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学位論文
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Mucosa>
(小腸膜結合性新規プロテアーゼに関する研究)
平成7年 12月
博士(理学)申請
東京大学大学院理学系研究科
生物化学専攻
< 土 屋 勇一>
目次
略語表
ーーーーーー ーーー
ー
ー ーーーー一一ー ー
ー
ー ーーーーーーーーーーーーー ー 2
第一章
序章ーーーー
第二主主
小腸膜結合性新規プロテアーゼの精製と性質
ー
ー
ー
ーー
ー
ー
ー ーーーーーーーーーーーーー ーーーーーーー ー ーーーーーーーーーーー- 3
c
D
N
Aク口一二ングの試み
およひ(
2
1 序
ーーー一一ーーーーーーーーーーーーーー ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー司 9
2-2 試薬と材料
ー司
ー
ーー
ー
ー
ー
ー
ー ーーーーーー一一一一 ーーーーーーーーー ー
ー
ー
ー
ー
ー 1
0
2
3 方法ーーーーーー ーーーーー司自ー ーーーーーー ーーーーー一一一ー一司ーー ーーーー ー ーーーーーーー 1
3
2
4 結果ーーーーーー ーーーーーーーー ーーーーーーーーーー一一一一一一ー司司ーーーー ー
ー
ー
ーー
ー
ー
ー
ー 21
2
5 考察 ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー司ー 37
第三章
小腸膜結合性新規フ.ロテアーゼの生理機能に関する考察
ーコレシストキニンプロセシング酵素の可能性についてー
4ぺ 序
ーー"ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー一一一一ーーーーーーーーーーーーーーーー- 4
3
4
2 試薬と材料
4
3 方法
ーー
ー
ー
ー ーーーーーーーーーー ー
ー
ー
ー
ー ーーーーーーーーーーーーーーーー 4
6
ー
ー
ー
ー
ー ーーーーーーー ーーーーーーーーーーーーーーーー ーーーー-- 匂ーーー- 4
7
4
4 結果
57
4
5 考察
6
1
ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー ーーーーーーーー- 6
4
第四章
総合的考察および展望
第五章
引用文献 ー
ー
ー
ー
ー ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー 7
0
第六章
謝 辞 ー ーーーー"ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー 79
略語表
BAM-12P:b
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TPCK:Nιtosyl-L-phcnylalanincc
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:bcnzyloxycarbonyl-
2
3
主
早
第
序章
蛋白質分WI~M ぷ(ブロテアーゼ、 E C 3
.
4.
XX.
XX) は、ペプチド結合の加水分解を j
生
1
1
M
!
ょ
する酔系の総称である。プロテアーゼ研究の庇史は 古く、特に tl~化に関与する分1必型プロ
テアーゼであるペプシン、 トリプシン、キモトリプシンなどは、 当研究室を始めとする多
くの研究.xにより、その分子的性質、反応機柄 、活性化のメカニズムなどが詳細1に解析さ
れており、何千楽学の発展において )1二'~ ;(;に重要な位 i丘を占めている。
プロテアーゼはその活性 '1'心柄造によって大きく 4つのグループに大別される( 1) 。
l
'心伐基がセリンであるセリンプロテ
すなわち 、キモトリプシンやサチライシンなど活性 r
アーゼ、パパインやカテプシン併など活性 '
1心残必がシステインであるシステインプロテ
アーセ¥ペプシンなど活性'1'心がアスパラギン般であるアス パラギン般プロテアー ゼ、そ
凶を配位する金j
瓜ブ'ロテアーゼであ
してサーモリシンやコラゲナーゼなど抗性'1'心にくQ
る。各グルーフ。
l
こはそれそ れt
.
.'j 'R 的な阻 ~lj: 斉IJ が存イ E し、これらを用いることで容易に各酵
F
素の帰属が可能であるが、近年になり、これらのいずれにも属しない新しいタイプのプロ
テアーゼが発見されている(スレオニンプロテアーゼであるプロテアソーム (
2
)など)。
また各併の代表的酔楽については詳細な給品川造船析がなされており、蛋白質の構造機能
.fll[児研究に多大なp:献を与えている。
ウイルス ・微生物から高等動物 ・他物に至る までほぼすべての生物に広く存在するプロ
テアーゼは、生体￨人l
の機能調印i
l
b
l子としても広範かつ非常に重要な役割を担っている。ほ
乳煩においては食物の消化に関与する酵素併が極めて初期から研究の対象となってきた
が、これ以外にも 、例えば復数の因子が、限定分的'により順次下流の分子を活性化するこ
とで生体機能を厳密に制御している「プロテアーゼ ・カスケード J の例としては、血液凝
固系 (
3
) 、補体系 (
4
) 、レニンーアンジオテンシン系による l
血圧制節系(5
) などが古
くからj:
i
lられている。
，
を治びている分'1f
fとして、細胞￨人l
プロテアーゼの機能が准げられる。これ
近年特に mまでに者向されていたものとしては、リソソーム内に都政されたカテプシン併による細胞
内不要蛋1'111 の分 f~1~ がある。分 1必蛍白r1:などが目見透過を行う際に機能する、蛋白質N 末端
のシグナルペプチドを認識 ・切断するシグナルペプチダーゼ(6)や、蛋白質がミトコン
ドリアに移行する際に働くミトコンドリアプロセシングプロテアーゼ(7
) についても、
既に多くの研究がなされている。ごく近年になり、 {
/
[
}
J
;
(のプロセシング及び促示における
フロテアソームの関与 (
8
) 、細胞質や核内において、高1胞周期制御因子がユビキチン分
) 、正 しくフォールディングの行われなかった具
解系によって調印lを受けていること(9
4
')I~ffi 白 1~ などが 、小 I1包体において速やかに分飢'される例 ( 1
0) などが知られるようになっ
た。さらにアポトーシス(予定刻1胞死)と呼ばれる現象においても、プロテアーゼがその
鍵分子として働いていること(1
1) などが I
I
J
Jらかになり、改めてプロテアーゼの豆要性が
認識されるところとなっている。
このようなプロテアーゼの多段かっìT~~な生別機能の '1' でも、近作品も進歩を遂げた分
野の ーっとして、 l
i
i
j駆体祈性化の分子機桁がある。ペプチドホルモンや生息活性ペプチド
i
i
j駆体として合成され、細胞￨人l
の特定以行において厳密な限定分解を受けたがi
などは最初 l
*、初めて生理活性を持つ機能分子として作川するようになる。綴々な前駆体 cDNAの配
手
J
I
が解析された結果、大部分の分子は活性化の切除r
rシグナルとして Arg残基、特に Arg-Arg
/L
y
s
A
r
gといった瓜必性アミノ般対を持っていることが明らかになった。したがって前駆
体祈'1'1
化に￨共J'
Jするプロセシングプロテアーゼもこの配列を 4
平民的に認識すると与一えら
れ、背くからその両手ぷの災体を IljJ らかにする Jよみがなされてきた。 ïìíj駆体{ff白 ~1 や合成基
1~ をJrJいた生化学的解析は、主に JI日や IrFI~~ において数多くなされており、その払11 月ミ多数の
新規プロテアーゼが同定、*，1
'
製されている。また近年には、同子母丘 c
er
e
v
l
S
Ia
eの遺伝学的解
析ーから符られた KE
λ?泣伝子の産物であるセリンプロテアーゼ Kcx
2が
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司
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r及ひい lc
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nの活性化酵素であることが証明された。さらにこの酔索と高い相向性
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r
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n/PC2/PC3/PC
4/PACE4/PC
6など数多くの分子がク
を持つほ乳矧ホモログとして、 f
ローニングされており、現任では k
c
x
inf
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m
i
l
y として総称されている(1 2、 1
3、 1
4)。こ
れら 一群の醇素は、組織から完全な形での精製は成功していないものの、発現系を用いた
T
Jいた実験から、fII
j
述した典型的な活性化
生化学的特性の解析や、前駆体との共発現系を J
シグナルを正確に認識してプロセシングを行うことが証明されている。これらの酵素はト
ランスゴルジあるいは分泌~~j粒といった細胞内コンパートメントに局在する 1I葉結合酵素で
あると考えられている。 1
1
史
料i
合性というのは酔系の機能を考える上で非常に重要な問題で
ある。すなわちlÌÍj~巨体分子は生合成後分泌に至る経路の rl' で、ある特定の小器官において
正確に限定分 f~rl~ が行われる必裂があり、そのためには桁性化 防素自体がある特定の場所に
止まって機能することが必要であるからで、 l
i
i
j
J
L
Gのk
c
x
inf
a
r
n
i
l
yプロテアーゼi
洋はこの条
件を制たすものである。またこれらの 両
手系併については、切断配安1特異性についても詳細
な解析がなされており、すでに知られているがI
駆体内の活性化部位、特に C末端のアミド
化を伴うような配ダI
1に対しては正般にプロセシングを行うことが明らかにされていること
から、大部分の前 Z巨体は、 .fr"~J&的あるいは誘導的分泌経路どちらを通るかに依存して、
k
e
x
i
nf
a
m
i
l
yのいずれかの両手素によりプロセシングを受けるという説が共通の認識とな っ
5
ている。しかしながら、これらのプロテアーゼによっては認識されないであろうと忠われ
る切断シグナルを持つ I
I
I
J駆体分子も多数報告されており (1
4、 1
5、 1
6
) 、前駆体活性化の
メカニズムにはまだ明らかにするべき点が数多く残されている。
小J
J
Mは??と並んで重要な r
l
'
j化・吸収の場である。さらに最近になって、小l
協には自律神
経とは別 fiìi/ に 、"尚 l i'f区制l終系とは独立した!比a1~判l純系が tf. イ Eすることが IYI らかにされてき
ている。またそれに伴い、ペプチド1"1
訓 l終伝迷物質やペプチドホルモンなどで、"厳に存在
Jli語版ホルモン J)や、!湯管特 J'W~ に発現する分
する分子が小脳にも発現している場合( r
子なども発見されてきた。このような立 l
沫から小脳は、"厳に劣らず重要な生体高次機能を
担う ~~/Iきであると巧一えられ、その機 f単調印に関与すると思われる静素の解析は非常に重要
かつ興味深い!日l
辺である。小協に存任するプロテアーゼのIjlで、これまでに詳細な解析が
行われたものとしては、 m 化系のJ/平 I~Hr泌両手ぷであるトリプシン、キモトリプシン、エラ
スターゼの他に、いくつかの以前i 合併ぷがある。アミノペフ。チダーセ~M 、ジペプチジルペ
プチダーゼ I
Y、IjI1
"
:
1
エンドペプチダーゼ(エンケファリナーゼ)、メプリン、アンジオテ
'#がこれまでに同
ンシン 1変換 Mぷ (ACE) といった 、金同プロテアーゼを中心とする M
定されているが、これらはいずれも主として小腸上皮細胞の刷子紘肢に存有することが証
明されている。また小脳以外にも腎臓や J
J
l臓を始め各組2
5官の細胞!換に存任していること
が知られており、消化ペプチド断片の完全分解以外にも、各種生理活性ペプチドの作用後
の速やかな分解に関与していることが保々な解析から明らかになってきている。さらに小
腸特異的に発現している自予来としてセリンプロテアーゼであるエンテロペプチダーゼが知
られている。この両手系は十二指腸より
m
化管に分泌され、腕!臓から送られる消化酵素前駆
体の 一つトリプシノゲンを限定分角平により活性化する、プロセシングプロテアーゼの一種
である。しかしながら前述したような、!肢がi
合性の前駆体活性化酔系の報告はほとんどな
い。"悩や副腎髄質、肝臓においては、各純生理活性ペプチドfÌÍj~巨体の活性化に関与すると
惟測されるJ/史紡介プロテアーゼの同定が生化学的手法により数多く行われており、小腸に
おいても同 一 あるいは類似の両手本が存花すると十分に抑祭できる。しかしながら小腸にお
いてこのような研究は、
1
併
の
:(
J
'
sl要性にもかかわらずほとんどなされていない。我々はこ
の点に着目し木研究に着手した。
II
より、 l
i
i
j似体フ。
ロセシングに関与する可能性のある酵素の条件として、
七にi&べた互U
01.以FI日分、特に小!泡体などの k~lI"包内小総官が回収されるミクロソーム四分に合まれる、
membranc-bound/Il1cmbr
a
n
c
-a
s
s
o
ci
a
tc
dな M系である
0 トリプシン級活性(特 に Arg残基の C端的!iJ~切断する)活性を持つ
6
という 二 点を条 flーとし、大日に人下しやすいブタ小 11易車IliJJ~ を川いて、合成法 n によるスク
.
n
リーニングを開始したところ、 l
i
i
jJ
i
l
i
し
たU
!
E
J
，1の両手ぷ i
;
r 以外に、 Boc-Gln-Ala-Arg-MCAを
最も良い l，~n とする新規 IJ央紡合性プロテアーゼの祈性を見出すことができた。以後本論文
ではこの両手素を、.Mc
m
b
r
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(
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c工
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p
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n
l
i
k
c
.
E
;nzymcの略とし
て MATEと表記する。本論文では、生化学及び泣伝子工学などの技術i
を川いて、
MATEの
生化学的 '~H'J 及び生理機能の Wt.析を総合的に解明することを 1 -1 的とした。内科の限J
t
r
r性か
ら、大きく以下の三市に分けてまとめることとする。
まず
m
ニヰでは、生化学的手法による、
MATE'
の完全精製と性質の W
f.析及び‘部分アミノ
酸両日列の決定について示す。本 f
;
tの内容は日!H
X
I (17) に基づく。第三2
1では、分子生物学
的手法を'1'心に
mい、 cDNAライブラリーの作製及びスクリーニング、 RT-PCRによる
MATE
のcDNAクローニングの試みを記す。さらに第￨川市においては、ゴミ1m機 f
i
Eに
￨
長l
する
一巧空気として、1:翌日活性ペプチドの 一つであるコレシストキニン( CCK) のプロセシン
の
￨
見l
ワの可能性を、
グへの MATE
1
ミ
化予及びi
l
l伝子て学的手法を用い 1H
をの立場から解析
する。そして第五，官において、本論で述べなかった予仙j((~ データを合め、総合的な考察及
び今後の j
及型について述べることとする。
7
立
早
第
一
一
小腸膜結合性新規プロテアーゼの精製と性質
および、cDNAクローニングの試み
8
2
1 序
序章で述べた作業仮説、すなわち
O版画分、特に小)自体などの *
1
)
泡内小 2
5官が回収されるミクロソーム回分に含まれる、
mcmbranc-bound/m
c
m
b
r
a
n
c
a
s
s
o
c
i
a
t
c
dな酔素である
0 トリプシン級祈性(特に Arg残法の Cy;
削
1
!
I
l
を切断する) i
i
5
'
ドl
ニを持つ
という 二点を条例とし、大 jlUこ人下しやすいブタ小 JJ&WiJJ~ を川いて、スクリーニングを開
始するとともに、脱却 l
の併ぷについても民間を I
Y
1らかにするため活性を同定した。アミノ
ペプチダーゼM、ジペプチジルペプチダーゼ I
Vについては合成基質により、エンケファリ
ナーゼは然変性カゼインにより 、エンテロ ペプチダーゼはトリプシノーゲン活性化能によ
りそれぞれ活性をa!11 Jtし、部分品'í~ を行った。しかしこれらとは全く別個で、
P1
}
}
g位に
Argを持つ J
，
H"lに以く作汀l
する $
M
J
W
i
f
l
:
を
検/
Uした。:'Jf
J
J
は BocGln-Ar
g-Arg-MCAを用い
pH8.0 で活性を検 11 11 していたが、必 l~ を Boc-Gln - AI a
A
r
g-MCAに
、 pHを9
.
