活性酸素によるヒアルロン酸の解重合反応 に及ぼす二，三の蛋白質

Departmental Bulletin Paper / 紀要論文
活性酸素によるヒアルロン酸の解重合反応
に及ぼす二，三の蛋白質，ポリペプチドお
よびアミノ酸の影響
The Effect of Some Proteins, A Peptide, and Amino Acids in
the Depolymerization of Hyaluronic Acid by Active Oxygen
Species
佐藤, 郁夫; 柏村, 直樹
Sato, Ikuo; Kashimura, Naoki
三重大学生物資源学部紀要 = The bulletin of the Faculty of
Bioresources, Mie University. 1995, 14, p. 151-156.
http://hdl.handle.net/10076/3085
三選大盤物資源紀祭
第14号：151∼156
平成7年3月25日
活性酸素によるヒアルロン酸の解重合反応に及ぼす
ニ，三の空白質，ポリペプチドおよぴアミノ酸の影響＃
佐藤 郁夫＊・柏村 直樹
三東大学生物斑源学部
TheEffectofSomeProtein＄，APeptide，andAminoAcid＄inthe
Depolymeriz乱tionofHy乱1uronieAeidbyAetiveOxygenSpeeie＄
IkuoSATOandNaokiKASHIMURA
FaeultyoどBioresourees，MieUniversity
Abstraet
The effect of proteins，a POlypeptide，and amino acids such as albumin，e−
polylyslnearldhisもidineinthedepolymerizationorhyaluronieacidwasexamined．
Allof the proteins，a pOlypepti加，and amino acids examined supressed 汰￠
depolymerizationwithdiffcrentinhibitionratios．Inaddition．theinhibitionratioin
thedepol）−merizaLioI10fh）・aluronieacidb）・D−fl・uCtOSe6−phosohate−Cuいdiffel・edfrom
thatin the depol〉，merization or hyaluronic acid by hydl・Ogen PerOXide． These
resultssuggested that the mode or depolymeriヱation of hyaluronic acid and active
OXygen SpeCiesi−1、rOl、・edin the reaction、、，ere different between the two s）・StemS．
ImcompleteiI−hibition of E，pOlylysine andlysinein the dcpolymerization of
hyaluronicaeidbyhydrogenperoxideimpliedtbeinvolvementorsomeactiveoxyg・en
SPeCiesinthereaction．
Key words‥ hyaluronic acid・depolym訂ization・aetive oxygen叩eCies・
Pl−Oteins ● E−pOlylysine
ように2価の銅イオンの存在で促進されたが，ヒアルロ
緒
言
ン酸の起源の相違により解番台の程度が興なる現象がみ
これまでに生体内多糖の…つであるヒアルロン酸が糖
られた。現私 動物と微生物由来のピアルロン敵間で構
質由来の活性酸素により解東食を受けることを見いだし
造等に塞がないと言われていることから，この原因とし
ているl・2）。これらの反応は，タバコモザイクウイルス
てそれらの分子盛か含有の不純物の遠いが考えられた。
やバクテリオファージ￠Ⅹ174の不清化作用8）と同じ
分子盟の異なる微生物由来のヒアルロン敢でその解惑合
に善がみられなかったこと1〉より，我々ほ後者の可能性
＃ 本研究は佐藤郁夫の学位論文研究の一部として行われた。
＊ 本学部生物資源学研究科，生物機能応用科学専攻
現孤 チッソ㈱水俣製造所勤務
が商いと考えた。
活性激発の生成を促遷あるいは阻解する化合物につい
てほ多くの研究が行われている4）。それらの申で，ヒア
佐藤 郁夫・柏村 麗樹
152
ルロン酸の起蘭に影轡を受ける不純物として含まれる蛋
阻寒率（％）＝［1−（Vp…Va）／（Vc…Va）］
白質が考えられる。蛋白質は活性観衆により変性等の影
×100
響を受けることば良く知られており，蛋白質の主観又は
Vc：ヒアルロン髄のみを24時間処理した時の粘度
