九州工業大学学術機関リポジトリ"Kyutacar"

九州工業大学学術機関リポジトリ
Title
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Issue Date
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分子選択的結合性に着目した非天然アミノ酸の抗体及び
トリプシン様酵素との相互作用に関する研究
畑中, 美博
2014
http://hdl.handle.net/10228/5271
Rights
Kyushu Institute of Technology Academic Repository
平 成 ２５年 度 博 士 論 文
分 子 選 択 的 結 合 性 に着 目した非 天 然アミノ酸 の
抗 体 及 びトリプシン様 酵 素との相 互 作 用 に関 する研 究
畑中 美博
主指導教官 ： 春山 哲也 教授
国立大学法人 九州工業大学大学院
第 1 章 序 論 ······································································ 1
1.1 はじめに ······································································· 3
1.2 分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の設 計 手 法 ······································ 4
1.2-1 ランダムな設 計 手 法 ···················································· 4
1.2-2 合 理 的 （ラショナル）な設 計 手 法 ······································ 5
1.2-3 ランダムな設 計 とラショナルな設 計 のメリットとデメリット ··············· 5
1.3 分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 としての天 然 アミノ酸 と非 天 然 アミノ酸 ········· 8
1.4 アフェレシス療 法 ···························································· 10
1.4-1 アフェレシスの方 法 ···················································· 12
1.4-2 吸 着 方 式 ······························································· 12
1.4-3 血 液 吸 着 療 法 （Hemoadsorption: HA） ··························· 15
1.4-4 血 漿 吸 着 療 法 （Plasma adsorption: PA） ························· 15
1.5 抗 体 を吸 着 する吸 着 材 ···················································· 17
1.5-1 抗 体 について ··························································· 17
1.5-2 抗 体 を吸 着 する吸 着 カラムの開 発 ··································· 19
1.6 イムソーバの開 発 ··························································· 20
1.6-1 イムソーバの自 己 抗 体 吸 着 機 構 ······································ 25
1.6-2 吸 着 材 における分 子 選 択 的 結 合 性 を測 定 する評 価 方 法 ········· 27
1.6-3 イムソーバの課 題 －フィブリノーゲン吸 着 性 － ······················· 27
1.6-4 改 良 イムソーバのリガンドが非 天 然 アミノ酸 であることの利 点 ······· 28
1.7 トリプシンについて ··························································· 29
1.7-1 トリプシン様 酵 素 について ············································· 29
1.8 酵 素 反 応 速 度 論 における分 子 選 択 的 結 合 性 ··························· 31
1.8-1 酵 素 反 応 速 度 式 ――ミカエリス・メンテンの式 ······················· 31
1.8-2 動 力 学 パラメーター K m と V max、 k cat の意 味 ···················· 32
1.8-3 Km と Vmax の求 め方 ――Lineweaver-Burk プロット ··········· 33
1.8-4 トリプシンによるパラグアニジノフェニルアラニンの加 水 分 解 ········ 34
1.9 本 研 究 の目 的 と意 義 ························································ 36
参 考 文 献 ········································································· 38
第 ２章 天 疱 瘡 自 己 抗 体 を吸 着 する天 然 ・非 天 然 アミノ酸 を基 にしたリガンド
のスクリーニング ·································································· 45
１．はじめに ······································································· 47
２．材 料 と方 法 ···································································· 51
2.1 材 料 ······································································· 51
2.2 吸 着 材 ライブラリーの調 製 ·············································· 51
2.3 Batchwise 法 による吸 着 材 ライブラリーのスクリーニング ············· 54
2.4 カラム・フローによる吸 着 実 験 ··········································· 54
2.5 天 疱 瘡 自 己 抗 体 およびその他 の血 漿 蛋 白 質 レベルの測 定 ········· 54
2.6 統 計 分 析 ·································································· 54
３．結 果 と考 察 ···································································· 55
3.1 天 疱 瘡 自 己 抗 体 用 の吸 着 材 ライブラリーのスクリーニング ············ 55
3.2 天 疱 瘡 自 己 抗 体 のカラム・フロー吸 着 試 験 ···························· 58
3.3 IgG サブクラスの吸 着 特 異 性 ··········································· 60
４．結 論 ············································································ 65
参 考 文 献 ········································································· 66
第 ３章 チエニルアミノ酸 をリガンドとするフィブリノーゲン吸 着 を抑 制 した選 択
的 IgG、IgM 抗 体 の吸 着 材 ···················································· 71
１．はじめに ······································································· 73
２．材 料 と方 法 ···································································· 75
2.1 血 液 血 漿 収 集 ···························································· 75
2.2 吸 着 材 の調 製 ···························································· 75
2.3 リガンド固 定 化 ···························································· 76
2.4 カラム吸 着 実 験 ·························································· 76
2.5 分 析 ······································································ 76
2.6 統 計 解 析 ································································· 77
３．結 果 と考 察 ···································································· 77
3.1 アルブミンの吸 着 ························································· 79
3.2 IgG の吸 着 ······························································· 81
3.3 フィブリノーゲンの吸 着 ··················································· 84
3.4 IgM の吸 着 ······························································· 86
3.5 IgG / Fbg および IgM / Fbg ··········································· 88
４．結 論 ············································································ 90
参 考 文 献 ········································································· 92
第 ４章 パラグアニジノフェニルアミノ酸 誘 導 体 と Streptomyces griseus トリ
プシンとの相 互 作 用 ······························································ 95
１．はじめに ······································································· 97
２．材 料 と方 法 ···································································· 99
2.1 基 質 ········································································ 99
2.2 酵 素 ······································································ 101
2.3 速 度 論 的 解 析 ·························································· 101
３．結 果 と考 察 ·································································· 102
3.1 エステル基 質 の加 水 分 解 ·············································· 102
3.2 アミドおよびアニリド基 質 の加 水 分 解 ································· 106
４．結 論 ·········································································· 110
参 考 文 献 ······································································· 111
第 ５章 エールリッヒ腹 水 癌 移 植 マウス腹 水 中 のパラグアニジノフェニルアラニ
ンに特 異 的 な新 しいセリンプロテアーゼ ······································ 115
１．はじめに ····································································· 117
２．材 料 と方 法 ·································································· 119
2.1 エールリッヒ腹 水 癌 細 胞 移 植 マウスの腹 水 および癌 細 胞 の調 製 ·· 119
2.2 ヒトの癌 細 胞 および腹 水 の調 製 ······································ 119
2.3 アミノ酸 およびペプチド基 質 ··········································· 119
2.4 酵 素 活 性 の測 定 ······················································· 119
３．結 果 と考 察 ·································································· 120
3.1 GPA と Arg を含 むバラニトロアニリド基 質 に対 する基 質 特 異 性 ··· 120
3.2 各 種 阻 害 剤 による影 響 ················································· 124
４．結 論 ·········································································· 130
参 考 文 献 ······································································· 131
第 ６章 結 論 ···································································· 133
謝 辞 ············································································· 138
研 究 業 績 一 覧 ·································································· 139
第１章
序論
1
2
1.1
はじめに
生 体 系 においては DNA や RNA はいうまでもなく、酵 素 と基 質 、阻 害 剤 、抗
体 と抗 原 、リガンド・レセプターによる細 胞 内 反 応 など核 酸 やタンパク質 などの高 分
子 による高 分 子 の認 識 や、ATP などの低 分 子 による認 識 がある。すなわち“分 子
認 識 ”が生 体 や生 体 成 分 の構 造 の形 成 や機 能 の発 現 、さらには生 命 の維 持 に重
要 な働 きをしている。このような生 体 系 で行 われているような分 子 認 識 を合 成 系 で
発 現 させるべく、多 くの研 究 が行 われている。すなわち、生 体 内 で起 こる、抗 原 抗
体 反 応 、酵 素 と基 質 反 応 、リガンド・レセプター反 応 などの分 子 選 択 的 結 合 のしく
みを利 用 した、センサー素 子 、プローブ素 子 、薬 剤 などの分 子 選 択 的 結 合 性 分 子
の開 発 が盛 んに行 われている。 1 - 3 )
本 論 文 中 でいうところの分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 とは、例 えば、リガンド・レセプ
ター の 分 子 認 識 で は、 概 ね小 さいほ うの 分 子 、 す なわ ちリ ガン ドが 分 子 選 択 的 結
合 性 分 子 に該 当 する。又 、酵 素 と基 質 の場 合 では、基 質 が分 子 選 択 的 結 合 性 分
子 となる。
分 子 選 択 的 結 合 に 関 わる力 としては、1)静 電 相 互 作 用 、2)イオン－双 極 子 相
互 作 用 、3)双 極 子 －双 極 子 相 互 作 用 、4)双 極 子 －誘 起 双 極 子 相 互 作 用 、5)水
素 結 合 、6)van der Waals 相 互 作 用 、7)疎 水 相 互 作 用 、8)π-π 相 互 作 用 が挙
げられる。これらの力 が分 子 間 で相 互 に働 いて分 子 選 択 的 結 合 が行 われており、
分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の設 計 に際 しては、これらの力 を考 慮 する必 要 がある。
本 論 文 では、第 1 章 で、分 子 選 択 的 結 合 に関 する概 論 及 び分 子 選 択 的 結 合
分 子 の設 計 手 法 について概 説 し、さらに、非 天 然 アミノ酸 からなる低 分 子 化 合 物
による分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 設 計 の重 要 性 について、医 療 用 デバイスである血
液 体 外 循 環 用 の自 己 抗 体 吸 着 材 と消 化 酵 素 であるトリプシン様 酵 素 の基 質 を例
に挙 げて述 べる。
3
1.2 分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の設 計 手 法
リガンド・レセプターのリガンドや酵 素 に対 する基 質 などの分 子 選 択 的 結 合 性 分
子 の設 計 手 法 としては、標 的 分 子 の構 造 などの情 報 がない場 合 は、1)ランダムな
化 合 物 群 から選 択 してくる方 法
4 ) , 5 ) や抗 体 などを作 製 する方 法 6 ) があり、ある程 度
の情 報 がある場 合 には、2)合 理 的 な設 計 手 法 をとるという大 きく２つの手 法 がある
(図 1-1)。以 下 、特 に 2 つの化 学 的 な手 法 について述 べる
1.2-1
ランダムな設 計 手 法
ランダムな化 合 物 群 から選 択 する手 法 のうち、化 学 的 な手 法 としては、コンビナ
トリアルケミストリーによる手 法 が挙 げられる。例 えば、H. Mario Geysen ら ４ ） は、
コンビナトリアルケミストリーの創 成 期 にスプリット・ミックス法 （N-mix 法 ）N-mix 法 と
呼 ばれる、固 相 合 成 法 を利 用 したペプチドライブラリーの構 築 法 を確 立 した。この
ペプチドライブラリーは抗 原 提 示 やレセプター結 合 でスクリーニングするのであれば
ELISA 法 などを利 用 することによって、固 相 担 体 上 のペプチドを利 用 してアッセイ
することが可 能 である。すなわち、担 体 から試 料 のペプチドを切 り出 さずに、アッセ
イに反 応 した担 体 粒 子 を拾 い 上 げ、そしてその担 体 粒 子 のペプチドをペプチドア
ナライザーで目 的 のペプチド配 列 を決 定 することができる。
生 物 学 的 手 法 としては、ファージディスプレイ（Phage display）等 を用 いて、目
的 のペプチド配 列 を取 得 することができる。ファージディスプレイとは、タンパク質 間
相 互 作 用 あるい はタ ン パク質 と その 他 標 的 物 質 と の 相 互 作 用 を 検 出 する 方 法 の
一 つであり、バクテリオファージに遺 伝 子 を組 み込 んでその表 面 にペプチドを発 現
させ、標 的 との結 合 を指 標 として相 互 作 用 を検 出 する手 法 である ５ ） 。又 、近 年 、創
薬 の分 野 では、莫 大 な量 の ランダムな化 合 物 群 からスクリーニングする、いわゆる
ハイスループットスクリーニング（HTS）の手 法 によってリード化 合 物 を取 得 するとい
うことも盛 んに行 われている
7)。
4
1.2-2
合 理 的 （ラショナル）な設 計 手 法
合 理 的 な設 計 手 法 とは、 自 然 界 で行 わ れている 分 子 認 識 、例 え ば、 抗 原 ―抗
体 反 応 であれば、抗 原 を認 識 する抗 体 の認 識 部 位 をリガンドとして設 計 したり、あ
るいは、酵 素 と基 質 であれば、酵 素 が認 識 する基 質 の P1 サイトのアミノ酸 やペプ
チドをそのままリガンドとしたり、あるいは修 飾 したりして設 計 する手 法 である。すな
わち、現 時 点 でわかっている生 体 分 子 が認 識 している部 位 の配 列 や化 学 構 造 を
利 用 してリガンドや基 質 などの分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 を設 計 するという手 法 であ
る。
近 年 では、X 線 解 析 技 術 の進 歩 も相 まって、合 理 的 な設 計 手 法 で分 子 選 択 的
結 合 性 分 子 を開 発 した例 もいくつか報 告 されている
1.2-3
8)。
ランダムな設 計 とラショナルな設 計 のメリットとデメリット
1.2-1、1.2-2 でランダムな設 計 手 法 とラショナルな設 計 手 法 について概 説 した。
それぞれの手 法 については、当 然 ながらメリットとデメリットがある。
ランダムな設 計 手 法 では、莫 大 な量 の化 合 物 や分 子 をスクリーニングするので、
分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の候 補 化 合 物 （分 子 ）としてヒットする確 率 が高 いというメ
リットがある。一 方 、ペプチドライブラリーでは、アフィニティは高 い分 子 が取 得 できる
可 能 性 はあるものの、ペプチドは、比 較 的 大 きな分 子 であり、例 えば、血 液 体 外 循
環 用 の吸 着 材 の分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 （リガンド）として、実 際 に血 液 中 で使 用
する場 合 には、タンパク分 解 酵 素 などで分 解 されたり、製 品 の滅 菌 によって分 解 し
たり変 性 したりする可 能 性 が高 いというデメリットがある。又 、ペプチドは残 基 数 にも
よるが、決 してコストも安 くはない。一 方 、大 量 の化 合 物 群 から選 択 する HTS の場
合 には、リード化 合 物 としては選 択 される可 能 性 はあるが、その後 、分 子 の最 適 化
が必 要 になり、なんといっても大 量 の化 合 物 群 を準 備 するだけで非 常 にコストがか
かってしまうというデメリットがある。
5
ラショナルな設 計 手 法 では、そこに分 子 選 択 的 結 合 のお手 本 があるので、分 子
選 択 的 結 合 を担 っている構 造 を模 倣 したり、類 似 物 質 を適 用 することで比 較 的 簡
単 に設 計 できるというメリットがある。特 に低 分 子 化 合 物 であれば、分 子 設 計 はかな
り簡 単 になる。但 し、この場 合 は、タンパク質 などの高 分 子 で認 識 するものではない
ために、分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 としてのアフィニティが低 くなる可 能 性 があること
がデメリットである。
資 金 が余 りあるという状 況 や医 薬 のように研 究 に投 資 した金 額 を後 に十 分 に回
収 できる目 途 があれば、ランダムな化 合 物 群 から選 択 するという手 法 は十 分 に考 え
られる。しかしながら、研 究 への投 資 資 金 力 がない場 合 や、投 資 金 額 に見 合 った
回 収 が望 めなければ、ランダムな化 合 物 群 からの選 択 は行 うべきではない。すなわ
ち、 研 究 の最 終 目 的 が 何 か、又 、 目 標 とする開 発 製 品 が 何 か、研 究 への投 資 金
額 と回 収 できるであろう金 額 とを熟 慮 した上 で、分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の設 計 、
研 究 開 発 は行 う必 要 がある。
本 論 文 では、目 標 とする分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の利 用 分 野 が医 薬 とは異 なり、
医 療 用 デ バイスであ る血 液 体 外 循 環 用 の抗 体 吸 着 材 のリ ガンドの 開 発 や 簡 便
