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JP 2014-1163 A 2014.1.9 (57)【要約】 【課題】より高いNO産生促進
JP 2014-1163 A 2014.1.9 (57)【要約】 【課題】より高いＮＯ産生促進活性を有し、特に冷え性改善効果が期待できる素材を提供 すること。 【解決手段】（１）アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼおよび／またはバチルス属菌 由来のプロテアーゼを用いて卵白を分解して得られる卵白加水分解物と、（２）ケイヒお よび／または黒酢を有効成分として含有することを特徴とするＮＯ産生促進組成物は、高 いＮＯ産生促進活性を有し、冷え性改善として利用することができる。 【選択図】なし (2) JP 2014-1163 A 2014.1.9 【特許請求の範囲】 【請求項１】 （１）アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼおよび／またはバチルス属菌由来のプロ テアーゼを用いて卵白を分解して得られる卵白加水分解物と、（２）ケイヒおよび／また は黒酢を有効成分として含有することを特徴とするＮＯ産生促進組成物。 【請求項２】 前記アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼがアスペルギルス・ニガー由来の酸性プロ テアーゼであり、前記バチルス属菌由来のプロテアーゼがバチルス・ズブチリス由来の中 性プロテアーゼ、バチルス・ズブチリス由来のアルカリ性プロテアーゼ、バチルス・ステ アロサーモフィラス由来の中性プロテアーゼから選ばれる少なくとも１種であることを特 10 徴とする請求項１に記載のＮＯ産生促進組成物。 【請求項３】 前記卵白加水分解物１００質量部に対して、ケイヒを５∼２００質量部および／または 黒酢を固形分として１００∼２０００質量部含有することを特徴とする請求項１または２ に記載のＮＯ産生促進組成物。 【請求項４】 請求項１∼３のいずれかに記載のＮＯ産生促進組成物を含有することを特徴とする冷え 性改善剤。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 20 【０００１】 本発明は、経口摂取可能なＮＯ産生促進組成物およびそれを含有する冷え性改善剤に関 するものである。 【背景技術】 【０００２】 ＮＯ（一酸化窒素）はＬ−アルギニンが酸化されＬ−シトルリンになる際に産生され、 その反応はＮＯ合成酵素（ＮＯ Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）によって触媒される。ＮＯ 産生は生体内の様々な組織、細胞種で観察されるが、恒常的にＮＯを産生、放出する代表 的な細胞種が血管内皮細胞である。血管内皮細胞で産生されるＮＯ（血管内皮性ＮＯ）が 内皮由来血管弛緩因子（ＥＤＲＦ）であることが報告されている（非特許文献１，２参照 30 ）。したがって、血管内皮細胞での自発的かつ十分量のＮＯ産生を促進する化合物やｅＮ ＯＳ活性化作用を有する化合物は、血管内皮機能を改善し、血流障害、動脈硬化、高脂血 症、虚血性心疾患や各種臓器での循環不全等の血管内皮機能低下に起因する疾患等に対し て優れた治療剤になると考えられる。それゆえ、従来ＮＯ産生促進作用を有する化合物の 探索が行われ、種々のＮＯ産生促進剤が提案されている。 【０００３】 ケイヒ（桂皮）は、クスノキ科クスノキ属の植物トンキンニッケイ（学名Cinnamomum c assia）、アンナンニッケイ（学名Cinnamomum obtussifolium）、セイロンニッケイ（学 名Cinnamomum verum）などの樹皮を乾燥したものであり、香辛料としてはシナモンと称さ れる。ケイヒは生薬として古くから使用されており、毛細血管の血行促進による冷え性改 40 善効果を有すると言われている。 黒酢は、鹿児島県霧島市で古くから製造され、もっぱら調味料として用いられていた。 近年、黒酢の脂質代謝改善作用、赤血球変形能改善作用、血圧調節作用、血糖調節作用、 抗酸化作用など様々な作用が報告され、人々の健康志向の高まりとともに黒酢を希釈して 飲用されるようになっている。特許文献１，２には、黒酢が血液流動性改善作用を有する ことが記載されている。 【０００４】 本願出願人は、過去に卵白加水分解物が血流改善作用を有すること（特許文献３）、Ｎ Ｏ産生促進作用を有すること（特許文献４）を見出し、特許出願している。