その残基と多糖の活性歓楽様に対する反応性の相違がヒ
Va：ま白質，ポリペプチドあるいはアミノ敷鯉添加
アルロン散解東金の程度差の原因であると考えられた。
での24時間後の反応液の粘度
そこで，本研究では活性酸素によるヒアルロン駿解墾合
Vp：蛋白質，ポリペプチドあるいはアミノ穀添加に
反応に対する蛋白質，ポリペプチドおよびアミノ敢の添
よる24時間後の反応液の粘度
加効果について検討した。
結果および考察
実験村糾および方法
1一 材料
乳酸蘭励㌻叩￡0ご0ごC㍑ぶZOO叩；deJ乃ic混ざ由来のヒア
これまでに活性観衆の玄白質への影妙については数多
く報告されている。特に川岸らによって蛋白質申のヒス
チジンとトリプトファンが活性観衆により軟化を受けや
ルロン酸ナトリウム塩（平均分子盟約100万）と
すく5・6），ヒスチジンと同様にイミダゾール環を有する
盈㍗呼￡omツeeぶα∼わ㍑ヱ㍑ぶ由来のど−ポリリジン塩酸墟
化合物に活性駿紫摘蘭作用があることが報告されてい
（平均分子戯約4000）はチッソ（株）より恵与されたも
る7）。また加藤らは，牛血滑アルブミンやグリケート化
のを用いた。D・プラクトース6・リン酸はSigma製を，
された年血滴アルブミンに活性酸素捕捉作用があると報
過酸化水素ほ三徳化学製を使用した。アミノ穀類は和光
告している8）。
純寒製を用いた。また，蛋白質のうちアルブミン（Bov
ine），チトクロームc（Horse HらarもType8）およ
そこで我々は活性酸素によるヒアルロン穀解蕊合反応
に対する市販の種々の蛋白質の添加劾束について検討し
びインスリン（Boville Pancreas Crystalline）は
た。使用したヒアルロン敵中の蛋白質含應が0．1％以下
Sig・ma製摩1d・グロプリ■ン（BovineyR4−1）とヘ
であるので，その添加段をヒアルロン酸露盤の1およぴ
モグロビン（Human2ⅩCryStallまzed）は‡NCPhar・
0．1％（反応液中の蛋白質濃度としてはそれぞれ
maceuticals製を使用した。
0．01および0．001％）とした。
2．D−フラクトース 8・リン放と過酸化水素によるヒ
の蛋白質が活性観衆によるヒアルロン駿の解東食反応を
検討した蛋白質問でその程度に差はあるものの，全て
アルロン酸解重合反応
それらの添加磯度に応じて阻脅した。ヘモグロビンは
ヒアルロン傲の反応液中での終濃度が1．0％になるよ
0．001％で28．3％の商い解蔑合阻害率を示した
うに，50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7．4）に溶解
（Tablel）。調製されたヒアルロン敵中に残存する動物
後，同じ緩衝液に溶解した硫軟鋼，D−フラクトース 6・
組織や微生物細胞由来の蛋白質含駿によっては，活性酸
リン酸，過酸化水素および蛋白質，ポリペプチドおよび
素によるヒアルロン酸の解東食反応に大きな影轡を与え
アミノ酸溶液のそれぞれを適宜添加し，1分間手で振と
るものと考えられる。これまでに種々の活性酸素生成系
う授絆後，37℃で静渡した。その後経時的にサンプリ
を用いてヒアルロン扱解意合反応が検討されているが9〉，
ングし，E型回転粘度計（東京計器製）を用いて回転数
これらの研究を進める上で，調製したヒアルロン教申の
1−100叩m，25℃で粘度を測定した。なお，粘度の
蛋白質にも十分注意してその結果を比較する必要がある
単位にはmPa・Sを用いた。
と思われる。
3．阻害率の計算
ラクトース6−リン酸および過酸化水素系を用いて解東
活性酸素生成系として2価の鋼イオン存在下でのD−フ
D．プラクトース6−リン駿，過酸化水素によるヒアル
合に及ぼすリジンのホモペプチドであるg・ポリリジン
ロン駿解褒愈反応に対する蜜自質，ポリペプチドおよぴ
（塩酸墟）の影啓をみた（ぎまg．1）。これらの活性駿東
アミノ酸の阻啓率を次式で計算した。
生成系でリジンあるいはe−ポリリジンが存在しない域
活性歓楽によるヒアルロン敢の解螢合反応に及ぼすこ三の蛋白質，ポリペプチドおよびアミノ酸の影轡 153
Tablcl．Inhibition effect of proteinsin the depolymeri組tion of hyaluronic acid byDイructose6−
phosphate
Proteinconcentration（％）
7
1
9
4
6
7
4
2
5
3
8
2
2
5
3
9
1
6
2・A▲
In＄ulin
4
Hemoglobin
5
α・Globulin
5
Cytochromec
0．001
0．01
0．001
0，01
0．001
0．01
0．001
0．01
0．001
0．01
∩くU
Albumin
Inhibitionratio（％）
ハ0
4
Hyaluronまcacid（1％）solutioncontainまngD・rruCtOS￠6−phosphaもe（1mM）andCu2サ（10〟M）
