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microRNA製品カタログ A版 - Thermo Fisher Scientific
microRNA製品カタログ microRNA製品カタログ having a big impact on biology MicroRNA_brochure_1205b.indd 1 12/12/05 16:36 MicroRNA：生物学の新しいフロンティア マイクロ RNA（ miRNA ）は、タンパク質をコードしない 小さな RNA 分 子で、遺伝 子 発 現 の 翻 訳 後 抑 制を行 い ます。この 分 子は、当初“生物学における暗黒 物 質のよ うなもの”[1*] として言及されましたが、その後、発生や 細 胞 増 殖、分 化 、数 多くの 基 本 的な生物 内プロセスに おいて重 要な調 節因子であるということが 明らかにさ れました。最 近の報 告では、miRNA が 癌や 代 謝 疾 患、 神経疾 患、感染症、その他のヒトの疾病に miRNA が関 与していることが示唆されています [2*] 。 通常、miRNA は比 較 的長い RNA からなる前駆体とし て転写され、17 ∼24 ヌクレオチドからなる活 性 型の成 熟 miRNA にプ ロセシングされます。非 常に低 分 子で あるため、成熟 miRNA やその他の small RNA の研究 には特 別 なテクニックが 必 要とされます。単 離 から新 規 miRNA の同定、プロファイリング、定量、あるいはバ リデーションや機能 解 析まで、ライフテクノロジーズは miRNA 研究のために特別に開発した革新的なツールを 提供しています。これらのツールは、多くの研究者による miRNA の基本的な研究をサポートするだけでなく、解明 された多くの結果から、このエキサイティングな生物科 学の新分野の全貌を明らかにすることを可能にします。 *Reference 情報は 26 ページをご参照ください。 2 MicroRNA_brochure_1205b.indd 2 12/12/05 16:36 Contents 4 small-RNAのゲノムワイド探索 8 microRNA 発現の網羅的プロファイリング 13 ターゲットmiRNAの定量 18 microRNA機能解析 23 microRNA 抽出 26 エキソソームの分離・回収 3 MicroRNA_brochure_1205b.indd 3 12/12/05 16:36 small-RNA のゲノムワイド探索 サンプル中の全ての small RNAの配列情報を 取得し発現レベルを把握する ここ 2 年 の 間 に 10,0 0 0 種 類 近くの 新 規 small RN A の 配 列 が miRBase レジストリに登録されており [3] 、新規 smallRNA の探 索が進んでいます。ライフテクノロジーズの Ion PGM™ システムの ための RNA シーケンシング手法なら、これまで報告されていない small RNAを迅速に発見し、その発現レベルを高感度に検出する ための数多くの製品が提供されています。 Ion 半導体シーケンシング： シンプルなワークフ ローのソリューションです Ion PGM™ システムでは、ライブラリ調製に始まり、シンプルで迅 速なシーケンシングのワークフローや直観的に操作できるデータ small RNA研究を行うための完全なワークフロー 解析ツールまで、 を提供します。 Ion Total RNA-Seq キット v2 は、ヒトおよびヒト以外のサンプル を使用し、シンプルな操作でたった 1 ng の small RNA から small RNA のライブラリ調製を可能にします。二本 鎖 cDNA にアダプタ をライゲーションする他の方法とは異なり、Ion Total RNA-Seq キット v2は独自の Ambion®テクノロジーを利用して方向性を維持 Ion OneTouch™ システムはテンプレートの調製を約 3 時間で完了 することを可能にします。実際に操作を行う時間は数分です。また、 引き続いて行われる Ion PGM™ シーケンサによるシーケンスは 1 時間未満で完了します。シーケンスの読み取りは Torrent Suiteソ フトウェアで行い、これも通常 1時間以内で完了し、次世代データ 解析ソフトウェアで解析を行うためのファイルがエクスポートされ ます。 原理 サンプルから small RNA を単 離した後、逆 転写 を行って small RNA 集 団 の cDNA ライブラリを 作 製します。このライブラリの cDNAを増幅し、シーケンシングを行い、通常“タグ ” と呼ばれるそ れぞれの small RNA の cDNA に対応する塩基配列情報を取得しま す。これらのタグを参照するリファレンス配列のデータベースにマ ッピングすることで、新規のあるいは既知の small RNA が同定さ れます。相対的な発現レベルは、それぞれの small RNA から得ら れたタグの数から計算可能です。また、結果をフォローアップする バリデーションは TaqMan ® 5'nuclease ケミストリを用いて行う ことができます（図 1）。 したままアダプタを付加するので、作製したライブラリでは元の鎖 の情報が保存されています（US Patent:8192941）。さらに、3'お よび 5'のアダプタを同時に付加するのでライゲーションとクリーン ナップのステップを減らすことができます。 1 ライブラリ作製 6時間 ǩ,RQ7RWDO51$6HT.LWY 2 テンプレート調製 5時間 ǩ,RQ2QH7RXFKDZシステム 3 シーケンス 2時間 ǩ,RQ3*0DZシーケンサ ǩ,RQ3URWRQDZシーケンサ 4 データ解析 1時間 ǩ7RUUHQW6HUYHU ǩ7RUUHQW6XLWH6RIWZDUH 図 1． small-RNA シーケンスワークフロー 4 MicroRNA_brochure_1205b.indd 4 12/12/05 16:36 Ion PGM™シーケンサを用いた全 miRNAアイソ プローブデザインに依存しない、 マイクロアレイ よりも優れたデジタルデータの産出 フォームの検出 Ion small RNA-Seqはマイクロアレイと異なりプローブデザインに 依存せずに small RNAの探索やプロファイリング、定量を実施する Ion RNA-Seq kit v2と Ion 314™ および Ion 316™ ための方法です。 チップを使用し、ヒトの肺や胎盤のサンプルから得られた miRNA のシーケンシングを行いました（肺については両方のチップで 3反 復、胎盤については Ion 314™ チップ が 3反復、Ion 316™ チップが 2 反復） 。シーケンスデータを GeneChip® miRNA マイクロアレイ（3 反復） 、および TaqMan® Array MicroRNA （それぞれの組織につい て 2 反復）で行った発現プロファイリング実験の結果と比較しまし た。検出された異なる miRNA 分子の数は、Ion PGM™シーケンサ 、miRNA 種の検 の検出結果がマイクロアレイの結果を上回り （表 1） 出感度では Ion 半導体シーケンシングがマイクロアレイを凌ぐこと Ion PGM™シーケンサはまた、アノテーション済みの miRNAの -3p フォームあるいは -5pフォーム（これらは以前はそれぞれ leading フォーム、star（*） フォームと呼ばれていたものです） を識別するこ とができます（表 2 ）。ステムループ hsa-mir-126 に由来する成熟 miRNAフォームの Ion PGM™シーケンスデータ解析の代表例を示 します。胎盤のライブラリから得られたこれらのリードでは、5'もし （データ未掲載） 。マイクロ くは 3'isomir がどちらも検出されました アレイによる解析では、正確に isomirを検出することは非常に困難 です。 表 2. Ion PGM™シーケンサによる成熟 miRNAの -3pフォームおよび -5pフォー ムの識別能力 ここには TaqMan® MicroRNA アッセイの Ct 値、マイクロアレイのハイブリダイ ゼーションシグナルの log2 値、mapped Ion PGM™シーケンサリードのノーマラ イズ済の log2 値です。 がわかります。 さらに、Ion RNA-Seqのデジタル検出手法のおかげで、検出装置の シグナル強度のしきい値に制限される LogRatio 値のダイナミック 。 レンジもマイクロアレイと比較して拡大されます（図 2） hsa-miR-126 hsa-miR-126* TaqMan® 法 21.4 26.5 マイクロアレイ 15.1 Not detected Ion PGM™シーケンサ 13.2 10.9 検出手法 表 1. Ion small RNA-Seqデータに見られる高い感度 最初のカラムには、それぞれのプラットフォームが含むコンテントにもとづいた 検出可能な miRNA の総数を示します。Ion PGM™ シーケンサによる検出のしき い値は、各コンテントに依存せず、この数は最新の miRBaseに含まれる miRNA の総数を示します。TaqMan®ケミストリによる検出では Ct < 40として計算してい ます。理論上 3 つ全てのプラットフォームで検出可能な miRNA の数を 2 番目のカ ラムに、また、各プラットフォームで実際に検出された miRNA の数を最後のカラ ムに示します。 Total assays Intersection assays Intersection detected TaqMan® 法 748 708 308 GeneChip® Array 847 708 216 Ion 314™ チップ 904 708 230 Ion 316™ チップ 904 708 358 検出手法 log2倍数変化の分布 log2(胎盤/肺) Ion PGM ™ システム PGM 316 PGM 314 Array 図 2. Ion small RNA-Seqはアレイよりも広いダイナミックレンジを示します Ion 316™ チップ と Ion 314™ チップで得られた ChipsLogRatio 値のダイナミックレンジを GeneChip® miRNA と比較しました。ダイナミックレンジは箱ヒゲプロットで表示しています。 Ordering information 製品名 Ion PGM ™ システム テンプレート調製自動化システム付 Ion PGM ™ シーケンサ、Ion Torrent ™ サーバー、Ion One Touch ™ 2.0 Duo システム、 VWR Galaxy MiniStar 遠心機、16 穴マグネチックスタンド、無停電安定化装置、 サイズ 製品番号 価格 一式 PGM-410M（2 年保証） PGM-400M（1 年保証） ¥12,200,000 ¥11,400,000 インスタレーション試薬、設置、基本取扱説明 5 MicroRNA_brochure_1205b.indd 5 12/12/05 16:36 Ion Total RNA-Seqキット v2 RiboMinus™ Eukaryote システムキット v2 Ion Total RNA-Seqキット v2は、既知の、あるいは予測した small RNA 配列を解析するだけの他の検出手法とは異なり、予め得られ RiboMinus™ Eukaryoteシステムキット v2 は、トータルRNA 試料 中の大きなリボソームRNA 分画を激減させることによって、RNA る配列情 報に依 存することなく、サンプル中に含まれるすべての small RNA 分子をデジタルな配列情報として得ることができます。 この能力が、新規の small RNA 分子の発見だけでなく、選択的プ ロセシングにより生じる異なるアイソフォームの検出も可能にし ます。100ng のトータル RNA 中の 5ng の miRNAもしくは濃縮済の 1ngの miRNA からスタートすることができます。 転写 物の全スペクトルを濃縮する新しい精製システムです。この 28S、5S、5.8S キットは、ヒトあるいはマウスの Total RNA から 18S、 rRNAを 95 ％以上取り除くことができるように、rRNA に特異的な 5’ ビオチン標識プローブを使用してます。rRNA/ プローブ複合体は、 ストレプトアビジン標識のマグネットビーズによって、試料から取り 除かれます。これによって、末端に PolyA+ を持たない断片化され た mRNA 、あるいは PolyA+選択法では精製することができないほ かの調節 RNA などの RNA 転写産物種の回収量が増加します。精製 された RNA は、次世代シーケンス、マイクロアレイ、RT-PCRなどの サンプル調製にお使いいただけます。 