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Page 1 (19)日本国特許庁(JP) (12)公表特許公報(A) (11)特許出願公表
JP 2012-516687 A 2012.7.26 (57)【要約】 本発明は、新規の細胞および細胞株、ならびにそれらを作製および使用するための方法 に関する。 【選択図】図１ (2) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【特許請求の範囲】 【請求項１】 甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを内 在的に発現する細胞を単離する方法であって、 ａ．細胞の集団を提供する工程； ｂ．Ｔ１Ｒ２の発現を検出する分子ビーコンを細胞へと導入し、および／またはＴ１Ｒ ３の発現を検出する分子ビーコンを細胞へと導入する工程；ならびに ｃ．甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニット を発現する細胞を単離する工程 を含む、前記方法。 10 【請求項２】 甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを内在的に発 現する細胞を単離する方法であって、 ａ．細胞の集団を提供する工程； ｂ．Ｔ１Ｒ２の発現を検出する分子ビーコンを細胞へと導入し、およびＴ１Ｒ３の発現 を検出する分子ビーコンを細胞へと導入する工程；ならびに ｃ．甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを発現す る細胞を単離する工程 を含む、前記方法。 【請求項３】 20 細胞の前記集団がＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３を発現することが公知ではない、請求項１ま たは２に記載の方法。 【請求項４】 前記単離された細胞におけるＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３の任意の発現レベルが、細胞の前 記集団の平均細胞におけるよりも少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５０ ０倍、７５０倍、１０００倍、２５００倍、５０００倍、７５００倍、１００００倍、５ ００００倍、または少なくとも１０００００倍高い、請求項１または２に記載の方法。 【請求項５】 細胞の前記集団における遺伝的変動が、該単離する工程に先立って増大した、請求項１ または２に記載の方法。 30 【請求項６】 請求項１∼５のいずれか一項に記載の方法に従って作製した単離された細胞。 【請求項７】 甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを内 在的に発現する単離された細胞であって、ここで、前記単離された細胞は、細胞の集団に 由来し、かつ前記単離された細胞における甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／また は甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットの発現は、細胞の前記集団の平均細胞におけるよりも 少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、１０００倍、２ ５００倍、５０００倍、７５００倍、１００００倍、５００００倍、または１０００００ 倍高い、前記単離された細胞。 40 【請求項８】 細胞の前記集団が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、確立されたニューロ ン細胞株、褐色細胞腫、神経芽腫線維芽細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓ ｆｉｂｒ ｏｂｌａｓｔ）、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳ０細胞、ＣＶ‐１（ＡＴＣＣ ＣＣ Ｌ ７０）、ＣＯＳ‐１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ‐７（ＡＴＣＣ ＣＲ Ｌ １６５１）、ＣＨＯ‐Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣ Ｌ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ‐Ｃ‐１（ＡＴＣＣ ＣＣ Ｌ ２６）、ＭＲＣ‐５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ‐２９３（ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １５７３）およびＰＣ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐１７２１）、ＨＥＫ２９ 50 (3) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐１１２６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐１３７８）、ＳＨ ‐ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ‐３４）、Ｓ Ｊ‐ＲＨ３０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ‐２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ‐８０６５ ）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ ８５０５０ ３０２）、ベロ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１）、Ｃａｃｏ‐２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ３７） 、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）、ジャーカット（ＡＴＣＣ ＴＩＢ‐１５２） 、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、 ライデン、オランダ）、Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣヒト 初代ＰＣＳ １００‐０１０、マウスＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５、ＣＲＬ２５１６ ）、ＨｕＨ‐７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５）、ＩＭＲ‐９０（ＡＴＣＣ ＣＣ 10 Ｌ １８６）、ＭＣＦ‐７（ＡＴＣ ＨＴＢ‐２２）、Ｕ‐２ ＯＳ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ‐９６）、Ｔ８４（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４８）、初代細胞、または不死化細胞の集団で ある、請求項７に記載の細胞。 【請求項９】 請求項７に記載の細胞の培養物。 【請求項１０】 甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブ不ニットを含む甘味受 容体を安定して発現する細胞または細胞株であって、前記サブユニットの少なくとも１つ の発現は、前記サブユニットをコードする核酸の宿主細胞への導入、あるいは宿主細胞お よび前記宿主細胞に由来する細胞または細胞株に既に存在するサブユニットをコードする 20 核酸の遺伝子活性化から結果として生じる、前記細胞または細胞株。 【請求項１１】 甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニット、甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニット、およびＧタンパ ク質を含む、甘味受容体を安定して発現する細胞または細胞株であって、前記サブユニッ トおよびＧタンパク質のうちの少なくとも１つの発現が、前記サブユニットまたはＧタン パク質をコードする核酸の宿主細胞への導入、あるいは宿主細胞および前記宿主細胞に由 来する細胞または細胞株に既に存在する前記サブユニットまたはＧタンパク質をコードす る核酸の遺伝子活性化から結果として生じる、前記細胞または細胞株。 【請求項１２】 少なくとも１つの甘味受容体サブユニットが、前記宿主細胞へと導入される該サブユニ 30 ットをコードする核酸から発現する、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項１３】 少なくとも１つの甘味受容体サブユニットが、前記宿主細胞に存在する核酸から遺伝子 活性化によって発現する、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項１４】 前記宿主細胞は： ａ．真核細胞であり； ｂ．哺乳類細胞であり； ｃ．甘味受容体の少なくとも１つのサブユニットもしくはＧタンパク質を内在的に発現 せず；または 40 ｄ．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせ である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項１５】 前記宿主細胞が、ＨＥＫ‐２９３細胞である、請求項１０または１１に記載の細胞また は細胞株。 【請求項１６】 前記甘味受容体は ａ．哺乳類であり； ｂ．ヒトであり； ｃ．異なる種に由来するサブユニットを含み； 50 (4) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｄ．キメラである１つ以上のサブユニットを含み； ｅ．（ａ）∼（ｄ）の任意の組み合わせ である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項１７】 前記甘味受容体が機能的である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項１８】 アッセイにおいて少なくとも０．３のＺ’値を有する、請求項１０または１１に記載の 細胞または細胞株。 【請求項１９】 アッセイにおいて少なくとも０．７のＺ’値を有する、請求項１７に記載の細胞または 10 細胞株。 【請求項２０】 選択的圧力の不在下で培地において甘味受容体を安定して発現する、請求項１０または １１に記載の細胞または細胞株。 【請求項２１】 前記甘味Ｔ１Ｒ２受容体サブユニットが、下記からなる群から選択される、請求項１０ または１１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号３４のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む、甘味受 容体サブユニット； ｂ．配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別 20 の種の対応物のアミノ酸配列を含む、甘味受容体サブユニット； ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３１、または配列番号３４のアミノ酸をコー ドする核酸とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列または別の種 の対応物のアミノ酸配列を含む、甘味受容体サブユニット；および ｄ．配列番号３１と少なくとも８５％同一である核酸、もしくは配列番号３４のアミノ 酸をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、または別の種の対応物のアミノ 酸配列を含む、甘味受容体サブユニット。 【請求項２２】 前記甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２が、下記からなる群から選択される核酸によって コードされる、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株： 30 ａ．配列番号３１を含む核酸： ｂ．配列番号３４のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプ チドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ．ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および ｄ．配列番号３１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、または 配列番号３４のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。 【請求項２３】 前記甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３が、下記からなる群から選択される、請求項１０ または１１に記載の細胞または細胞株： 40 ａ．配列番号３５のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む甘味受容 体サブユニット； ｂ．配列番号３５のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列と少なくとも８ ５％同一であるアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット； ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３２または配列番号３５のアミノ酸配列もし くは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列 を含む甘味受容体サブユニット；および ｄ．配列番号３２と少なくとも８５％同一である核酸または配列番号３５のアミノ酸配 列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ 酸配列を含む甘味受容体サブユニット。 50 (5) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項２４】 前記甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットが、下記からなる群から選択される核酸によって コードされる、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号３２を含む核酸； ｂ．配列番号３５のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプチ ドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ．ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および ｄ．配列番号３２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、または 配列番号３５のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。 10 【請求項２５】 前記Ｇタンパク質が、下記からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞または 細胞株： ａ．配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を 含むＧタンパク質； ｂ．配列番号３６もしくは３７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別の 種の対応物のアミノ酸配列を含むＧタンパク質； ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３３とハイブリッド形成する核酸あるいは配 列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核 酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質；および 20 ｄ．配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列あるいは配列番号３６もしく は３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコード されるアミノ酸配列を含むＧタンパク質。 【請求項２６】 前記Ｇタンパク質が、下記からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求 項１１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号３３を含む核酸； ｂ．配列番号３６もしくは３７のポリペプチドまたは別の種の対応物のアミノ酸配列を コードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ．ａ）またはｂ）の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌ 30 クレオチド配列を含む核酸および； ｄ．配列番号３３と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列、あるいは配列番号３６ もしくは３７のアミノ酸、または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸配列を 含む核酸。 【請求項２７】 ａ．甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットをコードする核酸を含む第一のベクター、甘味受 容体Ｔ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸を含む第二のベクター、および任意に、Ｇタ ンパク質をコードする核酸を含む第三のベクターを宿主細胞へと導入する工程； ｂ．前記甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットの発現を検出する第一の分子ビーコン、前記 甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットの発現を検出する第二の分子ビーコン、および任意に、 40 前記Ｇタンパク質の発現を検出する第三の分子ビーコンを、工程ａ）において作製される 宿主細胞へと導入する工程；ならびに ｃ．前記Ｔ１Ｒ２サブユニット、前記Ｔ１Ｒ３サブユニット、および任意に前記Ｇタン パク質を発現する細胞を単離する工程 を含む、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株を作製するための方法。 【請求項２８】 工程ｃ）において単離された細胞から細胞株を作製する工程をさらに含む、請求項２７ に記載の方法。 【請求項２９】 前記宿主細胞が： 50 (6) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ａ．真核細胞であり； ｂ．哺乳類細胞であり； ｃ．甘味受容体の少なくとも１つのサブユニットもしくはＧタンパク質を内在的に発現 せず；または ｄ．ａ）、ｂ）およびｃ）の任意の組み合わせ である、請求項２７に記載の方法。 【請求項３０】 ａ．細胞を１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される 期間培養する工程； ｂ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの発現を該時間にわたって周期的にアッセ 10 イし、前記発現がＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでアッセイされる工程；および ｃ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの実質的に安定した発現を特徴とする細胞 または細胞株を、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択さ れる期間にわたって選択する工程 をさらに含む、請求項２７に記載の方法。 【請求項３１】 ａ．細胞を１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される 期間培養する工程； ｂ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの発現レベルを該時間にわたって測定し、 前記発現がＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでアッセイされる工程；および 20 ｃ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの発現の実質的に同じレベルを特徴とする 細胞または細胞株を、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選 択される期間にわたって選択する工程 をさらに含む、請求項２７に記載の方法。 【請求項３２】 前記甘味受容体のタンパク質発現レベルの測定が、機能的アッセイを用いて実施される 、請求項３１に記載の方法。 【請求項３３】 前記Ｔ１Ｒ２サブユニットが、請求項１２のａ）∼ｄ）のサブユニットからなる群から 選択され、前記Ｔ１Ｒ３サブユニットが、請求項１４のａ）∼ｄ）のサブユニットからな 30 る群から選択され、かつ前記Ｇタンパク質が、請求項１６のａ）∼ｄ）のタンパク質から なる群から選択される、請求項２７に記載の方法。 【請求項３４】 前記Ｔ１Ｒ２サブユニットが、請求項１３のａ）∼ｄ）に記載の核酸によってコードさ れるサブユニットからなる群から選択される核酸によってコードされ、前記Ｔ１Ｒ３サブ ユニットが、請求項１５のａ）∼ｄ）に記載の核酸によってコードされるサブユニットか らなる群から選択され、かつ前記Ｇタンパク質が、請求項１７のａ）∼ｄ）に記載の核酸 によってコードされるタンパク質からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。 【請求項３５】 前記単離する工程が、蛍光励起セルソーターを利用する、請求項２７に記載の方法。 40 【請求項３６】 請求項６、１０、または１１に記載の少なくとも１つの細胞または細胞株を、少なくと も１つの試験化合物に曝露し、かつ甘味受容体機能における変化を検出する工程を含む、 甘味受容体機能の修飾因子を同定するための方法。 【請求項３７】 前記修飾因子が、甘味受容体阻害薬、甘味受容体アンタゴニスト、甘味受容体遮断薬、 甘味受容体活性化因子、甘味受容体アゴニスト、または甘味受容体増強薬からなる群から 選択される、請求項３６に記載の方法。 【請求項３８】 前記甘味受容体がヒト甘味受容体である、請求項３６に記載の方法。 50 (7) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項３９】 前記試験化合物が、小分子、化学部分、ポリペプチド、または抗体である、請求項３６ に記載の方法。 【請求項４０】 前記試験化合物が、化合物のライブラリである、請求項３６に記載の方法。 【請求項４１】 前記ライブラリが、低分子ライブラリ、組み合わせライブラリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒ ｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）、ペプチドライブラリ、または抗体ライブラリである、請求項 ４０に記載の方法。 【請求項４２】 10 前記修飾因子が、甘味受容体の酵素的に修飾された形態に対して選択的である、請求項 ３６に記載の方法。 【請求項４３】 請求項３６に記載の方法によって同定される修飾因子。 【請求項４４】 前記細胞または細胞株が、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群 から選択される期間にわたる、甘味受容体の実質的に安定した発現を特徴とする、請求項 ６、１０、または１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項４５】 前記細胞または細胞株が、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群 20 から選択される期間にわたる前記甘味受容体の発現の実質的に同じレベルを特徴とする、 請求項６、１０、または１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項４６】 前記発現レベルが、機能的アッセイを用いて測定される、請求項４５に記載の細胞また は細胞株。 【請求項４７】 請求項２７∼３５のいずれか一項記載の方法によって作製される、請求項６、１０、ま たは１１に記載の細胞または細胞株。 【請求項４８】 前記細胞が、経時的に一貫して少なくとも１つの望ましい特性を有し、下記を含む、請 30 求項１０または１１に記載の細胞または細胞株を作製するための方法： ａ．前記甘味受容体のサブユニットまたは任意にＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを 発現する複数の細胞を提供する工程； ｂ．細胞を個々の培養容器に分散させ、それにより複数の個別の細胞培養物を提供する 工程； ｃ．１セットの所望の培養条件が、前記個別の細胞培養物の各々と実質的に同一である ことを特徴とする自動細胞培養方法を用いて前記条件下で細胞を培養し、該培養の間、各 個別の細胞培養物におけるウェルあたりの細胞数が標準化され、かつ前記個別の培養物が 、同じスケジュールで継代される工程； ｄ．前記個別の細胞培養物を前記甘味受容体のまたは該受容体を産生する細胞の少なく 40 とも１つの所望の特徴について少なくとも２回アッセイする工程；および ｅ．前記所望の特徴を有する個別の細胞培養物を両アッセイにおいて同定する工程。 【請求項４９】 甘味受容体を産生し、かつ経時的に一貫した少なくとも１つの所望の特性を有し、請求 項４８に記載の方法によって作製される細胞または細胞株。 【請求項５０】 旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットと旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットとを含む旨味受容 体を安定して発現する細胞または細胞株であって、前記サブユニットの少なくとも１つの 発現が、宿主細胞への前記サブユニットをコードする核酸の導入、または宿主細胞におい て既に存在するサブユニットをコードする核酸の遺伝子活性化から結果として生じ、かつ 50 (8) JP 2012-516687 A 2012.7.26 前記細胞または細胞株が前記宿主細胞から誘導される、前記細胞または細胞株。 【請求項５１】 旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニット、旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニット、およびＧタンパ ク質を含む旨味受容体を安定して発現する細胞または細胞株であって、前記サブユニット の少なくとも１つおよびＧタンパク質の発現が、前記サブユニットまたはＧタンパク質を コードする核酸の導入または宿主細胞に既に存在する前記サブユニットまたはＧタンパク 質をコードする核酸の遺伝子活性化から結果として生じ、かつ前記細胞または細胞株が前 記宿主細胞から誘導される、前記細胞または細胞株。 【請求項５２】 少なくとも１つの旨味受容体サブユニットが、前記宿主細胞へと導入される該サブユニ 10 ットをコードする核酸から発現する、請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項５３】 少なくとも１つの旨味受容体サブユニットが、遺伝子活性化によって宿主細胞に存在す る核酸から発現する、請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項５４】 前記宿主細胞が： ａ．真核細胞であり； ｂ．哺乳類細胞であり； ｃ．旨味受容体のうちの少なくとも１つのサブユニットまたはＧタンパク質を内在的に 発現せず；あるいは 20 ｄ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせ である、請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項５５】 前記宿主細胞が、ＨＥＫ‐２９３細胞である、請求項５０または５１に記載の細胞また は細胞株。 【請求項５６】 前記旨味受容体が、 ａ．哺乳類であり； ｂ．ヒトであり； ｃ．異なる種由来のサブユニットを含み； 30 ｄ．キメラである１つ以上のサブユニットを含み； ｅ．（ａ）∼（ｄ）の任意の組み合わせ である、請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項５７】 前記旨味受容体が機能的である、請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項５８】 アッセイにおいて少なくとも０．３のＺ’値を有する、請求項５０または５１に記載の 細胞または細胞株。 【請求項５９】 アッセイにおいて少なくとも０．７のＺ’値を有する、請求項５８に記載の細胞または 40 細胞株。 【請求項６０】 選択的圧力の不在下で培地において旨味受容体を安定して発現する、請求項５０または ５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項６１】 前記旨味Ｔ１Ｒ１受容体サブユニットが、下記からなる群から選択される、請求項５０ または５１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号４２∼４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、別の種の対応物の アミノ酸配列とを含む旨味受容体サブユニット； ｂ．配列番号４２∼４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同 50 (9) JP 2012-516687 A 2012.7.26 一のアミノ酸配列と、別の種の対応物のアミノ酸配列とを含む旨味受容体サブユニット； ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号４１とハイブリッド形成する核酸、または配 列番号４２∼４５からなる群から選択されるアミノ酸配列および別の種の対応物のアミノ 酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニッ ト；ならびに ｄ．配列番号４１と少なくとも８５％同一である核酸、または配列番号４２∼４５から なる群から選択されるアミノ酸配列および別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核 酸によってコードされるアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニット。 【請求項６２】 前記旨味受容体サブユニットＴ１Ｒ１が、下記からなる群から選択される核酸によって 10 コードされる、請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号４１を含む核酸； ｂ．配列番号４２∼４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、別の種の対応物の アミノ酸配列とを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ．ａ）またはｂ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および ｄ．配列番号４１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、または 配列番号４２∼４５からなる群から選択されるアミノ酸配列および別の種の対応物のアミ ノ酸配列をコードする核酸。 【請求項６３】 20 前記旨味受容体サブユニットＴ１Ｒ３が、下記からなる群から選択される、請求項５０ または５１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号３５のアミノ酸配列と、別の種の対応物のアミノ酸配列とを含む旨味受容 体サブユニット； ｂ．配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列と、別の 種の対応物のアミノ酸配列とを含む旨味受容体サブユニット； ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３２とハイブリッド形成する核酸、または配 列番号３５のアミノ酸配列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によ ってコードされるアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニット；および ｄ．配列番号３２と少なくとも８５％同一である核酸または配列番号３５のアミノ酸配 30 列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ 酸配列を含む旨味受容体サブユニット。 【請求項６４】 前記旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットが、下記からなる群から選択される核酸によって コードされる、請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号３２を含む核酸； ｂ．配列番号３５のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプチド をコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ．ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および 40 ｄ．配列番号３２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、または 配列番号３５のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。 【請求項６５】 前記Ｇタンパク質が、下記からなる群から選択される、請求項５１に記載の細胞または 細胞株： ａ．配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を 含むＧタンパク質； ｂ．配列番号３６もしくは３７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別の 種の対応物のアミノ酸配列を含むＧタンパク質； ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３３とハイブリッド形成する核酸、あるいは 50 (10) JP 2012-516687 A 2012.7.26 配列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする 核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質；および ｄ．配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列、あるいは、配列番号３６も しくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコ ードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質。 【請求項６６】 前記Ｇタンパク質が、下記からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求 項５１に記載の細胞または細胞株： ａ．配列番号３３を含む核酸、または別の種の対応物のアミノ酸配列； ｂ．配列番号３６もしくは３７のポリペプチドまたは別の種の対応物のアミノ酸配列を 10 コードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ．ａ）またはｂ）の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌ クレオチド配列を含む核酸および； ｄ．配列番号３３と少なくとも９５％配列同一であるヌクレオチド配列、あるいは配列 番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸 配列を含む核酸。 【請求項６７】 請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株を作製するための方法であって、下記 の工程を含む方法： ａ．旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットをコードする核酸を含む第一のベクター、旨味受 20 容体Ｔ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸を含む第二のベクター、および任意に、Ｇタ ンパク質をコードする核酸を含む第酸のベクターを宿主細胞へと導入する工程； ｂ．旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットの発現を検出する第一の分子ビーコン、旨味受容 体Ｔ１Ｒ３サブユニットの発現を検出する第二の分子ビーコン、および任意に、前記Ｇタ ンパク質の発現を検出する第三の分子ビーコンを、工程ａ）において作製された宿主細胞 へと導入する工程；ならびに ｃ．前記Ｔ１Ｒ１サブユニット、前記Ｔ１Ｒ３サブユニット、および任意に前記Ｇタン パク質を発現する細胞を単離する工程。 【請求項６８】 工程ｃ）において単離された細胞から細胞株を作製する工程をさらに含む、請求項６７ 30 に記載の方法。 【請求項６９】 前記宿主細胞が、 ａ．真核細胞であり； ｂ．哺乳類細胞であり； ｃ．旨味受容体の少なくとも１つのサブユニットまたはＧタンパク質を内在的に発現せ ず；あるいは ｄ．ａ）、ｂ）、およびｃ）の任意の組み合わせ である、請求項６７に記載の方法： 【請求項７０】 40 下記の工程をさらに含む、請求項６７に記載の方法： ａ．細胞を１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間から選択される期間 培養する工程； ｂ．前記旨味受容体またはそのサブユニットの発現を該時間にわたって周期的にアッセ イし、前記発現はＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでアッセイされる工程；および ｃ．１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される期間に わたる、前記旨味受容体またはそのサブユニットの実質的に安定した発現を特徴とする細 胞または細胞株を選択する工程。 【請求項７１】 下記の工程をさらに含む、請求項６７に記載の方法： 50 (11) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ａ．細胞を１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される 期間培養する工程； ｂ．前記旨味受容体またはそのサブユニットの発現レベルを該時間にわたって周期的に 測定し、前記発現が前記ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルにおいてアッセイされる工 程；および ｃ．前記旨味受容体またはそのサブユニットの発現の実質的に同じレベルをとｋ長とす る細胞または細胞株を、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から 選択される期間にわたって選択する工程。 【請求項７２】 前記旨味受容体のタンパク質発現レベルの測定が、機能的アッセイを用いて実施される 10 、請求項７１に記載の方法。 【請求項７３】 前記Ｔ１Ｒ１サブユニットが、請求項１２のａ）からｄ）に記載のサブユニットからな る群から選択され、前記Ｔ１Ｒ３サブユニットが、請求項１４のａ）からｄ）に記載のサ ブユニットからなる群から選択され、かつ前記Ｇタンパク質が、請求項１６のａ）からｄ ）に記載のタンパク質からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。 【請求項７４】 前記Ｔ１Ｒ１サブユニットが、請求項１３のａ）からｄ）に帰しあの核酸によってコー ドされるサブユニットからなる群から選択され、前記Ｔ１Ｒ３サブユニットが、請求項１ ５のａ）からｄ）に記載の核酸によってコードされるサブユニットからなる群から選択さ 20 れ、かつ前記Ｇタンパク質が、請求項１７のａ）からｄ）に記載の核酸によってコードさ れるタンパク質からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。 【請求項７５】 前記単離する工程が、蛍光励起セルソーターを利用する、請求項６７に記載の方法。 【請求項７６】 請求項５０または５１に記載の少なくとも１つの細胞または細胞株を少なくとも１つの 試験化合物に暴露し、かつ旨味受容体機能における変化を検出する工程を含む、旨味受容 体機能の修飾因子を同定するための方法。 【請求項７７】 前記修飾因子が、旨味受容体阻害薬、旨味受容体アンタゴニスト、旨味受容体遮断薬、 30 旨味受容体活性化因子、旨味受容体アゴニスト、または旨味受容体増強薬からなる群から 選択される、請求項７６に記載の方法。 【請求項７８】 前記旨味受容体がヒト旨味受容体である、請求項７６に記載の方法。 【請求項７９】 前記試験化合物が、低分子、化学部分、ポリペプチド、または抗体である、請求項７６ に記載の方法。 【請求項８０】 前記試験化合物が化合物のライブラリである、請求項７６に記載の方法。 