wasincubatedwまthprotein（0．001andO．01％）at37℃どor24h．
1
0
Forinhit）ition ratio，SeeMatcriと11s andMctIlOds．
合には同程度のヒアルロン軟の解露台が起こるように条
酸の解東食への影轡ほ，川蝉らの研究結果から予測され
件を設定してある。ど−ポリリジン（塩酸塩）およびそ
るように，1mMヒスチジンの添加によって94．6％の
のモノマーであるリジン（塩酸墟）の場合も蛋白質同様
高い解整合阻審効果がみられた。これはヒアルロン観の
に活性散楽捕捉作用が組められた。さらに過酸化水系に
解惑合に関与する活性酸素がヒスチジンを優先して教化
よる活性観衆生成系の方がより太さな阻寒が見られ，活
したためと貰える。
性酸素生成系でその阻賓率に塞が生じた。これは，D−フ
このように蛋白質，ポリペプチドおよびアミノ観はヒ
ラクトース6−リン酸】2価飼イオン系および過餞化水
アルロン故意の1およぴ0．1％桂皮のわずかな應でヒア
素系では解惑合に関与する活性酸素種が異なるか，その
ルロン酸解窓合反応を強く阻害した。これはヒアルロン
生成経絡が異なることによると考えられる。また，D−フ
敢の解蛋合を引き起こす活性散発がヒアルロン敢よりほ
ラクトース6−リン駿とど−ポリリジンあるいはリジン
むしろ蛋白質，ポリペプチドやアミノ酸をより選択的に
間でアミノカルポエル反応が起こり，この反応が若干解
攻撃するためであると習える。
蕊合反応を促進している可能性も考えられる。ど・ポリ
以上のように活性散発によるヒアルロン駿解蛮合反応
リジンが，残遜数の同じ磯波でリジンに比べ約2倍程度
ほ蛋白質，ポリペプチドおよびアミノ酸により効果的に
高い阻審率を与えた。現在のところ理由は明らかでほな
阻寒された。このことから動物や微生物由来のヒアルロ
いが，高分子のポリリジンがヒアルロン駿と会合し，活
ン教の解蚤合反応を検討する際にば，用いるヒアルロン
性酸素の攻撃からヒアルロン按を保護する効娘が増大す
酸の精製を十分に行う必要があり，実験結果を相互に比
るのかもしれない。Fig．2において￡−ポリリジン，リ
絞する場合は蛋白含恩が同じか，よく似たヒアルロン駿
ジンともに0．01％以上の添加でその阻啓効果が頭打ち
を使用することが望ましい。さらに，生体内で発生した
になるのは，過酸化水素系によるヒアルロン駿の解露台
活性酸素はヒアルロン酸よりその周辺に存在するコラー
反応が単…・の活性酸素種のみによっておこっていないこ
ゲンなどの蛋白質を選択的に攻撃するのではないかと推
とを物語るものである。このような現象はヒアルロン駿
察される。
解盤台反応のSODによる阻啓実験でもみられたま〉。
Table2に種々のアミノ敢添加によるヒアルロン髄
解盛会反応の阻轡効果を示した。アミノ酸のヒアルロン
154
佐藤 郁夫・柏村 政樹
ActiY￠OXygeng￠n￠ratOrS
0 10
＝0 30 40 50 60 70 80 90 100
】nhibition】加10（馬）
Fig，1．Inhibitioneffectof8・POlylysineHCI（PL HCI）andlysine HCI（Lys HC‡）in the
depolymeriヱation or hyaluronic aeid byD・鉦uctose6−phosphate（FふP）and by
hydrogenperoxide．Hyaluronicacまd（1％）soluもioncontainingF・6・P（1mM）and
Cu2ヰ（10〃M）orhydrogenperoxide（1％）wasまneubatedwithPL HCI（0．01％）or
LysHCI（0．01％）at370cfor24h．
Forinhibition raLio．seeMaterialsandMethods．
00
鍾
鮒
Ⅶ
の
幻
亜 30
︵辞︶虐巴UO⋮︼ヨ叫召−
罰 10
0
0．∝〉5
0．01 0．015 0．02 0，025 0．03
Coneenhadon（％）
0．035
0．04
Fig．2．E汀ectofeoneentrationofど・pOiyiy扇neHC‡（FLHC‡）andlysine壬まC‡（Lys吾Cl）inthe
depolymerizatまonofhyaluronieaeidbyhydrogenperoxide．Hyaluronieacid（1％）
solutioncontaまning・hydr叩enperOXide（1％）wasincubatedwithPLHCI（昏）orLys
HCI（○）at370crol、24h．
Forinhibition ratio，SeeMaterialsandMethods．
活性敢紫によるヒアルロン酸の解盟合反応に及ぼすこ三の蛋白質，ポリペプチドおよびアミノ酸の影轡155