5に変更すること
で、このr，r，.性をより村民的に検1.1'，できることが判明したため、このように活性測定系を改
良し、主l
i
T
>
I
J
J
失結合性トリプシン様プロテアーゼを完全半1
市1
することができた。本章ではま
ず前半部で、本両手来の精製、生化学的性質の解析および部分アミノ酸配列について報告す
る。さらに後半部では、 RT-PCRおよびライブラリーのスクリーニングの二極類、の方法を
用いて cDNAクローニングを試みたのであわせて報告する。
9
2
2
. 試薬と材料
<酵素の精製と性質>
ブタ小脳
*京芝力!日以日目
DE52
ワットマン
ブチルトヨパール
来ソー
TSKgelODS-120T
BioGelP-150
バイオラッド
SDS-PAGE分子世マーカー
ベンズアミジンーセフアロース
ファルマシア
FPLCMonoQ
FPLCMonoP
フルオレスアミン
シグマ
DFP
大豆トリプシンインヒビター
ウシ勝臓トリプシンインヒビタpC
恥任3
EDTA
0-フェナントロリン
ルブロールPX
酸化インシュリンB鎖
クマシーブリリアントブルー G250
各種MCAun
ペプチド研究所
各種生理活性ペプチド
E
6
4
ホスホラミドン
デオキシコール椴ナトリウム
ナカライテスク
銀染色キット
和光純薬
TPCK
1
0
TLCK
アルド リッチ
BCATM/mi
croBCATMキット
ピアス
ProSpin™
アフライドバイオシステム
ヒドロキシアパタ イ ト
生化学工業
ロイペプチン
青拶1
I
高I
1
)
J
t
呼土の御供与による
アンチパイン
その他の試~は 、 特級もしくはそれ以上のものを川いた。
<cDNAクローニング>
湯 ・J
J
F
I
臓
ラット小j
埼玉実験動物
各種制限目
宇
奈
東 洋紡
アルカリフォスファターゼ(子牛小腸)
T4ポリヌクレオチドキナーゼ
DNAライゲーションキット
宝酒造
QuickPr
epMi
c
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ファルマシア
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アガロース
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アマシャム
HybondN
イース トエ クストラク ト
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パク トトリ プトン
合成 DNA
サワテ.イーテクノロジー
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その他の試薬は、特級もしくはそれ以上のものを川いた。
大腸菌
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'
/(
sr
l
-r
e
cA
)3
0
6
・
・ Tn1
Os
upEt
hト ι
[
F
t
r
aD3
6
]
AB，
プラスミド aJ，\j~裂など一般的 m 途
L87
hsdR(
r
k
-l
1
1k
+
)t
l
pRmetDSl
I
pEt
o
nA
NM5
引l
凶
4
h
臼
s
sdR51
4(
仇
山
I
k
寸
哨
叫
1
1
製
cDNAライフブeラリ一作4
辺
ベクター
λ
g
t
l
O
cDNAライブラリー作製
MI311l1
ヲ1
9
DNAシークエンス刀]サブクローニング
1
2
2
3
.方法
<酔素の精製と性質>
メチルクマリルアミド (MCA) 基質によるぺプチダーゼ活性の測定
n
daらの方法 (
1
8
) に従った。
メチルクマリルアミド誘将体を2Ji とした活性は、 Yanagi
4-メチル7クマリルアミド」品質はぺフ。
チダーセ・により下図の般に )
J日水分解される。この
時蛍光物質である 7
アミノ斗メチルクマリンが遊離するので、この蛍光強度を測定するこ
門
。
匂
主 2
ρ
O
7
とにより、活性が測定できる。
七
∞
O
」+叶ω
H
比
刑刑叩t
ト
P
e
p
t
i
凶
dase
~
/
実際には、適当な pHの緩衝液 0.
5mlに酵素溶液ト 1
0
μ
lを加え、 37Cで数分予温したの
0
ち
、 1
0mMの MCAt
J
i
質
を 5μi加え、 37"
C
で1
1
0分反応させた後、反応停止液として、 100mM
モノクロロ酢般を含む餅 霞ナトリウム緩衝液 pH4.
3を2
.
5ml
加えた。この溶液の励起波長
370nm、蛍光波長 460nmでの蛍光強度を測定し、活性を測定した。活性の単位は、 Inmolの
n
4
・アミノー7ーメチルクマリンを l
分
r
: に遊離する酵素の監を lユニットとした。
なお、 MATEの活性測定には緩衝液としlD.IMグリシンー水般化ナトリウム緩衝液
pH9.5 (グリシン緩衝液)を川いている。またアミノペプチダーゼ M及びジペプチジルペ
プチダーゼ IVの活性測定は、それそ‘れ Ala-MCA及び冶 Iy-Pro-MCAを用い、O.IMトリス一塩
般緩衝液 pH8
.0で測定した。
フルオレスアミンを用いた中性プロテアーゼ活性の高感度測定
中性プロテアーゼ活性は、 Sogawaらの方法((9
) を改変した方法により行った。基質
溶液は、各都Iff白を 1% のI
脱皮で、 O.IMほう酸ー炭酸ナトリウム緩衝液 pH8
.0に溶解し、
1
3
80"
C
で 2/1.'i川然変性をさせたものである。活性をiJl
l
仏t
するために、
M15:浴i
伎と酔京の混合
I
!
主
:2
50
μ
lを37
"
Cで 1
8時間反応させた後、 5%トリクロロ酢般溶液を 750
μ
l加えて反応を停止
させた。この溶液を室机で 30分以内した後、 1
2，
000rpmで 1
0分間述心し、分解されない蛋
白質を沈澱させた。この上山を 20
0
μI
l
取り、 O.IMほう酸ー水般化ナトリウム緩衝液 pH8.5
を2
.
0ml
加え、次いで 0_
3mg
f
mlのフルオレスアミンを合むアセトン総波 0.5ml
を激しく悦作
しながら加えた。この反応浴 I
伎の、似J
起波長 405nm、i
泣光 v
J
i
.長475nmでの蛍光強度を測定
<
:
'
]の災験においては、蛋白 n
'
!
.
!
S
:
1
に
末
、I
する活性は非常に弱
し活性を測定した。ただし今 1
かったために、この測定方法は制傾的には川いておらず、ユニットの定義もしていない。
ただしエンケフアリナーゼ活性はこの方法で検山できる。
フルオレスアミンは第一級アミンと反応し、強い蛍光物質を ~I: I&する。この蛍光を測定
することで 上t
'
l
l
1
''
の切断ペプチドのアミノ末端i
を定討することが本測定の原理である。
t
ー
ー
ー
一
一
一
一
一
ー
一
一
知
ー
。
/ ~nm
405nm
ペプチド 基質分解活性と切断位置の測定
1
仏1
ペプチド i
品質に対する活 t
ti
J
l
:
は、 Takahas
h
iらの方法 (
20) に従った。基質 Inmolと酵
ぷ0.
1
ユニットを、 10mMEOTAを合む 20μlの0.
07M トリス一組般緩衝液 pH8_
0'
l
'
で 2.
5f
時間
もしくはそれ以上の時間反応させた。反応 により生じたペプチド断片は、アプライ ドバイ
オシステム 1
30Aセバレーションシステム及びAquapor
c00-300Cl8カラム (
2
_
1X 30m m)
をmい分取した。熔出は 0.1% トリフルオ口問 般系で、アセトニトリル泌度を 0から 70% ま
で直線的に上げることで行った。 220nmの吸収に必づきピークを分取し、凍結乾燥後、ア
ハ
フライ ドバイオシステム 420A 30A920Aアミノ 酸組成分析総にかけ、アミノ駿組成及び
1
4
品から、切断位[白及び、切断率をt?=山した。
SDS-PAGE
、 1
2.5%のゲルを
SDSPAGEは
mいLac mliの方法
，
百
(
21
)に従って行った。泳動後は通常
は和光の銀染色キットを J
T
Jいて染色し、写 T
!I
k
l);~I
1
.
'
jにはクマシーブリリアントブルーを用
いた。
蛋白質の定量
蛋白 1
1の定 l
t
lは
、 280nmのl
汲
光
}
J
!
(
_
測
定 、及び Sm
i
t
hらによる BCA法 (
2
2
) を用いた。蛋
誌の標準として、ウシ J
u
L
7
，
'
i
アルブ‘ミンを使 j日した。
白i
N末端アミノ酸配列の決定
1llU1，ï後 ì**llf 乾燥したね:ll:! t'iH~ 500ユニットを、 50
μ
lの0.
2M，
1
l
.(
化ナトリウムを合む 20mM
酢酸ナトリウム緩衝液 pH4
.
5
1こ溶解し、プロトコルに従って P
roSpi
nPVDFI.肢に吸着させ
た。 この肢を純水で洗浄した後(メタノールを加えると肢から遊離する)、直接アプライ
ドバイオシステム 477A/1
20Aプロテインシークエンサーにかけ分析を行った。
部分アミノ磁配列の決定
本実験は、キリンビール基盤研究所の岩訟 n
f
j彦氏により行われた 26) 。精製酵素
1
，
000ユニットを SDS-PAGE後PVDFI.院に転写し、
1
史上で
Sー
カルボキシメチル化を行った
r
omo
b
a
c
t
e
rP
r
o
tc
a
s
c[J
Xひ:
E
n
d
o
p
e
p
t
i
d
as
eAs
p
-Nを万jいて川s
i
lud
igc
s
t
i
o
nを行い 、遊離
後
、 Ac
したペプチド断片を HPLCで
分
I
f
:
x
:
{
炎、島津 PSQ-Iプロテインシークエンサーにより配列 を
解析した。
1
5
酵素の精製方法
特に断らない限り、以下の傑作はすべて 4Cで行った。
0
を洗浄し、氷冷して実験室に持ち帰った。はさみで不用
フタ小!似は解体後軽く水で!人j，:m
な脂肪分を取り 徐
￨ き、およそ 30cmの長さに切り分けた後、スライドグラスを用いて小腸
内部の品l
i
J)央をはぎ取った。これを集めてー
2
0Cで保作し、必要に応じて解凍してJfJいた。
0
i
i
l
K
W
l
織がJ
1
，
600
g(
二頭分)に こ U
'
1位の O25Mしょ拡f
!
溶液を加え、ワーリング
角打点した *
，
ブレンダーを川いて細胞を 1
枝問 し (1
0，
0
0
0rpmX 2
0s
c
cX 1
0r
n
l
) 、組ホモジネイトを得
L
0，
0
0
0Xg，
3
0m
i
n述心し、上 r
'
l
i
を得た。この上前を 9
0，
0
0
0X g，1
2
0m
i
n速心し
た。これを 1
沈澱を回収した。このちt
澱を OIMほう般ー炭椴ナトリウム緩衝液 pH8
.
0 (ほう酸緩衝液)
，
で、ポッターエルベジエム型ガラスーテフロンホモジナイザーを
mいて(中速で
2スト
ローク)ホモジナイズし体制を 4
0
0m
lとした。これを 9
0，
0
0
0Xg，1
2
0min遠心し、沈澱を
1~f た。これを I MJílr~化カリウムを合むほう般緩術波で同般にホモジナイズし、 90，000 X g，
1
2
0mini
l
i心して沈澱を回収した。この操作で、 1失に l怜治的に絞く結合した蛋自民や、小
胞内に諮ら1
された可溶性蛋白質は除去されたものとした。最終的に得られた沈澱をほう酸
0
0m
lに合わせてミクロソーム四分とした。また、
緩衝液でホモジナイズし、体積を 4
Ca2+
を用いた選択的沈殿法を用いる際は、以下の操作を行った。 1
0，
0
0
0Xg，30min遠心して得
られた上消に対し、終波風 OmMになるよ うに塩化カルシウムを加え、 l時間撹枠した
0，
0
0
0Xg，
30minの迷心を行った。この操作により、小胞体などの函分は沈殿す
後、再び 1
るが、
免など般性脳に;苛む画分は上消に残る。 MATE活性は大部
トランスゴルジや刷子縁1
分が上消に存住するため、これを
mいさらに 90，000Xg，120min述心し沈澱を回収した。
この溶液に 1
0%デオキシコール殴ナトリウム水溶液(w/
v
) を6
0ml
J日え、ほう酸緩衝液
}
wを600mlに、界面活性剤泌度を 1%になるように調製した。 これを 一晩撹枠し
て脱蛋白 ~1 を百j 熔化し、 90，000 Xg，1
2
0m
i
n述心後、上 m
を回収した。これを 0
.
0
5%ルブ
を加えて体
ロールPXを含むほう殴緩衝液に対して透析し、界而活性J'i!Jを交換し、可溶化函分とし
て、以下のカラムクロマトグラフィーに用いた。
1
6
カラムク口マトグラフィー
(
a
).
DE52
透析後の可総化回分を 1
50m1ずつ四等分し、計4回の操作を行った。
可溶化回分を 、0
.
0
5%ルブロール PXを含むほう般緩衝液で平衡化した DE52カラム (
2
.
6
汲消させた。￨両l
緩衝液で洗った後、取化ナトリウム泌度をふ 0.3Mまで直線的
X 28cm) にI
Jを行った (Fig.2-1(
a
)
)。
に上げることで前 U
(
b
)ブチルトヨパール
上で符られた術的:匝i
分(およそ 0.2Mの取化ナトリウムを含む)に、硫般アンモニウム
をl
立接、 20%飽和波皮になるまで加えた。これを 0.02%ルブロール PX及び20%飽和硫酸
2
.
6X 2
8cm)
アンモニウムを合むほう酸緩衝液で平衡化したブチルトヨパールカラム (
にl
及活させた。カラムを同緩衝液で洗った後、r
m
t般アンモニウム泌度を 20-0%飽和まで直
線的に下げていくことで浴/1'，を行った(F
i
g
.
2
-1
(b))。活性阿分(およそ 1
0%飽和の硫般
アンモニウムを合む)を回収した後、
r
l
1
f
t
般アンモニウムを直後、
30%飽和濃度になるまで
irli.般アンモニウムを含むほう酸緩衝液
加えた。これを 0.02%ルブロール PX放び 30%飽和 r
1)に吸着させ、 0
.
1%ルブロール PXを含
で平衡化したブチルトヨパールミニカラム(5m
むほう般緩衝液で溶出することで=濃縮を行った。
(
c
)ゲルろ過 B
ioGelP-150
泌総i
した活性画分(およそ 7
m1) を
、 0
.02%ルブロール PX及び0.
2M塩化ナトリウムを含
むほう酸緩衝液で平衡化した Bi
o
Gc
1P
150ゲルろ過カラム (
2.
5X 82cm) に添加し、同緩
n
/I
¥
をf
J
こった (
F
i
g
.
2
-1
(
c
)
)
衝液で (
0
1，月 tl:~ln 分を I!.'I収し 、 0 .02% ルブロール PX を含む 20mM
トリスー瓜限緩{血液 pH8
.0 (トリス緩衝液)に対し透析した。
(
d
).FPLC MonoQ
透析後の活性問分を、 0.02% ルブロールPXを合むトリス緩衝液で平衡化したFPLC
0.
5X 5cm)に吸着させた。同級伍II-伎でカラムを洗った後、鹿化ナトリウ
MonoQカラム (
ム泌皮を ふ0.5Mまで直線的に上げていくことで溶/_L¥を行った (
F
ig
.