かつ 安 価 な酵 素 の 基 質 の 開 発 及 び その 利 用 を 目 指 して いる。 その ため、 合 理 的
（ラショナル）な設 計 手 法 を取 ることが最 良 であるとの立 場 をとり、特 に非 天 然 アミノ
酸 骨 格 に着 目 した、分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の設 計 及 びそれらの抗 体 並 びにトリ
プシン様 酵 素 との相 互 作 用 について論 ずる。
6
図 1-1 分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の設 計 手 法
7
1.3
分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 としての天 然 アミノ酸 と非 天 然 アミノ酸
アミノ酸 は、アミノ基 とカルボキシル基 を有 する有 機 化 合 物 であり、天 然 アミノ酸
と非 天 然 アミノ酸 に分 類 される。主 な天 然 のアミノ酸 は、２０種 類 のアミノ酸 に分 類
され、タンパク質 を構 成 する基 本 単 位 である。これらは、生 体 内 におけるプロテアー
ゼ等 の酵 素 やシグナル伝 達 におけるレセプターが認 識 する基 質 やリガンドの主 要
なアミノ 酸 やその周 辺 のアミノ 酸 配 列 、その高 次 構 造 を 形 成 するための重 要 な役
割 を果 たしている。
近 年 では、天 然 のアミノ酸 を化 学 修 飾 した非 天 然 のアミノ酸 を用 いて、プロテア
ーゼ等 の酵 素 と非 天 然 アミノ酸 を有 する基 質 との相 互 作 用 を解 析 したり、レセプタ
ー－リガンドの相 互 作 用 を解 析 したり、その解 析 結 果 を基 にした創 薬 研 究 におい
ても、非 天 然 アミノ酸 の重 要 性 が高 まってきている。 9 ) - 1 2 )
非 天 然 アミノ酸 は、その構 造 の多 様 性 や置 換 基 選 択 の自 由 度 が極 めて高 いた
めに、コンビナトリアルライブラリー構 築 におけるキラルビルディングブロックや分 子
スキャフォールドとしても広 く利 用 されている。又 、治 療 薬 としてペプチドミメティック
スやペプチドアナログに組 み込 まれることにより、創 薬 の強 力 なツールとなっている
1 3 ) , 14 ) 。
さらに、分 子 プローブや酵 素 の基 質 として利 用 することにより、生 態 系 シス
テムの機 能 の研 究 にも有 用 であることが知 られている
15),16)。
又 、アミノ酸 やその
誘 導 体 は、創 薬 研 究 のみならず、医 療 機 器 の分 野 でも用 いられており
17 ) , 1 8 ) 、とり
わけ、近 年 では、血 液 体 外 循 環 用 の治 療 用 吸 着 材 のリガンドへの応 用 も模 索 され
ている
19 - 2 1 ) （図
1-2）。
分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 としての非 天 然 アミノ酸 の有 用 性 について、医 療 用 デ
バイスである血 液 体 外 循 環 用 （アフェレシス用 ）の抗 体 吸 着 材 用 のリガンドとタンパ
ク分 解 酵 素 であるトリプシン様 酵 素 の基 質 を例 にとって以 下 に述 べる。
8
図 1-2 天 然 アミノ酸 ／非 天 然 アミノ酸 の活 用
9
1.4
アフェレシス療 法
アフ ェ レシス（apheresis ）と は、 ギリ シア語 で「 分 離 」 を 意 味 す る 言 葉 であるが、
現 在 では、アフェレシス療 法 は、体 外 循 環 によって血 液 中 から血 漿 成 分 、細 胞 成
分 を分 離 する、さらには分 離 した血 漿 成 分 から病 気 の原 因 となる液 性 因 子 を分 離
することをさすようになってきている（図 1-3）。具 体 的 には液 性 因 子 は抗 体 、炎 症
性 サイトカイン、代 謝 物 質 、中 毒 物 質 などをさし、細 胞 成 分 はリンパ球 、顆 粒 球 をさ
す。古 くは、アフェレシスというよりもプラスマ（plasma）とアフェレシス（aphereis）の
合 成 語 であるプラスマフェレシス（plsamapheresis）（血 漿 分 離 ）が一 般 的 であり、
血 液 から血 漿 を分 離 し、分 離 血 漿 を廃 棄 し、その後 、廃 棄 血 漿 と同 量 のヒト凍 結
新 鮮 血 漿 で置 換 する血 漿 交 換 療 法 が主 な治 療 法 であった。
しかしながら、近 年 では分 離 血 漿 中 からさらに高 分 子 物 質 、中 分 子 物 質 などを
膜 濾 過 や吸 着 などの技 術 を用 いて分 離 除 去 したり、血 液 中 からリンパ球 や顆 粒 球
を吸 着 除 去 するなど、血 漿 の交 換 を必 要 としない新 しい分 離 技 術 を用 いた治 療 法
が開 発 されてきている
1 7 ) , 1 8 ) ,2 2 ) , 2 3 ) 。
10
図 1-3 アフェレシス療 法 における血 液 の分 離
11
1.4-1
アフェレシスの方 法
血 液 から血 漿 成 分 と血 球 成 分 を分 離 する方 法 には、遠 心 分 離 、膜 分 離 法 があ
り、国 内 では、膜 分 離 によるプラスマフェレシスが一 般 的 となっている。とりわけ、吸
着 療 法 については、膜 によって分 離 された血 漿 を吸 着 材 によって処 理 する方 法 と、
直 接 、血 液 を 吸 着 材 に通 過 させ、病 因 物 質 を 除 去 する方 法 の二 つ がある。以 下
にその二 つの吸 着 方 式 についての概 略 を示 す。
1.4-2
吸着方式
吸 着 療 法 は 様 々 な 吸 着 剤 に 全 血 を 潅 流 す る 直 接 血 液 潅 流 法 （ Direct
hemoperfusion: DHP ） と 分 離 血 漿 を 潅 流 す る 血 漿 潅 流 法 （ Plasma
perfusion: PP）に大 別 され、それぞれの成 分 中 に含 まれる病 因 （関 連 ）物 質 を吸
着 除 去 する（図 1-4、図 1-5）。さらに最 近 では治 療 特 性 を明 確 にするうえで血 液
吸 着 療 法 、血 漿 吸 着 療 法 さらに吸 着 式 血 球 成 分 除 去 療 法 に分 類 されている。ま
た一 般 に吸 着 療 法 ではカラムにより病 因 （関 連 ）物 質 に対 する吸 着 能 に差 がある
ため、一 定 の処 理 量 を規 定 することは困 難 であり、病 態 に応 じた対 応 が必 要 となっ
てくるのが現 状 である。
12
図 1-4 直 接 血 液 潅 流 法
13
図 1-5 血 漿 潅 流 法
14
1.4-3
血 液 吸 着 療 法 （Hemoadsorption: HA）
血 液 吸 着 では血 液 中 に抗 凝 固 剤 注 入 後 、直 接 吸 着 カラムへ還 流 し、病 因 （関
連 ）物 質 を除 去 した後 に体 内 へ戻 される。HA に用 いられる吸 着 剤 としては治 療 目
的 により（1）活 性 炭 （DHP-1、ヘモソーバ、ヘマックス、ヘモカラム） 24 ) 、（2）ポリミキ
シン B 固 定 化 吸 着 剤 （トレミキシン） 2 5 ) 、（3）ヘキサデシル基 固 定 化 セルロースビー
ズ（リクセル） 26 ) などが挙 げられる。（表 1-1）
1.4-4
血 漿 吸 着 療 法 （Plasma adsorption: PA）
血 漿 吸 着 療 法 は 血 漿 分 離 膜 で分 離 さ れ た病 因 （ 関 連 ） 物 質 を 含 む 血 漿 成 分
は各 種 吸 着 カラムで病 因 （関 連 ）物 質 を除 去 した後 、血 球 成 分 とともに体 内 へ戻 さ
れる。現 在 、活 性 炭 をはじめとして疎 水 的 相 互 作 用
1 7 ) , 1 8 ) , 2 4 ) 、静 電 的 相 互 作 用
2 7 ) , 28 ) 、抗 原 抗 体 反 応 2 9 ) などを利 用 した吸 着 材 ・吸 着 カラムが開 発 されており、各
種 病 態 に対 して使 用 されている（表 1-2）。
15
表 1-1 血 液 吸 着 療 法 （HA）における吸 着 材
表 1-2 血 漿 吸 着 療 法 （PA）における吸 着 材
16
1.5
抗 体 を吸 着 する吸 着 材
1.5-1 抗 体 について
一 度 感 染 した病 気 には再 びかかりにくいシステムのことを免 疫 という。免 疫 は自
己 以 外 の異 物 （抗 原 ）の侵 入 を防 ぐ生 体 防 御 の重 要 なシステムである。このことか
ら免 疫 系 の働 きは“自 己 と非 自 己 との識 別 ”といわれている。免 疫 系 は高 分 子 の
侵 入 者 にしか働 かないという点 が重 要 であり、高 分 子 を特 異 的 に認 識 するというこ
とが特 徴 である。免 疫 を司 る重 要 なタンパク質 は抗 体 分 子 である。抗 体 分 子 に は
lgG、lgM、lgA、lgD、lgE などいろいろな種 類 があるが、基 本 的 な構 造 単 位 であ
る lgG の構 造 を図 1-6 に示 す。 lgG は分 子 量 約 5 万 の重 鎖 （H 鎖 ） 2 本 と
分 子 量 約 2 万 5 千 の軽 鎖 （L 鎖 ） 2 本 と若 干 の糠 鎖 からなる複 合 タンパク質
である。 lgG は Y の字 または、T の字 型 をした分 子 で分 子 の先 端 部 分 に抗 原
結 合 部 位 を有 し、この部 分 で抗 原 （ポリマー）の一 部 を認 識 する。この部 分 は無 数
の抗 原 に 対 応 するために 個 々の 抗 体 により多 様 性 を 示 す 。すなわ ち先 端 部 分 は
可 変 領 域 とよばれ、抗 体 によりアミノ酸 配 列 が異 なる。そのために立 体 構 造 も変 化
し、あらゆる抗 原 を認 識 できる部 位 を形 成 する。
Y 字 の幹 の部 分 は定 常 領 域 といわれ、抗 体 により変 化 せず、アミノ酸 配 列 もほ
ぼ一 定 である。lgG の中 にもさらにいろいろなサブクラスがある。IgM は lgG の 5
量 体 のような構 造 をしており、分 子 量 は約 90 万 にも達 する（図 1-6）。免 疫 初 期
に産 生 される抗 体 で 1 個 の分 子 に多 くの結 合 部 位 を有 するので抗 原 を強 く結 合
する。
免 疫 は外 からきた細 菌 やウイルスに対 して、これを排 除 するようにはたらくが、免
疫 に何 らかの異 常 があると、自 分 の体 や組 織 を異 物 のように認 識 して、自 己 抗 体
をつくり、自 分 の体 を攻 撃 することがある。これを自 己 免 疫 疾 患 という。自 己 免 疫 疾
患 の患 者 に対 しては、自 己 抗 体 （IgG,IgM など）を血 液 体 外 循 環 によって吸 着 材
などで除 去 するという治 療 が行 われている。
17
図 1-6 IgM, IgG の構 造
James N. Arnold et al. J. Biol. Chem. 2005, 280:29080-29087 より引 用
18
1.5-2 抗 体 を吸 着 する吸 着 カラムの開 発
近 年 では、血 漿 中 の抗 体 を選 択 的 に吸 着 するために、リガンドとしてトリプトファ
ン
1 7 ), 1 8 ) , 3 0 ) 、フェニルアラニン 1 7 ) , 1 8 ) ,3 1 ) 、合 成 ペプチド 3 2 ) , 3 3 ) 、プロテインＡ 3 4 ) , 3 5 ) 、
さらには、ヒトＩｇＧに対 するポリクローナルヒツジ抗 体
36)
などを有 した吸 着 材 を用 い
て、血 液 体 外 循 環 （免 疫 吸 着 療 法 ） が行 われ、自 己 免 疫 疾 患 をもつ様 々 な患 者
を治 療 す るために 使 用 され ている。 こ れらの 吸 着 材 は、 例 え ば、 関 節 リウマチ、 特
発 性 血 小 板 減 少 性 紫 斑 病 、 血 友 病 、 全 身 性 エリ テマトーデス、 重 症 筋 無 力 症 、
及 びギラン•バレー症 候 群 などのいくつかの自 己 免 疫 疾 患 の治 療 選 択 肢 として用
いられている。しかしながら、プロテインＡ、合 成 ペプチド及 びポリクローナル抗 体 な
どのようなリガンドを有 する吸 着 材 は、そのリガンドが生 体 分 子 である、もしくは、比
較 的 高 分 子 量 のペプチドであるため、高 価 で血 液 中 の酵 素 による分 解 による影 響
のために不 安 定 であるという欠 点 がある。
一 方 、免 疫 吸 着 器 イムソーバ TR（IM-TR）とイムソーバ PH（IM-PH）（旭 化 成 メ
ディカル社 製 ）は、それぞれ、単 純 なリガンドとして、トリプトファンとフェニルアラニン
を有 している。これらのリガンドは、上 述 したプロテインＡなどのようなタンパク質 性 の
リガンドと比 較 して安 定 で、安 価 である低 分 子 化 合 物 である。したがって、イムソー
バは自 己 免 疫 疾 患 の治 療 のために広 く臨 床 現 場 で使 用 されている。
19
1.6 イムソーバの開 発
イムソーバ TR-350、PH-350 は、図 1-7 に示 すように、多 孔 質 担 体 であるポリビ
ニルアルコールにトリプトファン、フェニルアラニンを固 定 化 した血 漿 吸 着 型 の免 疫
吸 着 器 である
1 7 ) , 1 8 ) 。治 療 の方 法 は、図
1-8 に示 されるように体 外 に取 り出 された
血 液 を膜 によって血 球 と血 漿 を分 離 し、分 離 された血 漿 を吸 着 カラム（イムソーバ）
に通 過 させることによって病 因 物 質 を除 去 することができる。
イムソーバ TR-350、PH-350 は、旭 メディカルが開 発 した非 生 物 学 的 吸 着 材 に
分 類 され、開 発 当 初 はリウマチを対 象 とするものであったが、現 在 では、表 1-3 に
示 される疾 患 に対 して健 保 適 用 となっている。
Yamawaki らは 、 当 時 リ ウマ チ 因 子 を よく 吸 着 す る こと が 知 られ てい た熱 変 成
IgG を解 析 したところ、その表 面 に疎 水 性 アミノ酸 であるトリプトファンが多 数 露 出
していること、このトリプトファンを多 孔 質 担 体 であるポリビニルアルコールに結 合 さ
せた吸 着 材 もリウマチ因 子 をよく吸 着 することを発 見 した
3 7 ) 。また免 疫 複 合 体 も同
時 に 吸 着 さ れ 、 こ の 吸 着 量 を 各 種 の アミ ノ 酸 を 固 定 化 し た 吸 着 材 で 比 較 す る と、
図 1-9 に示 すようにアミノ酸 の疎 水 性 と相 関 のあることが判 明 した。以 上 より、リウマ
チ因 子 、免 疫 複 合 体 の吸 着 性 に優 れたトリプトファンと、トリプトファン固 定 吸 着 材
では凝 固 因 子 フィブリノーゲンの吸 着 性 が強 いため、この吸 着 性 の低 いフェニルア
ラニンが選 択 された。
20
図 1-7 Immusorba PH,TR 吸 着 材 の構 造
21
図 1-8 イムソーバの体 外 循 環 回 路 図
22
表 1-3 イムソーバの TR-350 及 び PH-350 の保 険 適 用 範 囲
23
図 1-9 アミノ酸 の疎 水 性 と免 疫 複 合 体 吸 着 量 の関 係
24
1.6-1 イムソーバの自 己 抗 体 吸 着 機 構
イムソーバに用 いる吸 着 材 は 、ポリビニルアルコール担 体 にトリプトファンやフェ
ニルアラニンをアミノ基 の部 分 で結 合 させたものである。このためアミノ酸 のカルボキ
シル基 は フリーの状 態 で残 っ ており,吸 着 材 全 体 としては負 に荷 電 している。その
ため、アミノ酸 の疎 水 性 部 分 、カルボキシル基 の負 荷 電 と担 体 の親 水 性 部 分 のバ
ランスで各 種 の自 己 抗 体 、免 疫 複 合 体 が吸 着 されると考 えられている
18)
(図 1-10)。
Sato らはポリビニルアルコールに各 種 のリガンドを結 合 させた吸 着 材 の抗 アセチ
ルコリン・レセプター抗 体 吸 着 性 を検 討 し、疎 水 性 の強 いトリプトファンを固 定 した
吸 着 材 が最 も効 率 よく重 症 筋 無 力 症 の病 因 物 質 である抗 アセチルコリン・レセプタ
ー抗 体 を吸 着 することを発 見 した
18 ) 。また
Shibuya ら
38)
はイムソーバ TR の抗 ア
セチルコリン・レセプター抗 体 吸 着 に関 して、トリプトファン以 外 の物 質 をリガンドとし
た時 の吸 着 性 を検 討 し、疎 水 性 の強 さと吸 着 率 に関 係 があること、トリプトファンか
らカルボキシル基 を除 いたトリプタミンでもトリプトファンの 80%程 度 の吸 着 が認 めら
れ、陰 性 荷 電 の吸 着 への寄 与 は 20%程 度 と報 告 している。さらに、渋 谷 等 は重 症
筋 無 力 症 患 者 の IgG をペプシンで分 解 して得 た F(ab’)2 およびパパインで分 解 し
て得 た Fab と Fc の混 合 物 のイムソーバ TR に対 する吸 着 性 を比 較 し,F(ab')2 は
良 く吸 着 されたのに対 し、Fab は吸 着 されなかったことから、イムソーバ TR の IgG
吸 着 部 位 は、ヒンジ部 分 と推 定 されている
39)。
25
図 1-10
アミノ酸 リガンドと病 因 物 質 との相 互 作 用
26
1.6-2
吸 着 材 における分 子 選 択 的 結 合 性 を測 定 する評 価 方 法
吸 着 担 体 に固 定 化 されたリガンド分 子 と抗 体 （IgG、IgM）分 子 との選 択 的 結 合
性 を測 定 する方 法 としては、リガンド分 子 が結 合 した吸 着 材 と血 液 （血 漿 ）成 分 と
を接 触 させ、接 触 前 後 の血 漿 中 の IgG、IgM 濃 度 及 びアルブミン、フィブリノーゲ
ン濃 度 を測 定 することによって、各 吸 着 材 に対 するそれぞれの血 漿 タンパクの吸 着
率 として求 めることができる。
吸 着 材 と血 液 （血 漿 ）成 分 との接 触 方 法 については、血 液 （血 漿 ）成 分 に吸 着
材 を一 定 時 間 、浸 漬 ・静 置 するバッチ法 にて、IgG 等 の血 漿 タンパクの吸 着 率 を
測 定 することができる。又 、より、臨 床 条 件 に近 い方 法 としては、吸 着 材 を詰 めたミ
ニカラムを作 製 し、一 定 量 の血 液 （血 漿 ）成 分 をミニカラムに通 液 させるカラム法 に
よって、通 液 前 後 の血 漿 タンパクの吸 着 率 を測 定 することができる。
吸 着 率 (%)は、(Cin－Cout)/Cin×100（Cin：吸 着 前 の溶 質 濃 度 、Cout：吸 着
後 の溶 質 濃 度 ）として計 算 して求 められる。この場 合 、吸 着 されることが好 ましい
IgG や IgM の吸 着 率 と吸 着 されることが好 ましくないフィブリノーゲンの吸 着 率 との
比 を取 ることによって、分 子 選 択 的 結 合 性 を評 価 することが可 能 となる。
1.6-3 イムソーバの課 題 －フィブリノーゲン吸 着 性 －
リガンドにトリプトファンを有 するイムソーバ TR とリガンドがフェニルアラニンである
イムソーバ PH は、それぞれ、トリプトファンまたはフェニルアラニンとの芳 香 環 の疎
水 性 相 互 作 用 を介 して血 漿 から自 己 抗 体 （主 に IgG および IgM 抗 体 ）を吸 着 除
去 する。
しかしながら、イムソーバ TR やイムソーバ PH を用 いた治 療 回 数 が増 加 すると、
血 液 中 のフィブリノーゲンを必 要 以 上 に吸 着 除 去 するために、出 血 のリスクが生 じ
てしまう。従 って、血 液 中 から、フィブリノーゲンを吸 着 除 去 することなく選 択 的 に
IgG および IgM のような抗 体 を吸 着 、除 去 できる安 定 かつ安 価 なリガンドの開 発
27
が求 められている。
1.6-4
改 良 イムソーバのリガンドが非 天 然 アミノ酸 であることの利 点
上 述 したごとく、プロテインＡなどのタンパク質 性 のリガンドは、不 安 定 で高 価 な
ため自 ずとリガンドは安 価 な低 分 子 化 合 物 が望 ましい。イムソーバのリガンドは、天
然 アミノ酸 の 20 種 類 のうちで最 もよくＩｇＧ抗 体 を吸 着 する低 分 子 化 合 物 として選
択 されたもので、製 造 （反 応 ）工 程 （方 法 ）も十 分 に確 立 されたものである。
リガンドの担 体 粒 子 への固 定 化 には、アミノ酸 のアミノ基 を用 いて結 合 させてい
る。従 って、アミノ基 を有 する低 分 子 化 合 物 やアミノ基 とカルボキシル基 を持 つアミ
ノ酸 骨 格 の低 分 子 化 合 物 をリガンドとすることができる。イムソーバのリガンドである
トリプトファンやフェニルアラニンでは、カルボキシル基 も抗 体 との相 互 作 用 に寄 与
しているということが示 唆 されており、カルボキシル基 を有 するアミノ酸 骨 格 が、よりリ
ガンドとして相 応 しい。
又 、非 天 然 アミノ酸 の側 鎖 は、如 何 様 にも設 計 でき、分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 と
しての多 様 性 をかなり多 く持 たせることが可 能 であり、ＩｇＧやＩｇＭを選 択 的 に吸 着
するリガン ドを 見 出 せる 可 能 性 がある 。 さらに、 非 天 然 アミノ 酸 を 用 い るメリッ トは 、
血 中 のプロテアーゼの認 識 を受 けにくくしたり、天 然 アミノ酸 では、想 像 できなかっ
たような機 能 （親 和 性 や選 択 吸 着 性 の向 上 など）を発 揮 する可 能 性 がある。
本 論 文 では、第 2 章 で天 疱 瘡 自 己 抗 体 を吸 着 する吸 着 材 のリガンドとして、天
然 アミノ酸 及 び非 天 然 アミノ酸 を基 にした化 合 物 群 をスクリーニングを行 った結 果 、
チエニル基 を有 する化 合 物 が最 もよく天 疱 瘡 自 己 抗 体 を吸 着 することに言 及 し、
さらに第 3 章 では、チエニルアミノ酸 が、フィブリノーゲン吸 着 を抑 制 し、かつ、
IgG,IgM 抗 体 を選 択 的 に吸 着 することについて論 ずる。
28
1.7
トリプシンについて
トリプシン[EC 3.4.21.4.]は、膵 臓 由 来 のプロテアーゼであり、アルギニンやリジ
ンの C 末 端 を特 異 的 に加 水 分 解 するセリン酵 素 として知 られている。
ウシトリプシンは、アミノ酸 残 基 数 223、分 子 量 約 2400、活 性 中 心 は、疎 水 性
環 境 下 のポケットの中 に、触 媒 基 が Ser-183 のヒドロキシル基 で、空 間 的 に近 接 し
た His-46、Asp-90 の 2 残 基 との水 素 結 合 のネットワークにより求 核 性 が極 めて高
く保 たれていることが X 線 結 晶 解 析 より推 定 されている
4 0 ) 。上 述 のごとく、正 電 荷
をもつ基 質 を特 異 的 に認 識 するが、これは、酵 素 の基 質 結 合 部 位 の負 電 荷
Asp-177 との静 電 的 相 互 作 用 により発 現 される（図 1-11）。従 って、正 荷 電 をもつ
アルギニンやリジンのカルボニル側 のペプチド結 合 を選 択 的 に切 断 するエンドペプ
チダーゼとして作 用 し、エステル結 合 も同 じ機 構 で切 断 する。
ト リ プ シ ン の 活 性 測 定 に は 、 α-N- ベ ン ゾ イ ル -L- ア ル ギ ニ ン エ チ ル エ ス テ ル
（BAEE）や α-N-ベンゾイル-L-アルギニン-p-ニトロアニリド（BAPA）などが用 いら
れ、その動 力 学 的 定 数 が計 測 されている
41)。
1.7-1 トリプシン様 酵 素 について
トリプシン様 酵 素 は、上 述 した消 化 酵 素 だけでなく、例 えば、トロンビンに代 用 さ
れる 血 液 凝 固 系 カ スケ ード反 応 、 プ ラス ミンに 代 表 される 線 溶 系 や 補 体 系 など の
生 体 防 御 機 構 の重 要 な役 割 を担 う酵 素 として知 られている。さらには、炎 症 やがん
42)
などの病 態 においてもトリプシン様 酵 素 が重 要 な働 きをしていることが報 告 され
ている。
一 方 、トリプシン様 酵 素 は、ヒトやウシなどの哺 乳 類 ばかりでなく、昆 虫
4 4)
4 3 ) 、菌 体
等 にも その 存 在 が広 範 に 確 認 され ており、 トリ プシン 様 酵 素 の 種 による違 い を
明 らかにすることは、生 物 の進 化 の過 程 を知 るうえで大 変 意 義 深 いことといえる。
29
図 1-11 ウシすい臓 トリプシンの活 性 部 位
30
1.8
酵 素 反 応 速 度 論 における分 子 選 択 的 結 合 性
1.8-1 酵 素 反 応 速 度 式 ――ミカエリス・メンテンの式
酵 素 (E)と 基 質 (S) は 速 やかに 反 応 して 酵 素 ・ 基 質 複 合 体 (ES) を 形 成 し、 そ の
速 度 定 数 は k 1 である。ついで，ES は速 度 定 数 k 2 で分 解 するか，速 度 定 数 k cat
で反 応 産 物 P になる。全 過 程 は(式 1)のように表 わされる。
k1
E ＋ S
k cat
ES
E ＋ P
(式 1)
k2
以 下 ， 最 大 反 応 速 度 を V max、基 質 の初 濃 度 を[S] 0 、ミカエリス定 数 を K m とし
た場 合 、定 常 状 態 近 似 を用 いて反 応 速 度 （v）を求 めると，次 のミカエリス・メンテン
（Michaelis- Menten）の式
V max[S] 0
v ＝
(式 2)
K m + [S] 0
が得 られる。また、ここで、 V max は、酵 素 の濃 度 を[E 0 ]とすると、
k cat [E 0 ] ＝ V max
(式 3)
で示 される。
31
1.8-2
動 力 学 パラメーター K m と V max、 k cat の意 味
ミカエリス定 数 K m と V max は酵 素 の特 徴 を表 す重 要 なパラメーターで，反 応
