、SE 陽 性 、 SE と NSE ダブ ルポ ジ テ ィブ 、 NSE 陽 性の 4 つ に 分 類 した 。 6)-2 Nitro blue tetrazolium (NBT) 還 元能 試 験 NBT 還 元 能試 験 は 、朝 永 ら 23) の 方法 を参 考 に 実施 し た 。 すな わ ち 、 前 述 5)と 同 様 に、刺 激後 の U937 細 胞と HL-60 細胞 は 、ウェ ルご と に 試 11 験 管 に 回 収し た 。 PBS (-)に て遠 心 洗 浄 後、 RPMI に て 2×10 6 cells/mL に 調 製 し た。こ の細 胞懸 濁 液 1 mL ず つ を 1,300rpm、5 分 間遠 心 し、上 清 を 除 去 して 集 め た 細胞 沈 渣 に、 2 mg/mL NBT (SIGMA-ALDRICH、 No. N6876) 0.1mL と等 量 の PMA 400 ng/mL を それ ぞ れ 添 加し 、37℃ 、 20 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 そ の 後 、 反 応 懸 濁 液 は 、 氷 冷 し 、 PBS(-) を 0.8 mL ず つ加 え た。こ れら を サイ ト スピ ン にて 300 rpm、10 分間 遠 心 し 、 ス ライ ド 標 本 を作 製 し た。 乾 燥 後 、 400 倍 で鏡 検 し 、 200 個の細 胞 中 青 染 色さ れ て い る細 胞 を 陽性 細 胞 と して 計 数 した 。 ６ ． Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 と HL-60 細 胞 に お け る Lipopolysaccharides (LPS) 応答 RPMI に LPS (Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4、 SIGMA、No. L2630) 25 mg を 溶 解し て 10 mg/mL スト ッ ク 溶 液と し た 。 こ の も のを RPMI に て適 宜 希 釈し て 用 い た。 ５ ．2)と 同 様 に、U937 細胞と HL-60 細 胞は 3 日間 、24 ウ ェル マ イ ク ロ プ レ ー トに て 各 刺 激物 に よ り分 化 誘 導 刺激 を 行 った 。 刺 激 後、 各 ウェ ル に LPS (0、1,000 ng/mL)を 添加 し 、 37℃、 5 % CO 2 条 件下 で イ ンキ ュ ベ ー ト した 。60 分 後、各ウ ェ ル の培 養 上清 試 料 を回 収 し、0.45μ m pore size ディ ス ク フィ ル ター (IWAKI GLASS、 Code 2053-025)にて 細 胞 除 去 と と も に 濾 過 滅 菌 し た 。 こ の も の は 、 使 用 時 ま で − 80℃ 保 存 と し た 。 1) オプ ソ ニ ン処 理 latex beads (opsonin-treated LB)貪食 能 貪 食 作 用 を促 進 さ せ るた め の オプ ソ ニ ン 物質 と し て血 清中 IgG 抗体 を latex beads の 表 面 に結 合 さ せた opsonin-treated LB を調 製し た 。 すな わ ち 、 RPMI に 懸濁 した 0.04% latex beads (LB; average diameter 1.1 μ m、 SIGMA)に 、 同じ く RPMI に懸 濁し た 等 量の 10 %正常 ヒ ト 血清 (NHS; Normal Human Serum、CHEMICON INTERNATIONAL、Cat. 12 No. S1-100 mL)を 加え 、 37℃ 、 30 分 間振 盪 (40 rpm/min.)混 和し た 。 使 用 前 に 超音 波 処 理 (10 分 間 )し て beads を分 散 さ せて 用 い た 。 LPS 応 答貪 食 能に つ いて は 、以 下 の 通り 実施 し た。上 記 ５．の操 作 後 に ウ ェ ル の 底 に 残 っ た 細 胞 を 、 ウ ェ ル ご と に 試 験 管 に 回 収 し 、 PBS (-) に て 2 回遠 心 (1,300 rpm、 5 分 間 )洗浄 した 。 opsonin-treated LB を用 い た 貪 食 能の 測 定 は 、 Yamamoto-Yamaguchi et al. 24) の 方 法 を改 変 して 用 い た 。 すな わ ち 、 刺激 後 の U937 細 胞 ある い は HL-60 細 胞 0.5×10 6 cells/mL を そ れ ぞれ 試験 管 に 1 mL ず つ 加え 、遠心 し て 細胞 沈渣 を 得 た 。 こ こ に 先 述し た 0.02% opsonin-treated LB を 1 mL ず つ加 え、 37℃ 、 3 時 間 振 盪 (40 rpm/min.)混 和し た 。PBS (-)に て 、細胞 を 壊さ ない よ う に 注 意 し な がら 3 回 遠 心 、洗浄 後 、細 胞沈 渣に PBS (-)1 mL を 加え た 細 胞 懸 濁 液 を サイ ト ス ピ ンに て 300 rpm、10 分間 遠 心 し 、スラ イ ド標 本 を 作 製 し た 。 乾燥 後 、 メ イグ リ ュ ンワ ル ド ・ ギム ザ 染 色し 、 200 個の 細 胞中 1 個 以 上の LB を 取 り込 ん で いる 細 胞 を 陽性 細 胞 とし て 計 数 した 。 2) Phyco-CM 刺激 U937 細胞 、 HL-60 細 胞の TNF-α 量 産 生 上 記 で 回 収 し た 培 養 上 清 試 料 中 サ イ ト カ イ ン TNF-α 量 は 、 TNF-α /TNFSF1A ELISA Kit for humans TNF-α (Cat. No. DTA001、 R&D Systems、 Minneapolis)を 用 いて 測 定し た。 ELISA Kit の 測 定感 度 は 、 15.6-1,000 pg/mL で あ っ た 。 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Colona Electronics、Japan)で 450 nm と 570 nm 波長 の 吸 光度 差 (OD 450 nm − OD 570 nm)を 測 定し た 。 7． フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サイ ト カ イ ン の検 出 1) ヒト 末 梢 血単 核 球浮 遊 液 試料 の 細 胞 分類 前 述 で 各 被験 者 か ら 同意 を 得 て採 取、調 製し た ヒ ト単 核 球 球 浮遊 液 (1 13 ×10 6 cells/mL)の一 部を 用 い PBS (-)に て 2.5×10 5 cells/mL に希 釈 後 、 サ イ ト ス ピン にて 300 rpm、 10 分 間遠 心し 、 ス ライ ド 標 本 を作 製 し た 。 メ イ グ リ ュン ワ ル ド ・ギ ム ザ 染色 後 、 200 個の 細胞 を 計 数し 、リ ン パ 球 お よ び そ の他 含 ま れ てい る 細 胞の 割 合 を 算出 し た 。 2) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) 中 サ イ ト カイ ン の 検 出 第 2 節材 料 と 方法 3．ヒ ト 末 梢血 単 核 球 の分 離 の 項に 従 い ヒ ト末 梢 血 単 核 球 浮 遊液 (1×10 6 cells/mL)を 調 製 し た 。そ の 後 、第 2 節 材料と方 法 4． フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) の 調 製 に 従い 、 培 養 上清 試 料 を調 製 し た 。同 時 に 別の ウ ェ ル に陽 性 対照 用 と し て Phytohemagglutinin (PHA; Phytohemagglutinin-P、 和光 純 薬 、No. 161-15251) 100μg/mL (PHA-CM)を ヒ ト単 核 球浮 遊液 (1×10 6 cells/mL) 1mL/well あた り 0.1mL ずつ 添加 し た 。 37℃ 、 5%CO 2 イ ンキ ュ ベ ー タ ーに て 7 日 間培 養 し た。各 ウ ェ ルの 単 核 球培 養 上 清 試料 を 0.45 μm pore size デ ィ スク フ ィ ルタ ー (IWAKI GLASS、 Code 2053-025) に て 細 胞 除去 と と も に濾 過 滅 菌し た 。こ のも の は 、使用 時 ま で− 80℃ 保 存 と し た 。こ れ ら 単 核球 培 養 上清 試 料 中 分化 誘 導 サイ ト カ イ ンと し て、 Human Interferon gamma (INF-γ ) (DIF50)、 Human Interleukin 3 (IL-3) (D3000) お よ び Human Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (DGM00) に つ い て 、 ELISA 法 (R&D Systems、 Minneapolis) に て 測 定し た 。そ れ ぞ れの ELISA Kit の 感 度 は 、INF-γ; 15.6-1,000 pg/mL、IL-3; 31.2-2,000 pg/mL、GM-CSF; 7-500 pg/mL で あ っ た 。 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Colona Electronics 、 Japan)で 450 nm と 570 nm 波 長 の 吸 光度 差 (OD 450 nm− 570 nm)を 測定した。 14 8．統 計 解 析 デ ー タ は、平 均値 ±SD で表 し た。統計 解 析は 、StatView J 5.0 (Abacus Concepts、 CA)ソ フ ト ウ ウ ェ ア を 用 い た 。 各 群 間 の 比 較 に は 一 元 配 置 の 分 散 分 析 (ANOVA; One-way Analysis of Variance)を行 い 、多 重 比 較に は 、Bonferroni/Dunn t value を 用 いた 。危険 率 5 %未 満で 有 意差 あ り と した。 第3節 結果 １ ． 分 化 誘導 作 用 1) 増殖 曲 線 およ び 生存 率 無 刺 激 U937 細 胞 (Cont)に おい て 、 培 養 1 日 目と 3 日 目の 細胞 数 は 、 そ れ ぞ れ 0.7×10 6 、1.8×10 6 cells/mL で あっ た 。一方 、Phyco-CM 刺激 U937 細胞 では 、細 胞数 が 0.9×10 6 cells/mL であ り 、増 殖 抑制 が み られ た 。HL-60 細 胞に お いて も 同 様の 傾 向 が みら れ た。Phyco 刺 激で は 、U937、 HL-60 細胞 の い ずれ も増 殖 抑 制は み ら れ なか っ た 。HL-60 細 胞で は 、逆 に 増 加 傾 向を 示 し た (図 7.-a)。 U937、HL-60 細 胞 とも に 、Phyco、Phyco-CM、Cont-CM 刺激 に よ る 培 養 3 日目 の 生存 率 はい ず れ も約 80∼ 90 %であ っ た (図 7.-b)。 2) FCM 法に よ る細 胞表 面 抗 原の 測 定 FCM 法 で は 、 測 定 時 に 細 胞 が レ ー ザ ー 光 を 通 過 す る と き に レ ー ザ ー 光 を 散 乱 させ 、 標 識 した 蛍 光 色素 か ら 蛍 光を 発 す る。 レ ー ザ ーの 散 乱光 は 、 細 胞 表 面 で 生 じ る 表 面 積 に ほ ぼ 比 例 す る 前 方 散 乱 (FS; Forward Scatter)と 、 細胞 内 顆粒 等 で 生じ る 側 方 散乱 (SS; Side Scatter)を 測 定 す る こ と が でき る 。 15 U937 細胞と HL-60 細胞 に おけ る Phyco-CM と他 の 刺激 物を 用 い た CD 抗 原 測 定 時 の FS、 SS の パ タ ー ン 例 を 図 8.に 示 し た 。 図 9.-a に Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 の典 型 的な 細 胞表 面 抗 原の 測 定 パ ター ン を 示 し た 。 