しかし、卵白 加水分解物とケイヒおよび／または黒酢とを併用することは行われておらず、その効果も 50 (3) JP 2014-1163 A 2014.1.9 予測できなかった。 【先行技術文献】 【特許文献】 【０００５】 【特許文献１】特開２００３−７３２９６号公報 【特許文献２】特開２０１１−５７５７９号公報 【特許文献３】特開２００７−５１０９０号公報 【特許文献４】特開２０１１−１７３８１７号公報 【非特許文献】 【０００６】 10 【非特許文献１】Nature, 1987, 327, 524-526 【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9265-9269 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【０００７】 本発明は、より高いＮＯ産生促進活性を有し、特に冷え性改善効果が期待できる素材を 提供することを課題とする。 【課題を解決するための手段】 【０００８】 本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。 20 ［１］（１）アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼおよび／またはバチルス属菌由来の プロテアーゼを用いて卵白を分解して得られる卵白加水分解物と、（２）ケイヒおよび／ または黒酢を有効成分として含有することを特徴とするＮＯ産生促進組成物。 ［２］前記アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼがアスペルギルス・ニガー由来の酸性 プロテアーゼであり、前記バチルス属菌由来のプロテアーゼがバチルス・ズブチリス由来 の中性プロテアーゼ、バチルス・ズブチリス由来のアルカリ性プロテアーゼ、バチルス・ ステアロサーモフィラス由来の中性プロテアーゼから選ばれる少なくとも１種であること を特徴とする前記［１］に記載のＮＯ産生促進組成物。 ［３］前記卵白加水分解物１００質量部に対して、ケイヒを５∼２００質量部および／ま たは黒酢を固形分として１００∼２０００質量部含有することを特徴とする前記［１］ま 30 たは［２］に記載のＮＯ産生促進組成物。 ［４］前記［１］∼［３］のいずれかに記載のＮＯ産生促進組成物を含有することを特徴 とする冷え性改善剤。 【発明の効果】 【０００９】 本発明によれば、高いＮＯ産生促進活性を有し、冷え性改善効果が期待できるＮＯ産生 促進組成物を提供することができる。 【図面の簡単な説明】 【００１０】 【図１】異なるプロテアーゼを用いて調製した卵白加水分解物をｅＮＯＳ安定発現細胞に 40 作用させ、ＮＯ産生量を比較した結果を示す図である。 【図２】複数のプロテアーゼを用いて調製した卵白加水分解物をｅＮＯＳ安定発現細胞に 作用させ、ＮＯ産生量を比較した結果を示す図である。 【図３】卵白加水分解物によるＮＯ産生促進活性の濃度依存性を検討した結果を示す図で ある。 【図４】ｅＮＯＳ安定発現細胞にケイヒと卵白加水分解物とを組み合わせて作用させ、Ｎ Ｏ産生量を比較した結果を示す図である。 【図５】ＮＯＳ安定発現細胞に黒酢と卵白加水分解物とを組み合わせて作用させ、ＮＯ産 生量を比較した結果を示す図である。 【発明を実施するための形態】 50 (4) JP 2014-1163 A 2014.1.9 【００１１】 本発明は、以下の（１）および（２）を有効成分として含有するＮＯ産生促進組成物を 提供する。 （１）アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼおよび／またはバチルス属菌由来のプロテ アーゼを用いて卵白を分解して得られる卵白加水分解物 （２）ケイヒおよび／または黒酢 【００１２】 アスペルギルス属菌由来のプロテアーゼは特に限定されないが、例えばアスペルギルス ・ニガー（Aspergillus niger）由来の酸性プロテアーゼなどが挙げられる。バチルス属 菌由来のプロテアーゼは特に限定されないが、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus s 10 ubtills）由来の中性プロテアーゼ、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtills）由来の アルカリ性プロテアーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermop hilus）由来の中性プロテアーゼ、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyl oliquefaciens）由来の中性プロテアーゼなどが挙げられる。 