PDF 946KB - 日本薬物動態学会 JSSX

日本薬物動態学会学会賞受賞講演
「薬物の腸管膜透過に関する機構論的解析」
2005年10月22日
（マウイにて）
東京薬科大学薬学部
薬物動態制御学教室
林 正弘
薬物腸管吸収研究に取り組んで30年
薬物吸収機構研究
・Paracellular Routeとの出会い
・吸収促進剤の作用機構研究の始まり
・Paracellular Routeの変化に関する生理学的機構
・忘れてはいけないTranscellular Routeの変化
・トランスポーターと吸収促進剤
・病態時におけるParacellular Routeと
Transcellular Route透過性の変化
Paracellular Routeとの出会い
膜透過ルートとその解析法
・電気生理学の重要性
・Voltage Clamp法
Pm vs. ξ
・Impedance解析
Impedance vs. Frequency
・透過ルートの寄与率を評価可能
・吸収促進剤による透過ルートの変化を定量化
Two
TwoPermeation
PermeationRoutes
Routesand
andElectric
ElectricResistances
Resistancesin
in
Intestinal
IntestinalEpithelium
Epithelium
Transcellular Route
Paracellular Route
MV
Ra
TJ
Rtj
LIS
RL
Rb
MV: Microvilli
TJ: Tight Junction
LIS: Lateral intercellular space
Ra, Rb: Mucosal and serosal resistances
Rtj, RL: Junctional and intercellular resistances
吸収促進剤の生理学的作用機構
吸収促進剤の生理学的作用機構
・Paracellular Routeへの作用機構
Tight Junctionの開口
・吸収促進剤
Caprate (C10)
Decanoylcarnitine (DC)
Tartaric Acid (TA)
・Caco-2細胞とラット腸管膜
C10とDCのTJ開口機構
Decanoylcarnitine (DC)
Sodium caprate (C10)
PIP2 PLC
Uptake Process(OCT2)
Ca
2+
CaM Ca
2+
MLCK activation
Myosinphosphorylation
Depletion of ATP
Cadherin
Ca
2+
pool
Cadherin
Expansion
Ca
pool
Contraction of actin filament
2+
rich domain
Cadherin
IP3 + DAG
Ca
2+
Cadherin
ZO-1
Occuludin
Claudin
Dearrangement of
Cytoskeletal system
酒石酸 (Tartaric acid)のTJ開口機構
Tartaric acid
Actomyosin activation
Opening of TJ
ATP depletion
Intracellular acidosis
Increase of Ca2+
Ca2+-ATPase inhibition
Calpain activation
Phospholipase activation
Protein degradation and
Cytoskeletal destabilization
PKC activation
吸収促進剤の生理学的作用機構
吸収促進剤の生理学的作用機構
・Transcellular Routeの変化
膜Perturbation
・吸収促進剤
Caprate (C10)
・ＢＢＭを蛍光ラベル(膜タンパクと脂質部分)
蛍光偏光度（P value)測定 → 膜Perturbation
Sites Labelled by Fluorescent Probes
EMA, DNS-Cl
FITC
DNS-Cl
NH2
SH
ANS
ANS
2-AS
12-AS
DPH
Protein
Lipid
吸収促進剤と P-Glycoprotein (P-gp)
①Paracellular Routeの変化： Tight Junction (TJ) の開口
②Transcellular Routeの変化：
P-glycoprotein (P-gp) : Drug excretion pump function
の変化
促進剤：
Tartaric Acid (TA)
lumen
①
●
②
●
blood
stream
Rat Colon
1.4
1.4
0.2
0
pH7.4
TA
D-
co
n
(H trol
5 m Cl
M )
co
5 m ntro
l
M
DTA
0
pH4.5
0.8
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
pH7.4
pH4.5
A
0.02
0.6