特長 • 新規の small RNA 分子やアイソフォームを検出 • 細胞あたり 1コピー以下の small RNAを検出可能な感度 特長 • ストランド情報を保持した発現解析が可能 • ゲル精製不要のビーズ精製方式により、 プライマーダイマーを除去 • 細胞質およびミトコンドリア由来の rRNAを 95％以上除去 • 磁気ビーズ精製方式によりスムーズな約 1時間のワークフロー • 最新の逆転写酸素の採用により精度向上 • RiboMinus™ Eukaryote System v2は 1 ∼5 μgの RNAインプッ • 16サンプルまでのマルチプレックス可能 トに対応 • Low Input RiboMinus™ Eukaryote System v2は 100ng-1μ gの RNAインプットに対応 RNAサンプル アダプターの ハイブリダイゼーション 15分 ライゲーション 30分 逆転写 30分 精製 1時間 ライブラリの増幅 1時間 精製 1時間 5’ライゲーション部位 5’アダプター 3’ライゲーション部位 3’アダプター 目的の RNA サンプル ブロック 逆転写開始位置 ワークフロー 磁気ビーズ クリーンナップを備えた v2 システムでは、1時間でリボ ゾーム RNAを除去 Step 1 合計：4時間15分 Step 2 Step 3 Step 4 Hybridized RiboMinus™ probe Magnet Bead Biotin Ion Total RNA-Seqキットホールトランスクリプトーム ライブラリ調製 Non rRNAS Streptavidin Biotin rRNA-depleted RNA Non rRNAS リボソームRNAと ストレプトアビジン- マグネットで複合体 クリーンナップ プローブを 磁気ビーズを用いて、 を吸着 30分 ハイブリダイゼーション リボソームRNA / 10分 - 変性 20分 - キャプチャー プローブ複合体を捕捉 Ion Total RNA-Seqキット v2 Ordering information 製品名 Ion Total RNA-Seq kit v2、12Rxn Ion Total RNA-Seq kit v2、48Rxn Ion Xpress ™ RNA-Seq Bc 01-16kit RiboMinus ™ Eukaryote System v2 Low Input RiboMinus ™ Eukaryote System v2 サイズ 製品番号 価格 12 ライブラリ 48 ライブラリ 10 × 16 ライブラリ 12 反応 12 反応 4475936 4479789 4475485 A15026 A15027 ¥144,000 ¥480,000 ¥192,000 ¥84,000 ¥84,000 6 MicroRNA_brochure_1205b.indd 6 12/12/05 16:36 ERCC RNA Spike-In コントロールミックス ERCC RNA Spike-In コントロールミックスは、NIST（National Institute of Standards & Technology）によって ERCC（External RNA Control Consortium）で定められた RNA コントロールの内、 92 種 類を含む発 現 解 析 のためのコントロール RNAです。コント ロール RNA は polyA を有し、真核生物に対応しています。SOLiD® システムを用いた 遺伝 子 発 現 解 析にお いて、サンプル 調 整 時 の Total RNA から rRNA 除去時の品質確認、ライブラリ調製時の品 質確認、シーケンス後のデータ品質確認に利用できます。 特長 • 23 種× 4サブグループ：計 92 種類の polyA RNA • 約 106 のダイナミックレンジ • 次世代シーケンサ、マイクロアレイ、リアルタイム PCR などを用 いた遺伝子発現解析に対応 （small RNA 解析には適用不可） • total RNA に Spike-In ミックスを添加後、rRNA 除去または、 polyA RNA 精製する事で、RNAサンプル調製過程の品質確認が 可能 • Spike-In ミックスが添加された RNAサンプルを用いる事で、ラ イブラリ調製時の品質確認が可能 • データの品質確認（再現性、検出限界、ダイナミックレンジなど） が可能 • サブグループの濃度が異なる Spike-In ミックス 1と Spike-In ミ ックス 2 を併用する事で、発現変動の評価が可能 • 個 々 の コ ント ロ ー ル R N A を 検 出 するリ アル タイム P C R 用 TaqMan® Assayを別途提供しており、サンプル調製過程で確認 実験が可能 ERCC Mix 1（molecules/100ng mRNA） 1e+9 1e+8 1e+7 1e+6 1e+5 1e+4 ERCC Mix 2（molecules/100ng mRNA） 1e+9 1e+8 1e+7 1e+6 1e+5 1e+4 1e+3 1e+2 1e+2 1e+3 図 3. ERCC ExFold RNA Spike-In ミックスに含まれる ExFold RNA Spike-In ミックス 1と ミックス 2を 2 種のサンプルに加え比較した場合の模式図 23 種× 4サブグループ ：計 92 種類の polyA RNA からなる ERCC RNA Spike-In ミックス 1を用 いる事で、サンプル調製、データの品質確認が可能。 さらに、ExFold Spike-In ミックス 1 とミックス 2を用いた場合、それぞれのミックスの 4 種の サブグループの濃度が異なる為、発現変動の評価も可能。 Ordering information 製品名 ERCC ExFold RNA Spike-In ミックス ERCC RNA Spike-In ミックス サイズ 製品番号 価格 10 µl × 2 10 µl 4456739 4456740 ¥240,000 ¥120,000 7 MicroRNA_brochure_1205b.indd 7 12/12/05 16:36 microRNA 発現の網羅的プロファイリング ® ゴールドスタンダードとしての TaqMan テクノロ ジー：1日以内に microRNAのプロファイリングを 完了 ワークフローの特徴 •5 時間以内に数百種類の miRNA のプロファイリング実験が完了 します •ヒト、マウス、ラットのプロファイリングに最適です サンプル間の 全 miRNA 発 現の違いをプロファイリングすること は、生物学的プロセスに影響を与える特定の miRNAを同定する際 の最初のステップとなります。まず、miRNA 発現が異なると予想さ れるサンプル間の比較を行います。例えば疾患組織と正常組織、薬 剤処理サンプルと未処理サンプル、異なる組織間などで miRNAの 発現プロファイルの比較を行います。 miRNA は非常に低濃度でも細胞の機能に影響を与え、また、その 発 現レベル の範囲が 非常に広いので、その定 量には高感 度 で広 いダイナミックレンジを持つツールが必要となります。TaqMan ® OpenArray ® MicroRNA Panel および TaqMan ® Array Micro RNA Cardは、Megaplex™ Primer Poolsとの組み合わせで、この ような実験に最適です。 これらのツールは、ヒト、マウス、ラット由来の miRNA 解析に対応 しており、48 サンプル分の miRNA 発現プロファイルを同日中に得 ることができます。しかも、必要なのはたった 100 ng のトータル RNA だけです。ゴールドスタンダードとなっている TaqMan®アッセ イケミストリの感度や特異性、ダイナミックレンジのメリットを最 大限に生かし、また少量ターゲットの PCRにライフテクノロジーズ の革新的なステムループ RT プライマーデザインを採り入れたこと により、TaqMan® OpenArray ® MicroRNA パネルおよび TaqMan® Array MicroRNA カードは、データを得るために数日を有し、1回の 解析に数 100 ngの RNA が必要なマイクロアレイ解析に対して明ら 。 かな優位性を示します （図 4） 1 サンプル調製 ・mir VanaTM miRNA Isolation Kit ・TaqMan® ABC Purification Kit 2 逆転写反応(RT) 3 cDNA増刷 (オプション) ・MegaplexTM PreAmp Primers ・MegaplexTM RT Primers & ・TaqMan® MicroRNA ® Reverse Transcription Kit ・TaqMan PreAmp Master Mix •miRBaseに含まれる既知の miRNAを広く網羅します 原理 中規模のスループットを持つ TaqMan ® Array MicroRNA Card の 場 合には、377 種の miRNA に対 する逆 転写反 応を 1 本 のチュ ーブで行います。 （ A・Bアレイを両方とも解 析する場合は、それぞ れ 377 種 の miRNA に対 する逆 転 写反 応 を、2 本 の チューブに分 けて行います。また、ハイスループットの TaqMan® OpenArray ® MicroRNA Panelの場合には、754 種の miRNAを 2 本のチューブに 分けて逆転写します。逆転写に使用する Megaplex™ RT Primers は 377 種の miRNA 特異的なステム ル ープ プライマーがミックス されたもので Applied Biosystems ®リアルタイム PCR 装置を用 いた 解 析フォーマットに合わせてデ ザイン されています。次に、 Megaplex™ PreAmp Primer Pools を用いてプレ増幅のステッ プを行います。バイアスのない増幅を可能とするこのステップによ りサンプル中の miRNA の濃度が増加し、最大の感度でリアルタイ ム PCR の検出ができるようになります。最後の定量ステップでは、 TaqMan® Universal PCR Master Mix II を各サンプルに添加し ます。サンプルのロードはご利用になるシステムによって異なりま す。TaqMan® OpenArray ® MicroRNA Panelの場合、AccuFill™ システムを用いてサンプルをロードします （このパネルは予め調製 されたナノ流路プレートで 3 セット 754 種の TaqMan® MicroRNA Assays がプリントされています）。TaqMan ® Array MicroRNA Card の場合、ピペットを用いて Card のサンプル注入用ポートから サンプルをロードします。TaqMan® MicroRNA Cardは A・B の 2 枚 のカードから成り、それぞれ 377 種の miRNA Assay がマイクロ流 路カードに予めプリントされています。 4 cDNAの希釈 ＆ロード ・TaqMan® Array Card or ・OpenArray® Plate miRNA 5 リアルタイム PCR装置による ラン実行 ・QuantStudio™ 12K Flex, ・ViiA™ 7 ・7900HT Fast リアルタイム PCR システム データ解析 6 ・RealTime StatMiner® Software ・DataAssist™ Software xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx xxxxxxxx xxxxxxxxxx Total RNA 30 min 150 min 90 min 10 min 60 min 図 4. TaqMan® OpenArray ® MicroRNA Panelおよび TaqMan® Array® MicroRNA Cardsのワークフロー ヒト、げっ歯類の miRNA 発現プロファイリングを行う際、TaqMan®OpenArray ®MicroRNA Panels を用いた解析では、オプションの MegaplexTMPreAmp Primer Poolsによる pre-amplificationを行った場合でも、同時に 12 サンプルを 5.5 時間で処理することが可能です（ pre-amplificationなしでは 4.25 時間）。TaqMan®Array MicroRNA Cardsを用いた解析では、MegaplexTMPreAmp Primer Poolsによる pre-amplificationを行った場合、1サンプルあたり 5.75 時間で処理します。 8 MicroRNA_brochure_1205b.indd 8 12/12/05 16:36 ® Megaplex™ プライマープール：カードとパネル TaqMan MicroRNAアレイとパネル プロファイリング実験に究極の感度や広いカバー率を求める場合 には、Megaplex™ Primer Poolsがその目的を達成するためのフ レキシビリティを提供します。TaqMan® OpenArray ® MicroRNA Panel または TaqMan® Array MicroRNA Card は、Megaplex™ Primer Poolsと組み合わせて使用します。これらは miRBaseに 登録されている miRNA の多くをカバーしており、ヒトやげっ歯類 に対する理想的な miRNAプロファイリングソリューションを提供 します。 ヒト お よ び げ っ 歯 類 の プ ロ ファイリン グ に 最 適 な Ta q M a n ® MicroRNA Arrays は、microRNA アッセイが予めプリントされて いるマイクロ流路カードのセットでTaqMan® MicroRNA Assay の 優れた定 量性で解 析を行うことが可能です。アッセイの組み合わ せは Megaplex™ Primer Poolsと一致しており、セットアップの時 間や実験手技によるバイアスを減らせます。より高いスループット を求める場合には TaqMan® OpenArray ® MicroRNA Panels を TaqMan® OpenArray ® MicroRNA Panelsは 1枚 おすすめします。 のプレートで 3 つのサンプルを同時に処理することが可能です。ど ちらの場合でも、miRNAターゲットの逆転写には Megaplex™ RT Primer Pools を使用し、Megaplex™ PreAmp Primer Poolsに よるプレ増幅を行った後に各反応液に TaqMan® Universal PCR Master Mix IIを加えるだけのシンプルな試薬調製で、ハイスルー プット解析に適しています。 •Megaplex™ RT Primer Pools ̶ miRNA プロファイリングを シンプルにするためにデザインされた Megaplex™ RT Primer Poolsはグローバルな miRNA 発現プロファイリング用の RT プラ イマーのプールです。この製品は cDNA 調製や個別の TaqMan® MicroRNA Assaysにも使用することができます。 •Megaplex™ P r e A mp P r imer Pool s ̶ TaqMan ® A r r ay MicroRNA Cardsとともに使用する場合やサンプル量が限られ る場合、アッセイの感 度を最も重視する場合には、Megaplex™ P r e A mp P r imer Po ol s が 大 い に 役 立 ち 、低 発 現レ ベ ル の miRNAや限られたサンプル量の場合の検出感度を向上させるこ とができます。Megaplex™ PreAmp Primer Poolsは、わずか 1 ng のトータル RNA から効果的に miRNA 発現プロファイルを得 ることができます （図 5）。 TaqMan®Arrays MicroRNA Cardsおよび TaqMan® OpenArray® Panel miRNAマイクロアレイ 結果を得るまでの時間 少なくとも2日：サンプルのラベリングとハイブリダイゼーションのセッ トアップに丸1日かかり、2日目に洗浄とアレイのスキャニングを行い ます。 トータル RNAからリアルタイム PCRのデータまで2ステップ（プレ増 幅を行う場合は3ステップ）のみで1日で完了します。 ダイナミックレンジ 典型的には2–3 log （プラットフォームとプローブの種類によっては、 4 logの報告があります）。 最大7 logのレンジを持つので、高発現および低発現の miRNAの検 出を1回の実験で行う事が可能となります。 特異性 マイクロアレイの測定が単一のハイブリダイゼーションイベントに依 存することを考慮すると、クロスハイブリダイゼーションの懸念があり ます。また、キャプチャープローブのハイブリダイゼーションでは、 miRNA前駆体と生物学的に活性を持つ成熟型 miRNAを区別できま せん。 TaqMan®ケミストリによる高い特異性が得られます̶増幅シグナル を得るためには、4つのユニークなオリゴヌクレオチドのハイブリダイ ゼーションが必要です。 革新的なステムループ RTプライマーにより、成熟型 miRNAに対す る特異性が得られます。 使用 RNA量 典型的には1 µgもしくはそれ以上（いくつかのプラットフォームでは 100 ng以下がサポートされています）。 1–1,000 ngの範囲のいずれも使用可能です。 既知 miRNAのカバー率 マイクロアレイのデザインは、典型的には in silicoでの選抜に依存し ており、キャプチャープローブのデザインにはウェット実験によるバリ デーションは通常行われません。このことは無反応プローブが生じる ことによるカバー率の低下につながります。さらに、ハイブリダイゼー ションをベースとした技術であるため、感度が限定され、低発現の miRNAが検出されることは困難です。 全てのアッセイは、実績がありバリデートされた in silicoのデザイン パイプラインを使ってデザインされ、Megaplex™ Primer Poolsや TaqMan®Array Cardsに追加される前にはウェット実験によるバリ デーションが実施されています。Megaplex™ Primer Poolsによる アッセイのパフォーマンスは実際の実験で再検証できます。その結 果、全てのアッセイで必ず何らかの情報を得ることができます。 Megaplex™ Human A Pool の検出効率 Megaplex™ Human B Pool の検出効率 80 検出% 100 80 検出% 100 60 40 60 40 20 20 0 0 ntc RT 0.1 fM PreAmp 1 fM 10 fM 100 fM テンプレート濃度 1 pM 10 pM 100 pM ntc RT 0.1 fM PreAmp 1 fM 10 fM 100 fM 1 pM 10 pM 100 pM テンプレート濃度 図 5. Megaplex™ Primer Poolsと TaqMan® Array MicroRNA Cardsによる miRNAの検出 TaqMan®MicroRNA Array の A Card、B Cardに対して、それぞれの Cardにプリントされている miRNA アッセイの全ターゲットを人工的に化学合成し（10 pM）、total RNA （10ng/ µ L ）にスパイクとして添加しました。人工ターゲットが 6 logもしくは 4 logになるように段階希釈した混合物を用いて Megaplex™ ワークフローによる テストを行いました。プレ増幅を行った場合と行わなかった場合で測定を行っています。さらに、アッセイの特異性を確認するため、テンプレート無しのコントロール の反応を実施しました。 （NTC） 9 MicroRNA_brochure_1205b.indd 9 12/12/05 16:36 Ordering information：microRNA 発現プロファイリング ■ サンプル調製（ 23 ∼ 25 ページ参照） mirVana™ miRNA Isolation Kit TaqMan® miRNA ABC Purification Kit ■ microRNA 用 RT 試薬 TaqMan® MicroRNA RT Kit TaqMan ® MicroRNA RT Kitは、TaqMan ® MicroRNA Assays の逆転写反応試薬です。Megaplex™ Primer PoolsまたはTaqMan ® MicroRNA Assaysに添付の RT プライマーと組み合わせて使用します。 製品名 TaqMan® MicroRNA RT Kit TaqMan® MicroRNA RT Kit サイズ 製品番号 価格 200 反応 1000 反応 4366596 4366597 ¥24,000 ¥72,000 Megaplex™ Primer Pools Megaplex™ RT Primers はstem-looped構造の逆転写用プライマーをプールしたものです。TaqMan® MicroRNA Arrays と組み合わせることで効率的な プロファイリングワークフローを構築できます。数百の miRNA のプロファイリングを一回の反応に集約し、網羅的 miRNA発現解析に必要な逆転写反応とトー タル RNA の量を低減します。 Megaplex™ RT Primers Pool（for Human） 製品名 サイズ 製品番号 価格 Megaplex ™ RT Primers, Human Pool A 50 反応 4399966 ¥86,000 50 反応 4399968 ¥86,000 50 反応 4400928 ¥99,000 50 反応 4444281 ¥86,000 50 反応 4444745 ¥99,000 逆転写用プライマーのみ Megaplex ™ RT Primers, Human Pool B 逆転写用プライマーのみ Megaplex ™ RT Primers, Human Pool Set RT Primers Pools A&B (4399966 & 4399968) Megaplex ™ RT Primers, Human Pool B v3.0 逆転写用プライマーのみ Megaplex ™ RT Primers, Human Pool Set v3.0 RT Primers Pools A&B (4399966 & 4444281) Megaplex™ RT Primers Pool（for Rodent） 製品名 サイズ 製品番号 価格 Megaplex ™ RT Primers, Rodent Pool A 50 反応 4399970 ¥86,000 50 反応 4399972 ¥86,000 50 反応 4400926 ¥99,000 50 反応 4444292 ¥86,000 50 反応 4444746 ¥99,000 逆転写用プライマーのみ Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool B 逆転写用プライマーのみ Megaplex ™ RT Primers, Rodent Pool Set RT Primers Pools A&B (4399970 & 4399972) Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool B v3.0 逆転写用プライマーのみ Megaplex™ RT Primers, Rodent Pool Set v3.0 RT Primers Pools A&B(4399970 & 4444292) Megaplex Primer Pools の Pool A および Pool B は、TaqMan® MicroRNA Arrays の A、および B アレイに搭載されている遺伝子にそれぞれ対応しています。 PreAmp製品によるcDNA増幅を行う場合（オプション） Megaplex™ PreAmp Primersでは、1ng の微量のトータル RNAからでも網羅的な発現解析が可能になります。微量サンプルを用いたプロファイ リングに有効です。 Megaplex™ PreAmp Primers Pool（for Human） 製品名 サイズ 製品番号 価格 Megaplex ™ PreAmp Primers, Human Pool A 50 反応 4399233 ¥86,000 50 反応 4399201 ¥86,000 50 反応 4400927 ¥99,000 50 反応 4444303 ¥86,000 50 反応 4444748 ¥99,000 PreAmp 用プライマーのみ Megaplex ™ PreAmp Primers, Human Pool B PreAmp 用プライマーのみ Megaplex ™ PreAmp Primers, Human Pool Set PreAmp Primers Pools A&B (4399233 & 4399201) Megaplex ™ PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 PreAmp 用プライマーのみ Megaplex ™ PreAmp Primers, Human Pool Set v3.0 PreAmp Primers Pools A&B (4399233 & 4444303) 10 MicroRNA_brochure_1205b.indd 10 12/12/05 16:36 Megaplex™ RT and PreAmp Primers Package（for Human） 製品名 サイズ 製品番号 価格 Megaplex ™ Primer Pools, Human Pools A 50 反応 4401009 ¥120,000 50 反応 4401010 ¥120,000 50 反応 4401091 ¥136,000 50 反応 4444749 ¥120,000 50 反応 4444750 ¥136,000 RT Primers(4399966) + PreAmp Primers(4399233) Megaplex ™ Primer Pools, Human Pools B RT Primers(4399968) + PreAmp Primers(4399201) Megaplex ™ Primer Pools, Human Pools Set RT Primers Pools A&B (4400928(= 4399966 & 4399968)) PreAmp Primers Pools A&B (4400927(= 4399233 & 4399201)) Megaplex ™ Primer Pools, Human Pools B v3.0 RT Primers(4444281) + PreAmp Primers(4444303) Megaplex ™ Primer Pools, Human Pools Set v3.0 RT Primers Pools A&B (4444745(= 4399966 & 4444281)) PreAmp Primers Pools A&B (4444748(= 4399233 & 4444303)) Megaplex™ PreAmp Primers Pool（for Rodent） 製品名 サイズ 製品番号 価格 Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool A 50 反応 4399203 ¥86,000 50 反応 4399237 ¥86,000 50 反応 4400925 ¥99,000 50 反応 4444308 ¥86,000 50 反応 4444747 ¥99,000 PreAmp 用プライマーのみ Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool B PreAmp 用プライマーのみ Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool Set PreAmp Primers Pools A&B (4399203 & 4399237) Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool B v3.0 PreAmp 用プライマーのみ Megaplex™ PreAmp Primers, Rodent Pool Set v3.0 PreAmp Primers Pools A&B(4399203 & 4444308) Megaplex™ RT and PreAmp Primers Package（for Rodent） 製品名 サイズ 製品番号 価格 Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools A 50 反応 4401090 ¥120,000 50 反応 4401011 ¥120,000 50 反応 4401012 ¥136,000 50 反応 4444752 ¥120,000 50 反応 4444766 ¥136,000 RT Primers (4399970) + PreAmp Primers (4399203) Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools B RT Primers (4399972) + PreAmp Primers (4399237) Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools Set RT Primers Pools A&B (4400926(= 4399970 & 4399972)) PreAmp Primers Pools A&B (4400925(= 4399203 & 4399237)) Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools B v3.0 RT Primers(4444292) + PreAmp Primers(4444308) Megaplex™ Primer Pools, Rodent Pools Set v3.0 RT Primers Pools A&B(4444746(=4399970 & 4444292)) PreAmp Primers Pools A&B(4444747(=4399203 & 4444308)) TaqMan® PreAmp Master Mix 製品名 TaqMan® PreAmp Master Mix サイズ 製品番号 価格 40 反応 4391128 ¥124,000 11 MicroRNA_brochure_1205b.indd 11 12/12/05 16:36 ■ miRNA 定量用リアルタイム PCR Human TaqMan® Array Human MicroRNA Cards 製品名 TaqMan® Array Human MicroRNA A+B Cards Set v2.0 A array (4398965) + B Array (4398966) TaqMan® Array Human MicroRNA A Card v2.0 ® TaqMan Array Human MicroRNA B Card v2.0 TaqMan® Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 A array (4398965) + B Array (4444910) TaqMan® Array Human MicroRNA B Card v3.0 サイズ 製品番号 価格 8枚 （各 4 枚） 4400238 ¥258,000 4枚 4398965 ¥200,000 4枚 4398966 ¥200,000 8枚 （各 4 枚） 4444913 ¥258,000 4枚 4444910 ¥200,000 Rodent TaqMan® Array Rodent MicroRNA Cards 製品名 TaqMan® Array Rodent MicroRNA A+B Cards Set v2.0 A array (4398967) + B Array (4398968) TaqMan® Array Rodent MicroRNA A Card v2.0 ® TaqMan Array Rodent MicroRNA B Card v2.0 TaqMan® Array Rodent MicroRNA A+B Cards Set v3.0 A array (4398967) + B Array (4444899) TaqMan® Array Rodent MicroRNA B Card v3.0 サイズ 製品番号 価格 8枚 （各 4 枚） 4400239 ¥258,000 4枚 4398967 ¥200,000 4枚 4398968 ¥200,000 8枚 （各 4 枚） 4444909 ¥258,000 4枚 4444899 ¥200,000 TaqMan® MicroRNA Panelsおよび関連試薬 アッセイ数/Plate サンプル数/Plate サイズ 製品番号 価格 TaqMan® OpenArray® Human MicroRNA Panel QuantStudio TM 12K Flex 757 3 1 プレート 4470187* ¥99,000 TaqMan® OpenArray® Rodent MicroRNA Panel QuantStudio TM 12K Flex 757 3 1 プレート 4470188* ¥99,000 製品名 ® ® TaqMan OpenArray Real-Time Master Mix, 1.5mL TaqMan® OpenArray® Real-Time Master Mix, 5mL QuantStudio™ 12K Flex OpenArray® Accessories Kit 1.5 ml 4462159 ¥14,000 5 ml 4462164 ¥42,000 1 キット 4469576 ¥38,500 * QuantStudio ™ 12K Flex リアルタイム PCR システムで、4470187 と 4470188 をご使用になるためには、4469576 が必要です。 リアルタイム PCR 解析システム QuantStudio ™ 12K Flex リアルタイム PCR システム Applied Biosystems®ViiaTM7 リアルタイム PCR システム 12 MicroRNA_brochure_1205b.indd 12 12/12/05 16:36 ターゲット miRNA の定量 特定の miRNAを検出、定量 特定の miRNAを検出する実験は、以前に得られた結果の検証や特 定の miRNA についての情報を得たい場合によく実施されます。ラ TaqMan® イフテクノロジーズは、アッセイデザインの最適化により、 アッセイおよび定量リアルタイム PCR のメリットである「高い感度 と特異性、ダイナミックレンジ」を miRNAの検出および定量に利用 することに成功しました。 ® TaqMan MicroRNA Assaysには、ターゲット特異的なステムルー プ逆転写プライマーが含まれています。この革新的なデザインによ り、低分子の成熟 miRNA（~22 nt）の検出という miRNA の定量に おける根本的な問題点に取り組んでいます。このステムループ構造 末端 は、成熟 miRNAターゲットのみに特異性を持ち、miRNAの 3’ に RT プライマー/成熟 miRNAのキメラを形成します。 この少し長い RT 産物は、標準的な TaqMan®リアルタイム PCR の テンプレートとなります。 C. ライフテクノロジーズは、ヒトやマウス、ラット、アラビドプシス、 elegans 、ショウジョウバエなど、Sanger データベースに登録され ている全生物種の TaqMan® MicroRNA Assays の豊富なコレクシ ョンを提供しています。また、miRBaseデータベースが更新される のに伴って、迅速に新規のアッセイを追加しています。 1 サンプル調製 2 逆転写反応(RT) 3 ワークフローの特徴 • ヒトやマウス、ラット、ショウジョウバ エ 、アラビド プシス、 C. elegans な ど、miRB ase に 登 録さ れて い る 生 物 種 の 個 別 の miRNA の定量に最適です。 • 各 キット に は 、ター ゲット の 成 熟 miR N A に 対して 特 異 的 な TaqMan® Assaysおよび逆転写プライマーがセットで含まれてい ます。 •miRBase に登録されている全 miRNA へのカバー率を上げるた め、新たなアッセイが継続的に追加されています。 原理 TaqMan ® MicroRNA Assaysでは、革 新的なターゲット特異的 なステムループ逆転写プライマーを採用しており、低 分 子の成熟 miRNA の検出が困難という問題を解決しています。このプライ マーによってターゲットの 3' 末端に配列が付加された cDNA が合 成され、標準的な TaqMan ®リアルタイム PCR のテンプレートを 形成します。また、プライマー末端のステムループ構造は、生物学 的な活性を持つ成熟 miRNA を特異的に検出するというこれらの アッセイの重要なメリットとなります （図 5）。 TaqMan®MicroRNA Assayの反応準備 4 リアルタイムPCR装置 によるラン実行 5 データ解析 microRNA microRNA Stem-loop primer 30 min • mirVana™ miRNA Isolation Kit • TaqMan® miRNA ABC Purification Kit • RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE • TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit 65 min • TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit • TaqMan® MicroRNA Assays 25 min • TaqMan® Universal Master Mix II • TaqMan® MicroRNA Assays 90 min • Applied Biosystems® リアルタイム PCR システム • Instrument software (included) • RQ Manager enterprise software (optional) • RealTime StatMiner® Software (optional) 13 MicroRNA_brochure_1205b.indd 13 12/12/05 16:36 ® ® TaqMan MicroRNA Assays Custom TaqMan Small RNA Assays 2 ステップの TaqMan ® MicroRNA Assays（ TaqMan ®アッセイと ター ゲットに特異 的な逆 転写プライマーを含みます）は Sanger miRBaseデータベースに含まれるほぼ全ての miRNA に対してデ ザインされています。ライフテクノロジーズは、Sanger miRBase miRNA 研究のために開発された、TaqMan®miRNA Assay のデザ インのノウハウは、200 ベース以下のさまざまなタイプの低分子核 酸の解析にも利用することが可能です。Custom TaqMan® Small RNA Assayを使用すれば、これらのアッセイのメリットを、さまざ まな生物種の低分子 RNA に対しても利用できます。例えば、デー タベースにまだ登録されていない新規の miRNAや piRNA（ piwiinteracting RNA ）や snRNA 、snoRNA のようなさまざまな small RNA に有効です。 データベースの更新に合わせてアッセイコレクションの数を継続 して増やしています。 ® TaqMan MicroRNA Assays 内在性アッセイ ヒト、マウス、ラット、アラビドプシス、 C. elegans 、ショウジョウバ エの内在性コントロールの候補となるアッセイを提供しています。 これらのコントロールは、綿密に選 択された低 分 子ノンコーディ ング RNA に対してデザインされています。これらは、さまざまな タイプの細胞や組織、実験条件下で一定レベルの発現を示すこと を確認しています。詳細はアプリケーションノート“ Endogenous controls for real-time quantitation of miRNA using TaqMan® MicroRNA Assays”をご覧ください。 Stem-loop RT primer ® TaqMan テクノロジーが miRNA 研究の世界に大きな メリットをもたらします Target Sequence •高い特異性̶前駆体ではなく生物活性を持つ成熟 miRNA Reverse Transcription のみを定量します̶よく似たファミリーに属するホモログの 間の 1塩基の差異も識別可能です（図 6） •高感度̶わずか 1-10 ngのトータル RNAから検出可能。サ ンプルの節約もできます • 広いダイナミックレンジ̶最大 7 log のダイナミックレン ジ̶ 1回の実験で高発現と低発現の miRNAを同時に検出 可能です（図 7） Real-Time PCR Forward Primer •カスタムアッセイが利用可能̶シーケンスを特定して頂け ればライフテクノロジーズがデザインとアッセイを行います •迅速、シンプル、スケーラブル̶ 2ステップのリアルタイム PCRアッセイが、迅速に高品質な結果をもたらします Q F Reverse primer TaqMan® probe 図 6. TaqMan® MicroRNA Assay アプローチ シンプルな 2 ステップからなる反 応で、ターゲット miRNAをリアルタイム PCRで高感度かつ特異的な検出・定量が 可能です。 