21(
d)
)。
1
7
(
d
'
).
ヒドロキシアパタ イ ト
MATEはあi
t
製後半になると透析により火活する
'
J
rがあるため、改良法では FPLCMonoQ
の代わりにヒドロキシアパタイトを川いている。 B
io-GclP-150の活性画分をそのまま、
0.02% ルブロール PX及び0.2M~包化ナトリウムを合むほう般緩衝液で平衡化したヒドロキ
シアパタイトカラム (1mりに 添加し、同緩衝液で充分に洗った後、 0
.
02%)レブロール PX
及び0.
2M .1;¥，¥化ナトリウムを合む 10mMリン殴ナトリウム緩衝液 pH7.5 (リン酸緩衝液)で
総出を行った。この燥作により、 FPLCMonoQと問程度の料製度が得られる。
(
e
).
ベンズ アミ ジンー セフ アロース
f.1i位向分(およそ 0.
2
5Mの瓜化ナトリウ ムを含む)を、 0
.
0
2%ルブロールPX及び0.
2M鹿
化ナトリウムを合むトリス緩衝液(もしくはリン限緩衝液)で平衡化したベンズアミジ
m
l) に吸着させた。阿緩衝液で十分洗った後、
ンーセフアロースカラム(I
50m Mベンズ
アミジンを含む|日l 緩衝液で t，IÍ' Y~ 的に溶 / IJ を行った。活性四分は必要に応じて N AP-25脱 塩
カラム(ファルマシア)でベンズアミジンを除き 、品終結製傑品とした。
<cDNAク ロ ー ニ ン グ >
一般的手法
アルカリ法によるプラスミド調製、制 限酵素反応、アガロース電気泳動など基本的な操
a
n
i
a
t
i
sらの成蓄に従った (
62)
作は、 M
0
DNAライゲーションは宝酒造のキットの指示に
従った。
RTPCR
c
pMi
c
r
omRNAp
u
r
i
f
i
c
a
t
i
o
nK
i
tの指示に従い 、およそ O.
l
gの組織か
mRNAの調製は QuickPr
r
s
tS
t
r
a
n
dcDNAS
y
n
t
h
c
s
i
sK
i
tの指示に従って、
ら行った。この一部もしくは全部を用い、 Fi
O
l
ig
o
(
dT
)12_18プライマーを用いて逆転写により 1
s
ts
t
r
a
n
dcDNAを合成し 、反応液をそのま
ま鈎型としてJTlいた。 PCRはPromegaの指示に従い、添付 の緩衝液に 2mMMgCI2を加え 、
0.2mMdNTP/2pMプライマーの条件で行った。地中日条件は以下のように行った。
1
8
0
94C
1min
XOC
1min
C
72"
1min
5cyc
l
c
s
↓
0
94C
1min
C
55"
1min
0
1min
72C
0
30cy
c
lc
s
0
XOCの部分を、 37Cから 50Cまで変化させた。地的した断片は 1
G:気泳動後アガ、ロースゲル
より切り出し、 GcneCl
c
anI
Iを川いてキットの指示に従い精製を行った。なおプライマー
のデザインは Tabl
c31に示す。
なお cDNA合成のコントロールとして、ブタ小j
J
易ではコレシストキニン、ラット小腸及
び肝臓ではグルタチオンー
s
トランスフエラーゼ Pのプライマーを用い、正しく増幅される
ことを確認した。
塩基配列の決定
目的の断片は MI3mpl9にサフゃクローニング後、 s
sDNAを
ま1
)型として AutoRcadScqucnci
ng
Kit
およひ、A.L.
F.
DNAシークエンサー(ファルマシア)を用いて境基配列決定を行った。
全RNAの調製及ひ(mRNAの精製
cDNA ラ イ ブラ リ ー作製用には、 RT-PCR に比鮫して大量のm貯~A を必要とするため、
まずAGPC (Ac
i
d
-Guamidimium-Phc
nol
C
h
l
or
of
on11) 法を用いてフ タ小腸全RNAを摘出した
e
(
63
)。
ホルムアミ判官気泳 W
Jにより、 18S及び28SrRNAのバンドを確認することで、精製の
目安とした。さらに QuickPr
c
pMicromRNA p
u
r
i
f
ic
at
ionK
i
t添付の O
l
igo(
dT
)
cc
l
l
u
l
os
cを用い
てmR
NA を車内製した。
cDNAライブラリーの構築
二重鎖 cDNA合成は、 TimcSavcrcD
NA Syn
t
hc
si
sK
i
tの指示に従い行った。 E
coR
Iア
タ
・
フ
。
ターの付加された cDNAを
、 cDNAr
a
p
i
dCl
o
n
i
ngModulc-λgtlOの指示に従いベクターとラ
1
9
イゲーションを行い、 Gi
gaPack1
1GoldをJ
I
Jいてパッケージングを行った 。また 16伺ク
0f
o
r
w
a
r
d&r
c
v
c
r
s
cp
r
i
m
c
r
sをJ
I
Jいて PCRを行い、インサートの 長さ
ローンを選んで、入gt1
を3kbまで見附もった。
ライブラリーのスクリーニング
4に感染させ、 1
50mmのプレートに、 一枚あたり 4X 104
ライブラリーファージを NM51
プラークを形成させ、HybondN ニトロセルロースメンブレンに転写後べーキングによっ
06プラーク)用いた。
て回定化した。これを 24枚 (合計 IX1
プローブは [
y
3
2P
]ATP5MBqを川いて T4ポリヌクレオチドキナーゼにより末端をラベ
CKカラムを川い ATPを除去した。プローブのデザインは Tabl
c3
1に示す。
ルした後、 NI
メンブレンを 6X SSCI0
.
1% SDSI1X Dcnhardt
'sS
o
l
u
t
i
o
nI0
.
1mg
!mlSalmonSpcrmDNA
の条件で、 40C、引l
与
I
1n
プレハイブリダイゼーションを行った後、 5'
末端を 32pラベルした
0
0
f
tは6XSSCI0.
1%
プロープを加え、 40Cで終夜ハイブリダイゼーションを行った。洗?1
0
SDS、40Cの条件で行った。シグナルの得られたプラークに対しては、 90mmのプレー
03プラークを形成させ 、同 一条件で二次スクリーニングを行っ
トに 、一枚あたり 1X 1
た
。
20
2
4 結果
T
a
b
lc2
1に示した通り、 5段階のカラムクロマトグラフィー (
F
ig
s.
2
1a
d.
) によりブタ
小腸から新規 の 1I~ *，'i 合 性ト リプシン 級両手 素 を精製する こ とができた。 酔 ぷ活性 は界 I師活性
f
i
!
J
による可溶化でおよそニ併に上糾しており 、こ の段階から卜万倍以上の村製皮が必要で
栄作により、小腸の代表作J
なl
供給合フ。
ロテアーゼであるアミノペプチダーゼ
あった。この J
M、ジペプチジルペプチダーゼ N 、エンケファ リナーゼの活性は完全に除去された。また
本I
i
予奈は、 トリプシノーゲン活性化能も持たなかったことから、エンテロペプチダーゼ活
性も除去された(データ 作目的。
Table2
1 精製のまとめ
ブチルトヨパールの活性四分においては、高濃度の硫酸アンモニウムを含んでいるため
に
、 sCA法では蛋白質の)，i::訟を行うことができなかった。また見かけの活性も阻害されて
いる。
S
t
c
p
T
o
t
a
la
c
t
ivi
t
y
P
r
o
t
c
i
n
S
p
e
c
i日ca
c
t
i
v
i
t
yP
u
r
i
f
i
c
a
t
i
o
n
Y
i
c
l
d
u
n
i
ts
/
mg
%
u
m
t
s
mg
Microsomalmcmbran巴
3，
370
5，
400
0.
62
Sol
u
b
i
l
i
z
a
t
i
o
n
700
7，
4，
860
1
.58
DE52
880
4，
，
1
7
0
1
B
u
t
y
l
T
o
y
o
p
c
a
r
l
1
，
960
Bio-GclP-150
440
2，
FPLCMonoQ
1
，
620
B
c
n
z
a
m
i
d
i
n
c
Sc
p
h
a
r
o
s
c
，
030
1
N.D
1
.52
く
日
ーu
l
d
1
.0
1
0
0
4
.
1
7
2
.
6
6
3
N.
D
N.D
25
1
，
61
0
1
020
32
0
.
6
6
5
2，
410
1
5
3
0
2
1
0
.
0
0
5
>206，
000
>1
3
0，
000
1
3
N.D.，n
o
td
c
t
c
n
n
i
n
c
d
.
21
10
コ EE ︿
ifi?LtEEZZ
-
24
・
{
Z︿民医O凶@︿
1111 }εC0・ N L F︽ 凶ω
(
a
)
0
.
3
1
0.
2
豆
0.
1
U
何
Z
20
40
60
0
100
80
FRACTION NUMBER
F
i
g
u
re2
1
(
a
) DE52カラムクロマ卜グラフィー
カラムサイズは 2
.
6X2
8cm、i
f
i
t
i
tは60ml/h、 1
Oml/f
r
a
c
t
i
o
nで分間した。図の体帝京で示し
た四分を活性画分とした。
30
)
hu
(
32
{lill1
。
(
︼
E
E
0・例炉︿ 凶ωZ︽国区om凶︿
四
ト
C
四%百
コ
"
'
、
ξ
w
ω
E
)
w
Z
E
ト
2
10
1
:
E
〈
10%
ト
色3
〈
u
.
_J
コ
(
f
)
E
コ
z
o
三
0
100
01
ゐ
三
〈
F
i
g
u
r
e2
1(
b
) ブチルトヨパールカラムクロマトグラフィー
カラムサイズは 2
.
6X 28
cm、流速は 40ml/h、 11
ml/f
r
a
ct
i
o
nで分画した。図の様線で示し
た四分を活性画分とした。
22
0.
6
100
(
c
)
t
60
言
E
〈
~
3
:
40
E
0
.
2
。
<(
〉
ド
20 2
0
.
1
0
0
0
80
F
i
g
u
r
e2
1(
c
) B
i
o
G
e
lP150ゲルろ過
カラムサイズは 2
.
5X 82c
m、流速は 20ml
/h、2
.
7
m
l/f
r
a
c
t
i
o
nで分画した。棒線で示した薗
分を活性 l
四分とした。
∞
0
.
2
8
(
d
)
∞e
6
0
.
5
S
4∞
0
.
1
呈
C
3
o
E
王
国
霊
E
0.
4
0.
3
験-
∞2
2
図
0
.
2
《
(li)(
三一
umZ
~
E
0
.
1
。
。
。
40
F
i
g
u
r
e2
1
(
d
) FPLCMonoQカラムク口マトグラフィー
カラムサイズは 0
.
5X 5cm、流速は 0
.
5ml/min、0
.
5
m
l/f
r
a
c
t
i
o
nで分画した。宇幹線で示 し
た部分を活性四分とした。
2
3
1000
642
000
000
}士E百
三 Cコ}﹀ヒ﹀戸 U︽
10
20
30
40
50
60
FRACTION NUMBER
F
i
g
u
r
e2
1(
d
'
) ヒド口キシアパタイトカラムクロマトグラフィー
、流速は I
Oml
/h、 1
ml/f
r
a
c
t
i
o
nで分間1
(した 。俸紋で示した函分を活
カラムサイズは Iml
性画分とした。なお吸光度は測定していない。
0
0
8
T
I
-
1000
(
e
)
{
E
600
』
紛
糾
Z
コ
、- 400
t
〉
ト
~
200
10
20
FRACTION NUMBER
F
i
g
u
r
e2
1
(
e
) ベンズアミジン ーセフアロース
アフィニティーク口マトグラフィー
m
l、流速は 5m
l/h、 1
ml/f
r
a
ci
tonで分画した。 体線で示 した薗分を活性
カラムサイズは I
四分とし た。なお吸光度は測定してい ない 。
2
4
また、 MATEの辺元及ひ引:
辺元状態における SDS-PAGEをF
i
g
.
2
2に示す。還元知u(ジチ
オスレイトール、
DTT
) ~H'f{J:下では約 50k の位置に単 一 のバンドが現れている 。 また
B
i
o
G
c
lP
1
5
0及 び FPLCS
u
p
c
r
o
s
c1
2 の二種猿のゲルろ過カラムにおいても、およそ 5
0
kの
u
L
i
百に溶山した。 一方辺元 f
i
l
J:
f
押E
下 SDS-PAGEでは約 32kの位 1
[1にバンドが現れている。
後に考祭で述べるように、本田手ぷは S-S結合で艇がれたホモダイマーであると考えてい
る。また FPLCMonoPクロマトフォーカシングの結果より、本田手来の等電点はおよそ 4
.
5
と推定された(データ省目的。
F
i
g
u
r
e2
2 SDS-PAGE
酵素を DTTn任下及び非存住下で電気泳動し、クマシーブリリアントブルーにより染色
した。
レーン 1
. 分子量マーカー
レーン2 非還元状態
レーン3
. 選元状態
2
5
T
a
b
l
c2
2に科純何 l
，
'
!
;
:
1
i
I
J
の斜J
%を示す。本両
手 来は DFP、BPTI、SBTI、ロイペプチン、アン
チパインなどに強く I~fl ~ç された 。また Ca 2 + を合め金属には ~Iõ依存的であった。
Table2
・2 プ口テアーゼ活性に対する各種阻害剤の効果
E
子
一
素0
.
0
5ユニット を0
.
5ml
のグリシン緩衝液'1 1 で、各種阻害 ~J と室組で3 0 分間 反応さ せ
mいて測定した 。{
"
Jも試薬を加えないときの活
た後、残存祈 NをBoc-GI
n
A
l
a
Arg-MCAを
性を 100% とした。
R
c
a
g
c
n
t
Con
c
c
n
t
r
a
t
i
o
n
I
n
h
i
b
i
t
i
o
n
1
.0mM
%
34
TPCK
1
.0m M
1
2
Soybcan廿y
p
s
i
ni
n
h
i
b
i
t
o
r
0.
2mglml
78
ヴp
s
i
ni
n
h
i
b
i
t
o
r
Bovincp
a
n
c
r
c
a
st
0
.
2mglml
99
L
c
u
p
c
p
t
i
n
0
.1m M
9
1
Ant
i
p
a
i
n
O.lmM
8
8
DFP
1
.0mM
95
Bcnzamidinc
1
.0mM
58
TLCK
pC~偲
1
.
0mM
E-64
1
.0 m恥f
。
。
。
。
。
EDTA
10.OmM
かP
h
c
n
a
n
t
h
r
o
l
i
n
c
1
0.
Om M
Phosphoramidon
0
.
1m M
P
c
p
s
t
a
t
i
nA
0
.
1m M
Ca2+
1
.0m M
39
Zn2+
1
.0mM
27
26
20
T
a
b
lc2-3 では各種 MCA ，!，l; 1! に対する基 1'1:特 51~性を示した。これによればP 1 site に Arg を持
つ基貨を良く }
JIl水分解しているのに対し、 Ly
sを持つ基質に対しては活性が弱い。またキ
モトリプシンの必).~やエキソペプチダーゼの基 n には全く作用しなかった。このことから
木酵素は、 トリプシン版活性を持ち特に Arg に特 Jr~ 的であると脱税1) できる。さらに P 2 及び、
PJ
si
tcもi
6nに大きな影響を与えていることが予処!される。訓べた限りでは、 P2si
a
や
tdこAl
Gly 、 Scr なと.の小さな残 2，~が、
PJsitc には逆に Gln 、 Phcなどの大きな残基が高い籾利性を
持つと考えられる。
Table2-3 各種 MCA基質に対する活性
各種 MCA J，~n (1
0l1lM i
nDMSO) 5
μ
lを、0
.