速 度 や触 媒 効 率 等 がわかり，酵 素 の触 媒 機 構 を理 解 するためにも重 要 なパラメー
ターである。最 大 反 応 速 度 V max は，１秒 間 に酵 素 が変 化 させうる基 質 のモル数
で表 され，酵 素 の作 用 回 転 数 (turn over)という。すなわち、(式 3)からも明 らかな
ように、 k cat は単 位 時 間 当 たり、酵 素 の活 性 部 位 あたりの作 用 を受 ける基 質 分 子
の最 大 数 を示 しており、これを回 転 回 数 またはターンオーバー数 という。
ミカエリス定 数 K m は、ミカエリス・メンテンの(式 2)から， v ＝ V max/2 のとき，基
質 濃 度 [S]＝ K m になる。一 方 ，ES の解 離 定 数 を K S とすると， K S は次 のように表
される。
k2
[E] f [S] f
KS＝
(式 4)
＝
[ES]
k1
このとき、ES→E＋P の反 応 が律 速 段 階 ならば k 2≫ k cat となり，(式 2)と(式 4)
から， K m≒ K S となる。 したがって， K m は酵 素 と基 質 の親 和 性 （分 子 選 択 吸 的
結 合 性 ）を表 わすパラメーターと考 えることができる。 K m 値 が小 さい程 ES の解 離
が起 きにくく，E と S が結 合 し易 いことになる。一 般 に，E と S は極 めて速 い平 衡 に
あり， k 1 ， k 2 ≫ k cat の条 件 は満 たされていることが多 い。
32
1.8-3
K m と V max の求 め方 ――Lineweaver-Burk プロット
Michaelis-Menten の（式 ２）を変 形 すると，1／ v と 1／[S]のプロットは直 線 とな
る。これを Lineweaver-Burk の式 という。
Km
1
＝
v
1
(式 5)
＋
V max[S]
V max
1／[S]に対 して 1／ v をプロットすると，直 線 の X 切 片 から K m，Y 切 片 から
V max が 求 ま る 。 V max は 直 線 の 傾 き ( ＝ K m ／ V max) か ら求 め る こと も でき る 。
Lineweaver-Burk プロット以 外 に，Michaelis-Menten の式 を変 形 したいくつか
のプロット法 が知 られている。例 えば、本 論 文 の第 4 章 で後 述 する、[S]と v の値 で
プロットする Eadie(-Hofstee)プロットは、反 応 速 度 の誤 差 に敏 感 であり、データの
精 度 が良 い場 合 には、反 応 が Michaelis-Menten の式 に合 致 するかどうかを見
つけ出 すのに有 用 なプロットであり、基 質 活 性 化 や基 質 阻 害 の様 式 を確 認 、検 証
することができる。
33
1.8-4
トリプシンによるパラグアニジノフェニルアラニンの加 水 分 解
Klausner らや Tsunematsu らは、L－アルギニン(Arg)の側 鎖 のメチレン鎖 を
ベンゼン環 に置 換 した非 天 然 アミノ酸 である p－グアニジノ－Ｌ－フェニルアラニン
（GPA）の直 鎖 状 のエステル、アミド、及 びアニリド基 質 を合 成 し、トリプシンによる加
水 分 解 を調 べた結 果 、これらの基 質 がアルギニンの相 当 する基 質 とほぼ同 じ速 度
で加 水 分 解 されることを報 告 している
8 ), 4 5 - 4 7 ) (図
1-12)。
本 論 文 の第 4 章 では、 Streptomyces griseus （S.G.）トリプシンの L－Arg と
GPA の基 質 の加 水 分 解 について、速 度 論 的 に比 較 調 査 し、S.G.トリプシンと牛 ト
リプシンの活 性 中 心 の違 いについて議 論 する。さらに、第 ５章 では、通 常 のトリプシ
ン様 酵 素 の L－Arg 基 質 では加 水 分 解 されずに、GPA 基 質 を加 水 分 解 する酵 素
をエールリッヒ腹 水 癌 移 植 マウス腹 水 中 に見 出 すことができ、酵 素 の基 質 という分
子 選 択 的 結 合 性 分 子 として非 天 然 アミノ酸 を利 用 することの有 用 性 について論 じ
る。
34
図 1-12
L-アルギニンと p-グアニジノフェニルアラニンの構 造
35
1.9
本 研 究 の目 的 と意 義
以 上 述 べてきたように、本 研 究 においては、１）分 子 選 択 的 結 合 性 に優 れ、２）
物 理 化 学 的 及 び生 物 化 学 的 に安 定 で、かつ、３）比 較 的 安 価 な低 分 子 化 合 物 と
して、非 天 然 アミノ酸 の可 能 性 に着 目 した。
本 研 究 の 目 的 は、その非 天 然 アミノ酸 が、抗 体 を吸 着 するリガンドや酵 素 の基
質 と して 分 子 選 択 的 結 合 性 を 示 す こ と 、 並 び に 、 そ の 有 用 性 や 今 後 の 展 開 へ の
可 能 性 について示 すことである。このような低 分 子 化 合 物 （抗 体 に対 するリガンドや
酵 素 の基 質 等 ）の開 発 が可 能 になれば、医 療 技 術 や診 断 技 術 への貢 献 は大 きく、
大 変 意 義 深 いといえる。
第 1 章 では、生 体 内 で起 こる、抗 原 抗 体 反 応 、酵 素 と基 質 反 応 、リガンド・レセ
プター反 応 など の 分 子 選 択 的 結 合 に つ い て概 説 し、 分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の
設 計 手 法 について述 べ、本 研 究 においては、合 理 的 な設 計 手 法 が適 切 であるこ
とを述 べた。その上 で滅 菌 等 の物 理 化 学 的 安 定 性 や血 液 中 の酵 素 等 による分 解
耐 性 （生 物 化 学 的 安 定 性 ）を有 し、かつ、分 子 選 択 的 結 合 性 を示 す可 能 性 のある
低 分 子 化 合 物 として非 天 然 アミノ酸 を取 り上 げた。そして非 天 然 アミノ酸 の活 用 に
つ い て、 医 療 用 デ バ イスであ る 血 液 体 外 循 環 用 （ ア フ ェレシ ス 用 ） の 抗 体 吸 着 材
用 のリガンドとタンパク分 解 酵 素 であるトリプシンの基 質 を例 にとって論 じた。
第 2 章 では、医 療 用 デバイスである血 液 体 外 循 環 用 （アフェレシス用 ）の抗 体 吸
着 材 用 のリガンドを設 計 開 発 する目 的 で、非 天 然 アミノ酸 であるチエニル基 を有 す
るアミノ酸 やパラグアニジノフェニルアラニン（GPA）を含 む各 種 アミノ酸 について、
天 疱 瘡 患 者 の血 清 を用 いてスクリーニングを行 った結 果 、チエニル基 を持 つ化 合
物 が有 望 であることを述 べる。
第 3 章 では、さらに、第 2 章 の知 見 を受 けて、実 用 化 に向 けた検 討 を行 った結
果 、チエニルアミノ酸 がフィブリノーゲンの吸 着 を抑 制 し、IgG や IgM を選 択 的 に
吸 着 することを見 出 し、有 望 なリガンドとなりうることを論 じる。
36
第 4 章 では、非 天 然 アミノ酸 であるパラグアニジノフェニルアミノ酸 （GPA）基 質
が 、 ト リ プ シ ン 様 酵 素 の 良 い 基 質 に な り う る か 検 証 す る 目 的 で 、 Streptomyces
griseus トリプシンにて加 水 分 解 させ速 度 論 的 に解 析 を行 い、その結 果 、GPA がト
リプシン様 酵 素 の有 用 な基 質 であることを述 べる。
さらに、第 5 章 では、GPA 基 質 を用 いることで、L-Arg 基 質 では見 出 せなかった、
癌 性 腹 水 に存 在 するトリプシン様 酵 素 の存 在 を明 らかにすることができたことを論
じている。
第 6 章 では、結 論 として、抗 体 を吸 着 するリガンドや酵 素 の基 質 となる分 子 選 択
的 結 合 性 分 子 の設 計 ・開 発 のために非 天 然 アミノ酸 を利 用 することの有 用 性 につ
いてまとめ、今 後 の展 望 について述 べる。
37
参考文献
１ ． Sakamoto H, Ikeno S, Kato T, Nishino N, Haruyama T.,Smart
Immobilization of oligopeptides through electrochemical deposition
onto surface. Anal Chim Acta. 2007 Nov 26;604(1):76-80. Epub 2007
May 26.
2.
Takatsuji
Y,
functionalized
Ikeno
with
S,
Haruyama
peptides
for
T.,
specific
Gold
affinity
nanoparticles
aggregation
assays of estrogen receptors and their agonists., Sensors (Basel).
2012;12(4):4952-61. doi: 10.3390/s120404952. Epub 2012 Apr 18.
3. Martinez A, Perez DI, Gil C., Lessons learnt from glycogen synthase
kinase 3 inhibitors development for Alzheimer's disease., Curr Top
Med Chem. 2013; 13(15) :1808-19.,
4.Geysen HM, Schoenen F, Wagner D, Wagner R,.Combinatorial
compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nat
Rev Drug Discov. 2003 Mar;2(3):222-30.
5.Cesareni G.,Peptide display on filamentous phage capsids. A new
powerful tool to study protein-ligand interaction., FEBS Lett. 1992
Jul 27;307(1):66-70.
6. Köhler G, Milstein C., Continuous cultures of fused cells secreting
antibody of predefined specificity., Nature . 1975 Aug 7; 256(5517):
495-7.
7.
Rodrigues
AD.,Preclinical
drug
metabolism
in
the
age
of
high-throughput screening: an industrial perspective. Pharm Res.
1997 Nov;14(11):1504-10.
8. Greenlee WJ, Thorsett ED, Springer JP, Patchett AA, Ulm EH,
38
Vassil TC., Azapeptides: a new class of angiotensin-converting
enzyme
inhibitors., Biochem
Biophys
Res
Commun .
1984
Jul
31;122(2):791-7.
9. Tsunematsu. H. & Makisumi. S. Interactions of derivatives of
guanidinophenylglycine and guanidinophenylalanine with trypsin
and related enzymes. (1980) J. Biochem. 88, 1773-1783.
10. James J. Onuffer, Binh T. Ton, Ivan Klement and Jack F. Kirsh,
The use of natural and unnatural amino acid substrates to define
the substrate specificity differences of Escherichia coli aspartate
and
tyrosine
aminotransferases.
Protein
Science
(1995),
4:1743-1749.
11. Aalim M. WeIjie and Hans J. Vogel ; Protein Engineering, vol 13
no1 pp9-66, 2000.
12. Michael M. Torrice, Kiowa S. Bower, Henry A. Lester, and Dennis
A. Doughrty; Probing the role of the cation-pi interaction in the
binding sites of GPCRs using unnatural amino acids. PNAS July
21, 2009 , vol.106, no29, 11919-11924.
13. Ma, J., S. Chem. Today 2003, 65.
14. Doughherty, D. A., Unnatural amino acids as probes of protein
structure and function., Curr Opin Chem Biol. 2000, 6, 645.
15. Wester HJ, Herz M, Weber W, Heiss P, Senekowitsch-Schmidtke R,
Schwaiger M, Stöcklin G., Synthesis and radiopharmacology of
O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine for tumor imaging., J Nucl Med.
1999 Jan;40(1):205-12.
16. Kajihara D, Hohsaka T, Sisido M., Synthesis and sequence
39
optimization of GFP mutants containing aromatic non-natural
amino acids at the Tyr66 position., Protein Eng Des Sel. 2005
Jun;18(6):273-8. Epub 2005 May 31.
17. Yoshida M., Tamura Y., Yamada Y., Yamawaki N., Immusorba TR
and Immusorba PH: basics of design and features of functions.
1998., Ther Apher Dial 2000 Apr;4(2);127-134
18. Hirata N., Kuriyama T., Yamawaki N., Immusorba TR and PH.,
Ther Apher Dial 2003 Feb; 7(1):85-90.
19. Sato T., Anno M., Arai K. : Progress in Artificial Organs-1983 :
719-722, 1983.
20. Yuki N., Tryptophan-immobilized column adsorbs immunoglobulin
G anti-GQ1b antibody from Fisher's syndrome: A new approach to
treatment.: Neurology , 46: 1644-1651, 1996.
21. 山 田 裕 道 、伊 藤 章 、畑 中 美 博 、築 地 美 鈴 、高 森 健 二 ；天 疱 瘡 の特 異 的 血
漿 吸 着 療 法 をめざして－これまでの研 究 の歩 みと新 しく開 発 されたチオフェン
リガンド吸 着 材 －； 日 本 アフェレシス学 会 雑 誌 , 28(3), 230-234, (2009)
22. Sawada K, Ohnishi K, Fukui S, Yamada K, Yamamura M, Amano K,
Amano K, Wada M, Tanida N, Satomi M, et al., Leukocytapheresis
therapy, performed with leukocyte removal filter, for inflammatory
bowel disease., J Gastroenterol . 1995 Jun;30(3):322-9.
23. Hidaka T, Suzuki K, Matsuki Y, Takamizawa-Matsumoto M,
Kataharada K, Ishizuka T, Kawakami M, Nakamura H., Filtration
leukocytapheresis therapy in rheumatoid arthritis: a randomized,
double-blind, placebo-controlled trial., Arthritis Rheum . 1999 Mar;
42(3):431-7.
40
24. Talbot AR., A comparison of hemoperfusion columns for paraquat.,
Vet Hum Toxicol . 1989 Apr;31(2):131-5.
25. Shoji H., Extracorporeal endotoxin removal for the treatment of
sepsis: endotoxin adsorption cartridge (Toraymyxin)., Ther Apher
Dial . 2003 Feb;7(1):108-14.
26. Furuyoshi S, Nakatani M, Taman J, Kutsuki H, Takata S, Tani N.,
New adsorption column (Lixelle) to eliminate beta2-microglobulin
for direct hemoperfusion., Ther Apher . 1998 Feb;2(1):13-7.
27. Ihara H, Shino Y, Hashizume N, Aoki T, Suzuki Y, Igarasi Y, Naito
C., Decline in plasma retinol in unconjugated hyperbilirubinemia
treated with bilirubin adsorption using an anion-exchange resin., J
Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) . 1998 Apr;44(2):329-36.
28. Iwahori T, Yoshida M, Sugiura M, Ioya N, Kawaguchi M., Excellent
antiproteinuric effect by LDL apheresis in a case with severe renal
dysfunction due to focal segmental glomerulosclerosis., Nihon
Jinzo Gakkai Shi . 1996 Feb;38(2):91-7.
29.
Knöbl
P,
Derfler
K,
Korninger
L,
Kapiotis
S,
Jäger
U,
Maier-Dobersberger T, Hörl W, Lechner K, Pabinger I., Elimination
of acquired factor VIII antibodies by extracorporal antibody-based
immunoadsorption (Ig-Therasorb)., Thromb Haemost . 1995 Oct;
74(4): 1035-8.
30. Sato Y, Kimata N, Miyahara S, Nihei H, Agishi T, Takahashi M.
(2000) Extracorporeal adsorption as a new approach to treatment
of botulism. ASAIO J. 46: 783-785.
31. Sugimoto K, Yamaji K, Yang KS, Kanai Y, Tsuda H, et al. (2006)
41
Immunoadsorption plasmapheresis using a phenylalanine column
as an effective treatment for lupus nephritis. Ther Apher Dial. 10:
187-192.
32. Rönspeck W, Brinckmann R, Egner R, Gebauer F, Winkler D, et al.
(2003) Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption.
Ther Apher Dial. 7: 91-97.
33. Rech J, Hueber AJ, Kallert S, Leipe J, Kalden JR, et al. (2008)
Remission
of
immunoadsorption,
demyelinating
low
dose
polyneuropathy
corticosteroids
and
with
anti-CD20
monoclonal antibody. Ther Apher Dial. 12: 205-208
34. Belàk M, Borberg H, Jimenez C, Oette K. (1994) Technical and
clinical experience with protein A immunoadsorption columns.
Transfus Sci. 15: 419-422.
35. Samuelsson G. (2001) Extracorporeal immunoadsorption with
protein A: technical aspects and clinical results. J Clin Apher.
16:49-52.
36. Kiseleva EA, Afanasieva OI, Kosheleva NA, Pokrovsky SN. (1996)
Immunosorbent for IgG apheresis: an in vitro study. Transfus Sci.
17: 519-525.
37. 山 脇 直 邦 ：人 工 レセプタ-とその血 液 浄 化 治 療 への応 用 (「有 機 化 学 はバイ
オ サ イ エ ン ス に ど こ ま で 関 わ り 合 え る か 」 特 集 号 ), 有 機 合 成 化 学 教 会 誌 、
43(11)：1024-1034,1985
38. 渋 谷 統 寿 ：Annual Review 神 経 1987：67-74, 1987.
39. 渋 谷 統 寿 、高 島 秀 敏 、大 石 清 澄 、他 ： 免 疫 性 神 経 疾 患 調 査 研 究 班 63 年 度
研 究 報 告 , 388-390,1980.
42
40. Stroud RM, Kay LM, Dickerson RE, The structure of bovine
trypsin: electron density maps of the inhibited enzyme at 5
Angstrom and at 2-7 Angstron resolution. J Mol Biol. 1974 Feb
25;83(2):185-208
41. K.Walsh, ”Methods in Enzymology” , ed. By
G. E. Perlmann, L.
Lorand, Academic. Press, New York, Vol.19, p.41(1970).
42. Koshikawa N,Yasumitsu H,Umeda WI et al: Multiple secretion of
matrix serine proteinases by human gastric carcinoma cell lines.
Cancer Res 52:5046-5053, 1992
43. F. C. Kafatos,
A. M. Tartakoff and J. H. Law, Cocoonase. I.
Preliminary characterization of a proteolytic enzyme from silk
moths., J. Biol. Chem ., 242, 1477, 1488 (1967)
44.
Y. Narahashi and J. Fukunaga, Complete separation of three
alkaline
proteinases
a,
b,
and
c
from
pronase
and
some
characteristics of alkaline proteinase b., J. Biochem ., 66, 743
(1969)
45. Klausner, Y. S. , Rigbi, M.,
E.
J.,
&
Rinott,
Ticho, T.,
Y.
Y, Jong, P. J. Neginsky,
The
interaction
of
alpha-N-(p-toluenesulphonyl)-p-guanidino-L-phenylalanine
methyl ester with thrombin and trypsin., (1978) Biochem. J. 169,
157-167.
46. Tsunematsu, H. , Imamura, H., Mizusaki, K., & Makisumi. S.,
Kinetics
of
hydrolysis
of
p-guanidino-L-phenylalanine
amide
by
(1985) J. Biochem. 97, 617-623.
43
and
bovine
anilide
and
substrates
of
porcine trypsins.