14 MicroRNA_brochure_1205b.indd 14 12/12/05 16:36 Mature miRNAs miRNA Assays let-7a Precursors Perfectly matched Ct Mismatched Ct ∆Ct (mismatch vs. match) Ct ∆Ct (Precursor vs. mature) Looped 16.5 33.1 16.6 29.5 13.0 Linear 23.6 38.3 14.7 30.4 6.8 miRNA miRNA Stem-loop RT primer Linear RT primer 図 7. TaqMan® MicroRNA Assaysの逆転写反応におけるステムループプライマーが生物活性をもつ成熟 miRNAに対する特異性をもたらします let-7aに対するステムループ RTプライマーを含むデザイン済み TaqMan® MicroRNA Assayを、同等の配列を持つリニアな RTプライマー/PCRプライマー/TaqMan®プロー を模した 1.5 x 108コピーの合成 miRNA、ステムループ let-7a前 ブのセットと比較しました。次に、成熟 let-7aおよび成熟 let-7e（let-7aと 2塩基だけが異なる近縁の miRNA） 駆体を逆転写反応液に添加し、TaqMan® MicroRNA Assayの RTステムループプライマーあるいはリニア RTプライマーによるプライミングを行い、リアルタイム PCRで検出 を行いました。その結果、ステムループ RTプライマーでは、成熟 miRNAを前駆体 miRNAや近縁の miRNAターゲットからより明確に識別できることを示しました。 39 37 35 1.0 33 31 29 CT Δ Rn 27 25 0.1 70M copies 23 7 copies Slope = –3.36 R2 = 0.999 21 19 17 0.01 15 13 0 5 10 15 20 25 Cycle Panel A. Amplification Plot 30 35 40 11 10 100 1,000 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9 Quantity Panel B. Standard Curve 図 8. TaqMan® MicroRNA Assaysは最大 7 logのダイナミックレンジを示します このような広いダイナミックレンジによって、1回の実験で数コピーから数百万コピーまで発現の異なる miRNAターゲットを正確に定量することが可能になります̶細胞と組織、 または疾患のレベルなどにより、miRNAの発現レベルが大幅に変動することがあります。このようなケースには非常に有効です。TaqMan® MicroRNA Assaysのダイナミック （A）合成 lin-4 miRNAの増幅プロットは 7桁のダイナ レンジと感度を示すために、合成 lin-4 miRNAを段階希釈し、lin-4 TaqMan® MicroRNAアッセイを用いて増幅しました。 から 1.3 x 104 fM（反応当たり7 x 107コピーに相当します） まで ミックレンジを示しました。PCRにおける合成 RNAの投入量は 1.3 x 10-3 fM（反応当たり7コピーに相当します） 変化することになります。 （B）lin-4 miRNA増幅の標準曲線 15 MicroRNA_brochure_1205b.indd 15 12/12/05 16:36 Ordering information：ターゲット microRNA の定量 ■ サンプル調製（ 23 ∼ 25 ページ参照） mir Vana™ miRNA Isolation Kit TaqMan® miRNA ABC Purification Kit ■ microRNA 用 RT 試薬 TaqMan® MicroRNA RT Kit TaqMan ® MicroRNA RT Kitは、TaqManR MicroRNA Assays の逆転写反応試薬です。TaqMan ® MicroRNA Assaysに付属しているRTプライマーと組み合わせて逆転 写反応を行ないます。 製品名 TaqMan® MicroRNA RT Kit TaqMan® MicroRNA RT Kit サイズ 製品番号 価格 200 反応 1,000 反応 4366596 4366597 ¥24,000 ¥72,000 ■ miRNA 定量用リアルタイム PCR TaqMan® MicroRNA Assays TaqMan® MicroRNA Assaysは、 リアルタイムPCRでmicroRNA （miRNA） を定量するためのアッセイです。生物学的に活性のある成熟型 miRNAを検出 します。 製品名 TaqMan® MicroRNA Assays, Inventoried サイズ 製品番号 価格 50 サンプル・150 反応分 4427975 ¥29,800 25 サンプル・75 反応分 4440885 ¥29,000 50 サンプル・150 反応分 4440886 ¥39,000 750 サンプル・750 反応分 2,900 サンプル・2,900 反応分 4440887 4440888 ¥78,000 ¥145,000 各 miRNA 特異的 RT primer：5X reaction mix(50 サンプル分 / 15 µL 反応系 ) 各 miRNA 特異的 TaqMan® Assay：20X reaction mix (150 反応分 / 20 µL 反応系 ) 販売中の生物種：ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis thaliana、Caenorhabditis elegans、Drosophila melanogaster TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Extra Small 各 miRNA 特異的 RT primer：5X reaction mix(25 サンプル分 / 15 µL 反応系 ) 各 miRNA 特異的 TaqMan® Assay：20X reaction mix (75 反応分 / 20 µL 反応系 ) TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Small 各 miRNA 特異的 RT primer：5X reaction mix(50 サンプル分 / 15 µL 反応系 ) 各 miRNA 特異的 TaqMan® Assay：20X reaction mix (150 反応分 / 20 µL 反応系 ) TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Medium TaqMan® MicroRNA Assays, Made-to-Order, Large Custom TaqMan® Small RNA Assays 製品名 Custom TaqMan® Small RNA Assays, XＳ Custom TaqMan® Small RNA Assays, Ｓ Custom TaqMan® Small RNA Assays, Ｍ Custom TaqMan® Small RNA Assays,Ｌ サイズ* 製品番号 25 サンプル・75 反応 50 サンプル・150 反応 750 サンプル・2,250 反応 2,900 サンプル・8,700 反応 4440418 4398987 4398988 4398989 価格 ¥39,000 ¥50,000 ¥120,000 ¥254,000 *20µL の反応系として計算 16 MicroRNA_brochure_1205b.indd 16 12/12/05 16:36 TaqMan® Universal Master Mix II TaqMan ® Universal Master Mix IIは、TaqMan 技術を利用したさまざまなアプリケーションに使用できるマスターミックス試薬です。TaqMan ® MicroRNA Assays によるリアルタイムPCR 反応の際に使用します。 TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 製品名 TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 1mL TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 2 x 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 5 x 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 10 x 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, with UNG 50mL サイズ* 製品番号 40 反応 200 反応 400 反応 1,000 反応 2,000 反応 2,000 反応 4440042 4440038 4440044 4440045 4440046 4440039 価格 ¥14,000 ¥63,000 ¥122,000 ¥295,000 ¥570,000 ¥558,000 TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 製品名 TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 1mL TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 2 x 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 5 x 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 10 x 5mL TaqMan® Universal Master Mix II, no UNG 50mL サイズ* 製品番号 40 反応 200 反応 400 反応 1,000 反応 2,000 反応 2,000 反応 4440043 4440040 4440047 4440048 4440049 4440041 価格 ¥14,000 ¥58,000 ¥112,000 ¥270,000 ¥510,000 ¥500,000 *50µL の反応系として計算 リアルタイムPCR解析システム QuantStudio™12K Flex Applied Biosystems® ViiA™ 7 リアルタイムPCRシステム リアルタイムPCRシステム Applied Biosystems® 7500 Fast リアルタイム PCR システム StepOnePlusTM/StepOneTM リアルタイム PCR システム Applied Biosystems® 7500 リアルタイム PCR システム 17 MicroRNA_brochure_1205b.indd 17 12/12/05 16:36 microRNA 機能解析 miRNAの機能を解析する ワークフローの特徴 •gain-of-functionおよび loss-of-function形質により、miRNAで miRNA の機能解析では、タンパク質をコードする遺伝子とよく似 た戦略が取られます。培養細胞に人工的な miRNA mimicをトラン スフェクションすると、gain-of-function の形質を特定することに 役立ちます。また、loss-of-function の形質を特定するためには、 miRNA inhibitorを使った down-regulation 実験あるいは阻害実 験を実施します。 また、miRNA 発現の up-regulation 実験と down-regulation 実験 の組み合わせは、特定の miRNAによる制御を受けている遺伝子や 細胞内プロセスを同定するのに利用することができます。 調節される遺伝子やプロセスを同定します。 •miRN A ター ゲット のバリデ ーションには 、ウェスタン ブ ロッ もしくはその両方を使用します。 ティングまたはリアルタイム PCR、 • ターゲットサイトの相互作用とタンパク質発現に対する評価は、 レポーター遺伝子アッセイおよびイムノディテクションシステム で行うことができます。 原理 Ambion ®（現在はライフテクノロジーズの 1ブランド）は、最初に miRNAモジュレーターを提供した会社です。Ambion® microRNA mimicおよび inhibitor は、細胞内の miRNAの機能解析を行うツー Ambion® によって初めて製品化されました。 ルで、 •mir Vana™ miRNA mimicおよびmir Vana™ miRNA inhibitorは、特 定の miRNA を特異的に模倣もしくは阻害するようにデザインさ れており、ターゲット mRNA の翻訳を人 工的に増加もしくは減 最 新 の mir Vana™ miRNA mimic および mir Vana™ miRNA inhibitor は、特定の miRNA を模倣あるいは阻害するようにデザ インされており、それぞ れ gain-of-function もしくは loss-offunction の研究に使用します。どちらも siRNA の導入に使用され るソリューションを使ってのトランスフェクションもしくはエレクト ロポレーションによって細胞内に導入することができます。 •miRNAターゲットは、miRNA の増加や減少に伴う、ターゲットタ ンパク質および / もしくは mRNAレベルの定量でバリデートされ 少させるために使用できます。 ています。 •タンパク質発現への影響を調べる場合にはウェスタン解析が用 いられます。 •miRNA とそのターゲット部位との相互作用の研究には、レポー ター遺伝子のアッセイが用いられます。 