【００１３】 これらのプロテアーゼは酵素製剤として市販されており、本発明のＮＯ産生促進組成物 に用いる卵白加水分解物を得るために、市販の酵素製剤を好適に用いることができる。例 えば、アスペルギルス・ニガー由来の酸性プロテアーゼとしては、商品名「ニューラーゼ Ａ」（天野エンザイム株式会社）、商品名「スミチームＡＰ」（新日本化学工業株式会社 ）、商品名「オリエンターゼ２０Ａ」（エイチビィアイ株式会社）、商品名「デナプシン 20 ２Ｐ」（ナガセケムテックス株式会社）、商品名「プロテアーゼＹＰ−ＳＳ」（ヤクルト 薬品工業株式会社）などが挙げられる。 【００１４】 バチルス・ズブチリス由来の中性プロテアーゼとしては、商品名「プロテアーゼＮ「ア マノ」Ｇ」（天野エンザイム株式会社）、「オリエンターゼ９０Ｎ」、「オリエンターゼ １０ＮＬ」、「ヌクレイシン」（いずれも商品名、エイチビィアイ株式会社）などが挙げ られる。バチルス・ズブチリス由来のアルカリ性プロテアーゼとしては、商品名「プロレ ザーＦＧ−Ｆ」（天野エンザイム株式会社）、商品名「オリエンターゼ２２ＢＦ」（エイ チビィアイ株式会社）などが挙げられる。バチルス・ステアロサーモフィラス由来の中性 プロテアーゼとしては、商品名「プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ」（天野エンザイム株式会 30 社）、商品名「サモアーゼＰＣ１０Ｆ」（天野エンザイム株式会社）などが挙げられる。 バチルス・アミロリクエファシエンス由来の中性プロテアーゼとしては、「プロチンＳＤ −ＮＹ−１０」、「プロチンＳＤ−ＰＣ−１０Ｆ」（いずれも商品名、天野エンザイム株 式会社）、商品名「ニュートラーゼ」（ノボザイムズジャパン株式会社）などが挙げられ る。 【００１５】 本発明のＮＯ産生促進組成物に用いる卵白加水分解物は、アスペルギルス属菌由来のプ ロテアーゼおよびバチルス属菌由来のプロテアーゼから選択される少なくとも１種以上を 用いて得られるものであれば、これら以外の酵素を併用して得られるものでもよい。併用 する酵素としては、例えばパパイン、トリプシン、リゾプス属菌由来ペプチダーゼ（例え 40 ば、商品名「ペプチダーゼＲ」（天野エンザイム株式会社製）等）などが挙げられる。例 えば、パパインを併用することにより、作業性を向上させることができ、リゾプス属菌由 来ペプチダーゼを併用することにより、卵白加水分解物の呈味を改善することができる。 【００１６】 卵白加水分解物の原料となる卵白は、大量入手の容易な鶏卵の卵白（例えば、卵白液、 凍結卵白液、卵白粉末等）が好ましく用いられるが、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョ ウ等の卵の卵白を用いることもできる。なお、卵白は、酵母（イースト）などを用いて脱 糖処理したものが好ましく用いられる。脱糖処理は、例えば、卵白液をクエン酸などでｐ Ｈ７程度に調整した後、卵白液に対して０．１∼０．５質量％程度のイーストを添加し、 ３０∼４０℃で１∼６時間保持することで行うことができる。また、市販の脱糖卵白を用 50 (5) JP 2014-1163 A 2014.1.9 いてもよい。 【００１７】 卵白加水分解物の調製方法は特に限定されない。例えば、卵白１００質量部（固形分） に、必要に応じて酸またはアルカリを加えて酵素の至適ｐＨに調整した後、アスペルギル ス属菌由来のプロテアーゼおよび／またはバチルス属菌由来のプロテアーゼを０．０１∼ ５質量部（対卵白固形分）添加し、酵素の至適温度で０．５∼２４時間反応を行うことに より調製することができる。反応終了後、加熱などにより酵素失活処理を行ってから、固 液分離して液部を回収し、適宜乾燥粉末化することが好ましい。なお、回収した液部は必 要に応じて活性炭で脱色処理してもよい。 【００１８】 10 上記例示の調製方法において、パパインまたはトリプシンを併用する場合は、アスペル ギルス属菌由来のプロテアーゼおよび／またはバチルス属菌由来のプロテアーゼを作用さ せる前に、卵白１００質量部（固形分）に対して０．０１∼５質量部のパパインおよび／ またはトリプシンを添加し、所定時間（通常０．５∼４時間）作用させることが好ましい 。また、リゾプス属菌由来ペプチダーゼを併用する場合は、アスペルギルス属菌由来のプ ロテアーゼおよび／またはバチルス属菌由来のプロテアーゼを作用させた後に、卵白１０ ０質量部（固形分）に対して０．