47. Hideaki Tsunematsu, Kumi Ando, Yoshihiro Hatanaka, Koichi
Mizusaki,
Ryuichi
Isobe,
Satoru
Makisumi;
A
New
β-Naphthylamide Substrate of p-Guanidino -L-Phenylalanine for
Trypsin and Related Enzymes; J. Biochem .,98, 1597, (1985)
44
第2章
天疱瘡自己抗体を吸着する天然・非天然アミノ酸
を基にしたリガンドのスクリーニング
45
46
１．はじめに
天 疱 瘡 は、皮 膚 と粘 膜 の間 で表 皮 接 着 の消 失 や水 疱 形 成 を伴 った、棘 融 解 を
引 き 起 こ す 慢 性 的 な自 己 免 疫 疾 患 で ある。 こ れ らの 疾 患 には 、 臨 床 的 に 組 織 学
的 に識 別 可 能 な天 疱 瘡 や尋 常 性 天 疱 瘡 （PV）および落 葉 状 天 疱 瘡 （PF）の、大
きく 2 つのタイプがある。
棘 融 解 は、PV の場 合 は、表 皮 の深 い層 で生 じるが、PF の場 合 は、表 皮 の表
面 上 において病 変 が観 察 される。棘 融 解 は、PV においては、細 胞 接 着 に関 与 す
る接 着 タンパク質 である、デスモグレイン 3（Dsg3）および PF においては、デスモグ
レイン 1（Dsg1）に対 する自 己 抗 体 によってそれぞれ直 接 的 に引 き起 こされる
(図 2-1、図 2-2)。
47
1 ) ,2 )
図 2-1
皮 膚 科 疾 患 「天 疱 瘡 」の概 要
48
図 2-2
天 疱 瘡 の発 生 機 序
49
さらに、PV 患 者 の 50%以 上 については、酵 素 免 疫 吸 着 法 （ELISA） 3 ) あるいはウ
ェスタンブロット
4)
によって抗 Dsg1 自 己 抗 体 が測 定 された。さらに、多 くの研 究 が、
天 疱 瘡 患 者 に お い て 、 抗 Dsg3 お よ び 抗 Dsg1 自 己 抗 体 が 、 免 疫 グ ロ ブ リ ン
（IgG）のサブクラスの IgG1 および IgG4 に属 することを実 証 してきた
5)。
血 漿 からこれらの自 己 抗 体 を体 外 循 環 によって除 去 するプラズマフェレシスは、コ
ルチコステロイドが有 効 でない天 疱 瘡 患 者 のために確 立 されている治 療 法 の中 の
1 つである
6-8)。
近 年 、天 疱 瘡 患 者 に対 して、リガンドが、プロテイン A
合 成 ペプチド
1 4 ) 、及 びヒトの
9 ) , 1 0 ) 、トリプトファン 11 - 1 3 ） 、
IgG に対 するポリクローナルな羊 抗 体
15)
を有 する
様 々な吸 着 器 を使 用 して、血 液 体 外 循 環 による免 疫 吸 着 療 法 によって、血 漿 抗
体 を選 択 的 に吸 着 し、成 功 裡 に治 療 されたことが示 された。これらの吸 着 器 は既
に開 発 されており、関 節 リウマチ、特 発 性 血 小 板 減 少 性 紫 斑 病 、インヒビター保 有
血 友 病 、全 身 性 エリテマトーデス、重 症 筋 無 力 症 、及 び、ギランバレー症 候 群 のよ
うにいくつかの自 己 免 疫 疾 患 の治 療 オプションとして使 用 されてきているが、天 疱
瘡 治 療 用 の特 別 な治 療 法 にはなり得 ていない 16 ) 。プロテイン A や抗 体 のようなリガ
ンドを有 する上 記 の吸 着 器 は、リガンドが生 物 分 子 で作 られているので、酵 素 分 解
を受 け不 安 定 であり、又 、高 価 でもある。
この研 究 では、天 疱 瘡 自 己 抗 体 の免 疫 吸 着 療 法 用 のシンプルなリガンドを有 す
る新 しい候 補 吸 着 材 を捜 すために、多 孔 性 ビーズに低 分 子 化 合 物 リガンドが共 有
結 合 で固 定 化 さ れ た吸 着 材 のライブ ラリー を 作 製 した。 タン パク質 や 化 学 物 質 の
分 離 精 製 に用 いられる吸 着 材 である Thiopropyl Sepharose 6B は、天 疱 瘡 抗
体 を良 好 に吸 着 するという Yamada らの知 見 がある
17 )
。又 、イムソーバのリガンド
である疎 水 性 で環 状 骨 格 を有 するトリプトファンやフェニルアラニンが、自 己 抗 体 や
免 疫 複 合 体 を吸 着 するということが知 られている。これらのことから、低 分 子 化 合 物
としては、20 種 類 の天 然 アミノ酸 に加 えて、硫 黄 原 子 を有 し、かつ環 状 構 造 である
50
チエニル基 を有 する非 天 然 アミノ酸 やその誘 導 体 、並 びにチオール基 を有 するグ
ルタチオンを低 分 子 化 合 物 リガンドとして選 択 し、吸 着 材 ライブラリーとした。 次 に、
それらを用 いて、in vitro でスクリーニングを行 った。
２．材 料 と方 法
2.1 材 料
Dsg1 に対 する抗 体 および Dsg3 の両 方 に陽 性 であった、2 人 の PV 患 者 から
得 ら れ た 、 二 重 濾 過 血 漿 交 換 療 法 （ DFPP : Double Filtration Plasma
Pheresis）の廃 棄 血 漿 を使 用 した。抗 Dsg1 抗 体 の index value は、2600 およ
び 1820(それぞれ、患 者 -1 および患 者 -2)であった。また、抗 Dsg3 抗 体 の index
value は、240 および 177(それぞれ、患 者 -1 および患 者 -2)であった。
5 人 の健 康 なボランティアから得 られた血 漿 は、IgG サブクラスの吸 着 実 験 で用 い
た。書 面 によるインフォームド・コンセントは、すべての実 験 において得 られ、また、
研 究 は国 際 親 善 病 院 の倫 理 委 員 会 によって承 認 された。
2.2 吸 着 材 ライブラリーの調 製
吸 着 材 のリガンドとして、5 つのチオール化 合 物 (L-α-3-チエニルグリシン, β-2チエニル- DL-セリン, β-2-チエニル-D-アラニン,2-チオフェンエチルアミンおよびグ
ルタチオン)と、20 種 類 の L-アミノ酸 (グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ
ン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、
フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸 、グルタミン酸 、リジン、ア
ルギニン、およびヒスチジン)と、フェニルアラニン誘 導 体 としてパラグアニジノフェニ
ルアラニンを使 用 した(図 2-3)。
Tsunematsu ら 1 8 ) の方 法 によって合 成 されたパラグアニジノフェニルアラニンを
除 く、すべての化 合 物 は、Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)から購 入 した。
51
ポリビニルアルコール・ゲルからなる多 孔 性 ビーズ（旭 硝 子 社 製 ）をエピクロロヒドリ
ンによって、5 時 間 30°C で抗 応 させ、エポキシ化 した。
ゲルのエポキシ化 度 は、1.3 mM のチオ硫 酸 ナトリウム液 と 0.1 N 塩 酸 を加 えて、
110 μeq/ml・ゲルとして滴 定 した。
各 化 合 物 は、いずれも 50 μeq/ml・ゲルになるように、16 時 間 50 °C の抗 応 によっ
てゲルの表 面 上 にあるエポキシド基 とアミノ基 によって共 有 結 合 で固 定 化 した。
52
図 2-3
吸 着 材 ライブラリーのリガンド化 合 物
53
2.3 Batchwise 法 による吸 着 材 ライブラリーのスクリーニング
1 ml の 患 者 血 漿 サ ン プ ル は 、 24 穴 プ レ ー ト (Becton Dickinson, San
Jose,CA, USA)のウェル中 で 0.5 g の各 吸 着 材 と一 緒 に懸 濁 し、室 温 で 1 時 間 イ
ンキュベートした。その後 上 澄 み液 を回 収 し、Dsg1 と Dsg3 に対 する抗 体 を測 定 し
た。
2.4 カラム・フローによる吸 着 実 験
5 ml 容 の デ ィ ス ポ ー ザ ブ ル の ポ リ プ ロ ピ レ ン ・ カ ラ ム (Funakoshi, Tokyo,
Japan)に 2-チオフェンエチルアミン又 はトリプトファンが固 定 された 2 ml 容 の吸 着
材 を詰 めた。その後 、12 ml の患 者 血 漿 サンプルをカラムに流 し、2 ml 毎 に 6 つ
の流 出 フラクションに分 けて分 取 した。3 番 目 に流 出 するフラクション(流 出 液 の 4-6
ml に相 当 )とオリジナルの患 者 サンプル血 症 について、アルブミン、IgG、IgM およ
び Dsg1 と Dsg3 に対 する抗 体 について測 定 した。
2.5 天 疱 瘡 自 己 抗 体 およびその他 の血 漿 蛋 白 質 レベルの測 定
天 疱 瘡 自 己 抗 体 の力 価 は、リコンビナントの Dsg1 および Dsg3 タンパク用 いて
ELISA 法 によって測 定 した
1 9 ) 。IgG
と IgM のレベルは免 疫 ネフェロメトリーによっ
て測 定 した。
アルブミンと IgG のサブクラスのレベルはネフェロメトリーによって決 定 した。吸 着
率 (%)は、(Cin－Cout)/Cin×100（Cin：吸 着 前 の溶 質 濃 度 、Cout：吸 着 後 の溶
質 濃 度 ）として計 算 した。
2.6 統 計 分 析
データは平 均 値 の±標 準 偏 差 (SD)として示 し、Student’s t-test を用 いて検 定
し、P 値 が 0.05 未 満 の場 合 、統 計 的 に有 意 差 があるとした。
54
３．結 果 と考 察
3.1 天 疱 瘡 自 己 抗 体 用 の吸 着 材 ライブラリーのスクリーニング
我 々は、batchwise 法 によって 2 人 の PV 患 者 に由 来 した血 漿 サンプルを使 用
して、天 疱 瘡 自 己 抗 体 用 の 26 個 の吸 着 材 をスクリーニングした。抗 Dsg1 および
抗 Dsg3 自 己 抗 体 に対 する吸 着 率 の強 さの順 番 を、図 2-4a および図 2-4b の中
に、それぞれ示 した。
リガンド化 合 物 が 2-チオフェンエチルアミン、トリプトファン、パラグアニジノフェニ
ルアラニン、フェニルアラニンおよびチエニルグリシンを有 する吸 着 材 が、それぞれ、
順 に抗 Dsg1 自 己 抗 体 への高 い親 和 性 を示 した。これらの吸 着 材 は、又 、同 じ順
に抗 Dsg3 自 己 抗 体 への高 い親 和 性 を示 した。他 の吸 着 材 の吸 着 率 については、
リガンドのない多 孔 性 ビーズ(担 体 のみ)とも比 較 して、それほど大 きな値 ではなかっ
た。
55
図 2-4a 天 疱 瘡 自 己 抗 体 （anti-Dsg1）の吸 着 率
56
図 2-4b 天 疱 瘡 自 己 抗 体 （anti-Dsg3）の吸 着 率
57
3.2 天 疱 瘡 自 己 抗 体 のカラム・フロー吸 着 試 験
続 いて、我 々は、リガンド化 合 物 が 2-チオフェンエチルアミンおよびトリプトファン
である、チオフェン吸 着 材 およびトリプトファン吸 着 材 のそれぞれについて評 価 した。
これらの吸 着 材 は、カラム・フロー実 験 (図 2-5)によって評 価 した。チオフェン吸 着
材 は、抗 Dsg1 および抗 Dsg3 自 己 抗 体 への親 和 性 を示 した。トリプトファン吸 着
材 も、又 、抗 Dsg1 自 己 抗 体 に対 して親 和 性 を示 したが、抗 Dsg3 自 己 抗 体 に対
しての親 和 性 は、やや低 かった。
チオフェン及 びトリプトファンの吸 着 材 には、IgG への親 和 性 があった。又 、どち
らの吸 着 材 もアルブミンへの親 和 性 は低 かった。
一 方 、チオフェン吸 着 材 には IgM への親 和 性 が見 られなかった。この原 因 とし
ては、実 験 に用 いた DFPP の廃 棄 血 漿 には、通 常 の血 漿 と異 なり、フィブリノーゲ
ンや低 密 度 リポタンパク質 複 合 体 などの高 分 子 量 タンパク質 や脂 質 成 分 を含 んで
おり、IgM のチオフェンリガンドへの吸 着 が阻 害 されたのかもしれない。第 3 章 で後
述 するが、健 常 人 の血 漿 を用 いた実 験 では、チオフェンは IgM をよく吸 着 している
ことを論 じている。
58
図 2-5 カラム・フロー法 による天 疱 瘡 自 己 抗 体 の吸 着 率
」
59
3.3
IgG サブクラスの吸 着 特 異 性
IgG サブクラスの吸 着 特 異 性 をチオフェンとトリプトファンの吸 着 材 間 で比 較 した。
実 験 は、ボランティア健 常 人 (n=5、図 2-6)の血 漿 を使 用 して、カラム・フロー法 に
よって行 なった。IgG サブクラスの IgG1 と IgG2 の吸 着 率 は、双 方 の吸 着 材 間 で
差 異 はなかった。トリプトファン吸 着 材 はチオフェン吸 着 材 以 上 によく IgG3 を吸 着
した。しかし、チオフェン吸 着 材 は、トリプトファン吸 着 材 以 上 によく IgG4 を吸 着 し
た。
60
図 2-6 カラム・フロー法 による IgG サブクラスの吸 着 率 （健 常 人 血 液 使 用 ）
61
この章 では、吸 着 材 ライブラリーのスクリーニング及 び IgG サブクラスの吸 着 特
性 の結 果 から、チオフェン吸 着 材 が天 疱 瘡 自 己 抗 体 の免 疫 吸 着 法 に適 している
可 能 性 があることを示 した。チオフェン吸 着 材 は、リガンドとして、チエニル基 を有 す
る 2-チオフェンエチルアミンが多 孔 性 のビーズの表 面 に、短 いスペーサーを介 して
アミノ基 によって共 有 結 合 されている(図 2-7)。
62
図 2-7 チオフェン吸 着 材 のリガンドの構 造
63
チオフェン吸 着 材 には、なぜ天 疱 瘡 自 己 抗 体 への親 和 性 を持 つことができるの
かという疑 問 が生 じる。スクリーニングの結 果 、2 番 目 に良 かったトリプトファン吸 着
材 は、免 疫 吸 着 療 法 として臨 床 的 に使 用 されてきており、トリプトファンリガンドと自
己 抗 体 との親 和 性 は、主 に疎 水 的 相 互 作 用 によって結 合 しており、一 部 、イオン
相 互 作 用 によると考 えられている
20)。
チオフェンにはトリプトファンより高 い疎 水 性 があり、それらの分 配 係 数 (logP)は、
それぞれ 3.20 と 2.06 である。最 近 、Ren ら
21 )
は、in vitro の実 験 において 4-メ
ルカプトエチルピリジンを基 にした吸 着 材 が、抗 二 重 らせん構 造 DNA 自 己 抗 体 お
よびリウマチ因 子 を患 者 血 清 サンプルから取 り除 くことができる可 能 性 があることを
示 した。4-メルカプトエチルピリジンはチオール基 を備 えた複 素 環 芳 香 族 化 合 物 で
ある。我 々の研 究 では、リガンドが芳 香 族 化 合 物 である吸 着 材 は、自 己 抗 体 への
強 い親 和 性 を持 つ傾 向 がある。芳 香 環 に加 えて、硫 黄 は、チオフェンと自 己 抗 体
の間 の親 和 性 において何 らかの関 与 をしているのかもしれない。
実 験 間 において吸 着 率 に差 異 が認 められたが、これらの差 異 は吸 着 方 法 と 血
漿 サンプルに起 因 しているのかもしれない。図 2-4 の実 験 は batchwise 方 法 によ
って行 なわれた。図 2-5 および図 2-6 の実 験 はカラム・フロー法 により行 った。今 後 、
吸 着 の時 間 的 経 過 についてさらに調 べるためのカラム・フロー実 験 が必 要 である。
血 漿 サンプルについては、PV 患 者 から得 られた DFPP の廃 棄 血 漿 を図 2-4 お
よび図 2-5 の実 験 の中 で使 用 した。しかし、図 2-6 の実 験 では健 常 人 ボランティア
からの血 漿 を用 いた。DFPP の廃 棄 血 漿 は、希 少 かつ重 症 疾 患 の患 者 からのサ
ンプルであり、倫 理 的 には適 切 なものであるが、通 常 の血 漿 と異 なる成 分 としては、
大 量 のフィブリノーゲンおよび低 密 度 リポタンパク質 複 合 体 のような、高 分 子 量 のタ
ンパク質 や脂 質 複 合 体 を含 んでいる。これらのタンパク質 などの成 分 は免 疫 吸 着
療 法 においては、自 己 抗 体 と競 争 するかもしれないし、又 、吸 着 率 を変 化 させるか
もしれない。
64
４．結 論
チオフェン吸 着 材 は IgG1 および IgG4 サブクラスの両 方 を効 果 的 に吸 着 した。
この特 性 は天 疱 瘡 だけでなく IgG4 が関 与 する、水 疱 性 類 天 疱 瘡
炎
2 2 ) 、硬 化 性 膵
2 3 ) 、ウェゲナー肉 芽 腫 症 2 4 ) 、抗 シトルリン化 関 節 リウマチなどの自 己 免 疫 疾 患
抗体
2 5 ) 、および抗 筋 特 異 的 チロシンキナーゼ抗 体 を有 する重 症 筋 無 力 症 2 6 ) のよ
うな自 己 免 疫 疾 患 に対 して、自 己 抗 体 を除 去 するための免 疫 吸 着 療 法 に有 効 で
あるかもしれない。さらに、in vivo での動 物 実 験 や臨 床 試 験 が必 要 である。
65
参考文献
1. Stanley JR, Amagai M. Pemphigus, bullous impetigo, and the
staphylococcal scalded-skin syndrome. N Engl J Med 2006; 355:
1800–10.
2. Hertl M, Eming R, Veldman C. T cell control in autoimmune bullous
skin disorders. J Clin Invest 2006;116:1159–66.
3.
Amagai
M,
Komai
enzyme-linked
A,
Hashimoto
immunosorbent
T
assay
et
al.
using
Usefulness
of
recombinant
desmogleins1 and 3 for serodiagnosis of pemphigus. Br J Dermatol
1999;140:351–7.
4. Kricheli D, David M, Frusic-Zlotkin M et al. The distribution of
pemphigus
vulgaris-IgG
subclasses
and
their
reactivity
with
desmoglein 3 and 1 in pemphigus patients and their firstdegree
relatives. Br J Dermatol 2000;143:337–42.
5. Sitaru C, Mihai S, Zillikens D. The relevance of the IgG subclass of
autoantibodies for blister induction in autoimmune bullous skin
diseases. Arch Dermatol Res 2007;299:1–8.
6. Takamori K, Yamada H, Morioka S, Ogawa H. Long term remission
successfully achieved in severe types of pemphigus vulgaris and
bullous pemphigoid by the use of plasmapheresis. Eur J Dermatol
1993;3:433–7.
7. Yamada H,Yaguchi H,Takamori K,Ogawa H. Plasmapheresis for the
treatment of pemphigus vulgaris and bullous pemphigoid. Ther
Apher 1997;1:178–82.
8. Harman KE, Albert S, Black MM. Guidelines for the management of
66
pemphigus vulgaris. Br J Dermatol 2003;149:926–37.
9. Schmidt E, Klinker E, Opitz A et al. Protein A immunoadsorption: a
novel and effective adjuvant treatment of severe pemphigus. Br J
Dermatol 2003;148:1222–9.
10. Shimanovich I, Herzog S, Schmidt E et al. Improved protocol for
treatment of pemphigus vulgaris with protein A immunoadsorption.
Clin Exp Dermatol 2006;31:768–74.
11. Yaguchi H, Yamada H, Takamori K. Immunoadsorption with
tryptophan and phenylalanine column as an effective treatment of
pemphigus vulgaris. Jpn J Apheresis 1997;16:128–32.
12. Ogata K, Yasuda K, Matsushita M, Kodama H. Successful
treatment of adolescent pemphigus vulgaris by immunoadsorption
method. J Dermatol 1999;26:236–9.
13. Lüftl M, Stauber A,Mainka A, Klingel R, Schuler G, Hertl M.
Successful removal of pathogenic autoantibodies in pemphigus by
immunoadsorption
with
a
tryptophan-linked
polyvinyl
alcohol
adsorber. Br J Dermatol 2003;149:598–605.
14. Eming R, Rech J, Barth S et al. Prolonged clinical remission of
patients
with
severe
desmoglein-reactive
pemphigus
autoantibodies
upon
by
rapid
removal
of
immunoadsorption.
Dermatology 2006;212:177–87.
15. Günther C, Laske J, Frind A, Julius U, Pfeiffer C. Successful
therapy of pemphigus vulgaris with immunoadsorption using the
TheraSorb adsorber. J Dtsch Dermatol Ges 2008;6:661–3.
16.
Eming
R,
Hertl
M.
Immunoadsorption
67
in
pemphigus.
Autoimmunity 2006;39:609–16.
17. 山 田 裕 道 、伊 藤 章 、畑 中 美 博 、築 地 美 鈴 、高 森 健 二 ；天 疱 瘡 の特 異 的 血
漿 吸 着 療 法 をめざして－これまでの研 究 の歩 みと新 しく開 発 されたチオフェン
リガンド吸 着 材 －； 日 本 アフェレシス学 会 雑 誌 , 28(3), 230-234, (2009)
18.
Tsunematsu
H,
Makisumi
S.
Interactions
of
derivatives
of
guanidinophenylglycine and guanidinophenylalanine with trypsin
and related enzymes. J Biochem 1980;88:1773–83.
19.
Ishii
K,
Amagai
M,
Hall
RP
et
al.
Characterization
of
autoantibodies in pemphigus using antigen-specific enzyme-linked
immunosorbent assays with baculovirus-expressed recombinant
desmogleins. J Immunol 1997;159:2010–17.
20. Hirata N, Kuriyama T, Yamawaki N. Immusorba TR and PH. Ther
Apher Dial 2003;7:85–90.
21. Ren J, Jia L, Xu L, Lin X, Pi Z, Xie J. Removal of autoantibodies
by
4-mercaptoethylpyridine-based
adsorbent.
J Chromatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sci 2009;877:1200–4.
22. Laffitte E, Skaria M, Jaunin F et al. Autoantibodies to the
extracellular and intracellular domain of bullous pemphigoid 180,
the
putative
key
autoantigen
in
bullous
pemphigoid,
belong
predominantly to the IgG1 and IgG4 subclasses. Br J Dermatol
2001;144:760–8.
23. Hamano H, Kawa S, Horiuchi A et al. High serum IgG4
concentrations in patients with sclerosing pancreatitis. N Engl J
Med 2001;344:732–8.
24. Liu LJ, Chen M, Yu F, Zhao MH, Wang HY. IgG subclass
68
distribution, affinity of anti-myeloperoxidase antibodies in sera
from
patients
withWegener ’s
granulomatosis
and
microscopic
polyangiitis. Nephrology 2008;13:629–35.
25. Engelmann R,Brandt J, EggertMet al. IgG1 and IgG4 are the
predominant
subclasses
among
auto-antibodies
against
two
citrullinated antigens in RA. Rheumatology 2008;47:1489–92.