5l1l1
のグリシン緩衝液中で 0
.
0
5ユニットの酔
0
0分間反応させた。 Boc
G
l
n
A
l
a
A
r
g-MCAに対する活性を 1
0
0% とした相対活性
本と 37Cで 1
を示す。
S
u
b
s
t
r
a
t
e
R
c
l
a
t
i
v
ca
c
ti
v
i
t
y
S
u
b
s
t
r
a
t
e
R
e
l
a
t
i
v
ea
c
t
i
v
i
t
y
%
Boc-Gln-Ala-Arg-MCA
1
0
0
%
Ar
g
Ar
g-MCA
Z-
2
Boc
-G
l
n
G
l
y
-Ar
g-MCA
77
Boc-Phc-Scr-Arg-MCA
6
1
Boc-Val-L
巴u
-Lys-MCA
5
B
o
c
L
c
u
G
l
y
-Ar
g-MCA
57
B
o
c
G
l
u
L
y
s
L
y
s
恥1CA
Boc-Gln-Arg-Arg-MCA
45
Suc-Ala-Ala-Pro-Phc-MCA
B
o
c
L
c
u
-Thr
-Ar
g-MCA
30
Suc-Leu-L
e
u-V
a
l-Tyr-MCA
B
o
c
L
c
u
L
y
s
-Ar
g-MCA
2
3
Ala-MCA
Boc-GlyA
r
g
-Ar
g-MCA
6
。
。
。
。
骨
Bz-Arg-MCA
Gly-Pro-MCA
27
法ft 斜]: J~性をより詳細l に検泌するために、ペプチド基12 の切断を調べた結果を Tablc 2
4
n
に示す。基本的には合成 2
J
i と安らない結果であり、切断はすべてArg残基の C端 {
W
Jで起
こっているが、午.
，
'
;
に
生
耳
目 (I'~ な '-1' 性pH においては、 Arg-Argや A rg-Lys といった庖基性アミノ
R
討すの!日l
を切断する傾向が凡られるが、
VlPのLys
Ly
s結合は全く切断を受けなかった。。
P
r
oの結合は切断されず、またAr
g周辺に自主性アミノ酸がある場合(インシュリン
また ArgB鎖の Gl
u
A
r
g
G
l
y、またセクレチンの Arg-Glu) も
、 長時間の反応後も切断を受けなかっ
た
。
またデータには示さなかったが、 iff 白 1~~主1'1:に対する活性は非常に弱く、測定した基質
(ヒストン、卵白リゾチーム、 y-グロプリン、カゼイン及びウシ瓜1
1
宵アルブミン)いずれ
9
) を用いたに
にもほとんど作用しなかった。長時間反応させ非常に高感度な検出方法(1
もかかわらず、活性を検出するのが困難なことから、本酵素が生体内で蛋白質を非特異的
に分解する ïïJfìttl:は低いと批祭される。さらに、}y:~市i で述べた S. cerevisiae の prcp ro-α-factor
も本酵素は切断できなかった。
合成基質 Boc-GI
n
Al
a
Ar
g-MCA及びぺフ。
チド基質 BAM-12Pに対する反応の pH依存性を
1
mによらず至適pHは9.5であったが、よ
F
i
g
u
r
e2
3に示す。合成基質に対しては緩衝液の有
J
包内部の生理的 pHである 5
.
5付近ではほと
り低い pHでも祈性が検出された。しかし分泌小 I
んど活性が凡られなかった。 BAM-12Pの総切断活性に対しても同級の結果が得られた
が
、 Ta
bl
c
2
5に示すように、
pHが下がるほど切断が境基性アミノ駿対の聞に特異的とな
る
。
2
8
Table24
. 各種生理活性ペプチドに対する活性
方法の項で示した通りに、 1.0nmolの各組ペプチドと 0
.
1ユニットの酵素を反応させ、反
1山した。矢印は切断の起
応断片のアミノ般組成を分析することで切断位世及び割合を X
こった位凶を、数 7・は 2.511与川の反応で切断された'，l~llfî を示す。
C
t
a
:c
y
s
t
c
i
ca
c
i
d，
くG
l
u
:p
y
r
o
g
l
u
t
a
m
i
ca
c
i
dを示す。
，
BAM-12P
88 1
2
y
Ty
r
G
1
y
G
1
y
P
h
c
M
c
t
-Arg'Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Glu
i
n^
D刊 0中 h
98
、
Tyr
G
ly
G
l
y
-Phc
ーL
cu-Argl r
g
-I
lc
A
r
g
-P
r
o
L
y
s・Lcu-Lys-Trp-Asp-Asn・Gln
V
I
P
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V
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i
v
el
n
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S
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A
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-八 l
a
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a
l
P
h
e
Thr-Asp-Asn
ー
Tyr-Thr-Arg-Lcu-Arg!Lys-Gln-Mct-Ala-VaトL
y
s
L
y
s
T
y
r
L
c
u
A
s
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S
e
r
I
l
e
L
e
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Asn-N
11
2
N
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u
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I
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80
<Gl
u
L
c
u
T
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G山
α-N
∞endorphin
よ
Tyr山 川 Lcu
P
r
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g
a
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n
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dp
c
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t
i
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c
70
y
s
T
y
r
P
r
o
L
y
s
，
5
1
9
y
Gly-T
叩 M
ct八叩 Phc-Gly-Arg!Arg-Scr-Ala-Glu-Asp-Glu-Gln
S
c
o
r
e
t
i
n
y
y
1
I
i
s
Sc
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A
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p
Gl
y
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P
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G
l
uLc
u
S
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A
r
g
Lc
u八r
g
G
lu-Gl
y
A¥
a-Arg-Lcu-Gln-Arg-Lcu-Lcu-Gln-Gl
y
Lc
u
-V
a
l
N1
U
O
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d
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・
L
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y
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I
s
L
c
u
C
l
a・
P
r
o
-Lys
A
l
a
2
9
120
100
υ︽凶﹀一ト︽﹂凶区
(
ポ )﹀ト一﹀一↑
80
ー
---Gー
ー
ー
ー
.
ー
ー
一
一
一D
一
一
QAR/G
一
一
守
一
一
BAM/P
QAR
庁
汀
BAM
60
40
20
0
5
6
8
9
1
0
1
1
pH
F
i
g
u
r
e2
3
.
ブロテアーセ.
活性の pH依存性
合成
基
l
.
'
S
:BocGln-Al
a
Ar
g-MCA及び、ぺフ。
チ
ド
;
1
;
l
i
質 BAM-12Pに対して、 pHと活性の関係を
'
1
:と緩衝i
伎の組み合わせを記す。
謝べた。以下 にlH
QARIT
:Boc-Gl
n-Al
a-Arg-MCA/0
.1
M トリスー航自主緩衝液
R
l
G
QA
:Boc-Gl
n-Al
a
ArgMCA/0
.1
M グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液
BA
加v
r
BAM-12P/O
.I
M トリス一塩酸緩衝液
BAM/P
:BAM-1
2P/O
.I
M りん酸カリウム緩衝液
3
0
Table2
5
. BAM-12Pの加水分解に対する pHの影響
O.lnmol のl.~質及び 0.0 2ユニットの 酵 素を、方法の項に記したのと同係の条件で l 時間反
応させ、 HPLCによる分析 を行い 、 ピークの溶出位 i
uとアミノ酸分析か ら切断位 I
Uを、
ピーク l
回以から切断率をそれぞれ算定 した
。
A
B
Ty
r-G問 中 山 ルArJArgTval-GM-Pro-Glu
E
x
t
c
n
to
fc
l
c
a
v
a
g
c
pH(
B
u
f
f
c
r
)
A
B
T
o
t
a
l
%
%
%
1
0
.
0(
0.
1M T
r
iト HC
り
53
.
2
2
5
.
3
78.
5
9
.
0(
0
.
1M T
r
is
-HCl)
48.
1
4
6
.
0
9
4
.
1
8
.
0(
0
.
1M T
r
i
s
H
C
l
)
.0
41
4
.
9
45.
9
8
.
0(
0
.
1M KPB)
31
.1
4
.
0
3
5
.
1
7
.
0(
0
.
1M KPB)
1
7
.
7
1
.6
1
9.
3
6
.
0(
0
.
1M KPB)
6.
9
1
.5
8.
4
KPB:p
o
t
a
s
s
i
u
mp
h
o
s
p
h
a
t
cb
u
f
f
c
r
3
1
a
料i
製F
呼ぶを PVDF
I
I
!
:
l
に じなさせ、直接 N末端配手I
J
の決定を試みたが、明確なれl
l
来は得ら
f
t
処理によって 1央から遊離してしまうこ
れなかった。予備的実験より水防素は、通常の洗 1
とが判明しており、回収唱の押しい低下がよ
Lられた。また界而活性i'{JJ
の存在によるノイズ
も日く 、高村 J
J
f
.な角平析は難 しかった ため、以下の配列がかろうじ て得られた
Xaa-Val-
i
手京消化
両
l
析)
，'
' につい てはいくつかの部分配列を決定することができた
XaaGI
y-Gl
u。ープ
(
T
a
b
lc
2
6)。この内 3つはそれぞれ、
トリプシン係セリンプロテアーゼの保存領域 CR3
p) 、CR5、および CR6 (
活性中心Scr) に相当すると考えられる (
24) 。そ
(活性中心 As
こで他の ト
リ プシン様プロテアーゼとの配列比 ;1疫を行っ た (
Tabl
c27) 。
Table26 得 られた部分アミノ 酸配列
大文字は li'M í.L、小文字は米 航 定残 jl~ を示す。 AP: AC
Iοl
I
10bac
f
erP
r
ot
c
a
s
c1
，
DN:
En
d
o
p
c
p
t
i
d
a
s
e
As
p-N。
Pe
a
kNamc
S
e
q
u
e
n
c
c
API
(K)C工P
AP4
(K)LTYRcLnXl
AP5
(K)MrqApL
q t
d
AP7
(K)AIWVT
d q
DN2
DSRGFRY
勾
Homology
DN3
DSGGPLSSVE
CR6(
Ac
t
iv
cs
i
t
cS
c
r
)
7
DN-5，
DRMMCVGYL
CR5
DN9
DqPVEYSpXVrXipl
(C
R7
?
)
DN-II
dIALLXLt
巴As
p)
CR3(
A
c
t
i
v
es
it
32
Tabl
e 27 他の酵素 との相向性の比較
#:
Activcs
i
t
cAs
p，
*:
Act
ives
i
t
eSer.
CR3
戸nc
Enz
CR5
CR6
Rcf
*
者
MATE
DIALLXLT
DRMMCVGYL
DSGGPLSSVE
(
1
7
)
刀1
sm
Tr
Chymotrypsin
D工ML工KLS
D工TLLKLA
SSM工CVGFL
DVMTC且 GAS
DSGGPVVCNG
DSGGPLVCQK
(
2
5
)
(
2
6
)
DIALLKLA
D工ALLELE
DIMLLKLE
D工AMMHLE
TSM工CAGGD
DDMLCAGNT
DSGGPLNCQA
DSGGPLVCKV
(
2
7
)
(
2
8
)
GPLLCAGVA
ENMMCAGYE
DSGGPLLCAG
DSGGPLMCLE
(
2
9
)
(
3
0
)
D工ALLQLK
D工ALLK工R
DNMLCAGDT
TKMLCAADP
DSGGPLVCLN
DSGGPLVCSL
(
3
1)
(
3
2
)
D工ALLKLS
DIALMKLK
D工AVLRLK
DLMLLRLT
D工AL工KLQ
DLMLLHLS
DLKLLQLT
STELCAGHL
WYMFC且 GYK
DSGGPLVCFE
DSGGPFVMKS
(
3
3
)
(
3
4
)
QNMFCAGYD
DFMLCVGHL
QRMVCAGYK
DLMLCAGEM
MNMVCAGSL
DSGGPHVTRF
DSGGPLMCDG
DSGGPLVCKH
DSGGPL工CNG
(
3
5
)
(
3
6
)
(
3
7
)
D工ALVHLS
PKMFCAGYP
E
l
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s
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T
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k
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T
i
s
s
u
ckal
l
ik
r
ci
n
GranzymeA
Hepsin
33
DSGSPLLCEG
DSGGPFVCED
(
3
8
)
(
3
9
)
(
4
0
)
Tablc2-8に示すように、得られた部分アミノ酸配列の一部は両手来の活性中心を含む保存
領域に対応している。したがって、この情報を基に PCRにより断片問中日を試みた。プライ
マーとしては、実際のアミノ般配列に対応したものとして CR5-A/CR-6Aを、また配列は
ねられていないもののトリフシンファミリーに高度に保存されている領域である活性中心
Tabl
e2
9
)。
ヒスチジン出位に対応した CR-2Sを用いた (
Tab
le2
8 部分アミノ酸配列のアライメン卜
1
!
Jられた部分アミノ般配 :
)
'
1
)の内で対応部位が特定できたものについて、ラットトリプシ
ン (25) のアミノ般配列に ;N J，L~ させた。
PC R におけるプライマーの問中日方向は矢印で、また
F
u
r
i
cらの定義による保存飢域CRI
-CR7は下級で、活性中心残基は#で示した。
CR1
Try 1
MATE
CR2
持
r
.
VGGYTCPEH SVPYOVSLNS GTHFCGGST
.T NDOWVVSAAHCYKSRIQVRL
者
CR3
Try 51 GEHNIDVLEG DEQFINAAKI IKHPNYSSWT LNNQIMLIKL SSPVKLNARV
MATE
DIALLXL t
(DN-ll) CR5
CR4
Try 101 APVALPSACA PAGTQCLI三♀』且エ1..S.NGVN NPDLLQrvnA PVT，SOAnrFA
MATE
持 CR6
CR7
Try 151 AYPGEITSSM ICVGFLEGGK DSCOGDSGGP VYCNGQLQGI 平主旦♀正♀♀AlJ:
MATE
くー DRM MCVGYL
<ー DSGGP LSSVE
(DN5，
7
)
(DN3)
Try 201 QNPGVYTKVC NFVGWlQDTI AAN
34
T
a
b
l
e2-9 プライマーおよびプロープ
I
はイノシン、Nは4瓜基のミクスチャーを示す。
CR
2S
5'-AAATQ
♀ム工♀♀TNACNGCNGCNCA(TC)TG-3'
CR
5-A
BamHI
5
・
-AAAAQ
♀工A
CJ
二CNAC(GA)CACATCATNC
(
TG)(GA)TC-3・
29mcr
Kpn1
26mcr
CR6-A
5・
-GCA
_
C
工
♀
.
.
.