０１∼５質量部のリゾプス属菌由来ペプチダーゼを添加 し、所定時間（通常０．５∼８時間）作用させることが好ましい。 【００１９】 ケイヒは、クスノキ科クスノキ属の植物トンキンニッケイ（学名Cinnamomum cassia） 20 、アンナンニッケイ（学名Cinnamomum obtussifolium）、セイロンニッケイ（学名Cinnam omum verum）などの樹皮を乾燥したものである。本発明のＮＯ産生促進組成物に用いるケ イヒの品種、産地、樹皮の保存状態等は特に限定されない。本発明のＮＯ産生促進組成物 に用いるケイヒとしては、樹皮部をミキサーなどで粉砕したもの、ケイヒ乾燥粉末などが 好適である。粉砕方法、粉末化方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いる ことができる。また、ケイヒエキス、ケイヒエキス粉末なども本発明のケイヒとして好適 に用いることができる。エキスの抽出方法は特に限定されず、溶媒抽出法、超臨界流体抽 出法、加温加圧抽出法などの公知の方法を用いることができる。ケイヒ乾燥粉末、ケイヒ エキス等は市販されており、このような市販品を好適に用いることができる。 【００２０】 30 黒酢は、食酢品質表示基準（農林水産省告示第１５０７号平成２０年１０月１６日改正 参照）により定義されるものであり、米黒酢と大麦黒酢とからなる。このうち、米黒酢に ついては、「穀物酢のうち、原材料として米（玄米のぬか層の全部を取り除いて精白した ものを除く。以下この項において同じ。）又はこれに小麦若しくは大麦を加えたもののみ を使用したもので、米の使用量が穀物酢１Ｌにつき１８０ｇ以上であって、かつ、発酵及 び熟成によって褐色又は黒褐色に着色したものをいう。」と定義され、大麦黒酢は、「穀 物酢のうち、原材料として大麦のみを使用したもので、大麦の使用量が穀物酢１Ｌにつき １８０ｇ以上であって、かつ、発酵及び熟成によって褐色又は黒褐色に着色したものをい う。」と定義されている。本発明に用いる黒酢は、米黒酢および大麦黒酢のいずれでもよ い。黒酢から水分を除去した濃縮黒酢（黒酢エキスとも称される）、これを乾燥させた濃 40 縮黒酢粉末などの種々の形態の黒酢が市販されており、これらの市販品を好適に用いるこ とができる。 【００２１】 本発明のＮＯ産生促進組成物において、上記各有効成分の配合割合は特に限定されない 。ケイヒは、卵白加水分解物１００質量部に対して５∼２００質量部が好ましく、１０∼ ２００質量部がより好ましく、２０∼１５０質量部がさらに好ましく、３０∼１２０質量 部がさらに好ましく、５０∼１００質量部が特に好ましい。黒酢は固形分として卵白加水 分解物１００質量部に対して１００∼２０００質量部が好ましく、２００∼１５００質量 部がより好ましく、３００∼１２００質量部がさらに好ましく、５００∼１０００質量部 が特に好ましい。 50 (6) JP 2014-1163 A 2014.1.9 【００２２】 黒酢の固形分は、公知の方法で測定することができる。例えば、試料１０ｍＬを、あら かじめ秤量した径５０ｍｍのガラス秤量管または平底白金皿に量り取り、水浴上で蒸発乾 固し、さらに水を加えて蒸発乾固する操作を３回繰り返した後、１０５℃で恒量に達する まで乾燥して秤量し、試料容量に対する百分比を固形分とする方法が挙げられる。ただし 、これに限定されるものではない。 【００２３】 本発明のＮＯ産生促進組成物は、医薬品、医薬部外品、飲食品などとして使用すること ができる。本発明のＮＯ産生促進組成物を含有する医薬品は、各種の経口投与形態を有す る製剤とすることができる。固形製剤としては、例えば散在、顆粒剤、錠剤、タブレット 10 剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられる。液体製剤としては、乳剤、液剤 、シロップ剤などが挙げられる。 【００２４】 固形製剤は、本発明のＮＯ産生促進組成物の有効成分に、薬学的に許容される担体や添 加物を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、デンプン、マンニットのよ うな賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース 、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエ ン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、 ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化し たりしてもよい。 