【請求項８１】 40 前記ライブラリが、低分子ライブラリ、組み合わせライブラリ、ペプチドライブラリ、 または抗体ライブラリである、請求項８０に記載の方法。 【請求項８２】 前記修飾因子が、旨味受容体の酵素的に修飾された形態に対して選択的である、請求項 ７６に記載の方法。 【請求項８３】 請求項７６に記載の方法によって同定される修飾因子。 【請求項８４】 前記細胞または細胞株が、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群 から選択される期間にわたる旨味受容体の実質的に安定した発現を特徴とする、請求項５ 50 (12) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ０または５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項８５】 前記細胞または細胞株が、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群 から選択される期間にわたる旨味受容体の発現の実質的に同じレベルを特徴とする、請求 項５０または５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項８６】 前記発現レベルが、機能的アッセイを用いて測定される、請求項８５に記載の細胞また は細胞株。 【請求項８７】 請求項１８∼２６のいずれか一項に記載の方法によって作製される、請求項５０または 10 ５１に記載の細胞または細胞株。 【請求項８８】 請求項５０または５１に記載の細胞または細胞株を作製するための方法であって、この 中で、前記細胞が、経時的に一貫して少なくとも１つの所望の特性を有し、下記の工程を 含む前記方法： ａ．旨味受容体の前記サブユニットおよび任意にＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを 発現する複数の細胞を提供する工程； ｂ．細胞を個々の培養容器に個々に分散させ、それにより複数の個別の細胞培養物を提 供する工程； ｃ．前記個別の細胞培養物の各々について、１セットの所望の培養条件が実質的に同一 20 であることを特徴とする自動細胞培養方法を用いて、前記細胞を前記条件下で培養し、そ の間、各個別の細胞培養物におけるウェルあたりの細胞数を培養することが標準化され、 かつ前記個別の培養物が同じスケジュールで経代される工程； ｄ．旨味受容体のまたは該受容体を産生する細胞の少なくとも１つの所望の特徴につい て前記個別の細胞培養物を少なくとも２回アッセイする工程；および ｅ．前記消耗の特徴を有する個別の細胞培養物を両アッセイにおいて同定する工程。 【請求項８９】 旨味受容体を産生し、かつ経時的に一貫して少なくとも１つの所望の特性を有する細胞 または細胞株であって、請求項８８に記載の方法によって作製される前記細胞または細胞 株。 30 【請求項９０】 苦味受容体を安定して発現するよう操作された細胞または細胞株。 【請求項９１】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記苦味受容体が前記細胞または細胞 株へと導入された核酸から発現する前記細胞または細胞株。 【請求項９２】 前記苦味受容体が、操作された遺伝子活性化によって内在性核酸から発現する、請求項９ ０に記載の細胞または細胞株。 【請求項９３】 少なくとも１つの他の苦味受容体を安定して発現する、請求項９０に記載の細胞または 40 細胞株。 【請求項９４】 前記少なくとも１つの他の苦味受容体が内在的に発現する、請求項９３に記載の細胞ま たは細胞株。 【請求項９５】 請求項９３に記載の細胞または細胞株であって、前記少なくとも１つの他の苦味受容体 が、前記細胞または細胞株へと導入された核酸から発現する前記細胞または細胞株。 【請求項９６】 請求項９５に記載の細胞または細胞株であって、前記苦味受容体および前記少なくとも １つの他の苦味受容体が、前記細胞または細胞株へと導入された個別の核酸から発現する 50 (13) JP 2012-516687 A 2012.7.26 前記細胞または細胞株。 【請求項９７】 請求項９５に記載の細胞または細胞株であって、前記苦味受容体および前記少なくとも １つの他の苦味受容体が両方とも、前記細胞または細胞株へと導入された単一の核酸から 発現する前記細胞または細胞株。 【請求項９８】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または細胞株が安定して下記 を発現する前記細胞または細胞株： ａ．内在性Ｇタンパク質； ｂ．異種性Ｇタンパク質または 10 ｃ．その両方。 【請求項９９】 請求項９８に記載の細胞または細胞株であって、前記Ｇタンパク質が、３つの異なるサ ブユニットを含むヘテロ多量体Ｇタンパク質であり、かつ少なくとも２つの異なるサブユ ニットが、前記細胞または細胞株へと導入された異なる核酸から発現する前記細胞または 細胞株。 【請求項１００】 請求項９８に記載の細胞または細胞株であって、前記Ｇタンパク質が、３つの異なるサ ブユニットを含むヘテロ多量体Ｇタンパク質であり、かつ前記３つの異なるサブユニット がすべて、前記細胞または細胞株へと導入された同じ核酸から発現する前記細胞または細 20 胞株。 【請求項１０１】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または前記細胞株における細 胞が下記である前記細胞または細胞株： ａ．真核細胞； ｂ．哺乳類細胞； ｃ．内在性の苦味受容体を発現しない細胞；または ｄ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせ。 【請求項１０２】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または前記細胞株における細 30 胞が、ヒト肺性腎２９３Ｔ細胞である前記細胞または細胞株。 【請求項１０３】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記苦味受容体が： ａ．哺乳類であり； ｂ．ヒトであり； ｃ．該苦味受容体のアミノ末端またはカルボキシル末端でポリペプチドタグを有しない ； ｄ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせ である前記細胞または細胞株。 【請求項１０４】 40 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または細胞株が、細胞ベース のアッセイ、蛍光細胞ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リ ポーター細胞ベースのアッセイ、Ｇタンパク質仲介性細胞ベースのアッセイ、およびカル シウムフラックス細胞ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイにおいて、少 なくとも０．４５のＺ’値を生じる前記細胞または細胞株。 【請求項１０５】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または細胞株が、細胞ベース のアッセイ、蛍光細胞ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リ ポーター細胞ベースのアッセイ、Ｇタンパク質仲介性細胞ベースのアッセイ、およびカル シウムフラックス細胞ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイにおいて、少 50 (14) JP 2012-516687 A 2012.7.26 なくとも０．５のＺ’値を生じる前記細胞または細胞株。 【請求項１０６】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または細胞株が、細胞ベース のアッセイ、蛍光細胞ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リ ポーター細胞ベースのアッセイ、Ｇタンパク質仲介性細胞ベースのアッセイ、およびカル シウムフラックス細胞ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイにおいて、少 なくとも０．６のＺ’値を生じる前記細胞または細胞株。 【請求項１０７】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または細胞株が、少なくとも ２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月 10 間、および少なくとも９ヶ月間からなる群から選択される期間、抗生物質を有さない培地 において前記苦味受容体を安定して発現する前記細胞または細胞株。 【請求項１０８】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記苦味受容体が、下記からなる群か ら選択されるアミノ酸配列を含む前記細胞または細胞株： ａ．配列番号７７∼１０１のうちの任意の１つ； ｂ．配列番号７７∼１０１のうちの任意の１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一 であるアミノ酸配列； ｃ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの逆向きの相補性配列を含む核酸とストリ ンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列；お 20 よび ｄ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの対立遺伝子変異体である核酸によってコ ードされるアミノ酸配列。 【請求項１０９】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記苦味受容体が、下記からなる群か ら選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、前記細胞また は細胞株： ａ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つ； ｂ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチ ド配列；および 30 ｃ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの逆向きの相補性配列を含む核酸とストリ ンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸の配列；および ｄ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの対立遺伝子変異体である核酸の配列。 【請求項１１０】 前記苦味受容体が機能的苦味受容体である、請求項９０に記載の細胞または細胞株。 【請求項１１１】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または細胞株が、イソプロテ レノールト接触したときに細胞内遊離カルシウム濃度における変化を有する、前記細胞ま たは細胞株。 【請求項１１２】 40 請求項１１１に記載の細胞または細胞株であって、前記イソプロテレノールが、前記細 胞または細胞株を用いて導いた用量反応曲線において約１ｎＭ∼約２０ｎＭのＥＣ５０値 を有する、前記細胞または細胞株。 【請求項１１３】 請求項９０に記載の細胞または細胞株であって、前記細胞または細胞株が、１より大き な信号対ノイズ比を有する、前記細胞または細胞株。 【請求項１１４】 請求項９０に記載の細胞または細胞株の回収物であって、前記回収物が、２つ以上の細 胞または細胞株を含み、各細胞または細胞株が、異なる苦味受容体またはその対立遺伝子 変異体を安定して発現する、前記回収物。 50 (15) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項１１５】 公知のリガンドを用いて苦味受容体を安定して発現するよう操作された細胞または細胞 株を追加的に含む、請求項１１４に記載の回収物。 【請求項１１６】 前記その対立遺伝子変異体がＳＮＰである、請求項１１４に記載の回収物。 【請求項１１７】 前記細胞または細胞株が、イソプロテレノールと接触したときに細胞内遊離カルシウム 濃度における変化を有する、請求項１１４に記載の回収物。 【請求項１１８】 前記イソプロテレノールが、各細胞または細胞株を用いて導いた用量反応曲線において 10 １ｎＭ∼２０ｎＭのＥＣ５０値を有する、請求項１１７に記載の回収物。 【請求項１１９】 前記細胞または細胞株が、並行処理を可能にするために同じ生理学的特性を共有するよ う対応している、請求項１１４に記載の回収物。 【請求項１２０】 前記生理学的特性が増殖速度である、請求項１１９に記載の回収物。 【請求項１２１】 前記生理学的特性が、組織培養表面に対する接着である、請求項１１９に記載の回収物 。 【請求項１２２】 20 前記生理学的特性がＺ’因子である、請求項１１９に記載の回収物。 【請求項１２３】 前記生理学的特性が、前記苦味受容体の発現レベルである、請求項１１９に記載の回収 物。 【請求項１２４】 ２つ以上の細胞または細胞株を含み、各細胞または細胞株が、同じ苦味受容体またはそ の対立遺伝子変異体を安定して発現する、請求項９０に記載の細胞または細胞株の回収物 。 【請求項１２５】 前記回収物が、公知のリガンドを有する苦味受容体を安定して発現するよう操作された 30 細胞または細胞株を追加的に含む、請求項１２４に記載の回収物。 【請求項１２６】 前記その対立遺伝子変異体がＳＮＰである、請求項１２４に記載の回収物。 【請求項１２７】 前記細胞または細胞株の各々が、イソプロテレノールト接触したときに細胞内遊離カル シウム濃度における変化を有する、請求項１２４に記載の回収物。 【請求項１２８】 前記イソプロテレノールが、各細胞または細胞株を用いて導いた用量反応曲線において １ｎＭ∼２０ｎＭのＥＣ５０値を有する、請求項１２７に記載の回収物。 【請求項１２９】 40 前記細胞または細胞株が、並行処理を可能にするよう同じ生理学的特性を共有するよう 対応している、請求項１２４に記載の回収物。 【請求項１３０】 前記生理学的特性が増殖速度である、請求項１２９に記載の回収物。 【請求項１３１】 前記生理学的特性が組織培養表面に対する接着である、請求項１２９に記載の回収物。 【請求項１３２】 前記生理学的特性がＺ’因子である、請求項１２９に記載の回収物。 【請求項１３３】 前記生理学的特性が前記苦味受容体の発現レベルである、請求項１２９に記載の回収物 50 (16) JP 2012-516687 A 2012.7.26 。 【請求項１３４】 苦味受容体を安定して発現する細胞を作製する方法であって： ａ．前記苦味受容体をコードする核酸を複数の細胞へと導入すること； ｂ．前記苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンを、工程（ａ）において提供された 複数の細胞へと導入すること；および ｃ．前記苦味受容体を発現する細胞を単離すること を含む、前記方法。 【請求項１３５】 工程（ｃ）において単離された細胞から細胞株を作製する工程をさらに含む、請求項１ 10 ３４に記載の方法。 【請求項１３６】 作製された前記細胞株が、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、 少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、および少なくとも９ヶ月間からなる群から選 択される期間、抗生物質を有さない培地において前記苦味受容体を安定して発現する、請 求項１３５に記載の方法。 【請求項１３７】 前記細胞が下記である、請求項１３４に記載の方法： ａ．真核細胞； ｂ．哺乳類細胞； 20 ｃ．内在性苦味受容体を発現しない細胞；または ｄ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせ。 【請求項１３８】 前記細胞が、ヒト胚性腎２９３Ｔ細胞である、請求項１３４に記載の方法。 【請求項１３９】 前記苦味受容体が： ａ．哺乳類であり； ｂ．ヒトであり； ｃ．前記苦味受容体のアミノ末端またはカルボキシル末端においてポリペプチドタグを 有さない； 30 ｄ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせ である、請求項１３４に記載の方法。 【請求項１４０】 前記苦味受容体が、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３４ に記載の方法： ａ．配列番号７７∼１０１のうちの任意の１つ； ｂ．配列番号７７∼１０１のうちの任意の１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一 であるアミノ酸配列； ｃ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの逆向きの相補性配列を含む核酸とストリ ンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列；お 40 よび ｄ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの対立遺伝子変異体である核酸によってコ ードされるアミノ酸配列。 【請求項１４１】 前記苦味受容体が、下記からなる群から選択されるヌクレオチドはウィ列によってコー ドされるアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載の方法： ａ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つ； ｂ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチ ド配列；および ｃ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの逆向きの相補性配列を含む核酸とストリ 50 (17) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸の配列；および ｄ．配列番号５１∼７５農地の任意の１つの対立遺伝子変異体である核酸の配列。 【請求項１４２】 前記苦味受容体が機能的苦味受容体である、請求項１３４に記載の方法・ 【請求項１４３】 工程（ｃ）において単離された前記細胞が、イソプロテレノールト接触したときに細胞 内遊離カルシウム濃度における変化を有する、請求項１３４に記載の方法。 【請求項１４４】 前記イソプロテレノールが、前記細胞を用いて導いた用量反応曲線において、１ｎＭ∼ ２０ｎＭのＥＣ５０値を有する、請求項１４３に記載の方法。 10 【請求項１４５】 前記単離することが、蛍光励起セルソーターを利用する、請求項１３４に記載の方法。 【請求項１４６】 前記細胞が、内在性Ｇタンパク質、異種性Ｇタンパク質、またはその両方を安定して発 現する、請求項１３４に記載の方法。 【請求項１４７】 ａ．前記苦味受容体をコードする核酸を導入する前； ｂ．前記苦味受容体をコードする核酸を導入した後；または ｃ．前記苦味受容体をコードする核酸を導入することと同時に 前記細胞へとＧタンパク質をコードする核酸を導入することをさらに含む、請求項１３４ 20 に記載の方法。 【請求項１４８】 前記苦味受容体をコードする核酸および前記Ｇタンパク質をコードする核酸が単一のベ クター上にある、請求項１３４に記載の方法。 【請求項１４９】 ａ．前記苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンを導入する前； ｂ．前記苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンを導入した後；または ｃ．前記苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンを導入することと同時に 前記Ｇタンパク質の発現を検出する分子ビーコンを前記細胞へと導入することをさらに含 む、請求項５８に記載の方法。 30 【請求項１５０】 前記苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンおよび前記Ｇタンパク質の発現を検出す る分子ビーコンが異なる分子ビーコンである、請求項１４９に記載の方法。 【請求項１５１】 ａ．前記苦味受容体を発現する細胞を単離する前； ｂ．前記苦味受容体を発現する細胞を単離した後；または ｃ．前記苦味受容体を発現する細胞を単離することと同時に 前記Ｇタンパク質を発現する細胞を単離し；それにより前記苦味受容体および前記Ｇタ ンパク質の両方を発現する細胞を単離することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。 【請求項１５２】 40 ａ．苦味受容体を安定して発現する細胞または細胞株を試験化合物に曝露すること；お よび ｂ．前記苦味受容体の機能における変化を検出すること を含む、苦味受容体機能の修飾因子を同定する方法。 【請求項１５３】 前記検出することが、細胞内遊離カルシウムを測定するアッセイを利用する、請求項１ ５２に記載の方法。 【請求項１５４】 前記細胞内遊離カルシウムが、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素、蛍光顕微鏡、お よび任意に蛍光プレートリーダーを用いて測定され、かつ少なくとも１つの蛍光色素が遊 50 (18) JP 2012-516687 A 2012.7.26 離カルシウムを結合する、請求項１５３に記載の方法。 【請求項１５５】 前記細胞内遊離カルシウムが、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素を用いてリアルタ イム撮像によってモニターされ、かつ少なくとも１つの蛍光色素が遊離カルシウムを結合 する、請求項１５３に記載の方法。 【請求項１５６】 前記細胞または前記細胞株における細胞が： ａ．真核細胞； ｂ．哺乳類細胞； ｃ．内在性苦味受容体をまったく発現しない細胞；または 10 ｄ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせ である、請求項１５２に記載の方法。 【請求項１５７】 前記細胞または前記細胞株における細胞が、ヒト胚性腎２９３Ｔ細胞である、請求項１ ５２に記載の方法。 【請求項１５８】 前記苦味受容体が： ａ．哺乳類であり； ｂ．ヒトであり； ｃ．前記苦味受容体のアミノ末端またはカルボキシル末端においてポリペプチドタグを 20 有さない；あるいは ｄ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合わせ である、請求項１５２に記載の方法。 【請求項１５９】 前記苦味受容体が、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５２ に記載の方法： ａ．配列番号７７∼１０１のうちの任意の１つ； ｂ．配列番号７７∼１０１のうちの任意の１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一 であるアミノ酸配列； ｃ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの逆向きの相補性配列を含む核酸とストリ 30 ンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列；お よび ｄ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの対立遺伝子変異体である核酸によってコ ードされるアミノ酸配列。 【請求項１６０】 前記苦味受容体が、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードさ れるアミノ酸配列を含む、請求項１５２に記載の方法： ａ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つ； ｂ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチ ド配列；および 40 ｃ．配列番号５１∼７５のうちの任意の１つの逆向きの相補性配列を含む核酸とストリ ンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸の配列；および ｄ．配列番号５１∼７５農地の任意の１つの対立遺伝子変異体である核酸の配列。 【請求項１６１】 前記細胞または細胞株が、イソプロテレノールと接触したときに細胞内遊離カルシウム の濃度における変化を有する、請求項１５２に記載の方法。 【請求項１６２】 前記イソプロテレノールが、前記細胞または細胞株を用いて導いた用量反応曲線におい て１ｎＭ∼２０ｎＭのＥＣ５０値を有する、請求項１６１に記載の方法。 【請求項１６３】 50 (19) JP 2012-516687 A 2012.7.26 前記試験化合物が苦味受容体阻害薬である、請求項１５２に記載の方法。 【請求項１６４】 前記細胞または細胞株を前記試験化合物に曝露する工程の前にまたは同時に、前記細胞 または細胞株を前記苦味受容体の公知のアゴニストに曝露することをさらに含む、請求項 １６３に記載の方法。 【請求項１６５】 前記試験化合物が苦味受容体アゴニストである、請求項１５２に記載の方法。 【請求項１６６】 前記細胞または細胞株を前記試験化合物に曝露する工程の前にまたは同時に、前記細胞 または細胞株を前記苦味受容体の公知の阻害薬に曝露することをさらに含む、請求項１６ 10 ５に記載の方法。 【請求項１６７】 前記試験化合物が、低分子、化学部分、ポリペプチド、抗体、または食品抽出物である 、請求項１５２に記載の方法。 【請求項１６８】 苦味受容体機能の調節因子を同定する方法であって： ａ．細胞株の回収物を異なる試験化合物のライブラリに曝露し、この中で、前記細胞株 の回収物は２つ以上の細胞株を含み、各細胞株は同じ苦味受容体またはその対立遺伝子変 異体を安定して発現し、かつこの中で各細胞株が前記ライブラリにおける１つ以上の試験 化合物に曝露されること；および 20 ｂ．核細胞株によって安定して発現される前記苦味受容体またはその対立遺伝子変異体 の機能における変化を検出すること を含む、前記方法。 【請求項１６９】 前記検出することが、細胞内遊離カルシウムを測定しまたはモニターするアッセイを利 用する、請求項１６８に記載の方法。 【請求項１７０】 前記細胞内遊離カルシウムが、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素、蛍光顕微鏡、お よび任意に蛍光プレートリーダーを用いて測定され、かつ少なくとも１つの蛍光色素が遊 離カルシウムを結合する、請求項１６９に記載の方法。 30 【請求項１７１】 前記細胞内遊離カルシウムが、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素を用いたリアルタ イム撮像によってモニターされ、かつ少なくとも１つの蛍光色素が遊離カルシウムを結合 する、請求項１６９に記載の方法。 【請求項１７２】 前記ライブラリが、低分子ライブラリ、組み合わせライブラリ、ペプチドライブラリ、 または抗体ライブラリである、請求項１６８に記載の方法。 【請求項１７３】 前記試験化合物が、低分子、化学部分、ポリペプチド、抗体、および食品抽出物からな る群から選択される、請求項１６８に記載の方法。 40 【請求項１７４】 工程（ａ）の前にまたは同時に細胞株の前記回収ｂつを公知の苦味受容体アゴニストま たは阻害薬に曝露することをさらに含む、請求項１６８に記載の方法。 【請求項１７５】 ａ．細胞株の回収物を試験化合物に曝露し、この中で細胞株の前記回収物が２つ以上の 細胞株を含み、各細胞株が異なる苦味受容体またはその対立遺伝子変異体を安定して発現 すること；および ｂ．各細胞株によって安定して発現した苦味受容体の機能における変化を検出すること を含む、苦味受容体機能の修飾因子を同定する方法。 【請求項１７６】 50 (20) JP 2012-516687 A 2012.7.26 前記検出することが、細胞内遊離カルシウムを測定しまたはモニターするアッセイを利 用する、請求項１７５に記載の方法。 【請求項１７７】 前記細胞内遊離カルシウムが、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素、蛍光顕微鏡、お よび任意に蛍光プレートリーダーを用いて測定され、かつこの中で少なくとも１つの蛍光 色素が遊離カルシウムを結合する、請求項１７６に記載の方法。 【請求項１７８】 前記細胞内遊離カルシウムが、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素を用いたりあるタ イム撮像によってモニターされ、この中で、少なくとも１つの蛍光色素が遊離カルシウム を結合する、請求項１７６に記載の方法。 10 【請求項１７９】 前記試験化合物が、低分子、化学部分、ポリペプチド、抗体、および食品抽出物からな る群から選択される、請求項１７５に記載の方法。 【請求項１８０】 工程（ａ）の前にまたは同時に細胞株の前記回収物を公知の苦味受容体アゴニストまた は阻害薬に曝露することをさらに含む、請求項１７５に記載の方法。 【請求項１８１】 経時的に一貫したレベルで苦味受容体を安定して発現するよう操作された細胞であって 、下記の工程を含む方法によって作製される前記細胞： ａ．前記苦味受容体をコードするｍＲＮＡを発現する複数の細胞を提供する工程； 20 ｂ．前記細胞を個々の培養容器へと個々に分散させ、それにより複数の個別の細胞培養 物を提供する工程； ｃ．１セットの所望の培養条件が、前記個別の細胞培養物の各々と実質的に同一である ことを特徴とする自動細胞培養方法を用いて、前記細胞を前記条件下で培養し、その培養 することの間に、個別の細胞培養物あたりの細胞数を標準化し、かつこの中で、前記個別 の培養物を同じスケジュールで経代する工程； ｄ．前記個別の細胞培養物をアッセイして、前記苦味受容体の発現を少なくとも２回測 定する工程；および ｅ．両アッセイにおいて一貫したレベルで前記苦味受容体を発現する個別の細胞培養物 を同定し、それにより該細胞を得る工程。 30 【請求項１８２】 クローン細胞株の組み合わせ対応したパネルであって、前記クローン細胞株が同じ種類 であり、かつ前記パネルにおける細胞株のうちの少なくとも２つが関心対象のマルチサブ ユニットタンパク質のサブユニットの異なる組み合わせを発現し；かつ前記パネルのクロ ーン細胞株が、同じ細胞培養条件下で並行して増殖するように対応している、前記パネル 。 【請求項１８３】 前記細胞株細胞が、初代細胞および不死化細胞からなる群から選択される、請求項１８ ２に記載のクローン細胞株の対応したパネル。 【請求項１８４】 40 前記クローン細胞株細胞が真核細胞であり、かつ真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、酵 母細胞、藻類、甲殻類細胞、節足動物、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、植物細胞、 ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、ラット、有袋類、マウス、イヌ、ヒツジ、ヤギ 、ウサギ、モルモットハムスターからなる群から選択される、請求項１８２に記載のクロ ーン細胞株の対応したパネル。 【請求項１８５】 前記細胞株における細胞が、関心対象のタンパク質を発現するよう操作されている、請 求項１８２に記載のクローン細胞株の対応したパネル。 【請求項１８６】 前記細胞株における細胞が、関心対象のタンパク質を、前記タンパク質をコードする導 50 (21) JP 2012-516687 A 2012.7.26 入された核酸から、または多量体タンパク質の場合に前記タンパク質のサブユニットをコ ードする発現する、請求項１８２に記載のクローン細胞株の対応したパネル。 【請求項１８７】 前記細胞が、内在性核酸から関心対象のタンパク質を発現し、かつ前記細胞が、前記内在 性タンパク質の転写を活性化するよう操作され、または多量体タンパク質の場合、前記タ ンパク質のサブユニットの転写を活性化する、請求項１８２に記載のクローン細胞株の対 応したパネル。 【請求項１８８】 前記パネルが、少なくとも４の、少なくとも６の、少なくとも２０のクローン細胞株を 含む、請求項１８２に記載のクローン細胞株の対応したパネル。 10 【請求項１８９】 前記マルチサブユニットタンパク質が、イオンチャネル、イオンチャネル、Ｇタンパク 質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイ ドホルモン受容体、抗体、生物学的および免疫学的受容体からなる群から選択される、請 求項１８２に記載のクローン細胞株の対応したパネル。 【請求項１９０】 関心対象の少なくとも１つのＲＮＡを発現する細胞であって、この中で、関心対象の該 ＲＮＡが、導入された核酸によってコードされ、前記細胞が、生物学的に活性となるまた はなることのできる形態で関心対象のＲＮＡを産生することを特徴とし、この中で、前記 細胞が、選択的圧力の不在下で培養され、かつこの中で、前記ＲＮＡの発現が３ヶ月間に 20 わたって３０％超変動しない、前記細胞。 【請求項１９１】 前記ＲＮＡの発現が、６ヶ月間にわたって３０％超変動しない、請求項１９０に記載の 細胞。 【請求項１９２】 関心対象の少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞であって、関心対象の該タンパ ク質が、導入された核酸によってコードされ、前記細胞が、生物学的に活性となるまたは なることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生することを特徴とし、前記細胞が選 択的圧力の不在下で培養され、かつ前記タンパク質の発現が３ヶ月間にわたって３０％超 変動しない、前記細胞。 30 【請求項１９３】 前記タンパク質の発現が６ヶ月間にわたって３０％超変動しない、請求項１９２に記載 の細胞。 【請求項１９４】 関心対象の少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞であって、関心対象の前記タン パク質が公知のリガンドを有さず、または関心対象の該タンパク質の機能的発現を検出す るための公知のアッセイがなく；かつ関心対象の該タンパク質がタンパク質タグを含まな い、前記細胞。 【請求項１９５】 関心対象の少なくとも１つのタンパク質を、関心対象の前記少なくとも１つのタンパク 40 質をコードする導入された核酸から発現する細胞であって、この中で、関心対象の前記少 なくとも１つのタンパク質が、細胞の生理学的特性を変化させ、かつこの中で前記細胞の 生理学的特性が、一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわたって２５％超変動しない、前記 細胞。 【請求項１９６】 関心対象のタンパク質を発現する細胞であって、この中で、前記細胞が、関心対象の前 記タンパク質をコードする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、この中で、関心 対象の前記タンパク質が前記細胞の生理学的特性を変化させ、かつこの中で、前記細胞の 生理学的特性が一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわたって２５％超変動しない、前記細 胞。 50 (22) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項１９７】 関心対象のＲＮＡを発現する細胞であって、この中で、関心対象の前記ＲＮＡが、導入 された核酸によってコードされ、この中で、関心対象の前記少なくとも１つのＲＮＡが前 記細胞の生理学的特性を変化させ、かつこの中で前記細胞の生理学的特性が、一定の細胞 培養条件下で３ヶ月間にわたって２５％超変動しない、前記細胞。 【請求項１９８】 関心対象の少なくとも１つのタンパク質を関心対象の前記少なくとも１つのタンパク質 をコードする導入された核酸から発現する細胞であって、該細胞が、生物学的に活性とな るまたはなることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生することを特徴とし、かつ この中で、前記細胞が１個あたり１日あたり少なくとも５００、２、５００、５、０００ 10 、または１００、０００ピコグラムのタンパク質を一貫してかつ再生可能に発現する、前 記細胞。 【請求項１９９】 関心対象のタンパク質を発現する細胞であって、前記細胞が関心対象のタンパク質をコ ードする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞が、生物学的に活性となる またはなることのできる形態で、関心対象のタンパク質を産生することを特徴とし、かつ この中で、前記細胞が、１個あたり１日あたり少なくとも５００、２、５００、５、００ ０、または１００、０００ピコグラムのタンパク質を一貫してかつ再生可能に発現する、 前記細胞。 【請求項２００】 20 １週間未満、２週間未満、３週間未満、４週間未満、１ヶ月未満、２ヶ月未満、３ヶ月 未満、４ヶ月未満、５ヶ月未満、６ヶ月未満、７ヶ月未満、８ヶ月未満、または９ヶ月未 満から選択される期間で作製される、請求項１９５∼１９９のいずれか一項に記載の細胞 。 【請求項２０１】 関心対象の少なくとも１つのタンパク質を、関心対象の前記少なくとも１つのタンパク 質をコードする導入された核酸から発現する細胞であって、生物学的に活性となるまたは なることのできる関心対象の該タンパク質を産生することを特徴とし、７ヶ月未満、８ヶ 月未満、または９ヶ月未満から選択される期間で作製され、かつ少なくとも０．５、１． ０、５．０、または１０ｇ／Ｌのタンパク質を一貫しかつ再生可能に発現する、前記細胞 30 。 【請求項２０２】 関心対象のタンパク質を発現する細胞であって、関心対象の前記タンパク質をコードす る内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、生物学的に活性となるまたはなることの できる形態で関心対象の前記タンパク質を産生することを特徴とし、７ヶ月未満、８ヶ月 未満、または９ヶ月未満から選択される期間で作製され、かつ少なくとも０．５、１．０ 、５．０、または１０ｇ／Ｌのタンパク質を一貫しかつ再生可能に発現する、前記細胞。 【請求項２０３】 ３ヶ月未満、４ヶ月未満、または６ヶ月未満から選択される期間で作製される、請求項 ２０１または２０２に記載の細胞。 40 【請求項２０４】 前記タンパク質が単量体タンパク質である、請求項１９５∼２０３のいずれか一項に記 載の細胞。 【請求項２０５】 前記タンパク質が多量体タンパク質である、請求項１９５∼２０３のいずれか一項に記 載の細胞。 【請求項２０６】 請求項１９５∼２０３のいずれか一項に記載の細胞であって、関心対象の前記タンパク 質がタンパク質タグを含まず、または該細胞が選択的圧力の不在下で培養され、またはそ れらの組み合わせである、前記細胞。 50 (23) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項２０７】 関心対象の前記多量体タンパク質が、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブユ ニットを含む、請求項２０５に記載の細胞。 【請求項２０８】 関心対象の前記多量体タンパク質が、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰ ＣＲ）、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体、 抗体、生物学的および免疫学的受容体からなる群から選択される、請求項２０５に記載の 細胞。 【請求項２０９】 関心対象の前記多量体タンパク質がイオンチャネルであり、かつ前記細胞の生物学的特 10 性が、膜電位、小胞体ストレス応答、細胞生存率、改善されたタンパク質産生についての 能力、産生量、折りたたみアセンブリ、分泌、細胞膜への組み込み、翻訳後修飾、グリコ シル化、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２０８に記載の細胞。 【請求項２１０】 請求項１９５∼２０９のいずれか一項に記載の細胞から作製される細胞株。 【請求項２１１】 下記の工程を含む関心対象のタンパク質の修飾因子を同定するための方法： ａ．請求項１９５∼２１０のいずれか一項に記載の細胞を試験化合物と接触させる工程 ；および ｂ．試験化合物によって接触されていない細胞における前記タンパク質の活性と比較し 20 て、試験化合物と接触された前記細胞における関心対象の前記タンパク質の活性における 変化を検出し；この中で、不在下と比較して存在下での活性における差異を生じる化合物 が、関心対象の前記タンパク質の修飾因子である工程。 【請求項２１２】 請求項１９５∼２０９に記載の少なくとも２つの細胞または請求項２１０に記載の２つ のクローン細胞株を含む細胞またはクローン細胞株の対応したパネルであって、この中で 、前記少なくとも２つの細胞または前記少なくとも２つのクローン細胞株が、並行して同 じ細胞培養条件下で増殖するよう対応している、前記パネル。 【請求項２１３】 請求項２１２に記載の対応したパネルであって、前記対応したパネルが、請求項１９５ 30 ∼２０９に記載の少なくとも１０個の細胞または請求項２１０に記載の１０個のクローン 細胞株を含み、かつ前記少なくとも１０個の細胞または１０個のクローン細胞株が、並行 して同じ細胞培養条件下で増殖するよう対応している、前記パネル。 【請求項２１４】 請求項２１３に記載の対応したパネルであって、前記パネルが、請求項１９５∼２０９ に記載の少なくとも１００個の細胞または請求項２１０に記載の少なくとも１００個の細 胞を含み、かつ前記少なくとも１００個の細胞または前記少なくとも１００個のクローン 細胞株が並行して同じ細胞培養条件下で増殖する、前記パネル。 【請求項２１５】 クローン細胞株の対応したパネルであって、この中で、前記クローン細胞株が同じ種類 40 であり、かつ関心対象の第一および第二のタンパク質を含み；この中で、関心対象の前記 第一のタンパク質が核クローン細胞株において同じであり；この中で、関心対象の前記第 二のタンパク質が機能的生物学的経路の構成要素であり；かつこの中で： ａ．前記パネルが少なくとも５つの細胞株を含み； ｂ．前記パネルが、６ヶ月未満で作製され； ｃ．