人表皮細胞，ことに角質に対する ケラチナーゼの作用について

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日皮会誌:91 (2), 119-125, 1981 C昭56）
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人表皮細胞，ことに角質に対する
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ケラチナーゼの作用について
樋口 道生
滝内 石夫
要 旨
Microsporum
討し報告した，
canis よりKeratinaseを分離，精製し，
人足魅の表皮細胞ならびにKeratin
信＊
根木
fiber と反応させ
これら基礎的な報告の他Keratinaseの角質に対す
る直接的作用に関してはTrichophyton
mentagrophytes
た.
由来のKeratinaseをモルモットの毛とin
Keratinaseは皮膚のCryostat切片に対しては極めて
させ，その髄質が完全に消化され，皮質にも多数の皺裂
短時間に全ての有煉細胞を消化し，角質細胞も細胞膜を
が生じたというＹｕ等4）の報告がみられる．しかし糸状
残し細胞質を消化した．皮膚のBlockと反応させた結
菌が主として寄生する部位である表皮角質層に対する作
果もCryostat標本におけると略同様の結果であった.
用については,
Keratin
るのみである．
fiber との反応でも反応液中にアミノ酸が可
vitro で反応
Dobson等の否定的な報告5）が認められ
溶化され，反応後の沈澄についてもSDS電気泳動上
そこで，今回著者等はMicrosporum
Keratin fiber を構成する６本のバンドの内５本が消化
と略）より分離したKeratinaseが，人間の表皮細胞
canis（Ｍ. canis
されていた以上の結果より KeratinaseはKeratin
ことに角質やKeratin
fiberそのものを消化することか明らかとなった．
るか否かについて検索したので報告する．
fiber そのものに対して反応し得
材料と方法
はじめに
Ｍ･ canis :昭和大学藤が丘病院皮膚科保存株（Ｎｏ･
皮膚糸状菌感染症をParasiteの面から把えると，
780412―T株）を200mlのサブｐ一液体培地を入れた
Parasiteである糸状菌は生物の生存には極めて不適当な
11の三角フラスコにて約３週間，27°O
にて増菌培養し
環境と思われる皮膚角質にのみ棲息している．皮膚糸状
使用した.
菌はその生存に必要な栄養源を得るために種々工夫して
Reratinase産生のための培地の組織，滅菌方法，培養
いるのであろうが，その一手段としてKeratinaseを産
方法等は既に報告した如く1)2)おこなった．
生し，本来難溶性で栄養源とはなり得ないかにみえる角
酵素活性測定法（図1）:Ｙｕ等の方法6）に準じ，前
質を積極的に利用しているものと思われる．
回の報告1）に若干の変更を加え以下の如くおこなった
著者等は，多くの皮膚糸状菌が，栄養源を制限し代わ
りに毛髪を充分添加した培地内では，急速にこの毛髪
Keratina･●
を分解する酵素であるKeratinaseを産生することを見
い出した1).次いで我々はMicrosporum
gypseum
assay
-
Boiled Sample
へ
pie
より
flltrol・d
Keratinaseを精製し，その分子量や，その他の生化学的
性状2≒さらには本酵素の活性阻害物質等3)について検
￡ml
・SOllMcfviMit
gtllntgpigholr
昭和大学藤が丘病院皮膚科
＊順天堂大学皮膚科学教室
Iwao Takiuchi, Dousei Higuchi. and Makoto Negi :
The effect of keratinase on human epidermis,
especially on stratum corneum.
昭和55年７月８日受理
別刷請求先:（〒227)神奈川県横浜市緑区藤が丘
1―30 昭和大学藤が丘病院皮膚科 樋口 道生
6 ml
{−1
{−l
ineuboUd ３７°Ｃ ， 2 hrs
fillroted
m●●･ani O.D. at ZeOmii
§ompl･ Monk！ !:antrol 徊・ink
S-M-IC-blJ・Corrtctad
obsorbonet
O.IOO
図1
Keratinase活性測定法．
I
value
corf≪et≪dab･orbanc*
・ I K.U.