U937 細 胞 で は、 Phyco-CM 刺 激 CD14 と CD11b 抗原 に お いて 、 無 刺 激 Cont お よ び Cont-CM 刺 激 に比 較し て パ ター ン の 変 化が 見 ら れた 。 こ れ ら は 、図 8.で 示 した よ うに Phyco-CM 刺 激 にお いて SS の値 、す な わ ち 細 胞 内顆 粒 が 増 加し 、 横 軸の 右 方 に 陽性 細 胞 の出 現 が 見 られ た こと と 一 致 し てい る (図 8.-U937 (4)Phyco-CM)。 ロ グス ケ ール を用 い て ヒス ト グ ラ ム 上に 取 得 さ れる デ ー タの う ち 、 陽性 細 胞 は閾 値 を 越 えた 細 胞と し て 出 現 する 。そ の 蛍光 強 度 が強 い ほ ど 横軸 右 方 に出 現 す る 。Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 にお ける 細 胞 表 面 CD14 抗原 陽 性 細胞 率 (11 ± 3.3 %)は 、 Cont-CM 刺 激と 無 刺激 Cont の 陽 性細 胞率 (各 4.2 ± 2.0 %、3.4 ± 3.2 %) に 比 較 し て約 3 倍 を 示し た (表 2.)。 こ の時 の 蛍 光強 度 (5.6 ± 0.9)は 、 無 刺 激 Cont のそ れ (2.8 ± 0.8)に 比 較し て 有意 な 高 値 (p < 0.01)を 示 し た 。 Phyco 刺 激 U937 細 胞の 細 胞 表面 CD14 抗原 陽 性 細胞 率 (7.5 ± 3.6 %) は 、Cont (3.4 ± 3.2 %)の約 2 倍 であ っ た 。Phyco 刺 激 に おけ る CD14 抗 原 の 蛍 光 強度 は 、い ずれ も Cont と Cont-CM に 比 較 して 有 意 な増 加 は 見 ら れ な か っ た (表 2.)。 Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 に お け る 、 細 胞 表 面 CD11b 抗原 陽 性細 胞率 (18 ± 7.3 %)は、 Cont-CM と Cont の そ れら (各 4.8 ± 2.3 %、3.9 ± 1.0 %)に比 較 し て有 意 な差 は み られ な い も のの 高 値 を 示 し た (表 2.)。こ の とき の 蛍 光強 度 に つ いて は 、Phyco-CM、無刺 激 Cont、 Cont-CM の 間で 差 はみ ら れ なか っ た。顆粒 球 系 細胞 の マ ー カー で あ る細 胞 表 面 CD15 抗 原陽 性細 胞 率 は 、い ず れ の刺 激 に おい て も 低 値で あ っ た が 、 Phyco-CM 、 Cont-CM 刺 激 (各 1.8 ± 0.4 %、 1.5 ± 0.3 %)と もに 無 刺 激 Cont (4.6 ± 2.2 %)に お ける 陽 性 細 胞率 よ り 低値 で あ っ た。 16 Phyco-CM 刺激 HL-60 細胞 に おけ る FS、SS に つ いて は 、無 刺激 Cont に 比 較 し て FS、SS 方 向 への 顆 粒 の増 加が 見 ら れた (図 8.-HL-60)。 図 9.-b に Phyco-CM 刺激 HL-60 細 胞 の 典型 的 な 細胞 表 面 抗 原の 測 定 パタ ー ン を 示 した 。 HL-60 細胞 では 、 Phyco-CM 刺 激 に より CD11b 抗 原測 定 時 に お い て 横 軸 右 方 10 1 付 近 ま で に 陽 性 細 胞 の 出 現 が み ら れ た (図 9.-b (4)Phyco-CM-CD11b)。こ のこ と は 、図 8.で 示 した よ う に Phyco-CM 刺 激 に お いて 、 無 刺 激 Cont に 比較 し て FS、 SS の 顆 粒 が増 加し た こ と と 一 致 し た。Phyco 刺激 に お いて も 、CD11b 抗 原測 定 時 に 横軸 の 陽 性細 胞 出 現 は 横軸 右 方 10 1 付 近ま で に陽 性 細 胞の 出 現 がみ ら れ た (図 9.-b、 (2)Phyco-CD11b)。 HL-60 細 胞 につ い ては 、 い ずれ の 刺 激 にお い て も細 胞 表 面 CD14 抗 原 陽 性細 胞 率 は Cont-CM 刺 激 U937 細胞 の陽 性 細 胞率 よ り も 低 値で あ っ た (表 2.)。Phyco-CM 刺激 HL-60 細 胞に おけ る CD14 抗 原 の 蛍 光強 度 (10 ± 2.5)は 、Cont-CM 刺激 、Cont (5.8 ± 2.0、5.1 ± 2.0) に 比 較 して 2 倍を 示 した が 有 意な 増 加 で はな か っ た (表 2.)。単球 と 顆 粒 球 に 特 異 性を 示 す と いわ れ て いる 細 胞 表 面 CD11b、CD66b 抗 原の う ち、 CD11b 抗原 陽 性細 胞率 に つ いて は 、Phyco-CM 刺激 、Phyco 刺激 HL-60 細 胞 (各 14 ± 4.7 %、16 ± 4.6 %)に お い て 、Cont-CM 刺 激 (7.7 ± 3.1 %) に 比 較 し て有 意 で は ない も の の高 値 を 示 した 。こ の 時 の蛍 光 度 (各 6.6 ± 1.2 、 5.5 ± 2.0)は 、そ れ ぞれ Cont-CM (4.7 ± 0.6)よ り 高 値で あ っ た。 CD66b 抗 原 陽性 細 胞率 に つ いて は 、 Phyco-CM 刺 激 (1.3 ± 0.5 %)に お い て 、無 刺 激 Cont (4.5 ± 1.6 %)より も 有意 な 低 値 (p < 0.001)を 示 し た 。 蛍 光 強 度 も無 刺激 Cont (27 ± 32)より Phyco-CM 刺 激 (10 ± 2.0)では 低 下 し た (表 2.)。Phyco 刺激 HL-60 細 胞に お ける CD66b 抗原 (6.8 ± 3.1 %)は 、Phyco-CM 刺 激 より 高 値で あ った 。CD15 抗 原 陽 性細 胞 率 は、 Phyco-CM、 Cont-CM、 Phyco のい ず れ の刺 激 に おい て も 有 意な 差 は み 17 ら れ な か った (表 2)。 3) 形態 学 的 変化 U937 細胞 は 、 単 球 性 白 血 病 細 胞 で あ る 。 円 あ る い は 卵 型 の 形 で 、 ほ と ん ど の 細 胞 で 細 胞 質 周 辺 に 泡 状 の 突 起 を 持 つ 。 核 /細 胞 質 比 (N/C 比 ; nuclear/cytoplasmic ratio)は や や大 、核 クロ マ チ ンは 密 で あ り 、核は 不 規 則 に 分 葉し て い る 。大 き く て顕 著 な 核 小体 お よ び細 胞 質 内 には 多 数の 小 さ な 好 塩基 性 顆 粒 と多 数 の 空胞 を 持 つ 16) (図 10.-a-1)。 U937 細胞 は 、 Phyco-CM 刺 激 (図 10.-a-4)に よ り顆 粒を 持 つ 大き な 細 胞 質と 凝 集 の無 い 微 細 な 核ク ロ マ チ ン、 核 小 体の 残 存 す る細 胞 へ と変 化 し た 。こ の 形態 変 化 は 、PMA 刺激 U937 細胞 (図 10.-a-3)と 類似 し て いた 。Cont-CM 刺 激 で は 、 一部 の 細 胞 にの み 、 大き な 弯 曲 を持 つ 核 と淡 青 色 の 細胞 質 を持 つ 細 胞 が 見ら れ た (図 10.-a-5)。 U937 細胞 に お いて は 、 Phyco-CM 刺激 と Cont-CM 刺 激 に より 単 球 、マ ク ロ フ ァー ジ 細 胞が そ れ ぞ れ約 57 %と 21 %の 割合 で 存 在し た (図 11.-a)。こ れ ら は 、無 刺激 Cont の 単球 、マ ク ロ フ ァ ー ジ陽 性 率 よ りも 有 意 な高 値 を 示 した ( p < 0.05、 p < 0.01、 p < 0.001) (図 11.-a) 。 Phyco 刺 激 では 、 核 にく ぼ み があ る 細 胞 がみ ら れ た が 、 大 部 分は 前 単 球 様で あ っ た (図 10.-a-2)。 Phyco 刺激 U937 細胞 の 単 球 と マ クロ フ ァ ー ジ細 胞 の 割合 は 約 3.4 %であ っ た (図 11.-a)。 PMA 刺 激 細 胞 に つ い て は 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 形 態 (図 10.-a-3)に 分 化 誘 導 さ れた。 前 骨 髄 球 性白 血 病 細 胞で あ る HL-60 細 胞で は 、大 部分 を 占 める 前 骨 髄 球 様 細 胞 の他 に 若 干 の骨 髄 球 、顆 粒 球 様 細胞 が み られ る 。 前 骨髄 球 様細 胞 の 細 胞 質 は 、 多 数 の 粗 大 な ア ズ ー ル 顆 粒 で 満 た さ れ 、 N/C は 大 き く 、 核 は 偏 在 して い る (図 10.-b-1)。HL-60 細胞 に つ いて は 、特 に Phyco-CM 刺 激 に よ る分 化 誘 導 刺激 後 、 様々 な 特 徴 を持 つ 前 骨髄 球 細 胞 様形 態 が観 18 察 さ れ た ため 、 メ イ グリ ュ ン ワル ド ・ ギ ムザ 染 色 によ る 細 胞 分類 が 困難 で あ っ た 。Phyco-CM 刺 激 HL-60 細 胞 では 、N/C 比 が 減 少 し 、空 胞 と 青 白 い 細 胞 質を 持 つ 、 形態 学 的 には 成 熟 単 球様 細 胞 系へ 分 化 し てい る と推 測 さ れ る 細胞 が 約 15%み ら れ た (図 10.-b-4、 矢 印 )。 他 の 約 85%の 細 胞 は 、 大 き な核 と 顕 著 な細 胞 質 顆粒 、 さ ら に核 小 体 が縮 小 あ る いは 消 失し た と み ら れる 前 骨 髄 球 と 骨 髄 球を 含 む 顆 粒 球 系 細 胞で あ っ た (図 11.-b)。 Phyco お よび Cont-CM 刺激 HL-60 細 胞に つ い ては 、ほと んど 前 骨 髄球 様 細 胞 で あっ た (図 10.-b-2、 5)。 ATRA 刺激 HL-60 細胞 に つい て は 、 顆 粒 球 様 形態 (図 10.-b-6)に分 化 誘 導さ れ た。 図 11.-b に 示し たよ う に 、 一 部 の Phyco-CM 刺 激と Cont-CM 刺 激 HL-60 細 胞 につ い て は、mature に 分 類 さ れ た 細 胞 が み ら れ た 。 mature と は 、 成 熟 様 細 胞 、 す な わ ち 、 後 骨 髄 球 、桿 状 核 球 、分 葉 核 球、 単 球 、 マク ロ フ ァー ジ 様 細 胞の 形 態を 示 し た 細 胞の こ と で ある 。 Phyco-CM あ るい は Cont-CM 刺 激 HL-60 細 胞 の 成 熟 様細 胞 の 割 合 (各 約 15 %、 約 10 %)は 、 そ れぞ れ 無刺 激 Cont 細 胞 に 比 較し て 増 加 傾向 に あ った が 、 こ れら の 間 に有 意 差 は なか っ た。 Phyco 刺 激 では 、 こ れら 成 熟 様細 胞は 2 %の み で あっ た (図 11.-b)。 4) 細胞 化 学 的変 化 特 異 的 (SE)あ る い は 非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ (NSE)染 色 に よ り 細 胞 化 学 的 変 化 につ い て 検 討を 行 っ た。U937 細胞 は 、もと もと NSE 陽 性 細胞 で あ る が 、 Phyco-CM 刺 激 に よ り さ ら に こ の 比 率 は 高 ま っ た 。 一 方 、 HL-60 細 胞 につ い て は、 無 刺 激 Cont に おい て 特 異的 エ ス テ ラー ゼ 染 色 (SE)陽 性細 胞 の 割合 は 90 %で あ り、Phyco-CM、Cont-CM 刺 激で も 90% 以 上 で あ った (表 3.)。 NBT 還 元 能 試 験 に つ い て は 、 Phyco-CM 刺 激 に よ り U937 細 胞 と HL-60 細 胞の 両 方 の 陽性 細 胞 率が 、 そ れ ぞれ の Cont-CM 刺 激細 胞 の 陽 19 性 細 胞 率 に比 較 し て 有意 に 増 加し た ( p < 0.01 )。 Cont-CM 刺激 U937 細 胞 お よび HL-60 細胞 の NBT 還元 能 陽性 細 胞 率は 、Cont のそ れ と ほぼ 同 値 で あ った (表 4.)