第4回サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）

LTQ Orbitrapによるタンパク質大規模
解析（Shotgun proteomics）
Large scale proteomics by orbitrap technology.
Thermo fisher scientific K.K
SID C&MS Application
OMICS Team
肥後 大輔
まとめ
• イオントラップ、オービトラップアナライザーを搭載した質量分析計では、複数
のタンパク質を網羅的に同定するショットガンアプローチにその性能を発揮
します
• ショットガンアプローチに必要なサンプル前処理試薬はキット化されており、
必要に応じて調整して戴く事が可能になりました。
• 従来のイオントラップと比較をすると、オービトラップアナライザーを搭載した
分析計では、より効率的なタンパク質の大規模解析が可能です。
• アイソバリック試薬「TMT」を用いることで、従来のショットガンアプローチの
結果に、さらにタンパク質発現量変動結果を得ることが可能になります。
2
Proteome解析のためのサンプル前処理→測定・解析
Cell and Tissue
Protein
Extraction
Peptide
Protease
Bodily Fluids
Sample
Database
Search
3
Mass spectrometer
高速なLC-MS/MSn質量分析計の大きな違い
• 質量精度：Δm/z0.2（外部標準）
• 低分解能スペクトル
LTQ
Relative Abundance
100
588.3
588.3
VAQDR 588.3
80
60
VAKDR 588.3
589.3 589.3
40
590.3 590.3
20
0
587.0
587.5
588.0
588.5
589.0
589.5
590.0
590.5
591.0
591.5
592.0
m/z
• 質量精度：3ppm（外部標準）
~m/z1000.000に対してΔm/z0.003~
• 高分解能スペクトル
588.3464
Relative Abundance
100
LTQ Orbitrap
4
VAQDR 588.3100
80
60
588.3100
589.3127
40
589.3491
VAKDR 588.3464
20
0
587.0
587.5
588.0
588.5
589.0
589.5
m/z
590.0
590.5
591.0
591.5
592.0
Proteome解析の前処理
•
•
•
•
•
•
タンパク質の抽出キット
タンパク質の可溶化キット
メジャータンパク質除去キット
二次元電気泳動の試薬etc.
In-gel digestキット
In-Solution digestキット
• サンプルクリーンアップキット
• SILAC, TMT etc.
上記キット化された試薬と一緒に、プロト
コルも提供されています。
電話対応で、カスタマーサポートのスタ
ッフも充実しています。
5
Thermo Scientific / Mass Spec Sample Handbook
Cell and Tissue
Bodily Fluids
Cell Lysis and Protein Extruction
High Abundant Protein Removal
Pre-fractionation & Enrichment
Sample Clean up
In-Solution Digestion
Gel Separation
In-Gel Digestion
Peptide Enrichment
Peptide Clean up
Mass Spectrometry
6
Mass Spec Sample Handbookをご覧ください
ショットガン・プロテオミクス
Cell and Tissue
Bodily Fluids
In-Solution Digestion
∼ ショットガン・プロテオミクス∼
電気泳動など蛋白質を単離精製せ
ず、混合状態のまま酵素消化して、
質量分析計で一気に測定・同定を
行う手法
7
ショットガン・プロテオミクス
Cell and Tissue
Bodily Fluids
In-Solution Digestion
8
ショットガン・プロテオミクス → LC-MS/MS
LC-ESI-MS/MS
Intensity
Chro
mat
ogra
m
m/z
R.T.