120
樋口 道生ほか
足恕生検皮膚を約５×５×５ｍｍの小塊(Block)のま
Keratlnase solution O.iiaL
Keratin
fiber
ま２∼３回28mM
K.U./28mM
lｚｘｺubateat 37゛Ｃ for 0， 1, 3, 6 hrs
phosphate buffer にて洗った後，40
phosphate buffer,pH 7.8 1mlのKeratinase
溶液中にて37°O ・4時間浸し反応させた後，10％の中性
↓
Added cold １０ ●Ｔ Ｃ Ａ
↓
hold
in Ice vater
ホルマリン中で24時間固定しパラフィソ包埋後連続切
I.Oml
片を作成しH-E染色ならびにＰＡＳ染色を施した.
for 15 min.
3000
Controlには28mM
rptn 15
mln.
Keratin
P1μ!itteijout 0.5ml
姐面led
l m1 0.5N
phosphate buffer のみに浸した皮膚
Blockを用いた.
fiber の抽出法
E小川等の方法7）により人足鮭の角質より抽出した.
ＳＵｐ･s ol.
Keratin
NaCH
↓
Bber
とKeratlnaseの反応（図２）
足鮭より抽出したKeratin
lのiwry's
metht:XJ
fiber を最終濃度として
S Ｄ Ｓ e 1^^ trOfiliores 13
lmg/mlになるように28mM
図２．足跡の角質より抽出ＬたKeratin
Keratinaseの反応方法．
fiber と
にsuspendし,
Tris HCl bufferpH 7,8 中
34K.U･/mlのKeratinase溶液0.1ml
を添加後37°Ｃにて,0,1,3,6時間反応させた．そ
即ち，試料6ml中に白毛のモルモットの毛を50mg加
れぞれの時間毎に反応溶液を採取し，最終濃度５％のト
え，37°Ｃにて２時間振壹しながら反応させる.
にはモルモットの毛のみ加えない試料を,
Control
Blankとして
リクロール酢酸にて除蛋白を施した後遠沈し，上清は
Lowry法8）によりアミノ酸濃度を測定し，沈伎は0.5ml
はKeratinaseを15分間Boilしたものを用いた．反応
をとり，再び小川等の方法に従い0.5m‘の8M
後の280nmでの吸光度を測定しControl値Blank値
25mM
を補正し算出した.
280nmでのO.D.
０．１の増加をもっ
2ME-Tris buffer,pH
Urea-
9,0 に再溶解しSDS電気
泳動に供した．
て１ Keratinase unit (K.U･と略）とした.
電気泳動法
Keratlnaseの分離，精製法：前回の報告2)3)とほぼ同
1.
KeratinaseのDisc電気泳動
じく，培養濾液を28mM
Gel
filtrationにより最終的に精製され，限外濾過に
衡化したDEAE
液を28mM
たCM
phosphate builer,pH
7.8で平
Cellulose にバッチ法にて通し，流出
phosphate buffer,pH
Cellulose に吸着させた後,
phosphate buffer,pH
より濃縮された試料20μ1を永井の方法9）に従い，10％
6.1にて平衡化し
polyacrilamaid gel PH 4.0にChargeし3mA/Columii
O.IN
り電圧にて３時間泳動した.
NaCl･28mM
7.8 により溶出させるカラム・ク
2.
溶液を限外濾過(Amicon社Standard
し, O.IN
NaCl-28mM
cell. DM
5)
phosphate buffer,pH ７.8にて
Gel filtration
( Sephadex
SDS電気泳動
前述の如き方法にてKeratinase とKeratin
ロマトグラフィーをおこなった．溶出されたKeratinase
G-75)をおこなった．得られ
混合させた直後，ならびに３時間反応後の試料をLaeramli等の方法1°）により10％Ｇｅｌにて電圧3mA/Column
にて泳勤しKeratinaseによるkeratin
たKeratinase溶液を再び限外濾過にて脱塩した後，濃
較検討した．
縮し試料として用いた．
３．泳動ゲルの染色
足礁の生検皮膚とKeratinaseの反応
通常使用されるCoomassie
[I. Cryostat生標本とKeratinaseの反応．
用いて染色した．
結 果
にCryostat標本を作成し，これに28mM
1 . Gel
buffer,PH 7.8
ものを重層し,
を施した.
1ml
中にKeratinase
66K.U･加えた
37 °C・20分間反応させた後,
ControlにはKeratinase無添加の28mM
H-E染色
fiber分解像を比
Brillant Blue R-250
生検時に得た人間の足熊皮膚を直ちに0.5μの厚さ
phosphate
fiber を
filtration万により精製されたKeratI:−:・se
のDisc電気泳動像（図３） レ
清等の報告11）ではＭ.
canis 産生のKeratinaseは
Disc泳動上２本のバソドとして認められ，それぞれの
phosphate buffer のみを重層したものを用いた.
