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博士 (保健学) 学位論文 ヒト白血病細胞に対するスピルリナ抽出物

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博士 (保健学) 学位論文 ヒト白血病細胞に対するスピルリナ抽出物
博士 (保健学) 学位論文
論文題目
ヒト白血病細胞に対するスピルリナ抽出物フィコシアニンの
分化誘導作用
Effect of Phycocyanin, one of the Extracts of
Spirulina , on Differentiation of Human Myeloid
Leukemia Cells
2010 年
指導教員
林
修
石井 恭子
ISHII, Kyoko
女子栄養大学
教授
要旨
骨 髄 幹 細 胞 は 、マ ク ロ フ ァ ー ジ や 顆 粒 球 な ど の 成 熟 細 胞 に 分 化
す る 性 質 を 持 つ 未 分 化 な 細 胞 で あ る 。し か し な が ら 、分 化 過 程 が
ブ ロ ッ ク さ れ る な ど し て 正 常 な 増 殖 が 逸 脱 し た 場 合 、最 終 分 化 細
胞 に な る 前 に 細 胞 は 癌 化 、す な わ ち 白 血 病 化 す る 。こ れ ら 未 分 化
な 白 血 病 細 胞 に つ い て は 、 全 ト ラ ン ス 型 レ チ ノ イ ン 酸 ( AT R A ) 、
ビ タ ミ ン D 3 、 ホ ル ボ ル エ ス テ ル ( T PA ) の よ う な 化 学 物 質 等 に よ
り 多 機 能 に 分 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。そ れ ら の ひ と つ で あ
る β カ ロ テ ン の 代 謝 物 の AT R A は 、 急 性 前 骨 髄 球 性 白 血 病 細 胞
(APL)に 対 す る 治 療 の 一 つ 、 レ チ ノ イ ン 酸 療 法 と し て 導 入 さ れ て
いる。
本 研 究 は 、藍 色 細 菌 に 属 す る ス ピ ル リ ナ ( S p i r u l i n a p l a t e n s i s )
の 抽 出 物 の 一 つ で あ る フ ィ コ シ ア ニ ン (Phyco; Phycocyanin) に
着 目 し た 。 フ ィ コ シ ア ニ ン は 、 ク ロ ロ フ ィ ル や β -カ ロ テ ン と と
も に ス ピ ル リ ナ に 比 較 的 豊 富 に 含 ま れ る 270-kDa の 光 合 成 色 素
タ ン パ ク 質 で あ る 。ス ピ ル リ ナ 乾 燥 重 量 の 約 1 5 % を 占 め る 。6 1 5
nm に 強 い 最 大 吸 収 波 長 を 持 ち 、 主 に 、 食 品 や 化 粧 品 の 天 然 着 色
料 と し て 利 用 さ れ て い る 。近 年 、フ ィ コ シ ア ニ ン が 、抗 酸 化 作 用
や 抗 炎 症 作 用 、リ ン パ 球 の 活 性 化 、粘 膜 免 疫 シ ス テ ム の 機 能 を 高
める等の作用を持つことが明らかになってきた。しかしながら、
フィコシアニンの白血病細胞に対する分化誘導作用については
報 告 が 少 な い 。本 研 究 で は 、フ ィ コ シ ア ニ ン で 刺 激 し た ヒ ト 末 梢
血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) が 未 熟 な 白 血 病 細 胞 に 対 し
て分化誘導能を持つか否か、およびその分化方向性を検討した。
1
用 い た 白 血 病 細 胞 は 、ヒ ト 単 球 性 白 血 病 細 胞 株 U 9 3 7 細 胞 ( 単 球 、
マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 へ 分 化 )と 前 骨 髄 球 性 白 血 病 細 胞 株 HL-60 細 胞
(顆 粒 球 系 ま た は 単 球 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 へ 分 化 )で あ る 。
本 論 文 は U937 細 胞 と HL-60 細 胞 に 対 す る フ ィ コ シ ア ニ ン の
直 接 あ る い は 間 接 の 分 化 誘 導 効 果 に つ い て 比 較 検 討 し た 。分 化 誘
導 刺 激 に は 、フ ィ コ シ ア ニ ン で 刺 激 し た ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上
清 試 料 (Phyco-CM)を 用 い た 。被 験 者 か ら の 末 梢 血 採 血 に つ い て
は 、香 川 栄 養 学 園 医 学 倫 理 委 員 会 の 承 認 を 得 ( 香 倫 委 第 11 3 号 ) 、
被 験 者 に 文 書・口 頭 に て 実 験 概 要 を 説 明 し た 後 、そ の 同 意 を 得 た 。
末 梢 血 単 核 球 の 分 離 お よ び そ れ ら の 培 養 に よ り 得 ら れ た
P h y c o - C M を U 9 3 7 あ る い は H L - 6 0 細 胞 と と も に 培 養 後 、細 胞 数
の 測 定 、フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 法 を 用 い た 表 面 抗 原 の 検 索 、形 態
学 的 分 類 、細 胞 化 学 的 検 討 等 を 実 施 し 、分 化 誘 導 刺 激 に よ り ど の
方向にどの段階まで分化成熟しているかを検討した。この結果、
Phyco-CM は 、 U937 細 胞 に 対 し て 対 照 と し て 用 い た 無 刺 激 ヒ ト
末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 で あ る Cont-CM に 比 較 し て 細 胞 増 殖
の 抑 制 傾 向 を 示 し 、有 意 差 は み ら れ な い も の の 約 3 倍 の 細 胞 表 面
CD14 抗 原 の 発 現 お よ び 高 い エ ス テ ラ ー ゼ 活 性 を 示 し た 。
Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 は 、 形 態 学 的 観 察 に お い て も 約 57 %
の 単 球 と マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 形 態 を 示 し た 。フ ィ コ シ ア ニ ン 単 独 刺
激では、細胞増殖については抑制よりもむしろ増加傾向を示し、
細 胞 表 面 CD14 抗 原 陽 性 細 胞 率 は 、 無 刺 激 Cont の 約 2 倍 で あ っ
た 。形 態 学 的 分 類 で は 、成 熟 細 胞 へ の 分 化 は ほ と ん ど み ら れ な か
っ た 。H L - 6 0 細 胞 に つ い て は 、い ず れ の 刺 激 に お い て も 細 胞 表 面
CD14 抗 原 の 陽 性 細 胞 率 は 低 く 、 こ れ ら の 値 は U937 細 胞 に 比 較
2
し て 低 値 で あ っ た 。 形 態 学 的 観 察 で は 、 Phyco-CM 刺 激 に よ り
H L - 6 0 細 胞 は 単 球 系 と 顆 粒 球 系 細 胞 の 混 在 を 示 し た が 、顆 粒 球 系
細 胞 に お い て 陽 性 を 示 す 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 に つ い て は 、ほ
と ん ど 陽 性 で あ っ た 。 フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 HL-60 細 胞 で は 、 形
態 学 的 観 察 に お け る 成 熟 細 胞 の 割 合 は 2 %で あ っ た 。
次 に 、 分 化 誘 導 後 の 各 細 胞 に Lipopolysaccharides (LPS)を 添
加 し 、自 然 免 疫 系 で 働 く マ ク ロ フ ァ ー ジ や 樹 状 細 胞 に お い て 病 原
体 を 認 識 し そ の 応 答 シ グ ナ ル を 伝 達 す る 働 き を し て い る
To l l - l i k e r e c e p t o r 4 ( T L R 4 ) 発 現 の 有 無 を 推 測 す る た め に サ イ ト
カ イ ン T N F - α 量 を 測 定 し た 。そ の 結 果 、P h y c o - C M は 、U 9 3 7 と
HL-60 細 胞 の 両 方 に つ い て 、 分 化 誘 導 刺 激 後 の 培 養 上 清 中 TNFα 量 を 高 め た が 、L P S 刺 激 に 応 答 し た 有 意 な 増 加 は み ら れ な か っ
た 。フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 で は U 9 3 7 、H L - 6 0 細 胞 と も に L P S の 添
加 に 関 係 な く TNF-α 量 は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た 。 以 上 の こ と か
らフィコシアニンの未熟な白血病細胞に対する分化誘導作用は、
直 接 的 よ り も 間 接 的 に 働 き 、 Cont-CM よ り も フ ィ コ シ ア ニ ン で
刺 激 す る こ と で よ り 分 化 誘 導 作 用 を 高 め る こ と が 示 唆 さ れ た 。さ
ら に 、 Phyco-CM 刺 激 後 の 細 胞 に お い て 、 特 に U937 細 胞 に お い
て は 単 球 、マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 へ 分 化 誘 導 し た こ と が 示 唆 さ れ
た が 、 こ れ ら 細 胞 の LPS 応 答 性 は 低 い か あ る い は 持 た な い こ と
が示唆された。
Phyco-CM は 、 分 化 誘 導 因 子 と し て 、 高 濃 度 の IFN-γ お よ び
GM-CSF を 含 有 し て い た 。 本 研 究 の 結 果 か ら 、 IFN- γ お よ び
GM-CSF、 あ る い は そ れ ぞ れ が 、 U937 細 胞 と HL-60 細 胞 の 一 部
を単球、マクロファージ系へ分化したことが推測された。
3
以上の結果から、フィコシアニンは、リンパ球等に働きかけ、
白血病細胞のような未熟な細胞を正常な細胞へ分化するように
促す手助けをする可能性が示唆された。
4
目次
ヒ ト 白血 病 細胞 株 U937 細胞 およ び HL-60 細胞 にお よ ぼす フィ コシ ア ニ
ン 刺 激ヒ ト 単核 球培 養上 清 (Phyco-CM)の分 化誘 導 作用 ············ 1
第1節
序論 ················································ 1
第2節
材料 と方 法 ·········································· 4
1.
ヒ ト白 血 病細 胞 株 ······································· 4
1) U937 細胞 ············································· 4
2) HL-60 細胞 ············································ 4
2.
フ ィコ シ アニ ン (Phyco; Phycocyanin) ···················· 5
3.
ヒ ト末 梢 血単 核 球細 胞の 分 離 ····························· 6
4.
フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)の 調
製 ······················································ 6
5.
分 化誘 導 作用 の 測 定 ····································· 7
1) 陽 性 対照 ·············································· 7
1)-1 ホル ボ ルエ ス テル (PMA) ····························· 7
1)-2 全ト ラ ンス 型 レチ ノイ ン 酸 (ATRA) ···················· 7
2) 分 化 誘導 ·············································· 7
3) 細 胞 増殖 およ び 生存 率の 測 定 ··························· 8
4) フ ロ ーサ イト メ トリ ー (FCM; Flow cytometric)法を 用 いた 細
胞表 面抗 原 の測 定 ······································ 8
5) 形 態 学的 分析 ········································· 10
6) 細 胞 化学 的検 討 ······································· 11
6)-1 非特 異 的お よ び特 異的 エ ステ ラー ゼ染 色 ·············· 11
6)-2 Nitro bule tetrazolium (NBT) 還 元能 試験 ············ 11
i
6.
Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 と HL-60 細 胞 に お け る
Lipopolysaccharides (LPS)応答 性 ······················· 12
1) オ プ ソニ ン処 理 latex beads (opsonin-treated LB)貪食 能 · 12
2) Phyco-CM 刺激 U937、 HL-60 細胞の TNF-α 量産 生 ······ 13
7.
フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サ
イト カイ ン の検 出
···································· 13
1) ヒ ト 末梢 血単 核 球浮 遊液 試 料の 細胞 分類 ················ 13
2) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サ
イト カイ ン の検 出 ····································· 14
8.
統 計解 析 ·············································· 15
第3節
1.
結果 ··············································· 15
分 化誘 導 作用 ·········································· 15
1) 増 殖 曲線 およ び 生存 率 ································· 15
2) FCM 法 によ る細 胞表 面抗 原 の測 定 ······················ 15
3) 形 態 学的 変化 ········································· 18
4) 細 胞 化学 的変 化 ······································· 19
2.
Phyco-CM 刺激 U937 細胞と HL-60 細胞 にお ける LPS 応答 性
··················································· 20
1) opsonin-treated LB 貪食 能 ····························· 20
2) Phyco-CM 刺激 U937、 HL-60 細胞の TNF-α 量産 生 ······ 20
3.
フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) 中
サイ トカ イ ンの 検出 ··································· 21
1) ヒ ト 単核 球浮 遊 液試 料の 細 胞分 類 ······················ 21
2) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) 中
サイ トカ イ ンの 検出 ··································· 21
ii
3) ヒ ト 末梢 血単 核 球培 養上 清 試料 (Phyco-CM、Cont-CM)中サ イ
トカ イン と 分類 細胞 との 関連 ··························· 21
第4節
考察 ··············································· 22
図 表 ························································· 33
謝 辞 ························································· 54
参 考 文献 ····················································· 55
iii
ヒ ト 白 血 病細 胞 株 U937 細 胞お よ び HL-60 細 胞に お よ ぼす フィ コ シ ア
ニ ン 刺 激 ヒト 単 核 球 培養 上 清 の分 化 誘 導 作用
第1節
序論
骨 髄 幹 細 胞は 、 マク ロフ ァ ー ジや 顆 粒 球 など の 成 熟細 胞 に 分 化す る 性
質 を 持 つ 未分 化 な 細 胞で あ る 。し か し な がら 、 分 化過 程 が ブ ロッ ク され
る な ど し て正 常 な 増 殖が 逸 脱 した 場 合 、 最終 分 化 細胞 に な る 前に 細 胞は
癌 化 、す な わち 白 血 病化 す る
1) 。
こ れ ら 未分 化 な 白血 病 細 胞 につ い て は、
全 ト ラ ン ス型 レ チ ノ イン 酸 、 ビ タミ ン D 3 (1α , 25-dihydroxyvitamin
D 3 )、 ホル ボ ル エス テル (TPA; 12- o -tetradecanoyl phorbol-13 acetate)
の よ う な 化学 物 質 等 によ り 多 機能 に 分 化 する こ と が報 告 さ れ てい る
2, 3) 。
そ れ ら の ひと つ で あ るβ カ ロ テン の 代 謝 物の ATRA は、急 性 前骨 髄 球性
白 血 病 細 胞 (APL)に 対す る 治 療の 一 つ、レチ ノ イ ン酸 療 法 と して 導 入 さ
れ て い る 。白 血 病細 胞に は 分 化能 が あ り 、in vitro だ け で なく 、in vivo (白
血 病 患 者 )に お い て も 成 熟 細 胞 に 分 化 し 得 る 能 力 は 持 つ 。 1981 年 に in
vitro で APL 細 胞 の み が ATRA に 反 応 し 、 最 終 分 化 (Terminal
differentiated cell)する こ と が報 告 さ れ た
4) 。そ の 後 、 1991
年 に Chen
ら 5) に より ATRA が 重大 な 副 作用 も なく APL 患 者の 80 % 以 上を 単 独 で
分 化 誘 導 し、 寛 解 導 入に 成 功 した こ と が 示さ れ た 。こ の 報 告 によ り 白血
病 が 分 化 誘導 に よ っ て治 療 で きる こ と が 示さ れ た 。
本 研 究 で は、スピ ル リナ 抽 出 物の 一 つ で あり 、クロ ロ フィ ル やβ -カ ロ
テ ン と と も に 比 較 的 豊 富 に 含 ま れ る 270-kDa の 光 合 成 色 素 タ ン パ ク 質
フ ィ コ シ アニ ン (Phyco; Phycocyanin)に 着目 し た 。フ ィ コ シ アニ ン は 、
ス ピ ル リ ナ乾 燥 重 量 の約 15 %を 占 める
1
6, 7) 。 615
nm に 強い 最大 吸 収 波
長を持ち、主に、食品や化粧品の天然着色料として利用されている。
Shinohara ら
8) は 、 植物 性 の 食品 と し て 利用 さ れ てい る サ イ ココ ッ カス
や ス ピ ル リナ な ど の 好熱 性 藍 藻類 の 抽 出 液が ヒ ト 由来 の リ ン パ芽 球 様細
胞 な ど の 増殖 を 促 進 し、 そ の 活性 の 中 心 が光 合 成 色素 の フ ィ コシ ア ニン
タ ン パ ク であ る こ と を明 ら か にし た 。 健 康補 助 食 品と し て 市 販さ れ てい
る ス ピ ル リナ の 成 分 のひ と つ であ る フ ィ コシ ア ニ ンや 食 品 で ある 野 菜等
の 成 分 な どが 、 未 分 化の 白 血 病細 胞 に 対 して 分 化 誘導 す る こ とに よ り、
発 が ん 防 止や 成 熟 細 胞へ の 分 化促 進 を 期 待で き る 。Kobori ら
9, 10) は 、ホ
ウ レ ン 草 抽出 液 中 の 高分 子 画 分が ヒ ト 白 血病 細 胞 の形 態 変 化 を誘 導 し細
胞 を マ ク ロフ ァ ー ジ へ分 化 誘 導す る こ と や、 ホ ウ レン 草 の 非 透析 物 によ
る 前 骨 髄 球 性 白 血 病 細 胞 HL-60 細 胞 の 単 球 へ の 分 化 お よ び ヒ ト 単 球 性
白 血 病 細胞 U937 細 胞の 単 球 /マク ロ フ ァー ジ 系 への 分 化 に つい て 示 して
いる。
一 方 、Chiao ら
11) は 、ヒ ト 末 梢血 リ ンパ 球培 養 上 清
(CM; lymphocyte
conditioned medium)が、 前 骨 髄球 性 白 血病 細 胞株 HL-60 細胞 を 単 球 、
マ ク ロ フ ァー ジ 様 細 胞へ 分 化 させ る こ と を示 し た 。こ の 報 告 によ れ ば、
30 %CM 加 RPMI 培 地と と も に培 養 し た HL-60 細 胞 の 28 %が 3 日 目 で 、
96 %が 8 日 目 でマ ク ロフ ァ ー ジ様 形 態 を 示し て い る。また U937 細胞 に
つ い て も 、リ ン パ 球 の産 生 す るサ イ ト カ イン に よ り活 性 化 マ クロ フ ァー
ジ に 分 化 する こ と が 知ら れ て いる
12) 。こ の分 化 成 熟の 要 因 と して 、活 性
化 T リ ンパ 球 に より CM 中に 放 出 され た 成熟 因 子 の存 在 を 示 唆し て い る 。
動 物 実 験 にお い て 、 熱水 抽 出 物、 フ ィ コ シア ニ ン 、細 胞 壁 成 分の 各 スピ
ル リ ナ 試 料を 5 週 間 摂取 し た マウ ス の 末 梢血 液 に おい て 、好 中球 と リ ン
パ 球 割 合 の増 加 が 観 察さ れ た
13) 。ま た 、フィ コ シ アニ ン と 他 のス ピ ルリ
ナ 抽 出 物 を含 む 飼 料 を摂 取 さ せた マ ウ ス にお い て 、骨 髄 細 胞 の増 加 作用
2
と 脾 臓 細 胞を 培 養 し て得 た 上 清に よ る コ ロニ ー 形 成活 性 の 誘 導作 用 が報
告 さ れ て いる
14, 15) 。これ ら の こと か ら、スピ ル リ ナ成 分 が 骨 髄細 胞 の よ
う な 未 熟 な細 胞 を 成 熟細 胞 に 分化 誘 導 す るこ と が 期待 さ れ る が、 そ の報
告 は 少 な い。 フ ィ コ シア ニ ン でヒ ト 末 梢 血単 核 球 細胞 を 刺 激 する こ とに
よ り 、 リ ン パ 球 等 を 活 性 化 し 、 CM 中 の 成 熟 因 子 の 産 生 を 促 進 し 、 CM
と 同 等 あ るい は そ れ 以上 に 未 熟な 白 血 病 細胞 の 分 化を 促 進 す るこ と が期
待できる。
本 研 究 は 、ス ピ ルリ ナの 抽 出 物の 一 つ で ある フ ィ コシ ア ニ ン で刺 激 し
た ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)の 未 熟 な 白 血 病 細 胞 に 対
す る 分 化 誘導 能 の 有 無と そ の 分化 方 向 性 を検 討 し たも の で あ る。 細 胞の
分 化 に つ いて 検 討 す るう え で 重要 な こ と は、 増 殖 が抑 え ら れ てい る か、
最 終 分 化 細 胞 (Terminal differentiated cell)に 特 異 的 な 機 能 が 発 現 し て
い る か 否 か、 で あ る 。 Phyco-CM 刺 激 U937、 HL-60 細 胞を 用い て 、 分
化 誘 導 に 関す る 実 験 項目 (表 1.)、すな わ ち細 胞 数 の測 定、フ ロー サ イ ト
メ ト リ ー 法を 用 い た 表面 抗 原 の検 索 、 形 態学 的 分 類、 細 胞 化 学的 検 討を
実 施 し 、 分化 誘 導 刺 激に よ り どの 方 向 に どの 段 階 まで 分 化 し てい る かを
推 測 し た 。 同 時 に、 分 化誘 導 後 の 各 細胞 に Lipopolysaccharides (LPS)
を 添 加 し 、自 然 免 疫 系で 働 く マク ロ フ ァ ージ や 樹 状細 胞 に お いて 病 原体
を 認 識 し そ の 応 答 シ グ ナ ル を 伝 達 す る 働 き を し て い る Toll-like
receptor 発現 の 有 無 を推 測 す るた め に サ イト カ イン TNF-α 量を 測 定し
た 。 さ ら に、 Phyco-CM 中 の U937、 HL-60 細 胞 に 対す る 分 化誘 導 因 子
の 存 在 に つい て 検 索 する た め に、 Phyco-CM 中 サ イト カ イン の測 定 を 行
い 、 フ ィ コシ ア ニ ン のリ ン パ 球等 に 対 す る活 性 に つい て 検 討 した 。
3
第2節
材料と方法
1 . ヒ ト 白血 病 細 胞 株
1) U937 細 胞
U937 細胞 株 (JCRB9021)は 、ヒ ュ ー マン サイ エ ン ス研 究 資 源 バン ク (財
団 法 人 ヒ ュー マ ン サ イエ ン ス 振興 財 団 、大阪 )よ り入 手 した 。U937 細 胞
は 、 単 球 性白 血 病 細 胞で 、 組 織球 性 リ ン パ腫 患 者 の胸 水 か ら 得ら れ 、ウ
プ サ ラ 大 学の Sundstrom と Nilsson に よ って 1976 年に 樹 立 され た
16) 。
単 球 様 細 胞 の 形 態 を 示 し 、 リ ゾ チ ー ム 産 生 、 フ ッ 化 ナ ト リ ウ ム (NaF)に
よ っ て わ ずか に し か 阻害 さ れ ない 非 特 異 的エ ス テ ラー ゼ 活 性 を保 持 し、
Fc 受 容 体お よ び C3 受容 体 陽 性で あ る こ とが 知 ら れて い る。ファ ゴ サ イ
ト ー シ ス (貪 食 )も 観 察さ れ る 。リ ン パ 球 の産 生 す るサ イ ト カ イン に よ り 、
U937 細 胞は 活 性化 マク ロ フ ァー ジ に 分 化す る こ とが 知 ら れ てい る
表 面 免 疫 グロ ブ リ ン 、ア ル カ リ性 ホ ス フ ァタ ー ゼ など は 陰 性 であ る
12) 。
17)
2) HL-60 細胞
HL-60 細 胞 株 (JCRB0085)は 、 ヒ ュ ー マ ン サ イ エ ン ス研 究 資 源 バ ンク
(財 団 法 人 ヒ ュ ー マ ン サ イ エ ン ス 振 興 財 団 、 大 阪 )よ り 入 手 し た 。 前 骨 髄
球 性 白 血 病 細 胞 で 、 急 性 前 骨 髄 性 白 血 病 細 胞 (APL)の 患 者 の 末 梢 血 か ら
得 ら れ 、 アメ リ カ 国 立ガ ン 研 究所 の Gallo グル ー プ によ っ て 1979 年 に
樹 立 さ れた
18) 。前 骨 髄球 様 細 胞が
90%以 上を 占 め、若 干の 骨 髄芽 球・顆
粒 球 様 細 胞が み ら れ る 。HL-60 細胞 は 、用い る 分 化誘 導 物 質 によ り 、顆
粒 球 な い し単 球 ・ マ クロ フ ァ ージ 様 細 胞 の二 方 向 性を 示す
19) 。
継 代 培 養 に つ い て は 、 300 mg/mL L-Glutamine 、 2,000 mg/mL
NaHCO 3 、100 U/mL penicillin、 100 g/mL streptomycin お よび 10%不
活 性 化 ウ シ胎 児 血 清 (FBS; fetal bovine serum, GIBCO Lab., NY)を 添加
4
し た RPMI-1640 メ ディ ウ ム (日 研 生物 医学 研 究 所、 京 都 ) (RPMI-FBS)
を 用 い た 。 細 胞 保 存 液 セ ル バ ン カ ー (十 慈 科 学 工 業 株 式 会 社 )に 懸 濁 し 、
−80℃ フ リ ーザ ー 内 に保 存 し てあ る U937 お よ び HL-60 細 胞 各 1 mL を
溶 解 後 、RPMI-FBS を 10 mL 加 えた 培 養フ ラ ス コ (25 cm 2 flask, 住 友 ベ
ー ク ラ イ ト社 )に入 れ、37℃、5%CO 2 イ ンキ ュ ベ ータ ー に て 培養 し た。3
∼ 4 日 に 一度 の 割合 で、 2∼ 3 mL の細 胞浮 遊 液を 8 mL の 新鮮 な 培 地に
移 す こ と によ っ て 継 代培 養 し た。
2 . フ ィ コシ ア ニ ン (Phyco; Phycocyanin)
ス ピ ル リ ナ ( Spirulina platensis )の 乾燥 菌体 か ら 50 mM リ ン酸 緩 衝 液
(pH 6.0)に て 20℃ 、16 時間 抽 出し 、フ ィ コシ ア ニ ン粗 抽 出 物 を得 た
13) 。
こ の 粗 抽 出物 10g を 30 mM リ ン 酸カ リウ ム 緩 衝液 (pH 6.0) 250 mL に
溶 解 し 、 4 %フ ィ コ シ ア ニ ン 粗 抽 出 物 溶 液 と し た 。 そ こ に 、 硫 酸 ア ン モ
ニ ウ ム を 20 %濃度 にな る よ うに 加 え、沈殿 し た タン パ ク 質 を 7,000 rpm、
30 分間 遠 心分 離 し た。 こ の 上清 に さ ら に硫 酸 ア ンモ ニ ウ ム を 60 %にな
る よ う に 加え 、 7,000 rpm、30 分 間遠 心 分離 し 、 タン パ ク 質 を沈 殿 さ せ
た 。 こ の タン パ ク 質 沈殿 物 に はフ ィ コ シ アニ ン を 含む 。 こ れ をリ ン 酸カ
リ ウ ム 緩 衝液 に 再 度 溶解 、 透 析し 硫 酸 ア ンモ ニ ウ ムを 除 去 し た。 透 析内
液 は 、 DEAE-セ ル ロ ー ス -DE-52 イ オ ン 交 換 カ ラ ム クロ マ ト グ ラ フ ィー
に か け て 0.1M KCl 溶出 画 分 を採 取 し た 。こ の 溶 出画 分 に つ いて 、 再度
硫 酸 ア ン モニ ウ ム と 透析 を 繰 り返 し、純 度 80 %以 上 の フィ コシ ア ニ ンを
得 た 。フ ィ コシ ア ニ ン粗 抽 出物 10 g か ら 0.6 g の精 製 品 が 得ら れ た 。こ
の 標 品は DIC 株 式 会社 よ り 供与 さ れ た 。こ の フィ コ シア ニ ン粉 末を PBS
(-)に て 10 mg/mL 濃 度に な る よう に 溶 解 した 後 、 0.45 μ m pore size デ
ィ ス ク フ ィル タ ー に て濾 過 滅 菌し 、ス ト ック 液 と した 。実 験 には PBS (-)
に て 適 宜 希釈 し た も のを 用 い た。 な お 、 本研 究 で 用い た フ ィ コシ ア ニン
5
に つ い て は、 開 環 テ トラ ピ ロ ール 構 造 を 持ち 、 A 環で タ ン パ ク質 サ ブユ
ニ ッ ト と 共有 結 合 し てい る 1 量体 の フィ コシ ア ニ ンが 、 3 個 会合 し 3 量
体 を 形 成 し て い る C-フ ィ コ シ ア ニ ン (分 子 量 138,000) 20,
21) で あ る
(図
1.)。
3 . ヒ ト 末梢 血 単 核 球細 胞 の 分離
無 菌 的 に 採取 し た 健 常者 7 名か ら 得た 末 梢血 を 、PBS (-)にて 2 倍希 釈
し 、 リ ン パ球 比 重 分 離液 (比 重 1.077 g/mL、 NYCOMED) 5 mL に 重層
し 、 遠 心 (800g、30 分) 分離 し て 分 離液 と 血漿 の 間 にあ る 単 核 球層 を 回
収 し て ヒ ト末 梢 血 単 核球 細 胞 (PBMCs; peripheral blood mononuclear
cells)を 得た 。PBMCs 層に 0.83 %塩化 ア ンモ ニ ウ ム・トリ ス 緩衝 液 を 加
え 、 赤 血 球を 除 去 し た後 、 PBS (-)で 遠 心洗 浄 し 、 RPMI-FBS にて 各 被
験 者 の PBMCs 1×10 6 cells/mL 浮 遊液 を調 製 し た。
被 験 者 か らの 末 梢 血 採取 に つ いて は 、香 川栄 養 学 園医 学 倫 理 委員 会 の
承 認 を 得 (香倫 委第 113 号 )、被 験 者に 文 書・口頭 に て実 験 概 要を 説 明 し
た 後 、 そ の同 意 を 得 た。
4 . フ ィ コシ ア ニ ン 刺激 ヒ ト 単核 球 培 養 上清 試 料 (Phyco-CM)の 調 製
上 述 3 . で得 た ヒ ト 単核 球 浮 遊液 (1×10 6 cells/mL)を 、 24 ウェ ル マ
イ ク ロ プ レー ト (24-well culture plate、 CORNING、 Cat. No. 3526)1
ウ ェ ル あ たり 1 mL ずつ 播 種 し、 2 mg/mL フィ コ シ アニ ン を 0.1 mL ず
つ 添 加 して 37℃ 、5 %CO 2 条 件下 にて 7 日間 培 養 した 後 、培 養上 清 試 料
(Phyco-CM)を得 た 。比 較対 照 と して 単 核球 浮 遊 液に RPMI-FBS 0.1 mL
を 添 加 し 、 培 養 上 清 試 料 (Cont-CM)を 得 た 。 各 ウ ェ ル の 単 核 球 培 養 上 清
試 料 は 、0.45μm pore size ディ ス クフ ィ ルタ ー (IWAKI GLASS、Code
2053-025)に て細 胞 除去 と と もに 濾 過 滅 菌し た (図 2.)。こ の もの は、使 用
時 ま で −80℃保 存 と した 。
6
5 . 分 化 誘導 作 用 の 測定
1) 陽性 対 照
陽 性 対 照 とし て 次 の 試薬 を 用 いた 。
1)-1 ホル ボ ル エス テ ル
(PMA; phorbol-12-myristate-13-acetate 、 和 光 純 薬 工 業 、 No.