26. McConville J, Farrugia ME, Beeson D et al. Detection and
characterization of MuSK antibodies in seronegative myasthenia
gravis. Ann Neurol 2004;55:580–4.
69
70
第3章
チエニルアミノ酸をリガンドとするフィブリノーゲン吸
着を抑制した選択的 IgG、IgM 抗体の吸着材
71
72
1.はじめに
ここ数 十 年 、抗 体 タンパク質 を分 離 および精 製 するための多 くの技 術 が報 告 さ
れている。抗 体 およびタンパク質 精 製 の分 野 では、リガンドが抗 体
2 - 5 ) 、プロテイン
G
1 ) 、プロテイン
A
6 ) 、又 はペプチド 7 ) , 8 ) である、抗 体 やタンパク質 に対 する親 和 性 リ
ガンドを持 つカラムが開 発 されている。しかしながら、これらのリガンドは不 安 定 であ
り、高 価 である。リガンドとして低 分 子 化 合 物 を有 した精 製 カラムも開 発 されてきた
9 - 1 2 ) 。これらの低 分 子 化 合 物 は、硫 黄 原 子 を含 有 し、"thiophilic
interaction"を
介 して IgG 抗 体 を吸 着 すると報 告 されている。
一 方 、自 己 免 疫 疾 患 をもった様 々な患 者 を治 療 するために自 己 抗 体 を吸 着 除
去 するための種 々のリガンドを有 する血 液 体 外 循 環 用 の吸 着 材
1 3 - 2 1 ) が利 用 され
ている。と りわけ、 治 療 用 吸 着 材 である イムソー バ TR（ IM-TR）と イム ソ ーバ PH
（IM-PH）（旭 化 成 メディカル、東 京 、日 本 ）は、それぞれ、シンプルなリガンドとして
トリプトファンとフェニルアラニンを有 している。これらのリガンドは安 定 であり、安 価
な低 分 子 であり、広 く自 己 免 疫 疾 患 の治 療 のために臨 床 現 場 で使 用 されている。
IM-TR と IM-PH は、それぞれ、トリプトファンまたはフェニルアラニンの芳 香 環 の
疎 水 性 相 互 作 用 を介 して血 漿 から自 己 抗 体 （主 に IgG および IgM 抗 体 ）を吸 着 、
除 去 する。しかしながら、IM-TR 及 び IM-PH を用 いた治 療 の回 数 が増 えると、フ
ィブリノーゲンも吸 着 してしまうため、血 液 中 のフィブリノーゲン濃 度 が低 下 するため
に出 血 のリスクが増 加 してしまう。そのために、フィブリノーゲンを吸 着 することなく選
択 的 に IgG および IgM のような抗 体 を吸 着 、除 去 できる安 定 で安 価 なリガンドの
開 発 が必 要 とされている。
第 2 章 では、天 然 ・非 天 然 アミノ酸 を含 む低 分 子 化 合 物 についてスクリーニング
を実 施 した結 果 、硫 黄 原 子 を含 むシンプルな化 合 物 であるチエニル基 を有 するチ
オフェン吸 着 材 は、天 疱 瘡 の自 己 抗 体 との親 和 性 が高 いことを論 じた
フィブリノーゲンの吸 着 性 については、検 討 していなかった。
73
2 2 ) 。しかし、
したがって、第 3 章 における研 究 の目 的 は、上 記 のチエニル基 を含 有 する低 分
子 リガンドを有 する吸 着 材 がフィブリノーゲンを吸 着 することなく、疎 水 性 およびチ
オフィリック相 互 作 用 を発 揮 して、十 分 に抗 体 を吸 着 することができるかどうかを検
討 することである。
この目 的 のために、4 つのチオール化 合 物 （L-α-3-チエニルグリシン、β-2-チエ
ニル-DL-セリン、β-2-チエニル-D-アラニン及 びチオフェン-2-エチルアミン）または
5 種 のアミノ酸 （グリシン、L-アラニン、L-セリン、L-フェニルアラニン及 び L-トリプトフ
ァン）を IM-TR および IM-PH に使 われている多 孔 質 ビーズに共 有 結 合 させたも
のを準 備 した。ビーズは共 有 結 合 で低 分 子 量 化 合 物 と結 合 させ、次 いで血 漿 タン
パク質 の吸 着 を in vitro で試 験 した。リガンドとしてチエニルアミノ酸 を含 有 する吸
着 材 は、フィブリノーゲンを吸 着 することなく、IgG および IgM を吸 着 することが見
出 された。
74
2.材 料 と方 法
2.1 血 液 血 漿 収 集
3 人 の健 常 人 ボランティアから得 た血 漿 を用 いて、血 漿 タンパク質 （アルブミン、
IgG 抗 体 、IgM 抗 体 、およびフィブリノーゲン）の吸 着 実 験 を行 った。書 面 によるイ
ンフォームドコンセントは、すべての被 験 者 から得 られ、また、研 究 は旭 化 成 メディ
カルの倫 理 委 員 会 によって承 認 された。
2.2 吸 着 材 の調 製
ポリ酢 酸 ビニルからなる多 孔 質 ビーズ（平 均 粒 径 100 μm; 旭 硝 子 株 式 会 社 、
日 本 排 除 限 界 分 子 量 100 万 以 上 ）100 g のゲルをジメチルスルホキシド（DMSO；
和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 、日 本 ）1 リットルに懸 濁 した。
次 いで、水 素 化 ホウ素 ナトリウム 750 mg、エピクロロヒドリン 780 mL、水 酸 化 ナ
トリウム 120 g（いずれの試 薬 も和 光 純 薬 社 製 ）のすべてをビーズ-DMSO 混 合 物
に注 ぎ、30 ℃ で 5 時 間 反 応 させ、エポキシ基 を多 孔 質 ビーズに導 入 した。
反 応 後 、 多 孔 質 ビ ーズを メタ ノ ー ル（ 和 光 純 薬 社 製 ） で 洗 浄 し、 次 い で蒸 留 水 で
洗 浄 した。
多 孔 質 ビーズのゲル１ミリリットル当 たり 110 μeq 以 上 のエポキシ基 を導 入 したこ
とを、滴 定 法 により確 認 した。すなわち、1 ％のフェノールフタレインのエタノール溶
液 （和 光 純 化 学 株 式 会 社 、日 本 ）を 2 滴 を 2 mL の活 性 化 された多 孔 質 ビーズゲ
ルを含 有 する 1.3 mmol/ L のチオ硫 酸 ナトリウム溶 液 （和 光 純 薬 社 製 ）4 mL に滴
下 した。次 に、0.1 N 塩 酸 を赤 の発 色 が 70 ℃ で観 察 されなくなるまで添 加 した。
導 入 されたエポキシ基 の量 は次 式 により算 出 した：活 性 化 の量 （エポキシ基 の量 ）
=塩 酸 の力 価 /樹 脂 の量 ×100。
75
2.3 リガンド固 定 化
炭 酸 緩 衝 液 、pH9.3（炭 酸 ナトリウム/重 炭 酸 ナトリウム、和 光 純 薬 社 製 ）を、溶
媒 として使 用 し、リガンドを 50 μeq/ mL・ゲルを固 定 化 量 として得 られるように溶 解
した。
リガンド溶 液 および活 性 化 ビーズ多 孔 質 ゲルを 50 ℃ で 16 時 間 、混 合 して反
応 させた。リガンドのアミノ基 と多 孔 質 基 ビーズのエポキシ基 の間 で共 有 結 合 を形
成 させ、吸 着 材 を得 た。
チエニ ルグリシン（L-α-3- チエニルグリ シン）、チ エニルセリン （β-（2 -チエニル）
-DL-セリン）、チエニルアラニン（β-（2-チエニル）-D-アラニン）、チオフェン-2 -エチ
ルアミン、グリシン、L-アラニン、L-セリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファンを、リ
ガンドとして使 用 した。全 ての化 合 物 は、Sigma-Aldrich 社 （St. Louis, USA）か
ら購 入 した。
ゲル 1 ml あたりの固 定 化 リガンドの量 （当 量 / mL ゲル）は、固 定 化 反 応 前 後 の
溶 液 中 で 200〜280 nm 間 の波 長 の最 も高 い吸 収 を用 いて計 算 した。各 化 合 物
は、ゲルの１ mL あたりほぼ 50 μeq の共 有 結 合 で固 定 化 された。
2.4 カラム吸 着 実 験
吸 着 材 （1.0 mL）を、2.5 mL の実 験 用 カラム（Molecular Biotechnology、
USA ） に 入 れ て 、 1:8 比 （ 容 量 比 ） で 抗 血 液 凝 固 剤 で あ る CPD （ Citrate
Phosphate Dextrose-A）液 を添 加 した健 常 人 の血 液 から遠 心 分 離 することによ
り得 られた血 漿 3.0 mL をシリンジポンプを用 いて 0.3 mL /分 の流 速 で 10 分 間 、
カラムを通 過 させて、カラムから溶 出 された血 漿 の全 てを回 収 した。
2.5 分 析
血 漿 は 、 カ ラム を 通 過 さ せて溶 出 さ せ る 前 後 に サン プリ ン グ した。 IgG および
76
IgM 抗 体 の濃 度 は免 疫 比 濁 法 により測 定 し、アルブミンの濃 度 は、比 濁 法 により
測 定 した。又 、フィブリノーゲンの濃 度 は、トロンビン凝 固 時 間 法 により測 定 した。
吸 着 率 （ ％）は、（Cout-Cin）/ Cin×100（ Cin； 吸 着 前 の 溶 質 濃 度 、 Cout ；吸 着
後 の溶 質 濃 度 ）として算 出 した。
2.6 統 計 解 析
データは平 均 ±標 準 偏 差 （SD）として提 示 し、Student’s t-test を用 いて検 定 し、
P <0.05 を統 計 的 に有 意 とした。
３．結 果 と考 察
本 研 究 の 目 的 は 、 リ ガン ドと し て、 チ エニ ル 基 を 有 す る 低 分 子 化 合 物 を 有 す る
吸 着 材 がフィブリノーゲン吸 着 することなく、抗 体 を十 分 に吸 着 できるかどうかを検
証 することであった。
異 なる化 学 構 造 をもったリガンドを評 価 するために、IM-TR 及 び IM-PH で使 用
されている多 孔 質 ビーズを用 いた。リガンドの化 学 構 造 を図 3-1 に示 した。使 用 し
たリガンドは、通 常 、IM-TR および IM-PH で使 用 されるトリプトファン及 びフェニル
アラニン；天 疱 瘡 に対 する抗 体 を吸 着 するチオフェン-2-エチルアミン;
チオフェン
-2-チエニルエチルアミンにカルボキシル基 を有 するチエニルアラニン; チエニルア
ラニンの側 鎖 に水 酸 基 を有 するチエニルセリン； チエニルアラニンのメチレン鎖 の
ないチエニルグリシンであり、これらのアミノ酸 に対 応 する 3 個 のアミノ酸 （グリシン、
アラニン、およびセリン）をリガンドとして用 いた。
77
図 3-1 リガンドの化 学 構 造
78
3.1 アルブミンの吸 着
アルブミンの吸 着 率 を図 3-2 に示 した。チオフェン-2-エチルアミンは、アルブミン
のわずかに高 い吸 着 を示 したが、使 用 された吸 着 材 の間 では差 異 はなかった。す
なわち、チエニルアミノ酸 リガンドは、アルブミンの吸 着 については、臨 床 で使 用 さ
れている IM-TR および IM-PH と同 じレベルを示 した。
79
図 3-2
アルブミンの吸 着 率
80
3.2
IgG の吸 着
IgG の吸 着 率 は、図 3-3 に示 した。IgG の吸 着 率 の順 序 は、トリプトファン、チオ
フェン-2-エチルアミン、チエニルアラニン、チエニルグリシン、チエニルセリン、及 び
フェニルアラニンの順 であった。他 のリガンドは、IgG は若 干 の吸 着 性 を示 した。な
お、チオフェン-2-エチルアミンは、天 疱 瘡 に対 する抗 体 をトリプトファンより高 い吸
着 性 を示 すことが報 告 されている 2 2 ) 。しかしながら、上 記 以 外 のすべてのリガンドに
ついては、IgG の吸 着 に関 して、チオフェン-2-エチルアミンやトリプトファンより劣 っ
ていた。したがって、チオフェン-2-エチルアミンは、天 疱 瘡 に対 する IgG 抗 体 に特
異 的 親 和 性 を有 すると思 われる。 3 つのチエニルアミノ酸 は、フェニルアラニンより
わずかに高 い IgG の吸 着 性 を示 した。しかし、チエニル基 を持 っていない 3 つのア
ミノ酸 （グリシン、L-アラニン、L-セリン）は IgG を吸 着 しなかった。このように、チエニ
ル基 は、IgG と強 く相 互 作 用 していると考 えられる。なお、Porath らによって、チオ
エーテル基 に近 接 したスルホン基 を含 有 するリガンドが非 常 に免 疫 グロブリンと相
互 作 用 するという "thiophilic interaction"が報 告 されている
9 ) , 1 0 ) 。しかしながら、
リガンドとタンパクの相 互 作 用 において " thiophilic interaction " のメカニズム
については、完 全 には理 解 できていないが、Porath らは、リガンドがタンパク質 表
面 でアクセスできる芳 香 族 アミノ酸 とスルホンチオエーテル硫 黄 原 子 間 の
electron-donor/acceptor 機 構 や プ ロ ト ン 移 動 を 伴 っ て い る こ と を 推 測 し て い る
23)。
最 近 では、Ren ら
2 4 ) は、4-mercaptoethylpyridine
系 の吸 着 材 が、in vitro
の実 験 において、患 者 の血 清 サンプルから二 本 鎖 DNA およびリウマチ因 子 に対
する抗 体 を除 去 することができることを示 した。 4-Mercaptoethylpyridine は、チ
オール基 と窒 素 を含 む複 素 環 式 芳 香 族 化 合 物 である。我 々の研 究 においては、リ
ガンドが芳 香 族 化 合 物 である吸 着 材 は、自 己 抗 体 に強 い親 和 性 を持 っている傾
向 にあった。チエニル基 と自 己 抗 体 の親 和 性 に関 しては、芳 香 環 に加 えて硫 黄 も、
81
また、関 与 しているものと思 われる。
82
図 3-3 IgG の吸 着 率
83
3.3 フィブリノーゲンの吸 着
フィブリノーゲンに対 する吸 着 率 は、図 3-4 に示 した。3 つのチエニルアミノ酸 （チ
エニルグリシン、チエニルアラニン、及 びチエニルセリン）のフィブリノーゲン吸 着 率
は 3 つの対 応 するアミノ酸 （グリシン、アラニン、およびセリン）に比 べて低 かった。驚
くべきことに、チエニルグリシン及 びチエニルアラニンは、ほとんどこの実 験 において
フィブリノーゲンを吸 着 しなかった。対 照 的 に、フィブリノーゲンの吸 着 率 は、チオフ
ェ ン-2- エチル アミ ン 、 トリ プトフ ァン 、フ ェニルアラニ ンの 順 で 高 かった。 チオフ ェン
-2-エチルアミンのフィブリノーゲン吸 着 率 は高 かったが、チオフェン-2-エチルアミン
にカルボキシル基 を有 するチエニルアラニンのフィブリノーゲン吸 着 率 は、低 いこと
が観 察 された。
このように、カルボン酸 が吸 着 材 の表 面 上 にあるとき、フィブリノーゲンの吸 着 が
抑 制 されるように見 える。この理 由 としては、血 漿 中 のフィブリノーゲンの pKa が他
のタンパク質 （例 えば、アルプミン、IgG 及 び IgM 抗 体 ）のそれより酸 性 側 にあるた
めかもしれない。このこととは対 照 的 に、トリプトファンの高 いフィブリノーゲン吸 着 性
は 、 嵩 高 い イン ドール 環 と フ ィ ブリ ノ ーゲ ンと の 間 の 疎 水 性 相 互 作 用 が 、 カ ルボン
酸 とフィブリノーゲンの間 の静 電 相 互 作 用 よりも強 いことに起 因 していると考 えられ
る。
尚 、第 2 章 において天 疱 瘡 自 己 抗 体 の吸 着 材 のスクリーニングに用 いた、パラグ
アニジノフェニルアラニンを固 定 化 した吸 着 材 のフィブリノーゲン吸 着 性 についても
調 べた。その結 果 、そのフィブリノーゲン吸 着 性 は、トリプトファンを固 定 化 した吸 着
材 と同 等 以 上 であった（data not shown）。これは、フェニルアラニンのパラ位 にあ
るグアニジル基 が陽 性 電 荷 を有 するために、静 電 的 な相 互 作 用 によって極 めて高
いフィブリノーゲン吸 着 性 を示 したものと考 えられる。
84
図 3-4 フィブリノーゲンの吸 着 率
85
3.4
IgM の吸 着
IgM 抗 体 に対 する吸 着 率 は、図 3-5 に示 した。3 つのチエニルアミノ酸 （チエニ
ルグリシン、チエニルアラニン、及 びチエニルセリン）は、トリプトファンと同 じか同 等
以 上 の IgM 吸 着 性 を示 した。 IgM 抗 体 は、次 に、フェニルアラニン、チオフェン
-2-エチルアミンの順 に吸 着 された。他 のリガンドは、ほとんど、IgM を吸 着 しなかっ
た。これは、チエニル基 が強 く IgM 抗 体 と相 互 作 用 していることを示 している。対
照 的 に、予 期 せず、チオフェン-2-エチルアミンの IgM の吸 着 は低 かった。上 述 し
たように、カルボキシル基 との相 互 作 用 は、おそらく IgM 抗 体 の吸 着 にも寄 与 して
いるもと思 われる。したがって、チオフェン-2 - エチルアミンのカルボキシル基 の欠
失 は、IgM 抗 体 との相 互 作 用 を弱 くする可 能 性 があるといえる。
IgM との相 互 作 用 においては、おそらく、トリプトファンやフェニルアラニンの芳 香
環 によって媒 介 される疎 水 性 相 互 作 用 とチエニル基 によって媒 介 される "チオフ
ェン"相 互 作 用 による寄 与 と、又 、カルボキシル基 による静 電 相 互 作 用 の寄 与 も関
連 しているものと考 えられる。
86
図 3-5 IgM の吸 着 率
87
3.5 IgG / Fbg および IgM / Fbg
フィブリノーゲンの吸 着 率 に対 する IgG の吸 着 率 の比 （IgG / Fbg）とフィブリノ
ーゲンの吸 着 率 に対 する IgM の吸 着 率 の比 （IgM 抗 体 / Fbg）を図 3-6 に示 し
た。
3 つのチエニルアミノ酸 （チエニルグリシン、チエニルアラニン、及 びチエニルセリ
ン）は、他 のリガンドに対 して高 い IgG / Fbg 比 および IgM / Fbg 比 を有 していた。
上 述 したように、これらのアミノ酸 は、フィブリノーゲンの吸 着 を抑 制 した。そして、そ
れらは選 択 的 に IgG および IgM を吸 着 した。
88
図 3-6 フィブリノーゲンの吸 着 率 に対 する IgG 及 び IgM の吸 着 率 の比
89
４．結 論
チエニルアミノ酸 （チエニルグリシン、チエニルアラニン、及 びチエニルセリン）は、
ほ と んど フ ィ ブリ ノ ー ゲ ン を 吸 着 し なか っ たが 、 それ らは 、 選 択 的 に IgG と 、 特 に
IgM を吸 着 した（表 3）。この知 見 は、臨 床 現 場 での効 率 的 な血 漿 浄 化 のために
有 効 であるように思 える。なぜなら、チエニルグリシンの IgG の吸 着 性 は、IM-TR
の 2/3 程 度 であるが、吸 着 材 の量 を 1.5 倍 に増 加 した場 合 、例 えば、IgG の吸 着
率 は、IM-TR とほぼ同 じになると推 定 される。その場 合 、チエニルグリシンのフィブ
リノーゲン吸 着 量 は 1.5 倍 （フィブリノーゲン吸 着 率 は 9.3 ％である）となるが、それ
は IM-TR のフィブリノーゲン吸 着 率 に比 べてまだ十 分 に低 いといえる。
したがって、チエニルアミノ酸 を有 する吸 着 材 は、自 己 免 疫 疾 患 において産 生 さ
れた抗 体 を除 去 するための、あるいは、ABO 不 適 合 臓 器 移 植 における IgG および
IgM を除 去 するために有 用 であると考 えられる。今 後 は、in vitro での生 体 適 合
性 試 験 、in vivo における動 物 実 験 や臨 床 試 験 が必 要 である。
90
表 3 血 漿 タンパクの吸 着 率 と Fbg 吸 着 率 に対 する IgG 及 び IgM 吸 着 率 の比
91
参考文献
1. Mellman IS, Unkeless JC. (1980) Purificaton of a functional mouse
Fc receptor through the use of a monoclonal antibody. J Exp
Med. 152: 1048-1069.
2. Nakayama H, Withy RM, Raftery MA. (1982) Use of a monoclonal
antibody to purify the tetrodotoxin binding component from the
electroplax of Electrophorus electricus. Proc Natl Acad Sci 79:
7575-7579.
3. Ansari AA, Chang TS. (1983) Immunochemical studies to purify
rabbit
and
chicken
immunoglobulin
G
antibody
by
protein
A-Sepharose chromatography. Am J Vet Res. 44: 901-906.