関心対象の前記第一および第二のタンパク質が、タンパク質タグを有さず； ｄ．前記クローン細胞株が、選択的圧力の不在下で培養され；または ｅ．ａ）∼ｄ）の任意の組み合わせ である、前記パネル。 【請求項２１６】 50 (24) JP 2012-516687 A 2012.7.26 請求項２１５に記載の対応したパネルであって、関心対象の前記第一のタンパク質が抗 体であり、かつ前記機能的生物学的経路がグリコシル化経路である、前記パネル。 【請求項２１７】 インビボでの生物学的特性に対してインビトロでの相関物を生じるための方法であって 、下記を含む方法： ａ．前記生物学的特性を有する化合物または複数の化合物を、関心対象の第一のタンパ ク質を発現する第一の細胞と接触させること； ｂ．機能的アッセイにおいて第一のタンパク質に影響を及ぼす化合物または複数の化合 物の効果をアッセイすること； ｃ．化合物または複数の化合物を関心対象の第二のタンパク質を発現する第二の細胞と 10 接触させること； ｄ．機能的アッセイにおいて第二のタンパク質に及ぼす前記化合物または複数の化合物 の効果をアッセイすること； この中で、前記第一および第二のタンパク質は独立して、ｉ）タンパク質タグを含まず 、ｉｉ）前記細胞が前記機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよ う機能的アッセイにおいて使用するのに適した形態で一貫してかつ再生可能に産生され、 ｉｉｉ）選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、ｉｖ）前記細胞の生理学 的特性を変化させ、かつこの中で、前記細胞の生物学的特性が一定の細胞培養条件下で３ ヶ月間にわたって２５％超変動せず；ｖ）選択的圧力の不在下で培養した細胞において安 定して発現し、かつこの中で、前記タンパク質の発現が３ヶ月間にわたって３０％超変動 20 せず、ｖｉ）別のタンパク質をさらに発現する細胞において発現し、かつ該細胞が選択的 圧力の不在下で培養され、またはｖｉｉ）それらの任意の組み合わせであり；かつ この中で、工程ａ）∼ｄ）において得られた特性が、前記インビボでの生理学的特性に 対してインビトロでの相関物を提供する。 【請求項２１８】 請求項２１７に記載の方法であって、関心対象の前記第一および第二のタンパク質が、 単量体タンパク質または多量体タンパク質から独立して選択される、前記方法。 【請求項２１９】 前記多量体タンパク質が、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブユニットを含 む、請求項２１８に記載の方法。 30 【請求項２２０】 前記多量体タンパク質がヘテロ多量体タンパク質である、請求項２１９に記載の方法。 【請求項２２１】 請求項２１７∼２１９のいずれか一項に記載の方法であって、この中で： ａ．前記第一の細胞および前記第二の細胞が、少なくとも１つの他の細胞をさらに含む 細胞のパネル内の細胞であり； ｂ．細胞の前記パネルにおける各細胞が異なるタンパク質を発現するよう操作され、か つ化合物または複数の化合物によって接触し； ｃ．細胞の前記パネルにおける各細胞において発現した各タンパク質に及ぼす前記化合 物または複数の化合物の効果が、機能的アッセイにおいてアッセイされ；かつ 40 ｄ．各細胞における前記化合物または複数の化合物の活性特性を用いて、前記生理学的 特性に対して前記インビトロでの相関物を生じる、前記方法。 【請求項２２２】 各タンパク質が、単量体タンパク質または多量体タンパク質から独立して選択される、 請求項２２１に記載の方法。 【請求項２２３】 前記多量体タンパク質が、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブユニットを含 む、請求項２２２に記載の方法。 【請求項２２４】 前記多量体タンパク質がヘテロ多量体タンパク質である、請求項２２３に記載の方法。 50 (25) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項２２５】 下記を含む試験化合物の生理学的特性を推定するための方法： ａ．前記試験化合物または複数の試験化合物を請求項２１７∼２２０に記載の関心対象 の第一のタンパク質を発現する第一の細胞と接触させること； ｂ．機能的アッセイにおいて前記第一のタンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数 の試験化合物の効果をアッセイすること； ｃ．前記試験化合物または複数の試験化合物を請求項２１７∼２２０に記載の関心対象 の第二のタンパク質を発現する第二の細胞と接触させること； ｄ．機能的アッセイにおいて前記第二のタンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数 の試験化合物の効果をアッセイすること； 10 ｅ．工程ａ）∼ｄ）において得られた前記化合物の活性特性を、請求項２１７に記載の 方法によって生じたインビトロでの相関物と比較すること、 この中で、前記第一および第二のタンパク質は独立して、ｉ）タンパク質タグを含まず 、ｉｉ）前記細胞が、前記機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有する よう機能的アッセイにおいて使用するのに適した形態で一貫しかつ再生可能に産生され、 ｉｉｉ）選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、ｉｖ）前記細胞の生理学 的特性を変化させ、かつこの中で、前記細胞の生理学的特性が、一定の細胞培養条件下で ３ヶ月間にわたって２５％超変動せず；ｖ）選択的圧力の不在下で培養された細胞におい て安定して発現し、かつこの中で、前記タンパク質の発現が、３ヶ月間にわたって３０％ 超変動せず、ｖｉ）別のタンパク質をさらに発現する細胞において発現しかつ該細胞が選 20 択的圧力の不在下で培養され、またはｖｉｉ）それらの任意の組み合わせであり；かつ この中で、前記試験化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）または化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ） の活性特性および前記インビトロでの相関物の活性特性が少なくとも９０％同一である場 合、前記試験化合物または複数の試験化合物が、前記インビトロでの相関物の生理学的特 性を有すると推定される。 【請求項２２６】 下記を含む、試験化合物または複数の試験化合物の生理学的特性を確認するための方法 ： ａ．前記試験化合物または複数の試験化合物を、請求項２１７に記載の関心対象の第一 のタンパク質を発現する第一の細胞と接触させること； 30 ｂ．前記第一のタンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数の試験化合物の効果を機 能的アッセイにおいてアッセイすること； ｃ．前記試験化合物または複数の試験化合物を請求項２１７に記載の関心対象の第二の タンパク質を発現する第二の細胞と接触させること； ｄ．前記第二のタンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数の試験化合物の効果を機 能的アッセイにおいてアッセイすること； ｅ．工程ａ）∼ｄ）において得られた前記試験化合物または複数の試験化合物の活性特 性を、請求項２１７に記載の方法によって生じた生理学的特性に対するインビトロでの相 関物と比較すること、 この中で、前記第一および第二のタンパク質が独立して、ｉ）タンパク質タグを含まず 40 、ｉｉ）前記細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう、 前記機能的アッセイにおいて使用するのに適した形態で一貫しかつ再生可能に産生され、 ｉｉｉ）選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、ｉｖ）前記細胞の生理学 的特性を変化させ、かつこの中で、前記細胞の生理学的特性が、一定の細胞培養条件下で ３ヶ月間にわたって２５％超変動せず；ｖ）選択的圧力の不在下で培養された細胞におい て安定して発現し、かつこの中で、前記タンパク質の発現が３ヶ月間にわたって３０％超 変動せず、ｖｉ）別のタンパク質をさらに発現する細胞において発現し、かつ該細胞が選 択的圧力の不在下で培養され、またはｖｉｉ）それらの任意の組み合わせであり；かつ この中で、前記化合物または複数の試験化合物の活性特性および前記インビトロでの相 関物の活性特性が少なくとも９０％同一である場合、前記化合物が前記生理学的特性を有 50 (26) JP 2012-516687 A 2012.7.26 すると確認される。 【請求項２２７】 該第一および第二のタンパク質が、単量体タンパク質または多量体タンパク質から独立 して選択される、請求項２２５∼２２６のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２２８】 前記多量体タンパク質が、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブユニットを含 む、請求項２２７に記載の方法。 【請求項２２９】 前記多量体タンパク質がヘテロ多量体タンパク質である、請求項２２８に記載の方法。 【請求項２３０】 10 ａ．前記第一の細胞および前記第二の細胞が、少なくとも１つの他の細胞をさらに含む 細胞のパネル内の細胞であり； ｂ．細胞の前記パネルにおける各細胞が操作されて異なるタンパク質を発現し、かつ前 記試験化合物または複数の試験化合物によって接触され； ｃ．細胞の前記パネルにおける各細胞において発現した関心対象の各タンパク質に及ぼ す前記試験化合物または複数の試験化合物の効果が機能的アッセイにおいてアッセイされ ；かつ ｄ．各細胞における前記試験化合物または複数の試験化合物の活性特性を用いて、前記 インビトロでの相関物の特性と比較する、 請求項２２５∼２２９のいずれか一項に記載の方法。 20 【請求項２３１】 各タンパク質が独立して、単量体タンパク質または多量体タンパク質から選択される、 請求項２３０に記載の方法。 【請求項２３２】 前記多量体タンパク質が、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブユニットを含 む、請求項２３１に記載の方法。 【請求項２３３】 前記多量体タンパク質がヘテロ多量体タンパク質である、請求項２３２に記載の方法。 【請求項２３４】 関心対象の前記第一の多量体タンパク質および関心対象の前記第二の多量体タンパク質 30 のうちの少なくとも１つが、ヘテロマータンパク質である、請求項２１７、２２１、２２ ５、２２６または２３０のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２３５】 関心対象の前記第一のタンパク質および関心対象の前記第二のタンパク質のうちの少な くとも１つが二量体タンパク質である、請求項２１７、２２１、２２５、２２６、または ２３０のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２３６】 関心対象の前記第一のタンパク質および関心対象の前記第二のタンパク質のうちの少な くとも１つが三量体タンパク質である、請求項２１７、２２１、２２５、２２６、または ２３０のいずれか一項に記載の方法。 40 【請求項２３７】 関心対象の前記第一のタンパク質および関心対象の前記第二のタンパク質が、異なる形 態の多量体タンパク質である、請求項２１７、２２１、２２５、２２６、または２３０の いずれか一項に記載の方法。 【請求項２３８】 前記多量体タンパク質がＧＡＢＡ Ａ受容体である、請求項２３７に記載の方法。 【請求項２３９】 関心対象の該第一または第二のタンパク質のうちの少なくとも１つが、機能的生物学的 経路の一部である、請求項２１７、２２１、２２５、２２６、または２３０のいずれか一 項に記載の方法。 50 (27) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項２４０】 前記機能的生物学的経路が、グリコシル化、タンパク質合成、小胞体ストレス応答、小 胞体、リボソーム、ミトコンドリア活性、ＲＮＡ合成、翻訳後修飾、細胞シグナル伝達、 細胞増殖、および細胞死からなる群から選択される、請求項２３９のいずれか一項に記載 の方法。 【請求項２４１】 前記生理学的特性が治療効果である、請求項２１７、２２１、２２５、２２６、または ２３０のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２４２】 前記生理学的特性が有害な効果である、請求項２１７、２２１、２２５、２２６、また 10 は２３０のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２４３】 前記生理学的特性に及ぼす前記化合物または複数の化合物の効果がハイスループットス クリーニングによってアッセイされる、請求項２１７、２２１、２２５、２２６、または ２３０のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２４４】 工程ｅ）が、コンピュータシステムにおいて実行される、請求項２１７、２２１、２２ ５、２２６、または２３０のいずれか一項に記載の方法。 【請求項２４５】 下記を含む、試験化合物または複数の試験化合物の生理学的特性を決定するためのコン 20 ピュータにより実行される方法： ａ．該試験化合物または複数の試験化合物の第一の活性特性を受信し、この中で、該第 一の活性特性が、請求項２１７または２２１に記載の方法によって生じ、かつこの中で、 該第一の活性特性が、該試験化合物または複数の試験化合物の生理学的特性に対してイン ビトロでの相関物を提供すること； ｂ．該第一の活性特性を、データベースに保存された複数の目印活性特性と比較して、 該複数の目印活性特性における該第一の活性特性および各該目印活性特性の間の類似性の 測定結果を決定し、この中で、各該目印活性特性が、個々の公知の化合物または複数の公 知の化合物の公知の生理学的特性に対してインビトロの相関物を提供すること； ｃ．工程（ｂ）において決定された類似性の測定結果に基づいた該第一の活性特性と最 30 も類似の１つ以上の目印活性特性を決定すること；および ｄ．該試験化合物または複数の試験化合物の生理学的特性として、工程（ｃ）における 該第一の活性特性と最も類似していると決定された１つ以上の目印活性特性と関連した前 記公知の生理学的特性を同定すること； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【請求項２４６】 類似性の該測定結果が、あらかじめ決めておいた閾値を上回る場合、該１つ以上の目印 活性特性が、該第一の活性特性と最も類似している、請求項２４５に記載の方法。 【請求項２４７】 40 試験化合物または複数の試験化合物が特定の生理学的特性と関連していることを特徴づ けるための、コンピュータにより実行される方法であって、下記を含む方法： ａ．該試験化合物または複数の試験化合物の第一の活性特性を受信し、この中で、該第 一の活性特性が請求項２１７または２２１に記載の方法によって生じ、かつこの中で、該 第一の活性特性が、該試験化合物または複数の化合物の生理学的特性に対してインビトロ での相関物を提供すること； ｂ．複数が、該第一の活性特性および複数の目印活性特性を含む複数の活性特性をクラ スター化し、この中で、各該目印活性特性が、個々の公知の化合物または複数の公知の化 合物に関する公知の生理学的特性についてのインビトロでの相関物を提供すること； ｃ．該第一の活性特性を用いてクラスター化する該複数の目印活性特性における１つ以 50 (28) JP 2012-516687 A 2012.7.26 上の目印活性特性を同定すること；および ｄ．工程（ｃ）における該第一の活性特性を用いてクラスター化されたものとして同定 される１つ以上の目印活性特性に対応する前記個々の公知の化合物または複数の公知の化 合物の外公知の生理学的特性と関連しているものとして前記試験化合物または複数の試験 化合物を特徴づけること； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）が、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【請求項２４８】 試験化合物または複数の試験化合物を、分類指標を用いて生理学的特性に分類するコン ピュータにより実行される方法であって、下記を含む方法； 10 ａ．データベースに保存された複数の目印活性特性を用いて、試験化合物または複数の 試験化合物を薬理学的特性に分類するために分類指標をトレーニングし、この中で、各該 目印活性特性が、個々の公知の化合物または複数の公知の化合物に関する公知の生理学的 特性に対してインビトロでの相関物を提供すること；および ｂ．請求項２１７または２２１に記載の方法によって生じた第一の活性特性を、該分類 指標を用いて処理し、該試験化合物または複数の試験化合物を生理学的特性に分類するこ と； この中で、工程（ａ）および（ｂ）が、適切にプログラムされたコンピュータにおいて 実行される。 【請求項２４９】 20 試験化合物または複数の試験化合物を生理学的特性に分類指標を用いて分類するコンピ ュータにより実行される方法であって、下記を含む方法： ａ．データベースに保存された複数の目印活性特性を用いて、前記化合物または複数の 化合物を薬理学的特性に分類するために分類指標をトレーニングし、この中で、各該目印 活性特性は、個々の化合物の公知のインビボでの薬理学的特性に対してインビトロでの相 関物を提供すること；および ｂ．該分類指標を用いて、請求項２１７または２２１に記載の方法によって生じた第一 の活性特性を処理して、該試験化合物または複数の試験化合物を前記生理学的特性に分類 し、この中で、該分類指標は下記を含む方法に従ってトレーニングされ： この中で、工程（ａ）および（ｂ）は適切にプログラムされたコンピュータにおいて実 30 行される。 【請求項２５０】 細胞における関心対象の多量体タンパク質の活性のあるサブユニットの組み合わせを特 徴づけるための方法であって、下記を含む前記方法： ａ．関心対象の前記多量体タンパク質の第一のサブユニットを発現する第一の細胞を、 試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； ｂ．関心対象の前記多量体タンパク質の第二のサブユニットを発現する第二の細胞を、 前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； ｃ．関心対象の前記多量体タンパク質の第一のサブユニットおよび第二のサブユニット を発現する第三の細胞を、前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； 40 ｄ．前記多量体タンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数の試験化合物の効果を、 機能的アッセイにおいて前記多量体タンパク質が前記第一の細胞、前記第二の細胞、およ び前記第三の細胞において発現するであろう場合にアッセイすること； ｅ．前記第一および／または第二のサブユニットが、前記生物学的に活性のある多量体 タンパク質の一部であるかどうかを推定すること、ならびに この中で、工程ａ）∼ｄ）において得られた特性が、前記インビボでの生理学的特性に 対してインビトロでの相関物を提供し、 およびこの中で、前記多量体タンパク質の前記第一および第二のサブユニットが独立し て、タンパク質タグを含まず、選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、ま たはそれらの任意の組み合わせである。 50 (29) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項２５１】 関心対象の前記多量体タンパク質がヘテロ二量体である、請求項２５０に記載の方法。 【請求項２５２】 関心対象の前記多量体タンパク質がヘテロ三量体である、請求項２５０に記載の方法。 【請求項２５３】 細胞における関心対象の多量体タンパク質の活性のあるサブユニットの組み合わせを特 徴づけるための方法であって、下記を含む前記方法： ａ．関心対象の前記多量体タンパク質の第一のサブユニットを発現する第一の細胞を、 前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； ｂ．関心対象の前記多量体タンパク質の第二のサブユニットを発現する第二の細胞を、 10 前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； ｃ．関心対象の前記多量体タンパク質の第三のサブユニットを発現する第三の細胞を、 前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； ｄ．関心対象の前記多量体タンパク質の第一のサブユニット、第二および第三のサブユ ニットを発現する第四の細胞を、前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させるこ と； ｅ．前記多量体タンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数の試験化合物の効果を、 前記多量体タンパク質が機能的アッセイにおいて前記第一の細胞、前記第二の細胞、前記 第三の細胞、および第四の細胞において発現するであろう場合に、前記多量体タンパク質 に及ぼす前記試験化合物または複数の試験化合物の効果をアッセイすること； 20 ｆ．前記第一、第二、および／または第三のサブユニットが、生物学的に活性のある多 量体タンパク質の一部であるかどうかを推定すること； この中で、前記多量体タンパク質の前記第一、第二、および第三のサブユニットが独立 して、タンパク質タグを含まず、選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、 またはそれらの任意の組み合わせである。 【請求項２５４】 前記多量体タンパク質がヘテロ三量体である、請求項２５３に記載の方法。 【請求項２５５】 前記多量体タンパク質がＧＡＢＡ Ａ受容体である、請求項２５０に記載の方法。 【請求項２５６】 30 細胞のパネルであって、この中で前記パネルが、第一の細胞および第二の細胞を含み、 この中で前記第一の細胞および前記第二の細胞が、関心対象の多量体タンパク質の同じサ ブユニットを発現するよう操作されており、この中で、前記第一の細胞における関心対象 の前記多量体タンパク質の生理学的特性が、前記第二の細胞における前記多量体タンパク 質の生理学的特性とは異なっており、かつこの中で、前記第一の細胞および前記第二の細 胞が、同じ宿主細胞株から生じ； この中で、関心対象の前記多量体タンパク質のサブユニットが、タンパク質タグを含ま ず、選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、またはそれらの任意の組み合 わせである、前記パネル。 【請求項２５７】 40 クローン細胞株のパネルであって、この中で、各細胞株が関心対象の多量体タンパク質 の同じサブユニットを発現するよう操作されており、かつこの中で、各細胞株における前 記多量体タンパク質の生理学的特性が、前記パネルの他の細胞株における関心対象の前記 多量体タンパク質の生理学的特性とは異なっており、かつこの中で、細胞株の前記パネル における前記細胞株が、同じ宿主細胞株から生じ； この中で、関心対象の前記多量体タンパク質の前記サブユニットが、タンパク質タグを 含まず、選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、またはそれらの任意の組 み合わせである、前記パネル。 【請求項２５８】 前記パネルが２個の細胞株を含む、請求項２５７に記載のパネル。 50 (30) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項２５９】 前記パネルが５個の細胞株を含む、請求項２５７に記載のパネル。 【請求項２６０】 前記パネルが１０個の細胞株を含む、請求項２５７に記載のパネル。 【請求項２６１】 関心対象の前記多量体タンパク質がＮａＶである、請求項２５７に記載のパネル。 【請求項２６２】 機能的生物学的経路のすべての構成要素タンパク質を発現するよう操作された細胞。 【請求項２６３】 前記経路が、少なくとも５個のタンパク質構成要素を有する、請求項２６２に記載の細 10 胞。 【請求項２６４】 前記細胞が、選択的圧力の不在下で培養された、請求項２６２に記載の細胞。 【請求項２６５】 前記生物学的経路の構成要素タンパク質が、タンパク質タグを含まない、請求項２６２ に記載の細胞。 【請求項２６６】 複数のクローン細胞株を含むクローン細胞株のパネルであって、前記複数のクローン細 胞株の各クローン細胞株が、異なる嗅覚受容体を発現するよう操作されており；この中で 、前記嗅覚受容体がタンパク質タグを含まず、または前記嗅覚受容体が、前記細胞が機能 20 的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう前記機能的アッセイにおい て使用するのに適した形態で一貫しかつ再生可能に作製され、または前記クローン細胞が 、選択的圧力の不在下で培養され、またはそれらの任意の組み合わせである、前記パネル 。 【請求項２６７】 前記複数のクローン細胞株が少なくとも１０個の細胞株を含む、請求項２６６に記載の パネル。 【請求項２６８】 前記異なる嗅覚受容体が、ヒト嗅覚受容体または昆虫嗅覚受容体である、請求項２６６ に記載のパネル。 30 【請求項２６９】 前記異なるヒト嗅覚受容体が、ＯＲ１０Ａ１、ＯＲ１０Ａ３、ＯＲ１０Ａ４、ＯＲ１０ Ａ５、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ１０Ａ７、ＯＲ１０Ｃ１、ＯＲ１０Ｃ２、ＯＲ１０Ｄ４、ＯＲ １０Ｇ２、ＯＲ１０Ｇ３、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、ＯＲ１０Ｇ８、ＯＲ１０Ｇ９、 ＯＲ１０Ｈ１、ＯＲ１０Ｈ２、ＯＲ１０Ｈ３、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｊ １、ＯＲ１０Ｊ３、ＯＲ１０Ｊ５、ＯＲ１０Ｊ６、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ１０Ｋ２、ＯＲ１ ０Ｑ１、ＯＲ１０Ｒ２、ＯＲ１０Ｓ１、ＯＲ１０Ｔ２、ＯＲ１０Ｖ１、ＯＲ１０Ｚ１、Ｏ Ｒ１１Ａ１、ＯＲ１１Ｇ２、ＯＲ１１Ｈ１、ＯＲ１１Ｈ４、ＯＲ１１Ｈ６、ＯＲ１１Ｈ７ Ｐ、ＯＲ１１Ｌ１、ＯＲ１２Ｄ３、ＯＲ１３Ａ１、ＯＲ１３Ｃ２、ＯＲ１３Ｃ３、ＯＲ１ ３Ｃ４、ＯＲ１３Ｃ５、ＯＲ１３Ｃ７、ＯＲ１３Ｃ８、ＯＲ１３Ｃ９、ＯＲ１３Ｄ１、Ｏ 40 Ｒ１３Ｅ２、ＯＲ１３Ｆ１、ＯＲ１３Ｇ１、ＯＲ１３Ｈ１、ＯＲ１３Ｊ１、ＯＲ１４Ａ１ ６、ＯＲ１４Ａ２、ＯＲ１４Ｃ３６、ＯＲ１４Ｊ１、ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ａ２、ＯＲ１Ａ ２、ＯＲ１Ｂ１、ＯＲ１Ｃ１、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ１Ｄ４、ＯＲ１Ｄ５、ＯＲ１Ｅ１、ＯＲ １Ｅ２、ＯＲ１Ｅ２、ＯＲ１Ｅ５、ＯＲ１Ｅ５、ＯＲ１Ｅ６、ＯＲ１Ｅ７、ＯＲ１Ｆ１、 ＯＲ１Ｆ１０、ＯＲ１Ｆ１１、ＯＲ１Ｆ１２、ＯＲ１Ｆ２、ＯＲ１Ｇ１、ＯＲ１１１、Ｏ Ｒ１Ｊ１、ＯＲ１Ｊ２、ＯＲ１Ｊ２、ＯＲ１Ｊ４、ＯＲ１Ｊ５、ＯＲ１Ｋ１、ＯＲ１Ｌ１ 、ＯＲ１Ｌ３、ＯＲ１Ｌ４、ＯＲ１Ｌ６、ＯＲ１Ｌ８、ＯＲ１Ｍ１、ＯＲ１Ｍ１、ＯＲ１ Ｎ１、ＯＲ１Ｎ２、ＯＲ１Ｎ３、ＯＲ１Ｑ１、ＯＲ１Ｓ１、ＯＲ１Ｓ２、ＯＲ２Ａ１、Ｏ Ｒ２Ａ１０、ＯＲ２Ａ１９、ＯＲ２Ａ２０、ＯＲ２Ａ２１、ＯＲ２Ａ４、ＯＲ２Ａ４２、 ＯＲ２Ａ５、ＯＲ２Ａ６、ＯＲ２Ａ７、ＯＲ２ＡＥ１、ＯＲ２ＡＪ１、ＯＲ２ＡＫ２、Ｏ 50 (31) JP 2012-516687 A 2012.7.26 Ｒ２Ｂ１、ＯＲ２Ｂ２、ＯＲ２Ｂ３、ＯＲ２Ｂ６、ＯＲ２Ｂ９、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｄ１ 、ＯＲ２Ｄ２、ＯＲ２Ｄ３、ＯＲ２Ｆ１、ＯＲ２Ｆ２、ＯＲ２Ｆ３、ＯＲ２Ｇ２、ＯＲ２ Ｇ３、ＯＲ２Ｈ１、ＯＲ２Ｈ２、ＯＲ２Ｈ３、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｋ１、Ｏ Ｒ２Ｋ２、ＯＲ２Ｌ１、ＯＲ２Ｌ２、ＯＲ２Ｌ３、ＯＲ２Ｌ５、ＯＲ２Ｌ８、ＯＲ２Ｍ１ 、ＯＲ２Ｍ２、ＯＲ２Ｍ４、ＯＲ２Ｓ２、ＯＲ２Ｔ１、ＯＲ２Ｔ３、ＯＲ２Ｔ４、ＯＲ２ Ｔ５、ＯＲ２Ｔ６、ＯＲ２Ｔ７、ＯＲ２Ｔ８、ＯＲ２Ｖ１、ＯＲ２Ｖ２、ＯＲ２Ｖ３、Ｏ Ｒ２Ｗ１、ＯＲ２Ｗ３、ＯＲ２Ｙ１、ＯＲ２Ｚ１、ＯＲ３Ａ１、ＯＲ３Ａ２、ＯＲ３Ａ３ 、ＯＲ３Ａ４、ＯＲ４Ａ１５、ＯＲ４Ａ１６、ＯＲ４Ａ４、ＯＲ４Ａ５、ＯＲ４Ｂ１、Ｏ Ｒ４Ｃ１２、ＯＲ４Ｃ１３、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ４Ｃ１６、ＯＲ４Ｃ３、ＯＲ４Ｃ６、Ｏ Ｒ４Ｄ１、ＯＲ４Ｄ２、ＯＲ４Ｄ５、ＯＲ４Ｄ６、ＯＲ４Ｄ９、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ４Ｆ１ 10 ０、ＯＲ４Ｆ１５、ＯＲ４Ｆ１６、ＯＲ４Ｆ１６、ＯＲ４Ｆ１７、ＯＲ４Ｆ１８、ＯＲ４ Ｆ１９、ＯＲ４Ｆ３、ＯＲ４Ｆ６、ＯＲ４Ｋ１、ＯＲ４Ｋ１３、ＯＲ４Ｋ１４、ＯＲ４Ｋ １５、ＯＲ４Ｋ１７、ＯＲ４Ｋ２、ＯＲ４Ｋ３、ＯＲ４Ｋ５、ＯＲ４Ｌ１、ＯＲ４Ｍ１、 ＯＲ４Ｍ２、ＯＲ４Ｎ２、ＯＲ４Ｎ４、ＯＲ４Ｎ５、ＯＲ４Ｐ４、ＯＲ４Ｑ３、ＯＲ４Ｓ １、ＯＲ４Ｘ１、ＯＲ４Ｘ２、ＯＲ５１Ａ２、ＯＲ５１Ａ４、ＯＲ５１Ａ７、ＯＲ５１Ｂ ２、ＯＲ５１Ｂ４、ＯＲ５１Ｄ１、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｅ２、ＯＲ５１Ｆ２、ＯＲ５ １Ｇ１、ＯＲ５１Ｇ２、ＯＲ５１Ｈ１、ＯＲ５１１１、ＯＲ５１１２、ＯＲ５１Ｌ１、Ｏ Ｒ５１Ｍ１、ＯＲ５１Ｑ１、ＯＲ５１Ｓ１、ＯＲ５１Ｔ１、ＯＲ５２Ａ１、ＯＲ５２Ａ２ 、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ６、ＯＲ５２ Ｄ１、ＯＲ５２Ｅ２、ＯＲ５２Ｅ４、ＯＲ５２Ｅ５、ＯＲ５２Ｅ６、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ 20 ５２Ｈ１、ＯＲ５２Ｉ１、ＯＲ５２Ｉ２、ＯＲ５２Ｊ３、ＯＲ５２Ｋ１、ＯＲ５２Ｋ２、 ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｌ２、ＯＲ５２Ｎ１、ＯＲ５２Ｎ２、ＯＲ５２Ｎ４、ＯＲ５２Ｎ ５、ＯＲ５２Ｐ１、ＯＲ５２Ｒ１、ＯＲ５６Ａ４、ＯＲ５６Ａ６、ＯＲ５６Ｂ２、ＯＲ５ ６Ｂ４、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ５ＡＫ２、ＯＲ５ＡＫ３、ＯＲ５ ＡＮ１、ＯＲ５ＡＰ２、ＯＲ５ＡＲ１、ＯＲ５ＡＳ１、ＯＲ５ＡＵ１、ＯＲ５ＡＵ１、Ｏ Ｒ５Ｂ１３、 ＯＲ５Ｂ１６、ＯＲ５Ｂ１７、ＯＲ５Ｂ２、ＯＲ５Ｂ３、ＯＲ５Ｃ１、ＯＲ５Ｄ１３、Ｏ Ｒ５Ｄ１４、ＯＲ５Ｄ１６、ＯＲ５Ｄ１８、ＯＲ５Ｆ１、ＯＲ５Ｇ３、ＯＲ５Ｈ１、ＯＲ ５Ｈ２、ＯＲ５Ｈ６、ＯＲ５Ｉ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｋ２、ＯＲ５Ｌ１、ＯＲ５Ｌ２、 ＯＲ５Ｍ１、ＯＲ５Ｍ１０、ＯＲ５Ｍ１１、ＯＲ５Ｍ１１、ＯＲ５Ｍ３、ＯＲ５Ｍ３、Ｏ 30 Ｒ５Ｍ８、ＯＲ５Ｍ９、ＯＲ５Ｐ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５Ｔ２、ＯＲ５Ｔ３、ＯＲ５Ｖ１ 、ＯＲ６Ａ１、ＯＲ６Ｂ１、ＯＲ６Ｂ２、ＯＲ６Ｃ１、ＯＲ６Ｃ２、ＯＲ６Ｃ３、ＯＲ６ Ｆ１、ＯＲ６Ｊ２、ＯＲ６Ｋ３、ＯＲ６Ｋ６、ＯＲ６Ｍ１、ＯＲ６Ｎ１、ＯＲ６Ｎ２、Ｏ Ｒ６Ｐ１、ＯＲ６Ｑ１、ＯＲ６Ｓ１、ＯＲ６Ｔ１、ＯＲ６Ｖ１、ＯＲ６Ｘ１、ＯＲ６Ｙ１ 、ＯＲ７Ａ１０、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ａ２、ＯＲ７Ａ５、ＯＲ７Ｃ１、ＯＲ７Ｃ２、Ｏ Ｒ７Ｄ２、ＯＲ７Ｄ２、ＯＲ７Ｄ４Ｐ、ＯＲ７Ｅ１０２、ＯＲ７Ｅ１２０、ＯＲ７Ｇ１、 ＯＲ７Ｇ２、ＯＲ７Ｇ３、ＯＲ８Ａ１、ＯＲ８Ｂ１２、ＯＲ８Ｂ２、ＯＲ８Ｂ３、ＯＲ８ Ｂ４、ＯＲ８Ｂ８、ＯＲ８Ｄ１、ＯＲ８Ｄ２、ＯＲ８Ｄ４、ＯＲ８Ｇ１、ＯＲ８Ｇ２、Ｏ Ｒ８Ｈ１、ＯＲ８Ｈ２、ＯＲ８Ｈ３、ＯＲ８Ｉ２、ＯＲ８Ｊ１、ＯＲ８Ｊ３、ＯＲ８Ｋ１ 、ＯＲ８Ｋ３、ＯＲ８Ｋ５、ＯＲ９Ａ２、ＯＲ９Ａ４、ＯＲ９Ｇ１、ＯＲ９Ｇ４、ＯＲ９ 40 Ｇ５、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ９Ｋ２、ＯＲ９Ｑ１からなる群から選択される、請求項２６６に 記載のパネル。 【請求項２７０】 前記異なる昆虫嗅覚受容体が、ＩＯＲ１００、ＩＯＲ１０１、ＩＯＲ１０２、ＩＯＲ１ ０３、ＩＯＲ１０４、ＩＯＲ１０５、ＩＯＲ１０６、ＩＯＲ１０７、ＩＯＲ１０８、ＩＯ Ｒ１０９、ＩＯＲ１１０、ＩＯＲ１１１、ＩＯＲ１１２、ＩＯＲ１１３、ＩＯＲ１１４、 ＩＯＲ１１５、ＩＯＲ１１６、ＩＯＲ１１７、ＩＯＲ１１８、ＩＯＲ１１９、ＩＯＲ１２ ０、ＩＯＲ１２１、ＩＯＲ１２２、ＩＯＲ１２３、ＩＯＲ１２４、ＩＯＲ１２５、ＩＯＲ １２６、ＩＯＲ１２７、ＩＯＲ４９、ＩＯＲ５０、ＩＯＲ５１、ＩＯＲ５２、ＩＯＲ５３ 、ＩＯＲ５４、ＩＯＲ５５、ＩＯＲ５６、ＩＯＲ５７、ＩＯＲ５８、ＩＯＲ５９、ＩＯＲ 50 (32) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ６０、ＩＯＲ６１、ＩＯＲ６２、ＩＯＲ６３、ＩＯＲ６４、ＩＯＲ６５、ＩＯＲ６６、Ｉ ＯＲ６７、ＩＯＲ６８、ＩＯＲ６９、ＩＯＲ７０、ＩＯＲ７１、ＩＯＲ７２、ＩＯＲ７３ 、ＩＯＲ７４、ＩＯＲ７５、ＩＯＲ７６、ＩＯＲ７７、ＩＯＲ７８、ＩＯＲ７９、ＩＯＲ ８０、ＩＯＲ８１、ＩＯＲ８２、ＩＯＲ８３、ＩＯＲ８４、ＩＯＲ８５、ＩＯＲ８６、Ｉ ＯＲ８７、ＩＯＲ８８、ＩＯＲ８９、ＩＯＲ９０、ＩＯＲ９１、ＩＯＲ９２、ＩＯＲ９３ 、ＩＯＲ９４、ＩＯＲ９５、ＩＯＲ９６、ＩＯＲ９７、ＩＯＲ９８、ＩＯＲ９９、ＯＲＬ ７０７７、ＯＲＬ７０７８、ＯＲＬ７０７９、ＯＲＬ７０８０、ＯＲＬ７０８１、ＯＲＬ ７０８２、ＯＲＬ７０８３、ＯＲＬ７０８４、ＯＲＬ７０８５、ＯＲＬ７０８６、ＯＲＬ ７０８７、ＯＲＬ７０８８、ＯＲＬ７０８９、ＯＲＬ７０９０、ＯＲＬ７０９１、ＯＲＬ ７０９２、ＯＲＬ７０９３、ＯＲＬ７０９４、ＯＲＬ７０９５、ＯＲＬ７０９６、ＯＲＬ 10 ７０９７、ＯＲＬ７０９８、ＯＲＬ７０９９、ＯＲＬ７１００、ＯＲＬ７１０１、ＯＲＬ ７１０２、ＯＲＬ７１０３、ＯＲＬ７１０４、ＯＲＬ７１０５、ＯＲＬ７１０６、ＯＲＬ ７１０７、ＯＲＬ７１０８、ＯＲＬ７１０９、ＯＲＬ７１１０、ＯＲＬ７１１１、ＯＲＬ ７１１２、ＯＲＬ７１１３、ＯＲＬ７１１４、ＯＲＬ７１１５、ＯＲＬ７１１６、ＯＲＬ ７１１７、ＯＲＬ７１１８、ＯＲＬ７１１９、ＯＲＬ７１２０、ＯＲＬ７１２１、ＯＲＬ ７１２２、ＯＲＬ７１２３、ＯＲＬ７１２４、ＯＲＬ７１２５、ＴＰＲ２３０７、ＴＰＲ ２３０８、ＴＰＲ２３０９、ＴＰＲ２３１０、ＴＰＲ２３１２、ＴＰＲ２３１４、ＴＰＲ ２３１５、ＴＰＲ２３１６、ＴＰＲ２３１７、ＴＰＲ２３１８、ＴＰＲ２３１９、ＴＰＲ ２３２０、ＴＰＲ２３２１、ＴＰＲ２３２１、ＴＰＲ６９８、ＴＰＲ６９９、ＴＰＲ７０ ０、ＴＰＲ７０１、ＴＰＲ７０２、ＴＰＲ７０３、ＴＰＲ７０４、ＴＰＲ７０５、ＴＰＲ 20 ７０６、ＴＰＲ７０７、ＴＰＲ７０８、ＴＰＲ７０９、ＴＰＲ７１０、ＴＰＲ７１１、Ｔ ＰＲ７１２、ＴＰＲ７１３、ＴＰＲ７１４、ＴＰＲ７１５、ＴＰＲ７１６、ＴＰＲ７１７ 、ＴＰＲ７１８、ＴＰＲ７１９、ＴＰＲ７２０、ＴＰＲ７２１、ＴＰＲ７２２、ＴＰＲ７ ２３、ＴＰＲ７２４、ＴＰＲ７２５、ＴＰＲ７２５、ＴＰＲ７２６、ＴＰＲ７２７、ＴＰ Ｒ７２８、ＴＰＲ７２９、ＴＰＲ７３０、ＴＰＲ７３１、ＴＰＲ７３２、ＴＰＲ７３３、 ＴＰＲ７３４、ＴＰＲ７３５、ＴＰＲ７３６、ＴＰＲ７３７、ＴＰＲ７３８、ＴＰＲ７３ ９、ＴＰＲ７４０、ＴＰＲ７４１、ＴＰＲ７４２、ＴＰＲ７４３、ＴＰＲ７４４、ＴＰＲ ７４５、ＴＰＲ７４６、ＴＰＲ７４７、ＴＰＲ７４８、ＴＰＲ７４９、ＴＰＲ７５０、Ｔ ＰＲ７５１、ＴＰＲ７５２、ＴＰＲ７５３、ＴＰＲ７５４、ＴＰＲ７５５、ＴＰＲ７５６ 、ＴＰＲ７５７、ＴＰＲ７５８、ＴＰＲ７５９、ＴＰＲ７６０、ＴＰＲ７６１、ＴＰＲ７ 30 ６２、ＴＰＲ７６３、ＴＰＲ７６４、ＴＰＲ７６５、ＴＰＲ７６６、ＴＰＲ７６７、ＴＰ Ｒ７６８、ＴＰＲ７６９、ＴＰＲ７７０、ＴＰＲ７７１、ＴＰＲ７７２からなる群から選 択される蚊嗅覚受容体である、請求項２６６に記載のパネル。 【請求項２７１】 試験化合物または組成物の嗅覚活性特性を生じるための方法であって、下記を含む前記 方法： ａ．請求項２６６に記載のパネルを前記試験化合物または組成物と接触させること；お よび ｂ．前記パネルにおける少なくとも２つの異なる嗅覚受容体に関する機能的アッセイに おける前記活性に及ぼす前記試験化合物または組成物の効果を測定すること、 40 この中で、工程（ｂ）において測定された活性は、前記試験化合物または組成物の前記 嗅覚活性特性を提供する。 【請求項２７２】 第一の試験化合物または組成物の匂いを模倣する第二の試験化合物を同定するための方 法であって、下記を含む前記方法： ａ．請求項２６６に記載のパネルを前記第二の試験化合物と接触させること； ｂ．前記パネルにおける少なくとも２つの嗅覚受容体に関する機能的アッセイにおける 前記活性に及ぼす前記第二の試験化合物の効果を試験すること； ｃ．工程（ｂ）において得られた前記第二の試験化合物の前記嗅覚活性特性を、前記第 一の試験化合物または組成物の前記嗅覚活性特性と比較し；この中で、前記第二の試験化 50 (33) JP 2012-516687 A 2012.7.26 合物の前記嗅覚活性特性が、前記第一の試験化合物または組成物の前記嗅覚活性特性と類 似している場合、前記第一の試験化合物または組成物の前記匂いを模倣すること。 【請求項２７３】 第一の試験化合物または組成物の前記嗅覚活性特性を修飾する第二の試験化合物を同定 する方法であって、下記を含む前記方法： ａ．請求項２７１に記載の方法に従って、前記第一の試験化合物または組成物の存在下 で、第二の試験化合物の前記嗅覚活性特性を生じること； ｂ．工程（ａ）で得られた前記嗅覚活性特性を、前記第二の試験化合物の不在下で前記 第一の試験化合物または組成物の前記嗅覚活性特性と比較し；前記第一の試験化合物また は組成物単独の前記嗅覚活性特性が、前記第一の試験化合物または組成物の存在下で、前 10 記第二の試験化合物の前記嗅覚活性特性とは異なる場合、前記第二の試験化合物が、前記 第一の試験化合物または組成物の前記嗅覚活性特性を修飾すること。 【請求項２７４】 試験化合物と関連した匂いを同定するためのコンピュータにより実行される方法であっ て、下記を含む前記方法： ａ．前記試験化合物の第一の嗅覚活性特性を受信し、この中で、該第一の嗅覚活性特性 が請求項２７１に記載の方法によって生じること； ｂ．該第一の嗅覚活性特性をデータベースに保存された複数の目印嗅覚活性と比較して 、該第一の嗅覚活性特性と該複数の目印嗅覚活性特性における各該目印嗅覚活性特性の間 の類似性の測定結果を決定し、この中で、各該目印嗅覚活性特性が、公知の匂いを有する 20 個々の公知の化合物に対応し、かつこの中で、各該目印嗅覚活性特性が、請求項２７１に 記載の方法によって生じること； ｃ．工程（ｂ）において決定された類似性の測定結果に基づいて該第一の嗅覚活性特性 と最も類似した１つ以上の目印嗅覚活性特性を決定すること；および ｄ．工程（ｃ）における該第一の嗅覚活性特性と最も類似していると決定された１つ以 上の目印嗅覚活性特性と関連した匂いを、該公知の化合物と関連した匂いとして同定する こと； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【請求項２７５】 30 類似性の該測定結果が、あらかじめ決めておいた閾値を上回る場合、該１つ以上の目印 嗅覚活性特性が、該第一の嗅覚活性特性と最も類似している、請求項２７４に記載の方法 。 【請求項２７６】 特定の匂いと関連しているものとして化合物を特徴づけるための、コンピュータにより 実行される方法であって、下記を含む前記方法： ａ．該化合物の第一の嗅覚活性特性を受信し、この中で、該第一の嗅覚活性特性を請求 項２７１に記載の方法によって生じること； ｂ．複数が該第一の嗅覚活性特性および複数の目印嗅覚活性特性を含む、複数の嗅覚活 性特性をクラスター化し、この中で、各該目印嗅覚活性特性が、公知の匂いを有する個々 40 の公知の化合物に対応し、かつこの中で、各該目印嗅覚活性特性が、請求項２７１に記載 の方法によって生じること； ｃ．前記第一の嗅覚活性特性を用いてクラスター化する該複数の目印嗅覚活性特性にお ける１つ以上の目印嗅覚活性特性を同定すること；および ｄ．工程（ｃ）における該第一の嗅覚活性特性を用いてクラスター化されるものとして 同定される１つ以上の目印嗅覚活性特性に対応する個々の化合物と関連した該公知の匂い と関連しているものとして、前記化合物を特徴づけること； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【請求項２７７】 50 (34) JP 2012-516687 A 2012.7.26 分類指標を用いて試験化合物を、匂いを有するものとして分類する、コンピュータによ り実行される方法であって、下記を含む方法： ａ．データベースに保存された複数の目印嗅覚活性特性を用いて、試験化合物を匂いに 分類するための分類指標をトレーニングし、この中で、各該目印嗅覚活性特性が、公知の 匂いを有する個々の公知の化合物に対応し、かつこの中で、各該目印嗅覚活性特性が、請 求項２７１に記載の方法によって生じること；および ｂ．該分類指標を用いて、請求項２７１に記載の方法によって生じた該化合物の第一の 嗅覚活性特性を処理して、該化合物を公知の匂いに分類すること； この中で、工程（ａ）および（ｂ）は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて 実行される。 10 【請求項２７８】 分類指標を用いて匂いを有するものとして試験化合物を分類する、コンピュータにより 実行される方法であって、下記を含む方法： ａ．該分類指標を用いて、請求項２７１に記載の方法によって生じた該化合物の第一の 嗅覚活性特性を処理して、該試験化合物を公知の匂いに分類し、この中で、該分類指標が 下記を含む方法に従ってトレーニングされること： ｂ．