545-00261)
ホ ル ボ ル エス テ ル (PMA)は、 分 子式 C 35 H 55 O 8 、 分子 量 616.84、水 難
溶 性 、 有 機溶 媒 に 可 溶の 無 色 物質 で あ る 。 1 mg を dimethyl sulfoxide
(DMSO) 1mL に 溶 解し て ス トッ ク 溶 液 とし た 。 この も の を RPMI-FBS
に て 500 倍 希 釈 し て 2 μ g/mL 濃 度 で 用い た 。
1)-2 全ト ラ ン ス型 レ チノ イ ン 酸
(ATRA; all- trans retinoic acid、 SIGMA、 No. R-2625)
全 ト ラ ン ス型 レ チ ノ イン 酸 は 、分 子式 C 2 H 28 O 2 、分 子量 300.44、脂 溶
性 、黄 色粉 末 物質 で ある 。15 mg を 純 ア ルコ ー ル 10 mL に 溶解 し て 5 mM
ス ト ッ ク 溶 液 と し 、 こ れ を 適 宜 純 ア ル コ ー ル に て 1 mM と し て 用 い た 。
2) 分化 誘 導
25 cm 2 flask に て 3 日間 前 培 養し た U937 あ る い は HL-60 細 胞を 集 め
て 、 遠 心 、洗 浄 後 、 RPMI-FBS に て 0.5×10 6 cells/mL 浮 遊 液と し た 。
24 ウェ ル マイ ク ロ プレ ー ト 1 ウ ェ ルあ たり U937 ある い は HL-60 細 胞
懸 濁 液 を 1 mL ず つ 分注 し 、 37℃、 5 %CO 2 イ ン キュ ベ ー タ ーに て 3 日
間 分 化 誘 導 刺 激 し た 。 す な わ ち 、 ① 無 刺 激 対 照 (Cont) 群 と し て
RPMI-FBS を 0.1 mL/well、 ② 比較 対 照 群と し て フィ コ シ ア ニン 無 刺 激
単 核 球 培養 上 清 (Cont-CM)を 0.1 mL/well、 ③実 験 試 料 群 と し て フィ コ
シ ア ニ ン 刺激 単 核 球 培養 上 清 (Phyco-CM)を 0.1 mL/well、 ④ 陽性 対 照 群
と し て PMA 2μ g/mL あ る い は ATRA 1mM を そ れぞ れ 10μ L/well 加 え
7
た 。 分 化 誘導 刺 激 後 、各 ウ ェ ル中 の 細 胞 をそ れ ぞ れ小 試 験 管 に回 収 し、
PBS (-)にて 遠 心 洗 浄 (1,300 rpm、 5 分 )後 、 各分 化 誘導 作用 の 測 定に 用
い た (図 3.)。
3)細 胞 増 殖お よ び 生存 率 の 測定
2)に 従 い 、分 化 誘 導刺 激 後 に回 収 し 、 PBS (-)にて 遠 心洗 浄し た 細 胞
の 一 部 を 用い て 、 そ れぞ れ の 分化 誘 導 刺 激細 胞 に おけ る 細 胞 数の 算 定及
び 生 存 率 の算 出を 0.25 %ト リパ ン ブ ルー 染色 液 を 用い て 行 っ た 。分 化 誘
導 刺 激 後 、 1、2、3、4、5、7 日 目に 細 胞を 回 収 し、 生 細 胞 (無染 色 )、
死 細 胞 (青 染 色 )を ビ ル ケ ル チ ュ ル ク の 計 算 盤 に て 計 数 し 、 細 胞 生 存 率
(%)を算 出 し た 。同 時に 細 胞 数を 算 出 し た 。な お 、細 胞回 収 時に 24 ウ ェ
ル マ イ ク ロプ レ ー ト への 付 着 が見 ら れ た 細胞 に つ いて は 、 セ ルス ク レイ
パ ー (CELL SCRAPER、TPP®、 Cat. No. 99002)を 用い て 回 収し た 。
4) フロ ー サ イト メ トリ ー (FCM; Flow cytometric)法を 用 いた 細 胞 表
面 抗 原 の 測定
蛍 光 抗 体 染色 に つ い ては 以 下 のも の を 用 いた 。 細 胞表 面 抗原 につ い て
は 、 分 化 誘導 刺 激 後 の各 細 胞 がど ち ら の 方向 に ど の段 階 ま で 分化 誘 導さ
れ て い る か推 測 す る ため に 骨 髄系 細 胞 の 成熟 過 程 と表 面 抗 原 の発 現 を参
考 に 選 択 した
22 )
(図 4.)。
<U937 細 胞、 HL-60 細胞 共 通>
蛍光 標 識 モノ ク ロ ナ ール 抗 体 :
・ 抗 CD11b-FITC (IO Test、 IM0530、 Clone; BEAR1、 mouse IgG1)
・ 抗 CD15-PE (BD Pharmingen、 555402, Clone; HI98、 mouse IgM
κ)
・抗 CD14-FITC (IO Test、IM0645U、Clone; RMO52、mouse IgG2a)
蛍光 標 識 アイ ソ タ イ プコ ン ト ロー ル :
8
・mouse IgG2a-FITC (Cyto-stat、6603855、Clone; 7T4-1F5、mouse
IgG2a)
・mouse IgG1-FITC (IO Test、PN IM0639、Clone; 679.1Mc7、mouse
IgG1)
< HL-60 細 胞の み >
蛍光 標 識 モノ ク ロ ナ ール 抗 体
・ 抗 CD66b-FITC (IO Test、 IM0531、 Clone; 80H3、 mouse IgG1κ )
蛍光 標 識 アイ ソ タ イ プコ ン ト ロー ル :
・mouse IgG1-FITC (IO Test、PN IM0639、Clone; 679.1Mc7、mouse
IgG1)
蛍 光 抗 体 染色 に つ い ては 、 以 下の 通 り 実 施し た 。 3 日 間 分化 誘導 刺 激
し た U937 あ る いは HL-60 細胞 は 、回 収 、洗 浄 後、 2∼ 3×10 6 cells/mL
に 調 製 し 、各 蛍 光 抗 体染 色 に 用い た 。 す なわ ち 、 CD11b と CD66b 抗 原
陽 性 細 胞 を測 定 す る ため に 、洗浄 後の U937 ある いは HL-60 細胞 (2∼3
×10 6 cells/mL)各 0.1 mL と、 抗 CD11b 抗体 あ る いは 抗 CD66b 抗体 を
そ れ ぞ れ 別 の プ ラ ス チ ッ ク 製 試 験 管 (12mmφ×75mm; BECKMAN
COULTER)に 15μ L ずつ 添 加し 、4℃ 、30 分間 遮 光し て イ ンキ ュ ベ ート
し た 。PBS (-)に て 洗 浄後 、懸濁 し、測 定 試料 と し た。アイ ソ タイ プ コ ン
ト ロ ー ル につ い て も 同様 に 蛍 光抗 体 染 色 を行 い 、 刺激 ご と に 用意 し たコ
ン ト ロ ー ル試 料 を 用 いて デ ー タ取 得 時 の 閾値 を 決 めた 。
CD15 抗 原 を測 定 す るた め に、洗 浄後 の U937 ある いは HL-60 細胞 (2
∼ 3×10 6 cells/mL)各 0.1 mL に 、 2 %正常 ヒ ト 血清 (AB 型 ) (Human
Serum AB、 GEMINI、No. 100-512)を 添加 し 、 30 分 間 室 温に て イ ンキ
ュ ベ ー ト した 。PBS (-)に て 洗 浄 後、抗 CD15 抗体を 15μ L 添 加し 、4℃ 、
30 分間 遮 光し て イ ンキ ュ ベ ート し た 。洗浄 後 、懸濁 し 、測 定 試料 と し た。
9
閾 値 を 決 める た め の アイ ソ タ イプ コ ン ト ロー ル に つい て は、測定 時、PE
標 識 mouse IgM 抗 体が 市 販 され て い な かっ た 。 従っ て 、 分 化誘 導 刺激
に よ り 発 現が 推 測 さ れる Fc レ セ プ ター (FcR)の影 響 を 除く こ と、IgG よ
り IgM で 作 ら れ た 抗 体 の 方 が 抗 原 の 凝 集 が 強 い こ と か ら 非 特 異 結 合 の
無 い 状 態 で 測 定 す る た め に 、 抗 体 を 添 加 す る 前 に 正 常 ヒ ト 血 清 (AB 型 )
を 添 加 し た。 閾 値 に つい て は 、刺 激 ご と に無 染 色 の細 胞 を 用 いて 設 定し
た。
CD14 抗 原 の測 定 に つい て は 、最 初 に 洗 浄後 の U937 あ るい は HL-60
細 胞 (2∼3×10 6 cells/mL)各 0.1 mL に 、 3%正 常 マウ ス 血 清
(Normal
Mouse Serum、WAKO、No.146-06551)を添 加 し、マ ウス IgG2a に 対す
る Fc レセ プ ター を 塞ぎ 非 特 異的 結 合 の 無い 状 態 とし た 。次 に 、抗 CD14
抗 体 を 各 試験 管に 15μL 添 加 し 、4℃ 、30 分間 遮 光し て イ ンキ ュ ベ ート
し た 。 洗 浄後 、 懸 濁 し、 測 定 試料 と し た 。ア イ ソ タイ プ コ ン トロ ー ルに
つ い て も 同様 に 蛍 光 抗体 染 色 を行 い 、 刺 激ご と に 用意 し た コ ント ロ ール
試 料 を 用 いて デ ー タ 取得 時 の 閾値 を 決 め た。
フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 法 は 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー (FCM; EPICS®
ALTRA™、Beckman Coulter, Inc.、Fullerton、CA)を 用い て検 出 し た。
各 表 面 抗 原の 陽 性 に つい て は 、閾 値 を 越 えた 蛍 光 強度 を 持 つ 細胞 を 陽性
細 胞 と し た。 シ ン グ ルあ る い はダ ブ ル パ ラメ ー タ ーの ヒ ス ト グラ ム は、
ロ グ ス ケ ール を 用 い て示 し た 。デ ー タは 、各 試 料 あた り 5,000 個中 の 陽
性 細 胞 数 およ び 蛍 光 強度 で 表 した 。
5) 形態 学 的 分析
分 化 誘 導 刺激 した U937 および HL-60 細胞 は 、PBS(-)に て 遠心 、洗 浄
後 、2.5×10 5 cells/mL に調 製 し た。 そ の細 胞 懸 濁液 0.2 mL をサ イ トス
ピ ン (Shandon Southern Products、Cheshire、England)に て 300 rpm、
10
10 分間 遠 心し て ス ライ ド 標 本と し た。乾燥 後、メ イ グリ ュ ンワ ル ド 液お
よ び ギ ム ザ染 色 液 (武藤 化 学 、東 京 )を 用い て 染 色を 行 っ た 。細胞 形 態に
つ い て は 、 光 学 顕 微 鏡 下 で 次 の 分 類 に 従 い 、 細 胞 の 成 熟 過 程 を 、 U937
細 胞 に つ い て は 、 1) 単 芽 球 、 2) 前 単 球 、 3) 単 球 、 4) マ ク ロ フ ァ ー ジ
の 4 つ に分 類 した (図 5.)。 HL-60 細胞 につ い て は、 1) 芽 球、 2) 中 間 、
3) 成熟 の 3 つに 分 類し た 。 分 類 1)の 芽球 細 胞 は、 骨 髄 芽 球と 単 芽 球を
含 み 、2)の 中間 に つ いて は、前 骨 髄球 と 骨髄 球 を、3)の 成 熟 につ い て は、
後 骨 髄 球 と桿 状 核 球 およ び 分 葉核 球 を 含 んで い る (図 6.)。
6) 細胞 化 学 的検 討
6)-1 非 特 異 的お よ び特 異 的 エス テ ラ ー ゼ染 色
5)で PBS (-)に て 2.5×10 5 cells/mL に 調 製し た 細 胞懸 濁 液 0.2 mL を、
サ イ ト ス ピン にて 300 rpm、10 分 間 遠 心 して 別 に スラ イ ド 標 本を 作 製 し
た 。 乾 燥 後 、 U937 細 胞 に つ い て は 、 単 球 系 細 胞 に 強 い 反 応 性 を 示 す α
-naphtyl acetate を 基 質 と す る 非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 (NSE; non
specific esterase、 武藤 化 学 、東 京 )を 行っ た 。 HL-60 細 胞に つ い ては 、
非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 と 骨 髄 系 細 胞 に 強 い 反 応 性 を 示 す naphthyl
AS-D chloroacetate (3-hydroxy 2-naphtoic- o -toluidide chloroacetate)
を 基 質 と する 特 異 的 エス テ ラ ーゼ 染 色 (SE; specific esterase、武藤 化 学 、
東 京 ) を 用 いた 二 重 染色 を 行 った 。NSE 陽 性細 胞 は、細 胞 質内 に 暗 赤色
の 顆 粒 を 持 ち 、 SE 陽 性 細 胞 は 、 同 じ く 青 い 顆 粒 を 持 つ 。 染 色 後 の 細 胞
は 、400 倍 で 鏡 検し 、200 個細 胞 中 の陽 性細 胞 数 を計 数 し、陰性 、SE 陽
性 、 SE と NSE ダブ ルポ ジ テ ィブ 、 NSE 陽 性の 4 つ に 分 類 した 。
6)-2 Nitro blue tetrazolium (NBT) 還 元能 試 験
NBT 還 元 能試 験 は 、朝 永 ら
23) の 方法 を参 考 に 実施 し た 。 すな わ ち 、
前 述 5)と 同 様 に、刺 激後 の U937 細 胞と HL-60 細胞 は 、ウェ ルご と に 試
11
験 管 に 回 収し た 。 PBS (-)に て遠 心 洗 浄 後、 RPMI に て 2×10 6 cells/mL
に 調 製 し た。こ の細 胞懸 濁 液 1 mL ず つ を 1,300rpm、5 分 間遠 心 し、上
清 を 除 去 して 集 め た 細胞 沈 渣 に、 2 mg/mL NBT (SIGMA-ALDRICH、
No. N6876) 0.1mL と等 量 の PMA 400 ng/mL を それ ぞ れ 添 加し 、37℃ 、
20 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 そ の 後 、 反 応 懸 濁 液 は 、 氷 冷 し 、 PBS(-)
を 0.8 mL ず つ加 え た。こ れら を サイ ト スピ ン にて 300 rpm、10 分間 遠
心 し 、 ス ライ ド 標 本 を作 製 し た。 乾 燥 後 、 400 倍 で鏡 検 し 、 200 個の細
胞 中 青 染 色さ れ て い る細 胞 を 陽性 細 胞 と して 計 数 した 。
6 . Phyco-CM
刺 激
U937
細 胞 と
HL-60
細 胞 に お け る
Lipopolysaccharides (LPS) 応答
RPMI に LPS (Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4、
SIGMA、No. L2630) 25 mg を 溶 解し て 10 mg/mL スト ッ ク 溶 液と し た 。
こ の も のを RPMI に て適 宜 希 釈し て 用 い た。
5 .2)と 同 様 に、U937 細胞と HL-60 細 胞は 3 日間 、24 ウ ェル マ イ ク
ロ プ レ ー トに て 各 刺 激物 に よ り分 化 誘 導 刺激 を 行 った 。 刺 激 後、 各 ウェ
ル に LPS (0、1,000 ng/mL)を 添加 し 、 37℃、 5 % CO 2 条 件下 で イ ンキ
ュ ベ ー ト した 。60 分 後、各ウ ェ ル の培 養 上清 試 料 を回 収 し、0.45μ m pore
size ディ ス ク フィ ル ター (IWAKI GLASS、 Code 2053-025)にて 細 胞 除
去 と と も に 濾 過 滅 菌 し た 。 こ の も の は 、 使 用 時 ま で − 80℃ 保 存 と し た 。
1) オプ ソ ニ ン処 理 latex beads (opsonin-treated LB)貪食 能
貪 食 作 用 を促 進 さ せ るた め の オプ ソ ニ ン 物質 と し て血 清中 IgG 抗体 を
latex beads の 表 面 に結 合 さ せた opsonin-treated LB を調 製し た 。 すな
わ ち 、 RPMI に 懸濁 した 0.04% latex beads (LB; average diameter 1.1
μ m、 SIGMA)に 、 同じ く RPMI に懸 濁し た 等 量の 10 %正常 ヒ ト 血清
(NHS; Normal Human Serum、CHEMICON INTERNATIONAL、Cat.