Table 2・Inhibitioneffectofarninoacidsinthedepolymeriヱationof hyaluronic acid by hydrogen
pel・OXide
Addition
Inhibitionratio（？6）
5
4
9
rg
AG
nV
2
4
7
6
4
5
ハU
3
7
6
4
2
7
9
4
結
八一U
Forinhibition ratio．seeMaterialsand Methods．
翰
活性酸素によるヒアルロン敢の解東食反応がま自質，
QU
Hyaluronic aeid（1％）solution containing hydro酢n perOXide（1％）wasincubated with
aminoacids（1mM）at37bcfol・24h．
引用文献
1）SATO，Ⅰり才．ZU，S．NISH王KAWA and N．XAS肌
ポリペプチドやアミノ酸によりそれらの添加厳に応じて
MUR＾．Depolymerization of hyalしIrOnic acid
阻番された。ヒアルロン吸の起源の相遵により解窓合の
byD−fructose6−phosohate，Btosci．BEo亡ech．
程度が異なる原因としてサンプル申に微塵に存在してい
る蛋白質あるいはその分解物の作用によるためでほない
かと考えられる。
月よocJほm．57：2005−2009（1993）．
2）SATO，Ⅰ．，Y．YosH工D＾，S．NISHZKÅ＼＼7A，M．7NAGAKI
andN・K＾SHIMUR＾．］TIUitrodepol）・merization
Ofhyaluronicacidby oligosaccharide−derived
OXygen radicalspecies．ln FroTttiers q［
要
約
2価銅イオン存在下でのD・フラクトース 6・リン酸お
よび過酸化水発系によるヒアルロン穀解東合反応に及ぼ
す蛋白質，ポリペプチドおよぴアミノ酸の影啓を研究し
た。使用した蛋白質，ポリペプチド，アミノ酸全てに，
属eαC￡わg O∬ツge花 勒ぞぐieぶ ￡花 成0わgッ α花d
Medicine（ed．byl（．Asada andT．Yoshida，
Excepta Medica，Amsterdam），P167−168
（1994）．
3）RASH王MURA，N．，Ⅰ．SAで0，Z．KuMAZAWA，H．KuNO，
程度に産はあるものの，解重合反応阻審効果が認められ
S．KoYAMAand M．KJIr＾GAW＾．Generation of
た。これらの異なる活性駿東生成系でその阻賓率が異なっ
SuPerOXideandinuLtroinactivationofviruses
たが，これは発生している活性観衆種が異なるためと考
byaldopentoses，Agric．Biol．Chem‥46：2407L
えられる。さらに，e一ポリリジンとリジンの添加効果
2409．（1982）．
が0．01％以上で頭打ちになることより，過酸化水素系
によるヒアルロン敢解露台反応には禎数（2つ以上の意
味）の活性観衆確か関与しているもめと推察された。
4）HALLIWELL，B．andJ．M．C．GuγrERIDGE：フリー
ラジカルと生体（松尾光乳嵯峨井勝，膏川敏十私
学会出版センター），p71−149（1988）．
5）UcJilD＾．K．and S．K＾WAKISHl．Selective
謝
辞
本研究を行うに当たり多大な御助言を頂いた当研究室
の西川司朗助教授に心から感謝致します。
oxidation of imidazole ring in histidine
residues by the ascorbic acid−COpperion
SyStem，戯0ご九em．βi8pんッ訊Reg．Comm㍑軋，
138：659−665（1986）．
佐藤 郁夫・柏村 政樹
156
6）Uc昆ヱDA，Ⅹ．aIldS．XAWAXユS瓜Seleetiveoxida・
8）OKAMOTO，G．，F．HAYASEand罠−KA・m．
tion or tr）・ptOphan alld histidinel・esiduesin
Scaveng・1ng Of active oxyg・en Spedes by
protein through tbe copper・Catalyzed autq
glycatedproteins，β￡0ぷCi．戯0とどcん．戯oc′とem．，
OXidation or L−aSCOrbic acid，Agrよc．戯oZ．
56：928…931（1992）．
C九emり52：1529榊1535（1988）．
7）内田浩二三井弟番，川岸舜朗．活性酸索に対する
イミダゾール関連化合物の反応とその教化抑制作メ札
日本螢芸化学会昭和63年度大会餓演婆乱名儲乳
p215（1988）．
9）柏村麗樹．糖質と活性駿嵐蛋白質核酸酵素，33：
3116仙3126（1988）一