1 3' miRNA mimicまたは inhibitorを選択 5' mirVana™ miRNA mimic 3' 2 細胞へのトランスフェクション 3 ターゲット遺伝子の mRNAレベルの評価 4 ターゲットのタンパク質 レベルまたはその他の 生物学的作用の評価 5' mirVana™ miRNA Inhibitor • mirVana™ miRNA mimics • mirVana™ miRNA inhibitors • Lipofectamine™ RNAiMAX Transfection Agent • Neon Transfection System • TaqMan® Gene Expression Cells-to-CT™ Kit • TaqMan® Gene Expression Assays • Applied Biosystems® リアルタイム PCR システム • NuPAGE® プレキャストゲルシステム • iBlot® ゲルトランファーシステム • MagicMark™ XPウエスタンブロッティング スタンダード In vitro miRNA オリゴ： mir Vana™ miRNA mimics & inhibitors トランスフェクション： Lipofectamine® RNAiMAX In vivo miRNA オリゴ： mir Vana™ miRNA mimics & inhibitors, in vivo ready トランスフェクション： Invivofectamine® 2.0 miRNA 機能解析 18 MicroRNA_brochure_1205b.indd 18 12/12/05 16:36 microRNA合成分子 450 miRNA122 = miR122 miRNA inhibitor NT =Not transfected Neg1 = Negative Control #1 mir Vana™ miRNA mimics & inhibitors: •細胞毒性はありません •最新の miRBase に対応しています • in vitro レベルでは低濃度の導入でも最大の安定した効果を示し mRNA upregulation % 400 350 300 250 200 150 100 50 ます 0 miR 122 • in vitro および in vivo の両方で使用可能です NT NEG1 miR 122 AldoA mir Vana™ miRNA mimicsは化学的に修飾された二本鎖の短い RNA 分子で（siRNAとよく似てはいますが、同じものではありませ ん）、内在性の成熟 miRNA を模して働くようデザインされていま （RNAす。化学修飾により、目的の成熟 miRNAの正しい鎖が RISC induced silencing complex）に取り込まれます（図 8）。低分子であ るため、これらの分子はベクターよりも容易にトランスフェクショ ンが可能です。また、導入にあたっては siRNA のトランスフェクシ ョンやエレクトロポレーションで使用される条件と同等の条件が 使用できます。miRNA 発現ベクターと比較するとこれらの合成分 Dose responseの研究に使用することが可能です。 子は、 NEG1 NT miR 122 NEG1 miR 122 Slc35a4 NT NEG1 Lass6 図 10. mir Vana™ miRNA inhibitor は in vivoで効果的に miRNAを抑制します miR12 2 ま た は Ne gati v e C ontr ol #1 mir Vana™ miRN A inhibitor を Invivofectamine ® 2.0 試 薬と複合 体を 形成 させ、Balb-C マウスの尾 の 静 脈 に 3 日間連 続 で 7 mg/kgで尾 静脈 投与しました。最後 の 投与から 24 時間 後に マウスの肝臓の miR122 の 4つ の 細 胞内ター ゲットの 発 現レベルを TaqMan ® MicroRNA A ssay を 使って測 定しました 。無 処 理 のマウスおよび Negative Controlマウスとの比較で、miR122で処理したマウスの肝臓において、4 種すべて の mRNA の有意な発現増加が検出されました。 1.40 FW RV 1.20 1.00 Fold change mir Vana™ miRNA mimics NT Hfe2 0.80 0.60 0.40 mir Vana™ miRNA Inhibitors mir Vana™ miRNA Inhibitor は化学修飾された一本鎖の核酸で、 内在性の miRNAに特異的に結合して阻害するようにデザインされ ています。適当な miRNA 結合サイトを含むレポーターベクターを 用いてテストを行った場合に、これらの inhibitor は、ネガティブコ ントロール mir Vana™ miRNA Inhibitorを用いた場合と比較して、 平均で約 4 倍のレポーター遺伝子の発 現誘導を引き起こします。 このことからターゲット miRNA への強力な阻害活性が示唆され ます。 0.20 0.00 miRNA mimic Neg reporter 1 miRNA mimic Neg reporter 2 miRNA mimic Neg reporter 3 miRNA mimic Neg reporter 4 miRNA mimic Neg reporter 5 miRNA mimic Neg reporter 6 図 11. mir Vana™ miRNA mimicでは、ター ゲット miRNA の 配 列 からなる mature 鎖が特異的に活性を持ち、逆鎖側（star 鎖）は不活性化されます レポーターベクターを用いて、ターゲット鎖（mature 鎖）と逆 鎖（star 鎖）の活 mir Vana miRNA 性の比較を行いました。6 種類の miRNA の認識配列に対して、 mimicを導入したところ、すべてのケースで mature 鎖が高い活性を示しました。 （Negative Controlと比較するとシグナルが 5 倍から 10 倍減少しました）一方で star 鎖の活性は低い（Negative Controlと同じ）ものでした。 in vivo 研究にも利用可能（in vivo Ready 製品） miRNA 解析の in vivo 研究は近年急成長している分野です。多く の 研 究者 がより正 確 な 定 量 デー タを得 るために TaqMan ® ケミ ストリを 利 用するようになっており、それが mir Vana™ mRNA inhibitor が TaqMan®アッセイに完全に対応している理由です（図 10）。 mimic や inhibitor のようなオリゴヌクレオチドを in vivoで使用す る場合の重要な必要条件の 1つは、毒性や免疫刺激性を持たない ことです。開発の過程で、mimicも inhibitor もまったく毒性を示 さないことを確認しています。 miRNAライブラリー製品（ヒト用、マウス用） 網羅的な miRNA 機能解析を行うための miRNAライブラリー製品 もご用意しています。ライブラリーに含まれる mir Vana™ miRNA mimic または inhibitor は 96ウェルの各ウェルに 0.25 nmol が凍 結乾燥された状態で提供されます。これは 50 nM でトランスフェ mir Vana™ クションを行う場合に 50 回分に十分な量に相当します。 miR N A mimic ま た は inhibi to r と使 用 するた め の P o s i t i v e Controlおよび Negative Controlも別途販売しています。 mirVana™ miRNA mimics 3' 3' 5' 5'Cap 5' miRNA mimic 3' 5' miRNA inhibitor No translation Sequence-specific loading into RISC-like complex mirVana™ miRNA inhibitors 3' AAAAAAAAAAAAA3' 5' 3' 5' mRNA 5'Cap Complementary binding of specific miRNAs—no RISC-like complex association AAAAAAAAAAAAA3' 3' Translation 5' 図 9. mir Vana™ miRNA mimics および mir Vana™ miRNA inhibitors の働き 19 MicroRNA_brochure_1205b.indd 19 12/12/05 16:36 Ordering information：microRNA 機能解析 ■ microRNA合成分子 mirVana™ miRNA mimic 製品名 mir Vana ™ miRNA mimic mir Vana ™ miRNA mimic mir Vana ™ miRNA mimic, in vivo Ready Customer-defined mir Vana ™ miRNA Mimic Customer-defined mir Vana ™ miRNA Mimic Customer-defined mir Vana ™ miRNA Mimic, in vivo Ready mir Vana ™ miRNA Mimic Negative Control #1 mir Vana ™ miRNA Mimic Negative Control #1 mir Vana ™ miRNA Mimic Negative Control #1, in vivo Ready mir Vana ™ miRNA Mimic Negative Control #1, in vivo Ready mir Vana ™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control mir Vana ™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control mir Vana ™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control, in vivo Ready mir Vana ™ miRNA Mimic miR-1 Positive Control, in vivo Ready mir Vana ™ miRNA mimics ライブラリ（miRBase v 19*） mir Vana ™ miRNA mimics ライブラリ（miRBase v 19*） サイズ 製品番号 価格 5 nmol 20 nmol 250 nmol 5 nmol 20 nmol 250 nmol 5 nmol 20 nmol 50 nmol 250 nmol 5 nmol 20 nmol 50 nmol 250 nmol 0.25 nmol each 1 nmol each 4464066 4464067 4464070 4464068 4464069 4464071 4464058 4464059 4464060 4464061 4464062 4464063 4464064 4464065 4464074 4464075 ¥58,000 ¥178,000 ¥510,000 ¥98,000 ¥180,000 ¥510,000 ¥57,000 ¥174,000 ¥250,000 ¥500,000 ¥57,000 ¥174,000 ¥250,000 ¥500,000 お問い合わせ お問い合わせ * 2012 年 12 月現在 mirVana™ miRNA inhibitor 製品名 mir Vana ™ miRNA inhibitor mir Vana ™ miRNA inhibitor mir Vana ™ miRNA inhibitor, in vivo ready Customer-defined mir Vana ™ miRNA Inhibitor Customer-defined mir Vana ™ miRNA Inhibitor Customer-defined mir Vana ™ miRNA Inhibitor, in vivo ready mir Vana ™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 mir Vana ™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 mir Vana ™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 , in vivo Ready mir Vana ™ miRNA Inhibitor Negative Control #1 , in vivo Ready mir Vana ™ miRNA Inhibitor let-7 Positive Control mir Vana ™ miRNA Inhibitor let-7 Positive Control mir Vana ™ miRNA inhibitor ライブラリ（miRBase v 19*） mir Vana ™ miRNA inhibitor ライブラリ（miRBase v 19*） サイズ 製品番号 価格 5 nmol 20 nmol 250 nmol 5 nmol 20 nmol 250 nmol 5 nmol 20 nmol 50 nmol 250 nmol 5 nmol 20 nmol 0.25 nmol each 1 nmol each 4464084 4464085 4464088 4464086 4464087 4464089 4464076 4464077 4464078 4464079 4464080 4464081 4464092 4464093 ¥58,000 ¥178,000 ¥510,000 ¥98,000 ¥180,000 ¥510,000 ¥57,000 ¥174,000 ¥250,000 ¥500,000 ¥57,000 ¥174,000 お問い合わせ お問い合わせ * 2012 年 12 月現在 20 MicroRNA_brochure_1205b.indd 20 12/12/05 16:36 miRNA導入用トランスフェクション試薬 &機器 Lipofectamine® RNAiMAX reagent Neon® Transfection System 細 胞 へ の siRNA 導入 用に開 発されたトランスフェクション 試 薬 で、多くの RNAi 研究者の方にご利用いただいています。