12
No. S1-100 mL)を 加え 、 37℃ 、 30 分 間振 盪 (40 rpm/min.)混 和し た 。
使 用 前 に 超音 波 処 理 (10 分 間 )し て beads を分 散 さ せて 用 い た 。
LPS 応 答貪 食 能に つ いて は 、以 下 の 通り 実施 し た。上 記 5.の操 作 後
に ウ ェ ル の 底 に 残 っ た 細 胞 を 、 ウ ェ ル ご と に 試 験 管 に 回 収 し 、 PBS (-)
に て 2 回遠 心 (1,300 rpm、 5 分 間 )洗浄 した 。 opsonin-treated LB を用
い た 貪 食 能の 測 定 は 、 Yamamoto-Yamaguchi et al. 24) の 方 法 を改 変 して
用 い た 。 すな わ ち 、 刺激 後 の U937 細 胞 ある い は HL-60 細 胞 0.5×10 6
cells/mL を そ れ ぞれ 試験 管 に 1 mL ず つ 加え 、遠心 し て 細胞 沈渣 を 得 た 。
こ こ に 先 述し た 0.02% opsonin-treated LB を 1 mL ず つ加 え、 37℃ 、 3
時 間 振 盪 (40 rpm/min.)混 和し た 。PBS (-)に て 、細胞 を 壊さ ない よ う に
注 意 し な がら 3 回 遠 心 、洗浄 後 、細 胞沈 渣に PBS (-)1 mL を 加え た 細 胞
懸 濁 液 を サイ ト ス ピ ンに て 300 rpm、10 分間 遠 心 し 、スラ イ ド標 本 を 作
製 し た 。 乾燥 後 、 メ イグ リ ュ ンワ ル ド ・ ギム ザ 染 色し 、 200 個の 細 胞中
1 個 以 上の LB を 取 り込 ん で いる 細 胞 を 陽性 細 胞 とし て 計 数 した 。
2) Phyco-CM 刺激 U937 細胞 、 HL-60 細 胞の TNF-α 量 産 生
上 記 で 回 収 し た 培 養 上 清 試 料 中 サ イ ト カ イ ン TNF-α 量 は 、 TNF-α
/TNFSF1A ELISA Kit for humans TNF-α (Cat. No. DTA001、 R&D
Systems、 Minneapolis)を 用 いて 測 定し た。 ELISA Kit の 測 定感 度 は 、
15.6-1,000 pg/mL で あ っ た 。 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Colona
Electronics、Japan)で 450 nm と 570 nm 波長 の 吸 光度 差 (OD 450 nm
− OD 570 nm)を 測 定し た 。
7. フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サイ
ト カ イ ン の検 出
1) ヒト 末 梢 血単 核 球浮 遊 液 試料 の 細 胞 分類
前 述 で 各 被験 者 か ら 同意 を 得 て採 取、調 製し た ヒ ト単 核 球 球 浮遊 液 (1
13
×10 6 cells/mL)の一 部を 用 い PBS (-)に て 2.5×10 5 cells/mL に希 釈 後 、
サ イ ト ス ピン にて 300 rpm、 10 分 間遠 心し 、 ス ライ ド 標 本 を作 製 し た 。
メ イ グ リ ュン ワ ル ド ・ギ ム ザ 染色 後 、 200 個の 細胞 を 計 数し 、リ ン パ 球
お よ び そ の他 含 ま れ てい る 細 胞の 割 合 を 算出 し た 。
2) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)
中 サ イ ト カイ ン の 検 出
第 2 節材 料 と 方法 3.ヒ ト 末 梢血 単 核 球 の分 離 の 項に 従 い ヒ ト末 梢 血
単 核 球 浮 遊液 (1×10 6 cells/mL)を 調 製 し た 。そ の 後 、第 2 節
材料と方
法 4. フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)
の 調 製 に 従い 、 培 養 上清 試 料 を調 製 し た 。同 時 に 別の ウ ェ ル に陽 性 対照
用 と し て Phytohemagglutinin (PHA; Phytohemagglutinin-P、 和光 純
薬 、No. 161-15251) 100μg/mL (PHA-CM)を ヒ ト単 核 球浮 遊液 (1×10 6
cells/mL) 1mL/well あた り 0.1mL ずつ 添加 し た 。 37℃ 、 5%CO 2 イ ンキ
ュ ベ ー タ ーに て 7 日 間培 養 し た。各 ウ ェ ルの 単 核 球培 養 上 清 試料 を 0.45
μm pore size デ ィ スク フ ィ ルタ ー (IWAKI GLASS、 Code 2053-025)
に て 細 胞 除去 と と も に濾 過 滅 菌し た 。こ のも の は 、使用 時 ま で− 80℃ 保
存 と し た 。こ れ ら 単 核球 培 養 上清 試 料 中 分化 誘 導 サイ ト カ イ ンと し て、
Human Interferon gamma (INF-γ ) (DIF50)、 Human Interleukin 3
(IL-3) (D3000) お よ び
Human Granulocyte macrophage colony
stimulating factor (GM-CSF) (DGM00) に つ い て 、 ELISA 法 (R&D
Systems、 Minneapolis) に て 測 定し た 。そ れ ぞ れの ELISA Kit の 感 度
は 、INF-γ; 15.6-1,000 pg/mL、IL-3; 31.2-2,000 pg/mL、GM-CSF; 7-500
pg/mL で あ っ た 。 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Colona Electronics 、
Japan)で 450 nm と 570 nm 波 長 の 吸 光度 差 (OD 450 nm− 570 nm)を
測定した。
14
8.統 計 解 析
デ ー タ は、平 均値 ±SD で表 し た。統計 解 析は 、StatView J 5.0 (Abacus
Concepts、 CA)ソ フ ト ウ ウ ェ ア を 用 い た 。 各 群 間 の 比 較 に は 一 元 配 置 の
分 散 分 析 (ANOVA; One-way Analysis of Variance)を行 い 、多 重 比 較に
は 、Bonferroni/Dunn t value を 用 いた 。危険 率 5 %未 満で 有 意差 あ り と
した。
第3節
結果
1 . 分 化 誘導 作 用
1) 増殖 曲 線 およ び 生存 率
無 刺 激 U937 細 胞 (Cont)に おい て 、 培 養 1 日 目と 3 日 目の 細胞 数 は 、
そ れ ぞ れ 0.7×10 6 、1.8×10 6 cells/mL で あっ た 。一方 、Phyco-CM 刺激
U937 細胞 では 、細 胞数 が 0.9×10 6 cells/mL であ り 、増 殖 抑制 が み られ
た 。HL-60 細 胞に お いて も 同 様の 傾 向 が みら れ た。Phyco 刺 激で は 、U937、
HL-60 細胞 の い ずれ も増 殖 抑 制は み ら れ なか っ た 。HL-60 細 胞で は 、逆
に 増 加 傾 向を 示 し た (図 7.-a)。
U937、HL-60 細 胞 とも に 、Phyco、Phyco-CM、Cont-CM 刺激 に よ る
培 養 3 日目 の 生存 率 はい ず れ も約 80∼ 90 %であ っ た (図 7.-b)。
2) FCM 法に よ る細 胞表 面 抗 原の 測 定
FCM 法 で は 、 測 定 時 に 細 胞 が レ ー ザ ー 光 を 通 過 す る と き に レ ー ザ ー
光 を 散 乱 させ 、 標 識 した 蛍 光 色素 か ら 蛍 光を 発 す る。 レ ー ザ ーの 散 乱光
は 、 細 胞 表 面 で 生 じ る 表 面 積 に ほ ぼ 比 例 す る 前 方 散 乱 (FS; Forward
Scatter)と 、 細胞 内 顆粒 等 で 生じ る 側 方 散乱 (SS; Side Scatter)を 測 定 す
る こ と が でき る 。
15
U937 細胞と HL-60 細胞 に おけ る Phyco-CM と他 の 刺激 物を 用 い た
CD 抗 原 測 定 時 の FS、 SS の パ タ ー ン 例 を 図 8.に 示 し た 。 図 9.-a に
Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 の典 型 的な 細 胞表 面 抗 原の 測 定 パ ター ン を 示
し た 。 U937 細 胞 で は、 Phyco-CM 刺 激 CD14 と CD11b 抗原 に お いて 、
無 刺 激 Cont お よ び Cont-CM 刺 激 に比 較し て パ ター ン の 変 化が 見 ら れた 。
こ れ ら は 、図 8.で 示 した よ うに Phyco-CM 刺 激 にお いて SS の値 、す な
わ ち 細 胞 内顆 粒 が 増 加し 、 横 軸の 右 方 に 陽性 細 胞 の出 現 が 見 られ た こと
と 一 致 し てい る (図 8.-U937 (4)Phyco-CM)。 ロ グス ケ ール を用 い て ヒス
ト グ ラ ム 上に 取 得 さ れる デ ー タの う ち 、 陽性 細 胞 は閾 値 を 越 えた 細 胞と
し て 出 現 する 。そ の 蛍光 強 度 が強 い ほ ど 横軸 右 方 に出 現 す る 。Phyco-CM
刺 激 U937 細 胞 にお ける 細 胞 表 面 CD14 抗原 陽 性 細胞 率 (11 ± 3.3 %)は 、
Cont-CM 刺 激と 無 刺激 Cont の 陽 性細 胞率 (各 4.2 ± 2.0 %、3.4 ± 3.2 %)
に 比 較 し て約 3 倍 を 示し た (表 2.)。 こ の時 の 蛍 光強 度 (5.6 ± 0.9)は 、
無 刺 激 Cont のそ れ (2.8 ± 0.8)に 比 較し て 有意 な 高 値 (p < 0.01)を 示 し た 。
Phyco 刺 激 U937 細 胞の 細 胞 表面 CD14 抗原 陽 性 細胞 率 (7.5 ± 3.6 %)
は 、Cont (3.4 ± 3.2 %)の約 2 倍 であ っ た 。Phyco 刺 激 に おけ る CD14 抗
原 の 蛍 光 強度 は 、い ずれ も Cont と Cont-CM に 比 較 して 有 意 な増 加 は 見
ら れ な か っ た (表 2.)。 Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞 に お け る 、 細 胞 表 面
CD11b 抗原 陽 性細 胞率 (18 ± 7.3 %)は、 Cont-CM と Cont の そ れら (各
4.8 ± 2.3 %、3.9 ± 1.0 %)に比 較 し て有 意 な差 は み られ な い も のの 高 値 を
示 し た (表 2.)。こ の とき の 蛍 光強 度 に つ いて は 、Phyco-CM、無刺 激 Cont、
Cont-CM の 間で 差 はみ ら れ なか っ た。顆粒 球 系 細胞 の マ ー カー で あ る細
胞 表 面 CD15 抗 原陽 性細 胞 率 は 、い ず れ の刺 激 に おい て も 低 値で あ っ た
が 、 Phyco-CM 、 Cont-CM 刺 激 (各 1.8 ± 0.4 %、 1.5 ± 0.3 %)と もに 無
刺 激 Cont (4.6 ± 2.2 %)に お ける 陽 性 細 胞率 よ り 低値 で あ っ た。
16
Phyco-CM 刺激 HL-60 細胞 に おけ る FS、SS に つ いて は 、無 刺激 Cont
に 比 較 し て FS、SS 方 向 への 顆 粒 の増 加が 見 ら れた (図 8.-HL-60)。 図
9.-b に Phyco-CM 刺激 HL-60 細 胞 の 典型 的 な 細胞 表 面 抗 原の 測 定 パタ
ー ン を 示 した 。 HL-60 細胞 では 、 Phyco-CM 刺 激 に より CD11b 抗 原測
定 時 に お い て 横 軸 右 方 10 1 付 近 ま で に 陽 性 細 胞 の 出 現 が み ら れ た (図
9.-b (4)Phyco-CM-CD11b)。こ のこ と は 、図 8.で 示 した よ う に Phyco-CM
刺 激 に お いて 、 無 刺 激 Cont に 比較 し て FS、 SS の 顆 粒 が増 加し た こ と
と 一 致 し た。Phyco 刺激 に お いて も 、CD11b 抗 原測 定 時 に 横軸 の 陽 性細
胞 出 現 は 横軸 右 方 10 1 付 近ま で に陽 性 細 胞の 出 現 がみ ら れ た (図 9.-b、
(2)Phyco-CD11b)。 HL-60 細 胞 につ い ては 、 い ずれ の 刺 激 にお い て も細
胞 表 面 CD14 抗 原 陽 性細 胞 率 は Cont-CM 刺 激 U937 細胞 の陽 性 細 胞率
よ り も 低 値で あ っ た (表 2.)。Phyco-CM 刺激 HL-60 細 胞に おけ る CD14
抗 原 の 蛍 光強 度 (10 ± 2.5)は 、Cont-CM 刺激 、Cont (5.8 ± 2.0、5.1 ± 2.0)
に 比 較 して 2 倍を 示 した が 有 意な 増 加 で はな か っ た (表 2.)。単球 と 顆 粒
球 に 特 異 性を 示 す と いわ れ て いる 細 胞 表 面 CD11b、CD66b 抗 原の う ち、
CD11b 抗原 陽 性細 胞率 に つ いて は 、Phyco-CM 刺激 、Phyco 刺激 HL-60
細 胞 (各 14 ± 4.7 %、16 ± 4.6 %)に お い て 、Cont-CM 刺 激 (7.7 ± 3.1 %)
に 比 較 し て有 意 で は ない も の の高 値 を 示 した 。こ の 時 の蛍 光 度 (各 6.6 ±
1.2 、 5.5 ± 2.0)は 、そ れ ぞれ Cont-CM (4.7 ± 0.6)よ り 高 値で あ っ た。
CD66b 抗 原 陽性 細 胞率 に つ いて は 、 Phyco-CM 刺 激 (1.3 ± 0.5 %)に お
い て 、無 刺 激 Cont (4.5 ± 1.6 %)より も 有意 な 低 値 (p < 0.001)を 示 し た 。
蛍 光 強 度 も無 刺激 Cont (27 ± 32)より Phyco-CM 刺 激 (10 ± 2.0)では 低
下 し た (表 2.)。Phyco 刺激 HL-60 細 胞に お ける CD66b 抗原 (6.8 ±
3.1 %)は 、Phyco-CM 刺 激 より 高 値で あ った 。CD15 抗 原 陽 性細 胞 率 は、
Phyco-CM、 Cont-CM、 Phyco のい ず れ の刺 激 に おい て も 有 意な 差 は み