MS
s
m
tru
c
pe
配列情報
K
N
A
G
蛋白質/ペプチドの質量
MS/MS spectrum
9
ショットガン・プロテオミクス → 網羅的なタンパク質同定
LC-ESI-MS/MS
網羅的な
タンパク質同定
MS/MS測定結果から
データベース検索
10
目的に応じた前処理・目的に応じたシステムの選択
LC-ESI-MS/MS
HPLC-ESI
11
MALDI-MS or MS/MS
MALDI
タンパク質同定に対する質量精度の重要性
質量精度：5 ppm
Orbitrap Quality
Albumin
False positive
Albumin
12
質量精度：2 Da
Unit MS system
タンパク質同定に対する質量精度の重要性
質量精度：2 Da
False positive
Albumin
質量精度：0.1 Da
False positive
Albumin
質量精度：100 ppm
False positive
Albumin
質量精度：5 ppm
Orbitrap Quality
Albumin
13
大規模解析に求められる基準：False Discovery Rate ( FDR )
Protein
Database
Data file
Database search results
信頼性
(高)
Decoy
Database
Decoy database
Search results
Criteria
Criteria
FDR<5%
タンパク質同定数
FDR =
Decoy database
Search results
Database search results
Nature Methods 2, 667 - 675 (2005)
Published online: 23 August 2005; | doi:10.1038/nmeth785
Comparative evaluation of mass spectrometry platforms used in large-scale proteomics investigations
14
高速なLC-MS/MSn質量分析計の大きな違い
Database search results
信頼性(高)
Decoy database
Search results
Criteria
FDR<5%
LTQ
Database search results
信頼性(高)
Decoy database
Search results
LTQ Orbitrap
15
Criteria
FDR<5%
LTQとOrbitrap比較 （E.coli消化物100ng）
Database search results
信頼性(高)
Decoy database
Search results
Criteria
FDR<5%
LTQ
LTQ
Orbitrap
90,498
37,883
同定ペプチド数
4,274
9,432
スコアCut off値
35.88
19.82
<5%
<5%
MS/MS回数
LTQ Orbitrap
16
FDR
Pierce Biotechnology is Part of Thermo Scientific
TMT (Tandem Mass Tag)
TMT reagent (229Da)
126-131
103-97
Reporter
Balance
N-term
and K
*
*****
126 Da
• ペプチドレベルでラベル化
• N-末端 / Kのアミノ基に結合
• 多群間での比較定量が一度の分析結
果から解析可能
• 同定はMS/MSから、定量もMS/MSス
ペクトルから解析
*
129 Da
*
*** **
127 Da
*
*
*
*
130 Da
*
*
***
*
128 Da
17
***
*
**
*
131 Da
アイソバリックタグ試薬を用いた手法
ラベル化試薬
18
TMT試薬を用いたタンパク質発現変動解析
Cleavable Linker
TMT2 ： ２サンプルの比較
126, 127
(Normalizer : 99 - 100)
TMT6 ： ６サンプルの比較
126, 127, 128, 129, 130, 131
Mass Reporter
Mass Normalizer
(Normalizer : 99 - 104)
Reactive Group
MS/MS spectra
0
100
129
129.1374
80
TMT126 (229Da)
130.1409
130
90
128
128.1341
70
126
60
131
50
40
103
131.1382
127
127.1309
30
20
126
TMT127 (229Da)
126.1281
10
0
126
127
128
129
m/z
130
131
132
127
19
102
TMT試薬を用いたタンパク質発現変動解析
exp. ratio 1 : 2 : 4 : 6 : 8 : 3
obs. ratio 1 : 2 : 4 : 7 : 8 : 3
129.1374 130.1409
- 3.0 ppm + 1.9 ppm
128.1341
+ 2.6 ppm
126-131
131.1382
+ 1.2 ppm
127.1309
+ 1.5 ppm
126.1281
+ 2.9 ppm
Reporter
126
127
128
129
130
132
131
m/z
130.1409
b1
Relative Abundance
100
393.2339
230.1703
b2
798.4240
506.3185
y1
50
669.3823
365.2380
y3
y2
a2
200
300
a3
478.3249
a4
b5
770.4313
911.5057
a5
641.3881
246.1567
0
100
126~131
b3
a1
175.1188
359.2400
20
1156.6582
b4
883.5048
400
500
600
700
800
900
b6
103~97
1139.6388
982.5510
1000
1100
1200
m/z
TMTを用いたプロテオミクス
ショットガン・プロテオミクス →
→ 網羅的なタンパク質同定
タンパク質発現変動解析
LC-ESI-MS/MS
126~131
126~131
126~131
126~131
21
タンパク質同定 ＋
比較定量
MS/MS検索