。 ２ ． Phyco-CM 刺激 U937 細胞と HL-60 細胞 に お ける LPS 応答 性 1) opsonin-treated LB 貪 食能 Phyco-CM 刺激 U937 細 胞 に おけ る 貪食 陽性 細 胞 の割 合 (81 ± 13 %) は 、 Cont-CM 刺 激 (32 ± 5.5 %)に 比 較 し て 有 意 な 高 値 を 示 し た (p < 0.001)。し か し なが ら 、Phyco-CM 刺激 U937 細胞に LPS を 添加 し て も 貪 食 活 性 (%)の 有意 な増 加 は 見ら れ な か った 。Cont-CM 刺激 では 、LPS ( 0 ng/mL )に比 較 し て添 加 後 ( 1,000 ng/mL )に 貪 食活 性 (%)は 有 意 (p < 0.05)に増 加 し た (表 5.-a)。 HL-60 細 胞で は 、 Phyco-CM (36 ± 13 %)お よ び Cont-CM 刺 激 (35±12 %)の間 で 貪 食細 胞 の 割合 に 有 意 差は み ら れ な か っ た が、 い ず れ も無 刺 激 Cont (17 ± 6.2 %)に 比較 し て 有 意な 高 値を 示 し た (p < 0.01)。HL-60 細胞 に つ いて は、い ずれ の 刺 激で も LPS 添 加 に よ る 貪 食活 性 (%)の有 意 な 増加 は 見 ら れな か っ た (表 5.-b)。 2) Phyco-CM 刺激 U937、 HL-60 細 胞 の TNF-α 量 産 生 Phyco-CM 刺 激 U937 細胞 に お ける 培 養 上清 中 TNF-α 量 は、Cont-CM 刺 激 細 胞 よ り も 有 意 差 は み ら れ な い も の の 高 値 を 示 し た 。 こ の TNF-α 量 (66 ± 15 pg/mL)は 、LPS (1,000 ng/mL)添加 後 に 増加 す る傾 向 が みら れ た (84 ± 21 pg/mL) が 、LPS 添 加 無 (0 ng/mL)の Phyco-CM 刺激 細 胞 培 養 上 清に 比 較 し て有 意 な 増加 で は な かっ た (表 5.-a)。 Phyco-CM 刺 激 HL-60 細胞 に つ いて も 、 Cont-CM 刺激 細 胞 より 有 意 で はな い も のの 高 い TNF-α 量 を 示 した 。しか し な がら 、LPS (1,000 ng/mL)の 添 加 によ る 増 加 は みら れ な か った (表 5.-b)。Phyco 刺激 で は 、U937、HL-60 細胞 と も に 、 LPS の 添 加 に 関 係 な く TNF-α 量 は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た (表 20 5.-a、b)。 ３ ． フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サ イ ト カ イ ン の 検出 １ ) ヒ ト 単 核球 浮 遊 液試 料 の 細胞 分 類 各 被 験 者 の 細 胞 割 合 を 分 類 し た 各 種 細 胞 の 平 均 は 、 リ ン パ 球 63.8%、 好 中 球 17.4%、 好 塩 基球 2.7％ 、好 酸球 1.2％ 、単 球 15.1%であ っ た 。 7 日 間 培 養 した 後 の ヒ ト単 核 球 浮遊 液 試 料 試料 の 形 態分 類 に つ いて は 、無 刺 激 、 フ ィコ シ ア ニ ン刺 激 と もに 種 々 の 形態 が 出 現し て お り 分類 が 困難 で あ っ た こと か ら 実 施し な か った 。 ２ ) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) 中 サ イ ト カ イ ンの 検 出 Cont-CM (41 ± 27 pg/mL、 n=8)に 比 較 し て Phyco-CM (151 ± 75 pg/mL、 n=8)お よ び PHA-CM (215 ± 39 pg/mL、 n=3)に おけ る INF-γ 量 は 、 有 意な 高 値 (p < 0.001)を 示 し た (図 12. IFN-γ )。 GM-CSF 量 につ い て は、 Cont-CM (273 ± 240 pg/mL、 n=7)に比 較 し て Phyco-CM (857 ± 247 pg/mL、 n=7)、 PHA (1172 ± 27 pg/mL、 n=3) に お い て 有意 な 高 値 (p<0.001)を 示 した (図 12. GM-CSF)。 IL-3 量 に つい て は 、 Phyco-CM に お いて 検出 限 界 (7.4 pg/mL)以 下 で あ っ た 。 Cont-CM (n=2)では 59 ± 80 pg/mL、 PHA-CM (n=7)で は 282 ± 310 pg/mL で あっ た (図 12. IL-3)。 ３ ) ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM、 Cont-CM)中 サ イ ト カ イ ン と 分 類 細 胞と の 関 連 フ ィ コ シ アニ ン 刺 激 によ り Phyco-CM、Cont-CM 中 に産 生 のみ ら れ たサ イ ト カ イ ン INF-γ と GM-CSF 産 生量 につ い て 、結 果 ２ )で算 出 し た被 験 者 各 人 の単 核 球 割 合と の 相 関性 に つ い て検 討 し た (図 13.-a、 b)。 その 21 結 果 、 被 験者 各 人 の リン パ 球 割合 と Cont-CM、 Phyco-CM 中 INF-γあ る い は GM-CSF 産 生量 と の 間に 有 意 な 相関 は 見 られ な か っ た 。他 の 細胞 、 す な わ ち 、好 中 球 、 好酸 球 、 好塩 基 球 、 単球 に つ いて も サ イ トカ イ ン産 生 量 と の 間に 有 意 な 相関 は 見 られ な か っ た。 第４節 考察 フ ィ コ シ アニ ン は 、スピ ル リ ナ等 の 藍 藻 類に 含 ま れる 270-kDa の光 合 成 色 素 タ ンパ ク 質 で ある 。 本 研究 で は 、 フィ コ シ アニ ン で 刺 激し た ヒト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)が 未 熟 な 白 血 病 細 胞 に 対 し て 分 化 誘 導 能 を持 つ か 否 か、 お よ びそ の 分 化 方向 性 を 検討 し た 。 細胞 の 分化 誘 導 を 調 べる 上 で 重 要な こ と は、 ① 増 殖 が抑 え ら れて い る か 、② 最 終分 化 細 胞 に 特異 的 な 機 能 、例え ば 、NBT 還 元能 、接 着 能 、貪 食 能等 が 発 現 し て い る か、 で あ る 1) 。 分 化過 程 に 特 異的 な 細 胞表 面 抗 原 の出 現 か らも 分 化 方 向 性、 分 化 度 を知 る こ とが 出 来 る 。ス ピ ル リナ 熱 水 抽 出物 や フィ コ シ ア ニ ンは 、 こ れ らを 摂 取 した マ ウ ス の骨 髄 細 胞の 増 加 作 用と 脾 臓細 胞 を 培 養 して 得 た 上 清に よ る コロ ニ ー 形 成活 性 の 誘導 作 用 が 報告 さ れて いる 13) 。 Shinohara ら 8) は、 thermophilic bule-green alga であ る フィ コ シ ア ニ ンと ア ロ フ ィコ シ ア ニン の 両 方 がヒ ト リ ンパ 球 系 骨 髄腫 細 胞株 RPMI 8226 に 対 し 、細胞 増 殖 を促 進 す る こと を 報 告し て い る 。フ ィコ シ ア ニ ン (最 終濃 度 0.1 mg/mL )は 、 HL-60 細胞 に 対し て は 、増 殖 傾 向を 示 し 、 U937 細 胞 に 対 し て も 抑 制 よ り も 増 殖 を 促 す 傾 向 を 示 し た (図 7.-a)。こ の こ とは 、Shinohara ら の報 告 に一 致 す るが 、抑 制 傾向 が み ら れ な か っ たこ と か ら 、フ ィ コ シア ニ ン 単 独添 加 で の分 化 成 熟 作用 は 低い 可 能 性 を 示唆 し て い ると 思 わ れた 。 一 方 、単 球 系 のみ で な く 赤芽 球 また 22 は 血 小 板 へも 分 化 可 能で あ る ヒト 白 血 病 細胞 株 K562 細 胞 に 対し て フィ コ シ ア ニ ンは 濃 度 依 存的 (0.02-0.16 mg/mL)に増 殖 を 抑制 し た 25, 26) 。増 殖 抑 制 効 果を 示 し た フィ コ シ アニ ン の 添 加濃 度 つ いて は 、 種 々の 報 告が あ り 、 ヒ ト肝 癌 細 胞 であ る HepG2 に 対 して は フ ィコ シ ア ニ ン濃 度 7μ g/mL 27) 、 ヒ ト乳 が ん由 来 細胞 MCF-7 に対 し ては 80 mg/mL 28) で 増殖 抑 制 効 果 が示 さ れ て いる 。 こ れら の 報 告 から フ ィ コシ ア ニ ン によ る 増殖 あ る い は 抑制 作 用 は 、細 胞 種 によ る 分 化 方向 の 違 いや 細 胞 系 に依 存 した 効 果 を 持 つこ と が 示 唆さ れ た 。ま た 、 フ ィコ シ ア ニン の 癌 細 胞に 対 する 直 接 的 な 効 果 と し て 、 ミ ト コ ン ド リ ア を 介 し た ア ポ ト ー シ ス (細 胞 死 )作 用 経 路 へ の 関 与 が 報 告 さ れ て い る 。 K562 細 胞 で は フ ィ コ シ ア ニ ン 濃 度 50μ M (13.15 mg/mL) 29) 、 MCF-7 細 胞 に対 し ては 80 mg/mL の添 加 28) に よ り 、 いず れ も 細 胞内 ミ ト コン ド リ ア の内 膜 に 結合 し て い るチ ト クロ ー ム C の 放 出と 、こ の放 出 を 阻止 する Bcl-2 タン パ ク の減 少 が起 こ る こ と に よ る 癌細 胞 の 消 滅作 用 が 示唆 さ れ た 。こ れ ら の癌 細 胞 に 対し て 直接 ア ポ ト ー シス を 起 こ した フ ィ コシ ア ニ ン は、 本 研 究で 用 い た 濃度 に 比較 し て い ず れも 高 濃 度 であ っ た 。U937 細 胞と HL-60 細 胞に 対し て も 高濃 度 の フ ィ コシ ア ニ ン 添加 に よ り増 殖 抑 制 ある い は アポ ト ー シ スを 起 こす 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 フ ィ コ シ ア ニ ン は 、 UNIDO (国 連 工 業 開 発 機 構 ) 等 に よ っ てそ の 安 全 性が 認 め られ る と と もに 30) 、おも に 健 康 食品 と して 利 用 さ れ てき た 。 し かし な が ら、 フ ィ コ シア ニ ン のヒ ト で の 利用 に つい て は 、 一 日推 奨 量 (体重 60kg の 成 人で 10mg/kg、 0.6 g/day) 31) を 考 慮 し た 摂 取 濃度 の 検 討 が必 要 で ある 。 本 研 究に お け るフ ィ コ シ アニ ン 濃度 は 、 こ の 一日 推 奨 量 を参 考 に 算出 さ れ 、 マウ ス に 摂取 さ せ た 量を 目 安に した 32) 。 一 方 、Phyco-CM は 、U937 細胞 に 対し 有 意で は な いも の の 無 刺激 Cont 23 と Cont-CM に 比較 して CD14 抗原 と CD11b 抗 原 陽性 細 胞 の割 合 を 増加 さ せ た (表 2.)。同時 に、Phyco-CM 刺 激 は、無 刺激 Cont 比 較し て CD14 抗 原 測 定 時の 蛍 光 強 度を 有 意 に増 加 さ せ た (p < 0.01)。 細 胞 分類 で は、 57 %の 単球 /マ ク ロ ファ ー ジ 細胞 の 出 現 が観 察 さ れた (図 11.-a)。NBT 還 元 能 も 顕 著な 増 加 を 示し た (表 4.)。 これ らか ら Phyco-CM は、 U937 細 胞 を 成 熟 細 胞 で あ る 単 球 /マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 に 分 化 誘 導 し た こ と が 示 唆 さ れ た。