C
A
D
.NGGNCCNCCNGA(GA)TCNCC3'
Ps
t1
27mer
P
r
o
b
c
5
・
-A(AG)(AG)TAICCIAC(AG)CACATCAT
lCG(AG)T
C
3
'
26mer
λ
g
t1
0p
r
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a
r
d 5'
-GCTGGGTAGTCCCCACCTTT-3'
r
c
v
c
r
s
e
5
・
cγrATGAGTATTTCTTCCAGGTA-3
'
20mcr
24mer
このプライマーを組み合わせて 、まず RT-PCRにより特異的断片の泊中高を試みた。しか
しブタ小腸およびラット小)揚からは、条件を様々に変化させたが特異的な泊中置は見られな
かった。 一方コントロールとして用いたラット 1
I
干械からは、 CR2-SとCR-6Aの組み合わせ
により特異的な断片が泊中日した。その内二種類について塩基配列を決定したところ、 一つ
はセリンプロテアーゼであるトロンピン 、も う一つはチトクローム Cオキシダーゼポリペ
プチド 1
I
1であり 、いずれも既知の酵素であった(データ省略)。
RT-PCRでは限界があると判断し、方法をプラークハイブリダイゼーシ ョンによる cDNA
ライブラリーのスクリーニングに変更した。使用可能なブタ小 J
J
i
，
JcDNAライブラリーは入
手不可 能だったため、新しく ~lI1~裂を試みた。
2gのブタ小腸料i
股から、
AGPC法により五82mgの全 RNAを抗1
1出、その r
J
;
P.6mgを用い
て
、 Oi
lg
o
(
d
T
)ーCcl
l
u
l口
氏 による精製を二回行い 、3
μgのp
o
ly
(
A
)+悶叫Aを得た。これを用いて
cDNA合成およびEcoRIアダプター付加を行い 、0.13μgのd
scDNAを得た。この操作を 二
回繰り返し、合計 0.25μgのdscDNAを得た。
cDNA50ngずつを 、それぞれ比t
I
O/EcoRIアーム l
同とライゲーション後、 i
nv
i
t
r
oパッ
3
5
ケージングを行った。力仙および平均インサート長を Tabl
c2
1
0に示す。
T
a
b
le2-10 構築した cDNAライブラリー
S
o
u
r
c
c
P
i
gu
p
p
c
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n
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0kb(
A
v
c
.1
.6k
b
)(
c
s
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i
m
a
t
c
dbyPCR)
オリゴヌクレオチドプロープとしては、部分アミノ般配列の中でも最も縮重の少ない、
CR5領域に基づいて合成した (
T
a
b
l
e2
9
) 。なお PCRプライマーと異なりイノシンを導入
している。
上記のライブラリーおよびプロープを用いて 、 1X 1
0
6c
l
o
n
e
sを緩い条件でスクリーニ
ングしたが、￨場性プラークは符られなかった。また別のプロープでは高バックグラウンド
のため解析ができなかった。さらに条件を検討しスクリーニングを行っている 。
なお、作製したライブラリー DNAを$#裂に PCRも行ったが、有意な増幅断片は得られな
かった。
36
2
5 考察
T
a
b
l
c2
-1
に示した i
jJj_り、ブタ小腸粘膜から本酔系を均一に単離するには、十三万倍以上
の精製皮が必~であったことから本静素は非常に微虫にしか存在しないと考えられる。小
)]gには勝臓分泌 l
l
i白1
主であるトリプシンその他の消化防素が多自に含まれているため、膜
蛋白質回分の調製を念入りに行う必}!，!があった。実際合成基質を汀jいたみかけの活性の回
1
*モジネイトから比較するとかなり{尽くなっているが、その大部分は可溶性の
収率は、泊
別の両手本の共 {
fによるものと考えられるので考慮していない。ただし本酵素が膜との親和
性が弱いために解離している可能性も否定できない。これに関しては、将来特異的な抗体
をm
いるなどして解析する必要がある。なお可溶性繭分及び塩化カリウム抽出画分をゲル
ろ過にかけてrrr;一性の現れる分子此を維定したところ 、両者ともみ;併ぷーとは異なり、分子量
Uにピークが現れ(データ省略)、また DE52やアフィニティカラムに対す
I
O
O
k以上の位 I
る吸着は ~J~J かった。界而活性剤による可俗化で酵素活性が二 倍程度に上昇しているが、こ
の理由に￨刻しては許ーしく調べていない。しかしこの見かけの活性化は界面活性剤添加だけ
では起こらず、その後の超述心による不溶性回分の l
徐去が必要であることから、何らかの
阻告・物質の除去によると打t
i
J
!
l
J
できる。今回用いた'*，'
1
製方法について述べると、 i
b
，l(水性クロ
マトでは本酔来は、アミノペプチダーゼ M、ジペプチジルペフ。
チダーゼW を含む主要な膜
蛋白質よりも若干早く浴出することから 、これ らよりやや疎水性は弱いものの、朕結合性
という性質を持つ裏付けになると忠われる。しかしゲルろ過の結果から分かるように、前
洋が糖鎖を持ち分子量 l
O
O
k以上であるのに比べて、本酵素は分子量50kと
記の膜結合隣家 i
小さく、またコンカナパリン A及びヘパリンとの結合も見られなかった(データ省目的。
最終段階では￨むTl_::剤アフィニティクロマトであるべンズアミジンーセフアロースを用いた
J
の籾和1
性は決して高くない( 50%阻害泌度は約 0.5mM) ため
が、この際も防素と阻害i'fi
に、泌紛し体制を減らさないと l
及活しなかった。しかしトリプシン級酔ぷであるという性
1
質と矛盾はなく、作業仮説を 7
r
:
e
yたす酵素が精製できた。
本酔素はゲルろ過および1
，
;辺元状態 SDS-PAGEで分子量 50
k、巡元状態 SDS-PAGEでは
3
2
kと異なる数値を示す。この理由として本酔素が単一のポリペプチドから椛成されてい
ないということが上げられるが、具体的な分子梢成については明らかでない。後述するよ
うにトリプシン綴酔素の多くは辺元状態で分子日約3
0
k弱を示すので、本酵素も 3
2
kのバン
ドが主要な分子であると i
j
t
i
J
l
J
Iされる。その他にバンドが見られないことから非還元状態で
は二量体を形成している可能性がある。その場合には 60k付近にバンドが出るべきである
37
が、ここでは 1
0k程度小さい位辺に現れており 、正機に二母体であるとは言い灘い。ただ
o
還元状態ではみかけの分子量
しウシおよびラットトリプシンを同級に電気泳動すると、;Jl
がそれぞれ 5kおよび 10k程度小さくなったことから(ウシ血 7
1
'
{アルブミンでも同級の現象
が観察された)分子内 SS結合のために非還元状態では泳動度が大きくなっている可能性
がある。同級な *，'i% が、 知IJJ21~ò;î'， I ::tl:T 細胞から発見されたトリプシン綴セリンプロテアー
ゼであるグランザイム A についても報告されている 。 この酔系は J
ド還元状態 SDSPAGE
で
i
l
60k、i
辺元状態 SDSPAGEで 35kを示すが、 cDNAクローニングの結果からホモダイ
分子 i
マーを形成すると椛定されている (
4
1) 。本併系の直伎 N末端分析において、未確定なが
ら単一の配列がねられていることからも、この仮説が舟示される。詳細は c
DNAクローニ
ングによる 一次総 j
i
Eの決定により 明 らかになるであろう。
Tabl
c27に示すように、本 防ぷの精分アミノ般配ダJ
I
を、 トリプシンおよび近縁のセリン
プロテアーゼの配列と比 '
1
唆したところ、非常に日い本n
向性を示しながらも、ザl
らかに 一次
4なる全く新規の蛋白質であることが判明 し た (25-40) 。特にこれまで生化学的
構造の 5
にプロセシングフ。
ロテアーゼ候補であるとされてきた、カリクレインファミリー及びトリ
プターゼファミリーのいずれにも属さないことを記しておく。なおこ こでは代表的な酔素
との比較のみ示したが、データペース検索により既知の蛋白質すべてと相同性比較も行っ
たところ、やはり同 ーの配列を持つ蛋白質は見つからなかった。
さらにこれまでに精製のみが行われたプロテアーゼに対しでも 、生化学的特性に関する
比鮫を行いたい。 l
くc
xi
nFa mil y を除いた Ca2+ ~lõ依存性のArg特異的フ。 ロテアーゼについて
は、これまでに数多くの報告がなされているが、その多くは脳や肝臓から精製されたもの
で、小腸からの報告は少ない。近年ラット小腸から精製された
argi
ni
ncsc
l
e
c
t
ive
e
n
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p
r
o
t
ea
sc (
42、 43
) は、塩により 抽出可能で、また分子量(65k) や至適 pH (
7
.
5) な
ど多くの性質が見なる。その他にも 、詳しい性状が明らかで比較しうるプロテアーゼに関
しては Tab
lc21
1 に一覧表をまとめたが、本院宗はいずれ とも只なる、まったく新しいプ
ロテアーゼであると結論出来る。
3
8
Table2
1
1 これまでに報告された Ca2+非依存的 Arg特異的フ.口テアーゼ
/は切断 l~g位を示す。分子批については、 一 次 fl\\ ì1Jが既知の酵素についてはアミノ酸残
基数を、未J;Jlの M
来については SDS-PAGEの結果を記した。
S
o
u
r
c
c
M，
S
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c
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39
*両手ぷは代ぷ的な蛋白質基質に対しては、変性非変性を問わずほとんど作用しない。-
)
j各車T
I生
.
l
!g
前性ペプチドの I
II
には、
VI
Pなど非常に効率よく切断されるものが存在され
る。従って MATEの生理機能として、このようなペプチドの分解が考えられる。しかしな
がら、これらペプチ ドが生体内でどのように代謝されるのかは不明であり 、 この結果を即
1
1
1VIVO に結びつけることはできない。また小島j
には、同級に生息!活性ペプチドの不活性化
に関与するとされる 酵素として、アミノペプチダーゼ M、ジペプチジルペプチダーゼ W 、
nv
i
t
r
oで燦々な生理活性
エンケファリナーゼなどが多量に存在している。これら酵素は I
ペプチドを切断するととが示されている。速やかな分解が必要とされる場合には、広い特
異性を持ったプロテアーゼが多量に存在する方がイ
T効であり 、微量で高い特異性を持つ
MATEがこの機能を I~lll二、的に担っているとは考えにくい。同綴の理由で 、 食物の消化 ・ 吸
m
収に￨児りする 1
1げ 性も日くないと j
ぷわれる。
近年になり、 kc
xi
nf
a
m
i
lyの一日である PC6が小脇からクローニングされた (
60，
61
)。
本研究ではこの府系の活性は検出できていないが、おそらく分泌小J包などに局在し機能し
5
付近
ているものと抗測される。 一方、本酵系は分泌小胞内の pHで、あると考えられる pH5.
では全く活性を持たないととから、少なくとも小胞内で、作用する酵素ではないと推測でき
る。また kcxi
nf
ami
l
yの代表的基質である S
.
c
e
r
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eのp
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oαーf
ac
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rを本防素は切断でき
ず、ープ'
jPC6はAr
g-Ly
sの塩基対は認識しないと推測される。 このように二者 は生化学的
性質のみならず、生理機能についてもそれぞれ別個の作用を持つと考えられる。
ペプチド基貨の切断結果から 推定される配列特異性、また器官特異性に一致する生理的
基質候補として、生理活性ペプチ ドである コレ シストキニン( CCK) が挙げられる。第
三なにおいて、この可能性を考察する。
{呆イ子領域を利用して RT-PCRにより関連分子をクローニングするという手法は近年主流
となっており、多くの成功例が報告されている。トリプシンファミリーに属する酔素につ
いても、いくつかの級告がなされている。 Wicgandらはヒト J向からトリプシンアイソ
フォーム cDNAを
l
J
1
離し (
64) 、P
rz
ct
a
kらはヒト J
W水 cDNAライブラリーからグランサ.イ
ム3をクローニングした (
65)。これらはいずれも 、 トリプシンファミリーの保存領域で
および S
c
r
付近の配列を基 にしている。本研究においても同級の方法を採
ある活性中心 His
用し、実際ラット肝臓からはファミ リーの一員であるトロン ビン cDNA断片を上自問する こ
とができた。しかしながら 、ブタおよびラット小腸から は特異的断片の胤慨は見られな
40
かった。また通常行われるオリゴヌクレオチドを汀jいた cDNAライブラリーのスクリーニ
ングによっても、陽性クローンを得ることはできなかった。蛋白質レベルでは非常に発現
の少ない分子であるために、吋~A の存在世も J凶?に低いことが予 f，1{ され、通常の方法で
はクローニングは困難であると考えられる。また、本酔索の活性は現在のところ小腸にお
いてしか検 I
.
Uされていないが、 一般にトリプシン様酵素は前駆休として合成されることか
ら、他の組織では発現はしているものの活性化が起こっていないという可能性がある。こ
れを検出するには特異的抗体による解析が必要であることから、今回行わなかったペプチ
ド抗体作製についても試みる必~がある。さらに入手可能な他の組織のライブラリーにつ
いてもスクリーニングを行う予定である。
予備的うた!験 (
f
f
il
J
t
l
l
;
cにおいて述べる)から、ブタ小脇村 1史の細 j削除に、 トリプシン係活
性を示す分 f
ー
が {f{E
している n
J能性がある 。本防ぷとの 5
'
H
i
JはI
j
)J
らかでないが、このよう
に細胞表而に発呪する分子の場合、培養細胞を刑いた発現クローニングの手法が適用可能
，.j;:分子のクローニングにおいては大きな成功を収めている。受容体の場
であり、各租}受容 f
合はリガンド結合(および細胞内の変イじ)を検山するが、 l
股結合性プロテアーゼの場合は
特異的インヒピターの結合を検出すればよく、ラベル可能な特異的インヒビターが存在す
れば、この手法により未知の細胞J1英結合性プロテアーゼを同定できる可能性がある。第四
章において予fJi
J
i
的に、本手法の適用の可能性について考察を行った。
41
章
三
第
小腸膜結合性新規プロテアーゼの
生理機能に関する考察
ーコレシストキニンプロセシング酵素の
可能性についてー
42
3
1 序
第二本で述べたとおり、我々はブタ小脇市，I
i
l
l
失より新規1
英結合性プロテアーゼ MATEを同
定、完全車I'í~することに成功した。合成主主 J':U立びペプチド基貨を用いた解析より、本書手素
はJ
記基性アミノ般対に高いヰ，
'f)なド1:を示し、その C端
{
J
!
J
Iではなく間を切断することが示唆さ
れた 。 特に生互g 的な p H で特 5'~ 性が高くなることから、生体外l でもおそらくこれに類似し
た特異性を持つことが予想される。また Ca2+による選択的沈殿実験より、 MATEは小j
泡体
苦むトランスゴルジ、あるいは
やシスゴルジ、分泌願粒といった画分ではなく 、問主性紡に i
史に存在することが予怨される。
刷子縁1
ここで 当初の作業仮説に立ち返ってみたい 。本研究より明らかになった MATEの配列特
Y
L性を、小)財で発射しているペフチド r
i
j駆体配列と比較してみたところ、コレシストキニ
ン (CCK) という生理活性ペプチドのプロセシング部位によく合致していた。
CCKは脳
及び小腸で比較的多量に発現しているペプチドである。小腸における CCKの役割は良く
知られており、
革酔素の分 1
必促進、 I
腸管儒動、
J
における機能は不明だが、
旦護収縮などの消化促進的作用を持つ。脳
J
以内投与により実験動物の摂食を抑制することから、小腸と同
J
様に消化吸収を司る可能性がある。
CCKは目前と小腸で同ーの前駆体が発現するが、異なるプロセシングを受けることが知
6
6
)(
Fi
g
.