17
ら れ な か った (表 2)。
3) 形態 学 的 変化
U937 細胞 は 、 単 球 性 白 血 病 細 胞 で あ る 。 円 あ る い は 卵 型 の 形 で 、 ほ
と ん ど の 細 胞 で 細 胞 質 周 辺 に 泡 状 の 突 起 を 持 つ 。 核 /細 胞 質 比 (N/C 比 ;
nuclear/cytoplasmic ratio)は や や大 、核 クロ マ チ ンは 密 で あ り 、核は 不
規 則 に 分 葉し て い る 。大 き く て顕 著 な 核 小体 お よ び細 胞 質 内 には 多 数の
小 さ な 好 塩基 性 顆 粒 と多 数 の 空胞 を 持 つ
16)
(図 10.-a-1)。 U937 細胞 は 、
Phyco-CM 刺 激 (図 10.-a-4)に よ り顆 粒を 持 つ 大き な 細 胞 質と 凝 集 の無
い 微 細 な 核ク ロ マ チ ン、 核 小 体の 残 存 す る細 胞 へ と変 化 し た 。こ の 形態
変 化 は 、PMA 刺激 U937 細胞 (図 10.-a-3)と 類似 し て いた 。Cont-CM 刺
激 で は 、 一部 の 細 胞 にの み 、 大き な 弯 曲 を持 つ 核 と淡 青 色 の 細胞 質 を持
つ 細 胞 が 見ら れ た (図 10.-a-5)。 U937 細胞 に お いて は 、 Phyco-CM 刺激
と Cont-CM 刺 激 に より 単 球 、マ ク ロ フ ァー ジ 細 胞が そ れ ぞ れ約 57 %と
21 %の 割合 で 存 在し た (図 11.-a)。こ れ ら は 、無 刺激 Cont の 単球 、マ ク
ロ フ ァ ー ジ陽 性 率 よ りも 有 意 な高 値 を 示 した ( p < 0.05、 p < 0.01、 p <
0.001) (図 11.-a) 。 Phyco 刺 激 では 、 核 にく ぼ み があ る 細 胞 がみ ら れ た
が 、 大 部 分は 前 単 球 様で あ っ た (図 10.-a-2)。 Phyco 刺激 U937 細胞 の
単 球 と マ クロ フ ァ ー ジ細 胞 の 割合 は 約 3.4 %であ っ た (図 11.-a)。 PMA
刺 激 細 胞 に つ い て は 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 様 形 態 (図 10.-a-3)に 分 化 誘 導 さ
れた。
前 骨 髄 球 性白 血 病 細 胞で あ る HL-60 細 胞で は 、大 部分 を 占 める 前 骨 髄
球 様 細 胞 の他 に 若 干 の骨 髄 球 、顆 粒 球 様 細胞 が み られ る 。 前 骨髄 球 様細
胞 の 細 胞 質 は 、 多 数 の 粗 大 な ア ズ ー ル 顆 粒 で 満 た さ れ 、 N/C は 大 き く 、
核 は 偏 在 して い る (図 10.-b-1)。HL-60 細胞 に つ いて は 、特 に Phyco-CM
刺 激 に よ る分 化 誘 導 刺激 後 、 様々 な 特 徴 を持 つ 前 骨髄 球 細 胞 様形 態 が観
18
察 さ れ た ため 、 メ イ グリ ュ ン ワル ド ・ ギ ムザ 染 色 によ る 細 胞 分類 が 困難
で あ っ た 。Phyco-CM 刺 激 HL-60 細 胞 では 、N/C 比 が 減 少 し 、空 胞 と 青
白 い 細 胞 質を 持 つ 、 形態 学 的 には 成 熟 単 球様 細 胞 系へ 分 化 し てい る と推
測 さ れ る 細胞 が 約 15%み ら れ た (図 10.-b-4、 矢 印 )。 他 の 約 85%の 細 胞
は 、 大 き な核 と 顕 著 な細 胞 質 顆粒 、 さ ら に核 小 体 が縮 小 あ る いは 消 失し
た と み ら れる 前 骨 髄 球 と 骨 髄 球を 含 む 顆 粒 球 系 細 胞で あ っ た (図 11.-b)。
Phyco お よび Cont-CM 刺激 HL-60 細 胞に つ い ては 、ほと んど 前 骨 髄球
様 細 胞 で あっ た (図 10.-b-2、 5)。 ATRA 刺激 HL-60 細胞 に つい て は 、
顆 粒 球 様 形態 (図 10.-b-6)に分 化 誘 導さ れ た。 図 11.-b に 示し たよ う に 、
一 部 の Phyco-CM 刺 激と Cont-CM 刺 激 HL-60 細 胞 につ い て は、mature
に 分 類 さ れ た 細 胞 が み ら れ た 。 mature と は 、 成 熟 様 細 胞 、 す な わ ち 、
後 骨 髄 球 、桿 状 核 球 、分 葉 核 球、 単 球 、 マク ロ フ ァー ジ 様 細 胞の 形 態を
示 し た 細 胞の こ と で ある 。 Phyco-CM あ るい は Cont-CM 刺 激 HL-60 細
胞 の 成 熟 様細 胞 の 割 合 (各 約 15 %、 約 10 %)は 、 そ れぞ れ 無刺 激 Cont
細 胞 に 比 較し て 増 加 傾向 に あ った が 、 こ れら の 間 に有 意 差 は なか っ た。
Phyco 刺 激 では 、 こ れら 成 熟 様細 胞は 2 %の み で あっ た (図 11.-b)。
4) 細胞 化 学 的変 化
特 異 的 (SE)あ る い は 非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ (NSE)染 色 に よ り 細 胞 化
学 的 変 化 につ い て 検 討を 行 っ た。U937 細胞 は 、もと もと NSE 陽 性 細胞
で あ る が 、 Phyco-CM 刺 激 に よ り さ ら に こ の 比 率 は 高 ま っ た 。 一 方 、
HL-60 細 胞 につ い て は、 無 刺 激 Cont に おい て 特 異的 エ ス テ ラー ゼ 染 色
(SE)陽 性細 胞 の 割合 は 90 %で あ り、Phyco-CM、Cont-CM 刺 激で も 90%
以 上 で あ った (表 3.)。
NBT 還 元 能 試 験 に つ い て は 、 Phyco-CM 刺 激 に よ り U937 細 胞 と
HL-60 細 胞の 両 方 の 陽性 細 胞 率が 、 そ れ ぞれ の Cont-CM 刺 激細 胞 の 陽
19
性 細 胞 率 に比 較 し て 有意 に 増 加し た ( p < 0.01 )。 Cont-CM 刺激 U937
細 胞 お よび HL-60 細胞 の NBT 還元 能 陽性 細 胞 率は 、Cont のそ れ と ほぼ
同 値 で あ った (表 4.)。
2 . Phyco-CM 刺激 U937 細胞と HL-60 細胞 に お ける LPS 応答 性
1) opsonin-treated LB 貪 食能
Phyco-CM 刺激 U937 細 胞 に おけ る 貪食 陽性 細 胞 の割 合 (81 ± 13 %)
は 、 Cont-CM 刺 激 (32 ± 5.5 %)に 比 較 し て 有 意 な 高 値 を 示 し た (p <
0.001)。し か し なが ら 、Phyco-CM 刺激 U937 細胞に LPS を 添加 し て も
貪 食 活 性 (%)の 有意 な増 加 は 見ら れ な か った 。Cont-CM 刺激 では 、LPS
( 0 ng/mL )に比 較 し て添 加 後 ( 1,000 ng/mL )に 貪 食活 性 (%)は 有 意 (p
< 0.05)に増 加 し た (表 5.-a)。 HL-60 細 胞で は 、 Phyco-CM (36 ± 13 %)お
よ び Cont-CM 刺 激 (35±12 %)の間 で 貪 食細 胞 の 割合 に 有 意 差は み ら れ
な か っ た が、 い ず れ も無 刺 激 Cont (17 ± 6.2 %)に 比較 し て 有 意な 高 値を
示 し た (p < 0.01)。HL-60 細胞 に つ いて は、い ずれ の 刺 激で も LPS 添 加
に よ る 貪 食活 性 (%)の有 意 な 増加 は 見 ら れな か っ た (表 5.-b)。
2) Phyco-CM 刺激 U937、 HL-60 細 胞 の TNF-α 量 産 生
Phyco-CM 刺 激 U937 細胞 に お ける 培 養 上清 中 TNF-α 量 は、Cont-CM
刺 激 細 胞 よ り も 有 意 差 は み ら れ な い も の の 高 値 を 示 し た 。 こ の TNF-α
量 (66 ± 15 pg/mL)は 、LPS (1,000 ng/mL)添加 後 に 増加 す る傾 向 が みら
れ た (84 ± 21 pg/mL) が 、LPS 添 加 無 (0 ng/mL)の Phyco-CM 刺激 細
胞 培 養 上 清に 比 較 し て有 意 な 増加 で は な かっ た (表 5.-a)。 Phyco-CM 刺
激 HL-60 細胞 に つ いて も 、 Cont-CM 刺激 細 胞 より 有 意 で はな い も のの
高 い TNF-α 量 を 示 した 。しか し な がら 、LPS (1,000 ng/mL)の 添 加 によ
る 増 加 は みら れ な か った (表 5.-b)。Phyco 刺激 で は 、U937、HL-60 細胞
と も に 、 LPS の 添 加 に 関 係 な く TNF-α 量 は 検 出 限 界 以 下 で あ っ た (表
20
5.-a、b)。
3 . フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)中 サ イ ト
カ イ ン の 検出
1 ) ヒ ト 単 核球 浮 遊 液試 料 の 細胞 分 類
各 被 験 者 の 細 胞 割 合 を 分 類 し た 各 種 細 胞 の 平 均 は 、 リ ン パ 球 63.8%、
好 中 球 17.4%、 好 塩 基球 2.7% 、好 酸球 1.2% 、単 球 15.1%であ っ た 。 7
日 間 培 養 した 後 の ヒ ト単 核 球 浮遊 液 試 料 試料 の 形 態分 類 に つ いて は 、無
刺 激 、 フ ィコ シ ア ニ ン刺 激 と もに 種 々 の 形態 が 出 現し て お り 分類 が 困難
で あ っ た こと か ら 実 施し な か った 。
2 ) フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM) 中 サ
イ ト カ イ ンの 検 出
Cont-CM (41 ± 27 pg/mL、 n=8)に 比 較 し て Phyco-CM (151 ± 75
pg/mL、 n=8)お よ び PHA-CM (215 ± 39 pg/mL、 n=3)に おけ る INF-γ
量 は 、 有 意な 高 値 (p < 0.001)を 示 し た (図 12. IFN-γ )。
GM-CSF 量 につ い て は、 Cont-CM (273 ± 240 pg/mL、 n=7)に比 較 し
て Phyco-CM (857 ± 247 pg/mL、 n=7)、 PHA (1172 ± 27 pg/mL、 n=3)
に お い て 有意 な 高 値 (p<0.001)を 示 した (図 12. GM-CSF)。
IL-3 量 に つい て は 、 Phyco-CM に お いて 検出 限 界 (7.4 pg/mL)以 下 で
あ っ た 。 Cont-CM (n=2)では 59 ± 80 pg/mL、 PHA-CM (n=7)で は 282 ±
310 pg/mL で あっ た (図 12. IL-3)。
3 ) ヒ ト 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM、 Cont-CM)中 サ イ ト カ イ ン
と 分 類 細 胞と の 関 連
フ ィ コ シ アニ ン 刺 激 によ り Phyco-CM、Cont-CM 中 に産 生 のみ ら れ たサ
イ ト カ イ ン INF-γ と GM-CSF 産 生量 につ い て 、結 果 2 )で算 出 し た被
験 者 各 人 の単 核 球 割 合と の 相 関性 に つ い て検 討 し た (図 13.-a、 b)。 その
21
結 果 、 被 験者 各 人 の リン パ 球 割合 と Cont-CM、 Phyco-CM 中 INF-γあ
る い は GM-CSF 産 生量 と の 間に 有 意 な 相関 は 見 られ な か っ た 。他 の 細胞 、
す な わ ち 、好 中 球 、 好酸 球 、 好塩 基 球 、 単球 に つ いて も サ イ トカ イ ン産
生 量 と の 間に 有 意 な 相関 は 見 られ な か っ た。
第4節
考察
フ ィ コ シ アニ ン は 、スピ ル リ ナ等 の 藍 藻 類に 含 ま れる 270-kDa の光 合
成 色 素 タ ンパ ク 質 で ある 。 本 研究 で は 、 フィ コ シ アニ ン で 刺 激し た ヒト
末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Phyco-CM)が 未 熟 な 白 血 病 細 胞 に 対 し て 分
化 誘 導 能 を持 つ か 否 か、 お よ びそ の 分 化 方向 性 を 検討 し た 。 細胞 の 分化
誘 導 を 調 べる 上 で 重 要な こ と は、 ① 増 殖 が抑 え ら れて い る か 、② 最 終分
化 細 胞 に 特異 的 な 機 能 、例え ば 、NBT 還 元能 、接 着 能 、貪 食 能等 が 発 現
し て い る か、 で あ る
1) 。 分 化過 程 に 特 異的 な 細 胞表 面 抗 原 の出 現 か らも
分 化 方 向 性、 分 化 度 を知 る こ とが 出 来 る 。ス ピ ル リナ 熱 水 抽 出物 や フィ
コ シ ア ニ ンは 、 こ れ らを 摂 取 した マ ウ ス の骨 髄 細 胞の 増 加 作 用と 脾 臓細
胞 を 培 養 して 得 た 上 清に よ る コロ ニ ー 形 成活 性 の 誘導 作 用 が 報告 さ れて
いる
13) 。 Shinohara
ら
8) は、 thermophilic
bule-green alga であ る フィ
コ シ ア ニ ンと ア ロ フ ィコ シ ア ニン の 両 方 がヒ ト リ ンパ 球 系 骨 髄腫 細 胞株
RPMI 8226 に 対 し 、細胞 増 殖 を促 進 す る こと を 報 告し て い る 。フ ィコ シ
ア ニ ン (最 終濃 度 0.1 mg/mL )は 、 HL-60 細胞 に 対し て は 、増 殖 傾 向を
示 し 、 U937 細 胞 に 対 し て も 抑 制 よ り も 増 殖 を 促 す 傾 向 を 示 し た (図
7.-a)。こ の こ とは 、Shinohara ら の報 告 に一 致 す るが 、抑 制 傾向 が み ら
れ な か っ たこ と か ら 、フ ィ コ シア ニ ン 単 独添 加 で の分 化 成 熟 作用 は 低い
可 能 性 を 示唆 し て い ると 思 わ れた 。 一 方 、単 球 系 のみ で な く 赤芽 球 また
22
は 血 小 板 へも 分 化 可 能で あ る ヒト 白 血 病 細胞 株 K562 細 胞 に 対し て フィ