ま た、Phyco-CM 刺激 U937 細胞 は 、Cont-CM 刺激 に 比 較 し て U937 細 胞 の CD14 抗 原陽 性 細胞 割 合が 約 3 倍 (4.2 ± 2.0 % → 11 ± 3.3 %)、 CD11b 抗 原 陽性 細 胞 割合 が約 2 倍 (4.8 ± 2.3 % → 18 ± 7.3 %) に 変 化 し た (表 2.)。 形態 学 的 細胞 分 類 に おけ る 単 球、 マ ク ロ ファ ー ジの 割 合 (57 %)も Cont-CM 刺 激 (約 20 %)より 3 倍近 く 高値 を 示し た (図 11.-a) 。 こ れ ら の こ と か ら 、 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 で あ る Cont-CM 刺 激 よ り もフ ィ コ シア ニ ン を 添加 し た Phyco-CM の ほ う が高 い 分 化 誘 導作 用 を 持 つこ と が 示唆 さ れ た 。 HL-60 細胞 に つ いて は 、い ず れ の刺 激 に おい て も 細胞 表面 CD14 抗原 陽 性 細 胞 率 は 低 く 、 U937 細胞 と 比 較 し て も そ の 陽 性 細 胞 率 は 低 値 で あ っ た (表 2.)。HL-60 細胞 は 二 つの 異 な る 造血 幹 細 胞の 分 化 プ ログ ラ ム、 す な わ ち 、刺 激 に よ り骨 髄 系 ある い は マ クロ フ ァ ージ 系 い ず れか の 方向 に 分 化 が 可能 で あ る 33) 。形 態学 的 観察 結果 よ り、Phyco-CM 刺 激 HL-60 細 胞 に お いて 二 つ の 分化 方 向 、単 球 系 と 顆粒 球 系 の形 態 が 同 時に 存 在す る こ と が 示唆 さ れ た (図 10.-b)。こ の こと は 、Phyco-CM 刺 激 によ り 、水 溶 性 の 淡 黄色 色 素 で あり 、 好 中球 な ど の 食細 胞 に 取り 込 ま れ ると 不 溶性 の 黒 紫 色 (暗 青 色 )の ホ ル マ ザ ン を 形 成 す る NBT 還 元 能 23) が 増 加 し た こ と (表 4.)、 単 球 と 顆粒 球 に おい て 特 異 性を 示 す とい わ れ て いる 細 胞表 面 CD11b 抗原 の 割 合 (14 %)が Cont-CM 刺 激 (7.7 %)に 比 較し て 有 意で 24 は な い も のの 高 値 を 示し た こ と (表 2.)と 一致 す る 。 Tamagawa ら 34) は 、 NBT 還 元 能 の 陽 性 率 と 非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 (NSE)陽 性 細 胞 と は 相 関 傾 向 にあ る こ と から 、 NBT 還 元能 が分 化 誘 導刺 激 後 の HL-60 細 胞 に つ い て 、顆 粒 球 と 単球 の い ずれ に 分 化 した か の 指標 と し て 有用 で ある と 述 べ て い る 。 NSE の 反 応 性 は 、 単 球 /マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 に 特 異 的 で あ る と いわ れ る が 35) 、Phyco-CM によ る 分 化誘 導 刺 激 後の HL-60 細 胞のほとんどが骨髄系細胞に反応性を示す特異的エステラーゼ染色 (SE)陽 性で あ っ た (表 3.)。 形態 学 的 観 察で は NSE 陽 性 を 示す 単 球 系形 態 と SE 陽 性 を示 す 顆粒 球 系 形態 を 持 つ 細胞 が 混 在し て お り (図 11.-b)、 エ ス テ ラ ーゼ 染 色 の 結果 は 必 ずし も 形 態 学的 観 察 結果 と 一 致 して い なか っ た 。Phyco-CM 刺 激 HL-60 細 胞 にお いて 、単 球 と顆 粒 球 に特 異 性 を示 す と い わ れて いる CD66b 抗原 陽 性細 胞 率 (1.3 ± 0.5 %)は 、無刺 激 Cont (4.5 ± 1.6 %)よ り も 有意 に 低 値し た (表 2.)。こ れら の こと か ら 、Phyco-CM 刺 激 HL-60 細 胞の 一部 は 形 態学 的 変 化 およ び NBT 還元 能 と細 胞 表 面抗 原 の 結 果 から も 単 球 系へ の 分 化を し 始 め てい る が 、ほ と ん ど は未 熟 な顆 粒 球 系 細 胞で あ る 前 骨髄 球 か ら骨 髄 球 細 胞で あ る こと が 示 唆 され た 。 Chiao ら 11) は 、ヒ ト末 梢 血 リン パ 球 培 養上 清 (CM)が、 HL-60 細胞 を 単 球 、 マ クロ フ ァ ー ジ様 細 胞 へ分 化 誘 導 する こ と を示 し て い る。 こ の報 告 に よ れ ば、 30 %CM 加 RPMI とと も に培 養 した HL-60 細胞 の 28 %が 3 日 目 で、 96 %が 8 日目 で マ クロ フ ァ ー ジ様 形 態 を示 し て い る。 本 研究 で 用 い た Cont-CM、Phyco-CM と もに RPMI に 対す る CMs の 添加 割 合 は 10 %で ある が 、 Cont-CM 刺 激 では 3 日目 で 約 10%、 Phyco-CM 刺 激 で は 約 15 %が 単 球 、マ ク ロ ファ ー ジ 様 成熟 細 胞 に分 化 し た 。 HL-60 細 胞 が CM に より 分 化 を示 す こ とに つ い て は 、Chiao ら の 結果 に一 致 し た と い え る 。本 研 究 で はフ ィ コ シア ニ ン で ヒト 末 梢 血単 核 球 細 胞を 刺 激し 25 て 得 た 培 養上 清 試 料 であ る Phyco-CM の ほう が 特 に U937 細 胞に お い て 成 熟 細 胞 の割 合 を 増 加さ せ た こと か ら、Cont-CM よ りも 高 い分 化 誘 導作 用 を 持 つ こと を 示 し た。し かし な が ら、特に HL-60 細 胞に 対し て こ れら の 大 部 分 を成 熟 細 胞 に分 化 誘 導す る に は 培養 日 数 、 Phyco-CM の 添 加 量 (%)も含 め て 不十 分 であ っ た と推 測 さ れ た。本 研 究で は 、Phyco-CM 刺激 HL-60 細胞 に お け る 8 日 間の 培 養を 実 施し て い ない が、 3 日間 培 養 後の 形 態 に は 、様 々 な 特 徴を 持 つ 細胞 、 す な わち 、 前 骨髄 球 様 細 胞と 次 の段 階 で あ る 骨髄 球 様 の 特徴 の よ うな 特 徴 の 混在 し た 形態 が 観 察 され た 。正 常 骨 髄 標 本に お い て 、単 球 系 の未 熟 な 細 胞で あ る 幼弱 単 球 と 骨髄 系 の未 熟 な 細 胞 であ る 前 骨 髄球 は い ずれ も 細 胞 質内 に 微 細な 顆 粒 を 持ち 、 核内 に 核 小 体 を持 つ 等 の 形態 学 的 特徴 か ら 識 別は 困 難 であ る と い われ て いる 35) 。Phyco-CM 刺 激 HL-60 細胞 に お いて も様 々 な 特徴 を 持 つ 前骨 髄 球 様 形 態 が 観 察さ れ た た め、 細 胞 分類 が 困 難 であ っ た 。こ れ ら 形 態は 、 長期 培 養 に よ り顆 粒 球 系 へ分 化 成 熟す る の か 、単 球 系 へ分 化 成 熟 する の かさ ら に 明 瞭 な変 化 等 を 示す と 思 われ た 。 ヒ ト 単 球 にお い て 、LPS は TNF-αの 放 出の 引 き 金に な る こ とが 知 ら れている 36) 。 Phyco-CM 刺激 に より U937 細胞 に おい て 、Cont、Cont-CM 刺 激 に 比 較し て 増 加 の見 ら れた CD14 抗 原は 、 LPS と LPS 結合 タ ン パ ク (LBP; LPS binding protein)の レ セ プ タ ー で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。CD14 抗 原 は、単球 /マ ク ロフ ァ ー ジに お ける LBP と LPS の 結合 に 応 答 した TNF-α 産 生 を 仲 介 す る 。 近 年 、 自 然 免 疫 系 で 働 く マ ク ロ フ ァ ー ジ や 樹 状細 胞 に お いて 、病 原体 (異 物 )を認 識 し その 応 答 シ グナ ル を伝 達 す る 働 きを し て い る Toll-like receptor の 存 在 が注 目 され てい る 37) 。 そ の 中 の ひと つ で あ る Toll-like receptor 4 (TLR4)は、単 球 に おけ る LPS 応 答 の 引 き金 と し て 重要 で あ るこ と 、 CD14 と 結合 し た LPS に 、 TLR4 26 に 会 合 し てい る MD2 分 子が 結 合す る こ とで 活 性 を起 こ す タ ンパ ク で あ る こ と が 示さ れた 38, 39) 。本 研究 で は、Phyco-CM 刺激 U937 細胞 に お い て CD14 と CD11b 抗原 陽 性 細胞 の 発 現 がみ ら れ たこ と か ら 、分 化 誘導 刺 激 に よ る 単 球 /マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 へ の 分 化 後 、 異 物 を 認 識 す る TLR4 の 発 現と そ れ に伴 う TNF-α の 産 生増 加 が 予想 さ れ た 。そ こ で 、分 化 誘 導 刺 激後 の 各 細 胞 に LPS を 添 加し 、そ の 応 答性 を 検 討 した 。 TLR4 の 発 現 に は 、CD14 抗原 と LBP が 必要 であ る 。Phyco-CM は 、分 化 誘 導 刺 激 後 の U937 と HL-60 細 胞 の培 養 上 清中 に TNF-α を 生 じた (表 5.-a、 b)。しか し なが ら 、それ ら TNF-α 量は LPS (1,000 ng/mL)添加 に よ る応 答 性 、 す な わ ち 、 TNF-α 量 の 有 意 な 増 加 を 示 さ な か っ た 。 LPS は 、 グ ラ ム 陰 性 菌 の 細 胞 外 壁 を 構 成 す る 糖 脂 質 で あ り 、 内 毒 素 (エ ン ド ト キ シ ン )と し て 種々 の 細 胞 を強 く 活 性 化す る 38) 。 Phyco-CM 刺 激後 の U937 細 胞 に お ける 貪 食 活 性は 、 LPS 無 添 加 で は Cont-CM 刺 激 U937 細胞 の 貪 食 活 性 より 有 意 に 増加 し た。し かし な がら 、LPS 添加 に よ る貪 食 活 性 の 有 意 な 増加 は み ら れな か っ た (表 5.-a)。LPS 応 答性 TNF-α量 の 測 定 に つ い て は 、3 日 間 培養 後 に LPS を 添 加し 、培 養 上 清中 の TNF-α 産生 に つ い て 比較 し た 。 この 時 、 Phyco-CM 刺激 後 の 各細 胞 に お ける 応 答性 を 比 較 す る目 的 で 、 細胞 の 回 収お よ び 細 胞数 の 調 整を 実 施 し なか っ た。 こ の 結 果 、各刺 激 に よる 3 日間 培 養後 の 増殖 細 胞 数の 違 い を 反映 し 、LPS 応 答 と こ れ ら 各 細 胞 か ら 産 生 さ れ た サ イ ト カ イン TNF-α 量 に 影 響 が あ る こ と が 示唆 さ れ た 。し か し なが ら 、 Pnyco-CM 刺 激 U937、 HL-60 細 胞 の い ず れも LPS の添 加 に よる TNF-α量 の 有 意な 増 加 は 見ら れ な かっ た 。 こ の こと か ら 、 3 日 間 の刺 激 後に 細 胞を 回 収 し、 LPS を 添加 し た 場 合 、 細 胞 数あ た り の サイ ト カ イン 産 生 量 を反 映 し 、本 結 果 に 比較 し て陽 性 対 照 と の差 が 明 確 にな る こ とが 推 測 さ れた 。 27 CD14 は 二 つの 役 割 、す な わ ち、 TLR4/MD2 に LPS を 運 ぶ 役割 と 細 胞 内 に LPS を取 り 込む 役 割 があ り 、CD14 を介 し て細 胞 内 に取 り 込 まれ た LPS によ っ て 細 胞内 に 存 在す る TLR4/MD2 の活 性 化 が 起こ る と 考え ら れ て いる 40) 。Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞に お ける CD14 抗 原の 発 現 量 で は 、 CD14 を 介 し た LPS の 取 り込 み ある い は TLR4/MD2 の活 性 化が 起 ら ず 、 LPS 応 答 性 TNF-α 量の 増 加 を起 こ す ほど 十 分 に 機能 し な かっ た の か も しれ な い 。また 、形 態 的に Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞に お け る 単 球 /マ ク ロフ ァ ー ジへ 分 化 した 細 胞 は 、LPS 応 答性 を 起こ すた め の 貪食 能 以 上 の 機能 を 持 つ 活性 化 マ クロ フ ァ ー ジに ま で には 成 熟 し てい な かっ た の か も し れ な い 。 あ る い は 、 TNF-α 以 外 の 他 の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 、 例 え ば 、 IL-6、IL-8、IL-12、 IL-18 な ど別 の サ イト カ イ ン の LPS 応 答 に 関 連 し た増 加 に 影 響し た か もし れ な い 。ま た Cherng ら 41) は、フ ィコ シ ア ニ ン (0.12-0.25 mg/mL) 存 在 下 で マ ウ ス 単 球 マ ク ロ フ ァ ー ジ 細 胞 RAW 264.7 を 24 時 間培 養 後に LPS (1,000 ng/mL)で 1 時 間刺 激 し て得 た 培 養 上 清中 TNF-α 産 生 が 、 フ ィ コ シ ア ニ ン の 濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ た こ と を 報告 し て い る 。こ の こ とは 、フ ィコ シ ア ニン が 、LPS 刺激 RAW 264.7 にお ける NO 形成 を 抑 制し 、 こ の NO 形成 抑 制 に関 連し た と 推測 さ れ る IκB-αを 経 由し た 細 胞核 NF-κ B の 活性 を 抑 制し た 結果 で あ る と 推 測 し てい る 。 フ ィコ シ ア ニン の 抗 炎 症作 用 に つい て は 、 他に も 報告 がある 42-44) 。本 研 究に お け る TNF-α 産生 量 に つい て も TLR4/MD2 の 活 性 化 経 路 で は な く 、 LPS の 添 加 に よ り 生 じ た 一 酸 化 窒 素 合 成 酵 素 (nitric oxide synthase; iNOS)か ら 誘 導 さ れ る 一 酸 化 窒 素 (NO; nitric oxide)と 活 性 酸 素 を 含 む 炎 症 性 の 免 疫 応 答 等 、 別 の 経 路 に 関 連 し た 結 果 か も し れ ない 。 以 上 の 結 果 か ら 、 フ ィ コ シ ア ニ ン の 未 熟 な ヒ ト 白 血 病 細 胞 U937、 28 HL-60 細胞 に 対 する 分化 誘 導 作用 は 、直 接的 よ り もむ し ろ 間 接的 に 働 き 、 フィコシアニンで刺激したヒト末梢血リンパ球培養上清試料である Phyco-CM の ほ うが 成熟 細 胞 の割 合 を 増 加さ せ た こと か ら、Cont-CM よ り も 分 化 誘導 作 用 を 高め る こ とを 示 唆 し た。 次 に 、 Phyco-CM 中 に 存在 を 推 測 さ れ、U937 細胞 と HL-60 細胞 を成 熟 細 胞 (単 球 /マ クロ フ ァ ージ 様 細 胞 )に分 化 誘導 する 可 能 性を 持 つ 因 子と し て IFN-γ 、GM-CSF、IL-3 を 測 定 し た 。その 結 果 、Phyco-CM は 、高濃 度 の INF-γ お よび GM-CSF を 含 有 し、IL-3 に つ いて は、検 出 され な かっ た (図 12.)。ヒ ト末 梢 血 単 核 球 細 胞 のう ち 、リ ンパ 球 は 本研 究 で 測 定し た 3 種 類 のサ イ トカ イ ン を 産 生 す る 主な 産 生 細 胞で あ る が、 こ れ ら は他 の 様 々な 細 胞 か らも 産 生さ れ る (表 6.)。INF-γ は 、T リ ン パ球 や natural killer (NK) 細 胞か ら 産 生 さ れ る 、マ ク ロ フ ァー ジ 活 性能 や リ ン パ系 細 胞 の分 化 誘 導 因子 活 性を 持 つ サ イ トカ イ ン で 、U937 細 胞や HL-60 細胞 を 単球 系 へ分 化誘 導 す る こ と が 知 られ て い る 45, 46) 。 この こ と は、 Phyco-CM 刺激 U937 細胞 の 分 化 方 向 が単 球 /マ クロ フ ァ ージ 系 細 胞 であ り 、 INF-γ の 存在 が 分 化の 一 因 で あ るこ と を 支 持し て い ると 思 わ れ た。 GM-CSF は 、T 細 胞 、B 細胞 、血 管内 皮 細胞 、線 維芽 細 胞 等 の様 々 な 細 胞 か ら 、 IL-3 も T 細 胞 、 NK 細胞 、 内皮 細 胞 等の 細 胞 か ら産 生 さ れ 、 そ れ ぞ れ 未熟 な 造 血 細胞 の 増 殖と 分 化 に 関す る 機 能を 持 つ こ とが 知 られ ている 47-49) 。本研 究 の結 果 か ら、Phyco-CM 中の IFN-γと GM-CSF お よ び 、IFN-γま た は GM-CSF が U937 細胞 と HL-60 細 胞 の一 部 を 単球 /マ クロ フ ァー ジ 系 へ分 化 し たこ と が 推 測さ れ た 。Chen ら 50) は 、中 国 産 の 真 菌 で ある fu-ling (苓 茯、 Poria cocos Wolf 、PC)か ら抽 出 した 多 糖 画 分 (PS) で 5 日 間 刺 激 し て 得 た ヒ ト ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 (PC-PS-MNC-CM5)によ り U937 と HL-60 細胞 の 成 熟細 胞 への 分 化 促進 29 が 見 ら れ たこ と を 報 告し て い る。この 中 であ ら か じめ PC-PS-MNC-CM5 中 に 見 ら れた サ イ ト カイ ン IFN-γ、 TNF-α 、 IL-1βそ れ ぞ れに 対 す る 抗 体 を 添 加し て か ら U937 と HL-60 細胞 の 分 化誘 導 刺 激 を行 う と、こ れ ら に 対 す る分 化 促 進 作用 が 抑 制さ れ 、 成 熟細 胞 に 変化 し な か った こ とを 報 告 し て いる 。 こ れ らサ イ ト カイ ン に 対 する 抗 体 の添 加 は 、 1 種類 より も 複 数 種 類を 同 時 に 添加 し た 場合 で 、 よ り高 い 分 化促 進 作 用 の抑 制 が示 さ れ た 。 GM-CSF に つい て は 、単 独 よ り も ATRA や ビ タミン D 3 と組み 合 わ せ る こと で U937 細 胞の 細 胞表 面 CD14 抗 原や CD11b 抗原 の 割 合 が 増 加 し たと の 報 告 もあ る 51) 。ヒ ト 末 梢 血単 核 球 培養 上 清 中 分化 誘 導因 子 の 相 乗 効果 に つ い ては 、 他 の報 告 52) にも み ら れる よ う に 、複 数 のサ イ ト カ イ ンが 相 互 に 関係 す る こと で U937 あ るい は HL-60 細 胞等 の 未 熟 な 白 血 病 細胞 に 対 し てよ り 高 い分 化 誘 導 作用 を 示 して い る の かも し れな い 。 あ る いは フ ィ コ シア ニ ン は今 回 測 定 した IFN-γと GM-CSF、 IL-3 の よ う な サイ ト カ イ ンと 単 独 ある い は 組 み合 わ せ て用 い る こ とで 、 更な る 分 化 誘 導効 果 を 引 き起 こ す かも し れ な い。Niemeyer ら 47) は、PHA あ る い は PMA で 刺 激 した 単 核 球細 胞 に 含 まれ る T 細 胞ク ロ ー ン中 に IL-3 の 遺 伝 子 発現 が 見 ら れた こ と を述 べ て い る。IL-3 は、T リ ン パ球 か らも 産 生 さ れ る。本 論 に おけ る フ ィコ シ ア ニ ンの 添 加 濃度 (0.1 mg/mL)で は 、 T リ ン パ 球 中 の IL-3 産 生 を 引 き 起 こ す に は 不 十 分 だ っ た た め 、 Phyco-CM 中 に IL-3 産 生が み ら れな か った の か もし れ な い 。あ る い は 、 Cont-CM 中 から は 検出 さ れ てい る こ と から 、もと も とフ ィ コシ ア ニ ンは IL-3 産 生 には 関 与 し ない か 逆 に抑 制 し た のか も し れな い が 、この 点 につ い て は 今 後の 検 討 が 必要 で あ る。 本 研 究 で は、 フ ィコ シア ニ ン の未 熟 な 白 血病 細 胞 に対 す る 形 態的 、 機 能 的 な 分 化誘 導 結 果 につ い て 、フ ィ コ シ アニ ン が 単核 球 等 を 刺激 し てそ 30 の 培 養 上 清中 に サ イ トカ イ ン を産 生 し た こと に 一 因す る こ と を明 ら かに し た 。 こ のこ と は 、 自己 防 衛 免疫 シ ス テ ムに お い て、 フ ィ コ シア ニ ンが ヒ ト 末 梢 血単 核 球 の よう な 細 胞に 働 き か け、 白 血 病細 胞 の よ うに 未 熟な 細 胞 を 正 常な 細 胞 へ 分化 す る よう な 変 化 を促 す よ うに 働 く 手 助け を する こ と を 示 唆し て い る 。IFN-γ に つい て は 、Th1 細胞 か ら 産生 され る こ と が 知 ら れ てい るが 53, 54) 、フ ィコ シ アニ ン は、ヒ ト末 梢 血単 核 球細 胞 培 養 上 清 中 の サイ ト カ イ ン IFN-γ 産生 を 増 加さ せ た (図 12.)。 PHA 刺激 T 細 胞 は 、IFN-γを 産 生す る こ とが 報 告 さ れて い る 55) 。ヒト 末 梢血 単 核 球 に 添 加 さ れた フ ィ コ シア ニ ン は 、T 細 胞 を活 性 化 させ 、IFN-γ 、GM-CSF 等 の サ イ トカ イ ン の 産生 を 促 すと 思 わ れ る。 フ ィ コシ ア ニ ン を生 体 内に 摂 取 し た 場合 も T 細 胞表 面 の 特定 の 糖 タ ンパ ク 等 と結 合 し 、活性 化 さ れ た T 細 胞 か ら IFN-γ等 の サ イト カ イ ン が産 生 さ れる と 考 え られ る 。生 体 内 で の 働き に つ い ては 、 ア レル ギ ー 性 鼻炎 の 症 状を 持 つ 被 験者 が 、ス ピ ル リ ナ 1 日 1∼2 g (フ ィ コシ ア ニ ン 量に 換 算 する と 0.15∼ 0.3 g)を 3 ヶ 月 間 食 し た と こ ろ 、 末 梢 血 リ ン パ 球 に お い て Th1/Th2 の バ ラ ン ス が Th1 有 意に な り、IgE 抗 体の 産 生 亢進 に 働く IL-4 サ イ トカ イン 産 生 の減 少 が 見 ら れた と い う Mao ら 56) の 報 告 とオ ボ ア ルブ ミ ン を 投与 さ れ たマ ウ ス に お い て 8 週 間 の 0.05 %フ ィ コ シ ア ニ ン 溶 液 摂 取 (1.25 mg/20 g/day )に より 血 中 の IgE 抗 体 量の 抑 制が み ら れた 32) と いう 報 告 から も 示 唆 さ れ る。 し か し なが ら 、 生体 内 で の 単核 球 細 胞や 白 血 病 細胞 に 対す る フ ィ コ シア ニ ン の 働き は ま だ解 明 さ れ てい な い 。本 研 究 で 述べ た よう に 、直接 白 血病 細 胞 に対 し て 働く よ り も T 細 胞等 を 刺激 す るこ と で 間接 的 に 働 き かけ る の で はな い か と推 測 さ れ る。 こ の よう な フ ィ コシ ア ニン の 働 き は 、ヒト に お いて も 加 齢に 伴 い 低 下す る T 細 胞 機能 等 を維 持 す る こ と に 役 立つ か も し れな い 。 しか し な が ら、 現 在 、フ ィ コ シ アニ ン につ 31 い て は 、 食品 や 化 粧 品の 天 然 着色 料 と し ての 利 用 が主 で あ る 。