20 また、液体製剤は、本発明のＮＯ産生促進組成物の有効成分を、例えば、水、エタノー ル、グリセリン、単シロップ、またはこれらの混液などに、溶解または分散させることに より調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤 、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。 【００２５】 本発明のＮＯ産生促進組成物を含有する飲食品は、各種の飲食品の形態で提供すること ができる。飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品等が含まれ る。本発明に好適な飲食品は特に限定されないが、栄養補助食品（サプリメント）として 用いることが好ましい。 【００２６】 30 本発明の飲食品は、食品に通常用いられる賦形剤または添加物を配合して、錠剤、タブ レット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、ま たはエリキシル剤などの剤型に調製することができる。食品に通常用いられている賦形剤 としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マ ンニトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニ ルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステ アリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのよ うな潤滑剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤な どが挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分 散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。 40 【００２７】 また、本発明の飲食品は、一般の飲料、食品、調味料等の形態であってもよい。飲料と しては、スポーツ飲料、ドリンク剤、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、炭酸飲料、野菜飲 料、茶飲料、コーヒー飲料、アルコール飲料などが挙げられる。食品としては、麺類、パ ン粉のような穀物加工品；味噌のような豆類加工品；米粉、小麦粉、きな粉のような粉類 ；即席麺、即席スープのような乾燥食品；スープ、カレーのようなレトルト食品；クッキ ー、ビスケット、スナック、ゼリー、ガム、グミ、飴、チョコレート、アイスクリームの ような菓子などが挙げられる。調味料としては、ケチャップ、マヨネーズ、ドレッシング 、しょうゆ、ソース、つゆ、たれなどが挙げられる。 【００２８】 50 (7) JP 2014-1163 A 2014.1.9 本発明の飲食品における有効成分の含有量は、乾燥質量に換算して、通常約１質量％以 上とすればよく、約１０質量％以上が好ましく、約２０質量％以上がより好ましい。また 、本発明のＮＯ産生促進組成物の推奨摂取量は、摂取者の健康状態、年齢、体重などによ って異なるが、有効成分を乾燥重量に換算した１日摂取量が、例えば約０．１∼５０ｇ、 好ましくは約１∼３０ｇとなる量とすればよい。 【００２９】 本発明は、上記本発明のＮＯ産生促進組成物を含有する冷え性改善剤を提供する。本発 明の冷え性改善剤には、上記本発明のＮＯ産生促進組成物以外に、ショウガ、Ｌ−シトル リン、高麗人参、ヒハツ、カンカ、ニンニク、トウガラシ、サンショウ、ポリフェノール 、ビタミンＥ、ビタミンＰ等を含むことができる。 10 【実施例】 【００３０】 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは ない。 【００３１】 〔実施例１：プロテアーゼの検討−１〕 （１）卵白加水分解物の調製 表１に示すプロテアーゼ（表中「酵素」）を用いて脱糖卵白液３２ｇ（固形分約２．４ ｇ）を酵素処理し、卵白加水分解物を調製した。表１に記載の各条件で酵素反応を行った 後、反応液を加熱（９０℃、１０分間）して酵素を失活させ、濾過して液部を回収し、乾 20 燥粉末化してサンプル１∼７を得た。 【００３２】 【表１】 30 40 【００３３】 （２）ｅＮＯＳ安定発現細胞株の作製 ウシ血管内皮細胞（ＢＡＥＣ、Cell Systems社）から常法にしたがってｃＤＮＡを調製 し、これを鋳型としてウシ由来ｅＮＯＳ遺伝子（全長）をクローニングした。