データベースに保存された複数の目印嗅覚活性特性を用いて、試験化合物を匂いに 分類するために該分類指標をトレーニングし、この中で、各該目印嗅覚活性特性が、公知 の匂いを有する個々の公知の化合物に対応し、かつこの中で、各該目印嗅覚活性特性が、 請求項２７１に記載の方法によって生じ； 20 この中で、前記処理が、適切にプログラムされたコンピュータにおいて実行される。 【請求項２７９】 １つ以上の試験化合物を匂いと関連付けるための、コンピュータにより実行される方法 であって、下記を含む前記方法： ａ．第一の試験化合物の第一の嗅覚活性特性を受信し、この中で、該第一の嗅覚活性特 性が、請求項２７１に記載の方法によって生じ、かつこの中で、該第一の試験化合物が公 知の匂いを有すること； ｂ．該第一の嗅覚活性特性を、データベースに保存された複数の目印嗅覚活性特性と比 較して、該第一の嗅覚活性特性と、該複数の目印嗅覚活性特性における該目印嗅覚活性特 性の各々の間の類似性の測定結果を決定し、この中で、各該目印嗅覚活性特性が、個々の 30 公知の化合物に対応し、かつこの中で、各該目印嗅覚活性特性が、請求項２７１に記載の 方法によって生じること； ｃ．工程（ｂ）において決定された類似性に関する前記測定結果に基づいた該第一嗅覚 活性特性に最も類似している１つ以上の目印嗅覚活性特性を決定すること；および ｄ．工程（ｃ）における該第一の嗅覚活性特性に最も類似していると決定された前記１ つ以上の目印嗅覚活性特性に対応する前記個々の試験化合物を該公知の匂いと関連してい るものとして特徴づけること； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【請求項２８０】 40 類似性に関する該測定結果が、あらかじめ決めておいた閾値を上回る場合、該１つ以上 の目印嗅覚活性特性が該第一の嗅覚活性特性と最も類似している、請求項２７９に記載の 方法。 【請求項２８１】 １つ以上の試験化合物を特定の匂いと関連しているものとして特徴づけるための、コン ピュータにより実行される方法であって、下記を含む前記方法： ａ．第一の試験化合物の第一の嗅覚活性特性を受信し、この中で、該第一の嗅覚活性特 性が、請求項２７１に記載の方法によって生じ、かつこの中で、該第一の試験化合物が、 公知の匂いを有すること； ｂ．複数の嗅覚活性特性をクラスター化し、該複数が、該第一の嗅覚活性特性および複 50 (35) JP 2012-516687 A 2012.7.26 数の目印嗅覚活性特性を含み、この中で、各該目印嗅覚活性特性が、個々の公知の化合物 に対応し、かつこの中で、各該目印嗅覚活性特性が、請求項２７１に記載の方法によって 生じること； ｃ．第一の嗅覚活性特性を用いてクラスター化する該複数の目印嗅覚活性特性において １つ以上の目印嗅覚活性特性を同定すること；および ｄ．工程（ｃ）において該第一の嗅覚活性特性を用いてクラスター化されるものとして 同定された前記１つ以上の目印嗅覚活性特性に対応する前記個々の化合物を、該公知の匂 いと関連しているものとして特徴づけること； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 10 【請求項２８２】 分類指標を用いて匂いを有するものとして１つ以上の試験化合物を分類する、コンピュ ータにより実行される方法であって、下記を含む前記方法： ａ．該分類指標を用いて、請求項２７１に記載の方法によって生じた第一の嗅覚活性特 性を処理して（この中で、該第一の嗅覚活性特性が、公知の匂いを有する第一の試験化合 物に対応する。）、データベースに保存された複数の目印嗅覚活性特性の１つ以上の目印 嗅覚活性特性を、該公知の匂いを有するものとして分類し、この中で、該分類指標は、下 記を含む方法に従ってトレーニングされること： ｂ．匂いを有するものとして該１つ以上の目印嗅覚活性特性を分類するために、該複数 の目印嗅覚活性特性を用いて該分類指標をトレーニングし、この中で、各該目印嗅覚活性 20 特性が、個々の公知の化合物に対応し、かつ各該目印嗅覚活性特性が、請求項２７１に記 載の方法によって生じること； この中で、前記処理は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて実行される。 【請求項２８３】 関心対象のインビボでのタンパク質または関心対象の複数のタンパク質に対して、イン ビトロでの相関物であるタンパク質または複数のタンパク質であって、この中で、前記イ ンビトロでの相関物が、インビボで発現した前記対応するタンパク質または関心対象の複 数のタンパク質の機能または活性を予測し；この中で、前記インビトロでの相関物が、イ ンビトロで非生理学的条件下で発現する生物学的に活性のあるタンパク質または複数のタ ンパク質であり；この中で、前記インビトロでの相関物が、関心対象の前記インビボでの 30 タンパク質または複数のタンパク質に対応する少なくとも１つの機能的または薬理学的ま たは生理学的特性を含み；かつこの中で、該インビトロでの相関物を用いたハイスループ ットスクリーニングにおいて同定された化合物の少なくとも１０％が、インビボでの治療 効果を有することができる、前記タンパク質または複数のタンパク質。 【請求項２８４】 前記インビトロでの相関物が、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブユニット を含む、請求項２８３に記載のタンパク質。 【請求項２８５】 前記インビトロでの相関物のうちの少なくとも１つのタンパク質が、少なくとも２、３ 、４、５、または６個のサブユニットを含む、請求項２８３に記載の複数のタンパク質。 40 【請求項２８６】 前記インビトロでの相関物が、ヘテロ多量体において含む、請求項２８３に記載のタン パク質。 【請求項２８７】 前記インビトロでの相関物のうちの少なくとも１つのタンパク質が、ヘテロ多量体を含 む、請求項２８３に記載の複数のタンパク質。 【請求項２８８】 前記インビトロでの相関物のタンパク質または複数のタンパク質が、タンパク質タグを 含まない、請求項２８３∼２８７のいずれか一項に記載のタンパク質または複数のタンパ ク質。 50 (36) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【請求項２８９】 前記インビトロでの相関物が、選択的圧力の不在下で培養された細胞において安定して 発現する、請求項２８３∼２８８のいずれか一項に記載のタンパク質または複数のタンパ ク質。 【請求項２９０】 前記インビトロでの相関物が、細胞毒性を生じることなく細胞株において発現する、請 求項２８３∼２８９のいずれか一項に記載のタンパク質または複数のタンパク質。 【請求項２９１】 前記インビトロでの相関物が、前記タンパク質または複数のタンパク質を内在的に発現 しない細胞において発現する、請求項２８３∼２９０のいずれか一項に記載のタンパク質 10 または複数のタンパク質。 【請求項２９２】 請求項２８３∼２９１のいずれか一項に記載のタンパク質または複数のタンパク質を発 現する細胞。 【請求項２９３】 請求項２９２に記載の細胞から作製される細胞株。 【請求項２９４】 関心対象のインビボのタンパク質の修飾因子を同定するための方法であって、 ａ．任意の請求項２９２に記載の細胞を試験化合物と接触させる工程；および ｂ．前記試験化合物によって接触されていない細胞における前記インビトロでの相関物 20 のタンパク質または複数のタンパク質の活性と比較して、前記試験化合物と接触された細 胞における前記インビトロでの相関物のタンパク質または複数のタンパク質の活性におけ る変化を検出する工程； を含み、ここで、不在下と比較して存在下での活性における差異を生じる化合物が、関心 対象の前記インビボでのタンパク質の修飾因子である、前記方法。 【請求項２９５】 請求項２９４に記載の方法によって同定される修飾因子。 【請求項２９６】 前記細胞が、分化した細胞である、請求項１９０、１９２、１９４、１９５∼１９９、 ２０１∼２０２、２６２、および２９２のいずれか一項に記載の細胞。 30 【請求項２９７】 前記細胞が脱分化した細胞である、請求項１９０、１９２、１９４、１９５∼１９９、 ２０１∼２０２、２６２、および２９２のいずれか一項に記載の細胞。 【請求項２９８】 前記脱分化した細胞が、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞（ｏ ｍｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞 、臓器特異的幹細胞、および組織特異的幹細胞からなる群から選択される幹細胞である、 請求項２９７に記載の細胞。 【請求項２９９】 40 分化した細胞を環細胞へと脱分化させる工程を含み、前記分化した細胞が請求項２９６ に記載の細胞である、幹細胞を作製するための方法。 【請求項３００】 再分化した細胞を作製するための方法であって、下記の工程を含む前記方法： ａ．請求項２９６に記載の細胞を脱分化させて、幹細胞を作製する工程；および ｂ．前記幹細胞を再分化させて、前記再分化した細胞を作製する工程。 【請求項３０１】 前記幹細胞が、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能 性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞、人工多能性 幹細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、臓器特異的幹細胞、および組織特異的幹細胞からなる群 50 (37) JP 2012-516687 A 2012.7.26 から選択される幹細胞である、請求項２９９または請求項３００に記載の方法。 【請求項３０２】 前記再分化した細胞が、請求項２９６に記載の細胞とは異なる種類である、請求項３０ ０に記載の方法。 【請求項３０３】 下記の工程を含む、非ヒト生物を作製するための方法： ａ．請求項２９６に記載の細胞を脱分化させて、幹細胞を作製し、この中で、前記幹細 胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である工程；および ｂ．前記幹細胞を再分化させて、非ヒト生物を作製する工程。 【請求項３０４】 10 前記生物が哺乳類である、請求項３０３に記載の方法。 【請求項３０５】 前記哺乳類がマウスである、請求項３０４に記載の方法。 【請求項３０６】 請求項３００に記載の方法によって作製された再分化した細胞。 【請求項３０７】 請求項３０３に記載の方法によって作製された非ヒト生物。 【請求項３０８】 前記生物が哺乳類である、請求項３０７に記載の非ヒト生物。 【請求項３０９】 20 前記哺乳類がマウスである、請求項３０８に記載の非ヒト生物。 【請求項３１０】 関心対象の該第一および第二のタンパク質が、ＥＮａＣ、ＮａＶ、ＧＡＢＡＡ、甘味受 容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、およびＧＣＣからなる群から独立して選択さ れる、請求項２１８または請求項２２７に記載の方法。 【請求項３１１】 各タンパク質が、ＥＮａＣ、ＮａＶ、ＧＡＢＡＡ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容 体、ＣＦＴＲ、およびＧＣＣからなる群から独立して選択される、請求項２３１に記載の 方法。 【発明の詳細な説明】 30 【技術分野】 【０００１】 本出願は、２００９年２月２日に出願された米国仮出願第６１／１４９，３２１号；２ ００９年２月２日に出願された米国仮出願第６１／１４９，３１８号；米国仮出願第６１ ／１４９，３２４号；２００９年２月２日に出願された米国仮出願第６１／１４９，３１ １号；２００９年８月１９日に出願された米国仮出願第６１／２３５，１８１号；および ２００９年７月３１日に出願された米国仮出願第６１／２３０，５３６号の利益を主張す るものであり、これらの各々は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書 に組み込まれている。 【０００２】 40 （配列表） 本出願は、ＥＦＳ‐Ｗｅｂを介して提出された配列表を含んでおり、全体として引用に より本明細書により組み込まれている。２０１０年２月１日に作製された該ＡＳＣＩＩコ ピーは、００２２９８００２５ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔと命名され、２００，０２３バイ トの大きさである。 【０００３】 （本発明の分野） 本発明は、新規の細胞および細胞株、ならびにそれらを作製および使用するための方法 に関する。特定の実施態様において、本発明は、複合標的を安定して発現する細胞および 細胞株に関する。本発明はさらに、このような細胞および細胞株を作製する方法を提供す 50 (38) JP 2012-516687 A 2012.7.26 る。本明細書に提供された細胞および細胞株は、このような複合標的の修飾因子を同定す る上で有用である。 【背景技術】 【０００４】 （本発明の背景） 現在、製薬企業における薬剤開発プログラムのための産業平均失敗率は、およそ９８％ と報告されている。これには、プロセスのすべての段階での失敗が含まれるが、高い失敗 率は、プロセスの効率性における何らかの改善についての直接的な必要性を指摘している 。 【０００５】 10 高い失敗率に寄与する１つの因子は、薬剤開発の間の細胞ベースの機能的アッセイにお いて用いられるための治療標的を発現する細胞株がないことである。明らかに、細胞ベー スのアッセイを用いた研究、特に薬剤開発研究は、細胞ベースのアッセイにおいて使用す るための細胞および細胞株から利益を得るであろう。 【０００６】 結果として、新たなかつ改良された薬剤のより迅速な開発のための細胞ベースのアッセ イの迅速かつ効果的な確立についての必要性が大きい。好ましくは、より効果的な薬剤発 見のために、アッセイシステムは、インビボでの修飾因子の効果のより生理学的に関連性 のある予測因子を提供すべきである。 【０００７】 20 細胞ベースのアッセイが必要であるほかに、タンパク質産生、細胞ベースの治療法、お よび種々の他の用途のための改良された細胞が必要である。 【０００８】 従って、関心対象の機能タンパク質またはＲＮＡを発現する細胞および細胞株が緊急に 必要とされる。 【０００９】 口腔において、味覚受容体細胞（ＴＲＣ）は、舌、口蓋の一部、喉頭蓋、喉頭、および 咽頭を含めたいくつかの特殊化した帯域において認められることができる。舌において、 ＴＲＣは、味蕾と呼ばれる細胞群へと組織化される。味蕾は、ＴＲＣの微絨毛が、口腔内 に存在する味物質と接触する単一の頂孔（ａｐｉｃａｌ ｐｏｒｅ）からなる。舌におい 30 て、味蕾は、３つの種類の特殊化した表皮構造に埋め込まれている。茸状乳頭は、舌の前 部２／３にわたって分布する。誕生時に十分発達しているが加齢とともに退行する葉状乳 頭は、舌の後部１／３の両側に認められる。７∼９個の有郭乳頭は、分界溝近くの舌後部 上ではるか後方に配置される。味蕾において組織化された「古典的」ＴＲＣに加えて、化 学受容性細胞クラスターまたは孤立性化学受容細胞が、肺および腸管における非舌上皮に おいて認められる。 【００１０】 （甘味受容体） 甘味知覚は、２つのサブユニットＴＡＳＲ２（Ｔ１Ｒ２）およびＴＡＳＲ３（Ｔ１Ｒ３ ）から構成されるヘテロマーＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）によって仲介される。 40 該受容体は、甘味受容体と呼ばれる。該受容体の両サブユニットは、クラスＣのＧＰＣＲ サブファミリーのメンバーであり、蠅地獄（Ｖｅｎｕｓ ｆｌｙｔｒａｐ）ドメインとし ばしば呼ばれる大きなＮ末端細胞外ドメインを有する。Ｔ１Ｒサブユニットは、Ｇタンパ ク質αトランスデューシンまたはαガストデューシンと共役することができ、それを通じ てホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）β２依存性経路を活性化して、細胞内Ｃａ２＋濃度を増大 させることができる。これらはまた、ｃＡＭＰ依存性経路も活性化し得る。 【００１１】 甘味受容体は、単純な炭水化物（糖類など）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、およ び合成甘味料を含めた広範な種々の甘味化学物質を検出する。甘味受容体は、天然および 合成の両甘味料に対して感受性がある。該受容体を活性化することが公知の化学構造の広 50 (39) JP 2012-516687 A 2012.7.26 範な多様性を考慮すると、該受容体における複数の結合部位が提唱されており、それには 、旨味受容体と共有したサブユニットとして機能する膜貫通領域における部位およびＴ１ Ｒ３上の部位を含む。 【００１２】 また、甘味受容体は、栄養物質検出および感知において重要な役割を担っているように 見えるので、肥満および糖尿病などの容態においても関係づけられている。味覚受容体は 、ヒト近位小腸の栄養物質検出領域において発現し、そこで、証拠は、腸腔における栄養 物質の検出において役割を担っていることを示唆している。甘味受容体および、細胞内味 覚シグナル伝達に関与するＧタンパク質であるガストデューシンはこの領域において、よ り具体的には腸の内分泌細胞において高度に協調して発現する。これらの甘味受容体の機 10 能は従って、他のＧタンパク質共役受容体と類似のリガンド仲介性制御を示し得、すなわ ち、該甘味受容体は、高濃度のこれらのリガンドの存在下で活性およびまたは発現を失う であろう。このことは、血液および管腔におけるグルコース濃度の動的代謝変化に応答し た腸「味覚」シグナル伝達をなすであろう。従って、腸における甘味受容体およびその修 飾は、食事、食欲において、ならびに肥満および糖尿病などの種々の疾患の治療において 、重要な役割を有し得る。 【００１３】 また、天然糖類および人工甘味料による腸甘味受容体の活性化は、頂端グルコース輸送 体ＧＬＵＴ２および他のグルコース輸送体の増大した発現ももたらす。例えば、人工甘味 料は、栄養的に活性があり、その理由として、該甘味料は、栄養および食欲において重要 20 な意味を有し得る知見、従って、栄養失調および摂食障害の有望な治療における食事中の 糖の吸収を高めるための機能的味覚システムをシグナル伝達することができるからである 。一貫して上昇した頂端ＧＬＵＴ２レベルは結果的に、糖吸収を高め、実験的糖尿病の、 ならびにフルクトースおよび脂肪によって誘導されるインスリン抵抗性状態の特徴である 。加えて、神経内分泌細胞における甘味受容体活性化は、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ −１）およびおそらく他の消化修飾因子の放出をもたらす。全体として、腸における甘味 受容体は、管腔の内容物の栄養値を感知する上で重要な役割を担っており、調節された吸 収および消化を介して身体の応答を協調させるのを助ける。これらの知見は、甘味受容体 が、肥満および糖尿病を治療する上で有用な調節因子のための考えられ得る標的として機 能し得る。 30 【００１４】 （旨味受容体） 風味（旨味）知覚は、２つのサブユニットＴＡＳＲ１（Ｔ１Ｒ１）およびＴＡＳＲ３（ Ｔ１Ｒ３）から構成されるヘテロマーＧＰＣＲによって仲介される。該受容体は、旨味受 容体と呼ばれる。該受容体の両サブユニットは、クラスＣのＧＰＣＲサブファミリーのメ ンバーであり、蠅地獄ドメインとしばしば呼ばれる大きなＮ末端細胞外ドメインを有する 。Ｔ１Ｒサブユニットは、Ｇタンパク質αトランスデューシンまたはαガストデューシン と共役することができ、それらを通じて、該サブユニットは、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ ）２依存性経路を活性化して、細胞内Ｃａ２＋濃度を高めることができる。該サブユニッ トはまた、ｃＡＭＰ依存性経路も活性化し得る。これらの受容体は、Ｌ−アミノ酸および 40 グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）を含めた広範な種々の風味化学物質を検出すること ができる。また、Ｔ１Ｒ１は、旨味の公知の増強物質である５’−イノシン酸二ナトリウ ム（ＩＭＰ）および他のヌクレオチドを結合することも示されている。 【００１５】 また、旨味受容体は、ヒトにおける近位小腸の栄養物質検出領域においても発現し、そ こで、該受容体は、腸腔における栄養物質の検出における役割を担っていると思われる。 旨味受容体および、この領域における、具体的には神経内分泌細胞における細胞内味覚シ グナル伝達に関与するＧタンパク質であるガストデューシンの発現を高度に協調する。ア ミノ酸による腸旨味受容体の活性化は、頂端部オリゴペプチド輸送体ＰｅｐＴ１の調節を もたらす。全体として、腸における旨味受容体は、管腔の内容物の栄養値を感知する上で 50 (40) JP 2012-516687 A 2012.7.26 重要な役割を担っており、調節された吸収および消化を介して身体の応答を協調させるの を助ける。これらの知見は、旨味受容体が、肥満および糖尿病において有用な修飾因子に ついて起こり得る標的として機能し得る。 【００１６】 （苦味受容体） 苦味受容体は、味覚受容体細胞の表面に発現するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ） であり、二次メッセンジャー経路に連関している。ＴＡＳ２Ｒ受容体は、トランスデュー シン（例えば、ＧＮＡＴ１、ＧＮＡＴ２、およびグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ （ｔ））またはガストデューシン（例えば、ＧＮＡＴ３グアニンヌクレオチド結合タンパ ク質およびαトランスデューシン３）と共役することができ、例えば、それらを通じて、 10 ホスホジエステラーゼおよびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）β２依存性経路の両方を活性化 して、細胞内Ｃａ２＋濃度を高めることができる。また、ＴＡＳ２Ｒ受容体は、ヒトＧＮ Ａ１５（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）α１５（Ｇｑクラス；同 義語ＧＮＡ１６））およびマウスＧα１５、ならびにそれらのキメラタンパク質Ｇα１５ ‐ＧＮＡ１５（Ｇα１５‐Ｇα１６としても公知）と共役することもできる。 【００１７】 ヒト苦味は、ヒトＴＡＳ２受容体（ｈＴＡＳ２Ｒ）遺伝子ファミリーの約２５のメンバ ーによって仲介される。味覚におけるこれらの役割に加えて、苦味受容体はまた、一連の 生理学的脈絡においても重要である。例えば、味覚受容体アゴニストは、インビトロで腸 内分泌細胞において、およびインビボで動物において分泌応答を惹起し、ニューロンの活 20 性化を誘導する。それゆえ、苦味受容体ファミリーメンバーはすべて、苦味物質の検出と 管ｒ年下種々の容態を管理するための重要な臨床標的である。 【００１８】 標的味覚受容体（例えば、甘味受容体、旨味受容体、および苦味受容体）を具体的に標 的とし、従ってそれらの活性を調節する新たなかつ改良された化合物の発見は、頑強な生 理学的に関連のある細胞ベースのシステム、より特別には、味覚受容体修飾因子（例えば 、甘味受容体修飾因子、旨味受容体修飾因子、および苦味受容体修飾因子）を同定および 試験するための高処理量フォーマットに従いやすいシステムがないことによって妨げられ てきた。このような細胞ベースのシステムは、薬剤の発見および検証に好ましく、その理 由として、該システムが、結合アッセイを提供するのみである無細胞系とは反対の化合物 30 についての機能的アッセイを提供するからである。その上、細胞ベースのシステムは、細 胞毒性を同時に試験する利点を有する。理想的には、細胞ベースのシステムはまた、標的 タンパク質を安定かつ構成的に発現すべきである。また、細胞ベースのシステムが再生可 能であることも望ましい。本発明は、味覚受容体、例えば、甘味受容体、苦味受容体、ま たは旨味受容体を生理学的に関連のある形態で安定して発現する細胞および細胞株を提供 する脈絡において、ならびに該細胞および細胞株を用いて、味覚受容体、例えば、甘味受 容体、苦味受容体、または旨味受容体の修飾因子を同定する方法において、種々の実施態 様におけるこれらの問題に対処する。 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 40 【００１９】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ二量体タンパク質を関心対 象のヘテロ二量体タンパク質のサブユニットの少なくとも１つをコードする導入された核 酸から発現する細胞を提供し、該細胞は、機能的アッセイにおいて使用するのに適した形 態で関心対象のヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、この中で、関心対象 の該タンパク質は、タンパク質タグを含まず、または該タンパク質は、細胞が機能的アッ セイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう構成的かつ再現可能に形成するも のにおいて産生され、または該細胞は、選択的圧力の不在下で培養され、あるいはそれら の任意の組み合わせである。 【００２０】 50 (41) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ二量体タンパク質を発現す る細胞を提供し、この中で、細胞は、関心対象のヘテロ二量体タンパク質のサブユニット の少なくとも１つをコードする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、 機能的アッセイにおいて使用するのに適した形態で関心対象のヘテロ二量体タンパク質を 産生することを特徴とし、この中で、関心対象の該タンパク質は、タンパク質タグを含ま ず、または該タンパク質は、細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子 を有するよう一貫しかつ再生可能に形成するものにおいて産生され、または該細胞は、選 択的圧力の不在下で培養され、あるいはそれらの任意の組み合わせである。 【００２１】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ二量体タンパク質を、関心 10 対象のヘテロ二量体タンパク質のサブユニットの少なくとも１つをコードする導入された 核酸から発現する細胞を提供し、該細胞は、生物学的に活性となるまたはなることのでき る形態で関心対象のタンパク質を産生することを特徴とし、この中で、細胞は、選択的圧 力の不在下で培養される。 【００２２】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ二量体タンパク質を発現す る細胞を提供し、この中で、細胞は、関心対象のヘテロ二量体タンパク質のサブユニット の少なくとも１つをコードする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、 生物学的に活性となるまたはなることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生するこ とを特徴とし、この中で、細胞は、選択的圧力の不在下で培養される。 20 【００２３】 いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ二量体タンパク質の第二のサブユニッ トをコードする核酸は内在性である。他の実施態様において、関心対象のヘテロ二量体タ ンパク質の第二のサブユニットをコードする核酸が導入される。なおも他の実施態様にお いて、関心対象のタンパク質は、タンパク質タグを含まない。 【００２４】 いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ二量体タンパク質は、イオンチャネル 、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体 、核ステロイドホルモン受容体、抗体、生物学的および免疫学的受容体からなる群から選 択される。いくつかの実施態様において、ヘテロ二量体タンパク質は抗体または生物学的 30 製剤である。いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ二量体タンパク質は、甘味 受容体および旨味状態からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、関心対 象のヘテロ二量体タンパク質は公知のリガンドを有さない。他の実施態様において、関心 対象のヘテロ二量体タンパク質の機能的発現を検出するための公知のアッセイはない。 【００２５】 いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ二量体タンパク質は、同じ種類の細胞 において発現しない。いくつかの実施態様において、細胞は哺乳類細胞である。 【００２６】 いくつかの実施態様において、細胞はさらに、１を超えるシグナル対ノイズ比、経時的 に安定であること、発現を失うことなく選択的圧力のない増殖、生理学的ＥＣ５０値、お 40 よび生理学的ＩＣ５０値からなる群から選択される追加的な所望の特性を有することを特 徴とする。いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ二量体タンパク質は、少なく とも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ ヶ月間、少なくとも３ヶ月間少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ 月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、および少なくとも９ヶ月間から選択さ れる期間一貫しかつ再生可能な形態で産生される。いくつかの実施態様において、機能的 アッセイは、細胞ベースのアッセイ、蛍光細胞ベースのアッセイ、ハイスループットスク リーニングアッセイ、リポーター細胞ベースのアッセイ、Ｇタンパク質仲介性の細胞ベー スのアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースのアッセイからなる群から選択さ れる。いくつかの実施態様において、機能的アッセイは、膜電位アッセイ、ＥＬＩＳＡ、 50 (42) JP 2012-516687 A 2012.7.26 質量分析、関心対象のタンパク質の生化学的特徴付け、細胞増殖アッセイ、生存率アッセ イ、細胞特定アッセイ、またはタンパク質産生についての能力からなる群から選択される 。他の実施態様において、細胞は、細胞ベースのハイスループットスクリーニングにおい て利用するのに適している。 【００２７】 いくつかの実施態様において、選択的圧力は抗生物質である。他の実施態様において、 細胞は、選択的圧力の不在下で少なくとも１５日間、３０日間、４５日間、６０日間、７ ５日間、１００日間、１２０日間、または１５０日間ヘテロ二量体タンパク質を発現する 。 【００２８】 10 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ多量体タンパク質を発現す る細胞を提供し、この中で、該ヘテロ多量体タンパク質は、少なくとも３つのサブユニッ トを含み、この中で、ヘテロ多量体タンパク質関心対象の少なくとも１つのサブユニット は、導入された核酸によってコードされ、該細胞は、機能的アッセイにおいて使用するの に適した形態で関心対象のヘテロ多量体タンパク質を産生することを特徴とし、この中で 、関心対象の該タンパク質は、タンパク質タグを含まず、または該タンパク質は、細胞が 機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう一貫かつ再生可能に形 成するものにおいて産生され、または該細胞は、選択的圧力の不在下で培養され、あるい はそれらの任意の組み合わせである。 【００２９】 20 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ多量体タンパク質を発現す る細胞を提供し、この中で、該ヘテロ多量体タンパク質は、少なくとも３つのサブユニッ トを含み、この中で細胞は、関心対象のヘテロ多量体タンパク質のサブユニットのうちの 少なくとも１つをコードする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、機 能的アッセイにおいて使用するのに適した形態で関心対象のヘテロ多量体タンパク質を産 生することを特徴とし、この中で、関心対象の該タンパク質はタンパク質タグを含まず、 または該タンパク質は、細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有 するよう一貫しかつ再生可能に形成するものにおいて産生され、または該細胞は、選択的 圧力の不在下で培養され、あるいは、それらの任意の組み合わせである。 【００３０】 30 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ多量体タンパク質を発現す る細胞を提供し、この中で、該ヘテロ多量体タンパク質は、少なくとも３つのサブユニッ トを含み、この中で、ヘテロ多量体タンパク質関心対象の少なくとも１つのサブユニット は、導入された核酸によってコードされ、該細胞は、生物学的に活性となるまたはなるこ とのできる形態で、関心対象のタンパク質を産生することを特徴とする。 【００３１】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のヘテロ多量体タンパク質を発現す る細胞を提供し、この中で、該ヘテロ多量体タンパク質は少なくとも３つのサブユニット を含み、この中で、細胞は、関心対象のヘテロ多量体タンパク質のサブユニットのうちの 少なくとも１つをコードする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、生 40 物学的に活性となるまたはなることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生すること を特徴とする。 【００３２】 いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ多量体タンパク質のサブユニットの少 なくとも１つをコードする核酸は内在性である。 【００３３】 いくつかの実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質のサブユニットのうちの少なく とも１つをコードする核酸が導入される。 【００３４】 いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は、タンパク質タグを含まない。 50 (43) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【００３５】 いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ多量体タンパク質は、イオンチャネル 、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体 、核ステロイドホルモン受容体、および免疫学的受容体からなる群から選択される。いく つかの実施態様において、関心対象のヘテロ多量体タンパク質は、抗体または生物製剤で ある。他の実施態様において、関心対象のヘテロ多量体タンパク質は、ＧＡＢＡ、ＥＮａ Ｃ、およびＮａＶからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、関心対象の ヘテロ多量体タンパク質は公知のリガンドを有さない。他の実施態様において、関心対象 の該ヘテロ多量体タンパク質の機能的発現を検出する公知のアッセイはない。 【００３６】 10 いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ多量体タンパク質は、同じ種類の細胞 において発現しない。他の実施態様において、細胞は哺乳類細胞である。 【００３７】 いくつかの実施態様において、細胞はさらに、１を超えるシグナル対ノイズ比、経時的 に安定であること、発現を失うことなく選択的圧力のない増殖、生理学的ＥＣ５０値、お よび生理学的ＩＣ５０値からなる群から選択される追加的な所望の特性を有することを特 徴とする。いくつかの実施態様において、関心対象のヘテロ二量体タンパク質は、少なく とも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ ヶ月間、少なくとも３ヶ月間少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ 月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、および少なくとも９ヶ月間から選択さ 20 れる期間一貫しかつ再生可能な形態で産生される。 【００３８】 いくつかの実施態様において、機能的アッセイは、細胞ベースのアッセイ、蛍光細胞ベ ースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リポーター細胞ベースのア ッセイ、Ｇタンパク質仲介性の細胞ベースのアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞 ベースのアッセイからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、機能的アッ セイは、膜電位アッセイ、ＥＬＩＳＡ、質量分析、関心対象のタンパク質の生化学的特徴 付け、細胞増殖アッセイ、生存率アッセイ、細胞特定アッセイ、またはタンパク質産生の ための能力である。他の実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞は、 細胞ベースのハイスループットスクリーニングにおける利用に適している。 30 【００３９】 いくつかの実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞は、選択的圧力 の不在下で培養される。いくつかの実施態様において、選択的圧力は抗生物質である。他 の実施態様において、請求項３５または３６に記載の細胞であり、この中で細胞は、選択 的圧力の不在下でヘテロ多量体タンパク質を少なくとも１５日間、３０日間、４５日間、 ６０日間、７５日間、１００日間、１２０日間、または１５０日間発現する。 【００４０】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の２つ以上のタンパク質を、関心対 象のタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする導入された核酸から発現する細胞を 提供し、該細胞は、機能的アッセイにおける使用に適した形態で関心対象のタンパク質を 40 産生することを特徴とし、この中で、関心対象の該タンパク質は、タンパク質タグを含ま ず、または該タンパク質は、細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子 を有するよう一貫しかつ再生可能に形成するものにおいて産生され、または該細胞は選択 的圧力の不在下で培養され、あるいはそれらの任意の組み合わせである。 【００４１】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の２つ以上のタンパク質を発現する 細胞を提供し、この中で、細胞は、関心対象のタンパク質の少なくとも１つをコードする 内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、機能的アッセイにおいて使用す るのに適した形態で関心対象のタンパク質を産生することを特徴とし、この中で、関心対 象の該タンパク質は、細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有す 50 (44) JP 2012-516687 A 2012.7.26 るよう一貫しかつ再生可能に形成するものにおいて産生され、または該細胞は、選択的圧 力の不在下で培養され、あるいはそれらの任意の組み合わせである。 【００４２】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の２つ以上のタンパク質を関心対象 のタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする導入された核酸から発現する細胞を提 供し、該細胞は、生物学的に活性となるまたはなることのできる形態で関心対象のタンパ ク質を産生することを特徴とする。 【００４３】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の２つ以上のタンパク質を発現する 細胞を提供し、この中で、細胞は、関心対象のタンパク質のうちの少なくとも１つをコー 10 ドする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、生物学的に活性となるま たはなることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生することを特徴とする。 【００４４】 いくつかの実施態様において、関心対象の２つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１ つは、二量体タンパク質である。他の実施態様において、関心対象の二量体タンパク質は 、ホモ二量体タンパク質である。他の実施態様において、関心対象の二量体タンパク質は ヘテロ二量体タンパク質である。いくつかの実施態様において、関心対象の２つ以上のタ ンパク質のうちの少なくとも１つは多量体タンパク質である。他の実施態様において、関 心対象の多量体タンパク質はホモ多量体タンパク質である。他の実施態様において、関心 対象の多量体タンパク質はヘテロ多量体タンパク質である。 20 【００４５】 実施態様のいくつかにおいて、関心対象の２つ以上のタンパク質のうちの１つは、内在 性核酸によってコードされる。他の実施態様において、関心対象の２つ以上のタンパク質 のうちの１つは、導入された核酸によってコードされる。他の実施態様において、関心対 象のタンパク質はタンパク質タグを含まない。 【００４６】 いくつかの実施態様において、関心対象の２つ以上のタンパク質のうちの１つは、イオ ンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体、（ＧＰＣＲ）、チロシン受容体キナーゼ、サイト カイン受容体、核ステロイドホルモン受容体、および免疫学的受容体からなる群から選択 される。