co
nt
(
H
5 m C rol
M l)
DT
0.4
1
A
0.04
1.2
0.8
co
nt
(
5 m HC rol
M l)
DT
0.6
1.4
nt
ro
l
M
DTA
0.06
1
5m
0.8
1.6
co
0.08
1.8
pH3.5
pH dependent effects of tartaric acid on permeation clearance (CL)
of Rhodamine123 in the serosal (S) to mucosal (M) direction and Rm
● Rm ( ratio of control )
1
● Rm ( ratio of control )
1.2
0.1
2
1.2
CL (µL/min/cm2)
0.12
CL (µL/min/cm2)
Rabbit Colon
Tartaric Acid (TA) の作用機構
・高濃度(20mM)のTAはTight Junction開口
作用を持つが、低濃度(5mM)のTAはP-gp機能
の抑制を示した。このP-gpへの作用は、pH依存
性を有しており、細胞内アシドーシスが関係して
いる可能性が示された
・上記のP-gpへの作用は、他の促進剤ピロチオ
デカンにも見出された。
虚血再灌流障害モデル
Apical (A)
Basal (B)
A
B
membrane
・ 細胞系 : Caco-2 cell monolayers
・ 評価系 : in vitro 拡散チャンバー
・ 脂質過酸化剤 : tertiary-butyl hydroperoxide (t-BuOOH)
・in vitro 障害モデル :
in vivo
in vitro
虚血
低酸素
t-BuOOH (1hr)
再灌流
酸素再供給
(1hr)
・ Paracellular route の評価 : Tight Junctionにおける膜抵抗 (TEER)
・ Transcellular route の評価 : P-gp 基質である Rhodamine123 の膜透過性
100
1.8
control
90
80
70
60
t -BuOOH
50
0.5 mM
1.0 mM
2.0 mM
40
30
20
10
5.0 mM
0
0
15
30
45
Time ( min )
60
Permeability (x 10-5 cm/sec)
TEER (% of initial value)
110
1.6
1.4
**
*
A→B
***
B→A
****
*
1.2
1.0
0.8
0.6
****
0.4
0.2
0.0
***
control 0.5
***
1.0
2.0
5.0
t –BuOOH (mM)
Effects of t -BuOOH on TEER (% of initial value) and permeability of
Rhodamine 123 in Caco-2 cell monolayers.
Results represent means and S.E.
*p<0.1, **p< 0.05, ***p<0.01, ****p<0.001 compared with control
conditions.
(A) Tiron (O2 - scavenger)
(B) DFO (iron ion chelater)
●
TEER (% of initial value)
110
110
control
100
(no additive)
100
90
control
(no additive)
+ 1.0 mM
90
80
70
+ 30 mM
+ 10 mM
60
+ 5.0 mM
60
80
50
+ 0.5 mM
70
+ 0.1 mM
50
40
30
20
+ 2.5 mM
40
t -BuOOH
30
alone
10
0
0
15
30
45
Time ( min )
60
alone
20
10
0
t -BuOOH
0
15
30
45
60
Time ( min )
Effects of Tiron (A) and DFO (B) on TEER reduction caused by
0.5 mM t -BuOOH in Caco-2 cell monolayers.
Results represent means and S.E.
CTRL
I/R50g
I/R100g
1.5
1
0.5
ileum (µL/min/cm)
4
3.5
CLe
Cumultive exsorbed amount
(ng/cm)
2
1
0
3
2.5
2
1.5
*
0.5
***
0
0
10 20 30 40 50 60 70
Time (min)
CTRL
I/R 50g I/R 100g
Effects of in situ ischemia-reperfusion treatment on
exsorption of Rhodamine 123 in rat ileum
Data represents mean ± S.E. (n=6~10 for each condition).