バソドにKeratinase活性が証明されたが，今回の結果
2.
では単一のバンドとして染色された
Block生標本とKeratinaseの反応
を
人表皮細胞ことに角質に対するヶラチナーゼの作用について
121
図３．精製されたKeratinaseのDisc電気泳動像．
2.
Cryostat標本に対する反応（図4）
Keratinaseと20分間反応させた標本では，有斡細胞
は全て消化され消失していた．角質層についても細胞質
図4
は消失され，綱目状に細胞膜が残存しているのみであっ
有煉細胞は全て消失し，角質細胞は細胞膜が網目
た.
状に残存している．
3.
Cryostat標本に対するKeratinaseの反応像．
Blockに対する反応
Block中央部の切片では図５の如く有煉細胞は基底層
が一方，３時間Keratinaseと反応させた後では右側の
に接して水庖又は裂隙を形成し，あたかもAcantholysis
泳動像の如く，これら６本の構成々分のうち５本は完全
様に細胞間の結合が解離している像が認められた．又，
に消化さていた．
同部のＰＡＳ染色では水庖底，すなわち真皮側にPAS
考 按
陽性物質が線状に認められた（図６）．一方Blockの
白癖菌による感染が成立する以前に，まず白癖菌が何
端の部の切片では図７の如く有斡細胞は消失し，角質細
等かの原因により皮表に取りつかねばならない．この機
胞も細胞質の多くが消化され染色性が薄れCryostat標
序について詳細は明らかにされていないが，外傷等によ
本におけると略同様の像を示した図８にBlock標本
り角質層が傷つけられた状態にあることが必要とされて
のControl像を呈した.
いる12)ひとたび取りついた白癖菌が角質層内へ侵入し
4.
感染が成立する機序については，自癖菌が角質を物理的
Keratin
fiber に対する反応
Ａ）上清中に生じるアミノ酸量
な力により破壊してくいくとする説と，白癖菌の産生す
図９に示した如く,
る酵素等の化学的な力によるとする二者の説が認められ
Keratinaseの作用によってKeratin
fiberが可溶化され上清中に生じてくるアミノ酸は，約
る13)物理的な力によるとする前者の説の巾でRaubits-
１時間後には750nmにおけるO.D.が0.21と急速に上
chek等14)は，白癖菌はその栄養源をKeratinそのもの
昇し，その後６時間迄プラトーとなった．
でなく，可溶性の非Keratin物質(遊離アミノ酸やア
Ｂ）沈澄のSDS電気泳動像（図10）
ミノペプタイド)にかよっているのであろうと推則して
反応Ｏ時間では左側の泳動像の如く正常なKeratin
いる．一方，化学物質にたより栄養源を得ているとする
肋ｅrの構成々分である６本のバンドが染められている
後者の説では，毛髪に穿孔した菌糸の周辺部位のみの溶
122 樋口 道生ほか
図５．皮膚Blockに対するKeratinaseの反応像Blockの中央部の所見で基底層に接して水
庖，裂隙を形成し，細胞問は解離している．
図６．第５図のＰＡＳ染色像．水庖底，即ち真皮側にPAS陽性物質を認める
123
人表皮細胞ことに角質に対するケラチナーゼの作用について
図７．皮店Block角質に対するKeratinaseの反応像Blockの端の部の所見で，有輯細胞はす
でに消失し角質細胞は細胞質が消化され染色性が薄くなっている．
解像が蛍光法により観察されることにより，白癖菌は毛
される角質を消化出来ないという矛盾したものであっ
髪を溶解する物質(おそらく酵素)を積極的に放出し消化
た．
を行ってトると州則している15)二れに関しては叉，電
今回の著者等の結果は,
㈲的にも菌糸が角質細胞を貫いてトるという報告16)17Jも
niseは極めて短時間に角質細胞の細胞質を消化した
認められている．これら後者の説では白鮮菌は栄養源の
しかしながら細胞膜が部分的にせよ人工的に破壊され，
１つとして Keratinそのものを化学的に処理し利用し
細胞質が露出している状態にあるCryostat標本の結果
Cryostat切片においてKerati-
ていると推則される．
からは，はたしてKeratinaseが正常な角質細胞膜を通
この化学物質の１つであろう Keratinaseについて，