3
1)
られている (
0
CCK58/CCK39/CCK8は単一ArgのC端側における切断によ
g-Lysの問で切断を受けたものである。初
り生じる。 一方 CCK33は、組基性アミノ酸対Ar
期の研究より、
当では CCK8が、小腸では CCK33が主要な分子種とされた (
6
7
)。その中で
J
も小腸の主要分子種である CCK33のプロセシング部位は、合成基質およびペプチド基質
c
x
i
nf
a
m
i
l
yを含めた既知のプ
から推測される MATEの配列特泉佐と良く合致する 一方で、k
ロセシングプロテアーゼの特良性では説明できない。また合成t;l;~による結果から縦波IJ す
る限り、 CCK58/CCK39 の q
i- Arg 部位も MATEにより切断される可能性がある。 一方
CCK8プロセシング部位は、 l
j
i-Argが自主性アミノ酸に固まれている。この部位を特異的
に認識するプロテアーゼはJ1ì~から紡製されている (68) が、同報告中で本活性は小腸粘膜に
は{
.
n'.Iしないことが述べられている。この配列は MATEによってはおそらく切断されな
い
。
C
C
K
f
i
i
j駆体にはこれ以外にも被数の Arg/Lys残基が存在しているが、切断は特定の Ar
g
残基に特異的である。したがって CCKプロセシングを担う酵素は、高い基質特異性を持
43
つ (Ar g~，lf 5
.
'
:
?的)プロテアーゼであると般測されるが、 MATEはこの条{'!:を満たしてい
る
。
これまでにも脳および小腸における CC
Kプロセシングの報告はなされているが、いず
，
i
伎に対する抗体反応に基づいたものであり 、抽出効率の差や非特異的分角平に関
れも羽H1111
1
する考慮が不 1
分であると々えられる。正確なプロセシングメカニズムの解析や関勺する
プロテアーゼの liÎJ í.iごを行うためには 、 純粋な ~n を用いることが必袋であるが、 そのよう
な研究はまだ、成されていない。
本~では、 MATE と C CK プロセシングの関連を主に基貨の立場から解析する。まずiÌÍT 半
では、小)J易の主~分子高Eであり、 MATE の基質特yt性に最も良く合致する 、 CCK33 のプロ
セシング部位に相当する合成ペプチドを
mいて、
MATEが実際にこの部位を切断できる こ
と、及びその速度定数を示す。また CCK前駆体 l
人J
r
:
1
1
には複数の Ar
g残基が存在するが、そ
l
l
位のみが切 l
析を受けるということは、周辺部位のみならず]II
l
駆体全体の構
の内限られた n
造なども重要な;
;
診響を与えていると考 え られる。そこで後半では、
J
I
易からクローニングしたi
X
RT-PCRによりブタ小
K前版本を、大 ω
l 伝i
発現系を用いて生成する試みを報告す
る
。 CC
Kが生物活性を持つためには、 C末端のアミド化が必須であるが、この反応は大腸
菌では再現できない。しかし過去の研究より、プロセシングを受けていながらも C末端が
アミ ド化 されず Glyのままの型が、実際にはかなりの量(約半分程度)存在しているとさ
れる (
6
9
)。そ こで末端のアミド化はプロテアーセ・活性には影響を与えないと推測した。
T
y
rの硫酸化について も同級である こと から 、こ こではC末端 Gly型の大量発現を試みた。
発現方法としては、T7プロモーターを用いて単独で発現させる方法、およびマルト ー
ス結合蛋白質 MBPとの融合蛋白質と して発現させる方法の二種類を行った。
4
4
preproCCK
醸盤罷霊童
↓
匿~
Signal Pep山
…
proCCK
↓
CCK94
↓
e
医
2
2
l
Tyr Sulfotransf
…
Dibasic Prot
Y~
e(Kexin?)
CCK85
FGRR
↓
Ca山
ypeptidase
YiFG
CCK83
↓
Pep仙
α-amida川
Enzyme
Y
CCK82
CCK58
↓????
-Leu-Ala-Arg IAla-Vaト
CCK39
・
CCK33
-Gln-Ala-Arg ILys-Ala-
Y
Y
句
￨
-Ser-Asp-Arg IAsp-Tyr(S03H)ー
rCCK84
fM
F-amide
Y
寸 F-amide
亡コ下山 de
FG
TPR
I
EF一
一
﹁
食
日
V
﹄
ι
h
r
-
J
{
M
一
一
一
日
時一
一
組崎今
phpu
白河“。。
kk
RMRM
c
e
nrDE
MM
医週
Figure3
1 CCKプロセシングのモデル
Ebc
r
lci
nらによる図を改変した (
6
6
)。 削
F-a昨日 de
コ
LeuAla-Arg ITyr-l
Ie
-
CCK8
F-amide
f
o
r
r
nylMct
45
3
2 試薬と材料
基本的な試薬は、第二主主に準ずる。
発現ベクター pAR21
1
3は、東北大学理学部の藤井義 l
凋先生より御供与頂いた。
P
r
o
t
c
i
nf
u
s
i
o
nandp
u
r
if
i
c
a
t
i
o
ns
y
s
t
c
mはNcwEnglandBl
o
l
a
b
s社より腕入した。
CCK部分ペプチドは B
i
o
S戸 t
h
c
s
i
sI
n
c
.
(
T
X
)により合成された。
大腸菌
M V1
1
9
0
d
.
(
I
a
c
p
r
oAB)，d
.(
s
r
l
-r
e
cA)3
0
6
:
:Tn1
O，
s
u
pE，
t
hト ，[
Fソ
acI
q，
l
acZd
.M 1
5Pr
o
AB，
traD36]
プラスミド調製など一般的用途
BL21(
DE3)
hsdSg
a
l入
(c
l
t
s857i
n
d
lSam7n
i
n5l
a
cUV5-T7gcne1
)
組み換え蛋白1:[発現用
ベクタ一
Ml3mpl9
DNAシークエンス用サブクローニング
p
AR211
3
T7フロモータ一周発現ベクター
pMAL-p
ルf
f
i
P
融合蛋白質 I
月発現ベクター(ペリプラズム)
ルf
f
i
P
融合蛋白質用発現ベクター(細胞内)
pMAL
c
R
I
46
3
3 方法
CCK部分ペ プチドの切断
酵素反応および、HPLC によるペプチド断片の分離は、第二誌に準じた。また、基~泌度
を変化させて、速度定数を測定した。比較として、本務素により効率よく切断される合成
基質 (Boc-Gl
n
A
l
aArg-MCA/Boc-Gl
n
-Arg-Arg-MCA) およびペプチド基質 (BAM-12P/
i
nA 1
-1
3
) を用いた。
Dyno中 h
RT
PCRによ るブタpreproCCKのcDNAク口一ニング
ブタ小脇からの cDNA の合成は、第二平に当!\ずる。これを ~Jf 型として、既知の配列( 70
)をもとに CCK-NおよびCCK-Cプライマー (
T
a
b
l
c3
1
) を川い、以下の条件で'PCRを行っ
た
。
9
4
"
<
:
1min
6
5
"
<
:
1min
n
O
c
1mi
n
3
0
c
y
c
l
e
s
地中高した約 400bpの断片を t
l
l，山し、 XhoI
およびBc
II
で切断後、 M13mp1
9のSaLIおよび
Bam田部位にサブクローニングし、塩基配列を確認した (
T
a
bl
c
3
2
)。
47
Table3
1 プライマー
CCK-N
ーT
AT[.
工♀♀A.QGCCATGAACGGCGGCTTG-3'
5
'
27mcr
Xho!
CCK-C
5'-CGC工
.
G
A
工
.
C
AGGGCGGGGTCTTCTA-3'
24mcr
B
c
l!
CCKXP-N2
5
'GGCACC.
c
A
工
ム
工Q CAACCAGTACCTCCTGCG-3' 30mcr
CCKXP-C
5'
ACT工
Gム
エ
♀AGCCAAAATCCATCCAG-3'
Nde!
25mer
B
c
l!
CCK
ルlAしN2 5'-ACC.
G
A
ム
工
工
.
cCAGCCGGTGCCTCCT-3'
Ec
oRl
4
8
24mer
Tab
le3
2 RT-PCRによりク口一二ングした preproCCK
Pro25における l
瓜基変異が認めら れ
た にCC
>CCT)。
♀Z♀
♀MGCC
SalI
+
Xhor
ATG AAC GGC GGC TTG TGC CTG TGT GTG CTG ATG GCG GTC CTG GCG
1 MET 且sn G1v G1v Lf"口 Cvs Lf"l1 Cvs V
e
l
l T.f"11 阿f"t Alel V
e
l
l T.ρ11 Alel
(C)
S工gna1 peptide
GCA GGC ACC CTG GCG CAG CCG GTG CCT CCT GCG GAC TCC GCG GTC
T
'hγLeu A1a/G1n Pro Va1 Pro Pro A1a ASp Ser A1a Va1
16 A1河 口 1v '
CCC GGG GCA CAG GAG GAG GAG GCG CAC CGG CGG CAG CTG AGG GCG
31 Pro G1y A1a G1n G1u G1u G1u A1a His Arg Arg G1n Leu Arg/A1a
ー >CCK58
GTG CAA AAG GTA GAC GGC GAG TCC CGA GCG CAC CTG GGC GCG CTG
46 Va1 G1n Lys Va1 Asp G1y G1u Ser Arg A1a Hエs Leu G1y A1a Leu
CTG GCC AGA TAC ATC CAG CAG GCT CGA AAA GCA CCT TCT GGC CGA
61 Leu A1a Arg/Tyr I1e G1n G1n A1a Arg/Lys A1a Pro Se工 G1y Arg
ー >CCK39
->CCK33
GTA TCT ATG ATT AAG AAT CTG CAG AGC CTG GAC CCC AGC CAC AGA
76 Va1 Ser Met I1e Lys Asn Leu G1n Ser Leu Asp Pro Ser His Arg
ATA AGT GAC CGG GAC TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTT GGC CGG CGC
γ 口 且 γ口
91 I1e Ser Asp Arg/Asp Tyr Met G1y Trp Met Asp Phe G1v A
>CCK8
dibasic & amidation
l06AGT GCA GAG GAG TAT GAA TAT ACC TCC TAG AAGACCCCGCCCT
♀主主♀主
Bam1丑 +B
c
l[
Ser A1a G1u G1u Tyr G1u Tyr Thr Ser stop
4
9
CCK前駆体発現ベクタ -pAR-rCCK84の矯築
MI3mpl9にクローニングした p
r
cproCCK (M1
3
prcproCCK) を鋳型として、 CCKXP-N2
およびCCKXP-Cプライマー (Tabl
c31) を川い、以下の条例二で PCRを行った。
0
94C
1min
C
5
5"
1min
n
O
c
1min
3
0
c
y
cl
cs
増幅したがDOObpの断片を f
l
l
ll
J
:
l
し
、 Nde!
およびBcll
で切断後、 pAR211
3のNdelおよび
BamH
l
部位に組み込んだ (pARrCCK8
4，F
i
g.
32
) 。得られたトランスフォーマントにつ
いては、 Xba1
および、Hind1
1
1で切り /
Uした断片を MI3mpl9にサブクローニング後、底基配
c33
) 。なお pAR-rCCK95の梢築も試みたが、 トランスフォーマント
列を確認した (Tabl
は得られなかった。
rCCK84の発現
pAR-rCCK84および、pAR21
1
3が導入された BL21 (DE3) を
、 NZCYM培地で終夜地養し
μ
lを NZCYM+0.
1mg
!ml アンピシリン培地 5mlに加
た。それぞれについて、培養液 50
0
え
、 37Cで 2時間培養後、 1m MIPTGを加え、 l
時間ごとに菌体を破砕、SDS-PAGEによ
り蛋白質の発現を調べた。
50
T
a
b
l
e
3
3 rCCK84
PrcproCCKに対し、 S
i
g
n
a
lp
c
p
t
i
d
cをすべて取り除き 、N末端3残基のアミノ酸についてコ
ドン三文字目を Gから Aに変吏することで、合成品のよ
即U
Dを言￨った (
71
) (下線)。
A
A
C
A C
C=G
C=G
G T
A-T
G=C
G=C
pppG=CI
♀
ヱA♀
込AATAATTTTGTTTAACTTTAAG
主
主
♀
♀
主
♀
l
!
J
，TATA.
♀主主主主♀
SO
XOaI
Met 1
NdeI
CAA CCA GT
，
J
!
l CCT CCT GCG GAC TCC GCG GTC CCC GGG GCA CAG GAG
2 Gln Pro Val Pro Pro Ala Asp Ser Ala Val Pro Gly Ala Gln Glu
GAG GAG GCG CAC CGG CGG CAG CTG AGG GCG GTG CAA AAG GTA GAC
17 Glu Glu Ala His Arg Arg Gln Leu Arg/Ala Val Gln Lys Val Asp
GGC GAG TCC CGA GCG CAC CTG GGC GCG CTG CTG GCC AGA TAC ATC
32 Gly Glu Ser Arg Ala His Leu Gly Ala Leu Leu Ala Arg Tyr Ile
CAG CAG GCT CGA AAA GCA CCT TCT GGC CGA GTA TCT ATG ATT AAG
47 Gln Gln Ala Arg/Lys Ala Pro Ser Gly Arg Val Ser Met Ile Lys
AAT CTG CAG AGC CTG GAC CCC AGC CAC AGA ATA AGT GAC CGG GAC
62 Asn Leu Gln Ser Leu Asp Pro Ser His Arg Ile Ser Asp Arg Asp
TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTT GGC T♀ムエ♀♀ACAGACGGGTGTGGT.
7
7 Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe Gly Stop
BamHI+B
c
l1
51
Hi
nd
II
I
EcoRV
中
;
Xba1
Bglll
NoNde1
Hind
l
l
I
/
EcoRV
T中
NoNdeI
F
i
g
u
r
e3
2 発現ベクタ pAR
・
rCCK84
NoBamHI
MBP-CCK前駆体融合蛋白質発現ベクターの構築
MI3mpl9にクローニングした prcproCCK (MI3-preproCCK) を鈎型として、
CCKMAL-N2に以下のプライマーを組み合わせ、でPCRを行った。
CCKMAL-N2+CCK-C>
MBP-CCK94
CCKMAL-N2+CCKXP-Cー 〉
恥侶 P-CCK
8
3
温度条件は以下の通りである。
9
4C
0
Imin
5
0C
0
Imin
C
72"
Imin
3
0
c
y
c
l
e
s
指帽したがJ300bpの断片を f
l
ll
l
l
¥
し
、 EcoRI
および、BclI
で切断後、 MI3mp18の EcoRIおよび
BamH1l制立に組み込んだ。取t.!;~l] ~IJ を確認後 、 Eιo則 および、Hind I
I
1 (マルチクローニン
グサイト由来)で切り出し、 pMALpおよび、pMALc
R
IのEc
oRIおよび、HindI
I
Iに組み込み、
以下の 4種郊の発現ベクターを梢築した。
(
T
ab
l
c3
4
) 。なお pMALpはシグナルペプチド
を持っており融合蛋白質はペリプラズムに蓄積するが、
1
合蛋白質は創1胞内に蓄積する。
欠いており、民I
pMALpCCK94
2
.
P
恥1ALp
-CCK83
3
.
pMALcRI-CCK94
4
.
pMALcRICCK83
5
3
pMAL
c
RIはシグナルペフ。
チドを
Table34 pMALpIpMALcRIー CCK94/83
ベクターの積類、およ びCCKの長さにより、合計4積類の発現ベクターを椛築した。
pMALp
malE...