コ シ ア ニ ンは 濃 度 依 存的 (0.02-0.16 mg/mL)に増 殖 を 抑制 し た
25, 26) 。増
殖 抑 制 効 果を 示 し た フィ コ シ アニ ン の 添 加濃 度 つ いて は 、 種 々の 報 告が
あ り 、 ヒ ト肝 癌 細 胞 であ る HepG2 に 対 して は フ ィコ シ ア ニ ン濃 度 7μ
g/mL
27) 、 ヒ ト乳 が ん由 来 細胞
MCF-7 に対 し ては 80 mg/mL
28) で 増殖
抑 制 効 果 が示 さ れ て いる 。 こ れら の 報 告 から フ ィ コシ ア ニ ン によ る 増殖
あ る い は 抑制 作 用 は 、細 胞 種 によ る 分 化 方向 の 違 いや 細 胞 系 に依 存 した
効 果 を 持 つこ と が 示 唆さ れ た 。ま た 、 フ ィコ シ ア ニン の 癌 細 胞に 対 する
直 接 的 な 効 果 と し て 、 ミ ト コ ン ド リ ア を 介 し た ア ポ ト ー シ ス (細 胞 死 )作
用 経 路 へ の 関 与 が 報 告 さ れ て い る 。 K562 細 胞 で は フ ィ コ シ ア ニ ン 濃 度
50μ M (13.15 mg/mL)
29) 、 MCF-7
細 胞 に対 し ては 80 mg/mL の添 加
28)
に よ り 、 いず れ も 細 胞内 ミ ト コン ド リ ア の内 膜 に 結合 し て い るチ ト クロ
ー ム C の 放 出と 、こ の放 出 を 阻止 する Bcl-2 タン パ ク の減 少 が起 こ る こ
と に よ る 癌細 胞 の 消 滅作 用 が 示唆 さ れ た 。こ れ ら の癌 細 胞 に 対し て 直接
ア ポ ト ー シス を 起 こ した フ ィ コシ ア ニ ン は、 本 研 究で 用 い た 濃度 に 比較
し て い ず れも 高 濃 度 であ っ た 。U937 細 胞と HL-60 細 胞に 対し て も 高濃
度 の フ ィ コシ ア ニ ン 添加 に よ り増 殖 抑 制 ある い は アポ ト ー シ スを 起 こす
可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 フ ィ コ シ ア ニ ン は 、 UNIDO (国 連 工 業 開 発 機 構 )
等 に よ っ てそ の 安 全 性が 認 め られ る と と もに
30) 、おも に 健 康 食品 と して
利 用 さ れ てき た 。 し かし な が ら、 フ ィ コ シア ニ ン のヒ ト で の 利用 に つい
て は 、 一 日推 奨 量 (体重 60kg の 成 人で 10mg/kg、 0.6 g/day)
31) を 考 慮
し た 摂 取 濃度 の 検 討 が必 要 で ある 。 本 研 究に お け るフ ィ コ シ アニ ン 濃度
は 、 こ の 一日 推 奨 量 を参 考 に 算出 さ れ 、 マウ ス に 摂取 さ せ た 量を 目 安に
した
32) 。
一 方 、Phyco-CM は 、U937 細胞 に 対し 有 意で は な いも の の 無 刺激 Cont
23
と Cont-CM に 比較 して CD14 抗原 と CD11b 抗 原 陽性 細 胞 の割 合 を 増加
さ せ た (表 2.)。同時 に、Phyco-CM 刺 激 は、無 刺激 Cont 比 較し て CD14
抗 原 測 定 時の 蛍 光 強 度を 有 意 に増 加 さ せ た (p < 0.01)。 細 胞 分類 で は、
57 %の 単球 /マ ク ロ ファ ー ジ 細胞 の 出 現 が観 察 さ れた (図 11.-a)。NBT 還
元 能 も 顕 著な 増 加 を 示し た (表 4.)。 これ らか ら Phyco-CM は、 U937 細
胞 を 成 熟 細 胞 で あ る 単 球 /マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 に 分 化 誘 導 し た こ と が
示 唆 さ れ た。ま た、Phyco-CM 刺激 U937 細胞 は 、Cont-CM 刺激 に 比 較
し て U937 細 胞 の CD14 抗 原陽 性 細胞 割 合が 約 3 倍 (4.2 ± 2.0 % → 11 ±
3.3 %)、 CD11b 抗 原 陽性 細 胞 割合 が約 2 倍 (4.8 ± 2.3 % → 18 ± 7.3 %)
に 変 化 し た (表 2.)。 形態 学 的 細胞 分 類 に おけ る 単 球、 マ ク ロ ファ ー ジの
割 合 (57 %)も Cont-CM 刺 激 (約 20 %)より 3 倍近 く 高値 を 示し た (図
11.-a) 。 こ れ ら の こ と か ら 、 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 で あ る
Cont-CM 刺 激 よ り もフ ィ コ シア ニ ン を 添加 し た Phyco-CM の ほ う が高
い 分 化 誘 導作 用 を 持 つこ と が 示唆 さ れ た 。
HL-60 細胞 に つ いて は 、い ず れ の刺 激 に おい て も 細胞 表面 CD14 抗原
陽 性 細 胞 率 は 低 く 、 U937 細胞 と 比 較 し て も そ の 陽 性 細 胞 率 は 低 値 で あ
っ た (表 2.)。HL-60 細胞 は 二 つの 異 な る 造血 幹 細 胞の 分 化 プ ログ ラ ム、
す な わ ち 、刺 激 に よ り骨 髄 系 ある い は マ クロ フ ァ ージ 系 い ず れか の 方向
に 分 化 が 可能 で あ る
33) 。形 態学 的 観察 結果 よ り、Phyco-CM
刺 激 HL-60
細 胞 に お いて 二 つ の 分化 方 向 、単 球 系 と 顆粒 球 系 の形 態 が 同 時に 存 在す
る こ と が 示唆 さ れ た (図 10.-b)。こ の こと は 、Phyco-CM 刺 激 によ り 、水
溶 性 の 淡 黄色 色 素 で あり 、 好 中球 な ど の 食細 胞 に 取り 込 ま れ ると 不 溶性
の 黒 紫 色 (暗 青 色 )の ホ ル マ ザ ン を 形 成 す る NBT 還 元 能
23) が 増 加 し た
こ と (表 4.)、 単 球 と 顆粒 球 に おい て 特 異 性を 示 す とい わ れ て いる 細 胞表
面 CD11b 抗原 の 割 合 (14 %)が Cont-CM 刺 激 (7.7 %)に 比 較し て 有 意で
24
は な い も のの 高 値 を 示し た こ と (表 2.)と 一致 す る 。 Tamagawa ら
34) は 、
NBT 還 元 能 の 陽 性 率 と 非 特 異 的 エ ス テ ラ ー ゼ 染 色 (NSE)陽 性 細 胞 と は
相 関 傾 向 にあ る こ と から 、 NBT 還 元能 が分 化 誘 導刺 激 後 の HL-60 細 胞
に つ い て 、顆 粒 球 と 単球 の い ずれ に 分 化 した か の 指標 と し て 有用 で ある
と 述 べ て い る 。 NSE の 反 応 性 は 、 単 球 /マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 に 特 異 的
で あ る と いわ れ る が
35) 、Phyco-CM
によ る 分 化誘 導 刺 激 後の HL-60 細
胞のほとんどが骨髄系細胞に反応性を示す特異的エステラーゼ染色
(SE)陽 性で あ っ た (表 3.)。 形態 学 的 観 察で は NSE 陽 性 を 示す 単 球 系形
態 と SE 陽 性 を示 す 顆粒 球 系 形態 を 持 つ 細胞 が 混 在し て お り (図 11.-b)、
エ ス テ ラ ーゼ 染 色 の 結果 は 必 ずし も 形 態 学的 観 察 結果 と 一 致 して い なか
っ た 。Phyco-CM 刺 激 HL-60 細 胞 にお いて 、単 球 と顆 粒 球 に特 異 性 を示
す と い わ れて いる CD66b 抗原 陽 性細 胞 率 (1.3 ± 0.5 %)は 、無刺 激 Cont
(4.5 ± 1.6 %)よ り も 有意 に 低 値し た (表 2.)。こ れら の こと か ら 、Phyco-CM
刺 激 HL-60 細 胞の 一部 は 形 態学 的 変 化 およ び NBT 還元 能 と細 胞 表 面抗
原 の 結 果 から も 単 球 系へ の 分 化を し 始 め てい る が 、ほ と ん ど は未 熟 な顆
粒 球 系 細 胞で あ る 前 骨髄 球 か ら骨 髄 球 細 胞で あ る こと が 示 唆 され た 。
Chiao ら
11) は 、ヒ ト末 梢 血 リン パ 球 培 養上 清 (CM)が、 HL-60
細胞 を
単 球 、 マ クロ フ ァ ー ジ様 細 胞 へ分 化 誘 導 する こ と を示 し て い る。 こ の報
告 に よ れ ば、 30 %CM 加 RPMI とと も に培 養 した HL-60 細胞 の 28 %が
3 日 目 で、 96 %が 8 日目 で マ クロ フ ァ ー ジ様 形 態 を示 し て い る。 本 研究
で 用 い た Cont-CM、Phyco-CM と もに RPMI に 対す る CMs の 添加 割 合
は 10 %で ある が 、 Cont-CM 刺 激 では 3 日目 で 約 10%、 Phyco-CM 刺 激
で は 約 15 %が 単 球 、マ ク ロ ファ ー ジ 様 成熟 細 胞 に分 化 し た 。 HL-60 細
胞 が CM に より 分 化 を示 す こ とに つ い て は 、Chiao ら の 結果 に一 致 し た
と い え る 。本 研 究 で はフ ィ コ シア ニ ン で ヒト 末 梢 血単 核 球 細 胞を 刺 激し
25
て 得 た 培 養上 清 試 料 であ る Phyco-CM の ほう が 特 に U937 細 胞に お い て
成 熟 細 胞 の割 合 を 増 加さ せ た こと か ら、Cont-CM よ りも 高 い分 化 誘 導作
用 を 持 つ こと を 示 し た。し かし な が ら、特に HL-60 細 胞に 対し て こ れら
の 大 部 分 を成 熟 細 胞 に分 化 誘 導す る に は 培養 日 数 、 Phyco-CM の 添 加 量
(%)も含 め て 不十 分 であ っ た と推 測 さ れ た。本 研 究で は 、Phyco-CM 刺激
HL-60 細胞 に お け る 8 日 間の 培 養を 実 施し て い ない が、 3 日間 培 養 後の
形 態 に は 、様 々 な 特 徴を 持 つ 細胞 、 す な わち 、 前 骨髄 球 様 細 胞と 次 の段
階 で あ る 骨髄 球 様 の 特徴 の よ うな 特 徴 の 混在 し た 形態 が 観 察 され た 。正
常 骨 髄 標 本に お い て 、単 球 系 の未 熟 な 細 胞で あ る 幼弱 単 球 と 骨髄 系 の未
熟 な 細 胞 であ る 前 骨 髄球 は い ずれ も 細 胞 質内 に 微 細な 顆 粒 を 持ち 、 核内
に 核 小 体 を持 つ 等 の 形態 学 的 特徴 か ら 識 別は 困 難 であ る と い われ て いる
35) 。Phyco-CM
刺 激 HL-60 細胞 に お いて も様 々 な 特徴 を 持 つ 前骨 髄 球 様
形 態 が 観 察さ れ た た め、 細 胞 分類 が 困 難 であ っ た 。こ れ ら 形 態は 、 長期
培 養 に よ り顆 粒 球 系 へ分 化 成 熟す る の か 、単 球 系 へ分 化 成 熟 する の かさ
ら に 明 瞭 な変 化 等 を 示す と 思 われ た 。
ヒ ト 単 球 にお い て 、LPS は TNF-αの 放 出の 引 き 金に な る こ とが 知 ら
れている
36) 。
Phyco-CM
刺激 に より U937 細胞 に おい て 、Cont、Cont-CM
刺 激 に 比 較し て 増 加 の見 ら れた CD14 抗 原は 、 LPS と LPS 結合 タ ン パ
ク (LBP; LPS binding protein)の レ セ プ タ ー で あ る こ と が 知 ら れ て い
る 。CD14 抗 原 は、単球 /マ ク ロフ ァ ー ジに お ける LBP と LPS の 結合 に
応 答 した TNF-α 産 生 を 仲 介 す る 。 近 年 、 自 然 免 疫 系 で 働 く マ ク ロ フ ァ
ー ジ や 樹 状細 胞 に お いて 、病 原体 (異 物 )を認 識 し その 応 答 シ グナ ル を伝
達 す る 働 きを し て い る Toll-like receptor の 存 在 が注 目 され てい る
37) 。
そ の 中 の ひと つ で あ る Toll-like receptor 4 (TLR4)は、単 球 に おけ る LPS
応 答 の 引 き金 と し て 重要 で あ るこ と 、 CD14 と 結合 し た LPS に 、 TLR4
26
に 会 合 し てい る MD2 分 子が 結 合す る こ とで 活 性 を起 こ す タ ンパ ク で あ
る こ と が 示さ れた
38, 39) 。本 研究 で は、Phyco-CM
刺激 U937 細胞 に お い
て CD14 と CD11b 抗原 陽 性 細胞 の 発 現 がみ ら れ たこ と か ら 、分 化 誘導
刺 激 に よ る 単 球 /マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 細 胞 へ の 分 化 後 、 異 物 を 認 識 す る
TLR4 の 発 現と そ れ に伴 う TNF-α の 産 生増 加 が 予想 さ れ た 。そ こ で 、分
化 誘 導 刺 激後 の 各 細 胞 に LPS を 添 加し 、そ の 応 答性 を 検 討 した 。 TLR4
の 発 現 に は 、CD14 抗原 と LBP が 必要 であ る 。Phyco-CM は 、分 化 誘 導
刺 激 後 の U937 と HL-60 細 胞 の培 養 上 清中 に TNF-α を 生 じた (表 5.-a、
b)。しか し なが ら 、それ ら TNF-α 量は LPS (1,000 ng/mL)添加 に よ る応
答 性 、 す な わ ち 、 TNF-α 量 の 有 意 な 増 加 を 示 さ な か っ た 。 LPS は 、 グ
ラ ム 陰 性 菌 の 細 胞 外 壁 を 構 成 す る 糖 脂 質 で あ り 、 内 毒 素 (エ ン ド ト キ シ
ン )と し て 種々 の 細 胞 を強 く 活 性 化す る
38) 。 Phyco-CM
刺 激後 の U937
細 胞 に お ける 貪 食 活 性は 、 LPS 無 添 加 で は Cont-CM 刺 激 U937 細胞 の
貪 食 活 性 より 有 意 に 増加 し た。し かし な がら 、LPS 添加 に よ る貪 食 活 性
の 有 意 な 増加 は み ら れな か っ た (表 5.-a)。LPS 応 答性 TNF-α量 の 測 定
に つ い て は 、3 日 間 培養 後 に LPS を 添 加し 、培 養 上 清中 の TNF-α 産生