過し細胞質を消化出来るか否かにつトて解折することは
Ｙｕ等4)はTrichophyton mentagrophytes よりのKerati-
出来ない．この点に関しては，生検皮膚を切片にせず小
naseをモルモツIヽの毛と反応させ，髄質は完全に消化
塊のままKeratinase溶液に浸して反応させた後，連続
し，皮質にも多数の破裂が生じたと報告している．しか
しKeratinaseが人開の角質細胞，又はKeratin
切片を作成したBlock標本の結果も細胞質の多くは消
fiber
化され，細胞膜が網目状に残存していたというCryostat
そのものを消化することが可能であるか否かについての
標本における結果と類似したものであった．即ち，
直接的な証明はなされてトないDobson等5)はKerati-
Cryostat標本の所見からは少くとも細胞膜の保護がなけ
nase と皮膚を反応させた結果，短時間の反応では表
れば，細胞質はKeratinaseにより容易に消化され得る
皮・真皮開の結合が剥れ裂隙が生じ，裂隙の周囲の有縁
という結果を得たが，細胞膜自体に対する効果は半U然と
細胞には空胞か生じる，更に長時間の反応では有縁細胞
されなかった．しかしながらBlockを用いた実験では
はAcantholysis様の変化を示したとはいうものの，角
一見正常そうに光顕下にみえる細胞膜内の細胞質も消化
質屑には変化を及ばさない，又in
されていることは明らかである．これは，光顕的には明
vivo における反応で
乱Keratinaseは正常な角質層の存在下では有棟細胞に
白でないにせよKeratinaseは角質細胞膜のどこかの部
影響を及ぼＵ与なかったと論じている．従ってDobson
位を消化破壊し細胞内に侵入して消化をおこなったもの
等の結果はKeratinaseはKeratinにより主として構成
と想定される．又,実際に分離,精製したKeratin
fiber
124
樋口 道生ほか
３
０
２
０９１↑︻︼
Ｏ
Ｅｃ
Q
0. I
Ｃ5
1 3 6
図9
KeratinaseによりKeratin
hrs
fiber から可溶化
されるアミノ酸量の経時的な変化．
￨刈８．皮膚BlockのControl像(H-E染色)．
を川いた実験ではKeratinaseは極めて効率良く角質細
胞内の主嘆成分である線紐を消化することが明らかと
なった．尚，この角質細胞膜の消化過程に関してはさら
に詳細な電顕による観察や，細胞膜を抽出しKeratinase
と反応させる等の直接的な証明が今後必要であろう．
今日なおKeratinについての定義は定ってはおら
ず，狭義にはKeratin
fiber そのものと解釈され，広
川10. Keratin fiber をKeratinaseと反応させた後
のDSS電気泳動像．左側のゲルは反応直後のも
のでKeratin
fiber を構成するＧ本のバンドが認
められるが，右側の３時間反応させた後のゲルで
は１本を残し５本のバンドが消失している．
義には細胞間物質，細胞膜さらには線組[司を埋めるセノ
ソト様物質をも含むとトわれている18≒トずれにせよ，
水庖を形成する，しかもこの水泡はＰＡＳ染色により基
これを含めることに異議のないKeratin
底膜が水庖底に証明されたことにより表皮内水庖である
fiber そのも
のに対してのKeratinaseの反応態度は，反応液中にア
ことが確かめられた．又，有辣細胞以下のLiving部に
ミノ酸が遊離されてくること，反応後の沈読についての
おいて，核も細胞膜も含めて細胞は全て変性して認めら
SDS電気泳動上で正常のKeratin
れた．これらの結果を臨床面と比較すると，自癖患者に
fiber を構成する６
本の分子鎖のうち，分子量か約49,000と最も低分子の分
肉眼的又は顕微鏡的にほぼ必らず生じる小水痘を思わし
子鎖19)を残し極めて短時間に他の５つの分子鎖を消化し
める．一方Keratinaseの作用は有煉細胞以下の深層の
たという今回のこれらの結果より明白となった．即ち，
組織も消化出来るにもかかわらず，自癖菌が有韓細胞以
KeratinaseがKeratin
下のLiving部内へ容易に侵入出来ず，宿主の死亡によ
fiberそのものを消化する能力を
有することは明らかである.
