GIBH Talk - プレクセラ・バイオサイエンス(株)

お待たせしました
アフィニティLC-MSシステムが
ついに実用化されました。
アフィニティLC : SkiPro
ESI-MS
CAⅡを固定化したバイオセンサーに、8種類のサルファ系化合物
混合液を注入した時のセンサグラム
溶出液をMSに導入して、2本のスペクトルが得られ
m/zの値から1-3ベンゼンスルフォアミドとダンシルアミドと同定
アフィニティLC-MSの特徴
★ ミックスチャーや未精製のアナライト注入は、薬物スクリーニングに有効な手段となります。
★ 薬物投与後の血清などを注入して、代謝物のアフィニティ解析と同定が可能です。
★ アフィニティ解析時の定量精度が大いに向上します。
●シリコン3次元バイオセンサー・チップ
これまで多くのアフィニティLC-MSの試みがなされ
ましたが、感度の問題をどうしても克服することが
できませんでした。
NPOI
チップ
ナノチューブ
集合体
SkiProでは、従来の『金コーティング・スライドガラ
ス』ではなく、新開発の『ナノチューブ集合体の
シリコンウェハー』をバイオセンサーチップとして
採用しました。
シリコンチップは非常に広い表面席を有し、従来の
金コーティング・バイオセンサーに比べて100倍の
リガンドを固定化できます（もちろん消費量は同じ）。
それに従いアフィニティ結合するアナライトの量も
100倍増加し、これによりオンラインMS測定時の
感度の問題を大幅に改善することに成功しました。
●Nanopore Optical Interferometry (NPOI) ： 干渉分光法
MS側の感度の問題はシリコンチップで改善出来ましたが、アフィニティLCとしてはSPRが使用できなくなりました。
そこで同じノンラベル・リアルタイム検出法としてNPOI干渉分光法を搭載しました。
NPOIは従来のSPRに比べて非常に安定なので、ベースラインドリフトを僅か0.35RU/時間に抑える事に成功しました。
長時間の安定したベースラインにより、約3時間連続測定による『10－６秒のスロー・カイネティックオフ』をも測定することが可能に
なりました。
プレクセラ・バイオサイエンス株式会社
d)
HPLCポンプ
0.0１～0.05% ギ酸
50～80% AcCN
b) Skiトラップ
容量2.5μL C18
c)
SkiPro
廃液
a)
サンプルループ
③アフィニティLC-MSの流路図
サンプル注入時
ESI-MS
①固定されたリガンドに、
分子がアフィニティで結合します。
アフィニティを有しない分子は廃液と
なります。
①アフィニティ作用を有する分子
②バッファーが流れ、結合した分子が
解離して溶出液となります。
溶出液はa)のサンプルループに
満たされます。
②バイオセンサー上に保持された
のみが結合し、バイオセンサー上に
保持される
分子が溶出する
③解離中、または解離終了後に
サンプルループがインジェクトになり
HPLCポンプから流れるｃ）水により
分子はb)Skiトラップカラムに到達し
保持されます。
解離：ディソシエーション
結合：アソシエーション
④HPLCポンプからd)アセトニトリル
水溶液が流れ、トラップに保持され
た分子はESIへ導かれてイオン化し
MSで測定されます。
SkiProで得られるセンサグラム
MSへ
米国アムジェン社に納入され
LTQと接続運転中のSkiPro
インテンシティをプロット
MSスペクトル
SkiProで明瞭で良好なセンサグラムが得られ
MSではm/z543.84となりドキソルビシンであることが
確認できました。
溶出液を40秒毎にMSにインジェクトし、プロットした
グラフは、SkiProのディソシエーション・センサグラム
と良く一致しています。
アフィニティLCとしてのSkiPro
基本テクノロジー
SkiPro
従来方式
バイオセンサー：シリコン・ナノチューブ集合体
バイオセンサー：金コーティング・ガラス
リアルタイム・ノンラベル検出：
Interferometry （干渉分光法）
リアルタイム・ノンラベル検出：
SPR （表面ブラズモン共鳴）
バイオセンサーの種類
●
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●
●
●
●
アミンカップリング用COOH
ストレプトアビジン
ベンズアルデヒド
ヒスチジン用Ni
プロテインA
プロテインG
アプリケーション
化合物・医薬品
干渉分光法は広いダイナミックレンジと、安定したベースラインが特徴です。
タンパク質をリガンドとし、微量の低分子医薬品や、弱いアフィニティ結合など
も問題なく測定できます。
タンパク質の定量
リガンド；抗マウスIｇG（FCスペシフィック）抗体
アナライト；マウスIgGをハイブリドーマ培地/10％FBS
で調整して0.3～100ｎMの6種類の濃度に調整
各濃度での結合のプロフィール
濃度とインテンシティは良好な直線性を示し
ました。
バックグラウンド溶液の影響をほとんど受けず、
タンパク質の定量分析が可能であることが分ります。
検出限界は１nMでした。
スローKOffの測定
10-6sec-1を超える値の測定はこれまで非常に困難とされていました。
SkiProはベースラインが非常に安定していますので、3時間近い連続測定
が可能です。
アナライトとしてボツリヌストキシン用いる解析で、2時間半の長時間測定に
より2.4ｘ10-6sec-1と既に報告されている値と一致する、KOff値を得ることが
出来ました。
10,000秒＝167分＝2.8時間
ベースラインドリフト＜0.5RU/時間
シリコン・カイネティクス社は米国カリフォルニア州サンディエゴに2008年に設立されたベンチャー企業です。
2009年にSkiProの試作機を発表し、同年のR&D100 Awardを受賞しました。
2012年に世界初の実用型のアフィニティLC-MSを発表し
★ Amgen社
; タンパク質 vs 低分子化合物のスクリーニング
★ Plexxikon社 ; 低分子、ペプチドのカイネティック解析
★ SAIC社
; 抗体 vs ペプチドのスクリーニング
など、既に約20社に販売納品済みで、稼働中です。
日本では2013年3月にプレクセラ・バイオサイエンス社より販売開始されました。
シリコンチップを上部から見た
顕微鏡写真
平均孔径80nｍ、長さ２μｍのチューブ集合体の
シリコンウェハーをバイオセンサーに採用
画期的なアイデアでアフィニティ解析に新しい可能性を生み出しました。
シリコンチューブを真横から見た模式図。
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