miRNA mimic および miRNA inhibitor の導入にも最適なトランスフェク ション試薬です。 Neonシステムは、ピペットチップ型電極（特許）を採用したエレク 特長 トロポレーション装置です。このピペット型電極は、細長いチップ 内で均一な電界を形成することで導入効率を高め、電極に金メッ キを施すことで細胞へのダメージを軽減しています。 特長 • siRNA/miRNAの導入に最適な試薬 • 初代細胞、幹細胞、神経細胞などのトランスフェクションが • 少ない siRNA 量でも高効率にノックダウン 難しい細胞に最適なツール • 幅広い試薬レンジにおいて高い細胞生存率を維持 • ピペットチップ型電極（特許）により、高効率・低毒性な エレク • 様々な細胞株で使用可能 トロポレーションが実現 • 細胞タイプによって試薬を使い分ける必要なし Invivofectamine® 2.0 マウス 全 身投与 による肝 臓 へ の siRN A 導入 用に 開 発さ れ たト ランスフェクション試薬です。mir Vana™ miRNA mimics and inhibitors, in vivo ready 製品と組み合わせることで in vivo での miRNA 解析を行うことができます。 図12. Neon® Transfection システムとNeon® 消 耗品キット ■ miRNA導入用トランスフェクション試薬&機器 Lipofectamine® RNAiMAX 細胞への導入 製品名 Lipofectamine® RNAiMAX Lipofectamine® RNAiMAX Lipofectamine® RNAiMAX Lipofectamine® RNAiMAX Lipofectamine® RNAiMAX サイズ 製品番号 0.1 mL 0.3 mL 0.75 mL 1.5 mL 15 mL 13778-100 13778-030 13778-075 13778-150 13778-500 価格 ¥8,800 ¥24,000 ¥62,000 ¥88,000 ¥720,000 Invivofectamine® 2.0 In vivo 用 肝臓への導入 製品名 サイズ 製品番号 1mL 5mL 1377501 1377505 Invivofectamine® 2.0 Reagent Starter Kit Invivofectamine® 2.0 Reagent 価格 ¥140,000 ¥520,000 ※ Starter kit には、siRNA ポジティブコントロールとして Ambion® In Vivo FVll siRNA（マウス）50nmol が添付されています。 Neon® Transfection System 製品名 Neon® Transfection System*1 Neon® Transfection System Starter Pack*2 サイズ 製品番号 1 ユニット 1 セット MPK5000 MPK5000S 価格 ￥900,000 ￥1,050,000 ＊1 Neon® Transfection System(MPK5000) は、Neon® システム本体、Neon® Pipette（MPP100） 、Neon® Pipette Station（ MPS100）で構成されています。 ＊2 Starter Pack（MPK5000S）には、Neon® Transfection System(MPK5000) に、Transfection Kit(MPK10096、MPK1096（各1 キット）が添付されています。 Neon® Transfection System 消耗品 製品名 Neon® Transfection System Kit (100μL) Neon® Transfection System Kit (10μL) Neon® Transfection Tubes Neon® Pipette Neon® Pipette Station サイズ 製品番号 1 キット（Neon チップ：96 本） 1 キット（Neon チップ：25 本） 1 キット（Neon チップ：96 本） 1 キット（Neon チップ：25 本） 1 パック (100 本 ) MPK10096 MPK10025 MPK1096 MPK1025 MPT100 MPP100 MPS100 １ユニット １ユニット 価格 ￥165,000 ￥55,000 ￥165,000 ￥55,000 ￥49,000 ￥75,000 ￥100,000 21 MicroRNA_brochure_1205b.indd 21 12/12/05 16:36 miRNA機能解析のバリデーション miRNA 機能解析の gain-of-functionおよび loss-of-function 実 験では、ターゲット mRNA 発現に対する効果・影響を、遺伝子発現 レベルやタンパク質発現レベルでバリデーションを行ないます。 遺伝子発現解析 リアルタイム PCR 試薬・消耗品カタログ • TaqMan® リアルタイム PCR 用試薬 • SYBR® リアルタイム PCR 用試薬 • 遺伝子発現解析： microRNAのターゲットと予想される mRNAの発現量を測定 • 逆転写酵素 • RNA 抽出キット＆試薬 • タンパク質解析： microRNA のターゲットと予想されるタンパク質をウエスタン ブロットで検出 リアルタイム PCR システム 試薬・消耗品カタログ Reagents and Consumables Catalog ライフテクノロジーズでは、これらダウンストリーム解析にご利用 いただける製品を取り揃えております。製品の詳細については右 記のカタログをご覧ください。 タンパク質解析 タンパク質解析カタログ タンパク質解析カタログ • タンパク質電気泳動ゲル • タンパク質スタンダード • タンパク質染色試薬 • ウェスタンブロット用機器＆試薬 タンパク質解析カタログ タンパク質電気泳動 ウェスタンブロッティング & 検出システム 22 MicroRNA_brochure_1205b.indd 22 12/12/05 16:36 microRNA 抽出 ライフテクノロジーズでは、miRNA 、あるいはその他の small RNA の単離と分析のためのさまざまなキットを提供しています。それ （<200 nt）が定量的に回収できるため、 ぞれのキットは small RNA miRNAの解析に最適です： ® TaqMan miRNA ABC Purification Kit TaqMan® miRNA ABC (anti-miRNA Bead Capture)Purification Kit は、ヒトの TaqMan ® miRNA Assay および TaqMan ® Array Card 専用に特別にデザインされた精製キットです。 anti-miRNA オリゴがコンジュゲートされた磁気ビーズを用いており、全血、血 清、血漿あるいは FFPE 組織切片といった調製が難しいサンプル を対象とし、非常に少ないスタート量から miRNAを回収すること が可能です。スタートサンプル量は全血では 10 µL から、血清や血 漿では 50 µ L までとサンプルによって異なります。miRNA は磁気 ビーズでキャプチャーされ、血液などに含まれるリアルタイム PCR 阻害物質が容易に除去されます。 このプロセスにはフェノールや クロロホルム、TRIzol®試薬、あるいはグアニジンイソチアシアネー トなどの有害化学物質は使用しておらず、すべての操作は 75 分以 内で完了します。 さらに、さまざまな RNA が混在した状態で精製 される他のサンプル調製法とは異なり、TaqMan ® miRNA ABC Purification Kitでは特定の miRNAのみが回収されます。 このキットは 2 種 類が 提 供されており、1つは Human Panel A 、 もう１つは Human Panel B となります。それぞ れの キットは、 TaqMan® Array Human MicroRNA A Card および B Card（全部 で 754種のヒト miRNAに対応します）に含まれる miRNAアッセイ に応じた特定の miRNA が回収されるようにデザインされてい ます。 mir Vana™ miRNA Isolation Kit RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit （FFPEサンプル用） RecoverAll™ Kitでは、インキュベーション時間を除いた実際 の ハンドリング時間は約45 分で、1.5 時間以内に FFPEサンプルから RNA の単 離を完了することが できます。FFPE サンプルを、キシ レンとエタノールによる洗浄で脱パラフィンし、次に効果的なプロ テアーゼによる組織分解を行います。この時のインキュベーション 時間は回収するのが RNA か DNA かにより決定します。続いて迅速 なグラスフィルター法により、フィルター上でのヌクレアーゼ処理 を行いつつ核酸を精製し、最後に水もしくはキット付属の低塩濃 度バッファーで溶出します。得られた RNA はそのままリアルタイム PCRによる分析を行い、新鮮な組織や凍結サンプルを用いた場合 と同等のプロファイルを作成することができます。 ® TaqMan MicroRNA Cells-to-CT ™ Kit マル チウェルプレート、シングル チューブの 両 方のフォーマット で使 用でき、10 分以内にリアルタイム PCR に使 用可能な RNA を 10–10 5 個の培養細胞から調製します。細胞を PBS で洗浄し、室温 で 8 分間溶解します。この際に DNase 処理を行うこともできます。 Stop Solutionを添加して溶解を停止し、さらに 2 分間室温でイン キュベーションを行 います。サンプルを直 接 培 養プレート上（ 96 ウェルもしくは 384ウェル）で処理することができるので、サンプ ルのハンドリング回数を減らせ、サンプルロスや操作ミスの危険を 最小限に抑えられます。加熱や洗浄もしくは遠心の操作が不要で、 TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kitは従来の時間と手間のか かるプロセスをたった 10 分にまで大幅に減少することができまし た。また、キットに含まれる TaqMan® MicroRNA 逆転写試薬およ び TaqMan® Universal PCR Master Mix IIを使って、ゴールドス タンダードとも言える TaqMan ® miRNA プロファイリングのワー クフローを完了することができます。 サンプルはタンパク変性作用のある Lysis Solution 中で溶解され ると RNaseが不活性化され、RNA が安定化されます。次に、得ら れたライセートを酸性フェノール：クロロホルムで抽出し、RNA を 含む抽出液の上清を回収します。この RNA はさらにグラスファイ バーフィルターにより精製し、トータル RNA を得るか、サイズ分画 によって miRNAを濃縮することも可能です。このキットに含まれる （標準的なグラ 試薬は miRNA の回収率を上げ、small RNA のロス スファイバー法ではよく見られます）を減らすために特別に調製さ れたものです。この迅速で簡単な操作は実質的にほぼ全てのタイ プの細胞や組織に適しており、効率的に small RNA を含むトータ を濃縮し、解析で ル RNAを単離したり、small RNA 分画（<200 nt） の感度を向上するために使用できます。 