りたちどころに侵入していく2o)のは何故かとの疑問が残
Block標本の所見より，先ず基底膜近くに裂隙さらに
る．この問題に関してはBlank2o)や筆者等3)の報告の如
125
人表皮細胞ことに角質に対するケラチナーゼの作用について
く,
Keratinaseに対する血清中の自然阻害物質，たとえ
月）にて口演した．
ばα2マクログ￨=･プリン等が生体側の防禦因子として関
実験にあたり詳しく御教授いただきました順天堂大学
与しているのであろう．
皮膚科小川秀興助教授に深く感謝申しあげます．
本稿の要旨は，第23回日本医真菌学会総会(1979年10
文
献
１）滝内石夫：真菌におけるKeratinase産生に関
する研究，真菌と真菌症，14
head
: 191-196,
2）滝内石夫，樋口道夫:Microsporum
1973.
gypseum
の
産生するケラチナーゼの分離，精製ならびにそ
: 305-
1977.
gypseum
の
一分離株が産生する菌体外ケラチナーゼに対す
るイソヒビターについて，真菌と真菌症，21
101―108,
Yu,
:
1980.
R.J.,
by
S.R.
ａ
mentagrophytes,
&
Blank,
keratinase
of
j. Invest.
Derm.,
F.: Hair
Trichophyton
53:
166-171,
Yu,
&
Bosley,
131-133,
RJ.,
S.R.
of
Trichophyton
1435-1436,
7)
effect
J.
an
&
Blank,
F.:Isolation
extracellular
&
H.
&
Hattori,
of fibrous
O.H.,
Randall,
the
J.
protein
phenol
reagent,
N.J.,
Scientific
14)
Raubitschek,
15)
Verma,
in
by
16)
Mercer,
Farr,
measurement
J. Ｂｉｏ!.Chem.,
Favre,
M.:Maturation
Brit.
Verma,
Derm.,
B.S.: Hair
78:
digested
1963.
H･,
Seiji, M.
study
&
on
Takaki,
fungi
Y.: Elec-
in
horny
layer.
18）小川秀興：やさしい生化学（Ⅲ）．ケラチン・
ケラチナイゼーショソと角化異常症，西日皮
膚，42
:
455-463,
1980.
with
知見を中心としてー，皮膚，21
193:
20)
of the
J.
micropenetra‘
mentagropＶｒytｅs，Ａｒch. Ｄｅｒｍ.，
19）小川秀興：角化異常症の生化学的解析一最近の
19阻
hair
Ｄｅｒｍａt.,
" 76-. ２６５-271, 1966.
Blank,
79:
&
&
357-360,
Miyazaki,
infections
U.K.
E.H.
H。Sagami,
Jｒ.: The
818-823,
vitro
A.L.
1951.
:
of fluorescence
of in
fungi,
Trichophyton
ＪホＪ.
(1980).
1979,
1966.
tronmicroscopic
and
use
study
ringworm
Bad.,
of stratum
Oxford,
F.: -13)より引用.
the
222-224,
87:
96:
Publications,
B.S.: The
酵素，11
Laemmli,
1979.
779.
9）永井 裕；ディスク電気泳動法，蛋白・核酸・
10)
: 49-53,
A.: Ｔｅχtbook ｏｆＤｅｒｍａtｏｌｏｇｙ，Third
Ed.,
Blackwill
17)
M.: Isolation
Rosenbrough,
RJ.: Protein
Folin
265-273,
1973･
26-27.
Rook,
keratinase
corneum.Ａｒch，Ｄｅｒｍａｉｏｌ. Ｒｅｓ., ｉｎpress
Lowry,
Lれ･vest.
1968. ，
Ogawa,
packaging
13)
by
mentagrophytes,
characterization
8)
of
1963.
Harmon,
purification
of
L.: The
on human epidermis,
Ｄｅｒｍ.,41:
and
l.DNA
575-599,
昭51,
tion
R.L.
keratinase
6)
ついて，昭和医誌，39
scopy
1969.
Dobson,
T4.
･･，80:
11）清 佳浩，樋口道生，滝内石夫:Microsporum
pp-
Harmon,
digestion
5)
A型．及
12）宮崎寛明：水虫の療法，１版，金原出版，東京，
3）樋口道生，滝内石夫:Microsporum
4)
bacteriophage
J.
caisの産生するKeratinaseの生化学的性状に
の生化学的性状について，日皮会誌，87
309,
of
events,
: 5-14,
S., Boyd,
pathogenesis
in
524-535,
cultured
1959.
C.
&
of superficial
human
昭54.
Roth,
F.J.
fungous
skin， Ａｒch，Ｄｅｎ.，