今 後 、急 性 前 骨 髄 性白 血 病 患 者に 対 す る分 化 誘 導 療法 に 使 用さ れ る ATRA の よ う に 5) 、 実 用的 な 治 療 用薬 品 と して の 使 用 ある い は フィ コ シ ア ニン の 摂取 に よ り 加 齢に 伴 う 免 疫機 能 の 維持 あ る い は低 下 の 予防 が 期 待 され る 。 32 図 1. Phycocianin 化学 構 造 33 図 2. フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Cont-CM 、 Phyco-CM)の調製 34 図 3. ヒト末 梢 血単 核 球培 養 上 清試 料 による U937 および HL-60 細 胞の分 化 誘導 35 図 4. 骨髄 系 細 胞の成熟 過 程と表面 抗 原 発現 −U937、HL-60 細胞 の表面 抗 原 および細 胞 形 態における分 化 段階 の推 測 36 図 5. U937 細 胞における細 胞 分類とそれらの特 徴 37 図 6. HL-60 細 胞 における細 胞 分類とそれらの特 徴 38 図 7. 各 刺 激 物における U937 と HL-60 細胞 の細 胞 増殖 (a)および生存 率 (%) (b) 細 胞 は、培 養 後 １、２、３、４、５、７日 目 に計 数 した。生 存 率 (%)は、トリパンブルー染 色 法 に て測 定 した。測 定 1 回 当 たり各 試 料 3 点 ずつ、2∼3 回 の実 施 により得 た結 果 は、平 均 値 ± 標 準 偏 差 (n=2∼3)で表 した。 39 → (1) 無 刺 激 Cont (2) Phyco (3) Cont-CM (4) Phyco-CM (5) PMA U937 cells HL-60 cells 図 8. Phyco-CM と他 の刺 激 物を用いた U937 細 胞 、HL-60 細 胞 における FS, SS のパターン 40 (6) ATRA (1) 無 刺激 Cont (2) Phyco (3) Cont-CM (4) Phyco-CM (5) PMA 図 9.-a U937 細胞 における各 CD 抗 原 陽 性細 胞 の出 現パターン (1) 無 刺 激 Cont、(2) Phyco、(3) Cont-CM、(4) Phyco-CM と(5) PMA で刺 激 した U937 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL of medium)の各 CD 抗 原 は、 直 線 で示 した。各 刺 激 物 のコントロールは、点 線 で示 した。 41 (1) 無 刺激 Cont (2) Phyco (3) Cont-CM (4) Phyco-CM (5) PMA (6) ATRA 図 9.-b HL-60 細胞 における各 CD 抗 原 陽 性細 胞 の出 現パターン (1) 無 刺 激 Cont、(2) Phyco、(3) Cont-CM、(4) Phyco-CM と(5) PMA、(6) ATRA で刺 激 した HL-60 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL of medium)の各 CD 抗 原 は、直 線 で示 した。各 刺 激 物 のコントロールは、点 線 で示 した。 42 図 10.-a Phyco-CM と各刺 激 物で刺 激した U937 細 胞の形態 学 的変 化 細 胞 形 態 は、光 学 顕 微 鏡 下 (原 図 倍 率 x 1000) で観 察 した。 a. U937 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL)は、(1) RPMI-FBS (Cont)、(2) Phyco、(3) PMA、(4) Phyco-CM、(5) Cont-CM とともに 3 日 間 培 養 した。 43 図 10.-b Phyco-CM と各刺 激 物で刺 激した HL-60 細 胞の形 態 学的 変 化 細 胞 形 態 は、光 学 顕 微 鏡 下 (原 図 倍 率 x 1000) で観 察 した。 b. HL-60 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL)は、(1) RPMI-FBS (Cont)、(2) Phyco、(3) PMA、(4) Phyco-CM、(5) Cont-CM、(6)ATRA とともに 3 日 間 培 養 した。 44 図 11. Phyco-CM と各 刺激 物 で刺 激した U937 と HL-60 細 胞の形 態学 的 分 類 U937 と HL-60 細 胞 は、メイギリュンワルド・ギムザ染 色 を行 い、材 料 と方 法 に示 した方 法 で分 けた群 に分 類 した。200 個 中 の陽 性 細 胞 について、光 学 顕 微 鏡 下 (原 図 倍 率 x 1000)で観 察 した。測 定 1 回 当 たり各 試 料 3 枚 ずつ、3 回 の実 施 により得 た結 果 は、平 均 値 ±標 準 偏 差 (n=3)で表 した。 45 図 12. フィコシアニン刺激ヒト単核球の培養上清試料中 IFN-γ、GM-CSF、IL-3 被験者毎の培養上清 (CMs)は、材料と方法に述べたように採取した。培養上清 (CMs)中サイトカイン値は、ELISA 法にて測定した。CMs 中陽性対照は、PHA (10 μg/mL)とともに培養した。測定 1 回当たり各試料 2 点ずつ行ったそれぞれの値は、平均値±標準偏差 (n=2∼8)で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、使 用した CMs 数を表している。 46 図 13. ヒト単核球培養上清試料 (Phyco-CM、Cont-CM) 中サイトカイン IFN-γ (a)、 GM-CSF (b)とリンパ球割合との関係 各被験者 (n=7)における Phyco-CM と Cont-CM 中サイトカイン量は、ELISA 法にて算出した。リンパ球 等の割合は、各被験者から得たヒト単核球浮遊液 (1×106 cells/mL)をサイトスピンにてスライド標本と し、メイグリュンワルド・ギムザ染色後、200 個の細胞を計数し、リンパ球およびその他含まれている細 胞の割合を算出した。 47 表 1. 機能マーカー (分化方向性マーカー)の検索における顆粒球/単球/マクロファージの反応態度一覧 1) 機能マーカー 顆粒球 単球 マクロファージ ＋＋ ＋ ＋ ± ＋＋＋ ＋＋＋ NBT 還元能 ＋＋ ＋ ± 接着能 − ＋ ＋＋＋ 貪食能 ± ＋ ＋＋＋ CD11b ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ CD14 ＋w ＋＋ ＋＋ CD15 ＋ ＋ − 特異的エステラーゼ (基質；Naphthol AS-D chloroacetate) 非特異的エステラーゼ (基質；α-naphtyl butyratel) 表面 抗原例 ＋＋＋；強陽性、−；陰性 48 表 2. Cont-CM あるいは Phyco-CM 刺激 U937 と HL-60 細胞の各表面抗原と蛍光強度比較 cells CD 抗原 (%) (蛍光強度) CD14 U937 CD11b CD15 CD14 CD11b HL-60 CD15 CD66b Cont (n=3) 3.4 ± 3.2 (2.8 ± 0.8) 3.9 ± 1.0 (3.1 ± 2.7) 4.6 ± 2.2 (4.1 ± 2.3) 1.7 ± 1.2 (5.1 ± 2.0) 10 ± 7.4 (3.9 ± 3.4) 5.2 ± 1.9 (20 ± 24) 4.5 ± 1.6 (27 ± 32) Phyco (n=3) 7.5 ± 3.6 (3.1 ± 0.9) 7.9 ± 7.3 (5.6 ± 1.0) 3.9 ± 4.0 (13 ± 2.1) 1.5 ± 0.5 (4.7 ± 1.3) 16 ± 4.6 (5.5 ± 2.0) 5.9 ± 2.4 (10 ± 8.1) 6.8 ± 3.1 (11 ± 5.6) Cont-CM (n=5) 4.2 ± 2.0 (5.3 ± 0.8 ++) 4.8 ± 2.3 (4.3 ± 0.8) 1.5 ± 0.3 (7.5 ± 1.8) 1.5 ± 0.6 (5.8 ± 2.0) 7.7 ± 3.1 (4.7 ± 0.6) 7.8 ± 3.6 (4.8 ± 1.4) 2.2 ± 0.7 (7.7 ± 1.4) Phyco-CM (n=5) 11 ± 3.3 (5.6 ± 0.9 ++) 18 ± 7.3 (4.6 ± 0.6) 1.8 ± 0.4 (12 ± 10) 1.6 ± 0.5 (10 ± 2.5) 14 ± 4.7 (6.6 ± 1.2) 7.6 ± 1.9 (5.6 ± 2.0) 1.3 ± 0.5 ### (10 ± 2.0) PMA (n=3) 22 ± 11 +++, ***, ### (5.4 ± 1.6) 60 ± 17 +++, ***, ### (21 ± 11 +++, ***, ###) 2.1 ± 1.0 (7.9 ± 1.2) 1.6 ± 0.7 (7.2 ± 2.3) 43 ± 14 +++, ***, ### (16 ± 5.1 +++, ***, ###) 1.8 ± 0.3 (27 ± 37) 0.9 ± 0.3 ### (59 ± 40 ###) ATRA (n=3) 1.5 ± 1.0 (3.3 ± 3.2) 36 ± 4.9 +++, ***, ### (7.6 ± 2.4) 19 ± 8.1 +++, ***, ### (4.6 ± 1.2) 20 ± 4.0 +++, ***, ### (19 ± 2.7) 測定 1 回当たり各試料 1 点ずつ、3 回の実施により得た結果は、平均値±標準偏差で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、、測定 1 回当たり各試料 1 点ず つ、3 回の実施時に使用した CMs 数を表している。 ++ ; p< 0.01、+++; p< 0.001 compared to Cont、***; p < 0.001 compared to Cont-CM、###; p < 0.001 compared to Phyco 49 表 3. Phyco-CM と各刺激物を用いた U937 と HL-60 細胞の特異的、非特異的エステラーゼ染色 cells SE or NSE (%) Cont (n=3) Phyco (n=3) Cont-CM (n=7) Phyco-CM (n=7) PMA (n=3) ATRA (n=3) U937 NSE 94.2 ± 9.5 98.8 ± 1.7 98.9 ± 2.0 99.9 ± 0.2 98.9 ± 1.1 - NSE 0.3 ± 0.5 0.5 ± 0.7 0.5 ± 0.5 0.3 ± 0.5 50 ± 11 +++, *** 0 SE 90 ± 6.5 96 ± 1.4 92 ± 3.2 93 ± 1.4 15 ± 7.1 +++, *** 90 ± 6.5 HL-60 測定 1 回当たり 3 点ずつ、2∼3 回の実施により得た結果は、平均値±標準偏差で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、使用した CMs 数を表している。 +++ ; p < 0.001 compared to Cont、***; p < 0.01compared to Cont-CM 50 表 4. Phyco-CM と各刺激物を用いた U937 と HL-60 細胞の NBT 還元能 cells Cont (n=3) Phyco (n=3) Cont-CM (n=2) Phyco-CM (n=2) PMA (n=3) ATRA (n=3) U937 1.2 ± 0.3 5.0 ± 3.0 1.3 ± 0.8 7.5 ± 4.1 ** 5.2 ± 2.9 - HL-60 0.7 ± 0.3 2.0 ± 1.0 2.1 ± 0.7 5.3 ± 1.9 +++, ** 1.7 ± 0.8 10.8 ± 3.3 +++, *** 値は、測定 1 回当たり各試料 2∼3 枚ずつ実施した結果の平均値±標準偏差で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、使用した CMs 数を表している。 +++ ; p < 0.001 compared to Cont、**; p < 0.01, ***; p < 0.001 compared to Cont-CM 51 表 5. Phyco-CM 刺激 U937 と HL-60 細胞の LPS 応答 a. U937 cells LPS (0 ng/mL) Stimulators Cont Phyco Cont-CM Phyco-CM PMA Phagocytic activity (%) 18 ± 5.2 23 ± 5.1 32 ± 5.5 ++ 81 ± 13 +++, *** 96 ± 4.6 +++, *** LPS (1000 ng/mL) TNF-α (pg/mL) ND < 15.6 46 ± 31 66 ± 15 968 ± 150 *** Phagocytic activity (%) 25 ± 6.3 26 ± 8.3 ** 45 ± 13 +++, # 83 ± 8.2 +++,*** 97 ± 3.7 +++,*** TNF-α (pg/mL) ND ND 51 ± 28 84 ± 21 2103 ± 180 ***, ### b. HL-60 cells LPS (0 ng/mL) Stimulators Cont Phyco Cont-CM Phyco-CM PMA ATRA Phagocytic activity (%) 17 ± 6.2 16 ± 3.8 35 ± 12 ++ 36 ± 13 ++ 84 ± 13 +++ 72 ± 5.2 +++ LPS (1000 ng/mL) TNF-α (pg/mL) ND < 15.6 32 ± 29 71 ± 18 585 ± 39 ND Phagocytic activity (%) 18 ± 2.4 20 ± 7.6 *** 39 ± 7.8 +++ 40 ± 11 +++ 89 ± 10 +++, *** 69 ± 6.9 +++, *** TNF-α (pg/mL) ND < 15.6 50 ± 31 74 ± 18 1246 ± 59 ***, ### 28 ± 18 貪食能は、オプソニン処理 latex beads (opsonin-treated LB)を用いた取り込み細胞数の割合により測 定した。Phyco-CM 刺激 U937 と HL-60 細胞の LPS に対する応答について、貪食能および培養上清中 TNF-α の測定により比較した。測定 1 回当たり 3 点ずつ、1∼3 回の実施により得た結果は平均値± 標準偏差(n=3)で示した。 ++ ; p < 0.01、+++; p < 0.001 compared to Cont in each LPS (0 or 1000 ng/mL)、**; p < 0.01、***; p < 0.001 compared to Cont-CM in each LPS (0 or 1000 ng/mL)、#; p < 0.05, ng/mL、< 15.6; under detection limit (15.6 pg/mL)、ND; not detected 52 ### ; p < 0.001 compared to LPS 0 表 6. サイトカイン産生細胞一覧 主な産生細胞 リンパ球 サイトカイン (T 細胞) IFN-γ IL-3 GM-CSF ○ ○ ○ (B 細胞) NK 細胞 マクロ ファージ ○ ○ ○ 肥満 細胞 ○ ○ ○ 53 上皮 細胞 ○ 謝辞 本研究を進めるにあたり、終始懇切丁寧なご指導を賜りました女子栄養大学 免疫検査学研究室教授 林 修先生に謝意を表します。終始温かい励ましを賜り ました女子栄養大学前教授 奥脇義行先生、細胞の形態学的観察についてご指導 賜りました故小野昭治先生に感謝申し上げます。DIC ライフテック株式会社 (旧 大日本インキ化学工業株式会社)の故加藤敏光様、太郎田博之様、吉川典孝様、 石原光輝様、山西腫瘤医院の石硯海様に感謝申し上げます。最後に、この論文 に関する研究テーマを選択した免疫検査学研究室卒研生の皆さん、支えてくれ た家族、友人に感謝します。 54 参考文献 木口薫: 白血病細胞: 羊土社, 1995: 201-209. 1) 2) Trayner ID, Bustorff T, Etches AE, et al.: Changes in antigen expression on differentiating HL60 cells treated with dimethylsulphoxide, all-trans retinoic acid, alpha1, 25-dihydroxyvitamin D3 or 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate. Leuk Res. 1998; 22: 537-547. 3) Huang ME, Ye YC, Chen SR, et al.: Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Blood. 1988; 72: 567-572. Breimtan.T.R.: Induction of differentiation of human promyelocytic 4) leukemia cel line (HL-60) by retinoic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980; 77: 2936-2940. 5) Chen ZX, Xue YQ, Zhang R, et al.: A clinical and experimental study on all-trans retinoic acid-treated acute promyelocytic leukemia patients. Blood. 1991; 78: 1413-1419. 6) Ciferri O: Spirulina, the edible microorganism. Microbio Rev. 1983; 47: 551-578. 7) Kay R: Microalgae as food and supplement. Critical reviews in food science and nutrition. 1991; 30: 555-573. Shinohara K, Okura Y, Koyano T, Murakami H, Omura H: Algal 8) phycocyanins promote growth of human cells in culture. In Vitro Cell Dev Biol. 1988; 24: 1057-1060. 9) Kobori M, Miyama Y, Tsushida T, Shinmoto H, Shinohara K: Effecct of non-dialyzable extracts of vegetables on the differentiation of U937 human myeloid leukemia cell line. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi. 1995; 42: 61-68. 10) Kobori M, Shinohara K: Effects of Spinach extract on the differentiation of the human promyelocytic cell line. Biosci Biotechnol Biochem. 1993; 57: 1951-1952. 11) Chiao JW, Freitag WF, Steinmetz JC, Andreeff M: Changes of cellular 55 markers during differentiation of HL-60 promyelocytes to macrophages as induced by T lymphocyte conditioned medium. Leuk Res. 1981; 5: 477-489. 12) Koren HS, Anderson SJ, Larrick JW: In vitro activation of a human macrophage-like cell line. Nature. 1979; 279: 328-331. 13) Hayashi O, Ono S, Ishii K, et al.: Enhancement of proliferation and differentiation in bone marrow hematopoietic cells by Spirulina (Arthrospira) platensis in mice. J Appl phycol. 2006; 18: 47-56. 14) Hayashi O, Katoh T, Okuwaki Y: Enhancement of antibody production in mice by dietary Spirulina platensis. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 1994; 40: 431-441. 15) Hayashi O, Hirahashi T, Katoh T, et al.: Class specific influence of dietary Spirulina platensis on antibody production in mice. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 1998; 44: 841-851. 16) Sundstrom C, Nilsson K: Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). Int J Cancer. 1976; 17: 565-577. 17) Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, et al.: Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 1980; 26: 171-176. 18) Gallagher R, Collins S, Trujillo J, et al.: Characterization of the continuous, differentiating myeloid cell line (HL-60) from a patient with acute promyelocytic leukemia. Blood. 1979; 54: 713-733. 19) Collins SJ, Gallo RC, Gallagher RE: Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 1977; 270: 347-349. 20) MacColl R: Allophycocyanin and energy transfer. Biochimica et biophysica acta. 2004; 1657: 73-81. 21) Sidler WA: Phycobilisome and Phycobiliprotein Structures. Netherlands: Kluwer Academic publishers, 1994: 139-216. 22) 新保敏和, 鈴木徹臣, 関口恭子, 石黒精: CD 分類ハンドブック 56 改訂第Ⅳ版 (2000). 東京: 癌と化学療法社, 2003. 23) 朝長万左男: NBT 還元能試験. 臨床病理. 1978; 特集 34 号: 112-124. 24) Yamamoto-Yamaguchi Y, Tomida M, Hozumi M, et al.: Combined effects of differentiation-inducing factor and other cytokines on induction of differentiation of mouse myeloid leukemic cells. Jpn J Cancer Res. 1989; 80: 115-121. 25) Yufeng Liu LX, Ni Cheng, Lijun Lin, Chengwu Zhang: Inhibitory effect of phycocyanin from Spirulina platensis on the growth of human leukemia K562 cells. J Appl phycol. 2000; 12: 125-130. 26) Niu ZY, Pan L, Liu YJ, Zhang XJ, Suo XH: Effects of integrin beta1 on phycocyanin inhibiting proliferation of K562 cells. Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi / Zhongguo bing li sheng li xue hui = Journal of experimental hematology / Chinese Association of Pathophysiology. 2006; 14: 658-661. 27) Basha OM, Hafez RA, El-Ayouty YM, et al.: C-Phycocyanin inhibits cell proliferation and may induce apoptosis in human HepG2 cells. The Egyptian journal of immunology / Egyptian Association of Immunologists. 2008; 15: 161-167. 28) Li B, Chu X, Gao M, Li W: Apoptotic mechanism of MCF-7 breast cells in vivo and in vitro induced by photodynamic therapy with C-phycocyanin. Acta biochimica et biophysica Sinica. 2010; 42: 80-89. 29) Subhashini J, Mahipal SV, Reddy MC, et al.: Molecular mechanisms in C-Phycocyanin induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line-K562. Biochemical pharmacology. 2004; 68: 453-462. 30) Chamorro-Cevallos G. Toxicological research on the alga Spirulina. United Nations International Development Organization (UNIDO); 1980. Report No.: UF/MEX/78/048, Vienna 31) Nakaya N, Goto Y, Yasuhiko H: Cholesterol lowing effect of spurilina. Nutrition Reports International. 1988; 37: 1329-1337. 32) Nemoto-Kawamura C, Hirahashi T, Nagai T, et al.: Phycocyanin enhances secretary IgA antibody response and suppresses allergic IgE antibody 57 response in mice immunized with antigen-entrapped biodegradable microparticles. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2004; 50: 129-136. 33) Fontana JA, Colbert DA, Deisseroth AB: Identification of a population of bipotent stem cells in the HL60 human promyelocytic leukemia cell line. Proc Natl Acad Sci USA. 1981; 78: 3863-3866. 34) Tamagawa K, Fukushima S, Kobori M, Shinmoto H, Tsushida T: Proanthocyanidins from barley bran potentiate retinoic acid-induced granulocytic and sodium butyrate-induced monocytic differentiation of HL60 cells. Biosci Biotechnol Biochem. 1998; 62: 1483-1487. 35) 西村敏治: 血液細胞アトラス−細胞分類の基礎と特殊染色−: 日本臨床衛生 検査技師会, 1987: 24-25. 36) Tudhope SJ, Finney-Hayward TK, Nicholson AG, et al.: Different mitogen-activated protein kinase-dependent cytokine responses in cells of the monocyte lineage. J Pharmacol Exp Ther. 2008; 324: 306-312. 37) Janeway CA, Jr., Medzhitov R: Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 2002; 20: 197-216. 38) Beutler B: Tlr4: central component of the sole mammalian LPS sensor. Curr Opin Immunol. 2000; 12: 20-26. 39) Lu YC, Yeh WC, Ohashi PS: LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 2008; 42: 145-151. 40) da Silva Correia J, Soldau K, Christen U, Tobias PS, RJ. U: Lipopolysaccharide is in close proximity to each of the proteins in its membrane receptor complex. transfer from CD14 to TLR4 and MD-2. J Biol Chem. 2001; 276: 21129-21135. 41) Cherng SC, Cheng SN, Tarn A, Chou TC: Anti-inflammatory activity of c-phycocyanin in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. Life sciences. 2007; 81: 1431-1435. 42) Shih CM, Cheng SN, Wong CS, Kuo YL, Chou TC: Antiinflammatory and antihyperalgesic activity of C-phycocyanin. Anesthesia and analgesia. 2009; 108: 1303-1310. 58 43) Romay C, Gonzalez R, Ledon N, Remirez D, Rimbau V: C-phycocyanin: a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects. Current protein & peptide science. 2003; 4: 207-216. 44) Ge B, Qin S, Han L, Lin F, Ren Y: Antioxidant properties of recombinant allophycocyanin expressed in Escherichia coli. Journal of photochemistry and photobiology. 2006; 84: 175-180. 45) Grolleau A, Sonenberg N, Wietzerbin J, Beretta L: Differential regulation of 4E-BP1 and 4E-BP2, two repressors of translation initiation, during human myeloid cell differentiation. J Immunol. 1999; 162: 3491-3497. 46) Mita Y, Dobashi K, Nakazawa T, Mori M: Induction of Toll-like receptor 4 in granulocytic and monocytic cells differentiated from HL-60 cells. Br J Haematol. 2001; 112: 1041-1047. 47) Niemeyer CM, Sieff CA, Mathey-Prevot B, et al.: Expression of human interleukin-3 (multi-CSF) is restricted to human lymphocytes and T-cell tumor lines. Blood. 1989; 73: 945-951. 48) Lotem J, Sachs L: In vivo control of differentiation of myeloid leukemic cells by cyclosporine A and recombinant interleukin-1 alpha. Blood. 1988; 72: 1595-1601. 49) Ihle JN: Interleukin-3 and hematopoiesis. Chem Immunol. 1992; 51: 65-106. 50) Chen YY, Chang HM: Antiproliferative and differentiating effects of polysaccharide fraction from fu-ling (Poria cocos) on human leukemic U937 and HL-60 cells. Food Chem Toxicol. 2004; 42: 759-769. 51) Ketley NJ, Allen PD, Kelsey SM, Newland AC: Modulation of idarubicin-induced apoptosis in human acute myeloid leukemia blasts by all-trans retinoic acid, 1,25(OH)2 vitamin D3, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood. 1997; 90: 4578-4587. 52) Chen YJ, Shiao MS, Lee SS, Wang SY: Effect of Cordyceps sinensis on the proliferation and differentiation of human leukemic U937 cells. Life sciences. 1997; 60: 2349-2359. 59 53) Anderson P, Sundstedt A, Li L, et al.: Differential activation of signal transducer and activator of transcription (STAT)3 and STAT5 and induction of suppressors of cytokine signalling in T(h)1 and T(h)2 cells. International immunology. 2003; 15: 1309-1317. 54) Shi M, Lin TH, Appell KC, Berg LJ: Janus-kinase-3-dependent signals induce chromatin remodeling at the Ifng locus during T helper 1 cell differentiation. Immunity. 2008; 28: 763-773. 55) Christmas SE, Meager A: Production of interferon-gamma and tumour necrosis factor-alpha by human T-cell clones expressing different forms of the gamma delta receptor. Immunology. 1990; 71: 486-492. 56) Mao TK, Van de Water J, Gershwin ME: Effects of a Spirulina-based dietary supplement on cytokine production from allergic rhinitis patients. Journal of Medicinal Food. 2005; 8: 27-30. 60