4. Schmerr MJ, Goodwin KR. (1991) Separation of ovine IgG1 and
IgG2 on protein A-sepharose. Comp Immunol Microbiol Infect
Dis. 14: 289-295.
5. Zusman R, Beckman DA, Zusman I, Brent RL. (1992) Purification of
sheep immunoglobin G using protein A trapped in sol-gel glass. Anal
Biochem. 14; 103-106.
6. Faulmann EL, Boyle MD. (1991) A simple preparative procedure to
extract and purify protein G from group G streptococci. Prep
Biochem. 21:75-86.
7. Palombo G, Rossi M, Cassani G, Fassina G. (1998) Affinity
purification of mouse
monoclonal IgE using a protein A mimetic
ligand (TG19318) immobilized on solid supports. J Mol Recognit. 11:
247-249.
8. Yang H, Gurgel PV, Carbonell RG. (2009) Purification of human
92
immunoglobulin G via Fc-specific small peptide ligand affinity
chromatography. J Chromatogr A. 1216: 910-918.
9. Porath J, Maisano F, Belew M. (1985) Thiophilic adsorption--a new
method for protein fractionation. FEBS Lett. 185: 306-310.
10.
Hutchens
TW,
Porath
J.
(1986)
Thiophilic
immunoglobulins--analysis
of
conditions
adsorption
optimal
for
of
selective
immobilization and purification. Anal Biochem. 159: 217-226.
11. Belew M, Juntti N, Larsson A, Porath J. (1987) A one-step
purification
method
for
monoclonal
antibodies
based
on
salt-promoted adsorption chromatography on a 'thiophilic' adsorbent.
J Immunol Methods. 102: 173-182.
12. Qian H, Li C, Zhang Y, Lin Z. (2009) Efficient isolation of
immunoglobulin G by paramagnetic polymer beads modified with
2-mercapto-4-mythyl-pyrimidine. J Immunol Methods. 343: 119-129.
13. Belàk M, Borberg H, Jimenez C, Oette K. (1994) Technical and
clinical experience with protein A immunoadsorption columns.
Transfus Sci. 15: 419-422.
14. Samuelsson G. (2001) Extracorporeal immunoadsorption with
protein A: technical aspects and clinical results. J Clin Apher.
16:49-52.
15. Yoshida M, Tamura Y, Yamada Y, Yamawaki N, Yamashita Y. (2000)
Immusorba TR and Immusorba PH: basics of design and features of
functions. Ther Apher. 4: 127-134.
16. Sato Y, Kimata N, Miyahara S, Nihei H, Agishi T, Takahashi M.
(2000) Extracorporeal adsorption as a new approach to treatment of
93
botulism. ASAIO J. 46: 783-785.
17. Hirata N, Kuriyama T, Yamawaki N. (2003) Immusorba TR and PH.
Ther Apher Dial. 7: 85-90.
18. Sugimoto K, Yamaji K, Yang KS, Kanai Y, Tsuda H, et al. (2006)
Immunoadsorption plasmapheresis using a phenylalanine column as
an effective treatment for lupus nephritis. Ther Apher Dial. 10:
187-192.
19. Rönspeck W, Brinckmann R, Egner R, Gebauer F, Winkler D, et al.
(2003) Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption.
Ther Apher Dial. 7: 91-97.
20. Rech J, Hueber AJ, Kallert S, Leipe J, Kalden JR, et al. (2008)
Remission of demyelinating polyneuropathy with immunoadsorption,
low dose corticosteroids and anti-CD20 monoclonal antibody. Ther
Apher Dial. 12: 205-208.
21. Kiseleva EA, Afanasieva OI, Kosheleva NA, Pokrovsky SN. (1996)
Immunosorbent for IgG apheresis: an in vitro study. Transfus Sci.
17: 519-525.
22. Yamada H, Itoh A, Hatanaka Y, Tsukiji M, Takamori K. (2010)
Screening and analysis of adsorbents autoantibodies. Ther Apher
Dial. 14: 292-297.
23. Hutchens TW, Porath J. (1986) Protein recognition of immobilized
ligans: Promotion of selective adsorption. Clin Chem 33; 1502-1508.
24. Ren J, Jia L, Xu L, Lin X, Pi Z, et al. (2009) Removal of
autoantibodies
by
4-mercaptoethylpyridine-based
adsorbent.
Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 877: 1200-1204.
94
J
第４章
パラグアニジノフェニルアミノ酸誘導体と
Streptomyces griseus トリプシンとの相互作用
95
96
１． はじめに
酵 素 と基 質 の反 応 においては、通 常 、基 質 濃 度 がある範 囲 を超 えると、反 応 速
度 が低 下 したり、逆 に、反 応 速 度 が上 昇 したりする場 合 がある。反 応 速 度 が低 下
する場 合 を基 質 による阻 害 （基 質 阻 害 ）と呼 び、反 応 速 度 が上 昇 する場 合 を基 質
による活 性 化 (基 質 活 性 化 )という。
アルギニンの側 鎖 であるアルキルメチレン鎖 がベンゼン環 で置 換 された N α -置 換
の p-グアニジノ-L-フェニル L アラニン（GPA）のエステル、アミドおよびアニリドは、
ウシトリプシンの優 れた基 質 であり、GPA の N α -置 換 アニリド基 質 の酵 素 的 加 水 分
解 において、アルギニンの基 質 の加 水 分 解 と同 様 に基 質 活 性 化 が観 察 されること
が報 告 されている
1-4) 。
又 、 Streptomyces griseus （ S.G. ） ト リ プ シ ン に よ る
N α -p- ト ル エン スルホ ニ ル-L- アル ギニン メチルエス テルの 加 水 分 解 に お い て基 質
活 性 化 が 観 察 さ れ 、 一 方 、 N α - ベ ン ゾ イ ル -L- ア ル ギ ニ ン -p- ニ ト ロ ア ニ リ ド
（Bz-Arg-pNA）のこの酵 素 による加 水 分 解 では、基 質 阻 害 が観 察 されたことが報
告 されている
5)。
一 方 、Read らは、放 線 菌 （ Streptomyces griseus ）由 来 のトリプシン様 酵 素 で
ある S.G.トリプシンの X 線 結 晶 構 造 は、ウシトリプシンと 33％の配 列 同 一 性 を有 し
ており、部 分 的 に α-キモトリプシンに類 似 しているが、S.G.トリプシンの構 造 は、ウシ
トリプシンとは明 らかに異 なっていることを報 告 している
6 ) (図
4-1)。
我 々は、GPA 誘 導 体 が、ウシトリプシンと同 様 にこの酵 素 によって急 速 に加 水
分 解 されることを見 出 した。 GPA 基 質 の側 鎖 は、ベンゼン環 と正 に帯 電 したグア
ニジノ基 の両 方 で構 成 されており、S.G.トリプシンによる GPA 誘 導 体 の加 水 分 解
の速 度 論 的 解 析 を行 うことは、大 変 意 義 深 い。第 4 章 では、GPA とアルギニンの
エステル、アミド及 びアニリド基 質 並 びに p-グアニジノ-L-フェニルグリシンのエステ
ル基 質 と S.G.トリプシンによる加 水 分 解 における相 互 作 用 について解 析 し、S.G.ト
リプシンとウシトリプシンの活 性 部 位 の構 造 上 の違 いを推 察 した。
97
図 4-1
ウシトリプシンと Streptomyces griseus トリプシンの構 造
98
２．材 料 と方 法
2.1 基 質
Bz-Arg-OEt•HCI、Bz-Arg-NH 2 •HCI および Bz-Arg-pNA•HCI は、蛋 白
質 研 究 所 （箕 面 、大 阪 ）から購 入 した。 Z-Arg-pNA•HCI と Ac-Arg-pNA•HCI
は 、 Somorin ら の 方 法 に よ っ て 合 成 し た
Bz-GPA-OEt•HCI
、
Bz-GPA-NH2•HCl
7)
、
。
Bz-GPG-OEt•HCI 、
Bz-GPA-pNA•HBr
、
Z-GPA-pNA•HCI と Ac-GPA-pNA•HBr は、Tsunematsu らの方 法 に従 って調
製 した
2-4)
(図 4-2 )。
99
図 4-2
Arg, GPA, GPG 基 質 の構 造
100
2.2 酵 素
ウシトリプシン（凍 結 乾 燥 品 ; Lot.10813460）は、ベーリンガーマンハイム山 之
内 （株 ）から入 手 し、Tsunematsu らの方 法
4 ) によって
57 ％の活 性 があることを確
認 し た 。 S.G. ト リ プ シ ン は 、 Yokosawa ら の 方 法 に よ り 科 研 化 学 工 業 株 式 会 社
（東 京 ）、から入 手 したアクチナーゼ E（プロナーゼ E）から精 製 した
8)。
実 験 に用
いた S.G.トリプシン溶 液 の活 性 規 定 度 は、活 性 部 位 滴 定 剤 として p-ニトロフェニル
-p ' -グアニジノベンゾエートを用 いて決 定 した
9 ) 。この酵 素 のモル濃 度 は
M-1•cm-1 のモル吸 光 係 数 を用 いて、280nm の吸 光 度 から決 定 した
37100
8)。
2.3 速 度 論 的 解 析
S.G.トリプシンによるアルギニン、GPA 及 び GPG のエステル基 質 の加 水 分 解 の
初 期 速 度 は、radiometer RTS-5 titrator（water-jacketed cell 付 き）を用 いて
25℃ （pH 7.85）で決 定 した
2 ) 。アッセイ混 合 溶 液 中 の酵 素 濃 度 は、Bz-Arg-OEt
に対 しては、（3.59－3.86）・10 - 8 M、Bz-GPA-OEt に対 しては、（3.36－3.91）・
10 - 8 M、Bz-GPG-OEt に対 しては、（7.80－8.18）・10 - 7 M であった。基 質 濃 度
範 囲 は、Bz-Arg-OEt においては、1.56・10-5 －1.23・10 - 3 、Bz-GPA-OEt にお
い て は 、 1.57•10-5 － 1.96•10 - 4 M 、 Bz-GPG-OEt に お い て は 、 4.71•10-5 －
4.02•10 - 4 M であった。
S.G.トリプシンによる GPA およびアルギニンのアミドおよびアニリド基 質 の加 水
分 解 速 度 は、分 光 光 度 を用 いた測 定 を行 った
4 ) 。アミド基 質 の場 合 には、アッセイ
混 合 溶 液 中 の酵 素 濃 度 は、それぞれ、Bz-GPA-NH 2 に対 しては、1.47•10 - 7 M、
Bz-Arg-NH 2 に対 しては、1.50・10 - 7 M であった。そして、基 質 濃 度 範 囲 について
は 、 そ れ ぞ れ 、 Bz-GPA-NH 2 に お い て は 、 9.48•10 - 5 － 4.74•10 - 4 M 、
Bz-Arg-NH 2 においては、1.25•10 - 4 －7.49•10 - 4 M であった。アニリド基 質 の場
合 に は 、 ア ッ セ イ 混 合 溶 液 中 の 酵 素 濃 度 は 、 GPA の ア ニ リ ド 基 質 に 対 し て は 、
101
8.68•10 - 8 － 1.15•10 - 7 M 、 ア ル ギ ニ ン の ア ニ リ ド 基 質 に 対 し て は 、 6.39•10 - 8 －
1.21•10 - 7 M であ っ た。 基 質 濃 度 の 範 囲 は 、 GPA の アニ リ ド 基 質 に おい ては 、
2.58•10 - 6 － 8.16•10 - 4 M 、 ア ル ギ ニ ン の ア ニ リ ド 基 質 に お い て は 、 1.23•10 - 5 －
2.30•10 - 3 M であった。 K m と k cat の値 については、単 純 なミカエリス-メンテンの
式 が適 用 可 能 である低 い基 質 濃 度 範 囲 のデータを用 い、異 なる 8-10 点 の [E] 0
/ v vs. 1 / [S]のプロットから最 小 二 乗 法 を用 いて計 算 した
10)。
３．結 果 と考 察
3.1 エステル基 質 の加 水 分 解
速 度 定 数 を決 定 する前 に、S.G.トリプシンによる Bz-GPA-OEt の加 水 分 解 の
pH 活 性 相 関 を調 べた。基 質 濃 度 を固 定 して（1・10 - 4 M）、pH に対 して初 期 速 度
をプロットすると、pH7.8 付 近 で最 大 値 をもつ曲 線 のパターンを持 つベル型 曲 線 が
得 ら れ 、 そ れ は 、 Bz-Arg-OEt の 加 水 分 解 の 場 合 と よ く 似 て い た （ data not
shown） 。 こ の 相 関 関 係 は 、 こ れ ら二 つ の 基 質 の ウシトリ プ シン に よる 加 水 分 解 に
類 似 していた。
Bz-GPA-OEt の S.G.トリプシンによる加 水 分 解 で観 測 された初 速 度 の基 質 濃
度 に対 する依 存 性 を Eadie プロットの形 で表 現 し、図 4-3(a)に示 した
11 ) 。プロット
は、約 1・10 - 4 M の基 質 濃 度 まで直 線 をなし、このことは、酵 素 による加 水 分 解 過
程 がこの低 濃 度 範 囲 では、単 純 なミカエリス-メンテンの速 度 論 に従 うことを示 して
いる。約 1・10 - 4 M よりも高 い基 質 濃 度 範 囲 のグラフの上 方 への湾 曲 は、基 質 活
性 化 の結 果 として説 明 することができる。同 様 の現 象 は、Bz-Arg-OEt の加 水 分
解 において、基 質 の濃 度 範 囲 が約 5・10 - 4 M よりも高 い範 囲 で観 察 された。このこ
とは、これら 2 つの Bz-GPA-OEt 及 び Bz-Arg-OE の基 質 の K m 値 の間 に有 意
な差 異 はないけれども、基 質 活 性 化 は、2 つのエステル基 質 でそれぞれ異 なる濃
度 レベル以 上 から起 こるということを示 しており興 味 深 い。
102
Trowbridge らは、ウシトリプシンによる N α -p-トルエンスルホニル-L-アルギニンメ
チルエステルの加 水 分 解 で起 こる基 質 活 性 化 には、通 常 のミカエリス複 合 体 （ES）
以 外 に、酵 素 -基 質 の三 つの複 合 体 （SES）の生 成 を含 むメカニズムを提 案 してい
る
1 2 ) 。この基 質 における
S.G.トリプシンの基 質 活 性 化 のメカニズムもこの機 構 によ
って説 明 することができると思 われる。Bz-GPA-OEt の側 鎖 のベンゼン環 の S.G.ト
リプシンの二 次 結 合 部 位 への結 合 性 は、Bz-Arg-OEt の側 鎖 のメチレン基 の結 合
性 よりも優 れている可 能 性 が高 いと思 われる。しかしながら、そのような基 質 活 性 化
は 、 Bz-GPA-OEt の ウ シ ト リ プ シ ン に よ る 加 水 分 解 に お い て は 、 基 質 濃 度 が
1.25•10 - 3 M までは観 察 されなかったことが報 告 されている
2)。
すなわち、S.G.ト
リプシンとウシトリプシンとの間 で、基 質 活 性 化 の現 象 における重 要 な差 異 が 明 ら
かになったといえる。
基 質 活 性 化 は、S.G.トリプシンによる Bz-GPG-OEt の加 水 分 解 では、基 質 濃
度 が 4.02•10 - 4 M までは観 察 されなかった。S.G.トリプシンによる Bz-GPA-OEt、
Bz-Arg-OEt、及 び Bz-GPG-OEt の加 水 分 解 速 度 パラメーターは、単 純 なミカエ
リス-メンテンの式 に適 応 可 能 と思 われる低 い基 質 濃 度 の範 囲 内 のデータを用 いて
算 出 した。これらのデータは、ウシトリプシンによる加 水 分 解 で報 告 されたものと一
緒 に 、 表 4 に 記 載 し た 。 二 次 速 度 定 数 で あ る （ k cat / K m ） に 基 づ く と 、
Bz-GPA-OEt での値 は、Bz-Arg-OEt でのそれよりも 2 倍 低 かった。前 者 に対 す
る K m 値 は、ほぼ後 者 のそれと同 じであったが、前 者 の k cat 値 は後 者 に比 べて約
2 倍 低 かった。ウシトリプシンによる GPA とアルギニンのエステル基 質 の加 水 分 解
時 における k cat および K m 値 の間 で顕 著 な差 が見 出 されており、このことは、
Bz-GPA-OEt の側 鎖 であるベンゼン環 の影 響 に起 因 すると考 えられるということが
報 告 されている
2 ) 。しかしながら、本 研 究 では、このような現 象 は、S.G.トリプシンに
よる GPA およびアルギニンのエステル基 質 の加 水 分 解 では観 察 されなかった。こ
れらの結 果 は、ウシトリプシンとは異 なり、S.G.トリプシンは、GPA のベンゼン環 とア
103
ルギニンのメチレン基 の構 造 の違 いを区 別 することができないことを示 している。
Nozawa らは、'逆 基 質 （inverse substrate）'を使 用 して得 られたデータから、
アシル残 基 と特 異 的 リガンドの共 存 に関 連 して、ウシトリプシンの活 性 部 位 の空 間
的 な抑 制 は、S.G.トリプシンのそれよりも厳 密 であることを推 測 している
1 3 ) 。我 々の
結 果 もまた、ウシトリプシンの活 性 部 位 は、S.G.トリプシンのそれよりも厳 密 であると
いう概 念 を支 持 するものである。
Bz-GPA-OEt は、Bz-GPG-OEt よりも約 570 倍 高 い率 で、S.G. トリプシンによ
って加 水 分 解 された。 Bz-GPA-OEt での K m 値 は、Bz-GPG-OEt でのそれより
57 倍 低 く、一 方 、 k cat 値 は 10 倍 高 くなっている。これらの結 果 は、GPA 誘 導 体
の β-メチレン基 が、ウシトリプシンによる加 水 分 解 と同 様 に、S.G.トリプシンによる加
水 分 解 においても重 要 な役 割 を果 たしていることを示 している
2)
。特 に、β-メチレ
ン基 の存 在 は、ウシトリプシンの加 水 分 解 時 の K m とは異 なり、S.G.トリプシンによ
る加 水 分 解 時 の K m 値 に影 響 している。
104
図 4-3
S.G.トリプシンによる各 基 質 の加 水 分 解 (25℃, pH8.0)
における Eadie プロット
105
3.2
アミドおよびアニリド基 質 の加 水 分 解
Bz-GPA-NH 2 と GPA の N α -置 換 のパラニトアニリド基 質 の S.G.トリプシンによる
加 水 分 解 の至 適 pH は、それぞれ 8.0 と 8.2 であり、この挙 動 は、ウシトリプシンの
それと類 似 していた。アミド基 質 における S.G.トリプシンの挙 動 は、基 質 の濃 度 範
囲 が 6.50•10 - 4 M 以 下 においては、ミカエリス-メンテンの速 度 式 に従 った。アミド
基 質 による活 性 化 も阻 害 も観 察 されなかった。一 方 、三 つのアルギニン基 質 に類
似 した GPA の N α -置 換 アニリド基 質 の加 水 分 解 においては、基 質 阻 害 が観 察 さ
れた。
GPA 及 びアルギニンのアニリド基 質 の S.G.トリプシンによる加 水 分 解 の Eadie