クローニン グしたｅＮＯＳ遺伝子（全長）を、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（invitr ogen社）のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩサイトへ挿入した。このベクターをヒ ト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、理化学研究所）に、「ＦｕＧＥＮＥ ６ Ｔｒａｎｓｆｅ 50 (8) JP 2014-1163 A 2014.1.9 ｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」（商品名、Roche社製）を用いてトランスフェクションした 後、薬剤（Ｇ４１８、ナカライテスク社）選抜を行い、ｅＮＯＳを安定的に発現する細胞 株（Ｂ３６株）を取得した。このＢ３６株において、抗ヒトｅＮＯＳ抗体（R＆D SYSTEMS , Inc.）を用いたウエスタンブロッティングおよび免疫染色を行い、ほぼすべての細胞で 安定的にｅＮＯＳが発現していることを確認した。また、通常のヒト臍帯静脈内皮細胞（ ＨＵＶＥＣ）よりもｅＮＯＳ発現量が増加していることも確認した。 【００３４】 （３）卵白加水分解物のＮＯ産生促進活性の評価 上記（１）で得られたサンプル１∼７、または酵素処理していない脱糖卵白をＰＢＳ（ −）にそれぞれ溶解し（濃度：1000μg/mL）サンプル溶液を調製した。コントロールには 10 ＰＢＳ（−）を用いた。 上記（２）で作製したｅＮＯＳ発現細胞（Ｂ３６株）を２４ウェルプレートに播種し、 ３日間前培養した後、アルギニン（100μM）を含むＰＢＳ（−）を用いて洗浄を行った。 続いて、サンプル溶液またはＰＢＳ（−）を各ウェルに２５０μＬ添加して１５分間反応 させた。反応後、ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を溶解し、培養上清お よび細胞を破砕して得られた細胞破砕液の混合液をＮＯ産生量の測定に供した。ＮＯ産生 量の測定には、「ＮＯ２／ＮＯ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＦＸ」（商品名、株式会社同仁化 学研究所製）を用いた。コントロール（ＰＢＳ（−））のＮＯ産生量を１として、各サン プルのＮＯ産生量の相対比を算出した。 【００３５】 20 結果を図１に示した。図１から明らかなように、サンプル１、３、４はコントロールの ２倍以上のＮＯを産生し、サンプル２、５、６、７はコントロールの５倍以上のＮＯを産 生した。この結果から、使用する酵素によって得られる卵白加水分解物のＮＯ産生促進の 程度は異なるものの、酵素分解により得られる卵白加水分解物は、ＮＯ産生を促進するこ とが明らかとなった。 【００３６】 〔実施例２：プロテアーゼの検討−２〕 （１）卵白加水分解物の調製 表２に示す複数のプロテアーゼ（表中「酵素」）を併用して酵素処理を行い、卵白加水 分解物を調製した。なお、パパイン処理後にｐＨを８に調整し、その後はｐＨを調整せず 30 に酵素処理を行った。表２に記載の各条件で酵素反応を行った後、反応液を加熱（９０℃ 、１０分間）して酵素を失活させ、濾過して液部を回収し、乾燥粉末化してサンプル８∼ １０を得た。得られたサンプル８∼１０のＮＯ産生量を実施例１と同様の方法で測定し、 コントロール（ＰＢＳ（−））に対する相対比を算出した。 【００３７】 【表２】 40 【００３８】 結果を図２に示した。図２から明らかなように、複数の酵素を併用して調製した卵白加 水分解物は、コントロールの２倍以上のＮＯを産生した。この結果から、複数の酵素を併 50 (9) JP 2014-1163 A 2014.1.9 用して調製した卵白加水分解物は、ＮＯ産生を促進することが明らかとなった。 【００３９】 〔実施例３：卵白加水分解物によるＮＯ産生促進活性の検討〕 （１）卵白加水分解物の調製 脱糖卵白液１０００ｇ（固形分約１００ｇ）に、表３に示す５種類のプロテアーゼ（表 中「酵素」）を順次添加して酵素処理を行い、卵白加水分解物を調製した。なお、パパイ ン処理後に反応液のｐＨを８に調整し、その後はｐＨ調整を行わず酵素処理を行った。酵 素反応終了後、酵素を失活させ、濾過して液部を回収した。得られた液部を活性炭で脱色 処理し、噴霧乾燥して卵白加水分解物５２ｇを得た。