(*p<0.05, ***<0.001 compared with control)
虚血再灌流障害のまとめ
In vitro障害モデル
・脂質過酸化により、Tight Junctionが開口する
・上記機構には、スーパーオキシドや鉄イオンが
関与している
・脂質過酸化の程度が増大すると、Tight Junction
開口に加えて、P-Glycoprotein機能も低下する
In situ障害モデル
・P-Glycoproteinの機能低下は、in situモデルによ
り、確認された
感染症モデル
正常ラット結腸では
（背景） 水溶性高分子Lipopolysaccharide (LPS)は、
Paracellular routeでわずかに透過可能 → 敗血症時には
腸管由来のLPSが血中に出現 → Paracellular route以外にも
Transcellular routeを介した能動的な透過機構の存在の可能性
実際に得られた結果
・粘膜側および奨膜側からLPSの構造認識を介した
FITC-LPSの取り込み過程が存在し、さらにCD14
およびTLR4やScavenger receptorも関与している
・細胞内へ取り込まれたFITC-LPSはP-gpおよび
mrpによって粘膜側へ排泄される
2
M to S
S to M
100
80
1.5
60
1
40
0.5
0
**
Normal
Disease
Normal
*
Disease
20
Rm (% of initial value)
Permeation coefficient (x10-4cm/s)
FITC-LPS Permeability through Rat Colonic
Epithelial Cells in Normal and Disease Conditions
Colonic Epithelial Cells
(M)
(S)
LPS Infection
0
Normal: Saline i.p.
Disease: Unlabeled-LPS (O111: B4) 10mg/kg i.p
４時間後に結腸部を摘出 → 透過実験
FITC-LPS: 0.5µg/mL
n: 7-15 *P<0.01,
**P<0.005 vs. Normal
Permeation coefficient (% of Normal)
The Effect of Verapamil on the FITC-LPS Permeability
through Rat Colonic Epithelial Cells in Disease Conditions
M to S
400
300
200
S to M
(M)
(S)
*
*
100
0
Colonic Epithelial Cells
LPS Infection
P-gp
e
l
l
l
il
i
se
s
a
a
a
a
m
m
m
m
e
e
a
a
r
r
s
s
i
i
p
p
o
o
a
a
D
D
N
N
er
er
V
V
+
+
FITC-LPS: 0.5mg/mL
Verapmail: 1mM
n: 3-15, *P<0.005
感染症におけるLPSの腸管膜透過のまとめ
Disease Conditions
Normal Conditions
Mucosal
LPS
CD14
TLR4
P-gp
mrp
Serosal
Mucosal
Serosal
LPS
SR
LPS Infection
●感染症時において、LPSの透過性は変動し、 その機構には、
Receptorによる取り込み機構の低下（粘膜側）、消失（漿膜側）
および排泄型Transporterの発現レベルもしくは機能の亢進が
関与する
●腸管からのLPSの解毒・排泄を介した感染症の新たな治療
および予防法の確立へと繋がる重要な基礎情報となり得る
吸収促進剤投与時および
病態時の吸収制御因子の変動
•酒石酸：
P-gp機能低下 → 濃度↑で TJの開口
・虚血再灌流障害： TJの開口→ 障害↑で P-gp機能低下
•感染症：
ReceptorおよびTransporterの発現
レベルの変動 → LPSの透過性変動
•潰瘍性大腸炎： TJの開口→ 炎症↑でP-gp機能低下
薬物吸収を制御する腸管膜の変化機構
Physiological Change
Pathological Change
Tight Junctionの開口
P-gpの機能、発現の低下 or 亢進
謝辞
・花野 学
・粟津荘司
（東京薬科大学名誉教授） （東京大学名誉教授）
**********************
********************
・東京薬科大学薬学部
堀江利治（千葉大学教授）
水間 俊（助教授）
富田幹雄（講師）
柳樂眞友子（助手）
・東京理科大学薬学部
芳賀 信（助教授）
奥平和穂（東邦大学講師）
海保房夫（講師）
電気生理学
・山下伸二
（摂南大学教授）
・高村喜代子
（東京薬科大学名誉教授）
・楠 文代
（東京薬科大学教授）
*********************************************
・東京薬科大学大学院生 ・東京理科大学大学院生