プロットを図 4-3（b）（c）に示 した。Ac-、Bz-及 び Z-保 護 された GPA の p-ニトロア
ニリド基 質 およびアルギニン基 質 の加 水 分 解 において、それぞれ、基 質 濃 度 範 囲
が、約 5.0•10 - 5 、5.0•10 - 5 、1.0•10 - 4 M と約 3.0・10 - 4 、2.0•10 - 4 、1.0•10 - 4 M よ
りも高 い範 囲 で、基 質 阻 害 が観 察 された。なお、ウシトリプシンによるエステルの加
水 分 解 における基 質 活 性 化 は、N α -置 換 基 の種 類 に密 接 に関 連 することが報 告 さ
れているが
1 4 ) 、このような関 係 は、アルギニンおよびリシンのアニリド基 質 の場 合 に
は、成 り立 たない
1 4 - 1 7 ) 。また、我 々は、基 質 活 性 化 は
5.10 - 4 M よりも高 い基 質 濃
度 において、GPA の Nα-置 換 （AC-、Bz-および Z-）のアニリド基 質 のウシトリプシン
による加 水 分 解 で観 察 され、N α -置 換 基 の種 類 とは関 係 ないことを報 告 している
4)。
しかしながら、S.G.トリプシン加 水 分 解 において、基 質 阻 害 は GPA とアルギニンの
アニリド基 質 の N α -置 換 基 の種 類 に関 連 していた。このように、基 質 阻 害 は GPA
基 質 の加 水 分 解 においては、アルギニン基 質 の濃 度 よりも低 い濃 度 範 囲 で観 測 さ
れた。
106
表 4 S.G. ト リ プ シ ン 及 び ウ シ ト リ プ シ ン に よ る GPA, Arg 基 質 の 加 水 分 解
（25℃）における速 度 パラメーター
＊ウシトリプシンのデータは、Tsunematsu らの報 告
107
2 ) , 4 ) を引 用 した。
この事 実 は、これら二 つの基 質 のベンゼン環 及 び側 鎖 のメチレン基 の違 いに由
来 すると思 われる。そのことは、つまり、ベンゼン環 の補 助 的 な結 合 部 位 に対 する
結 合 性 が 、 メチ レン 基 の そ れ よ り 勝 っ て い る と 考 え られ る 。 ま た、 GPA 基 質 に よ る
S.G.トリプシンの基 質 阻 害 のメカニズムは Trowbridge らによって提 案 されたメカニ
ズムによっても説 明 できると思 われる
12)。
但 し、何 故 、S.G.トリプシンによるエステ
ル基 質 での基 質 活 性 化 とアニリド基 質 での基 質 阻 害 が起 こるのか、その理 由 につ
いてはまだ明 らかではない。
Bz-GPA-NH 2 での二 次 速 度 定 数 （ k cat / K m）は、Bz-Arg-NH 2 の場 合 とよく
似 ていながら、エステル基 質 である Bz-GPA-OEt でのそれよりも約 3300 倍 低 かっ
た。Bz-GPA-NH 2 での kcat 値 は、Bz-Arg-NH 2 に比 べ 7 倍 低 く、一 方 、 K m 値
は、後 者 のそれよりも 5 倍 低 かった。 S.G.トリプシンのこれらの基 質 の結 合 親 和 性
が K m に関 連 しているとすると、この酵 素 の特 異 性 部 位 への結 合 能 においては、
Bz-GPA-NH 2 は、Bz-Arg-NH 2 よりも好 ましいことは明 らかである。これは、S.G.ト
リプシンによるアミド基 質 の加 水 分 解 に おいて、Bz-GPA-NH 2 の側 鎖 のベンゼン
環 の結 合 は、Bz-Arg-NH 2 のメチレン基 のそれより良 好 であることを示 唆 している。
一 方 、Bz-GPA-NH 2 の低 い k cat 値 は、S.G.トリプシンの触 媒 セリン残 基 の切 断
可 能 なアミド結 合 への配 向 不 良 に起 因 する可 能 性 がある。Bz-GPA-NH 2 の K m
値 は 、 Bz-GPA-OEt の そ れ よ り も 約 10 倍 大 き く 、 Bz-Arg-NH 2 の そ の 値 は 、
Bz-Arg-OEt でのそれよりも約 70 倍 高 かった。S.G.トリプシンによる Bz-GPA-OEt
と Bz-GPA-NH 2 の 加 水 分 解 に お け る K m 値 と の 差 は 、 Bz-Arg-OEt と
Bz-Arg-NH 2 の加 水 分 解 における K m 値 との差 ほど大 きくない。これは、S.G.トリ
プシンによる Bz-GPA-OEt の加 水 分 解 において、律 速 段 階 は、脱 アシル化 過 程
であるが、アシル化 過 程 の速 度 と脱 アシル化 過 程 の速 度 との間 に大 きな違 いがな
いことを意 味 している。Bz-GPA-OEt の k cat 値 は、Bz-GPA-NH 2 に比 べ、約 310
倍 高 くなっているが、Bz-Arg-OEt での k cat 値 は、Bz-Arg-NH 2 のと比 較 して、わ
108
ずかに 66 倍 高 いだけである。Bz-GPA-NH 2 の k cat 値 に対 する Bz-GPA-OEt の
k cat 値 の 比 率 は 、 アル ギニ ン の アミ ド 基 質 の k cat 値 に 対 する エス テ ル基 質 の
k cat 値 の比 率 に比 べ約 5 倍 高 かった。しかし、この比 率 は、ウシトリプシンによる
Bz-GPA-OEt と Bz-GPA-NH 2 の加 水 分 解 のそれと比 較 して、それほど高 くはなか
った。 Bz-GPA-OEt での k cat 値 は、Bz-Arg-OEt でのそれよりも約 2 倍 低 かっ
たというこの事 実 は、ウシトリプシン加 水 分 解 で得 られた結 果 とは大 きく異 なってい
る。我 々は、Bz-GPA-OEt の側 鎖 のベンゼン環 によって誘 導 されるウシトリプシン
の活 性 部 位 の構 造 変 化 が、エステル基 質 の脱 アシル化 過 程 の速 度 を特 異 的 に増
加 させるということが示 唆 されることを報 告 している
4 ) 。このような挙 動 は、GPA
誘導
体 の S.G.トリプシンによる加 水 分 解 では観 察 されなかった。
Bz-GPA-NH 2 は、S.G.トリプシンによって Bz-GPA-pNA と比 べて約 46 倍 低 い
速 度 で加 水 分 解 された。Bz-GPA-NH 2 での K m 値 は、Bz-GPA-pNA のそれより
23 倍 高 く な っ て い た が 、 前 者 の k cat 値 は 後 者 の そ れ よ り も 2 倍 低 か っ た 。
Bz-GPA-pNA での著 しく低 い K m 値 は、S.G.トリプシンに対 する Bz-GPA-pNA
の結 合 が、Bz-GPA-NH 2 のそれよりも勝 っていることを意 味 する。S.G.トリプシンに
対 する Bz-GPA-pNA のこの良 好 な結 合 は、ウシトリプシンによる加 水 分 解 に対 す
るこの基 質 類 縁 体 の脱 離 基 に付 加 しているベンゼン環 の存 在 が起 因 しているのか
もしれない。
GPA の N α -置 換 アニリド基 質 のウシトリプシンによる加 水 分 解 において、著 しく低
い k cat と K m 値 が見 出 されたことが報 告 されているが、低 い二 つの速 度 パラメータ
ーは、非 生 産 的 結 合 に起 因 しているのかもしれないという可 能 性 については、除 外
することができなかった
3 ) , 4 ) 。速 度 パラメーターの同 様 の傾 向 は、S.G.トリプシンに
よるアニリド基 質 の加 水 分 解 においても得 られた。 ウシトリプシンにとっては、
Z-GPA-pNA や Z-Arg-pNA が最 良 の基 質 であったが、S.G.トリプシンにとっては、
Bz-GPA-pNA が、3 つの GPA の N α -置 換 アニリド基 質 の中 で、Bz-Arg-pNA と
109
同 様 に最 も良 好 な基 質 であった。このことは、S.G.トリプシンの二 次 結 合 部 位 が、
ウシトリプシンのものと明 らかに異 なることを示 唆 している。Read らは、S.G.トリプシ
ンの X 線 結 晶 構 造 を解 明 し、精 査 し、S.G.トリプシンの結 晶 構 造 は、ウシトリプシン
の構 造 と比 べて明 らかに異 なっていることを報 告 している
6 ) 。二 次 速 度 定 数 に基 づ
くと、GPA とアルギニンのすべてのエステル、アミド及 びアニリド基 質 の S.G.トリプシ
ンによる加 水 分 解 の値 は、ウシトリプシン加 水 分 解 の値 よりも 2 から 62 倍 程 度 高 く
なっている。S.G.トリプシンでは、ウシトリプシンと比 較 して、 3 つのジスルフィド結
合 （Cys-Cys ）を 欠 い てい るこ と が 報 告 さ れ ている
1 8 ) 。 したが って、 上 述 した効 率
的 な触 媒 能 は、S.G.トリプシンの活 性 部 位 の構 造 の柔 軟 性 に起 因 することが推 測
される。この研 究 で得 られた結 果 は、S.G.トリプシンとウシトリプシンの活 性 部 位 の
構 造 とでは、大 きな差 異 があることを示 している。
４．結 論
上 述 したように、GPA 誘 導 体 は、Arg 基 質 と同 様 に S.G.トリプシンの良 好 な基
質 となることが示 された。又 、ウシトリプシンによる加 水 分 解 の速 度 論 的 挙 動 と同 じ
ように、S.G.トリプシンによる GPA のアミド及 びアニリド基 質 の加 水 分 解 において、
Arg 基 質 の場 合 と比 べて、低 い K m 値 が観 察 された。 このことは、GPA 基 質 が、
S.G.ト リ プ シン に 対 し て分 子 選 択 結 合 性 を 有 してお り、 ト リプ シ ン 様 酵 素 における
活 性 部 位 の構 造 の違 いを明 らかにするために有 用 であるとことを示 すものである。
110
参考文献
1. Klausner, Y.S., Rigbi, M., Ticho. T.. Jong. P.J., Neginsky.
Rinott.Y.,
The
E.J . and
interaction
of
alpha-N-(p-toluenesulphonyl)-p-guanidino-L-phenylalanine
methyl
ester with thrombin and trypsin. (1978) Biochem. J. 169, 157-167
2. Tsunematsu. H. and Makisumi, S., Interactions of derivatives of
guanidinophenylglycine and guanidinophenylalanine with trypsin
and related enzymes. (1980) J. Biochem. 88,1773- 1783
3. Tsunematsu . H., Imamura , T. and Makisumi, S., Kinetics of
hydrolysis of N α -benzoyl-p-guanidino-L-phenylalanine p-nitroanilide
by trypsin. (1983) J.Biochem. 94. 123-128
4. Tsunematsu . H.. Nishimura. H ., Mizusaki . K . and Makisumi . S.,
Kinetics
of
hydrolysis
of
amide
and
anilide
substrates
of
p-guanidino-L-phenylalanine by bovine and porcine trypsins. (1985)
J. Biochem. 97, 617-623
5. Nakata , H., Yoshid a, N., Naraha shi, Y. and Ishii, S., Substrate
activation and substrate inhibition of trypsin-like enzymes from
three strains of Streptomyces species. (1972) J. Biochem. 71,
1085-1088
6. Read, R.J., Brayer, G.D., Jurasek, L. and James, M.N.G., Critical
evaluation of comparative model building of Streptomyces griseus
trypsin . (1984) Biochemistry 23, 6570-6575
7. Somorin, O., Nishi, N. and Noguchi, J. (1978) Bull. Chem Soc.
Japan. 51, 1225-1256
8. Yokosawa, H., Hanba, T. and Ishii, S., Affinity chromatography of
111
trypsin and related enzymes. III. Purification of Streptomyces
griseus trypsin using an affinity adsorbent containing a tryptic
digest of protamine as a ligand. (1976) J.Biochem. 79, 757-763
9. Chase, T.
and
Shaw, E., p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoate HCl:
a new active site titrant for trypsin. (1967) Biochem. Biophys. Res.
Commun. 29, 508-514
10. Williams, E.J. (1959) Regression Analysis pp.10-12, John Wiley
and Sons, New
York
11. Eadie, G.S., The inhibition of cholinesterase by physostigmine and
prostigmine. (1942) J. Biol. Chem. 146, 85-93
12. Trowbridge, C.G., Krehbiel, A. and Laskowski, M., Jr., Substrate
activation of trypsin. (1963) Biochemistry 2, 843-850
13. Nozawa, M., Tanizawa , K . and Kanaoka, Y., Comparative studies
on the structure of active sites. Behavior of "inverse substrates"
toward
trypsin
and
related
enzymes.
(1982)
J. Biochem. 91,
1837-1843
14. Kallen-Trummer, V., Hoffman, V. and Rottenberg, M., Activation of
trypsin. Specificity and structure of effector molecules. (1970)
Biochemistry 9, 3580-3584
15. Nakata, H. and Ishii, S., Substrate activation of trypsin and
acetyltrypsin caused by -N-benzoyl-L-arginine p-nitroanilide. (1972)
J. Biochem. 72, 281-290
16. Seydoux, F., Tryptic hydrolysis of amino acid derivatives not
substituted at alpha. Function of pH. (1970) Eur. J. Biochem. 17,
209-217
112
17. Kanazawa , M. and Ishii, S. (1971) Seikagaku (in Japanese) 43,
726
18. Olofson, R.W., Jurasek, L., Carpenter, M.R. and Smillie, L.B.,
Amino acid sequence of Streptomyces griseus trypsin. Cyanogen
bromide fragments and complete sequence. (1975) Biochemistry , 14,
1168-1177
113
114
第５章
エールリッヒ腹水癌移植マウス腹水中のパラグアニ
ジノフェニルアラニンに特異的な新しいセリンプロテ
アーゼ
115
116
１．はじめに
蛋 白 質 加 水 分 解 酵 素 は、多 くの生 物 学 的 現 象 や病 気 の過 程 において重 要 な
役 割 を果 たしている。癌 細 胞 によって誘 導 された蛋 白 質 加 水 分 解 酵 素 は、癌 の増
殖 や転 移 に関 して病 理 生 理 学 上 重 要 であることが数 多 く報 告 されている 1 ) , 2 ) 。また、
合 成 され たプロ テアーゼ 阻 害 剤 、 天 然 に存 在 す る蛋 白 性 の阻 害 剤 、および 微 生
物 から単 離 された阻 害 剤 が、癌 細 胞 の増 殖 を抑 制 するので、癌 細 胞 の増 殖 や正
常 細 胞 の癌 化 にセリンプロテアーゼの関 与 が示 唆 されている
3-6)。
第 4 章 で述 べたように、塩 基 性 アミノ酸 に特 異 性 をもつトリプシン様 酵 素 の活 性
部 位 の環 境 を調 べるために、L-アルギニン(Arg)のメチレン鎖 の部 分 をベンゼン環
に置 換 したパラグアニジノ-L-フェニルアラニン(GPA)のパラニトロアニリド(pNA)基
質 ( 図 5-1(I))を 合 成 し、 本 化 合 物 がトリ プシン 様 酵 素 の 特 異 性 の 研 究 に 有 用 な
chromogenic substrate であることを論 じた
7 ,8 ) 。
そこで、本 研 究 では、癌 細 胞 とその腹 水 中 のセリンプロテアーゼ、特 にトリプシン
様 酵 素 に着 目 し、3 種 の塩 基 性 アミノ酸 (Arg,リジン(Lys),GPA)のアニリド基 質 に
対 する活 性 を調 べた。その結 果 、マウスのエールリッヒ腹 水 癌 、ヒトの胃 癌 、および
結 腸 癌 の癌 細 胞 ならびに腹 水 中 に、Lys や Arg の基 質 よりも、GPA の基 質 をはる
かに強く加水分解する酵素が存在することを見いだし、この酵素を
“p-guanidinophenylalanine specific enzyme(GPASE)” と命 名 した。
第 5 章 では、マウスの腹 水 中 の GPASE が GPA の C 端 側 を特 異 的 に加 水 分
解 する新 しいタイプのセリンプロテアーゼであることを明 らかにしたので以 下 に論 ず
る。
117
図 5-1
代 表 的 な GPA 及 び Arg 基 質 の 化 学 構 造
118
２．材 料 と方 法
2.1
エールリッヒ腹 水 癌 細 胞 移 植 マウスの腹 水 および癌 細 胞 の調 製
エールリッヒ腹 水 癌 細 胞 (5×10 7 個 /ml)を 30 匹 のマウス(ddY,雌 性 ,8 週 齢 ,体 重
20～22g)の腹 腔 内 に 0.2ml ずつ移 植 した。7 日 後 、腹 水 および癌 細 胞 を無 菌 的
に腹 腔 より採 取 し、遠 心 (40×g,10 分 , 4 ℃ )によりペレットと上 澄 に分 離 した。癌 細
胞 はペレットを Dulbecco's phosphate buffered saline(Ca 2 + and Mg 2+ -free,
pH 7.4)で 4 ℃ にて 10 回 以 上 洗 い、また、cell-free の腹 水 は、上 澄 を遠 心
(110×g,15 分 ,4 ℃ ) して得 た。
生 細 胞 数 の割 合 は、trypan blue dye exclusion により 95%以 上 であった。癌
細 胞 は、Pottcr-Elvehjem homogcnizer を用 いて 3 倍 容 の 0.1 M Tris-HCI
buffer(pH8.0)中 で 0 ℃にてホモジナイズし、遠 心 (25,000×g,20 分 ,4 ℃ )して、
その上 澄 の酵 素 活 性 を測 定 した。
2.2
ヒトの癌 細 胞 および腹 水 の調 製
ヒトの癌 細 胞 は、末 期 の胃 癌 および結 腸 癌 と診 断 された患 者 から手 術 により摘
出 されたものを、腹 水 はそれぞれの患 者 から腹 腔 穿 刺 により採 取 されたものを用 い
た。
2.3
アミノ酸 およびペプチド基 質
Arg と GPA を含 むアミノ酸 基 質 は Tsunematsu ら 8 ) ,11 ) の方 法 により合 成 した。
すべてのペプチド基 質 は、既 報 の方 法 によって合 成 した
2.3
13)。
酵 素 活 性 の測 定
酵 素 に よ る ア ニ リ ド 基 質 の 加 水 分 解 速 度 を 分 光 光 度 計 (Shimadzu,
UV-200MU recordcr) に よ り 、 0.05MTris-HCI buffer (pH8.0) を 用 い て 、
119
25 ℃ 410 nm における吸 収 の増 加 を測 定 することにより求 めた
9)。
３．結 果 と考 察
3.1
図
GPA と Arg を含 むバラニトロアニリド基 質 に対 する基 質 特 異 性
5-2
に マ ウ ス の 腹 水 (100
μl) に よ る
3
種 の ア ニ リ ド 基 質
(Z-GPA-pNA,Z-Arg-pNA,Bz-Lys-pNA,農 度 はすべて 0.2 mM)の加 水 分 解 の
様 子 を示 した。Z-GPA-pNA は、Z-Arg-pNA よりはるかに速 く加 水 分 解 されたが、
Bz-Lys-pNA はまったく加 水 分 解 されなかった。
この結 果 より、我 々は、マウスの腹 水 中 に Arg や Lys の基 質 よりも GPA 基 質 に
対して強い活性をもつ酵素が存在することを見いだし、この酵素を
“p-guanidinophcnylalanine spccific enzyme(GPASE)” と命 名 した。
120
図 5-2
Z-GPA-pNA, Z-Arg-pNA 及 び Bz-Lys-pNA の マ ウ ス 腹 水 に よ る
加 水 分 解 。100 μ l の マ ウ ス 腹 水 中 に 各 基 質 を 加 え 、 25 ℃ 、 pH
8.0 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 .