この卵白加水分解物を１００、５０ ０、または１０００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）に溶解して卵白加水分解物溶液 10 を調製し、実施例１と同様の方法で各サンプルのＮＯ産生量を測定し、コントロール（Ｐ ＢＳ（−））に対する相対比を算出した。 【００４０】 【表３】 20 【００４１】 結果を図３に示した。図３から明らかなように、卵白加水分解物は濃度依存的にＮＯ産 生量を増加させた。なお、有意差検定にはｔ検定を用いた。 【００４２】 〔実施例４：ケイヒおよび卵白加水分解物によるＮＯ産生の検討〕 ケイヒは日本粉末薬品株式会社製「ケイヒエキスパウダーＶ」を購入して使用した。卵 白加水分解物は実施例３で調製した卵白加水分解物を使用した。ＮＯ産生量の測定は、実 施例１と同様の方法で行った。卵白加水分解物は、卵白加水分解物のＰＢＳ（−）溶液を 30 終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように添加した。ケイヒは、「ケイヒエキスパウダーＶ 」をＰＢＳ（−）に溶解した後ろ過してケイヒ溶液を調製し、終濃度１００、５００、ま たは１０００μｇ／ｍＬとなるように添加した。コントロールにはＰＢＳ（−）を用いた 。有意差検定にはｔ検定を用いた。 【００４３】 結果を図４に示した。図４からわかるように、ケイヒを単独で添加すると、濃度依存的 にＮＯ産生量を増加させた。また、ケイヒと卵白加水分解物を併用した場合には、ケイヒ ５００μｇ／ｍＬおよびケイヒ１０００μｇ／ｍＬの条件において、それぞれを単独で添 加した場合より有意にＮＯ産生量を増加させた。この結果から、ケイヒと卵白加水分解物 とを組み合わせることにより、ＮＯ産生量を相乗的に増加させることが明らかとなった。 40 【００４４】 〔実施例５：黒酢および卵白加水分解物によるＮＯ産生の検討〕 黒酢はサントレック株式会社製「濃縮黒酢粉末」を購入して使用した。「濃縮黒酢粉末 」は、液体の黒酢を約１０倍濃縮し、乾燥させたものである。卵白加水分解物は実施例３ で調製した卵白加水分解物を使用した。ＮＯ産生量の測定は、実施例１と同様の方法で行 った。卵白加水分解物は、卵白加水分解物のＰＢＳ（−）溶液を終濃度１０００μｇ／ｍ Ｌとなるように添加した。黒酢は、「濃縮黒酢粉末」をＰＢＳ（−）に溶解した後ろ過し て黒酢溶液を調製し、濃縮黒酢粉末濃度として終濃度が１００、５００、または１０００ μｇ／ｍＬとなるように添加した。コントロールにはＰＢＳ（−）を用いた。有意差検定 にはｔ検定を用いた。 50 (10) JP 2014-1163 A 2014.1.9 【００４５】 結果を図５に示した。図５からわかるように、黒酢を単独で添加すると、濃度依存的に ＮＯ産生量を増加させた。また、黒酢と卵白加水分解物を併用した場合には、濃縮黒酢５ ００μｇ／ｍＬおよび濃縮黒酢１０００μｇ／ｍＬの条件において、それぞれを単独で添 加した場合より有意にＮＯ産生量を増加させた。この結果から、黒酢と卵白加水分解物と を組み合わせることにより、ＮＯ産生量を相乗的に増加させることが明らかとなった。 【００４６】 なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示 した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を 適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 【図１】 10 (11) 【図２】 【図３】 JP 2014-1163 A 2014.1.9 (12) 【図４】 JP 2014-1163 A 2014.1.9 (13) 【図５】 JP 2014-1163 A 2014.1.9 (14) JP 2014-1163 A 2014.1.9 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ａ６１Ｋ 35/74 (2006.01) Ａ６１Ｋ 35/74 Ｇ Ａ６１Ｋ 35/54 (2006.01) Ａ６１Ｐ 43/00 １２１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 35/54 Ｆターム(参考) 4C084 AA02 AA03 AA06 AA19 BA43 CA41 CA70 DC02 MA02 NA14 ZA361 ZB211 ZC751 4C087 AA01 AA02 AA03 CA10 MA02 NA14 ZA36 ZB21 ZC75 4C088 AB33 BA08 MA02 NA14 ZA36 ZB21 ZC75 10