に つ い て 比較 し た 。 この 時 、 Phyco-CM 刺激 後 の 各細 胞 に お ける 応 答性
を 比 較 す る目 的 で 、 細胞 の 回 収お よ び 細 胞数 の 調 整を 実 施 し なか っ た。
こ の 結 果 、各刺 激 に よる 3 日間 培 養後 の 増殖 細 胞 数の 違 い を 反映 し 、LPS
応 答 と こ れ ら 各 細 胞 か ら 産 生 さ れ た サ イ ト カ イン TNF-α 量 に 影 響 が あ
る こ と が 示唆 さ れ た 。し か し なが ら 、 Pnyco-CM 刺 激 U937、 HL-60 細
胞 の い ず れも LPS の添 加 に よる TNF-α量 の 有 意な 増 加 は 見ら れ な かっ
た 。 こ の こと か ら 、 3 日 間 の刺 激 後に 細 胞を 回 収 し、 LPS を 添加 し た 場
合 、 細 胞 数あ た り の サイ ト カ イン 産 生 量 を反 映 し 、本 結 果 に 比較 し て陽
性 対 照 と の差 が 明 確 にな る こ とが 推 測 さ れた 。
27
CD14 は 二 つの 役 割 、す な わ ち、 TLR4/MD2 に LPS を 運 ぶ 役割 と 細
胞 内 に LPS を取 り 込む 役 割 があ り 、CD14 を介 し て細 胞 内 に取 り 込 まれ
た LPS によ っ て 細 胞内 に 存 在す る TLR4/MD2 の活 性 化 が 起こ る と 考え
ら れ て いる
40) 。Phyco-CM
刺 激 U937 細 胞に お ける CD14 抗 原の 発 現 量
で は 、 CD14 を 介 し た LPS の 取 り込 み ある い は TLR4/MD2 の活 性 化が
起 ら ず 、 LPS 応 答 性 TNF-α 量の 増 加 を起 こ す ほど 十 分 に 機能 し な かっ
た の か も しれ な い 。また 、形 態 的に Phyco-CM 刺 激 U937 細 胞に お け る
単 球 /マ ク ロフ ァ ー ジへ 分 化 した 細 胞 は 、LPS 応 答性 を 起こ すた め の 貪食
能 以 上 の 機能 を 持 つ 活性 化 マ クロ フ ァ ー ジに ま で には 成 熟 し てい な かっ
た の か も し れ な い 。 あ る い は 、 TNF-α 以 外 の 他 の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン 、
例 え ば 、 IL-6、IL-8、IL-12、 IL-18 な ど別 の サ イト カ イ ン の LPS 応 答
に 関 連 し た増 加 に 影 響し た か もし れ な い 。ま た Cherng ら
41) は、フ ィコ
シ ア ニ ン (0.12-0.25 mg/mL) 存 在 下 で マ ウ ス 単 球 マ ク ロ フ ァ ー ジ 細 胞
RAW 264.7 を 24 時 間培 養 後に LPS (1,000 ng/mL)で 1 時 間刺 激 し て得
た 培 養 上 清中 TNF-α 産 生 が 、 フ ィ コ シ ア ニ ン の 濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ
た こ と を 報告 し て い る 。こ の こ とは 、フ ィコ シ ア ニン が 、LPS 刺激 RAW
264.7 にお ける NO 形成 を 抑 制し 、 こ の NO 形成 抑 制 に関 連し た と 推測
さ れ る IκB-αを 経 由し た 細 胞核 NF-κ B の 活性 を 抑 制し た 結果 で あ る
と 推 測 し てい る 。 フ ィコ シ ア ニン の 抗 炎 症作 用 に つい て は 、 他に も 報告
がある
42-44) 。本 研 究に お け る
TNF-α 産生 量 に つい て も TLR4/MD2 の
活 性 化 経 路 で は な く 、 LPS の 添 加 に よ り 生 じ た 一 酸 化 窒 素 合 成 酵 素
(nitric oxide synthase; iNOS)か ら 誘 導 さ れ る 一 酸 化 窒 素 (NO; nitric
oxide)と 活 性 酸 素 を 含 む 炎 症 性 の 免 疫 応 答 等 、 別 の 経 路 に 関 連 し た 結 果
か も し れ ない 。
以 上 の 結 果 か ら 、 フ ィ コ シ ア ニ ン の 未 熟 な ヒ ト 白 血 病 細 胞 U937、
28
HL-60 細胞 に 対 する 分化 誘 導 作用 は 、直 接的 よ り もむ し ろ 間 接的 に 働 き 、
フィコシアニンで刺激したヒト末梢血リンパ球培養上清試料である
Phyco-CM の ほ うが 成熟 細 胞 の割 合 を 増 加さ せ た こと か ら、Cont-CM よ
り も 分 化 誘導 作 用 を 高め る こ とを 示 唆 し た。 次 に 、 Phyco-CM 中 に 存在
を 推 測 さ れ、U937 細胞 と HL-60 細胞 を成 熟 細 胞 (単 球 /マ クロ フ ァ ージ
様 細 胞 )に分 化 誘導 する 可 能 性を 持 つ 因 子と し て IFN-γ 、GM-CSF、IL-3
を 測 定 し た 。その 結 果 、Phyco-CM は 、高濃 度 の INF-γ お よび GM-CSF
を 含 有 し、IL-3 に つ いて は、検 出 され な かっ た (図 12.)。ヒ ト末 梢 血 単
核 球 細 胞 のう ち 、リ ンパ 球 は 本研 究 で 測 定し た 3 種 類 のサ イ トカ イ ン を
産 生 す る 主な 産 生 細 胞で あ る が、 こ れ ら は他 の 様 々な 細 胞 か らも 産 生さ
れ る (表 6.)。INF-γ は 、T リ ン パ球 や natural killer (NK) 細 胞か ら 産
生 さ れ る 、マ ク ロ フ ァー ジ 活 性能 や リ ン パ系 細 胞 の分 化 誘 導 因子 活 性を
持 つ サ イ トカ イ ン で 、U937 細 胞や HL-60 細胞 を 単球 系 へ分 化誘 導 す る
こ と が 知 られ て い る
45, 46)
。 この こ と は、 Phyco-CM 刺激 U937 細胞 の
分 化 方 向 が単 球 /マ クロ フ ァ ージ 系 細 胞 であ り 、 INF-γ の 存在 が 分 化の
一 因 で あ るこ と を 支 持し て い ると 思 わ れ た。
GM-CSF は 、T 細 胞 、B 細胞 、血 管内 皮 細胞 、線 維芽 細 胞 等 の様 々 な
細 胞 か ら 、 IL-3 も T 細 胞 、 NK 細胞 、 内皮 細 胞 等の 細 胞 か ら産 生 さ れ 、
そ れ ぞ れ 未熟 な 造 血 細胞 の 増 殖と 分 化 に 関す る 機 能を 持 つ こ とが 知 られ
ている
47-49) 。本研 究 の結 果 か ら、Phyco-CM
中の IFN-γと GM-CSF お
よ び 、IFN-γま た は GM-CSF が U937 細胞 と HL-60 細 胞 の一 部 を 単球
/マ クロ フ ァー ジ 系 へ分 化 し たこ と が 推 測さ れ た 。Chen ら
50) は 、中 国 産
の 真 菌 で ある fu-ling (苓 茯、 Poria cocos Wolf 、PC)か ら抽 出 した 多 糖 画
分 (PS) で 5 日 間 刺 激 し て 得 た ヒ ト ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清
(PC-PS-MNC-CM5)によ り U937 と HL-60 細胞 の 成 熟細 胞 への 分 化 促進
29
が 見 ら れ たこ と を 報 告し て い る。この 中 であ ら か じめ PC-PS-MNC-CM5
中 に 見 ら れた サ イ ト カイ ン IFN-γ、 TNF-α 、 IL-1βそ れ ぞ れに 対 す る
抗 体 を 添 加し て か ら U937 と HL-60 細胞 の 分 化誘 導 刺 激 を行 う と、こ れ
ら に 対 す る分 化 促 進 作用 が 抑 制さ れ 、 成 熟細 胞 に 変化 し な か った こ とを
報 告 し て いる 。 こ れ らサ イ ト カイ ン に 対 する 抗 体 の添 加 は 、 1 種類 より
も 複 数 種 類を 同 時 に 添加 し た 場合 で 、 よ り高 い 分 化促 進 作 用 の抑 制 が示
さ れ た 。 GM-CSF に つい て は 、単 独 よ り も ATRA や ビ タミン D 3 と組み
合 わ せ る こと で U937 細 胞の 細 胞表 面 CD14 抗 原や CD11b 抗原 の 割 合
が 増 加 し たと の 報 告 もあ る
51) 。ヒ ト 末 梢 血単 核 球 培養 上 清 中 分化 誘 導因
子 の 相 乗 効果 に つ い ては 、 他 の報 告
52)
にも み ら れる よ う に 、複 数 のサ
イ ト カ イ ンが 相 互 に 関係 す る こと で U937 あ るい は HL-60 細 胞等 の 未 熟
な 白 血 病 細胞 に 対 し てよ り 高 い分 化 誘 導 作用 を 示 して い る の かも し れな
い 。 あ る いは フ ィ コ シア ニ ン は今 回 測 定 した IFN-γと GM-CSF、 IL-3
の よ う な サイ ト カ イ ンと 単 独 ある い は 組 み合 わ せ て用 い る こ とで 、 更な
る 分 化 誘 導効 果 を 引 き起 こ す かも し れ な い。Niemeyer ら
47) は、PHA
あ
る い は PMA で 刺 激 した 単 核 球細 胞 に 含 まれ る T 細 胞ク ロ ー ン中 に IL-3
の 遺 伝 子 発現 が 見 ら れた こ と を述 べ て い る。IL-3 は、T リ ン パ球 か らも
産 生 さ れ る。本 論 に おけ る フ ィコ シ ア ニ ンの 添 加 濃度 (0.1 mg/mL)で は 、
T リ ン パ 球 中 の IL-3 産 生 を 引 き 起 こ す に は 不 十 分 だ っ た た め 、
Phyco-CM 中 に IL-3 産 生が み ら れな か った の か もし れ な い 。あ る い は 、
Cont-CM 中 から は 検出 さ れ てい る こ と から 、もと も とフ ィ コシ ア ニ ンは
IL-3 産 生 には 関 与 し ない か 逆 に抑 制 し た のか も し れな い が 、この 点 につ
い て は 今 後の 検 討 が 必要 で あ る。
本 研 究 で は、 フ ィコ シア ニ ン の未 熟 な 白 血病 細 胞 に対 す る 形 態的 、 機
能 的 な 分 化誘 導 結 果 につ い て 、フ ィ コ シ アニ ン が 単核 球 等 を 刺激 し てそ
30
の 培 養 上 清中 に サ イ トカ イ ン を産 生 し た こと に 一 因す る こ と を明 ら かに
し た 。 こ のこ と は 、 自己 防 衛 免疫 シ ス テ ムに お い て、 フ ィ コ シア ニ ンが
ヒ ト 末 梢 血単 核 球 の よう な 細 胞に 働 き か け、 白 血 病細 胞 の よ うに 未 熟な
細 胞 を 正 常な 細 胞 へ 分化 す る よう な 変 化 を促 す よ うに 働 く 手 助け を する
こ と を 示 唆し て い る 。IFN-γ に つい て は 、Th1 細胞 か ら 産生 され る こ と
が 知 ら れ てい るが
53, 54) 、フ ィコ シ アニ ン は、ヒ ト末 梢 血単 核 球細 胞 培 養
上 清 中 の サイ ト カ イ ン IFN-γ 産生 を 増 加さ せ た (図 12.)。 PHA 刺激 T
細 胞 は 、IFN-γを 産 生す る こ とが 報 告 さ れて い る
55) 。ヒト 末 梢血 単 核 球
に 添 加 さ れた フ ィ コ シア ニ ン は 、T 細 胞 を活 性 化 させ 、IFN-γ 、GM-CSF
等 の サ イ トカ イ ン の 産生 を 促 すと 思 わ れ る。 フ ィ コシ ア ニ ン を生 体 内に
摂 取 し た 場合 も T 細 胞表 面 の 特定 の 糖 タ ンパ ク 等 と結 合 し 、活性 化 さ れ
た T 細 胞 か ら IFN-γ等 の サ イト カ イ ン が産 生 さ れる と 考 え られ る 。生
体 内 で の 働き に つ い ては 、 ア レル ギ ー 性 鼻炎 の 症 状を 持 つ 被 験者 が 、ス
ピ ル リ ナ 1 日 1∼2 g (フ ィ コシ ア ニ ン 量に 換 算 する と 0.15∼ 0.3 g)を 3
ヶ 月 間 食 し た と こ ろ 、 末 梢 血 リ ン パ 球 に お い て Th1/Th2 の バ ラ ン ス が
Th1 有 意に な り、IgE 抗 体の 産 生 亢進 に 働く IL-4 サ イ トカ イン 産 生 の減
少 が 見 ら れた と い う Mao ら
56) の 報 告 とオ ボ ア ルブ ミ ン を 投与 さ れ たマ
ウ ス に お い て 8 週 間 の 0.05 %フ ィ コ シ ア ニ ン 溶 液 摂 取 (1.25 mg/20
g/day )に より 血 中 の IgE 抗 体 量の 抑 制が み ら れた
32) と いう 報 告 から も
示 唆 さ れ る。 し か し なが ら 、 生体 内 で の 単核 球 細 胞や 白 血 病 細胞 に 対す
る フ ィ コ シア ニ ン の 働き は ま だ解 明 さ れ てい な い 。本 研 究 で 述べ た よう
に 、直接 白 血病 細 胞 に対 し て 働く よ り も T 細 胞等 を 刺激 す るこ と で 間接
的 に 働 き かけ る の で はな い か と推 測 さ れ る。 こ の よう な フ ィ コシ ア ニン
の 働 き は 、ヒト に お いて も 加 齢に 伴 い 低 下す る T 細 胞 機能 等 を維 持 す る
こ と に 役 立つ か も し れな い 。 しか し な が ら、 現 在 、フ ィ コ シ アニ ン につ
31
い て は 、 食品 や 化 粧 品の 天 然 着色 料 と し ての 利 用 が主 で あ る 。今 後 、急
性 前 骨 髄 性白 血 病 患 者に 対 す る分 化 誘 導 療法 に 使 用さ れ る ATRA の よ う
に
5) 、 実 用的 な 治 療 用薬 品 と して の 使 用 ある い は フィ コ シ ア ニン の 摂取
に よ り 加 齢に 伴 う 免 疫機 能 の 維持 あ る い は低 下 の 予防 が 期 待 され る 。
32
図 1. Phycocianin 化学 構 造
33
図 2. フ ィ コ シ ア ニ ン 刺 激 ヒ ト 末 梢 血 単 核 球 培 養 上 清 試 料 (Cont-CM 、
Phyco-CM)の調製
34
図 3. ヒト末 梢 血単 核 球培 養 上 清試 料 による U937 および HL-60 細 胞の分 化
誘導
35
図 4. 骨髄 系 細 胞の成熟 過 程と表面 抗 原 発現 −U937、HL-60 細胞 の表面 抗
原 および細 胞 形 態における分 化 段階 の推 測
36
図 5. U937 細 胞における細 胞 分類とそれらの特 徴