121
まず、本 酵 素 の性 質 をトリプシンとトロンビンの場 合 と比 較 してみた。GPASE の
Z-GPA-pNA に対 する至 適 pH は 8 あたりで、トリプシンの場 合 と類 似 していたが、
ペプチド基 質 に対 する特 異 性 はトリプシンやトロンビンとかなり異 なっていた。表 5-1
に、Z-GPA-pNA の加 水 分 解 速 度 を 1 としたときの GPA と Arg を含 むシおよびト
リペプチド基 質 の GPASE、トリプシン、ﾄロンビンによる加 水 分 解 の相 対 速 度 を示 し
た。トリプシンやトロンビンは、GPA を含 むペプチドよりも Arg を含 むペプチドを速 く
加 水 分 解 したが、GPASE の場 合 は、まったく逆 で、GPA ペプチドのほうを速 く加
水 分 解 した。また、トリプシンは、Arg 基 質 に対 してはアミノ酸 基 質 よりもペプチド基
質 をはるかに速 く水 分 解 するが、GPA の場 合 には、ペプチド基 質 とアミノ酸 基 質 の
間 には大 きな差 はみられなかった。
この点 については以 下 のように考 察 できる。Krieger ら
10)
は、拮 抗 阻 害 剤 であ
るベン ズアミ ジンが トリ プシンの 特 異 性 ポ ケット に 結 合 した際 、 ポケ ット の 主 鎖 や 側
鎖 にかなりのコンフォメーション変 化 が起 こることを報 告 している。ゆえに、GPA ペプ
チ ドの トリ プ シンに よ る 加 水 分 解 に おい て、 アミノ 酸 基 質 と ペプ チド基 質 の 加 水 分
解 速 度 の 間 に 大 き な差 がみられないの は、GPA の側 鎖 の ベンゼン環 が、 酵 素 ―
基 質 複 合 体 を形 成 しているときに、トリプシンの活 性 中 心 にコンフォメーション変 化
を引 き起 こし、その変 化 がトリプシンのサブサイトとペプチド基 質 の相 互 作 用 にわる
い要 因 を与 えているためである。しかし、このような挙 動 は、GPASE による GPA ペ
プチドの加 水 分 解 においてはみられなかった。
一 方 、トロンビンは P2 位 にプロリンを含 む Arg ペプチドを速 く加 水 分 解 し、GPA
ペプチドの場 合 も同 様 の傾 向 がみられた。ところが、GPASE による GPA ペプチド
の加 水 分 解 においては、このような傾 向 はみられなかった。
122
表 5-1
GPA ペプチド基 質 及 び Arg ペプチド基 質 の GPASE, トリプシン
及 びトロンビンによる加 水 分 解 における相 対 活 性 （ Z-GPA-pNA を
1.0 と し て 表 し た 。）
123
我 々は、トリプシン様 酵 素 の特 異 性 の研 究 のために、環 状 のチオエステルである
GPA の 2-phenyl-5-tliiazolone(PTA-GPA) 11 ) (図 5-1(III))を合 成 した。トリプシ
ンやトロンビンは、本 化 合 物 を加 水 分 解 するが、GPASE はまったく加 水 分 解 しな
かった。
以 上 述 べた事 実 から、GPASE のアミノ酸 およびペプチド基 質 に対 する特 異 性
は、トリプシンやトロンビンの場 合 とかなり異 なると考 えられる。
3.2 各 種 阻 害 剤 による影 響
表 5-2 に GPASE 活 性 に対 する各 種 阻 害 剤 の影 響 を示 した。GPASE は、
diisopropylfluorophosphate
(DFP) と
(PMSF) で 強 く 、 tosyl-L-lysine
phenylmethanesulfonylfluoride
chloromethylketone
(TLCK) と
tosyl-L-phenylalanine chlormethylketone (TPCK) で 弱 く 阻 害 さ れ た が 、
E-64 などの SH 基 反 応 性 試 薬 や EDTA また、蛋 白 性 の阻 害 剤 などでは阻 害 さ
れなかった。
124
表 5-2
GPASE に対 する各 種 タンパク分 解 酵 素 阻 害 剤 の影 響
125
図 5-3 に DFP による阻 害 の様 子 を示 したが、約 14 μM の DFP で 100 μl の
腹 水 の GPASE 活 性 が完 全 に阻 害 された。また、PMSF による GPASE 活 性 の阻
害 は、反 応 時 間 および PMSF 濃 度 に依 存 していた(図 5-4)。ゆえに、本 酵 素 の活
性 発 現 に は セリ ン 残 基 が 必 須 である と 考 え られ る 。 ま た、diethylpyrocarbonate
により阻 害 されることから、この酵 素 の触 媒 作 用 にはヒスチジンが関 与 していること
が示 唆 される。
本 酵 素 は、トリプシンやトロンビンの強 力 な拮 抗 阻 害 剤 であるベンズアミジンで阻
害 されなかった。ベンズアミジンと GPA の側 鎖 の構 造 が類 似 していることを考 慮 す
ると、これは意 外 な結 果 であった。これらの事 実 から、GPASE はべンズアミジンや
アルキルグアニジンよりもフェニルグアニジンに対 して強 い親 和 性 をもち、そのペプ
チド基 質 に対 する特 異 性 がトリプシンやトロンビンと異 なる新 しいタイプのセリンプロ
テアーゼであることが明 らかになった。
126
図 5-3
DFP 添 加 による GPASE の阻 害
Z-GPA-pNA を添 加 する前 の腹 水 （100 μl）に DFP を加 え、15 分 間
25 ℃でプレインキュベートし、残 存 活 性 を測 定 した。
127
図 5-4
GPASE の PMSF 阻 害 の時 間 依 存 性
Z-GPA-PNA を 添 加 す る 前 の 腹 水 （ 100 μ l ） に PMSF を 加 え 、
25 ℃、1 時 間 プレインキュベートし、残 存 活 性 を測 定 した。
128
近 年 、 Stcven
ら
12 )
は 、 ト リ プ シ ン の
4-nitrophenyl-p-guanidinobcnzoate
titrant
で あ る
(NPGB)
や
4-methylumbelliferyl-p-guanidinobcnzoate を加 水 分 解 する酵 素 をエールリ
ッヒ腹水癌の癌細胞とそのまわりの腹水中に見いだし、その酵素を
“guanidinobenbenzoatase” と命 名 した。彼 らは、この酵 素 の NPGB に対 する
活 性 が HgCl 2 により阻 害 されることを報 告 しているが、GPASE の Z-GPA-pNA に
対 す る 活 性 は HgCl 2 で は 阻 害 さ れ な か っ た 。 こ の 点 よ り 、 GPASE と
guanidinobenzoatase とは異 なる酵 素 であると考 えられる。マウスの腹 水 中 にフェ
ニルグアニジンに対 して特 異 性 をもつ 2 種 類 の酵 素 が存 在 することは興 味 ある事
実 である。
我 々は、GPASE 活 性 をヒトの胃 癌 および結 腸 癌 の癌 細 胞 と腹 水 中 にも見 いだ
したので、さらにさまざまな種 類 の癌 組 織 中 の GPASE 活 性 を検 討 している。また、
ヒト白 血 球 の膜 結 合 酵 素 中 にも GPA 基 質 を速 く加 水 分 解 する酵 素 を見 いだして
おり、GPASE が炎 症 反 応 に関 与 している可 能 性 も考 えられる。現 在 、GPASE の
生 理 学 的 役 割 は 不 明 だが、生 体 内 に 存 在 しないアミノ酸 基 質 に 対 して特 異 性 を
示 す 興 味 ある酵 素 と 考 え られる ので、 本 酵 素 をマウスの 腹 水 から精 製 し、 蛋 白 質
化 学 的 研 究 ならびに癌 細 胞 の増 殖 と GPASE 活 性 の関 係 などを検 討 中 である。
129
４．結 論
以 上 述 べたように、パラグアニジンフェニルアラニン（GPA）を含 む基 質 を用 い
ることによって、アルギニン基 質 よりも、はるかに強 く加 水 分 解 することができるトリプ
シン 様 酵 素 が、 エールリ ッヒ腹 水 癌 細 胞 移 植 マウスの 腹 水 中 に 存 在 するこ とを 証
明 することができた。すなわち、パラグアニジノフェニルアラニン（GPA）誘 導 体 は、ト
リプシン様 酵 素 に対 して、分 子 選 択 結 合 性 を有 しており、また、新 規 なトリプシン様
酵 素 の探 索 や活 性 を調 べるためのツールとして有 用 であると結 論 付 けられた。
130
参考文献
1. Distefano, J.F., Lysik, R., Zucker, S.: Pharmacological studies of the
mechanism of tumorinduced bone marrow cytolysis. Cancer Res.
39:1193-1198, 1979.
2. Jones, P.A., DeClerck, Y.A.: Destruction of extracellular matrices
containing glycoproteins, elastin, and collagen by metastatic human
tumorcells. Cancer Res. 40:3222-3227, 1980.
3.
Kennedy,
A.R.,
radiation-induced
Little,
J.B.:
malignant
Protease
transformation
inhibitors
in
vitro.
suppress
Nature
276:825-826, 1978.
4. Kuroki, T., Drevon, C.: Inhibition of chemical transformation in
C3H/10T1/2 cells by protease inhibitors. Cancer Res. 39:2755-2761,
1979.
5. B orek, C., Miller, R., Pain, C., Troll, W.: Conditions for inhibiting
and enhancing effects of the protease inhibitor antipain on x-ray
induced neoplastic transformation in hamster and mouce cells. Proc.
Natl. Acad. Sci. US.76:1800-1803, 1979.
6. Long, C.W., Bruszewski, J.A., Christensen, W.L., Suk, W.A.: Effects
of protease inhibitors on chemical induction of type C virus. Cancer
Res. 39:2995-2999, 1979.
7. Tsunematsu, H., Imamura, T., Makisumi, S.: Kinetics of hydrolysis
of
N-α-benzoyl-p-guanidino-L-phenylalanine
p-nitroanilide
by
trypsin. J. Biochem. 94:123-128, 1983.
8. Tsunematsu, H., Nishimura, H., Mizusaki, K.. Makisumi, S.:
Kinetics
of
hydrolysis
of
amide
131
and
anilide
substrates
of
p-guanidino-L-phenylalanine by bovine and porcine trypsins. J.
Biochem. 97:617-623, 1985.
9. Erlanger, B.F., Kokowsky, N., Cohen, W.: The preparation and
properties of two new chromogenie substrates of trypsin. Arch.
Biochem. Biophys. 95:271-278, 1961.
10. Krieger, M., Kay, L.M., Stroud, R.M.: Structure and specific
binding of trypsin: Comparison of inhibited derivatives and a model
for substrate binding. J. Mol. Biol. 83:209-230, 1974.
11. Tsunematsu, H. Hatanaka, Y. Sugahara , Y., Makisumi, S.:
Hydrolysis of phenylthiazolones of p-guanidinophenylalanine and
arginine by trypsin and related enzymes. J. Biochem. 94: 1119-1125,
1983.
12. Steven, F.S., Al-Ahmad, R.K.: Evidence for an enzyme which
cleaves the guanidinobenzoate moiety from active-site titrants
specifically designed to inhibit and quanify trypsin. Eur. J. Biochem.
130:335-339, 1983.
13. Hideaki Tsunematsu, Koichi Mizusaki, Yoshihiro Hatanaka, Masao
Kamahori, Satoru Makisumi.;Kinetics of Hydrolysisi of a New
Peptide
Substrate
Containing
p-Guanidino-L-phenylalanine
Trypsin and Thrombin; Chem. Phrm. Bull. , 34, 1351, (1986)
132
by
第６章
結論
133
134
近 年 、生 体 内 で起 こる、抗 原 抗 体 反 応 、酵 素 と基 質 反 応 、リガンド・レセプター
反 応 など の分 子 選 択 的 結 合 のしくみを 利 用 した、 センサー 素 子 、プローブ素 子 、
薬 剤 などの分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 に関 する研 究 ・開 発 の進 展 はめざましい。とり
わけ、分 子 選 択 的 結 合 性 分 子 の設 計 やスクリーニング技 術 としてのペプチドライブ
ラリー作 製 技 術 やハイスループットスクリーニング（HTS）等 のような技 術 の進 歩 に
は、目 を見 張 るものがある。
本 論 文 おいて、第 1 章 では、生 体 内 で起 こる、抗 原 抗 体 反 応 、酵 素 と基 質 反 応 、
リガンド・レセプター反 応 など の分 子 選 択 的 結 合 について概 説 した。分 子 選 択 的
結 合 性 分 子 の設 計 手 法 については、標 的 分 子 の構 造 などの情 報 がない場 合 は、
ランダムな化 合 物 群 から選 択 してくる方 法 や抗 体 などを作 製 する方 法 があり、ある
程 度 の情 報 がある場 合 には、合 理 的 な設 計 手 法 をとるという、大 きく２つの手 法 が
あることを述 べた。
本 研 究 においては、研 究 開 発 資 金 の制 約 を考 慮 し、また、対 象 とする分 子 が抗
体 リガンドやトリプシン様 酵 素 の基 質 であり、比 較 的 、経 験 や構 造 などの情 報 があ
ることから、合 理 的 な設 計 手 法 が適 切 であることも述 べた。
本 研 究 では、物 理 化 学 的 及 び生 物 化 学 的 に 安 定 で、か つ 、安 価 な低 分 子 化
合 物 として、非 天 然 アミノ酸 に着 目 した。本 研 究 の目 的 は、その非 天 然 アミノ酸 が、
抗 体 を結 合 するリガンドや酵 素 の基 質 として分 子 選 択 的 結 合 性 を示 すこと、並 び
に、その有 用 性 や今 後 の展 開 への可 能 性 について示 すことであった。
本 論 文 中 では 、 医 療 用 デバ イス である 血 液 体 外 循 環 用 （ ア フェレシス 用 ） の 抗
体 吸 着 材 用 のリガンドとタンパク分 解 酵 素 であるトリプシンの基 質 を例 にとって論 じ
てきたが、総 括 すると、全 体 として、目 的 は達 せられたといえる。以 下 、将 来 の展 望
も含 め詳 細 に述 べる。
第 2 章 では、医 療 用 デバイスである血 液 体 外 循 環 用 （アフェレシス用 ）の抗 体 吸
着 材 用 のリガンドを設 計 開 発 する目 的 で、非 天 然 アミノ酸 であるチエニル基 を有 す
135
るアミノ酸 やパラグアニジノフェニルアラニン（GPA）を含 む各 種 アミノ酸 について、
天 疱 瘡 患 者 の血 清 を用 いてスクリーニングを行 った結 果 、チエニル基 を持 つ化 合
物 が天 疱 瘡 の自 己 抗 体 を吸 着 することを見 出 し、抗 体 吸 着 材 の有 望 なリガンドで
あることを示 した。
第 3 章 では、第 2 章 の結 果 を受 けて、さらに実 用 化 に向 けた検 討 を行 った結 果 、
チエニルアミノ酸 がフィブリノーゲンの吸 着 を抑 制 し、IgG や IgM を選 択 的 に吸 着
することを見 出 し、抗 体 吸 着 材 の有 望 なリガンドとなりうることを示 した。今 後 の課 題
としては、チエニルアミノ酸 をリガンドとした吸 着 材 は、フィブリノーゲンの吸 着 は抑
制 するものの、既 存 製 品 であるイムソーバ TR と比 較 すると、IgG の吸 着 容 量 が不
足 しており、その改 良 が必 要 な点 である。対 策 案 としては、以 下 の 3 つの案 が考 え
られる。一 つ目 として、１）吸 着 材 の容 積 （ボリューム）を増 加 させる。二 つ目 として、
２）リガンドの固 定 化 量 を増 加 させる。三 つ目 としては、３）担 体 樹 脂 自 体 の吸 着 表
面 積 を上 げる。という手 法 が考 えられる。最 も安 易 な方 法 としては、１）の方 法 であ
るが、 その 場 合 、 患 者 様 の 脱 血 量 が 増 加 する とい うリス クが 生 じる 可 能 性 が あ る。
２）の対 策 案 の具 体 的 な方 法 としては、リガンドと担 体 との固 定 化 反 応 の際 に、さら
にリガンド濃 度 を上 げて、担 体 へのリガンド固 定 化 量 を増 加 させることが考 えられる。
又 、あるいは、担 体 にあらかじめスペーサー分 子 を挿 入 し、リガンドをスペーサー分
子 と反 応 させることによって、リガンド固 定 化 量 を増 加 させるなどの方 法 が考 えられ
る。３）の対 策 案 については、担 体 開 発 は必 要 となるが可 能 な手 段 である。いずれ
にしても、今 後 、さらに実 用 化 に向 けた検 討 を進 め、近 い将 来 には製 品 化 できるも
のと期 待 している。
第 4 章 では、非 天 然 アミノ酸 であるパラグアニジノフェニルアミノ酸 （GPA）基 質
が 、 ト リ プ シ ン 様 酵 素 の 良 い 基 質 に な り う る か 検 証 す る 目 的 で 、 Streptomyces
griseus （ S.G. ） ト リ プ シ ン に て 加 水 分 解 さ せ 速 度 論 的 に 解 析 し た 。 そ の 結 果 、
GPA がトリプシン様 酵 素 の有 用 な基 質 になることを示 した。すなわち、S.G.トリプシ
136
ンの GPA 基 質 の加 水 分 解 を速 度 論 的 に解 析 した結 果 、GPA 基 質 は、Arg 基 質
に比 べて、極 めて小 さな K m 値 を示 し、優 れた分 子 選 択 結 合 性 を示 した。又 、ウシ
トリプシンと S.G.トリプシンの加 水 分 解 様 式 を解 析 することによって、酵 素 の活 性 中
心 の構 造 の違 いを推 察 することができた。つまり、種 の異 なるトリプシン様 酵 素 の活
性 中 心 や加 水 分 解 メカニズムを研 究 するための有 力 なツールになることを示 すこと
ができたといえる。今 後 、GPA 基 質 を用 いて、加 水 分 解 メカニズムという観 点 から
研 究 ・解 析 を行 い、様 々なトリプシン様 酵 素 の種 による違 いや、より活 性 の高 い人
工 酵 素 等 の開 発 に役 立 てられるものと期 待 される。
さらに、第 5 章 では、GPA 基 質 を用 いることで、L-Arg 基 質 では見 出 せなかった、
マウスの癌 性 腹 水 に存 在 するトリプシン様 酵 素 の存 在 を明 らかにすることができた。
今 後 の展 望 としては、トリプシン様 酵 素 は、あらゆる細 胞 や組 織 中 に存 在 しており、
癌 のみならず、その他 の病 変 組 織 にも存 在 すると思 われる新 規 なトリプシン様 酵 素
のスクリーニング用 ツールとして活 用 されることが期 待 される。
以 上 論 述 してきたことから、抗 体 を吸 着 するリガンドや酵 素 の基 質 となる分 子 選
択 的 結 合 分 子 の設 計 ・開 発 のために非 天 然 アミノ酸 を利 用 することは、極 めて有
用 であると結 論 づけられた。
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謝辞
本 論 文 は、九 州 工 業 大 学 大 学 院 生 命 体 工 学 研 究 科 教 授 春 山 哲 也 先 生
のご指 導 の下 に作 成 したものであり、多 大 なるご指 導 、ご意 見 を賜 りましたことに心
より深 く感 謝 いたします。
本 論 文 をまとめるにあたり、金 沢 大 学 理 工 研 究 域 電 子 情 報 学 系 教 授 福 間 剛
士 先 生 、九 州 工 業 大 学 大 学 院 工 学 研 究 院 物 質 工 学 研 究 系 教 授 横 野 照 尚
先 生 、九 州 工 業 大 学 大 学 院 生 命 体 工 学 研 究 科 准 教 授 加 藤 珠 樹 先 生 、なら
びに准 教 授 池 野 慎 也 先 生 に多 大 なご指 導 、そして適 切 なるご意 見 、ご助 言 を賜
りましたことに対 して厚 く御 礼 申 し上 げます。
本 研 究 の天 疱 瘡 抗 体 の吸 着 試 験 のための臨 床 研 究 を行 うに当 たり、国 際 親 善
総 合 病 院 皮 膚 科 部 長 山 田 裕 道 先 生 に臨 床 上 の知 見 やこれまでの研 究 成 果
に関 する有 益 な情 報 、ご意 見 を賜 りましたことに対 して厚 く御 礼 申 し上 げます、
酵 素 化 学 研 究 を行 うにあたり、酵 素 の精 製 や活 性 測 定 方 法 並 びにパラグニジノ
フェニルアミノ酸 基 質 やペプチド合 成 に関 する多 大 なるご指 導 とご助 言 をいただき
ました九 州 大 学 時 代 の指 導 教 官 である元 九 州 大 学 理 学 部 化 学 科 酵 素 化 学 講
座 教 授 故 牧 角 啓 先 生 、元 同 講 座 恒 松 英 明 博 士 、元 同 講 座 水 崎 幸 一 博
士 に深 く感 謝 いたします。
さらに、本 論 文 をまとめる機 会 を与 えて下 さいました旭 化 成 メディカル株 式 会 社
医 療 製 品 開 発 本 部 三 浦 司 和 本 部 長 、同 本 部 医 療 材 料 研 究 所 井 出 正 一 所 長
並 びに 本 研 究 にご協 力 頂 きました旭 化 成 メディカル株 式 会 社 の伊 藤 章 博 士 、
築 地 美 鈴 氏 、他 皆 様 方 に心 より御 礼 申 し上 げます。
最 後 になりますが、不 肖 の著 者 のわがままを温 かく見 守 るとともに、いつも励 まし
てくれた、今 は亡 き両 親 にこころから感 謝 致 します。
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研究業績一覧
【公 表 論 文 】
1. Yoshihiro Hatanaka, Misuzu Tsukiji, Akira Itoh,
Haruyama,
Selective
immunoglobulin
adsorption
of
and Tetsuya
immunoglobulin
G
and
M from plasma without adsorption of fibrinogen
by using thienyl amino acids as ligands； J Chromatograph Separat
Techniq , (2013) 4: 190. doi:
10.4172/2157-7064. 1000190
【関 連 特 許 】
1. 特 開 2013-53079
IgM 型 抗 体 吸 着 材 及 び IgM 型 抗 体 除 去 シ ス テ ム ;
畑 中 美 博 ,他 １名
【参 考 論 文 】
1. Hiromichi Yamada, Akira Itoh, Yoshihiro Hatanaka, Misuzu Tsukiji,
and Kenji Takamori ； Screening and analysis of adsorbents for
pemphigus
autoantibodies.
；
Ther
Apher
Dial. ,
2010
Jun;14(3):292-7.
2. 山 田 裕 道 、伊 藤 章 、畑 中 美 博 、築 地 美 鈴 、高 森 健 二 ；天 疱 瘡 の特 異 的 血 漿
吸 着 療 法 をめざして－これまでの研 究 の歩 みと新 しく開 発 されたチオフェンリガ
ンド吸 着 材 －； 日 本 アフェレシス学 会 雑 誌 , 28(3), 230-234, (2009)
3. Yoshihiro Hatanaka, Hideaki Tsunematsu, Koichi Mizusaki, and
Satoru
Makisumi.;
Guanidinophenylalanine
Interaction
and
of
Derivatives
Guanidinophenylglycine
of
with
Streptomyces griseus Trypsin; Biochem. Biophys. Acta. , 832, 274,
(1985)
4. 恒 松 英 明 ，水 崎 幸 一 ，畑 中 美 博 ，西 昭 宏 ，牧 角 啓 ，岡 元 孝 二 ，恒 松 芳 洋 ;
139
エールリッヒ腹 水 癌 移 植 マウス腹 水 中 のパラグアニジノフェニルアラニンに特 異
的 な新 しいセリンプロテアーゼ; 炎 症 , 6, 148, (1986)
5. Hideaki Tsunematsu, Yoshihiro Hatanaka, Yuji Sugahara, and
Satoru
Makisumi.;
Hydrolysis
of
Phenylthiazolones
of
p-Guanidinophenylalanine and Arginine by Trypsin and Related
Enzymes; J. Biochem. ,94, 1119, (1983)
6. Hideaki Tsunematsu, Kumi Ando, Yoshihiro Hatanaka, Koichi
Mizusaki, Ryuichi Isobe, Satoru Makisumi; A New β-Naphthylamide
Substrate of p-Guanidino -L-Phenylalanine for Trypsin and Related
Enzymes; J. Biochem. ,98, 1597, (1985)
7. Hideaki Tsunematsu, Koichi Mizusaki, Yoshihiro Hatanaka, Masao
Kamahori, Satoru Makisumi.;Kinetics of Hydrolysisi of a New
Peptide
Substrate
Containing
p-Guanidino-L-phenylalanine
Trypsin and Thrombin; Chem. Phrm. Bull. , 34, 1351, (1986)
【参 考 特 許 】
1. 特 許 第 4942034 号 自 己 抗 体 吸 着 材 及 び体 外 循 環 モジュール;
畑中美博,
他 ３名
140
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