GTA CCC GGC CGG GGA TCC ATC GAG GGT AGG CCT ♀Aム
エZ♀
Ile Glu Gly Arg/Pro Glu Phe
E
c
oR1
p骨IALcRI
malE・
・
ー CCG TCC TCT CTC GTG ATC GAG GGA AGG ATT TCA ♀M._エヱ♀
Ile Glu Gly Arg/Ile Se工 Glu Phe
E
c
oR
1
CAG CCG GTG CCT CCT GCG GAC TCC GCG GTC CCC GGG GCA CAG GAG
1 Gln Pro Val Pro pro Ala Asp Ser Ala Val Pro Gly Ala G1n Glu
GAG GAG GCG CAC CGG CGG CAG CTG AGG GCG GTG CAA AAG GTA GAC
16 Glu Glu Ala His Arg Arg Gln Leu Arg/Ala Val Gln Lys Val Asp
GGC GAG TCC CGA GCG CAC CTG GGC GCG CTG CTG GCC AGA TAC ATC
31 Gly Glu Ser Arg Ala His Leu Gly Ala Leu Leu Ala Arg Tyr Ile
CAG CAG GCT CGA AAA GCA CCT TCT GGC CGA GTA TCT ATG ATT AAG
46 Gln Gln Ala Arg/Lys Ala Pro Ser Gly Arg Val Ser Met Ile Lys
AAT CTG CAG AGC CTG GAC CCC AGC CAC AGA ATA AGT GAC CGG GAC
61 Asn Leu Gln Ser Leu Asp Pro Ser His Arg Ile Ser Asp Arg Asp
CCK83
TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTT GGC I♀ムエ♀♀TCTAGAGTCGAC..・
76 Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe Gly Stop
Bam~包 + Bc/1
CCK94
TAC ATG GGC TGG ATG GAT TTT GGC CGG CGC AGT GCA GAG GAG TAT
76 Tyr Met Gly Trp Met Asp Phe ~lv Ar口 Ar口 Ser Ala Glu Glu Tyr
GAA TAT ACC TCC TAG AAGACCCCGCCCT
♀A工
♀♀TCTAGAGTCGAC.
91 Glu Tyr Thr Ser stop
BamHI+Bcl1
54
rrnB
t
e口nmator
と
て
F
a
c
t
o
rXas
i
t
e(
I
E
G
R
J
P
E)
rrnB
tenmnator
P
t
a
c
F
i
g
u
r
e3
3 発現ベクタ pMA
しp
R
I/
p
M
A
L
屯
5
5
pMALcRI-CCK83/CCK94の少量発現
cwEnglandB
i
o
l
a
b社のプロトコルに従い、以下のように行った。
pMALc則ー CCK94および‘pMALc則一 CCK83が導入された大腸菌 MVI190の終夜.ta養液 O.
4ml
をLB+Ampl
:
'
i
l
也40mlに加 え37Cで培養を開始し、 A600が0.4になった時点で 0.5mMTPTGを
0
加えた。さらに 2時間信益した後、 3，
000X g，
3minの遠心によ って歯体を回収し 、L
y
s
i
s
B
u
f
f
c
r(IOmMNa-PhosphatcB
u
f
f
c
rpH7.0，
30mMNaCI，
0.
25%Twccn20，10mMEDTA，10mM
EGTA)5
1
1
1
1に懸濁した。液体笠ぷにより急速凍結した後、氷水によって解凍し、超音波に
創作した。 3，
000Xg，
3minの遠心によって可溶性画分と不溶性画分を分自l
fし
よって菌体を 1
u
f
f
c
r(
1OmMNa-Phosphatcb
u
f
f
e
rpH7.0，
0.5MNaCI)
た。可溶性四分 50μlに対し、 Columnb
で平衡化したアミロースレジン 5
0
μl
を加え、氷 1
((
で 10min懸濁した 。遠心により上前を除
き、Columnb
u
f
f
c
rI
m
lで洗
r
，
した後、
SDS-PAGEb
u
f
f
e
rを加え 95"(に加熱することで吸着
皮
肉
，l
fさせた。各回i
分を SDS-PAGEにより展開した (Pi
g
.
3
4
)。
蛋白質を i
pMALp-CCK83/CCK94の少量発現
cwEnglandB
i
o
l
a
b社のプロトコルに従い、以下のように行った。
pMALcR
l-CCK94および、pMALcRI-CCK83が導入された大腸菌 MVI190の終夜培養液 0.4ml
0
をLB+Amp培地40mlに加 え37Cで培養を開始し、 A600が0.4になった時点で O.
3m MTPTGを
加えた。さらに 2時間培養した後、 3，
000X g，
3minの遠心によって菌体を回収し、 30l
1
1M
T
r
i
s
H
C
IpH8.0，
20%s
u
c
r
o
s
e，1
m MEDTA1
0
1
1
1
1に懸濁した。室温で 10mi
n撹枠した後、再び
3
，
000Xg，
3minの遠心によって菌体を回収した。これに氷冷した 5mMMgS04 10mlを加
え、氷巾で 1
0minì党J4~した。 3 ，000 Xg，
3minの遠心によって浸透圧ショック回分と菌体画
fした。浸透圧ショック四分に対し、上と同級にアミロースレジンを用いた精製を
分を分自l
P
i
g.
35) 。
行い、 SDS-PAGEにより展開した (
56
3
4 結果
CCK33を生成するプロセシング部位に相当するペプチド Ty
r
-l
l
c
G
l
nG
ln-Al
a
Arg
Ly
s
A
l
a
-
、 MATEによって効率よく切断された (
T
a
b
l
e
3
4
)
o KMは4.8μMであり、他の合成
P
r
o
S
c
rは
n
品質やペプチドlJi よりも高い %
3!
f
1性を示 した。 一方醇ぷの反応効率を表す k
KMは各
c
a'I
n
:
r
j
:で大きな差はなく、比較的大きな他を示した。
基
T
a
b
le34 MATEによる CCK部分ペプチドの切断
10mMTris-HCI(
p
H
8
.
0
) ImMEDTA緩衝液中でペプチドと酵素 0.5ユニットを 1
1
1
寺問反応
させ、
トリフルオロ酢酸を終濃度 0
.1% になるように加え反応を停止させた。
280nmにお
ロットにより速度定数を
ける HPLCのピーク而秘より切断率を計算し、 Lineweaver-Burkフ。
鉱山した。合成基質については第こなの方法に準じた。なお酵素濃度については、分子量
を32K、また Tab
l
c2
-1
より 50μg=1
.
6nmol= 1
0，
000ユニット、すなわち 0.
08pmol=0
.
5ユ
ニットと仮定し求めた。
Pc
p
t
i
d
e
Scquence
KM(μM) kc
s
I
) k
M
1
s
l
)
a'(
c
a'IKM(
3
.
4
7
.
1X 1
05
CCK33p
c
p
t
i
d
e
YlQQARKAPS
ト1
3
)
D
y
n
o
r
p
h
i
nA (
YGGFLRRlAPKLK
43
25
5.
8X 1
05
BAM-12P
YGGF恥1RRVGRPE
50
22
4AX1
05
Boc-QAR-MCA
27
28
1
.0X 1
0
6
Boc-QRR-MCA
27
1
8
6.
5X 1
0
5
4.8
57
RT-PCRr.
去を
mいて、ブタプレプロ CCKをクローニングすることに成功した。
6クロー
c32) 。この配列を G
u
b
l
e
rらの結果と
ンについてすべて同一の瓜必配列が得られた (Tabl
比較すると、 Pro25において、 CCCから CC
Tへの瓜基置換があったが、複数のクローンに
ついて同 ーの配列が得られたことから 、 PCRにおける変異ではなく種間差であると解釈
し、これを $
)
i型として
mみ換え体 rCCK84を作製した
(
T
a
bl
c
3
3
) 。なお大腸 l
泊における発
現の効率化のため 、Loomanらの結果に基づき、 N末端3アミノ酸についてコドンの三文字
口を Gから Aに世換し、 Fi
g
.
3
2に示す発現ベクターを精築した。しかし現在のところ、誘
導など級々な条件を検討したが、 rCCK84の発現は検出できていない。
一方マルトース結合蛋白質 MBPとの融合 蛋 白 質 に つ い て は 、 細 胞 内 発 現 ベ ク タ pMALc
則では他かな発到しか凡られず、アミロースレジンにも吸必ーしなかった( F
i
g
.
34
)
。 一方ぺリプラズム分泌ベクター pMALpで
ミ
は
、 CCK83/CCK94ともに十分な発現蛋白質
がねられ、 i
.
:
1透圧ショック函分に効率よく回収されたが、アミロースレジンへの l
没者率は
高くなかった (
F
i
g
.
3・5
) 。しかしこの融合蛋白質は 2本のバンドに分離しており、その分
、 46Kおよび48Kであった。なお /
o
nおよび‘ompTプロ
子量は CCK83/CCK94ともに同一で
テアーゼ欠損株である BL21(
DE3)においても同級の結果が得られた。
また pMALpにより発現した融合蛋白質は、 トリプシン、キモトリプシン、 F
a
c
t
o
rXaおよ
びMATEのいずれによっても切断を受けなかったため 、プロ テアーゼによる分解を受けに
くい椛造をとっていることが予想された。現在塩酸グアニジンを用いて融合蛋白質を変性
させる条件検討を行っている。
58
F
i
g
u
r
e34 pMALcRトCCK83/CCK94の発現
L
a
n
c
s
l，
8
: -IPTG
1-4
:pMALcRI-CCK83
2，
7
: +IPTG
5-8
:pMALcRI-CCK94
3，
6
: 可溶性匝i
分
4，
5 アミロースレジン吸着回分
M:分子 i
i
Jマーカー
9
:pMALcRI/アミロースレジン吸着画分(肘l
l
i
P
s
G
a
l
α
)
5
9
34M5 6
67k
4Sk
3
1厄
地
F
i
g
u
r
e3-5 pMALp-CCK83/CCK94の発現
L
a
n
e
s1
，
8
: -IPTG
1-4
:pMALp-CCK83
2，
7: +I
PTG
5-8:
pMALp-CCK94
3，
6
: 浸透圧ショック四分
4，
5・アミロースレジン吸着回分
M 分子品マーカー
9:pMALp/アミロースレジン吸着函分 (
MBP-s-Gal-α)
6
0
3
5 考察
木研究のれりI!:より、 MATEはCCK33のプロセシング部伎に高い籾和性を示し、かっ効率
よく切断することから 、 CCKプロセシングプロテアーゼとして機能する可能性が示唆さ
れた。また、生体内においてこの反応は 、d
i
b
as
i
cs
i
g
n
a
lの切断およびC末端のアミド化と
いった、ゴ、ルジ以前に起こる修釘i
l
に引き続いて起こることが報告されているが、本酵素が
トランスゴルジもしくは刷子縁Il失に局在するという結果と矛盾しない。なお本研究では行
1
1
:すれば、 CCK58/CCK39 のプロセシング部位
わなかったが、合成基貨の結果より類 1
I
T
駆体の中には生理的には切
も、単一Argながら切断される可能性がある。 一方で、 CCKi
断されない瓜必性アミノ般対も存 u
:することから 、切断部位周辺のみならず全体的な椛造
も重要な凶子であると推測される。
CCKのプロセシングに関する研究はこれまでに多数なされている。初期の研究では、
脳および小腸において具なるプロセシングを受けるとされていた。
(
6
7
) これによれば最
小の CCKで、ある CCK8は、lIi過においては CCK58から直接生成するのに対し、小腸において
はまずCCK3
3を経由するとされる。近年 Re
c
veJ
r らは、小腸においても CC
K8はCC
K5
8か
7
2
)、その他にも様々なグループが報告をしているが、結果に
ら生成すると報告しており (
ついては一致を凡ていない。これらはいずれも部位特異的抗体を mいた検出系を用いてい
ることから、抗原部位を保持しているペプチドしか検出できず、
CC
K前駆体の動向を正
確に反映しているとは言いがたい。組織からの刷出効率もフォームにより異なることが指
摘されており 、また特に消化静素の豊富に存在する小腸においては、組織破砕時における
非特異的な分解の影響も無仰できない と考えられる。
このような点について詳細に検討を加えるには、純化 した基Js:を用いて生化学的に解析
することが必~であるが、これまでそのような試みはほとんどなされていなかった。そと
で本研究では、 l
i
i
j駆体を大 I
J
M幽の系を川いて発現する試みを行った。しかし細胞内発現の
系では、単独および融合蛋白質とも卜分な発現 i
立が得られなかった。対象として用いた
MBP-s-Galαは大 i
l1に発現しかっアミロースレジンに効率よく吸着した ことから、 CCK前
駆体部分がK~II JJ包内で安定に存任できないという可能性が考えられる。一方ぺリプラズム分
泌系では融合蛋白質そのものは効率よく発現 ・分泌されたが、分子量が 46kおよび、48kと、
予想される数字 (52k/恥1BP
-CCK8
3，
53k/MBP-CC
K94)よりも小さくなっていた。 CCK8
3
およびCCK94ともに向じ分子 i
訟を示 した ことから 、以下の可能性が考えられる。
6
1
mーに、
CCKliij駆体の一部が分泌されるまでの間に特異的に切断されている可能性が
考えられるが、その部位は今のところ同定できていない。また細胞内では大量に発現した
MBPs-Gal
α は、逆に分泌系ではほとんど発現が見られなかったことから、細胞内におい
てMBP-ccKiiir駆体が発現しなかったのは、分泌蛋白質であるためだと推測される。
1
)能性として、コドン頻度の I
'
，
J
泌が准げら れる。今回川いた CCKIIIj駆体に
また第二の 1
mいられているが、これらは大腸菌内で'tRNAが
おいては、 Argコドンに - mIAGG/AGAが
非常に少なく、その結果翻訳が停止する可能性がある。仮に CCK58プロセシング部位(
AGG) あるいは CCK39プロセシング部位 (AGA) において倒訳が停止すると、融合蛋白
質の分子品はそれぞれ 45kおよび、47Kとなって、観察されるバンドに近い数字となる。実
際にこのようなことが起こるかどうかは不明だが、シグナルペプチドを持つ pMALpにお
いては 、翻訳停止 ql に強 njIJ(I'~に分 1必される可能性が否定できない。もしこれ が原因であれ
ば、 l~11伶特 )'W~ 変 JI~ によりコドンを置き換えることで解決できょう。
またこれまでのところ発現蛋白質はプロテアーゼ耐性になっており、現段階では CCK
前駆休部分を切り放すことには成功していない。このように現在の系では完全長の前駆体
を大腸菌から得ることはできないため、更なる検討を行っている。
前E巨体の発現実験に際しては、 [
3
5
S]Metを用いた invitro翻訳系もよく用いられるが、こ
の系ではアミノ般配安I
J
分析に足る:[i];の基質が符られない。Azaryanらは本研究と同様の手
I
I
i耳
巨体 POMCの大腸菌における発現を行い、プロセシングプロテ
法で、生l!l)活性ペプチド I
アーゼによる作用を解析している (
5
8
)。
Roseらは、ラット大脳皮質において CCK8を分解するセリンプロテアーゼの性質を解析
している (
7
3
)。この酵系は阻害i'fI
J
効果よりエラスターゼ様特異性を持っていると批測され
る。また Vicrcckらはラット I
H
近シナプトソームより、 CCK33から CCK8を生成する E
手素を精
製した (68)。本 N
手索は分子 ii190kのセリンプロテアーゼであり 、 CCK内の Ar
gを切断する
が
、 トリプシンやカリクレイン川の合成基1'!は切断しない。また論文中で、木活性は小腸
ミe
cvcJ
rらの結果と兵なっている。またこの醇素は
にはず子任しないとされており、前述の I
MATEとも性質を具にしている 。Koningsらは CCK発現培養細胞において k
e
x
i
nf
a
m
i
l
yおよ
びエンケファリナーゼの存住を同定、それぞれCCKのd
i
b
a
s
i
cs
i
g
n
a
lプロセシングおよび分
解に関与する静素と推測している (74)。またこれ以外にも CCKの分解についてはいくつか
の報告があるが、一般に基質として入手可能なフォームは CCK8とCCK33のみであること
6
2
から、 F
i
g.