いくつかの実施態様において、関心対象の２つ以上のタンパク質は独立して、抗 30 体または生物製剤である。他の実施態様において、関心対象のタンパク質のうちの１つは 公知のリガンドを有さない。他の実施態様において、関心対象の２つ以上のタンパク質の 機能的発現を検出する公知のアッセイはない。 【００４７】 いくつかの実施態様において、関心対象の２つ以上のタンパク質のうちの１つは、同じ 種類の細胞において発現しない。いくつかの実施態様において、２つ以上のタンパク質を 発現する細胞は哺乳類細胞である。 【００４８】 いくつかの実施態様において、２つ以上のタンパク質を発現する細胞はさらに、１を超 えるシグナル対ノイズ比、経時的に安定であること、発現を失うことなく選択的圧力をと 40 もなわない増殖、生理学的ＥＣ５０値、および生理学的ＩＣ５０値からなる群から選択さ れる追加的な所望の特性を有することを特徴とする。 【００４９】 いくつかの実施態様において、関心対象の２つ以上のタンパク質は、少なくとも１週間 、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少 なくとも３ヶ月間少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少な くとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、および少なくとも９ヶ月間から選択される期間一 貫しかつ再生可能な形態で産生される。 【００５０】 いくつかの実施態様において、機能的アッセイは、細胞ベースのアッセイ、蛍光細胞ベ 50 (45) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リポーター細胞ベースのア ッセイ、Ｇタンパク質仲介性の細胞ベースのアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞 ベースのアッセイからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、機能的アッ セイは、膜電位アッセイ、ＥＬＩＳＡ、質量分析、関心対象のタンパク質の生化学的特徴 付け、細胞増殖アッセイ、生存率アッセイ、細胞特定アッセイ、またはタンパク質産生の ための能力である。いくつかの実施態様において、２つ以上のタンパク質を発現する細胞 は、細胞ベースのハイスループットスクリーニングにおいて利用するのに適している。 【００５１】 いくつかの実施態様において、２つ以上のタンパク質を発現する細胞は、選択的圧力の 不在下で培養される。いくつかの実施態様において、選択的圧力は抗生物質である。いく 10 つかの実施態様において、細胞は、２つ以上のタンパク質を選択的圧力の不在下で少なく とも１５日間、３０日間、４５日間、６０日間、７５日間、１００日間、１２０日間、ま たは１５０日間発現する。 【００５２】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の少なくとも１つのＲＮＡを発現す る細胞を提供し、この中で、関心対象の該ＲＮＡは、導入された核酸によってコードされ 、該細胞は、機能的アッセイにおいて使用するのに適した形態で関心対象の少なくとも１ つのＲＮＡを産生することを特徴とし、この中で、関心対象の該ＲＮＡはタグを含まず、 または該ＲＮＡは、細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有する よう一貫しかつ再生可能に形成するものにおいて産生され、または該細胞は、選択的圧力 20 の不在下で培養され、あるいは、それらの任意の組み合わせである。 【００５３】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の少なくとも１つのＲＮＡを発現す る細胞を提供し、この中で、細胞は、関心対象の少なくとも１つのＲＮＡをコードする内 在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、機能的アッセイにおいて使用する のに適した形態で関心対象の少なくとも１つのＲＮＡを産生することを特徴とし、この中 で関心対象の該ＲＮＡはタグを含まず、または該ＲＮＡは、細胞が機能的アッセイにおい て少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう一貫しかつ再生可能に形成するものにおいて 産生され、または該細胞は、選択的圧力の不在下で培養され、あるいはそれらの任意の組 み合わせである。 30 【００５４】 いくつかの実施態様において、細胞は関心対象の少なくとも２つのＲＮＡを発現する。 他の実施態様において、細胞は、関心対象の少なくとも１つのＲＮＡを発現する。いくつ かの実施態様において、細胞はさらに、導入された核酸によってコードされるＲＮＡを発 現する。いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡは、イオンチャネルをコードす るＲＮＡ、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードするＲＮＡ、チロシン受容体キ ナーゼをコードするＲＮＡ、サイトカイン受容体をコードするＲＮＡ、核ステロイドホル モン受容体をコードするＲＮＡ、および免疫学的受容体をコードするＲＮＡからなる群か ら選択される。他の実施態様において、関心対象のＲＮＡは、抗体をコードするＲＮＡま たは生物製剤をコードするＲＮＡである。 40 【００５５】 いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡは、同じ種類の細胞において発現しな い。いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡを発現する細胞は哺乳類細胞である 。 【００５６】 いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡを発現する細胞はさらに、１を超える シグナル対ノイズ比、経時的に安定であること、発現を失うことなく選択的圧力をともな わない増殖、生理学的ＥＣ５０値、および生理学的ＩＣ５０値からなる群から選択される 追加的な所望の特性を有することを特徴とする。いくつかの実施態様において、関心対象 のＲＮＡは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ 50 (46) JP 2012-516687 A 2012.7.26 月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月 間、すくなくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、および少なくと も９ヶ月間から選択される期間一貫しかつ再生可能な形態で産生される。 【００５７】 いくつかの実施態様において、機能的アッセイは、細胞ベースのアッセイ、蛍光細胞ベ ースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リポーター細胞ベースのア ッセイ、Ｇタンパク質仲介性の細胞ベースのアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞 ベースのアッセイからなる群から選択される。他の実施態様において、機能的アッセイは 、膜電位アッセイ、ＥＬＩＳＡ、質量分析、関心対象のタンパク質の生化学的特徴付け、 細胞増殖アッセイ、生存率アッセイ、細胞特定アッセイ、またはタンパク質産生のための 10 能力である。 【００５８】 いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡを発現する細胞は、細胞ベースのハイ スループットスクリーニングにおける利用に適している。 【００５９】 いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書において説明される細胞から作製さ れる細胞株を提供する。 【００６０】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質を発現する細胞を作製 するための方法を提供し、この中で、細胞は、経時的に一貫する少なくとも１つの所望の 20 特性を有し、下記の工程を含む： ａ）関心対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡを発現する複数の細胞を提供する工程 ； ｂ）個々の培養容器に細胞を個々に分散させ、それにより複数の個別の細胞培養物を提 供する工程 ｃ）条件が個別の細胞培養物の各々について実質的に同一であることを特徴とする自動 細胞培養法を用いて、１セットの所望の培養条件下で細胞を培養し、その培養間に、個別 の細胞培養物あたりの細胞数を標準化し、およびこの中で、個別の培養物を同じスケジュ ールで継代する工程； ｄ）関心対象のタンパク質の少なくとも１つの所望の特徴について個別の細胞培養物を 30 少なくとも２回アッセイする工程；ならびに ｅ）両アッセイにおいて所望の特徴を有する個別の細胞培養物を同定する工程。具体的 な実施態様において、本明細書に説明された方法によって作製される細胞は、分化した細 胞である。具体的な実施態様において、本明細書で説明された方法によって作製された細 胞は、脱分化した細胞である。特定の実施態様において、脱分化した細胞は、多能性幹細 胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔ ｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅ ｌｌ）、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、臓器特異的幹細胞、および組織特異 的幹細胞からなる群から選択される幹細胞である。 【００６１】 40 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質を発現する細胞を作製 するための方法を提供し、この中で、細胞は、経時的に一貫した少なくとも１つの所望の 特性を有し、下記の工程を含む： ａ）関心対象のタンパク質をコードするＲＮＡを発現する少なくとも２つの細胞を提供 する工程； ｂ）個々の培養容器へと細胞を個々に分散させ、それにより複数の個別の細胞培養物を 提供する工程 ｃ）個別の細胞培養物の各々について条件が実質的に同一であることを特徴とする自動 細胞培養法を用いて、１セットの所望の培養条件下で細胞を培養し、その培養の間、個別 の細胞培養物あたりの細胞数を標準化し、およびこの中で、個別の培養物を同じスケジュ 50 (47) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ールで継代する工程； ｄ）関心対象のタンパク質の少なくとも１つの所望の特徴について個別の細胞培養物を 少なくとも２回アッセイする工程；ならびに ｅ）両アッセイにおいて所望の特徴を有する個別の細胞培養物を同定する工程。具体的 な実施態様において、本明細書に説明された方法によって作製される細胞は、分化した細 胞である。具体的な実施態様において、本明細書で説明された方法によって作製される細 胞は、脱分化した細胞である。特定の実施態様において、脱分化した細胞は、多能性幹細 胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔ ｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、癌幹細 胞、臓器特異的幹細胞、および組織特異的幹細胞からなる群から選択される幹細胞である 10 。 【００６２】 いくつかの実施態様において、本明細書で説明された方法の工程ａ）における複数の細 胞は、工程ｂ）において分散させる前にいくらかの期間培養される。 【００６３】 いくつかの実施態様において、本発明の方法において用いられる個々の培養容器を、多 重ウェルプレートの個々のウェルおよびバイアルからなる群から選択される。 【００６４】 いくつかの実施態様において、方法はさらに、複数の個別の細胞培養物の増殖速度を決 定する工程、およびすべての群における最速の増殖速度と最遅の増殖速度の差が工程ｂ） 20 とｃ）の間で１、２、３、４、または５時間以下であるよう、個別の細胞培養物を増殖速 度によって群分けする工程を含む。 【００６５】 いくつかの実施態様において、方法はさらに、個別の培養物の１つ以上の保存されたス トックを調製する工程を含む。いくつかの実施態様において、方法はさらに、個別の細胞 培養物の１つ以上の複製セットの工程、およびソースの個別の細胞培養物から１つ以上の 複製物セットを個別に培養する工程を含む。 【００６６】 いくつかの実施態様において、本発明の方法の工程ｄ）におけるアッセイは、タンパク 質についての機能的アッセイである。 30 【００６７】 いくつかの実施態様において、工程ｅ）において定常のままである少なくとも１つの特 徴は、タンパク質の機能である。 【００６８】 いくつかの実施態様において、本発明の方法の工程ｃ）における培養は、ロボット細胞 培養装置においてである。いくつかの実施態様において、ロボット細胞培養装置は、マル チチャネルロボットピペッターを含む。いくつかの実施態様において、マルチチャネルロ ボットピペッターは、少なくとも９６個のチャネルを含む。いくつかの実施態様において 、ロボット細胞培養装置はさらに、良品だけをつかむアームを含む。 【００６９】 40 いくつかの実施態様において、自動化法には、培地除去、培地交換、細胞洗浄、試薬添 加、細胞の除去、細胞分散、および細胞経代の１つ以上を含む。 【００７０】 いくつかの実施態様において、本発明において用いられる複数の個別の細胞培養物は少 なくとも５０個の培養物である。他の実施態様において、複数の個別の細胞培養物は少な くとも１００個の培養物である。他の実施態様において、複数の個別の細胞培養物は少な くとも５００個の培養物である。なおも他の実施態様において、複数の個別の細胞培養物 は少なくとも１０００個の培養物である。 【００７１】 いくつかの実施態様において、増殖速度は、ＡＴＰを測定すること、細胞の培養密度、 50 (48) JP 2012-516687 A 2012.7.26 光散乱、光学密度測定を測定することからなる群から選択される方法によって決定される 。いくつかの実施態様において、１つの群における最速の増殖速度と最遅の増殖速度の差 は、１、２、３、４、または５時間以下である。 【００７２】 いくつかの実施態様において、本発明の方法の工程ｃ）における培養は、少なくとも２ 日間である。 【００７３】 いくつかの実施態様において、複数の個別の細胞培養物の増殖速度は、細胞を分散させ ることおよび細胞の培養密度を測定することによって決定される。いくつかの実施態様に おいて、本発明の方法の各個別の細胞培養物における細胞は、細胞の培養密度を測定する 10 前に分散させられる。いくつかの実施態様において、分散工程は、トリプシンをウェルに 添加して、凝集塊を排除することを含む。いくつかの実施態様において、分散工程は、細 胞解離試薬をウェルに添加して、凝集塊を排除することを含む。いくつかの実施態様にお いて、複数の個別の細胞培養物の細胞の培養密度は、自動マイクロプレートリーダーを用 いて測定される。 【００７４】 いくつかの実施態様において、少なくとも２つの培養密度測定が、増殖速度を計算する 前に実施される。いくつかの実施態様において、細胞の培養密度は、自動プレートリーダ ーによって測定され、培養密度値は、増殖速度を計算するソフトウェアプログラムで用い られる。 20 【００７５】 いくつかの実施態様において、工程ｄ）における個別の細胞培養物は、脆弱性、形態、 固体表面への接着；固体表面への接着の欠失およびタンパク質機能のうちの１つ以上から 選択される所望の形質について特徴付けられる。他の実施態様において、所望の形質は、 小胞体ストレス応答、細胞の生存率、改良されたタンパク質産生についての能力、収量、 折りたたみ、アセンブリ、分泌、細胞膜への組み込み、翻訳後修飾、またはグリコシル化 、あるいはそれらの任意の組み合わせである。 【００７６】 いくつかの実施態様において、本発明の方法において用いられる細胞は、真核細胞であ る。いくつかの実施態様において、本発明の方法において用いられる真核細胞は、哺乳類 30 細胞である。いくつかの実施態様において、哺乳類細胞株は、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞、 ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ‐２９３細胞、ＨＵＶＥＣ、３Ｔ３細胞、およびＨｅＬａ細胞からな る群から選択される。別の実施態様において、哺乳類細胞株はＰｅｒｃ６である。 【００７７】 いくつかの実施態様において、本発明の方法において発現する関心対象のタンパク質は 、ヒトタンパク質である。いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は、ヘテ ロ多量体である。いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は、Ｇタンパク質 共役受容体である。他の実施態様において、タンパク質は公知のリガンドを有さない。他 の実施態様において、該タンパク質の機能的発現を検出するための公知のアッセイはない 。 40 【００７８】 いくつかの実施態様において、本発明の方法はさらに、同定する工程後に下記の工程を 含む： ａ）所望の培養条件下で工程ｅ）において同定された細胞培養の保存された一定分量を 増量する工程；および ｂ）ａ）の増量された細胞培養物が所望の特徴を有するかどうかを決定する工程。 【００７９】 いくつかの実施態様において、本発明は、クローン細胞株の対応したパネルを提供し、 この中で、クローン細胞株は同じ細胞種類であり、およびこの中でパネルにおける各細胞 株は、関心対象のタンパク質を発現し、およびこの中で、パネルにおけるクローン細胞株 50 (49) JP 2012-516687 A 2012.7.26 は、同じ生理学的特性を共有して、並行処理を可能にするよう対応している。 【００８０】 いくつかの実施態様において、本発明は、クローン細胞株の対応したパネルを提供し、 この中で、クローン細胞株は同じ細胞の種類であり、およびこの中で、パネルにおける少 なくとも２つの細胞株は、関心対象のタンパク質を発現し、およびこの中で、パネルにお けるクローン細胞株は、同じ生理学的特性を共有して、並行処理を可能にするよう対応し ている。 【００８１】 いくつかの実施態様において、本発明は、クローン細胞株の組み合わせ対応したパネル を提供し、この中で、クローン細胞株は同じ細胞の種類であり、およびこの中で、細胞株 10 のうちの少なくとも２つは、関心対象の多重サブユニットタンパク質を発現し、およびこ の中で、該クローン細胞株の各々は、関心対象の多重サブユニットタンパク質のサブユニ ットの異なる組み合わせを含み；およびこの中で、パネルのクローン細胞株は、並行して 同じ細胞培養条件下で増殖するよう対応している。 【００８２】 いくつかの実施態様において、生理学的特性は増殖速度である。他の実施態様において 、生理学的特性は、組織培養表面に対する接着である。他の実施体お湯において、生理学 的特性はＺ’因子である。他の実施態様において、生理学的特性は、関心対象のタンパク 質をコードス売るＲＮＡの発現レベルである。なおも他の実施態様において、生理学的特 性は、関心対象のタンパク質の発現レベルである。さらに他の実施態様において、生理学 20 的特性は、関心対象のタンパク質をコードするＲＮＡの活性レベルである。いくつかの実 施態様において、パネルにおけるクローン細胞株の増殖速度は、互いに１、２、３、４、 または５時間以内である。他の実施態様において、対応したパネルに用いられる培養条件 は、パネルにおけるすべてのクローン細胞株について同じである。 【００８３】 いくつかの実施態様において、対応したパネルにおいて用いられるクローン細胞株は、 真核細胞株である。いくつかの実施態様において、真核細胞株は、哺乳類細胞株である。 いくつかの実施態様において、対応したパネルにおいて用いられる細胞株細胞は、初代細 胞および不死化細胞からなる群から選択される。 【００８４】 30 いくつかの実施態様において、対応したパネルにおいて用いられる細胞株細胞は、原核 細胞または真核細胞である。いくつかの実施態様において、対応したパネルにおいて用い られる細胞株細胞は真核細胞であり、かつ真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、 藻類、甲殻類細胞、節足動物、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、および植物細胞から なる群から選択される。いくつかの実施態様において、対応したパネルにおいて用いられ る細胞株細胞は哺乳類であり、、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、ラット、有袋 類、マウス、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモットハムスターからなる群から選択さ れる。 【００８５】 いくつかの実施態様において、対応したパネルの細胞株における細胞は、関心対象のタ 40 ンパク質を発現するよう操作される。いくつかの実施態様において、対応したパネルの細 胞株における細胞は、該タンパク質をコードする、または多量体タンパク質の場合、該タ ンパク質のサブユニットをコードする導入された核酸から関心対象のタンパク質を発現す る。いくつかの実施態様において、細胞は、内在性核酸から関心対象のタンパク質を発現 し、およびこの中で、細胞は、内在性棚ｐく質の転写を活性化するよう操作され、または 多量体タンパク質の場合、タンパク質のサブユニットの転写を活性化する。 【００８６】 いくつかの実施態様において、パネルは、少なくとも４つのクローン細胞株を含む。他 の実施態様において、パネルは、少なくとも６個のクローン細胞株を含む。なおも他の実 施態様において、パネルは、少なくとも２５個のクローン細胞株を含む。 50 (50) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【００８７】 いくつかの実施態様において、パネルにおけるクローン細胞株のうちの２つ以上は、関 心対象の同じタンパク質を発現する。他の実施態様において、パネルにおけるクローン細 胞株のうちの２つ以上は、関心対象の異なるタンパク質を発現する。 【００８８】 いくつかの実施態様において、パネルにおける細胞株は、関心対象のタンパク質の異な る形態を発現し、この中で、該形態は、アイソフォーム、アミノ酸配列バリアント、スプ ライスバリアント、切断型、融合タンパク質、キメラ、またはそれらの組み合わせからな る群から選択される。他の実施態様において、該形態は、活性のある形態、修飾された形 態、グリコシル化形態、タンパク質分解形態、機能的形態、またはそれらの組み合わせか 10 らなる群から選択される。 【００８９】 いくつかの実施態様において、パネルにおける細胞株は、関心対象のタンパク質の群に おける異なるタンパク質を発現し、この中で、関心対象のタンパク質の群は、同じシグナ ル伝達経路におけるタンパク質、類似のタンパク質の発現ライブラリ、モノクローナル抗 体重鎖ライブラリ、モノクローナル抗体軽鎖ライブラリ、および一塩基多型からなる群か ら選択される。 【００９０】 いくつかの実施態様において、パネルにおいて発現した関心対象のタンパク質は、一本 鎖タンパク質である。いくつかの実施態様において、一本鎖タンパク質は、Ｇタンパク質 20 共役受容体である。いくつかの実施態様において、Ｇタンパク質共役受容体は、味覚受容 体である。いくつかの実施態様において、味覚受容体は、苦味受容体、甘味受容体、塩味 受容体、および旨味受容体からなる群から選択される。 【００９１】 他の実施態様において、パネルにおいて発現した関心対象のタンパク質は、多量体タン パク質である。いくつかの実施態様において、タンパク質は、ヘテロ二量体またはヘテロ 多量体である。 【００９２】 いくつかの実施態様において、パネルにおいて発現した関心対象のタンパク質は、イオ ンチャネル、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシン受容体キ 30 ナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体、および免疫学的受容体から なる群から選択される。他の実施態様において、パネルにおいて発現した関心対象のタン パク質は、抗体または生物製剤である。いくつかの実施態様において、対応したパネルに おいて発現したタンパク質は、上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）である。いくつかの 実施態様において、ＥＮａＣは、αサブユニット、βサブユニット、およびγサブユニッ トを含む。他の実施態様において、パネルにおける細胞株は、異なるＥＮａＣアイソフォ ームを発現する。他の実施態様において、パネルにおける細胞株は、異なるタンパク質分 解したアイソフォームのＥＮａＣを含む。いくつかの実施態様において、ＥＮａＣはヒト ＥＮａＣである。いくつかの実施態様において、対応したパネルにおいて発現したタンパ ク質は、電位開口型ナトリウムチャネル（ＮａＶ）である。いくつかの実施態様において 40 、ＮａＶは、１つのαサブユニットと２つのβサブユニットを含む。いくつかの実施態様 において、ＮａＶはヒトＮａＶである。 【００９３】 いくつかの実施態様において、対応したパネルにおいて発現したタンパク質は、γアミ ノ酪酸Ａ受容体（ＧＡＢＡＡ受容体）、γアミノ酪酸Ｂ受容体（ＧＡＢＡＢ受容体）、お よびγアミノ酪酸Ｃ受容体（ＧＡＢＡＣ受容体）からなる群から選択される。いくつかの 実施態様において、タンパク質はＧＡＢＡＡ受容体である。いくつかの実施態様において 、ＧＡＢＡＡ受容体は、２つのαサブユニット、２つのβサブユニット、および１つのγ またはδサブユニットを含む。 【００９４】 50 (51) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いくつかの実施態様において、パネルにおけるクローン細胞株は、同時にまたは互いに ４週間以内で作製される。他の実施態様において、パネルにおけるクローン細胞株は、パ ネルのクローン細胞株の単離、維持、または試験のための実質的に同一の方法を用いて作 製される。 【００９５】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の単量体タンパク質を関心対象の該 単量体タンパク質をコードする導入された核酸から発現する細胞を提供し、生物学的に活 性となるまたは活性となることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生することを特 徴とし、この中で、細胞は、選択的圧力の不在下で培養され、およびこの中でタンパク質 の発現は３ヶ月間にわたって５％超変動しない。いくつかの実施態様において、タンパク 10 質の発現は、６ヶ月間にわたって５％超変動しない。いくつかの実施態様において、関心 対象の単量体タンパク質は、公知のリガンドを有しない。 【００９６】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の単量体タンパク質を、関心対象の 該単量体タンパク質をコードする導入された核酸から発現する細胞を提供し、生物学的に 活性となるまたは活性となることのできる形態で、関心対象のタンパク質を産生すること を特徴とし、この中で、細胞は選択的圧力の不在下で培養され、およびこの中で、タンパ ク質の発現は、３ヶ月間にわたって３０％超変動しない。いくつかの実施態様において、 タンパク質の発現は、６ヶ月間にわたって３０％超変動しない。 【００９７】 20 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の少なくとも１つのＲＮＡを発現す る細胞を提供し、この中で、関心対象の該ＲＮＡは、導入された核酸によってコードされ 、生物学的に活性となるまたはなることのできる形態で関心対象のＲＮＡを産生すること を特徴とし、この中で、細胞は選択的圧力の不在下で培養され、およびこの中で、ＲＮＡ の発現は、３ヶ月間にわたって３０％超変動しない。いくつかの実施態様において、ＲＮ Ａの発現は、６ヶ月間にわたって３０％超変動しない。 【００９８】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質を発現する細胞を提供 し、この中で、関心対象の該タンパク質は、導入された核酸によってコードされ、生物学 的に活性となるまたはなることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生することを特 30 徴とし、この中で、細胞は、選択的圧力の不在下で培養され、およびこの中で、タンパク 質の発現は、３ヶ月間にわたって３０％超変動しない。いくつかの実施態様において、タ ンパク質の発現は、６ヶ月間にわたって３０％超変動しない。 【００９９】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の少なくとも１つのタンパク質を発 現する細胞を提供し、この中で、関心対象のタンパク質は公知のリガンドを有さず、また は関心対象の該タンパク質の機能的発現を検出するための公知のアッセイがなく；および この中で、関心対象の該タンパク質は、タンパク質タグを含まない。 【０１００】 いくつかの実施態様において、本発明は、下記の工程を含む関心対象のタンパク質の修 40 飾因子を同定するための方法を提供する： ａ）先に説明した細胞の実施態様のうちのいずれか１つに記載の細胞を試験化合物と接 触させる工程；および ｂ）試験化合物によって接触していない細胞におけるタンパク質の活性と比較して、試 験化合物と接触した細胞において、関心対象のタンパク質の活性における変化を検出する 工程； この中で、不在の場合と比較して存在下での活性の差を生じる化合物は、関心対象のタ ンパク質の修飾因子である。 【０１０１】 別の実施態様において、本発明は、先の段落の方法によって同定された修飾因子を提供 50 (52) JP 2012-516687 A 2012.7.26 する。 【０１０２】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の少なくとも１つのタンパク質を、 関心対象の少なくとも１つのタンパク質をコードする導入された核酸から発現する細胞を 提供し、この中で、関心対象の少なくとも１つのタンパク質は、細胞の生理学的特性を変 化させ、およびこの中で、細胞の生理学的特性は、一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわ たって２５％超変動しない。 【０１０３】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質を発現する細胞を提供 し、この中で、細胞は、関心対象のタンパク質をコードする内在性核酸の転写を活性化す 10 るよう操作され、この中で、関心対象のタンパク質は、細胞の生理学的特性を変化させ、 およびこの中で、細胞の生理学的特性は、一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわたって２ ５％超変動しない。 【０１０４】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のＲＮＡを発現する細胞を提供し、 この中で、関心対象のＲＮＡは、導入された核酸によってコードされ、この中で、関心対 象の少なくとも１つのＲＮＡは、細胞の生理学的特性を変化させ、およびこの中で、細胞 の生理学的特性は、一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわたって２５％超変動しない。 【０１０５】 関心対象の少なくとも１つのタンパク質を、関心対象の少なくとも１つのタンパク質を 20 コードする導入された核酸から発現する細胞であって、該細胞は、生理学的に活性となる またはなることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生することを特徴とし、および この中で、細胞は、１個あたり１日あたり、少なくとも５００、２，５００、５，０００ 、または１００，０００ピコグラムのタンパク質質を一貫しかつ再生可能に発現する。 【０１０６】 関心対象のタンパク質を発現する細胞であって、この中で、細胞は、関心対象のタンパ ク質をコードする内在性核酸の転写を活性化するよう操作され、該細胞は、生物学的に活 性となるまたはなることのできる形態で関心対象のタンパク質を産生することを特徴とし 、およびこの中で、細胞は、１個あたり１日あたり、少なくとも５００、２，５００、５ ，０００、または１００，０００ピコグラムを一貫しかつ再生可能に発現する。 30 【０１０７】 いくつかの実施態様において、細胞は、１週間未満、２週間未満、３週間未満、４週間 未満、１ヶ月未満、２ヶ月未満、３ヶ月未満、４ヶ月未満、５ヶ月未満、６ヶ月未満、７ ヶ月未満、８ヶ月未満、または９ヶ月未満から選択される期間で作製される。 【０１０８】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の少なくとも１つのタンパク質を関 心対象の少なくとも１つのタンパク質をコードする導入された核酸から発現する細胞を提 供し、該細胞は、生物学的に活性となるまたはなることのできる形態で関心対象のタンパ ク質を産生することを特徴とし、この中で、細胞は、７ヶ月未満、８ヶ月未満、または９ ヶ月未満から選択される期間で作製され、およびこの中で、細胞は、少なくとも０．５、 40 １．０、５．０、または１０ｇ／Ｌのタンパク質を一貫しかつ再生可能に発現する。 【０１０９】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のタンパク質を発現する細胞を提供 し、この中で、細胞は、関心対象のタンパク質をコードする内在性核酸の転写を活性化す るよう操作され、該細胞は、生物学的に活性となるまたはなることのできる形態で関心対 象のタンパク質を産生することを特徴とし、この中で、細胞は、７ヶ月未満、８ヶ月未満 、または９ヶ月未満から選択される期間で作製され、およびこの中で、細胞は、少なくと も０．５、１．０、５．０、または１０ｇ／Ｌのタンパク質を一貫しかつ再生可能に発現 する。 【０１１０】 50 (53) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いくつかの実施態様において、細胞は、３ヶ月未満、４ヶ月未満、または６ヶ月未満か ら選択される期間で作製される。いくつかの実施態様において、タンパク質は単量体タン パク質である。他の実施態様において、タンパク質は多量体タンパク質である。いくつか の実施態様において、関心対象のタンパク質は、タンパク質タグを含まないか、または該 細胞は、選択的圧力の不在下で培養鎖得るか、またはそれらの組み合わせである。いくつ かの実施態様において、関心対象の多量体タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、ま たは少なくとも６個のサブユニットを含む。いくつかの実施態様において、関心対象の多 量体タンパク質は、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、チロシン受 容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体、抗体、生物製剤、お よび免疫学的受容体からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、関心対象 10 の多量体タンパク質はイオンチャネルであり、細胞の生理学的特性は、膜電位、小胞体ス トレス応答、細胞の生存率、改良されたタンパク質産生についての能力、収量、折りたた みアセンブリ、分泌、細胞膜への組み込み、翻訳後修飾、グリコシル化、またはそれらの 任意の組み合わせから選択される。 【０１１１】 別の実施態様において、本発明は、本明細書に説明された細胞から作製される細胞株を 提供する。 【０１１２】 いくつかの実施態様において、本発明は、下記の工程を含む関心対象のタンパク質の修 飾因子を同定するための方法を提供する： 20 ａ）本明細書に説明された細胞（例えば、関心対象の少なくとも１つのタンパク質また はＲＮＡを発現する細胞）を試験化合物と接触させる工程；および ｂ）試験化合物によって接触していない細胞におけるタンパク質の活性と比較して、試 験化合物と接触した細胞における関心対象のタンパク質の活性の変化を検出する工程； この中で、不在下と比較して存在下での活性の差を生じる化合物は、関心対象のタンパ ク質の修飾因子である。 【０１１３】 いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に説明された少なくとも２つの細胞 （例えば、関心対象の少なくとも１つのタンパク質またはＲＮＡを発現する細胞）または 本明細書に説明された２つのクローン細胞株（例えば、本明細書に説明された細胞から作 30 製される細胞株）を含む細胞またはクローン細胞株の対応したパネルを提供し、この中で 、少なくとも２つの細胞または少なくとも２つのクローン細胞株は、同じ細胞培養条件下 で並行して増殖するよう対応している。 【０１１４】 いくつかの実施態様において、対応したパネルは、少なくとも１０個の細胞１０個のク ローン細胞株を含み、少なくとも１０個の細胞または１０個のクローン細胞株は、同一の 細胞培養条件下で並行して増殖するよう対応している。他の実施態様において、パネルは 、少なくとも１００個の細胞または少なくとも１００個のクローン細胞株を含み、少なく とも１００個の細胞または少なくとも１００個のクローン細胞株は、同一の細胞培養条件 下で並行して増殖する。 40 【０１１５】 いくつかの実施態様において、本発明は、クローン細胞株の対応したパネルを提供し、 この中で、クローン細胞株は、同じ種類であり、関心対象の第一および第二のタンパク質 を含み；この中で、関心対象の第一のタンパク質は、各クローン細胞株において同じであ り；この中で、関心対象の第二のタンパク質は、機能的生物学的経路の構成要素であり； およびこの中で： ａ）パネルは少なくとも５個の細胞株を含み； ｂ）パネルは６ヶ月未満で作製され； ｃ）関心対象の第一および第二のタンパク質は、タンパク質タグを有さず； ｄ）クローン細胞株は選択的圧力の不在下で培養され；または 50 (54) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｅ）ａ）∼ｄ）の任意の組み合わせ である。 【０１１６】 いくつかの実施態様において、関心対象の第一のタンパク質は抗体であり、機能的生物 学的経路は、グリコシル化経路である。 【０１１７】 いくつかの実施態様において、本発明は、インビボでの生理学的特性についてインビト ロでの相関物を生じるための方法を提供し、この中で前記方法は下記を含む： ａ）生理学的特性を有する化合物または複数の化合物を関心対象の第一のタンパク質を 発現する第一の細胞と接触させること； 10 ｂ）機能的アッセイにおいて第一のタンパク質に及ぼす化合物または複数の化合物の効 果をアッセイすること； ｃ）化合物または複数の化合物を、関心対象の第二のタンパク質を発現する第二の細胞 と接触させること； ｄ）機能的アッセイにおいて第二のタンパク質に及ぼす化合物または複数の化合物の効 果をアッセイすること； この中で、第一および第二のタンパク質は独立して、ｉ）タンパク質タグを含まず、ｉ ｉ）細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう機能的アッ セイにおいて使用するのに適した形態で一貫しかつ再生可能に産生され、ｉｉｉ）選択的 圧力の不在下で培養された細胞において発現され、ｉｖ）細胞の生理学的特性を変化させ 20 、およびこの中で、細胞の生理学的特性は、一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわたって ２５％超変動せず；ｖ）選択的圧力の不在下で培養された細胞において安定して発現され 、およびこの中で、タンパク質の発現は、３ヶ月間にわたって３０％超変動せず、ｖｉ） 別のタンパク質をさらに発現する細胞において発現され、および該細胞は選択的圧力の不 在下で培養され、またはｖｉｉ）それらの任意の組み合わせであり；およびこの中で、工 程ａ）∼ｄ）で得られた特性は、インビボでの生理学的特性についてのインビトロでの相 関物を提供する。 【０１１８】 いくつかの実施態様において、関心対象の第一および第二のタンパク質は独立して、単 量体タンパク質または多量体タンパク質から選択される。いくつかの実施態様において、 30 多量体タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブユニットを含む。い くつかの実施態様において、多量体タンパク質は、ヘテロ多量体タンパク質である。いく つかの実施態様において、関心対象の第一および第二のタンパク質は独立して、ＥＮａＣ 、ＮａＶ、ＧＡＢＡＡ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、およびＧＣＣ からなる群から選択される。 【０１１９】 いくつかの実施態様において、第一の細胞および第二の細胞は、少なくとも１つの他の 細胞をさらに含む細胞のパネル内の細胞であり；細胞のパネルにおける各細胞は、異なる タンパク質を発現するよう操作され、化合物または複数の化合物によって接触し；細胞の パネルにおける各細胞において発現した各タンパク質に及ぼす化合物または複数の化合物 40 の効果は、機能的アッセイにおいてアッセイされ；各細胞における化合物または複数の化 合物の活性特性を用いて生理学的特性についてのインビトロでの相関物を生じる。 【０１２０】 いくつかの実施態様において、各タンパク質は独立して、単量体タンパク質または多量 体タンパク質から選択される。いくつかの実施態様において、多量体タンパク質は、少な くとも２、３、４、５、または６個のサブユニットを含む。いくつかの実施態様において 、多量体タンパク質はヘテロ多量体タンパク質である。いくつかの実施態様において、各 タンパク質は独立して、ＥＮａＣ、ＮａＶ、ＧＡＢＡＡ、甘味受容体、旨味受容体、苦味 受容体、ＣＦＴＲ、およびＧＣＣからなる群から選択される。 