37
図 6. HL-60 細 胞 における細 胞 分類とそれらの特 徴
38
図 7. 各 刺 激 物における U937 と HL-60 細胞 の細 胞 増殖 (a)および生存 率 (%)
(b)
細 胞 は、培 養 後 1、2、3、4、5、7日 目 に計 数 した。生 存 率 (%)は、トリパンブルー染 色 法 に
て測 定 した。測 定 1 回 当 たり各 試 料 3 点 ずつ、2∼3 回 の実 施 により得 た結 果 は、平 均 値 ±
標 準 偏 差 (n=2∼3)で表 した。
39
→
(1) 無 刺 激 Cont
(2) Phyco
(3) Cont-CM
(4)
Phyco-CM
(5) PMA
U937 cells
HL-60 cells
図 8. Phyco-CM と他 の刺 激 物を用いた U937 細 胞 、HL-60 細 胞 における FS, SS のパターン
40
(6) ATRA
(1) 無 刺激 Cont
(2) Phyco
(3) Cont-CM
(4)
Phyco-CM
(5) PMA
図 9.-a U937 細胞 における各 CD 抗 原 陽 性細 胞 の出 現パターン
(1) 無 刺 激 Cont、(2) Phyco、(3) Cont-CM、(4) Phyco-CM と(5) PMA で刺 激 した U937 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL of medium)の各 CD 抗 原 は、
直 線 で示 した。各 刺 激 物 のコントロールは、点 線 で示 した。
41
(1) 無 刺激 Cont
(2) Phyco
(3) Cont-CM
(4)
Phyco-CM
(5) PMA
(6) ATRA
図 9.-b HL-60 細胞 における各 CD 抗 原 陽 性細 胞 の出 現パターン
(1) 無 刺 激 Cont、(2) Phyco、(3) Cont-CM、(4) Phyco-CM と(5) PMA、(6) ATRA で刺 激 した HL-60 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL of medium)の各
CD 抗 原 は、直 線 で示 した。各 刺 激 物 のコントロールは、点 線 で示 した。
42
図 10.-a Phyco-CM と各刺 激 物で刺 激した U937 細 胞の形態 学 的変 化
細 胞 形 態 は、光 学 顕 微 鏡 下 (原 図 倍 率 x 1000) で観 察 した。
a. U937 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL)は、(1) RPMI-FBS (Cont)、(2) Phyco、(3) PMA、(4)
Phyco-CM、(5) Cont-CM とともに 3 日 間 培 養 した。
43
図 10.-b Phyco-CM と各刺 激 物で刺 激した HL-60 細 胞の形 態 学的 変 化
細 胞 形 態 は、光 学 顕 微 鏡 下 (原 図 倍 率 x 1000) で観 察 した。
b. HL-60 細 胞 (0.5 x 10 6 cells/mL)は、(1) RPMI-FBS (Cont)、(2) Phyco、(3) PMA、(4)
Phyco-CM、(5) Cont-CM、(6)ATRA とともに 3 日 間 培 養 した。
44
図 11. Phyco-CM と各 刺激 物 で刺 激した U937 と HL-60 細 胞の形 態学 的 分 類
U937 と HL-60 細 胞 は、メイギリュンワルド・ギムザ染 色 を行 い、材 料 と方 法 に示 した方 法 で分
けた群 に分 類 した。200 個 中 の陽 性 細 胞 について、光 学 顕 微 鏡 下 (原 図 倍 率 x 1000)で観 察
した。測 定 1 回 当 たり各 試 料 3 枚 ずつ、3 回 の実 施 により得 た結 果 は、平 均 値 ±標 準 偏 差
(n=3)で表 した。
45
図 12. フィコシアニン刺激ヒト単核球の培養上清試料中 IFN-γ、GM-CSF、IL-3
被験者毎の培養上清 (CMs)は、材料と方法に述べたように採取した。培養上清 (CMs)中サイトカイン値は、ELISA 法にて測定した。CMs 中陽性対照は、PHA (10
μg/mL)とともに培養した。測定 1 回当たり各試料 2 点ずつ行ったそれぞれの値は、平均値±標準偏差 (n=2∼8)で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、使
用した CMs 数を表している。
46
図 13. ヒト単核球培養上清試料 (Phyco-CM、Cont-CM) 中サイトカイン IFN-γ (a)、
GM-CSF (b)とリンパ球割合との関係
各被験者 (n=7)における Phyco-CM と Cont-CM 中サイトカイン量は、ELISA 法にて算出した。リンパ球
等の割合は、各被験者から得たヒト単核球浮遊液 (1×106 cells/mL)をサイトスピンにてスライド標本と
し、メイグリュンワルド・ギムザ染色後、200 個の細胞を計数し、リンパ球およびその他含まれている細
胞の割合を算出した。
47
表 1. 機能マーカー (分化方向性マーカー)の検索における顆粒球/単球/マクロファージの反応態度一覧 1)
機能マーカー
顆粒球
単球
マクロファージ
++
+
+
±
+++
+++
NBT 還元能
++
+
±
接着能
−
+
+++
貪食能
±
+
+++
CD11b
+++
+++
++
CD14
+w
++
++
CD15
+
+
−
特異的エステラーゼ
(基質;Naphthol AS-D chloroacetate)
非特異的エステラーゼ
(基質;α-naphtyl butyratel)
表面
抗原例
+++;強陽性、−;陰性
48
表 2. Cont-CM あるいは Phyco-CM 刺激 U937 と HL-60 細胞の各表面抗原と蛍光強度比較
cells
CD 抗原 (%)
(蛍光強度)
CD14
U937
CD11b
CD15
CD14
CD11b
HL-60
CD15
CD66b
Cont
(n=3)
3.4 ± 3.2
(2.8 ± 0.8)
3.9 ± 1.0
(3.1 ± 2.7)
4.6 ± 2.2
(4.1 ± 2.3)
1.7 ± 1.2
(5.1 ± 2.0)
10 ± 7.4
(3.9 ± 3.4)
5.2 ± 1.9
(20 ± 24)
4.5 ± 1.6
(27 ± 32)
Phyco
(n=3)
7.5 ± 3.6
(3.1 ± 0.9)
7.9 ± 7.3
(5.6 ± 1.0)
3.9 ± 4.0
(13 ± 2.1)
1.5 ± 0.5
(4.7 ± 1.3)
16 ± 4.6
(5.5 ± 2.0)
5.9 ± 2.4
(10 ± 8.1)
6.8 ± 3.1
(11 ± 5.6)
Cont-CM
(n=5)
4.2 ± 2.0
(5.3 ± 0.8 ++)
4.8 ± 2.3
(4.3 ± 0.8)
1.5 ± 0.3
(7.5 ± 1.8)
1.5 ± 0.6
(5.8 ± 2.0)
7.7 ± 3.1
(4.7 ± 0.6)
7.8 ± 3.6
(4.8 ± 1.4)
2.2 ± 0.7
(7.7 ± 1.4)
Phyco-CM
(n=5)
11 ± 3.3
(5.6 ± 0.9 ++)
18 ± 7.3
(4.6 ± 0.6)
1.8 ± 0.4
(12 ± 10)
1.6 ± 0.5
(10 ± 2.5)
14 ± 4.7
(6.6 ± 1.2)
7.6 ± 1.9
(5.6 ± 2.0)
1.3 ± 0.5 ###
(10 ± 2.0)
PMA
(n=3)
22 ± 11 +++, ***, ###
(5.4 ± 1.6)
60 ± 17 +++, ***, ###
(21 ± 11 +++, ***, ###)
2.1 ± 1.0
(7.9 ± 1.2)
1.6 ± 0.7
(7.2 ± 2.3)
43 ± 14 +++, ***, ###
(16 ± 5.1 +++, ***, ###)
1.8 ± 0.3
(27 ± 37)
0.9 ± 0.3 ###
(59 ± 40 ###)
ATRA
(n=3)
1.5 ± 1.0
(3.3 ± 3.2)
36 ± 4.9 +++, ***, ###
(7.6 ± 2.4)
19 ± 8.1 +++, ***, ###
(4.6 ± 1.2)
20 ± 4.0 +++, ***, ###
(19 ± 2.7)
測定 1 回当たり各試料 1 点ずつ、3 回の実施により得た結果は、平均値±標準偏差で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、、測定 1 回当たり各試料 1 点ず
つ、3 回の実施時に使用した CMs 数を表している。
++
; p< 0.01、+++; p< 0.001 compared to Cont、***; p < 0.001 compared to Cont-CM、###; p < 0.001 compared to Phyco
49
表 3. Phyco-CM と各刺激物を用いた U937 と HL-60 細胞の特異的、非特異的エステラーゼ染色
cells
SE or NSE
(%)
Cont
(n=3)
Phyco
(n=3)
Cont-CM
(n=7)
Phyco-CM
(n=7)
PMA
(n=3)
ATRA
(n=3)
U937
NSE
94.2 ± 9.5
98.8 ± 1.7
98.9 ± 2.0
99.9 ± 0.2
98.9 ± 1.1
-
NSE
0.3 ± 0.5
0.5 ± 0.7
0.5 ± 0.5
0.3 ± 0.5
50 ± 11 +++, ***
0
SE
90 ± 6.5
96 ± 1.4
92 ± 3.2
93 ± 1.4
15 ± 7.1 +++, ***
90 ± 6.5
HL-60
測定 1 回当たり 3 点ずつ、2∼3 回の実施により得た結果は、平均値±標準偏差で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、使用した CMs 数を表している。
+++
; p < 0.001 compared to Cont、***; p < 0.01compared to Cont-CM
50
表 4. Phyco-CM と各刺激物を用いた U937 と HL-60 細胞の NBT 還元能
cells
Cont
(n=3)
Phyco
(n=3)
Cont-CM
(n=2)
Phyco-CM
(n=2)
PMA
(n=3)
ATRA
(n=3)
U937
1.2 ± 0.3
5.0 ± 3.0
1.3 ± 0.8
7.5 ± 4.1 **
5.2 ± 2.9
-
HL-60
0.7 ± 0.3
2.0 ± 1.0
2.1 ± 0.7
5.3 ± 1.9 +++, **
1.7 ± 0.8
10.8 ± 3.3 +++, ***
値は、測定 1 回当たり各試料 2∼3 枚ずつ実施した結果の平均値±標準偏差で表した。Cont-CM と Phyco-CM の n 数は、使用した CMs 数を表している。
+++
; p < 0.001 compared to Cont、**; p < 0.01, ***; p < 0.001 compared to Cont-CM
51
表 5. Phyco-CM 刺激 U937 と HL-60 細胞の LPS 応答
a. U937 cells
LPS (0 ng/mL)
Stimulators
Cont
Phyco
Cont-CM
Phyco-CM
PMA
Phagocytic
activity (%)
18
± 5.2
23
± 5.1
32
± 5.5 ++
81
± 13 +++, ***
96
± 4.6 +++, ***
LPS (1000 ng/mL)
TNF-α
(pg/mL)
ND
< 15.6
46
± 31
66
± 15
968
± 150 ***
Phagocytic
activity (%)
25
± 6.3
26
± 8.3 **
45
± 13 +++, #
83
± 8.2 +++,***
97
± 3.7 +++,***
TNF-α
(pg/mL)
ND
ND
51 ± 28
84 ± 21
2103
± 180 ***, ###
b. HL-60 cells
LPS (0 ng/mL)
Stimulators
Cont
Phyco
Cont-CM
Phyco-CM
PMA
ATRA
Phagocytic
activity (%)
17
± 6.2
16
± 3.8
35
± 12 ++
36
± 13 ++
84
± 13 +++
72
± 5.2 +++
LPS (1000 ng/mL)
TNF-α
(pg/mL)
ND
< 15.6
32
± 29
71
± 18
585
± 39
ND
Phagocytic
activity (%)
18
± 2.4
20
± 7.6 ***
39
± 7.8 +++
40
± 11 +++
89
± 10 +++, ***
69
± 6.9 +++, ***
TNF-α
(pg/mL)
ND
< 15.6
50
± 31
74
± 18
1246
± 59 ***, ###
28
± 18
貪食能は、オプソニン処理 latex beads (opsonin-treated LB)を用いた取り込み細胞数の割合により測
定した。Phyco-CM 刺激 U937 と HL-60 細胞の LPS に対する応答について、貪食能および培養上清中
TNF-α の測定により比較した。測定 1 回当たり 3 点ずつ、1∼3 回の実施により得た結果は平均値±
標準偏差(n=3)で示した。
++
; p < 0.01、+++; p < 0.001 compared to Cont in each LPS (0 or 1000 ng/mL)、**; p < 0.01、***; p < 0.001
compared to Cont-CM in each LPS (0 or 1000 ng/mL)、#; p < 0.05,
ng/mL、< 15.6; under detection limit (15.6 pg/mL)、ND; not detected
52
###
; p < 0.001 compared to LPS 0
表 6. サイトカイン産生細胞一覧
主な産生細胞
リンパ球
サイトカイン
(T 細胞)
IFN-γ
IL-3
GM-CSF
○
○
○
(B 細胞)
NK
細胞
マクロ
ファージ
○
○
○
肥満
細胞
○
○
○
53
上皮
細胞
○
謝辞
本研究を進めるにあたり、終始懇切丁寧なご指導を賜りました女子栄養大学
免疫検査学研究室教授 林
修先生に謝意を表します。終始温かい励ましを賜り
ました女子栄養大学前教授 奥脇義行先生、細胞の形態学的観察についてご指導
賜りました故小野昭治先生に感謝申し上げます。DIC ライフテック株式会社 (旧
大日本インキ化学工業株式会社)の故加藤敏光様、太郎田博之様、吉川典孝様、
石原光輝様、山西腫瘤医院の石硯海様に感謝申し上げます。最後に、この論文
に関する研究テーマを選択した免疫検査学研究室卒研生の皆さん、支えてくれ
た家族、友人に感謝します。
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