23 MicroRNA_brochure_1205b.indd 23 12/12/05 16:36 microRNA 抽出用試薬セレクションガイド mirVana™ miRNA Isolation Kit mirVana™ PARIS™ Kit MagMAX™-96 for Microarrays Total RNA Isolation Kit TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit TaqMan® miRNA ABC Purification Kit RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE Tissues テクノロジー 酸性フェノールと改良 グラスファイバーフィ ルターによる迅 速 な 精製法です 細胞溶解バッファーと 酸性フェノール：クロロ ホルム抽出およびグラ スファイ バ ー フィル ターによる精 製 法を 組み合わせています TRI Reagent®による 細胞溶解と磁気ビー ズによる精製法です Cells-to-C T™テクノ ロジーとオプションの DNase 処理を用いる ことで、RNA 精 製ス テップを省略して、簡 単 にリア ル タ イ ム PCRに使用可能な細 胞ライセートが得られ ます Anti-miRNA オリゴ を付 加した磁 気ビ ー ズを用 い て 、少 量 サ ンプルから得られたヒ ト m i R N A の キャプ チャーと精 製 を 行 い ます 脱パラフィン、プロテ アーゼによる分解、グ ラスファイバーフィル ターによる精 製 法で す サンプル 使用量 培養細胞103–107個 もしくは 組織0.5–250 mg 培養細胞102–107個 もしくは 組織最大100 mg 培養細胞最大5x106個 もしくは 組織最大100 mg 培養細胞10-105個 血液関連サンプル10– 50 µ L 、培養細胞 10106個、組織1–10 mg、 FFPE切片5–10 µm、 唾液50 µL FFPE切片最大 20 µm 特長 • 培養細胞および多く • 30分で完了するシン の組織（高レベルの RNase を持つ組織 を含みます）から迅 速かつ容易に small RNAを精製します • miRNAプロファイリ ング実験やその他の 遺 伝 子 発 現 アプリ ケーションに最適で す プルなプロトコール • 実験間での高い再現 性が得られます • ト ー タ ル R N A 、 • 競合他社のキットと 比較してより短い操 small RNAと同時 に、タンパク質も回 収できます • オプションで smallRNA 濃縮操作も可 能です • mRNA や miRNA 、 siRNAとタンパク質 の 相 関 を 調 べる実 験に最適です 作時間 • small RNA 精製の ための改良プロトコ ルを採用しています • 10分以内に室温で培 養細胞からリアルタ イム PCR 用のライ セートが得られます • サンプルの移しかえ や遠心、バキューム マニホルドなどの操 作は不要です ® • ロボットを使った自 動化プラットフォー ムに組み込むことが 可能です • Ta q M a n M i c r o RNA Array Cardお よび Panelと使用す ることで良好な結果 が得られます • フェノール、クロロホ • FFPE サンプルから ルム TRIzol® 試薬、 DNA 、miRNA など グアニジンイソチア シアネートなどの有 害化学物質を使用し ません • 難しいサンプルから 磁気ビーズを用いて シンプルに精製を行 います の核酸をトータルで 精製します • Proteinase K の処 理 が 不 要 です ̶ 午 前中に脱パラフィン を始めても午後には リアルタイム PCRが 可能です • 75 分以内に、感度、 • 同一サンプル由来の 特異性、再現性の面 からも 良 好 な R T qPCR結果が得られ ます • TaqMan ® Human MicroRNAアッセイ およびアレイカード のために特別に開発 されました 未固定組織と比較し て >50%の収率です • リアルタイム PCRお よび PCR、変異スク リーニング、マイク ロアレイ解析に使用 できます 24 MicroRNA_brochure_1205b.indd 24 12/12/05 16:36 Ordering information：microRNA 抽出 microRNA を含む Total RNA の抽出 mir Vana™ miRNA Isolation Kit 製品名 サイズ 製品番号 mir Vana ™ miRNA Isolation Kit mir Vana ™ miRNA Isolation Kit（without Phenol） ＜ 40 回 AM1560 AM1561 ＜ 40 回 価格 ¥50,300 ¥44,000 血清、血漿からの miRNA抽出 mir Vana™ PARIS™ Kit 製品名 サイズ 製品番号 価格 mirVana ™ PARIS ™ Kit 40 反応 AM1556M ¥57,800 MagMax™ シリーズ 製品名 サイズ 製品番号 MagMAX ™ Total Nucleic Acid Isolation Kit MagMAX ™ -96 Blood RNA Isolation Kit MagMAX ™ -96 Total RNA Isolation Kit MagMAX ™ Viral RNA Isolation Kit MagMAX ™ -96 Viral RNA Isolation Kit 100 回 96 回 96 回 50 回 96 回 AM1840 AM1837 AM1830 AM1939 AM1836 価格 ¥110,000 ¥65,800 ¥59,500 ¥40,000 ¥59,900 キットを使用する際にはマグネティックスタンドが必要です。 磁気ビーズを用いるRNA抽出キット用のマグネティックスタンド 製品名 サイズ 製品番号 1個 1個 1個 AM10026 AM10027 AM10050 Single Place Magnetic Stand Magnetic Stand-96 96 well Magnetic-Ring Stand 価格 ¥12,400 ¥59,800 ¥124,000 TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT™ Kit RNA抽出無しで、培養細胞から直接 microRNA（miRNA）の発現プロファイリングを可能にします。 製品名 サイズ* 製品番号 TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT ™ Kit 100 反応 4391848 価格 ¥190,000 * スタートサンプル数（細胞溶解反応数）として表示 微量サンプルからの microRNA抽出 TaqMan® miRNA ABC（Anti-miRNA Bead Capture）Purification Kiｔ 製品名 サイズ 製品番号 価格 TaqMan® miRNA ABC Purification Kit-Human Panel A TaqMan® miRNA ABC Purification Kit-Human Panel B 40 回 40 回 4473087 4473088 ¥60,000 ¥60,000 25 MicroRNA_brochure_1205b.indd 25 12/12/05 16:36 エキソソームの分離・回収 Total Exosome Isolation シリーズ Total Exosome Isolation シリーズは、手間と時間がかかる超遠心法と同等品質のインタクト なエキソソームを短時間で抽出する試薬です。エキソソームからのRNA・タンパク質精製や、 特定タンパク質の濃縮試薬もご用意しております。 エキソソーム単離から解析へのワークフロー ❸ R N A 解 析 へ（リアルタイムPCR など） ❷ R N A とタン パ ク 質 の 精 製 ❶ エキソソーム単離 ❸ タン パ ク 質 解 析 へ ■作業時間わずか 20 分で抽出 Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit ■得られたサンプルは超遠心法と同等品質 ■ 30-60 分で高純度な RNA を抽出 ■ 細胞培養上清と血清の 2 種類のサンプルタイプに ■同一サンプルからタンパク質とRNA を回収可能 Total Exosome Isolation Exosome Immunoprecipitation ■ Protein A/G で、ターゲットタンパク質を 10 ∼ 50 倍に濃縮可能 ■ 磁性ビーズを利用した、わずか 30 分のシンプルな プロトコール 対応 超遠心法と同品質のサンプルを抽出 miRNA の発現レベル エキソソームのサイズ分布と粒子サイズ ［超遠心法］ 純度 純度 Average Ct Values ［Total Exosome Isolation 試薬］ 40 ■ Total Exosome Isolation 35 ■ 超遠心法 30 25 20 15 10 5 粒子サイズ 粒子サイズ 0 hsa-let7e HeLa細胞培養上清からTotal Exosome Isolation試薬と超遠心法でエキソソームを 抽出。Nanosight 社の LM10を用いて、エキソソームのサイズと数を解析しました。そ の結果、両法ともエキソソームのサイズ分布は同様で、粒子サイズは全て300 nm 未満、 ほとんどが約50-150 nmのサイズでした。 hsa-miR26a HeLa 細胞培養上清からTotal Exosome Isolation試薬および超遠 心によりエキソソームを抽出。Total Exosome RNA and Protein Isolation KitでRNAを回収し、TaqMan®プローブを用いた定量RTPCRでmiRNAの発現レベルを解析。 Ordering information 製品名 サイズ 製品番号 価格 Total Exosome Isolation（細胞培養上清） Total Exosome Isolation（血清） Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit Exosome Immunoprecipitation（Protein A）* Exosome Immunoprecipitation（Protein G）* 50ml 6ml 40 反応 1ml 1ml 4478359 4478360 4478545 10610D 10612D ¥41,000 ¥38,000 ¥38,000 ¥22,000 ¥22,000 *別途、目的に応じた抗体が必要になります。 References 1. Bartel DP (2004) MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116(2): 281–297. 2. Soifer HS, Rossi JJ, Saetrom P (2007) MicroRNAs in disease and potential therapeutic applications. Mol Ther 15(12): 2070–2079. 3. Griffiths-Jones S, Saini HK, van Dongen S, Enright AJ (2008) miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36: D154–D158. 26 MicroRNA_brochure_1205b.indd 26 12/12/05 16:36 オンラインオーダーシステムのご案内 TaqMan® Assaysなどの製品については、オンラインオーダーシステムを採用しています。このシス テムのご利用には、事前登録が必要となります。一度ご登録いただければ、次回以降ユーザーIDとパス ワードだけで簡単にご注文いただけます。 オンラインオーダー製品 • TaqMan® MicroRNA Assays • mir Vana™ miRNA mimics • mir Vana™ miRNA inhibitors 〈ご登録方法〉 ユーザー登録は、ウェブサイトの登録画面をご利用ください。ウェブの登録画面は必要事項を直接タイプ 入力できるようになっております。 新規ユーザーアカウントのご登録に関する詳細は、以下のウェブサイトをご参照ください。 www.appliedbiosystems.jpから “サポート”→“インターネットオーダーシステムご利用案内”ページ ウェブ登録画面 ご登録からご注文までの流れ ウェブ登録画面に必要事項を記入する Applied Biosystems® 製品取扱代理店に登録用紙を渡す 代理店が必要事項を記入し弊社宛に郵送 ユーザー ID とパスワードをご登録者に email でお知らせ ログインしてオンラインオーダー可能 ご登録に関してご不明な点がありましたら弊社ヘルプデスクまでお問い合わせください。 メール：JPOrderAdminCS＠appliedbiosystems.com 電 話：03-6832-6980（音声ガイダンス ①のあと アプライドバイオシステムズ オリゴ・ウェブ受注品の④を選んでください。） MicroRNA_brochure_1205b.indd 27 12/12/05 16:36 公式 Facebook ページ & Twitter もチェック！ facebook.com/LifeTechnologiesJapan @LifetechJPN 記載の価格は2012年現在の価格です。 消費税は含まれておりません。価格は予告なしに変更する場合がありますので予めご了承ください。 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。 記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。 The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. TaqMan and AmpliTaq Gold are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc., used under permission and license. RealTime StatMiner is a registered trademark of Integromics, S.L. © 2012, Life Technologies Japan Ltd. All rights reserved. Printed in Japan. GNL130-A1212OB 販売条件はこちらをご覧ください。www.lifetechnologies.com/TC 取扱店 ライフテクノロジーズジャパン株式会社 本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 TEL.03（6832）9300 FAX. 03（6832）9580 大阪：〒564-0052 大阪府吹田市広芝町 10-28 TEL.06（6389）1201 FAX. 06（6389）1206 www.lifetechnologies.com MicroRNA_brochure_1205b.indd 28 12/12/05 16:36