【０１２１】 50 (55) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物の生理学的特性を推定するための 方法を提供し、この中で方法は下記を含む： ａ）試験化合物または複数の試験化合物を、先に説明した関心対象の第一のタンパク質 （例えば、インビボでの生理学的特性についてのインビトロでの相関物を生じるための方 法において説明した関心対象の第一のタンパク質）を発現する第一の細胞と接触させるこ と； ｂ）機能的アッセイにおいて第一のタンパク質に及ぼす試験かご物または複数の試験化 合物の効果をアッセイすること； ｃ）試験化合物または複数の試験化合物を、先に説明した関心対象の第二のタンパク質 （例えば、インビボでの生理学的特性についてのインビトロでの相関物を生じるための方 10 法において説明された関心対象の第二のタンパク質）を発現する第二の細胞と接触させる こと； ｄ）機能的アッセイにおいて第二のタンパク質に及ぼす試験化合物または複数の試験化 合物の効果をアッセイすること； ｅ）工程ａ）∼ｄ）において得られた化合物の活性特性を、先に説明した方法によって 生じるようなインビボでの相関物と比較すること、 【０１２２】 この中で、第一および第二のタンパク質は独立して、ｉ）タンパク質タグを含まず、ｉ ｉ）細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう、機能的ア ッセイにおいて使用するのに適した形態で一貫しかつ再生可能に産生され、ｉｉｉ）選択 20 的圧力の不在下で培養された細胞において発現され、ｉｖ）細胞の生理学的特性を変化さ せ、およびこの中で、細胞の生理学的特性を一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわたって ２５％超変動せず；ｖ）選択的圧力の不在下で培養された細胞において安定して発現し、 およびこの中で、タンパク質の発現が３ヶ月間にわたって３０％超変動せず、ｖｉ）別の タンパク質をさらに発現させる細胞において発現し、および該細胞が選択的圧力の不在下 で培養され、またはｖｉｉ）それらの任意の組み合わせであり；およびこの中で、試験化 合物または複数の試験化合物の活性特性およびインビトロでの相関物の活性特性が少なく とも９０％同一である場合、試験化合物または複数の試験化合物が、インビトロでの相関 物の生理学的特性を有すると推定される。 【０１２３】 30 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物または複数の試験化合物の生理学 的特性を確認するための方法を提供し、この中で、方法は下記を含む： ａ）試験化合物または複数の試験化合物を先に説明した関心対象の第一のタンパク質（ 例えば、インビボでの生理学的特性についてのインビトロでの相関物を生じるための方法 において説明された関心対象の第一のタンパク質）を発現する第一の細胞と接触させるこ と； ｂ）機能的アッセイにおいて第一のタンパク質に及ぼす試験化合物または複数の試験化 合物の効果をアッセイすること； ｃ）試験化合物または複数の試験化合物を先に説明した関心対象の第二のタンパク質（ 例えば、インビボでの生理学的特性についてのインビトロでの相関物を生じるための方法 40 において説明された関心対象の第二のタンパク質）を発現する第二の細胞と接触させるこ と ｄ）機能的アッセイにおいて第二のタンパク質に及ぼす試験化合物または複数の試験化 合物の効果をアッセイすること； ｅ）工程ａ）∼ｄ）において得られた試験化合物または複数の試験化合物の活性特性を 、先に説明した方法（例えば、インビボでの生理学的特性についてのインビトロでの相関 物を生じるための方法）によって生じた生理学的特性についてのインビトロでの相関物と 比較すること、 この中で、第一および第二のタンパク質は独立して、ｉ）タンパク質タグを含まず、ｉ ｉ）細胞が、機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有するよう、機能的 50 (56) JP 2012-516687 A 2012.7.26 アッセイにおいて使用するのに適した形態で一貫しかつ再生可能に産生され、ｉｉｉ）選 択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、ｉｖ）細胞の生理学的特性を変化さ せ、およびこの中で、細胞の生理学的特性は、一定の細胞培養条件下で３ヶ月間にわたっ て２５％超変動せず；ｖ）選択的圧力の不在下で培養された細胞において安定して発現し 、およびこの中で、タンパク質の発現は、３ヶ月間にわたって３０％超変動せず、ｖｉ） 別のタンパク質をさらに発現させる細胞において発現し、および該細胞は、選択的圧力の 不在下で培養され、またはｖｉｉ）それらの任意の組み合わせであり；およびこの中で、 化合物は、試験化合物または複数の試験化合物の活性特性およびインビトロでの相関物の 活性特性が少なくとも９０％同一である場合、生理学的特性を有すると確認される。 【０１２４】 10 いくつかの実施態様において、第一および第二のタンパク質は独立して、単量体タンパ ク質または多量体タンパク質から選択される。いくつかの実施態様において、多量体タン パク質は、少なくとも２、３、４、５、または少なくとも６個のサブユニットを含む。い くつかの実施態様において、多量体タンパク質は、ヘテロ多量体タンパク質である。 【０１２５】 いくつかの実施態様において、第一の細胞および第二の細胞は、少なくとも１つの他の 細胞をさらに含む細胞のパネル内の細胞であり；細胞のパネルにおける各細胞は、異なる タンパク質を発現するよう操作され、試験化合物または複数の試験化合物によって接触し ；細胞のパネルにおける各細胞において発現した関心対象の各タンパク質に及ぼす試験化 合物または複数の試験化合物の効果が機能的アッセイにおいてアッセイされ；および各細 20 胞における試験化合物または複数の試験化合物の活性特性を用いて、インビトロでの相関 物の特性と比較する。 【０１２６】 いくつかの実施態様において、関心対象の第一の多量体タンパク質および関心対象の第 二の多量体タンパク質のうちの少なくとも１つはヘテロマータンパク質である。いくつか の実施態様において、関心対象の第一のタンパク質および関心対象の第二のタンパク質の うちの少なくとも１つは二量体タンパク質である。他の実施態様において、関心対象の第 一のタンパク質および関心対象の第二のタンパク質のうちの少なくとも１つは三量体タン パク質である。いくつかの実施態様において、関心対象の第一のタンパク質および関心対 象の第二のタンパク質は、異なる形態の多量体タンパク質である。いくつかの実施態様に 30 おいて、多量体タンパク質は、ＧＡＢＡ Ａ受容体である。 【０１２７】 いくつかの実施態様において、関心対象の第一または第二のタンパク質のうちの少なく とも１つは、機能的生物学的経路の一部である。いくつかの実施態様において、機能的生 物学的経路は、グリコシル化、タンパク質合成、小胞体ストレス応答、小胞体、リボソー ム、ミトコンドリア活性、ＲＮＡ合成、翻訳後修飾、細胞シグナル伝達、細胞増殖、およ び細胞死からなる群から選択される。 【０１２８】 いくつかの実施態様において、生理学的特性は治療効果である。いくつかの実施態様に おいて、生理学的特性は有害効果である。いくつかの実施態様において、生理学的特性に 40 及ぼす化合物または複数の化合物の効果は、ハイスループットスクリーニングによってア ッセイされる。いくつかの実施態様において、先に説明した工程比較は、コンピュータシ ステムにおいて実行される。 【０１２９】 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物または複数の試験化合物の生理学 的特性を決定するためのコンピュータにより実行される方法を提供し、この中で前記方法 は下記を含む： （ａ）該試験化合物または複数の試験化合物の第一の活性特性を受信し、この中で該第 一の活性特性は、先に説明した方法によって作製され、およびこの中で、該第一の活性特 性は、該試験化合物または複数の試験化合物の生理学的特性についてのインビトロでの相 50 (57) JP 2012-516687 A 2012.7.26 関物を提供すること； （ｂ）該第一の活性特性をデータベースに保存された複数の目印活性特性（ｌａｎｄｍ ａｒｋ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ）と比較して、該第一の活性特性と該複数 の目印活性特性における各該目印活性特性の間の類似性の測定結果を決定し、この中で、 各該目印活性特性は、個々の公知の化合物または複数の公知の化合物の公知の生理学的特 性についてのインビトロでの相関物を提供すること； （ｃ）工程（ｂ）において決定された類似性の測定結果に基づいた該第一の活性特性と 最も類似の１つ以上の目印活性特性を決定すること；ならびに （ｄ）工程（ｃ）における該第一の活性特性と最も類似していると決定された１つ以上 の目印活性特性と関連した公知の生理学的特性を、該試験化合物または複数の試験化合物 10 の生理学的特性として同定すること；この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ ｄ）は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて実行される。 【０１３０】 いくつかの実施態様において、１つ以上の目印活性特性は、類似性の該測定結果が、あ らかじめ決めておいた閾値を上回る場合に、該第一の活性特性と最も類似している。 【０１３１】 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物または複数の試験化合物を特定の 生理学的特性と関連しているものとして特徴づけるためのコンピュータにより実行される 方法を提供し、この中で方法は下記を含む： （ａ）該試験化合物または複数の試験化合物の第一の活性特性を受信し、この中で、該 20 第一の活性特性は、先に説明した方法によって生じ、およびこの中で、該第一の活性特性 は、該試験化合物または複数の化合物の生理学的特性についてのインビトロでの相関物を 提供すること； （ｂ）複数の活性特性をクラスター化し、該複数は、該第一の活性特性および複数の目 印活性特性を含み、この中で、各該目印活性特性は、個々の公知の化合物または複数の公 知の化合物の公知の生理学的特性についてのインビトロでの相関物を提供すること； （ｃ）第一の活性特性でクラスター化する該複数の目印活性特性における１つ以上の目 印活性特性を同定すること；および （ｄ）工程（ｃ）において該第一の活性特性でクラスター化されたものとして同定され た１つ以上の目印活性特性に対応する個々の公知の化合物または複数の公知の化合物の該 30 公知の生理学的特性と関連しているものとして、試験化合物または複数の試験化合物を特 徴づけること； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【０１３２】 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物または複数の試験化合物を、分類 指標を用いて生理学的特性に分類するコンピュータにより実行される方法を提供し、この 中で前記方法は下記を含む： （ａ）データベースに保存された複数の目印活性特性を用いて、試験化合物または複数 の試験化合物を薬理学的特性に分類するために分類指標をトレーニングし、この中で、各 40 該目印活性特性が、個々の公知の化合物または複数の公知の化合物に関する公知の生理学 的特性についてのインビトロでの相関物を提供すること；および （ｂ）先に説明した方法によって生じた第一の活性特性を、該分類指標を用いて処理し 、該試験化合物または複数の試験化合物を生理学的特性に分類すること； この中で、工程（ａ）および（ｂ）は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて 実行される。 【０１３３】 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物または複数の試験化合物を生理学 的特性に分類指標を用いて分類するコンピュータにより実行される方法を提供し、この中 で前記方法は下記を含む： 50 (58) JP 2012-516687 A 2012.7.26 （ａ）データベースに保存された複数の目印活性特性を用いて、前記化合物または複数 の化合物を薬理学的特性に分類するために分類指標をトレーニングし、この中で、各該目 印活性特性は、個々の化合物の公知のインビボでの薬理学的特性についてのインビトロで の相関物を提供すること；および （ｂ）該分類指標を用いて、先に説明した方法によって生じた第一の活性特性を処理し て、該試験化合物または複数の試験化合物を前記生理学的特性に分類すること。 （ｃ）データベースに保存された複数の目印活性特性を用いて、試験化合物または複数 の試験化合物を生理学的特性に分類するために、該分類指標をトレーニングし、この中で 、各該目印活性特性は、個々の公知の化合物または複数の化合物の公知の生理学的特性に ついてのインビトロでの相関物を提供すること； 10 （ｄ）この中で、工程（ａ）および（ｂ）は適切にプログラムされたコンピュータにお いて実行される。 【０１３４】 いくつかの実施態様において、細胞における関心対象の多量体タンパク質の活性のある サブユニットの組み合わせを特徴づけるための方法を提供し、この中で前記方法は下記を 含む： （ａ）関心対象の前記多量体タンパク質の第一のサブユニットを発現する第一の細胞を 、試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； （ｂ）関心対象の前記多量体タンパク質の第二のサブユニットを発現する第二の細胞を 、前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； 20 （ｃ）関心対象の前記多量体タンパク質の第一のサブユニットおよび第二のサブユニッ トを発現する第三の細胞を、前記試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； （ｄ）前記多量体タンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数の試験化合物の効果を 、機能的アッセイにおいて前記多量体タンパク質が前記第一の細胞、前記第二の細胞、お よび前記第三の細胞において発現するであろう場合にアッセイすること； （ｅ）前記第一および／または第二のサブユニットが、前記生物学的に活性のある多量 体タンパク質の一部であるかどうかを推定すること、ならびに この中で、工程ａ）∼ｄ）において得られた特性が、前記インビボでの生理学的特性に ついてのインビトロでの相関物を提供し、 およびこの中で、前記多量体タンパク質の前記第一および第二のサブユニットが独立し 30 て、タンパク質タグを含まず、選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、ま たはそれらの任意の組み合わせである。 【０１３５】 いくつかの実施態様において、関心対象の多量体タンパク質はヘテロ二量体である。他 の実施態様において、関心対象の多量体タンパク質はヘテロ三量体である。 【０１３６】 いくつかの実施態様において、本発明は、細胞における関心対象の多量体タンパク質の 活性のあるサブユニットの組み合わせを特徴づけるための方法を提供することであり、こ の中で前記方法は下記を含む： （ａ）関心対象の多量体タンパク質の第一のサブユニットを発現する第一の細胞を、試 40 験化合物または複数の試験化合物と接触させること； （ｂ）関心対象の多量体タンパク質の第二のサブユニットを発現する第二の細胞を、試 験化合物または複数の試験化合物と接触させること； （ｃ）関心対象の多量体タンパク質の第三のサブユニットを発現する第三の細胞を、試 験化合物または複数の試験化合物と接触させること； （ｄ）関心対象の多量体タンパク質の第一のサブユニット、第二および第三のサブユニ ットを発現する第四の細胞を、試験化合物または複数の試験化合物と接触させること； （ｅ）前記多量体タンパク質に及ぼす前記試験化合物または複数の試験化合物の効果を 、機能的アッセイにおいて前記多量体タンパク質が前記第一の細胞、前記第二の細胞、前 記第三の細胞、および第四の細胞において発現するであろう場合にアッセイすること； 50 (59) JP 2012-516687 A 2012.7.26 （ｆ）前記第一、第二および／または第三のサブユニットが、前記生物学的に活性のあ る多量体タンパク質の一部であるかどうかを推定すること； この中で、多量体タンパク質の第一、第二、および第三のサブユニットが独立して、選 択的圧力の不在下で培養された細胞において発現する、またはそれらの任意の組み合わせ である。 【０１３７】 いくつかの実施態様において、多量体タンパク質はヘテロ三量体である。いくつかの実 施態様において、多量体タンパク質はＧＡＢＡ Ａ受容体である。 【０１３８】 いくつかの実施態様において、本発明は細胞のパネルを提供し、この中で、パネルは、 10 第一の細胞および第二の細胞を含み、この中で、第一の細胞および第二の細胞は、関心対 象の多量体タンパク質の同じサブユニットを発現するよう操作されており、この中で、第 一の細胞における関心対象の多量体タンパク質の生理学的特性は、第二の細胞における多 量体タンパク質の生理学的特性とは異なり、およびこの中で、第一の細胞および第二の細 胞は、同じ宿主細胞株に由来し；この中で、関心対象の多量体タンパク質のサブユニット は、タンパク質タグを含まず、選択的圧力の不在下で培養された細胞において発現し、ま たはそれらの任意の組み合わせである。 【０１３９】 いくつかの実施態様において、本発明は、クローン細胞株のパネルを提供し、この中で 、各細胞株は、関心対象の多量体タンパク質の同じサブユニットを発現するよう操作され 20 ており、およびこの中で、各細胞株における多量体タンパク質の生理学的特性は、パネル の他の細胞株における関心対象の多量体タンパク質の生理学的特性とは異なっており、お よびこの中で、細胞株のパネルにおける細胞株は、同じ宿主細胞株に由来し；この中で、 関心対象の多量体タンパク質のサブユニットは、タンパク質タグを含まず、選択的圧力の 不在下で培養された細胞において発現し、またはそれらの任意の組み合わせである。 【０１４０】 いくつかの実施態様において、パネルは、２つの細胞株を含む。いくつかの実施態様に おいて、パネルは、５つの細胞株を含む。いくつかの実施態様において、パネルは、１０ 個の細胞株を含む。 【０１４１】 30 いくつかの実施態様において、関心対象の多量体タンパク質はＮａＶである。 【０１４２】 いくつかの実施態様において、本発明は、機能的生物学的経路のすべての構成要素タン パク質を発現するよう操作された細胞を提供する。 【０１４３】 いくつかの実施態様において、経路は、少なくとも５つのタンパク質構成要素を有する 。いくつかの実施態様において、細胞は、選択的圧力の不在下で培養される。いくつかの 実施態様において、生物学的経路の構成要素タンパク質はタンパク質タグを含まない。 【０１４４】 いくつかの実施態様において、本発明は、複数のクローン細胞株を含むクローン細胞株 40 のパネルを提供し、この中で、複数のクローン細胞株の各クローン細胞株は、異なる匂い 受容体を発現するよう操作されており；この中で、匂い受容体は、タンパク質タグを含ま ず、または匂い受容体は、細胞が機能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を 有するよう、機能的アッセイにおいて使用するのに適した形態で一貫しかつ再生可能に産 生され、またはクローン細胞株が選択的圧力の不在下で培養され、またはそれらの任意の 組み合わせである。 【０１４５】 いくつかの実施態様において、複数のクローン細胞株は、少なくとも１０個の細胞株を 含む。いくつかの実施態様において、異なる匂い受容体は、ヒト匂い受容体または昆虫匂 い受容体である。 50 (60) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０１４６】 いくつかの実施態様において、異なるヒト匂い受容体は、ＯＲ１０Ａ１、ＯＲ１０Ａ３ 、ＯＲ１０Ａ４、ＯＲ１０Ａ５、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ１０Ａ７、ＯＲ１０Ｃ１、ＯＲ１０ Ｃ２、ＯＲ１０Ｄ４、ＯＲ１０Ｇ２、ＯＲ１０Ｇ３、ＯＲ１０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、ＯＲ １０Ｇ８、ＯＲ１０Ｇ９、ＯＲ１０Ｈ１、ＯＲ１０Ｈ２、ＯＲ１０Ｈ３、ＯＲ１０Ｈ４、 ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｊ１、ＯＲ１０Ｊ３、ＯＲ１０Ｊ５、ＯＲ１０Ｊ６、ＯＲ１０Ｋ １、ＯＲ１０Ｋ２、ＯＲ１０Ｑ１、ＯＲ１０Ｒ２、ＯＲ１０Ｓ１、ＯＲ１０Ｔ２、ＯＲ１ ０Ｖ１、ＯＲ１０Ｚ１、ＯＲ１１Ａ１、ＯＲ１１Ｇ２、ＯＲ１１Ｈ１、ＯＲ１１Ｈ４、Ｏ Ｒ１１Ｈ６、ＯＲ１１Ｈ７Ｐ、ＯＲ１１Ｌ１、ＯＲ１２Ｄ３、ＯＲ１３Ａ１、ＯＲ１３Ｃ ２、ＯＲ１３Ｃ３、ＯＲ１３Ｃ４、ＯＲ１３Ｃ５、ＯＲ１３Ｃ７、ＯＲ１３Ｃ８、ＯＲ１ 10 ３Ｃ９、ＯＲ１３Ｄ１、ＯＲ１３Ｅ２、ＯＲ１３Ｆ１、ＯＲ１３Ｇ１、ＯＲ１３Ｈ１、Ｏ Ｒ１３Ｊ１、ＯＲ１４Ａ１６、ＯＲ１４Ａ２、ＯＲ１４Ｃ３６、ＯＲ１４Ｊ１、ＯＲ１Ａ １、ＯＲ１Ａ２、ＯＲ１Ａ２、ＯＲ１Ｂ１、ＯＲ１Ｃ１、ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ１Ｄ４、ＯＲ １Ｄ５、ＯＲ１Ｅ１、ＯＲ１Ｅ２、ＯＲ１Ｅ２、ＯＲ１Ｅ５、ＯＲ１Ｅ５、ＯＲ１Ｅ６、 ＯＲ１Ｅ７、ＯＲ１Ｆ１、ＯＲ１Ｆ１０、ＯＲ１Ｆ１１、ＯＲ１Ｆ１２、ＯＲ１Ｆ２、Ｏ Ｒ１Ｇ１、ＯＲ１１１、ＯＲ１Ｊ１、ＯＲ１Ｊ２、ＯＲ１Ｊ２、ＯＲ１Ｊ４、ＯＲ１Ｊ５ 、ＯＲ１Ｋ１、ＯＲ１Ｌ１、ＯＲ１Ｌ３、ＯＲ１Ｌ４、ＯＲ１Ｌ６、ＯＲ１Ｌ８、ＯＲ１ Ｍ１、ＯＲ１Ｍ１、ＯＲ１Ｎ１、ＯＲ１Ｎ２、ＯＲ１Ｎ３、ＯＲ１Ｑ１、ＯＲ１Ｓ１、Ｏ Ｒ１Ｓ２、ＯＲ２Ａ１、ＯＲ２Ａ１０、ＯＲ２Ａ１９、ＯＲ２Ａ２０、ＯＲ２Ａ２１、Ｏ Ｒ２Ａ４、ＯＲ２Ａ４２、ＯＲ２Ａ５、ＯＲ２Ａ６、ＯＲ２Ａ７、ＯＲ２ＡＥ１、ＯＲ２ 20 ＡＪ１、ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ２Ｂ１、ＯＲ２Ｂ２、ＯＲ２Ｂ３、ＯＲ２Ｂ６、ＯＲ２Ｂ９ 、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｄ１、ＯＲ２Ｄ２、ＯＲ２Ｄ３、ＯＲ２Ｆ１、ＯＲ２Ｆ２、ＯＲ２ Ｆ３、ＯＲ２Ｇ２、ＯＲ２Ｇ３、ＯＲ２Ｈ１、ＯＲ２Ｈ２、ＯＲ２Ｈ３、ＯＲ２Ｊ２、Ｏ Ｒ２Ｊ３、ＯＲ２Ｋ１、ＯＲ２Ｋ２、ＯＲ２Ｌ１、ＯＲ２Ｌ２、ＯＲ２Ｌ３、ＯＲ２Ｌ５ 、ＯＲ２Ｌ８、ＯＲ２Ｍ１、ＯＲ２Ｍ２、ＯＲ２Ｍ４、ＯＲ２Ｓ２、ＯＲ２Ｔ１、ＯＲ２ Ｔ３、ＯＲ２Ｔ４、ＯＲ２Ｔ５、ＯＲ２Ｔ６、ＯＲ２Ｔ７、ＯＲ２Ｔ８、ＯＲ２Ｖ１、Ｏ Ｒ２Ｖ２、ＯＲ２Ｖ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｗ３、ＯＲ２Ｙ１、ＯＲ２Ｚ１、ＯＲ３Ａ１ 、ＯＲ３Ａ２、ＯＲ３Ａ３、ＯＲ３Ａ４、ＯＲ４Ａ１５、ＯＲ４Ａ１６、ＯＲ４Ａ４、Ｏ Ｒ４Ａ５、ＯＲ４Ｂ１、ＯＲ４Ｃ１２、ＯＲ４Ｃ１３、ＯＲ４Ｃ１５、ＯＲ４Ｃ１６、Ｏ Ｒ４Ｃ３、ＯＲ４Ｃ６、ＯＲ４Ｄ１、ＯＲ４Ｄ２、ＯＲ４Ｄ５、ＯＲ４Ｄ６、ＯＲ４Ｄ９ 30 、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ４Ｆ１０、ＯＲ４Ｆ１５、ＯＲ４Ｆ１６、ＯＲ４Ｆ１６、ＯＲ４Ｆ１ ７、ＯＲ４Ｆ１８、ＯＲ４Ｆ１９、ＯＲ４Ｆ３、ＯＲ４Ｆ６、ＯＲ４Ｋ１、ＯＲ４Ｋ１３ 、ＯＲ４Ｋ１４、ＯＲ４Ｋ１５、ＯＲ４Ｋ１７、ＯＲ４Ｋ２、ＯＲ４Ｋ３、ＯＲ４Ｋ５、 ＯＲ４Ｌ１、ＯＲ４Ｍ１、ＯＲ４Ｍ２、ＯＲ４Ｎ２、ＯＲ４Ｎ４、ＯＲ４Ｎ５、ＯＲ４Ｐ ４、ＯＲ４Ｑ３、ＯＲ４Ｓ１、ＯＲ４Ｘ１、ＯＲ４Ｘ２、ＯＲ５１Ａ２、ＯＲ５１Ａ４、 ＯＲ５１Ａ７、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｂ４、ＯＲ５１Ｄ１、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｅ ２、ＯＲ５１Ｆ２、ＯＲ５１Ｇ１、ＯＲ５１Ｇ２、ＯＲ５１Ｈ１、ＯＲ５１１１、ＯＲ５ １１２、ＯＲ５１Ｌ１、ＯＲ５１Ｍ１、ＯＲ５１Ｑ１、ＯＲ５１Ｓ１、ＯＲ５１Ｔ１、Ｏ Ｒ５２Ａ１、ＯＲ５２Ａ２、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ４ 、ＯＲ５２Ｂ６、ＯＲ５２Ｄ１、ＯＲ５２Ｅ２、ＯＲ５２Ｅ４、ＯＲ５２Ｅ５、ＯＲ５２ 40 Ｅ６、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｈ１、ＯＲ５２Ｉ１、ＯＲ５２Ｉ２、ＯＲ５２Ｊ３、ＯＲ ５２Ｋ１、ＯＲ５２Ｋ２、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｌ２、ＯＲ５２Ｎ１、ＯＲ５２Ｎ２、 ＯＲ５２Ｎ４、ＯＲ５２Ｎ５、ＯＲ５２Ｐ１、ＯＲ５２Ｒ１、ＯＲ５６Ａ４、ＯＲ５６Ａ ６、ＯＲ５６Ｂ２、ＯＲ５６Ｂ４、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５Ａ２、ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ５ＡＫ ２、ＯＲ５ＡＫ３、ＯＲ５ＡＮ１、ＯＲ５ＡＰ２、ＯＲ５ＡＲ１、ＯＲ５ＡＳ１、ＯＲ５ ＡＵ１、ＯＲ５ＡＵ１、ＯＲ５Ｂ１３、ＯＲ５Ｂ１６、ＯＲ５Ｂ１７、ＯＲ５Ｂ２、ＯＲ ５Ｂ３、ＯＲ５Ｃ１、ＯＲ５Ｄ１３、ＯＲ５Ｄ１４、ＯＲ５Ｄ１６、ＯＲ５Ｄ１８、ＯＲ ５Ｆ１、ＯＲ５Ｇ３、ＯＲ５Ｈ１、ＯＲ５Ｈ２、ＯＲ５Ｈ６、ＯＲ５Ｉ１、ＯＲ５Ｋ１、 ＯＲ５Ｋ２、ＯＲ５Ｌ１、ＯＲ５Ｌ２、ＯＲ５Ｍ１、ＯＲ５Ｍ１０、ＯＲ５Ｍ１１、ＯＲ ５Ｍ１１、ＯＲ５Ｍ３、ＯＲ５Ｍ３、ＯＲ５Ｍ８、ＯＲ５Ｍ９、ＯＲ５Ｐ２、ＯＲ５Ｐ３ 50 (61) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、ＯＲ５Ｔ２、ＯＲ５Ｔ３、ＯＲ５Ｖ１、ＯＲ６Ａ１、ＯＲ６Ｂ１、ＯＲ６Ｂ２、ＯＲ６ Ｃ１、ＯＲ６Ｃ２、ＯＲ６Ｃ３、ＯＲ６Ｆ１、ＯＲ６Ｊ２、ＯＲ６Ｋ３、ＯＲ６Ｋ６、Ｏ Ｒ６Ｍ１、ＯＲ６Ｎ１、ＯＲ６Ｎ２、ＯＲ６Ｐ１、ＯＲ６Ｑ１、ＯＲ６Ｓ１、ＯＲ６Ｔ１ 、ＯＲ６Ｖ１、ＯＲ６Ｘ１、ＯＲ６Ｙ１、ＯＲ７Ａ１０、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ａ２、Ｏ Ｒ７Ａ５、ＯＲ７Ｃ１、ＯＲ７Ｃ２、ＯＲ７Ｄ２、ＯＲ７Ｄ２、ＯＲ７Ｄ４Ｐ、ＯＲ７Ｅ １０２、ＯＲ７Ｅ１２０、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ７Ｇ２、ＯＲ７Ｇ３、ＯＲ８Ａ１、ＯＲ８Ｂ １２、ＯＲ８Ｂ２、ＯＲ８Ｂ３、ＯＲ８Ｂ４、ＯＲ８Ｂ８、ＯＲ８Ｄ１、ＯＲ８Ｄ２、Ｏ Ｒ８Ｄ４、ＯＲ８Ｇ１、ＯＲ８Ｇ２、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ８Ｈ２、ＯＲ８Ｈ３、ＯＲ８Ｉ２ 、ＯＲ８Ｊ１、ＯＲ８Ｊ３、ＯＲ８Ｋ１、ＯＲ８Ｋ３、ＯＲ８Ｋ５、ＯＲ９Ａ２、ＯＲ９ Ａ４、ＯＲ９Ｇ１、ＯＲ９Ｇ４、ＯＲ９Ｇ５、ＯＲ９Ｉ１、ＯＲ９Ｋ２、およびＯＲ９Ｑ 10 １からなる群から選択される。 【０１４７】 いくつかの実施態様において、異なる昆虫匂い受容体は、ＩＯＲ１００、ＩＯＲ１０１ 、ＩＯＲ１０２、ＩＯＲ１０３、ＩＯＲ１０４、ＩＯＲ１０５、ＩＯＲ１０６、ＩＯＲ１ ０７、ＩＯＲ１０８、ＩＯＲ１０９、ＩＯＲ１１０、ＩＯＲ１１１、ＩＯＲ１１２、ＩＯ Ｒ１１３、ＩＯＲ１１４、ＩＯＲ１１５、ＩＯＲ１１６、ＩＯＲ１１７、ＩＯＲ１１８、 ＩＯＲ１１９、ＩＯＲ１２０、ＩＯＲ１２１、ＩＯＲ１２２、ＩＯＲ１２３、ＩＯＲ１２ ４、ＩＯＲ１２５、ＩＯＲ１２６、ＩＯＲ１２７、ＩＯＲ４９、ＩＯＲ５０、ＩＯＲ５１ 、ＩＯＲ５２、ＩＯＲ５３、ＩＯＲ５４、ＩＯＲ５５、ＩＯＲ５６、ＩＯＲ５７、ＩＯＲ ５８、ＩＯＲ５９、ＩＯＲ６０、ＩＯＲ６１、ＩＯＲ６２、ＩＯＲ６３、ＩＯＲ６４、Ｉ 20 ＯＲ６５、ＩＯＲ６６、ＩＯＲ６７、ＩＯＲ６８、ＩＯＲ６９、ＩＯＲ７０、ＩＯＲ７１ 、ＩＯＲ７２、ＩＯＲ７３、ＩＯＲ７４、ＩＯＲ７５、ＩＯＲ７６、ＩＯＲ７７、ＩＯＲ ７８、ＩＯＲ７９、ＩＯＲ８０、ＩＯＲ８１、ＩＯＲ８２、ＩＯＲ８３、ＩＯＲ８４、Ｉ ＯＲ８５、ＩＯＲ８６、ＩＯＲ８７、ＩＯＲ８８、ＩＯＲ８９、ＩＯＲ９０、ＩＯＲ９１ 、ＩＯＲ９２、ＩＯＲ９３、ＩＯＲ９４、ＩＯＲ９５、ＩＯＲ９６、ＩＯＲ９７、ＩＯＲ ９８、ＩＯＲ９９、ＯＲＬ７０７７、ＯＲＬ７０７８、ＯＲＬ７０７９、ＯＲＬ７０８０ 、ＯＲＬ７０８１、ＯＲＬ７０８２、ＯＲＬ７０８３、ＯＲＬ７０８４、ＯＲＬ７０８５ 、ＯＲＬ７０８６、ＯＲＬ７０８７、ＯＲＬ７０８８、ＯＲＬ７０８９、ＯＲＬ７０９０ 、ＯＲＬ７０９１、ＯＲＬ７０９２、ＯＲＬ７０９３、ＯＲＬ７０９４、ＯＲＬ７０９５ 、ＯＲＬ７０９６、ＯＲＬ７０９７、ＯＲＬ７０９８、ＯＲＬ７０９９、ＯＲＬ７１００ 30 、ＯＲＬ７１０１、ＯＲＬ７１０２、ＯＲＬ７１０３、ＯＲＬ７１０４、ＯＲＬ７１０５ 、ＯＲＬ７１０６、ＯＲＬ７１０７、ＯＲＬ７１０８、ＯＲＬ７１０９、ＯＲＬ７１１０ 、ＯＲＬ７１１１、ＯＲＬ７１１２、ＯＲＬ７１１３、ＯＲＬ７１１４、ＯＲＬ７１１５ 、ＯＲＬ７１１６、ＯＲＬ７１１７、ＯＲＬ７１１８、ＯＲＬ７１１９、ＯＲＬ７１２０ 、ＯＲＬ７１２１、ＯＲＬ７１２２、ＯＲＬ７１２３、ＯＲＬ７１２４、ＯＲＬ７１２５ 、ＴＰＲ２３０７、ＴＰＲ２３０８、ＴＰＲ２３０９、ＴＰＲ２３１０、ＴＰＲ２３１２ 、ＴＰＲ２３１４、ＴＰＲ２３１５、ＴＰＲ２３１６、ＴＰＲ２３１７、ＴＰＲ２３１８ 、ＴＰＲ２３１９、ＴＰＲ２３２０、ＴＰＲ２３２１、ＴＰＲ２３２１、ＴＰＲ６９８、 ＴＰＲ６９９、ＴＰＲ７００、ＴＰＲ７０１、ＴＰＲ７０２、ＴＰＲ７０３、ＴＰＲ７０ ４、ＴＰＲ７０５、ＴＰＲ７０６、ＴＰＲ７０７、ＴＰＲ７０８、ＴＰＲ７０９、ＴＰＲ 40 ７１０、ＴＰＲ７１１、ＴＰＲ７１２、ＴＰＲ７１３、ＴＰＲ７１４、ＴＰＲ７１５、Ｔ ＰＲ７１６、ＴＰＲ７１７、ＴＰＲ７１８、ＴＰＲ７１９、ＴＰＲ７２０、ＴＰＲ７２１ 、ＴＰＲ７２２、ＴＰＲ７２３、ＴＰＲ７２４、ＴＰＲ７２５、ＴＰＲ７２５、ＴＰＲ７ ２６、ＴＰＲ７２７、ＴＰＲ７２８、ＴＰＲ７２９、ＴＰＲ７３０、ＴＰＲ７３１、ＴＰ Ｒ７３２、ＴＰＲ７３３、ＴＰＲ７３４、ＴＰＲ７３５、ＴＰＲ７３６、ＴＰＲ７３７、 ＴＰＲ７３８、ＴＰＲ７３９、ＴＰＲ７４０、ＴＰＲ７４１、ＴＰＲ７４２、ＴＰＲ７４ ３、ＴＰＲ７４４、ＴＰＲ７４５、ＴＰＲ７４６、ＴＰＲ７４７、ＴＰＲ７４８、ＴＰＲ ７４９、ＴＰＲ７５０、ＴＰＲ７５１、ＴＰＲ７５２、ＴＰＲ７５３、ＴＰＲ７５４、Ｔ ＰＲ７５５、ＴＰＲ７５６、ＴＰＲ７５７、ＴＰＲ７５８、ＴＰＲ７５９、ＴＰＲ７６０ 、ＴＰＲ７６１、ＴＰＲ７６２、ＴＰＲ７６３、ＴＰＲ７６４、ＴＰＲ７６５、ＴＰＲ７ 50 (62) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ６６、ＴＰＲ７６７、ＴＰＲ７６８、ＴＰＲ７６９、ＴＰＲ７７０、ＴＰＲ７７１、およ びＴＰＲ７７２からなる群から選択される蚊匂い受容体である。 【０１４８】 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生 じるための方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含む： ｉ．本明細書で説明されたパネル（例えば、複数のクローン細胞株を含むクローン細胞 株のパネルであり、この中で、複数のクローン細胞株の各クローン細胞株は、異なる匂い 受容体を発現するよう操作されている。）を試験化合物または組成物と接触させること； および ｉｉ．パネルにおける少なくとも２つの異なる匂い受容体の機能的アッセイにおいて活 10 性に及ぼす試験化合物または組成物の効果を測定すること、この中で、工程（ｉｉ）にお いて測定された活性は、試験化合物または組成物の匂い活性特性を提供する。 【０１４９】 いくつかの実施態様において、本発明は、第一の試験化合物または組成物の匂いを模倣 する第二の試験化合物を同定するための方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含む ： ｉ．本明細書で説明されたパネル（例えば、複数のクローン細胞株を含むクローン細胞 株のパネルであり、この中で、複数のクローン細胞株の各クローン細胞株は、異なる匂い 受容体を発現するよう操作されている。）を第二の試験化合物と接触させること； ｉｉ．パネルにおける少なくとも２つの匂い受容体の機能的アッセイにおいて活性に及 20 ぼす第二の試験化合物の効果を試験すること； ｉｉｉ．工程（ｉｉ）において得られた第二の試験化合物の匂い活性特性を、第一の試 験化合物または組成物の匂い活性特性と比較すること；この中で、第二の試験化合物の匂 い活性特性が、第一の試験化合物または組成物の匂い活性特性と類似している場合、第二 の試験化合物が第一の試験化合物または組成物の匂いを模倣する。 【０１５０】 いくつかの実施態様において、本発明は、第一の試験化合物または組成物の匂い活性特 性を修飾する第二の試験化合物を同定する方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含 む： ｉ．本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生 30 じるための方法）に従って、第一の試験化合物または組成物の存在下で、第二の試験化合 物の匂い活性特性を生じること； ｉｉ．第二の試験化合物の不在下で、工程（ｉ）で得られた匂い活性特性を、第一の試 験化合物または組成物の匂い活性特性と比較すること；この中で、第一の試験化合物また は組成物の匂い活性特性が、第一の試験化合物または組成物の存在下で第二の試験化合物 の匂い活性特性とは異なる場合、第一の試験化合物または組成物の匂い活性特性を修飾す る。 【０１５１】 いくつかの実施態様において、本発明は、試験化合物と関連した匂いを同定するための コンピュータにより実行される方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含む： 40 （ａ）試験化合物の第一の匂い活性特性を受信し、この中で、該第一の匂い活性特性は 、本明細書で説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生じる ための方法）によって生じる。 （ｂ）該第一の匂い活性特性をデータベースに保存された複数の目印匂い活性特性と比 較して、該第一の匂い活性特性および各複数の目印匂い活性特性における各該目印匂い活 性特性の間の類似性の測定結果を決定すること、この中で、各該目印匂い活性特性は、公 知の匂いを有する個々の公知の化合物に対応し、およびこの中で、各該目印匂い活性特性 は、本明細書で説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生じ るための方法）によって生じる； （ｃ）工程（ｂ）において決定された類似性の測定結果に基づいて該第一の匂い活性特 50 (63) JP 2012-516687 A 2012.7.26 性に最も類似した１つ以上の目印匂い活性特性を決定すること；ならびに （ｄ）工程（ｃ）において該第一の匂い活性特性と最も類似していると決定された１つ 以上の目印匂い活性特性と関連した匂いを、該公知の化合物と関連した匂いとして同定す ること； この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【０１５２】 いくつかの実施態様において、類似性の該測定結果があらかじめ決めておいた閾値を上 回る場合、１つ以上の目印匂い活性特性は、該第一の匂い活性特性と最も類似している。 【０１５３】 10 いくつかの実施態様において、本発明は、化合物を特定の匂いと関連しているものとし て特徴づけるためのコンピュータにより実行される方法を提供し、この中で、前記方法は 下記を含む： （ａ）該化合物の第一の匂い活性特性を受信すること、この中で、該第一の匂い活性特 性は、本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生 じるための方法）によって生じ； （ｂ）複数の匂い活性特性をクラスター化し、該複数は、該第一の匂い活性特性および 複数の目印匂い活性特性を含み、この中で、各該目印匂い活性特性は、公知の匂いを有す る個々の公知の化合物に対応し、およびこの中で、各該目印匂い活性特性は、本明細書に 説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生じるための方法） 20 によって生じ； （ｃ）第一の匂い活性特性でクラスター化する該複数の目印匂い活性特性における１つ 以上の目印匂い活性特性を同定すること；ならびに （ｄ）工程（ｃ）において該第一の匂い活性特性を用いてクラスター化したものとして 同定された１つ以上の目印匂い活性特性に対応する個々の化合物と関連した該公知の匂い と関連しているものとして化合物を特徴づけること； 【０１５４】 この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【０１５５】 30 いくつかの実施態様において、本発明は、分類指標を用いて匂いを有するものとして試 験化合物を分類するコンピュータにより実行される方法を提供し、この中で、前記方法は 下記を含む： 【０１５６】 （ａ）データベースに保存された複数の目印匂い活性特性を用いて、試験化合物を匂い に分類するための分類指標をトレーニングすること、この中で、各該目印匂い活性特性は 、公知の匂いを有する個々の公知の化合物に対応し、およびこの中で、各該目印匂い活性 特性は、本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を 生じるための方法）によって生じ；ならびに 【０１５７】 40 （ｂ）本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を 生じるための方法）によって生じた該化合物の第一の匂い活性特性を該分類指標を用いて 処理して、該化合物を公知の匂いに分類すること； 【０１５８】 この中で、工程（ａ）および（ｂ）は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて 実行される。 【０１５９】 いくつかの実施態様において、本発明は、分類指標を用いて試験化合物を匂いを有する ものとして分類するコンピュータにより実行される方法を提供し、この中で、前記方法は 下記を含む： 50 (64) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０１６０】 本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性）によっ て生じた該化合物の第一の匂い活性特性を、該分類指標を用いて処理して、該試験化合物 を公知の匂いに分類すること、この中で、該分類指標は下記を含む方法に従ってトレーニ ングされる： 【０１６１】 データベースに保存された複数の目印匂い活性特性を用いて、試験化合物を匂いに分類 するための分類指標をトレーニングし、この中で、各目印匂い活性特性は、公知の匂いを 有する個々の公知の化合物に対応し、およびこの中で、各該目印匂い活性特性は、本明細 書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生じるための方 10 法）によって生じ； 【０１６２】 この中で、処理は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて実行される。 【０１６３】 いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上の試験化合物を匂いと関連付けるた めのコンピュータにより実行される方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含む： 【０１６４】 （ａ）第一の試験化合物の第一の匂い活性特性を受信すること、この中で、第一の匂い 活性特性は、本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特 性を生じるための方法）によって生じ、およびこの中で該第一の試験化合物は公知の匂い 20 を有し； 【０１６５】 （ｂ）該第一の匂い活性特性をデータベースに保存された複数の目印匂い活性特性と比 較して、該第一の匂い活性特性と、該複数の目印匂い活性特性における各該目印匂い活性 特性の間の類似性の測定結果を決定すること、この中で、各該目印匂い活性特性は、個々 の公知の化合物に対応し、およびこの中で、各該目印匂い活性特性は、本明細書に説明さ れた方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生じるための方法）によっ て生じ； 【０１６６】 （ｃ）工程（ｂ）において決定された類似性の測定結果に基づいた該第一の匂い活性特 30 性と最も類似した１つ以上の目印匂い活性特性を決定すること；ならびに 【０１６７】 （ｄ）工程（ｃ）において該第一の匂い活性特性と最も類似していると決定された１つ 以上の目印匂い活性特性に対応する個々の試験化合物を、該公知の匂いと関連しているも のとして特徴づけること； 【０１６８】 この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は、適切にプログラムされたコ ンピュータにおいて実行される。 【０１６９】 いくつかの実施態様において、１つ以上の目印匂い活性特性は、類似性の該測定結果が 40 あらかじめ決めておいた閾値を上回る場合、該第一の匂い活性特性に最も類似している。 