31 に示したような多級なフォームを産山する単一Argフ。
ロセシングプロテアー
ゼの生化学的研究はこれまで皆無といってよく、本研究は高い意義を持つと考えられる。
i
i
j駆体を mい統一的な研究を行うことで、 I
J
単ー小腸問のプロセシングの異同に
また同ーの l
関する新たな知比が得られると予想される。
6
3
第四章
総合的考察および展望
6
4
これまでに述べてきたように、木研究では、ブタ小腸粘膜ミクロソーム画分より新規の
u
1
央結合性プロテアーゼを同定 、シヒ全*，弛 を行った。その生化学的特性について解析を行う
とともに、 cDNAクローニングを試みた。また生理的機能に￨刻する 一身祭として、生理活
性ペプチドであるコレシストキニンの小脇特異的フ。
ロセシングに関与する可能性を示し
た。本市ではさらに、予備的なデータを加えた総合的な考察を行う。
完全精製した酵素は第二 f~ に述べたような特性を示したが、この結果を細胞レベルで検
m
証するのは凶難であった。 Ca2+を いた選択的沈殿法の結果から、本酵素はミクロソーム
画分の中でも小胞休などではなく、酸性糖に笥んだトランスゴルジ、または細胞表面であ
る刷子縁版画分に存在すると予位!される。後者の仮説が正しければ、細胞けんだく液を用
いて_，f;: ~H~ のf，1; tl:ðll l定が T可能であると々え、小!阪市'，Iîll央k:fII胞をピペッテイング放びコラゲ
ナーゼ処 E
I
!(
J
占
n特見性を考慮しトリプシン処耳目は行わなかった)により i
位
向[
fさせ、ハン
クス+イーグル最小アミノ般隔地にけんだくし各種活性測定を行った。
この払む具、 トリプシン様酵素の基 l
"tに対して非常に強い活性が検出された。いくつかの
合成基質に対する活性の相対値は精製した本酔素と知似していたが、至適 pHは8
.
0であっ
.
5における活性量は、本書手素の予定!存在 f
誌と大きく隊れるものではなかったが、
た
。 pH9
pH8
.
0における活性量はその十倍にのぼった。しかしながらこの測定系では、他の膜結合
プロテアーゼであるアミノペフ。
チダーゼMやジペフ。
チジルペフ。
チダーセ:
I
Vなども検出され
ることから、単一のトリプシン傑酵素活性を特異的に検出できているとは断定できず、
様々な酵素の復合活性としてみかけの活性が現れている可能性があるため、詳細な解析は
行わなかった。阻害剤効果からも 、複数の酵素の関与が示唆された。またこのトリプシン
係活性は洗浄により失われることはなく 、パパインや EDTAなどでは可溶化できず、低濃
度の T
r
t
i
o
nX
I
O
Oにより 一部可溶化した。
第二立で考察したとおり、現在の調製方法では、消化酵素の混入を防ぐため1
1
見聞分の調
製を厳格に行っており、みかけのトリプシン様活性の大部分が可溶画分として除去される
が、これらはゲルろ過では分子 i
l
l1
0
0k以上の位 i
uに溶出し、 DE52及びアフィニティーカ
ラムに吸石しないことから 、本酵素とは異なると考えられ、既知の西手素との関連も不明で
ある。細胞けんだく液で観祭された病性が何に由来するのかは定かではないが、本酵素以
外に !l~ なるトリプシン様プロテアーゼが仔在する可能性も考えられる。しかし過去の論文
からはそのような報告は符られていない。 一つの可能性として、細胞分画により破駁され
る何らかの複合体が細胞1
失(刷l
子縁I
失)に存在し、その中に本酵素が含まれていると考え
6
5
ることもできるが、現在の段階で、は f
f
t
i
H
リの域を出ない。特異的抗体による組織染色により
その詳細￨が r
l
j
lらかになるであろう。
剤1
1
1
1
包l
以上に存在するプロテアーゼの機能については段々な報告がなされており、基質の
分月中への [
Y
;
J
ljのみならず、 レセプターとしての機能が示唆されている例もあり、
q
lでもト
I
J
足が報告されている。例えばCD4+リン
リプシン級プロテアーゼについては、興味深いまJ
パ球上 にイ了伝するトリプターゼ級プロテアーゼが、 H
lVウイルスのレセプターとして機能
4
8
)。またトリプシンインヒビターの一種である Kazal型 (
する級代がなされている (
P
a
n
c
r
c
a
ti
cS
c
c
r
c
t
or
yT
r
y
p
s
inI
nhi
b
i
t
or
，
PSTI
) は、各種細胞に結合し細胞噌殖や分化を引き起
7
5
7
8
)、これらの細胞上結合因子として、 トリプシン
こすという研究が多数なされており (
級プロテ Yーゼの (
i
{
J
:が示唆されている。
J
革I
1
械から
m化uに分泌され、小腸細胞に結合し、
CCKの合成を誘導する分子として、
Mon
it
orPC
J
lt
id
cが同定された。この分子は PSTTに高い相同性を持っている (
7
9
)。ラッ ト小
I
]
l
;
J
における Mon
it
orPC
J
lt
id
cの結合蛋 l
コがクロスリンキング法により同定されたが、この分
子は S D S- PAGEから計算される相対分子量が、 ~Iô~元状態で 50k、還元状態で3 2k と、本酵
素に円;
!
1似していた (
8
0
)。この結合は PSTI
により阻害されるが、阻害中心の変具体には阻害
されないことから 、結合蛋白はトリプシン様の活性中心を持つと推測された。そこで細胞
o
rPC
J
l!
i
d
cの結合蛋 白と木両手素の異同判別のため、各草i
f
蛋自性トリプシ
衣聞における Monit
ンインヒビターと本酔素の相互作用を検討した。
PSTI
は市販されていなかったため、既報 (
81
)
を元にブタ及びラット勝臓から精製を行
い、酸加熱処理、CM52、HPLCにより、ブタからは PSTIを単一 ピークとして精製した。
この他にも、 Kunit
z型トリプシンインヒビター (
BPTI) 、卵白トリプシンインヒビター
(オボムコイド)などについて、
トリプシンを比鮫対象として阻害定数の算定を試みた。
6
6
Table4
1 各種トリプシンインヒビターの50%阻害濃度
法貨として O
.lmMBoc-Gln-Ala-Arg-MCAを用い、 1
0m MTris-HCIpH8.
0緩衝液中で、あ
らかじめ基質と 1;IHlJ: ~J を混平11 しておき、 M 素を加えることで反応を開始した。阻害剤泌度
を変化させ、 50%阻害泌j
交を外jfJiにより求めた。
l
n
h
i
b
i
t
o
r
lCs
s
.ルfATE
ov
I
Cs
s
.T
r
y
p
s
i
n
ov
SoybcanT
r
y
p
s
i
nI
n
h
i
b
i
t
o
r(SBTI)
07
9X 1
2X 1
0
1
0
Ovomucoid
noi
n
h
i
b
i
t
i
o
n
1
0
2X 1
0-
BovincP
a
c
r
c
a
sT
r
y
p
s
i
ni
n
h
i
b
i
t
o
r(BP
T
I
)
6X 1
07
4X 1
0
1
0
P
a
n
c
r
c
a
sS巳c
r
c
t
o
r
yT
r
y
p
s
i
nI
n
h
i
b
it
o
r(PST
り
noinh以t10n
1X 1
09
Tablc4
1に示すように、本酵素はトリプシンと比較して、検討したすべてのトリプシン
インヒビターに対して紡合定数が千倍程度弱く、特にオボムコイド及びPSTIには全く阻
害されないという結果が符られた。このことより、本酵素がMonitorPe
p
t
i
d
eの結合蛋白で
あるという結論を得るには至らなかった。また同実験を細胞けんだく液についても行った
が、精製酵素のような明確な結果を得ることはできなかった。
このように、生理作用を示唆するような確実なデータは今のところ得られていない。
CCKプロセシングについても、細胞内外の局在などが明らかでない現段階では、
]
/
1
v
i
t
r
o
で
古i
!.l巨体を切断できるという点しか判明しておらず、総合的な研究の進展を待たねばなら
ない。
しかしながら、 i
nv
iνoの検証を行う上で、ブタという実験動物は必ずしも最適とは言え
守系の確立した小動物の方が wh
o
lcbodyでの解析には有利である 。この点をふま
ず、飼 1
えて我々は、ラット小腸より M ATEに相当する西宇奈を単離する試みを行った。
ブタと同級のd.~質および方法を用いて、ラット小腸粘膜ミクロソーム四分より、
トリプ
シン綴プロテアーゼの精製を行った。しかし精製された酔素は、分子量、必質特異性およ
びN末端アミノ般配列が、
トリプシンと 一致した。この醇素は Ca2+選択沈澱法により凝集
する小胞体四分から回収された点で MATEとも異なる。またこれとは別個に、熱変性:カゼ
6
7
インを必 1
'5:とするプロテアーゼをやはりミクロソーム四分より精製したが、これは分子
岳
、
J
.
H
"
1
:特J
Z性およびN末端アミノ酸配列がキモトリプシンと同一であった。トリプシン
およびキモトリプシンはいずれも勝臓から消化包・に分泌される醇素であり、ミクロソーム
間分より回収された理由は不明であるものの、混入の危険性が高いことは明らかである。
J
co
hnらはブタ円車，'
ilJ失ミクロソーム回分より g
a
s
t
n
ct
r
y
p
s
mをl
l
1離し、翻訳後修飾により l
浪
商分への籾平n
t'l:が閉す可能性を示唆している (
8
2
)。ラット小 l
i
l
lにおいてもトリプシンが細
胞内 j
民間分に存促する可能性は否定できないが、組織虫に比して大量の酵素が存在するこ
とから、生理的条件を反映していないと考え 、これ以上の解析を行わなかった。
Table4-2 ラット小腸ミクロソーム函分から精製された二穫のセリンプロテアーゼ
T
r
y
p
s
i
n
l
i
k
c
C
h
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G
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t
c
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i日c
匂
g，
叩
s
叫
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l
t
山 i
l
悶 t
l
∞
On
c
f
l
b
e
n
z
a
m
i
d
i
n
c
DE-52，
c
，
匡
:
fs
o
l
u
bi
l
i
z
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i
o
n
h
y
d
r
o
xy
a
p
a
ti
te
DE-52，
SDS-PAGE
20k仲ー旧)
28k(
+
/
-s
-l¥伍)
P
u
r
i
f
i
c
a
t
i
o
nf
o
l
d
2
1
5
f
o
l
d
2
9
5
f
o
l
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C
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s
e
i
n
)
，
7
7
0
f
ol
d(MCA)
1
Nt
c
r
m
i
n
a
ls
c
q
u
c
n
c
c
ヲPEHSVPYQVSLN?
IVGGYT
Rぺ
可GEDAIPGS?PWQVSLQ?
l
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c
n
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c
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lw
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h
R
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ta
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ct
r
y
p
s
i
n1
R
a
tc
h
y
m
o
t
r
y
p
s
i
n
28k(+s-ME)
6
8
このようにラット小)協から MATEを村製する試みは成功しなかったため、 cDNAレベル
の解析を行うことにした。しかし RT-PCRの結果からは、第二
主主に示したとおり、ラット
小腸からも特異的断片を泊中市することはできなかった。またライブラリーのスクリーニン
グに関しては今回行っていないが、ブタと異なりラット小Jj易 cDNAライブラリーは市販さ
れていることから、今後行うべき F
J!!題であると考えている。
本研究では、酔素の存在量が非常に微抵であるということが大きな障害となっている。
しかし小脇上皮は多級な細胞が集まっていることが知られており、その中の特定の細胞群
にのみ発現しているという可能性も否定できない。したがって、均一な細胞集団の得られ
泡系は非常に有効である。また I
告義細胞を用いることによって、種々の薬剤l
処理
る培養剤lIJ
を刀1 い、制lI J胞内輸送や朔訳後修釘lî の WI~析を行えることから、生理機能についてより詳細な
研究が可能でミある。さらに本章冒顕で述べたように、生理的に重要な作用を示す細胞膜結
合性プロテアーゼを 、 I~[l筈剤結合を利用して発現クローニングする際にも培議細胞系は必
須であり 、今後の f
J!!題としたい。
6
9
第五章
引用文献
70
第一章
可能な限り総説を引用した。
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第二章
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78
第六章
謝辞
79
指導教行をお引き受け取き、本研究の遂行に大きなお力添えを頂いた、鈴木紘一先生
(東京大'手分子細胞生物学研究所
生体超高分子分野
教授)に感謝いたします。
本研究の大部分は、来京大学大学院理学系研究不￨生物化学専攻
高橋研究室において行
われました。本研究を全間的に支援して頂き御指導下さった、高橋健治先生
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ミ京薬科大
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l 教授)に感謝いたします。
学生命科や f
蛋白質閃辿の研究においては、高橋孝行先生(北海道大学理学部
教授)に全面的なご
支援を賜りました。アミノ酸分析については機 )
1
:康子先生(生物化学専攻
山本研究室)
の、また昔日分アミノ般配列の決定には岩松 IYJ~ 先生(キリンビール基盤技術研究所)のご
協力を頂きました。
DNA
関連の研究においては、 )
1
:上英史先生(東京薬科大学生命科学部 助教授)およ
び村松友 h~ 先生(国立がんセンタ一生物物里Ul~11
室長)の質量な御指導およびご芯見を仰
ぎました。
生化学を合めた総合的な考一祭においては、n:I之合優先生(東京大学生物生産工学セン
ター
教J
受)および、小島正樹先生(束京j!;!i*
;
1大学生命科学部
助手)に有意義な御指導を
]頁きました。
本研究の遂行において、 Dr
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uda(スリランカ ・ペ ラ デ ニ ヤ 大 学 医 学 部 議
附)、孔光勲先生(斡国中央大学校
助教授) 、玉野上佳明先生(工業技術院生命工学工
業技術研究所)、金箱泰先生(打山学院大学理工学部
助手)、全光美先生(米国 NIH)
の諸先生方には常に素晴らしい手本となって頂きました。
一瀬雄夫先生、中公嶋成志先生、矢作直久先生、塚田真子先生(東京大学医学部第一内
科)には、協同研究者として公私にわたるご支援を頂きました。
佐々木宏先生(東京大学生物生産工学センタ一
専攻同期の友人諸兄、また生物化学専攻
助手) 、秦野賢一氏を始め、生物化学
高橋研究室時代の学生の皆様には、活発な討論
の機会と大学内外での交流の場を与えて頂きました。
配属を1:}(く御承諾]頁き、具なる視点から有意義なご教示を下さいました 、石持i
f
草ー先
r
生、反nJ 下之先生を始め、東京大学分子細胞生物学研究所
生体超高分子分野の皆般に御
1し上げます。
礼を 1
大学院生i?:ーを支えてくれた、家族と多くの友人に心より感謝いたします。
8
0