【０１７０】 いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上の試験化合物を、特定の匂いと関連 しているものとして特徴づけるためのコンピュータにより実行される方法を提供し、この 中で、前記方法は下記を含む： （ａ）第一の試験化合物の第一の匂い活性特性を受信すること、この中で、該第一の匂 い活性特性は、本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性 特性を生じるための方法）によって生じ、およびこの中で、該第一の試験化合物は公知の 匂いを有し； （ｂ）複数の匂い活性特性をクラスター化し、該複数は、該第一の匂い活性特性および 50 (65) JP 2012-516687 A 2012.7.26 複数の目印匂い活性特性を含むこと、この中で、各該目印匂い活性特性は、個々の公知の 化合物に対応し、およびこの中で、各該目印匂い活性特性は、本明細書に説明された方法 （例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生じるための方法）によって生じ； （ｃ）第一の匂い活性特性でクラスター化する該複数の目印匂い活性特性における１つ 以上の目印匂い活性特性を同定すること；ならびに （ｄ）工程（ｃ）において該第一の匂い活性特性でクラスター化されたものとして同定 される１つ以上の目印匂い活性特性に対応する個々の化合物を、該公知の匂いと関連して いるものとして特徴づけること；この中で、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ） は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて実行される。 【０１７１】 10 いくつかの実施態様において、本発明は、１つ以上の試験化合物を、匂いを有するもの として分類指標を用いて分類するコンピュータにより実行される方法を提供し、この中で 、前記方法は下記を含む： 本明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性をを生じ るための方法）によって生じた第一の匂い活性特性を、該分類指標を用いて処理して（こ の中で、該第一の匂い活性特性は、公知の匂いを有する第一の試験化合物に対応する。） 、データベースに保存された複数の目印匂い活性特性の１つ以上の目印匂い活性特性を、 該公知の匂いを有するものとして分類すること、この中で、該分類指標は、下記を含む方 法に従ってトレーニングされる： 該１つ以上の目印匂い活性特性を、匂いを有するものとして分類するために該複数の目 20 印匂い活性特性を用いて該分類指標をトレーニングすること、この中で、各該目印匂い活 性特性は、個々の公知の化合物に対応し、およびこの中で、各該目印匂い活性特性は、本 明細書に説明された方法（例えば、試験化合物または組成物の匂い活性特性を生じるため の方法）によって生じ； この中で、処理は、適切にプログラムされたコンピュータにおいて実行される。 【０１７２】 いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲ ＮＡである。いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は、少なくとも２、３ 、４、５、または６個のサブユニットを含む。 【０１７３】 30 いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は、ＢＲＳ３、ＧＰＲ４２Ｐ、Ｆ ＰＲＬ２、ＧＰＲ８１、ＯＰＮ３、ＧＰＲ５２、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ７８、ＧＰＲ２６、 ＧＰＲ３７、ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ６３、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ８３、ＧＲＣＡｅ、ＧＰ Ｒ１５３、Ｐ２ＲＹ５、Ｐ２ＲＹ１０、ＧＰＲ１７４、ＧＰＲ１４２、ＧＰＲ１３９、Ａ ＤＭＲ、ＣＭＫＯＲ１、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＧＰＲ８５、ＧＰＲ２７、ＧＰ Ｒ１７３、ＣＣＲＬ２、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＰＲＥ、ＭＲＧＰＲＦ、ＭＲＧＰ ＲＧ、ＭＲＧＸ３ｅ、ＭＲＧＸ４ｅ、ＧＰＲ５０、ＧＰＲ８７、ＴＲＡＲ３ｆ、ＴＲＡＲ ４、ＴＲＡＲ５、ＰＮＲｅ、ＧＰＲ５７ｇ、ＧＰＲ５８、ＥＢＩ２、ＧＰＲ１６０、ＧＰ Ｒｅ、ＧＰＲ１、ＧＰＲ１０１、ＧＰＲ１３５、ＯＰＮ５、ＧＰＲ１４１、ＧＰＲ１４６ 、ＧＰＲ１４８、ＧＰＲ１４９、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１５０、ＧＰＲ１５２、ＧＰＲ１６ 40 １、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１７１、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２２、Ｇ ＰＲ２５、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３３、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ６１ 、ＧＰＲ６２、ＧＰＲ７９ｈ、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ８４、ＧＰＲ８８、ＧＰＲ９２、Ｐ２ ＲＹ８、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ６４、ＧＰＲ５６、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１１４、ＢＡＭ、 ＢＡＩ２、ＢＡＩ３、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＬＳＲ３、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２ 、ＧＰＲ９７、ＧＰＲ１１０、ＧＰＲ１１１、ＧＰＲ１１２、ＧＰＲ１１３、ＧＰＲ１１ ６、ＭＡＳＳ１、ＥＬＴＤ１、ＧＰＲ１２３、ＧＰＲ１２４、ＧＰＲ１２５、ＧＰＲ１２ ６、ＧＰＲ１２８、ＧＰＲ１４４、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４ｂ、ＣＤ９７、ＬＰＨＮ２、ＬＰ ＨＮ３、ＬＰＨＮ１、ＧＰＲ１５７、ＧＰＲ５１、ＧＰＲ１５６、ＧＰＲＣ６Ａ、ＧＰＲ Ｃ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ１５８、およびＧＰＲ１５ 50 (66) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ８Ｌ１からなる群から選択される表８に示されるＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌに よって同定されたオーファン受容体である。 【０１７４】 いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質の少なくとも１つのサブユニット は、遺伝子活性化によって発現する。他の実施態様において、関心対象のタンパク質の少 なくとも１つのサブユニットは、導入された核酸から発現する。 【０１７５】 いくつかの実施態様において、本発明は、細胞株を作製するための方法を提供し、この 中で、方法は、同じ培養条件下で複数の並行培養物において複数の細胞株を培養すること 、および経時的に一貫したままである少なくとも１つの特性を有する細胞株を同定するこ 10 とを含む。 【０１７６】 いくつかの実施態様において、複数の並行培養物は、少なくとも５０個の細胞培養物を 含む。他の実施態様において、複数の並行培養物は、少なくとも１００個の細胞培養物を 含む。なおも他の実施態様において、複数の並行培養物は、少なくとも２００個の細胞培 養物を含む。 【０１７７】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のインビボでのタンパク質または関 心対象の複数のタンパク質についてのインビトロでの相関物であるタンパク質または複数 のタンパク質を提供し、この中で、インビトロでの相関物は、インビボで発現した対応す 20 るタンパク質または複数のタンパク質の機能または活性を予測し；この中で、インビトロ での相関物は、インビトロでの非生理学的条件下で発現した生物学的に活性のあるタンパ ク質または複数のタンパク質であり；この中で、インビトロでの相関物は、インビボでの タンパク質または関心対象の複数のタンパク質に対応する少なくとも１つの機能的または 薬理学的または生理学的特性を含み；およびこの中で、該インビトロでの相関物を用いた ハイスループットスクリーニングにおいて同定される化合物の少なくとも１０％は、イン ビボでの治療効果を有することができる。 【０１７８】 いくつかの実施態様において、インビトロでの相関物は、少なくとも２、３、４、５、 または６個のサブユニットを含む。いくつかの実施態様において、インビトロでの相関物 30 のうちの少なくとも１つのタンパク質は、少なくとも２、３、４、５、または６個のサブ ユニットを含む。いくつかの実施態様において、インビトロでの相関物はヘテロ多量体を 含む。いくつかの実施態様において、インビトロでの相関物の少なくとも１つのタンパク 質はヘテロ多量体を含む。いくつかの実施態様において、インビトロでの相関物のタンパ ク質または複数のタンパク質は、タンパク質タグを含まない。 【０１７９】 いくつかの実施態様において、インビトロでの相関物は、選択的圧力の不在下で培養さ れた細胞において安定して発現する。いくつかの実施態様において、インビトロでの相関 物は、細胞毒性を生じることなく細胞株において発現する。いくつかの実施態様において 、インビトロでの相関物は、タンパク質または複数のタンパク質を内在的に発現しない細 40 胞において発現する。 【０１８０】 いくつかの実施態様において、タンパク質または複数のタンパク質は、本発明の細胞に よって産生され得る。 【０１８１】 いくつかの実施態様において、本発明は、先に説明したタンパク質または複数のタンパ ク質を発現する細胞を提供する。 【０１８２】 いくつかの実施態様において、本発明は、先に説明したタンパク質または複数のタンパ ク質を発現する細胞から作製された細胞株を提供する。 50 (67) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０１８３】 いくつかの実施態様において、本発明は、下記の工程を含む関心対象のインビボでのタ ンパク質の修飾因子を同定するための方法を提供する ａ）先に説明したタンパク質または複数のタンパク質を発現する細胞を試験化合物と接 触させる工程；および ｂ）試験化合物によって接触していない細胞におけるインビトロの相関物のタンパク質 または複数のタンパク質の活性と比較して、試験化合物と接触した細胞におけるインビト ロでの相関物のタンパク質または複数のタンパク質の活性の変化を検出する工程； この中で、不在下と比較して存在下での活性の差を生じる化合物は、関心対象のインビ ボでのタンパク質の修飾因子である。 10 【０１８４】 いくつかの実施態様において、本発明は、先の段落において説明した方法によって同定 される修飾因子を提供する。 【０１８５】 いくつかの実施態様において、先の段落のいずれか１つに説明した細胞は、分化した細 胞である。いくつかの実施態様において、先の段落のいずれか１つに説明した細胞は、脱 分化した細胞である。さらなる実施態様において、脱分化した細胞は、多能性幹細胞（ｍ ｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ） 、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、臓器特異的幹細胞、および組織特異的幹細 20 胞からなる群から選択される幹細胞である。 【０１８６】 具体的な実施態様において、本発明は、分化した細胞を幹細胞へと脱分化させる工程を 含む幹細胞を作製するための方法を提供し、この中で、分化した細胞は、本明細書に説明 された細胞または本明細書に説明した方法によって作製された細胞である。特定の実施態 様において、幹細胞は、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ） 、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能性幹細胞、人工 多能性幹細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、臓器特異的幹細胞、および組織特異的幹細胞から なる群から選択される。 【０１８７】 30 ある実施態様において、本発明は、下記の工程を含む再分化した細胞を作製するための 方法を提供する： ａ）先の段落のいずれか１つにおいて説明された細胞または本明細書に説明された方法 によって作製された細胞を、本明細書に説明された方法によって脱分化させ、幹細胞を作 製する工程；および ｂ）幹細胞を再分化させて、再分化した細胞を作製する工程。 特定の実施態様において、幹細胞は、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅ ｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、全能 性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、癌幹細胞、臓器特異的幹細胞、および組織特 異的幹細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、再分化した細胞は、脱分 40 化をしなかった分化した細胞とは異なる種類である。 【０１８８】 ある実施態様において、本発明は、下記の工程を含む非ヒト臓器を作製するための方法 を提供する： ａ）本明細書に説明された分化した細胞または本明細書に説明された方法によって作製 された分化した細胞を脱分化させて、幹細胞を作製する工程、この中で、幹細胞は、胚性 幹細胞または人工多能性化細胞であり；および ｂ）幹細胞を再分化させて、非ヒト臓器を作製する工程。このような方法の特定の実施 態様において、臓器は哺乳類である。このような方法の他の特定の実施態様において、哺 乳類はマウスである。 50 (68) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０１８９】 他の態様において、本発明は、本明細書に説明された方法によって作製された再分化し た細胞を提供する。 【０１９０】 ある態様において、本発明は、本明細書に説明された方法によって作製された非ヒト臓 器を提供する。このような方法のある実施態様において、臓器は哺乳類である。このよう な方法の特定の実施態様において、哺乳類はマウスである。 【０１９１】 具体的な実施態様において、少なくとも１つの甘味受容体サブユニットは、宿主細胞へ と導入されたサブユニットをコードする核酸から発現する。他の具体的な実施態様におい 10 て、少なくとも１つの甘味受容体サブユニットは、遺伝子活性化によって宿主細胞に存在 する核酸から発現する。他の具体的な実施態様において、宿主細胞は：ａ）真核細胞であ り；ｂ）哺乳類細胞であり；ｃ）甘味受容体の少なくとも１つのサブユニット 【０１９２】 ある態様において、甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユ ニットを含む甘味受容体を安定して発現する細胞または細胞株が本明細書に提供され、前 記サブユニットのうちの少なくとも１つの発現は、サブユニットをコードする核酸を宿主 細胞へ導入すること、または宿主細胞、宿主細胞から派生した細胞または細胞株において 既に存在するサブユニットをコードする核酸の遺伝子活性化から結果として生じる。任意 に、細胞または細胞株はまた、Ｇタンパク質を産生するよう操作され得る。 20 【０１９３】 具体的な実施態様において、少なくとも１つの甘味受容体サブユニットは、宿主細胞へ と導入されるサブユニットをコードする核酸から発現する。他の具体的な実施態様におい て、少なくとも１つの甘味受容体サブユニットは、遺伝子活性化によって宿主細胞におい て存在する核酸から発現する。他の具体的な実施態様において、宿主細胞は：ａ）真核細 胞であり；ｂ）哺乳類細胞であり；ｃ）甘味受容体の少なくとも１つのサブユニットまた はＧタンパク質を内在的に発現せず；あるいはｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意 の組み合わせである。他の具体的な実施態様において、宿主細胞は、ＨＥＫ‐２９３細胞 である。他の具体的な実施態様において、甘味受容体は、ａ）哺乳類であり；ｂ）ヒトで あり；ｃ）異なる種由来のサブユニットを含み；ｄ）キメラである１つ以上のサブユニッ 30 トを含み；またはｅ）（ａ）∼（ｄ）の任意の組み合わせである。他の具体的な実施態様 において、甘味受容体は機能的である。他の具体的な実施態様において、本明細書に説明 された細胞または細胞株は、アッセイにおいて少なくとも０．３のＺ’値を有する。他の 具体的な実施態様において、本明細書に説明された細胞または細胞株は、アッセイにおい て少なくとも０．７のＺ’値を有する。他の具体的な実施態様において、本明細書に説明 された細胞または細胞株は、選択的圧力の不在下で培地において甘味受容体を安定して発 現する。他の具体的な実施態様において、甘味Ｔ１Ｒ２受容体サブユニットは、下記から なる群から選択される： ａ）配列番号３４のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む甘味受容 体サブユニット； 40 ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列と少なくとも８ ５％同一であるアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット； ｃ）配列番号３１とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸、または配 列番号３４のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によって コードされるアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット；および ｄ）配列番号３１と少なくとも８５％同一である核酸または配列番号３４のアミノ酸も しくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配 列を含む甘味受容体サブユニット。 【０１９４】 特定の実施態様において、本明細書に説明された細胞または細胞株の甘味受容体サブユ 50 (69) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ニットＴ１Ｒ２は、下記からなる群から選択される核酸によってコードされる： ａ）配列番号３１を含む核酸： ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプ チドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および ｄ）配列番号３１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、または 配列番号３４のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。他の 特定の実施態様において、甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３は、下記からなる群から選択 される： 10 ｅ）配列番号３５のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む甘味受容 体サブユニット； ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別 の種の対応物のアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット； ｇ）ストリンジェントな条件下で配列番号３２とハイブリッド形成する核酸または配列 番号３５のアミノ酸配列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によっ てコードされるアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット；および ｈ）配列番号３２と少なくとも８５％同一である核酸または配列番号３５のアミノ酸配 列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ 酸配列を含む甘味受容体サブユニット。 20 【０１９５】 他の特定の実施態様において、甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットは、下記からなる群か ら選択される核酸によってコードされる： ａ）配列番号３２を含む核酸； ｂ）配列番号３５のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプチド をコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および ｄ）配列番号３２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸または配 列番号３５のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。 30 【０１９６】 他の特定の実施態様において、Ｇタンパク質は、下記からなる群から選択される： ａ）配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を 含むＧタンパク質； ｂ）配列番号３６もしくは３７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別の 種の対応物のアミノ酸配列を含むＧタンパク質； ｃ）配列番号３３とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸あるいは配 列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核 酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質；および ｄ）配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列あるいは配列番号３６もしく 40 は３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコード されるアミノ酸配列を含むＧタンパク質。 【０１９７】 他の特定の実施態様において、Ｇタンパク質は、下記からなる群から選択される核酸に よってコードされる： ａ）配列番号３３を含む核酸； ｂ）配列番号３６もしくは３７のポリペプチドまたは別の種の対応物のアミノ酸配列を コードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ）ａ）またはｂ）の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌ クレオチド配列を含む核酸および； 50 (70) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｄ）配列番号３３と少なくとも９５％配列同一であるヌクレオチド配列を含む核酸ある いは配列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコード する核酸配列。 【０１９８】 ある態様において、旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットおよび旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユ ニットを含む旨味受容体を安定して発現する細胞または細胞株が本明細書に提供され、サ ブユニットのうちの少なくとも１つの発現は、サブユニットをコードする核酸の宿主細胞 への導入または宿主細胞に既に存在するサブユニットをコードする核酸の遺伝子活性化か ら結果として生じ、細胞または細胞株は宿主細胞に由来する。任意に、細胞または細胞株 はまた、Ｇタンパク質を産生するよう操作され得る。 10 【０１９９】 具体的な実施態様において、少なくとも１つの旨味受容体サブユニットは、宿主細胞に 導入された該サブユニットをコードする核酸から発現する。他の具体的な実施態様におい て、少なくとも１つの旨味受容体サブユニットは、遺伝子活性化によって宿主細胞に存在 する核酸から発現する。他の具体的な実施態様において、宿主細胞は：ａ）真核細胞であ り；ｂ）哺乳類細胞であり；ｃ）旨味受容体の少なくとも１つのサブユニットまたはＧタ ンパク質を内在的に発現せず；またはｄ）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の任意の組み合 わせである。他の具体的な実施態様において、宿主細胞はＨＥＫ‐２９３細胞である。他 の具体的な実施態様において、旨味受容体はａ）哺乳類であり；ｂ）ヒトであり；ｃ）異 なる種由来のサブユニットを含み；ｄ）キメラである１つ以上のサブユニットを含み；ま 20 たはｅ）（ａ）∼（ｄ）の任意の組み合わせである。他の具体的な実施態様において、旨 味受容体は機能的である。他の具体的な実施態様において、本明細書に説明された細胞ま たは細胞株は、アッセイにおいて少なくとも０．３のＺ’値を有する。他の具体的な実施 態様において、本明細書に説明された細胞または細胞株は、アッセイにおいて少なくとも ０．７のＺ’値を有する。他の具体的な実施態様において、本明細書に説明された細胞ま たは細胞株は、選択的圧力の不在下で培地において旨味受容体を安定して発現する。他の 具体的な実施態様において、旨味Ｔ１Ｒ１受容体サブユニットは、下記からなる群から選 択される： ａ）配列番号４２∼４５のいずれか１つのアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ 酸配列を含む旨味受容体サブユニット； 30 ｂ）配列番号４２∼４５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である アミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニット； ｃ）配列番号４１とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸あるいは配 列番号４２∼４５のいずれか１つのアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコー ドする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニット；および ｄ）配列番号４１と少なくとも８５％同一である核酸あるいは、配列番号４２∼４５の いずれか１つのアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によって コードされるアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニット。 【０２００】 特定の実施態様において、本明細書に説明された細胞または細胞株の旨味受容体サブユ 40 ニットＴ１Ｒ１は、下記からなる群から選択される核酸によってコードされる： ａ）配列番号４１を含む核酸： ｂ）配列番号４２∼４５のいずれか１つのアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ 酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および ｄ）配列番号３１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、あるい は配列番号３４のアミノ酸あんたは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。他 の特定の実施態様において、旨味受容体サブユニットＴ１Ｒ３は、下記からなる群から選 択される： 50 (71) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｅ）配列番号３５のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む旨味受容 体サブユニット； ｆ）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別 の種の対応物のアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニット； ｇ）配列番号３２とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸または配列 番号３５のアミノ酸配列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によっ てコードされるアミノ酸配列を含む旨味受容体サブユニット；および ｈ）配列番号３２と少なくとも８５％同一である核酸または配列番号３５のアミノ酸配 列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ 酸配列を含む旨味受容体サブユニット。 10 【０２０１】 他の特定の実施態様において、旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットは、下記からなる群か ら選択される核酸によってコードされる： ａ）配列番号３２を含む核酸； ｂ）配列番号３５のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプチド をコードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレ オチド配列を含む核酸；および ｄ）配列番号３２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸または配 列番号３５のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。 20 【０２０２】 他の特定の実施態様において、Ｇタンパク質は下記からなる群から選択される： ａ）配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を 含むＧタンパク質； ｂ）配列番号３６もしくは３７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別の 種の対応物のアミノ酸配列を含むＧタンパク質； ｃ）配列番号３３とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸あるいは配 列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核 酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質；および ｄ）配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列あるいは、配列番号３６もし 30 くは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコー ドされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質。 【０２０３】 他の特定の実施態様において、Ｇタンパク質は、下記からなる群から選択される核酸に よってコードされる： ａ）配列番号３３を含む核酸； ｂ）配列番号３６もしくは３７のポリペプチドまたは別の種の対応物のアミノ酸配列を コードするヌクレオチド配列を含む核酸； ｃ）ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸配列とハイブリッド形成するヌ クレオチド配列を含む核酸および； 40 ｄ）配列番号３３と少なくとも９５％配列同一であるヌクレオチド配列を含む核酸ある いは、配列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコー ドするヌクレオチド配列。 【０２０４】 一実施態様において、本発明の細胞および細胞株は、機能的でありかつ生理学的に関連 性のある旨味受容体または甘味受容体を産生する。前記細胞および細胞株は従って、旨味 状態または甘味受容体の修飾因子を同定し選択するのに有用である。 【０２０５】 別の実施態様において、本発明の細胞および細胞株は、１∼４週間、１∼９ヶ月間、ま たはそれらの間の任意の時間かけて、旨味受容体または甘味受容体を安定して発現する。 50 (72) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０２０６】 別の実施態様において、本発明の細胞および細胞株は、１∼４週間、１∼９ヶ月間、ま たはそれらの間の任意の時間かけて、実質的に同じレベルで旨味受容体または甘味受容体 を発現する。 【０２０７】 特定の実施態様において、発現レベルは、機能的アッセイを用いて測定される。 【０２０８】 他の実施態様において、本発明は、本発明の細胞および細胞株を用いて同定された旨味 受容体または甘味受容体の修飾因子、ならびに食品および医薬品を含めた製品の味覚を修 飾する上での、または糖尿病および肥満を含めた、旨味受容体もしくは甘味受容体が関係 10 する疾患を治療する上での該修飾因子の使用に関する。 【０２０９】 ある実施態様において、下記の工程を含む本明細書に説明された細胞または細胞株（例 えば、甘味受容体を安定して発現する細胞または細胞株）を作製するための方法が本明細 書に提供される： ａ）甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットをコードする核酸を含む第一のベクター、甘味受 容体Ｔ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸を含む第二のベクター、および任意にＧタン パク質をコードする核酸を含む第三のベクターを宿主細胞へ導入する工程； ｂ）甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットの発現を検出する第一の分子ビーコン、甘味受容 体Ｔ１Ｒ３サブユニットの発現を検出する第二の分子ビーコン、および任意にＧタンパク 20 質の発現を検出する第三の分子ビーコンを、工程ａ）において作製した宿主細胞へ導入す る工程；ならびに ｃ）Ｔ１Ｒ２サブユニット、Ｔ１Ｒ３サブユニット、および任意にＧタンパク質を発現 する細胞を単離する工程。 【０２１０】 ある実施態様において、下記の工程を含む本明細書に説明された細胞または細胞株（例 えば、旨味受容体を安定して発現する細胞または細胞株）を作製するための方法が本明細 書に提供される： ａ）旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットをコードする核酸を含む第一のベクター、旨味受 容体Ｔ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸を含む第二のベクター、および任意にＧタン 30 パク質をコードする核酸を含む第三のベクターを宿主細胞へ導入する工程； ｂ）旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットの発現を検出する第一の分子ビーコン、旨味受容 体Ｔ１Ｒ３サブユニットの発現を検出する第二の分子ビーコン、および任意にＧタンパク 質の発現を検出する第三の分子ビーコンを、工程ａ）において作製した宿主細胞へ導入す る工程；ならびに ｃ）Ｔ１Ｒ１サブユニット、Ｔ１Ｒ３サブユニット、および任意にＧタンパク質を発現 する細胞を単離する工程。 【０２１１】 具体的な実施態様において、本明細書に説明された方法（例えば、甘味受容体または旨 味受容体を安定して発現する細胞または細胞株を作製するための方法）はさらに、工程ｃ 40 ）において単離された細胞から細胞株を作製する工程を含む。他の具体的な実施態様にお いて、宿主細胞は： ａ）真核細胞であり； ｂ）哺乳類細胞であり； ｃ）甘味受容体もしくは旨味受容体の少なくとも１つのサブユニットまたはＧタンパク 質を内在的に発現せず；あるいは ｄ）ａ）、ｂ）、およびｃ）の任意の組み合わせ である。 【０２１２】 他の実施態様において、本明細書に説明された方法（例えば、甘味受容体または旨味受 50 (73) JP 2012-516687 A 2012.7.26 容体を安定して発現する細胞または細胞株を作製するための方法）はさらに、下記の工程 を含む： ａ）細胞を１∼４ヶ月間、１∼９ヶ月間、またはそれらの間の任意の時間の群から選択 される期間培養する工程； ｂ）甘味受容体もしくは旨味受容体またはそのサブユニットの発現を、該時間にわたっ て周期的にアッセイし、発現がＲＮＡまたはタンパク質レベルでアッセイされる工程；お よび ｃ）甘味受容体もしくは旨味受容体またはそのサブユニットの実質的に安定した発現を 特徴とする細胞または細胞株を、１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはそれらの間の任意の 時間の群から選択される期間にわたって選択する工程。 10 【０２１３】 他の実施態様において、本明細書に説明された方法（例えば、甘味受容体または旨味受 容体を安定して発現する細胞または細胞株を作製するための方法）はさらに、下記の工程 を含む： ａ）細胞を１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはそれらの間の任意の時間の群から選択さ れる期間培養する工程； ｂ）甘味受容体もしくは旨味受容体またはそのサブユニットの発現レベルを該時間にわ たって周期的に測定し、発現がＲＮＡまたはタンパク質レベルでアッセイされる工程；お よび ｃ）１∼４週間、１∼９ヶ月間、またはそれらの間の任意の時間の群から選択される期 20 間にわたって、甘味受容体もしくは旨味受容体またはそのサブユニットの実質的に同じレ ベルの発現を特徴とする細胞または細胞株を選択する工程。 【０２１４】 ある実施態様において、甘味受容体のタンパク質発現レベルを測定することは、機能的 アッセイを用いて実施される。ある実施態様において、単離する工程は、蛍光励起セルソ ーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）を利用する。 【０２１５】 特定の実施態様において、甘味受容体を安定して発現する本明細書に説明っされた少な くとも１つの細胞または細胞株を少なくとも１つの試験化合物に曝露し、および甘味受容 体の機能の変化を検出する工程を含む、甘味受容体の機能の修飾因子を同定するための方 30 法が本明細書に提供される。特定の実施態様において、修飾因子は、甘味受容体阻害薬、 甘味受容体アンタゴニスト、甘味受容体遮断薬、甘味受容体活性化因子、甘味受容体アゴ ニスト、または甘味受容体増強物質からなる群から選択される。他の特定の実施態様にお いて、甘味受容体はヒト甘味受容体である。他の特定の実施態様において、試験化合物は 、低分子、化学部分、ポリペプチド、または抗体である。他の特定の化合物において、試 験化合物は化合物のライブラリである。他の特定の実施態様において、ライブラリは、低 分子ライブラリ、組み合わせライブラリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ）、ペプチドライブラリ、または抗体ライブラリである。具体的な実施態様において、修 飾因子は、甘味受容体の酵素的に修飾された形態について選択的である。 【０２１６】 40 特定の実施態様において、旨味受容体を安定して発現する本明細書に説明された少なく とも１つの細胞または細胞株を少なくとも１つの試験化合物に曝露し、旨味受容体の機能 の変化を検出する工程を含む、旨味受容体の機能の修飾因子を同定するための方法が本明 細書に提供される。特定の実施態様において、修飾因子は、旨味受容体阻害薬、旨味受容 体アンタゴニスト、旨味受容体遮断薬、旨味受容体活性化因子、旨味受容体アゴニスト、 または旨味受容体増強物質からなる群から選択される。他の特定の実施態様において、他 の特定の実施態様において、旨味受容体はヒト旨味受容体である。他の特定の実施態様に おいて、試験化合物は、低分子、化学部分、ポリペプチド、または抗体である。他の特定 の化合物において、試験化合物は、化合物のライブラリである。他の特定の実施態様にお いて、ライブラリは、低分子ライブラリ、組み合わせライブラリ、ペプチドライブラリ、 50 (74) JP 2012-516687 A 2012.7.26 または抗体ライブラリである。具体的な実施態様において、修飾因子は、旨味受容体の酵 素的に修飾された形態について選択的である。 【０２１７】 特定の実施態様において、本明細書に説明された方法（例えば、甘味受容体機能または 旨味受容体機能の修飾因子を同定するための方法）によって同定された修飾因子が本明細 書に提供される。 【０２１８】 特定の実施態様において、本明細書に説明された細胞または細胞株（例えば、甘味受容 体または旨味受容体を安定して発現する細胞または細胞株）が本明細書に提供され、該細 胞または細胞株は、このような細胞または細胞株を作製するための本明細書に説明された 10 方法によって作製される。このような方法の具体的な実施態様において、このような方法 の細胞（例えば、甘味受容体または旨味受容体を安定して発現する細胞）は、経時的に一 貫した少なくとも１つの所望の特性を有し、このような方法は下記の工程を含む： （ａ）味覚受容体（例えば、甘味受容体または旨味受容体）のサブユニット、および任 意にＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを発現する複数の細胞を提供する工程； （ｂ）細胞を個々の培養容器に個々に分散させ、それにより複数の個別の細胞培養物を 提供する工程； （ｃ）１セットの所望の培養条件が、前記個別の細胞培養物の各々と実質的に同一であ ることを特徴とする自動細胞培養方法を用いて前記条件下で細胞を培養し、該培養の間、 各個別の細胞培養物における１ウェルの細胞数が標準化される工程、およびこの中で、個 20 別の培養物が同じスケジュールで継代される； （ｄ）味覚受容体（例えば、甘味受容体または旨味受容体）のあるいは該受容体を産生 する細胞の少なくとも１つの所望の特徴について個別の細胞培養物を少なくとも２回アッ セイする工程；および （ｅ）両アッセイにおいて所望の特徴を有する個別の細胞培養物を同定する工程。ある 態様において、味覚受容体（例えば、甘味受容体または旨味受容体）を産生し、および経 時的に一貫した少なくとも１つの所望の特性を有する細胞または細胞株が本明細書に提供 され、細胞または細胞株はこのような方法によって作製される。 【０２１９】 ある実施態様において、甘味受容体、旨味受容体、および／またはＧタンパク質を内在 30 的に発現する細胞は、本明細書に説明された細胞の集団から単離することができる。この ような単離された細胞は、スクリーニング方法およびパネルなど、本明細書に説明された 方法および組成物とともに使用することができる。 【０２２０】 本発明の一態様によると、細胞または細胞株は、苦味受容体を安定して発現するよう操 作される。いくつかの実施態様において、苦味受容体は、細胞または細胞株へと導入され た核酸から発現する。いくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、操作された遺伝 子活性化によって内在性核酸から発現する。いくつかの実施態様において、細胞または細 胞株は、少なくとも１つの他の苦味受容体を安定して発現する。いくつかの実施態様にお いて、少なくとも１つの他の苦味受容体は、内在的に発現する。いくつかの他の実施態様 40 において、前記少なくとも１つの他の苦味受容体は、細胞または細胞株へと導入された核 酸から発現する。さらにいくつかの他の実施態様において、前記苦味受容体および前記少 なくとも１つの他の苦味受容体は、細胞または細胞株へと導入された個別の核酸から発現 する。なおもいくつかの他の実施態様において、前記苦味受容体および前記少なくとも１ つの他の苦味受容体は両方とも、細胞または細胞株へと導入された単一の核酸から発現す る。 【０２２１】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、内在性Ｇタンパク質を安定して発 現する。いくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株は、異種性Ｇタンパク質を 安定して発現する。さらにいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株は、内在 50 (75) JP 2012-516687 A 2012.7.26 性Ｇタンパク質および異種性Ｇタンパク質の両方を安定して発現する。いくつかの実施態 様において、Ｇタンパク質は、３つの異なるサブユニットを含むヘテロ多量体Ｇタンパク 質である。いくつかの実施態様において、ヘテロ多量体のＧタンパク質の少なくとも１つ のサブユニットは、細胞または細胞株へ導入された核酸から発現する。いくつかの他の実 施態様において、少なくとも２つの異なるサブユニットは、細胞または細胞株へ導入され た異なる核酸から発現する。さらにいくつかの他の実施態様において、少なくとも２つの 異なるサブユニットは、細胞または細胞株へ導入された同じ核酸から発現する。なおもい くつかの他の実施態様において、３つの異なるサブユニットは各々、細胞または細胞株へ 導入された同じ核酸から発現する。 【０２２２】 10 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株における細胞は真核細胞である。いく つかの他の実施態様において、細胞または細胞株における細胞は、哺乳類細胞である。さ らにいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株における細胞は、内在性苦味受 容体を発現しない。なおもいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株における 細胞は、内在性苦味受容体を発現しない細胞種類の真核細胞である。なおもいくつかの他 の実施態様において、細胞または細胞株における細胞は、内在性苦味受容体を発現しない 細胞種類の哺乳類細胞である。いくつかの実施態様において、細胞または細胞株における 細胞は、ヒト胚性腎２９３Ｔ細胞である。 【０２２３】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は哺乳類である。いくつかの他の実施態様に 20 おいて、苦味受容体はヒトである。さらにいくつかの他の実施態様において、苦味受容体 はそのアミノ末端またはカルボキシル末端においてポリペプチドタグを有さない。なおも いくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、そのアミノ末端またはカルボキシル末 端においてポリペプチドタグを有さない哺乳類苦味受容体である。なおもいくつかの他の 実施態様において、苦味受容体は、そのアミノ末端またはカルボキシル末端においてポリ ペプチドタグを有さないヒト苦味受容体である。 【０２２４】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、細胞ベースのアッセイ、蛍光細胞 ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リポーター細胞ベースの アッセイ、Ｇタンパク質仲介性細胞ベースのアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞 30 ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイにおいて、少なくとも０．４５のＺ ’値を生じる。いくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株は、細胞ベースのア ッセイ、蛍光細胞ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、リポー ター細胞ベースのアッセイ、Ｇタンパク質仲介性細胞ベースのアッセイ、およびカルシウ ムフラックス細胞ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイにおいて、少なく とも０．５のＺ’値を生じる。さらにいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞 株は、細胞ベースのアッセイ、蛍光細胞ベースのアッセイ、ハイスループットスクリーニ ングアッセイ、リポーター細胞ベースのアッセイ、Ｇタンパク質仲介性細胞ベースのアッ セイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースのアッセイからなる群から選択されるアッ セイにおいて、少なくとも０．６のＺ’値を生じる。 40 【０２２５】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、抗生物質を含まない培地において 苦味受容体を少なくとも２週間安定して発現する。いくつかの他の実施態様において、細 胞または細胞株は、抗生物質を含まない培地において苦味受容体を少なくとも４週間安定 して発現する。さらにいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株は、抗生物質 を含まない培地において苦味受容体を少なくとも６週間安定して発現する。さらにいくつ かの他の実施態様において、細胞または細胞株は、抗生物質を含まない培地において苦味 受容体を少なくとも３ヶ月間安定して発現する。なおもいくつかの他の実施態様において 、細胞または細胞株は、抗生物質を含まない培地において苦味受容体を少なくとも６ヶ月 間安定して発現する。なおもいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株は、抗 50 (76) JP 2012-516687 A 2012.7.26 生物質を含まない培地において苦味受容体を少なくとも９ヶ月間安定して発現する。 【０２２６】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、配列番号７７∼１０１のいずれか１つの アミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、配列番号７７∼ １０１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む 。さらにいくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれ か１つの逆方向に相補的な配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形 成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。なおもいくつかの他の実施態様に おいて、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つの対立遺伝子バリアントであ る核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。 10 【０２２７】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つのヌ クレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施態様にお いて、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つと少なくとも９５％同一である ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。さらにいくつかの他の実施 態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つの逆方向に相補的な配 列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸の配列によってコ ードされるアミノ酸配列を含む。なおもいくつかの他の実施態様において、苦味受容体は 、配列番号５１∼７５のいずれか１つの対立遺伝子バリアントである核酸の配列によって コードされるアミノ酸配列を含む。 20 【０２２８】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、機能的苦味受容体である。いくつかの実 施態様において、細胞または細胞株は、イソプロテレノールと接触した場合に細胞内遊離 カルシウムの濃度の変化を有する。いくつかの実施態様において、イソプロテレノールは 、細胞または細胞株を用いて導いた用量反応曲線において、約１ｎＭ∼約２０ｎＭのＥＣ ５０値を有する。いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、１よりも大きなシ グナル対ノイズ比を有する。 【０２２９】 本発明の別の態様によると、苦味受容体を安定して発現するよう操作された細胞または 細胞株の回収物が提供される。いくつかの実施態様において、回収物は、２つ以上の細胞 30 または細胞株を含み、各細胞または細胞株は、異なる苦味受容体またはその対立遺伝子バ リアントを発現する。いくつかの実施態様において、回収物は追加的に、公知のリガンド を有する苦味受容体を安定して発現するよう操作された細胞または細胞株を含む。いくつ かの実施態様において、対立遺伝子バリアントは一塩基多型（ＳＮＰ）である。さらにい くつかの他の実施態様において、各細胞または細胞株は、イソプロテレノールと接触した 場合に細胞内遊離カルシウム濃度の変化を有する。いくつかの実施態様において、イソプ ロテレノールは、各細胞または細胞株を用いて導かれた用量反応曲線において約１ｎＭ∼ 約２０ｎＭのＥＣ５０値を有する。 【０２３０】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、並行処理を可能にするために同じ 40 生理学的特性を共有するよう対応している。いくつかの実施態様において、生理学的特性 は増殖速度である。いくつかの他の実施態様において、生理学的特性は組織培養表面に対 する接着である。さらにいくつかの他の実施態様において、生理学的特性はＺ’因子であ る。なおもいくつかの他の実施態様において、生理学的特性は、苦味受容体の発現レベル である。 【０２３１】 本発明のいくつかの他の実施態様において、回収物は、２つ以上の細胞または細胞株を 含み、各細胞または細胞株は、同じ苦味受容体またはその対立遺伝子バリアントを安定し て発現する。いくつかの実施態様において、回収物は追加的に、公知のリガンドを有する 苦味受容体を安定して発現するよう操作された細胞または細胞株を含む。いくつかの実施 50 (77) JP 2012-516687 A 2012.7.26 態様において、対立遺伝子バリアントはＳＮＰである。さらにいくつかの他の実施態様に おいて、各細胞または細胞株は、イソプロテレノールと接触した場合に細胞内遊離カルシ ウム濃度の変化を有する。いくつかの実施態様において、イソプロテレノールは、各細胞 または細胞株を用いて導いた用量反応曲線において約１ｎＭ∼約２０ｎＭのＥＣ５０値を 有する。 【０２３２】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、並行処理を可能にするために同じ 生理学的特性を共有するよう対応している。いくつかの実施態様において、生理学的特性 は増殖速度である。いくつかの他の実施態様において、生理学的特性は、組織培養表面に 対する接着である。さらにいくつかの他の実施態様において、生理学的特性はＺ’因子で 10 ある。なおもいくつかの他の実施態様において、生理学的特性は、苦味受容体の発現レベ ルである。 【０２３３】 本発明のさらに別の態様によると、苦味受容体を安定して発現する細胞を作製する方法 が提供される。方法は、ａ）苦味受容体をコードする核酸を複数の細胞へ導入すること； ｂ）苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンを、工程（ａ）に提供される複数の細胞へ 導入すること；およびｃ）苦味受容体を発現する細胞を単離することを含む。いくつかの 実施態様において、方法はさらに、工程（ｃ）において単離された細胞から細胞株を作製 する工程を含む。いくつかの実施態様において、作製された細胞株は、抗生物質の選択を 全く有さない培地において苦味受容体を少なくとも２週間安定して発現する。さらにいく 20 つかの他の実施態様において、作製された細胞株は、抗生物質の選択を全く有さない培地 において苦味受容体を少なくとも４週間安定して発現する。さらにいくつかの他の実施態 様において、作製された細胞株は、抗生物質の選択を全く有さない培地において苦味受容 体を少なくとも６週間安定して発現する。さらにいくつかの他の実施態様において、作製 された細胞株は、抗生物質の選択を全く有さない培地において苦味受容体を少なくとも３ ヶ月間安定して発現する。なおもいくつかの他の実施態様において、作製された細胞株は 、抗生物質の選択を全く有さない培地において苦味受容体を少なくとも６ヶ月間安定して 発現する。なおもいくつかの他の実施態様において、作製された細胞株は、抗生物質の選 択を全く有さない培地において苦味受容体を少なくとも９ヶ月間安定して発現する。 【０２３４】 30 いくつかの実施態様において、苦味受容体を安定して発現する細胞を作製するために用 いられる細胞は、真核細胞である。いくつかの他の実施態様において、苦味受容体を安定 して発現する細胞を作製するために用いられる細胞は、哺乳類細胞である。さらにいくつ かの他の実施態様において、苦味受容体を安定して発現する細胞を作製するために用いら れる細胞は、内在性苦味受容体を発現しない。なおもいくつかの他の実施態様において、 苦味受容体を安定して発現する細胞を作製するために用いられる細胞は、内在性苦味受容 体を発現しない細胞種類の真核細胞である。なおもいくつかの他の実施態様において、苦 味受容体を安定して発現する細胞を作製するために用いられる細胞は、内在性苦味受容体 を発現しない細胞種類の哺乳類細胞である。いくつかの実施態様において、苦味受容体を 安定して発現する細胞を作製するために用いられる細胞は、ヒト胚性腎２９３Ｔ細胞であ 40 る。 【０２３５】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は哺乳類である。いくつかの他の実施態様に おいて、苦味受容体はヒトである。さらにいくつかの他の実施態様において、苦味受容体 は、そのアミノ末端またはカルボキシル末端でポリペプチドタグを有しない。なおもいく つかの他の実施態様において、苦味受容体は、そのアミノ末端またはカルボキシル末端に おいてポリペプチドタグを有しない哺乳類苦味受容体である。なおもいくつかの他の実施 態様において、苦味受容体は、そのアミノ末端またはカルボキシル末端においてポリペプ チドタグを有さないヒト苦味受容体である。 【０２３６】 50 (78) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、配列番号７７∼１０１のいずれか１つの アミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、配列番号７７∼ １０１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む 。さらにいくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれ か１つの逆方向の相補性配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成 する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。なおもいくつかの他の実施態様にお いて、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つの対立遺伝子バリアントである 核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。 【０２３７】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つのヌ 10 クレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施態様にお いて、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つと少なくとも９５％同一である ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。さらにいくつかの他の実施 態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つの逆方向の相補性配列 を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸の配列によってコー ドされるアミノ酸配列を含む。なおもいくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、 配列番号５１∼７５のいずれか１つの対立遺伝子バリアントである核酸の配列によってコ ードされるアミノ酸配列を含む。 【０２３８】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、機能的苦味受容体である。いくつかの実 20 施態様において、工程（ｃ）において単離された細胞は、イソプロテレノールと接触した 場合に細胞内遊離カルシウムの濃度の変化を有する。いくつかの実施態様において、イソ プロテレノールは、細胞を用いて導かれた用量反応曲線において約１ｎＭ∼約２０ｎＭの ＥＣ５０値を有する。 【０２３９】 いくつかの実施態様において、単離することは、蛍光励起セルソーターを利用する。 【０２４０】 いくつかの実施態様において、苦味受容体を安定して発現する細胞を作製するために用 いられる細胞は、内在性Ｇタンパク質を安定して発現する。いくつかの他の実施態様にお いて、苦味受容体を安定して発現する細胞を作製するために用いられる細胞は、異種性Ｇ 30 タンパク質を安定して発現する。本発明のさらにいくつかの他の実施態様において、苦味 受容体を安定して発現する細胞を作製するために用いられる細胞は、内在性Ｇタンパク質 および異種性Ｇタンパク質を安定して発現する。 【０２４１】 いくつかの実施態様において、苦味受容体を発現する細胞株を作製する方法はさらに、 Ｇタンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含む。いくつかの他の実施態様に おいて、Ｇタンパク質をコードする核酸は、苦味受容体をコードする核酸を導入する前に 細胞へ導入される。いくつかの他の実施態様において、Ｇタンパク質をコードする核酸は 、苦味受容体をコードする核酸を導入した後に細胞へ導入される。さらにいくつかの他の 実施態様において、Ｇタンパク質をコードする核酸は、苦味受容体をコードする核酸を導 40 入すると同時に導入される。いくつかの実施態様において、苦味受容体をコードする核酸 およびＧタンパク質をコードする核酸は、単一のベクター上にある。いくつかの実施態様 において、方法はさらに、苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンを導入する前に、Ｇ タンパク質の発現を検出する分子ビーコンを細胞へ導入することを含む。いくつかの他の 実施態様において、方法はさらに、苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンを導入した 後に、Ｇタンパク質の発現を検出する分子ビーコンを細胞へ導入することを含む。さらに いくつかの他の実施態様において、方法はさらに、苦味受容体の発現を検出する分子ビー コンを導入すると同時に、Ｇタンパク質の発現を検出する分子ビーコンを細胞へ導入する ことを含む。いくつかの実施態様において、苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンお よびＧタンパク質の発現を検出する分子ビーコンは、異なる分子ビーコンである。いくつ 50 (79) JP 2012-516687 A 2012.7.26 かの他の実施態様において、苦味受容体の発現を検出する分子ビーコンおよびＧタンパク 質の発現を検出する分子ビーコンは、同じ分子ビーコンである。いくつかの実施態様にお いて、方法はさらに、苦味受容体を発現する細胞を単離する前に、Ｇタンパク質を発現す る細胞を単離し、それにより、苦味受容体およびＧタンパク質の両方を発現する細胞を単 離することを含む。いくつかの他の実施態様において、方法はさらに、苦味受容体を発現 する細胞を単離した後にＧタンパク質を発現する細胞を単離し、それにより、苦味受容体 およびＧタンパク質の両方を発現する細胞を単離することを含む。さらにいくつかの他の 実施態様において、方法はさらに、苦味受容体を発現する細胞を単離すると同時にＧタン パク質を発現する細胞を単離し、それにより、苦味受容体およびＧタンパク質の両方を発 現する細胞を単離することを含む。 10 本発明のなおも別の態様によると、苦味受容体機能の修飾因子を同定する方法は、ａ） 苦味受容体を安定して発現する細胞または細胞株を試験化合物に曝露すること；およびｂ ）苦味受容体の機能の変化を検出することを含む。いくつかの実施態様において、検出す ることは、細胞内遊離カルシウムを測定するアッセイを利用する。いくつかの実施態様に おいて、細胞内遊離カルシウムは、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素、蛍光顕微鏡、 および任意に蛍光プレートリーダーを用いて測定され、この中で、少なくとも１つの蛍光 色素は遊離カルシウムを結合する。いくつかの他の実施態様において、細胞内遊離カルシ ウムは、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素をリアルタイム撮像することによってモニ ターされ、この中で、少なくとも１つの蛍光色素は遊離カルシウムを結合する。 【０２４２】 20 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株における細胞は、真核細胞である。い くつかの他の実施態様において、細胞または細胞株における細胞は、哺乳類細胞である。 さらにいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株における細胞は、内在性苦味 受容体を発現しない。なおもいくつかの他の実施態様において、細胞または細胞株におけ る細胞は、内在性苦味受容体を発現しない細胞種類の真核細胞である。なおもいくつかの 他の実施態様において、細胞または細胞株における細胞は、内在性苦味受容体を発現しな い細胞種類の哺乳類細胞である。いくつかの実施態様において、細胞または細胞株におけ る細胞は、ヒト胚性腎２９３Ｔ細胞である。 【０２４３】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、配列番号７７∼１０１のいずれか１つの 30 アミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、配列番号７７∼ １０１のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む 。さらにいくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれ か１つの逆方向の相補性配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成 する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。なおもいくつかの他の実施態様にお いて、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つの対立遺伝子バリアントである 核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。 【０２４４】 いくつかの実施態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つのヌ クレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施態様にお 40 いて、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つと少なくとも９５％同一である ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。さらにいくつかの他の実施 態様において、苦味受容体は、配列番号５１∼７５のいずれか１つの逆方向の相補性配列 を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸の配列によってコー ドされるアミノ酸配列を含む。なおもいくつかの他の実施態様において、苦味受容体は、 配列番号５１∼７５のいずれか１つの対立遺伝子バリアントである核酸の配列によってコ ードされるアミノ酸配列を含む。 【０２４５】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、細胞内遊離カルシウム濃度の変化 を有する。いくつかの実施態様において、イソプロテレノールは、細胞または細胞株を用 50 (80) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いて導かれた用量反応曲線において１ｎＭ∼２０ｎＭのＥＣ５０値を有する。 【０２４６】 いくつかの実施態様において、試験化合物は、苦味受容体阻害薬である。いくつかの実 施態様において、方法はさらに、細胞または細胞株を試験化合物に曝露する工程の前に、 細胞または細胞株を苦味受容体の公知のアゴニストに曝露することを含む。いくつかの他 の実施態様において、方法はさらに、細胞または細胞株を試験化合物に曝露する工程と同 時に、細胞または細胞株を苦味受容体の公知のアゴニストに曝露することを含む。 【０２４７】 いくつかの実施態様において、試験化合物は、苦味受容体アゴニストである。いくつか の実施態様において、方法はさらに、細胞または細胞株を試験化合物に曝露する工程の前 10 に、細胞または細胞株を苦味受容体の公知の阻害薬に曝露することを含む。いくつかの他 の実施態様において、方法はさらに、細胞または細胞株を試験化合物に曝露する工程と同 時に、細胞または細胞株を苦味受容体の公知の阻害薬に曝露することを含む。 【０２４８】 いくつかの実施態様において、試験化合物は低分子である。いくつかの実施態様におい て、試験化合物は化学部分である。いくつかの実施態様において、試験化合物はポリペプ チドである。いくつかの実施態様において、試験化合物は抗体である。いくつかの実施態 様において、試験化合物は食品抽出物である。 【０２４９】 本発明のさらなる態様において、苦味受容体の機能の修飾因子を同定する方法は、ａ） 20 再オブ株の回収物を異なる試験化合物のライブラリに曝露すること、この中で、再オブ株 の回収物は２つ以上の細胞株を含み、各細胞株は同じ苦味受容体またはその対立遺伝子バ リアントを安定して発現し、およびこの中で、各細胞株は、ライブラリにおいて１つ以上 の試験化合物に曝露され；ならびにｂ）各細胞株によって安定して発現する苦味受容体ま たはその対立遺伝子バリアントの機能の変化を検出することを含む。いくつかの実施態様 において、検出することは、細胞内遊離カルシウムを測定するアッセイを利用する。いく つかの実施態様において、細胞内遊離カルシウムは、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色 素。蛍光顕微鏡、および任意に蛍光プレートリーダーを用いて測定され、この中で、少な くとも１つの蛍光色素は、遊離カルシウムを結合する。いくつかの他の実施態様において 、細胞内遊離カルシウムは、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素を用いたリアルタイム 30 撮像によってモニタリングされ、この中で、少なくとも１つの蛍光色素は遊離カルシウム を結合する。 【０２５０】 いくつかの実施態様において、、ライブラリは低分子ライブラリである。いくつかの実 施態様において、ライブラリは組み合わせライブラリである。いくつかの実施態様におい て、ライブラリはペプチドライブラリである。いくつかの実施態様において、ライブラリ は抗体ライブラリである。 【０２５１】 いくつかの実施態様において、試験化合物は低分子である。いくつかの実施態様におい て、試験化合物は化学部分である。いくつかの実施態様において、試験化合物はポリペプ 40 チドである。いくつかの実施態様において、試験化合物は抗体である。いくつかの実施態 様において、試験化合物は食品抽出物である。 【０２５２】 いくつかの実施態様において、方法はさらに、工程（ａ）の前にまたは同時に細胞株の 回収物を公知の苦味受容体アゴニストに曝露することを含む。いくつかの他の実施態様に おいて、方法はさらに、細胞株の回収物を工程（ａ）の前にまたは同時に公知の苦味受容 体阻害薬に曝露することを含む。 【０２５３】 本発明のなおも別の態様によると、苦味受容体機能の修飾因子を同定する方法は、ａ） 細胞株の回収物を試験化合物に曝露すること、この中で、細胞株の回収物は２つ以上の細 50 (81) JP 2012-516687 A 2012.7.26 胞株を含み、各細胞株は、異なる苦味受容体またはその対立遺伝子バリアントを安定して 発現し；およｇびｂ）各細胞株によって安定して発現した苦味受容体の機能の変化を検出 することを含む。いくつかの実施態様において、検出することは、細胞内遊離カルシウム を測定するアッセイを利用する。いくつかの実施態様において、細胞内遊離カルシウムは 、１つ以上のカルシウム感受性蛍光色素、蛍光顕微鏡、および任意に蛍光プレートリーダ ーを用いて測定され、この中で、少なくとも１つの蛍光色素は遊離カルシウムを結合する 。いくつかの他の実施態様において、細胞内遊離カルシウムは、１つ以上のカルシウム感 受性蛍光色素を用いたリアルタイム撮像によってモニターされ、この中で、少なくとも１ つの蛍光色素は遊離カルシウムを結合する。 【０２５４】 10 いくつかの実施態様において、試験化合物は低分子である。いくつかの実施態様におい て、試験化合物は化学部分である。いくつかの実施態様において、試験化合物はポリペプ チドである。いくつかの実施態様において、試験化合物は抗体である。いくつかの実施態 様において、試験化合物は食品抽出物である。 【０２５５】 いくつかの実施態様において、方法はさらに、細胞株の回収物を、工程（ａ）の前にま たは同時に公知の苦味受容体アゴニストに曝露することを含む。いくつかの他の実施態様 において、方法はさらに、工程（ａ）の前にまたは同時に、細胞株の回収物を公知の苦味 受容体阻害薬に曝露することを含む。 【０２５６】 20 本発明のなおも別の態様によると、苦味受容体を一貫したレベルで経時的に安定して発 現するよう操作された細胞は、ａ）苦味受容体をコードするｍＲＮＡを発現する複数の細 胞を提供する工程；ｂ）細胞を個々の培養容器に個々に分散させ、それにより複数の個別 の細胞培養物を提供する工程；ｃ）個別の各細胞培養物について１セットの所望の培養条 件が実質的に同一であることを特徴とする児童細胞培養方法を用いた該条件下で細胞を培 養し、該培養の間、個別の細胞培養物あたりの細胞数を標準化する工程、およびこの中で 、個別の培養物を同じスケジュールで継代し；ｄ）個別の細胞培養物をアッセイして、苦 味受容体の発現を少なくとも２回測定する工程；ならびにｅ）両アッセイにおいて一貫し たレベルで苦味受容体を発現する個別の細胞培養物を同定し、それにより該細胞を得る工 程を含む方法によって作製される。 30 【０２５７】 ある実施態様において、苦味受容体を内在的に発現する細胞は、本明細書に説明された 細胞の集団から単離することができる。このような単離された細胞は、スクリーニング方 法およびパネルなど、本明細書に説明された方法および組成物とともに用いることができ る。 【０２５８】 ある実施態様において、本発明は、タンパク質複合体を修飾する化合物の化学空間を規 定するための方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含む： ａ）複数の化学的に多様な化合物を個別に、タンパク質複合体を発現するよう操作され た細胞と接触させること； 40 ｂ）タンパク質複合体の活性に及ぼす化合物の効果をアッセイすること； ｃ）工程ｂ）において得られた効果を化合物の構造的共有性と相関づけること。 【０２５９】 ある実施態様において、本発明は、タンパク質複合体を修飾する化合物間で構造的共有 性を同定するための方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含む： （ａ）先に説明した方法の工程ａ）およびｂ）に従ったタンパク質複合体を修飾する化 合物を同定すること； （ｂ）個々の化合物の分子提示および個々の化合物の活性特性を用いて、各該化合物に ついての構造‐活性関係（ＳＡＲ）を構築すること、この中で、各該化合物の該分子提示 は、個々の化合物の構造的記述子を含み、この中で、各該活性特性は、タンパク質複合体 50 (82) JP 2012-516687 A 2012.7.26 の生物学的活性に及ぼす個々の化合物の効果の定量的測定結果を含み、およびこの中で、 各該ＳＡＲモデルは、個々の化合物の構造的特徴を、個々の化合物の活性特性と相関づけ ； （ｃ）個々の化合物についての該ＳＡＲモデルに基づいた個々の化合物の活性特性と相 関する各該化合物の１つ以上の構造的特徴を同定すること；ならびに （ｄ）工程（ｃ）において同定された各該化合物の１つ以上の構造的特徴のうちから該 化合物と共通の少なくとも１つの構造的特徴を同定すること。 【０２６０】 ある実施態様において、本発明は、タンパク質複合体を修飾する化合物のうちから構造 的共有性を同定するための方法を提供し、この中で、前記方法は下記を含む： 10 （ａ）複数の候補化合物を、該タンパク質複合体を発現するよう操作された細胞と個別 に接触させること； （ｂ）該タンパク質複合体の活性に及ぼす該複数の化合物の個々の候補化合物の効果を アッセイして、各該候補化合物の活性特性を提供すること、この中で、各該活性特性は、 タンパク質複合体の生物学的活性に及ぼす個々の候補化合物の効果の定量的測定結果を含 み； （ｃ）該候補化合物の活性特性に基づいた該タンパク質複合体の活性を修飾する１つ以 上の候補化合物を同定すること； （ｄ）個々の候補化合物の分子提示および個々の候補化合物の活性特性を用いて、工程 （ｃ）において同定された各該１つ以上の候補化合物についての構造‐活性関係（ＳＡＲ 20 ）モデルを構築すること、この中で、各該１つ以上の候補化合物の該分子提示は、個々の 候補化合物の構造的記述子を含み、およびこの中で、各該ＳＡＲモデルは、個々の候補化 合物の構造的特徴を個々の候補化合物の活性特性と相関づけ； （ｅ）個々の候補化合物についての該ＳＡＲモデルに基づいた個々の候補化合物の活性 特性と相関する各該１つ以上の候補化合物の１つ以上の構造特徴を同定すること；ならび に （ｆ）工程（ｅ）において同定された各該個々の候補化合物の１つ以上の構造的特徴の うちから該１つ以上の候補化合物と共通の少なくとも１つの構造的特徴を同定すること。 【０２６１】 より具体的な実施態様において、各該化合物の該分子提示はさらに、個々の化合物の物 30 理化学的データ、個々の化合物の空間的データ、個々の化合物の位相幾何学的データ、ま たはそれらの組み合わせを含む。 【０２６２】 より具体的な実施態様において、タンパク質複合体は苦味受容体である。 【０２６３】 より具体的な実施態様において、各該化合物について該ＳＡＲモデルを該構築すること は、個々の化合物の該分子提示と個々の化合物の該活性特性の間の関連性を決定する回帰 方法を適用することを含む。 【０２６４】 より具体的な実施態様において、各該化合物についての該ＳＡＲモデルは独立して、受 40 容体依存性遊離エネルギー力場ＱＳＡＲ（ＦＥＦＦ‐ＱＳＡＲ）モデル、受容体非依存性 ３次元ＱＳＡＲ（３Ｄ‐ＱＳＡＲ）、または受容体依存性もしくは受容体非依存性４次元 ＱＳＡＲ（４Ｄ‐ＱＳＡＲ）である。 【０２６５】 ある態様において、本明細書に説明された方法において使用することができるキットが 本明細書に提供される。特に、１つ以上の複合体標的を安定して発現する１つ以上の細胞 または細胞株を含むキットが本明細書に提供される。ある実施態様において、本明細書に 提供されるキットは、本明細書に説明された１つ以上のシグナル伝達プローブを含む。特 定の実施態様において、キットは、１つ以上の複合体標的をコードする１つ以上のベクタ ーを含んでよい。具体的な実施態様において、キットは、１つ以上の複合体標的を安定し 50 (83) JP 2012-516687 A 2012.7.26 て発現する細胞をスクリーニングしおよび選択するために、機能的細胞ベースのアッセイ において使用するための１つ以上の色素を含む。 【０２６６】 ある態様において、本明細書に提供された１つ以上の細胞、ベクター、および／または シグナル伝達プローブなど、本明細書に説明された試薬および／または細胞のうちの１つ 以上で満たされた１つ以上の容器を含むキットが本明細書に提供される。任意に、キット における構成要素を用いるための指示を含む通知がこのような容器に付随している。 【図面の簡単な説明】 【０２６７】 【図１−３】図１∼３は、本発明に従って使用することのできるコンピュータプログラム 10 モジュールの各ダイアグラムである。 【図４】図４は、ＮａＶα、β１、およびβ２サブユニットを発現する４つの異なるＮａ Ｖ １．７細胞株に対して各々試験されたいくつかの化合物についての用量反応曲線を各 々示す４つのパネルを含んでいる。 【図５】図５は、ビンによってグループ化された異なる化合物の異なる用量に対する、Ｎ ａＶα、β１、およびβ２サブユニットを発現する異なるＮａＶ１．７細胞株の応答を示 す表である。 【図６】図６は、旨味受容体発現細胞を、１２．５ｍＭフルクトース（甘味アゴニスト） または２５ｍＭ ＭＳＧ（旨味アゴニスト）のいずれかで処理し、種々の条件下で増殖さ せた旨味受容体発現（ＲＮＡ）細胞ベースのアッセイ後に得られたデータの棒グラフの提 20 示であり、これらの条件のうちの１つにおいて試験した々再オブの一定分量からのアッセ イ結果をこの図に示す。 【図７】図７は、旨味受容体Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニットならびにＧα１５タン パク質を発現する本発明の細胞株の定量的遺伝子発現分析のグラフ提示である。遺伝子特 異的プライマーならびにＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３、およびＧα１５についてのブローブを用い た遺伝子発現のＴａｑＭａｎ分析について、全ＲＮＡを細胞株から抽出した。対照細胞の 上回る相対的な発現レベルを呈する。 【図８】図８は、培養における９ヶ月後の細胞株における旨味受容体発現の安定性を分析 する代表的なゲルを示す。単一の終点ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、旨味受容体発現細胞株の１ および９ヶ月培養物におけるＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３、およびＧα１５遺伝子発現を評価した 30 。逆転写酵素（「＋ＲＴ」または「−ＲＴ」）を有するおよび有さない、かつ対照細胞（ 「対照」）または水のみ（「なし」）の試料を用いた反応も実施し、ポジティブコントロ ールとして、ネオマイシン耐性遺伝子（「ｎｅｏ」）をコードしたプラスミドの発現を用 いた。矢印は、陽性結果を期待した反応を示す。多数の反応により、異なるゲルからのデ ータをデジタル方式で並置した。Ｔ１Ｒ３についてのデータをそれ自体のパネルにおいて 、独立したＰＣＲ条件を必要とするこれらの反応として示す。 【図９】図９は、旨味受容体発現細胞ベースのアッセイを実施した後に生じた一連の代表 的な反応トレースである。旨味受容体発現細胞ベースのアッセイを、緩衝液単独を対照と して（囲まれたウェル）、残りのウェルにおける３３ｍＭにおいて旨味受容体アゴニスト ＭＳＧを用いて実施した。細胞株は、０．８超のＺ’値を生じる。 40 【図１０】図１０は、旨味受容体発現細胞ベースのアッセイにおいて旨味受容体アゴニス トＭＳＧを用いる用量反応曲線実験後に得られたデータを表す線グラフである。旨味受容 体発現細胞株および対照細胞の反応を、アゴニスト濃度の関数としてプロットした。 【図１１】図１１は、種々の濃度のＭＳＧ（１ｍＭ∼１００ｍＭ、右から左）および増強 物質ＩＭＰ（０ｍＭ∼３０ｍＭ、下から上）の存在下で、旨味受容体発現細胞ベースのア ッセイを実施した後に生じた一連の代表的な反応トレースである。 【図１２】図１２は、種々の濃度のシクラミン酸ナトリウムの存在下での旨味状態発現細 胞ベースのアッセイを実施した後に生じた一連の代表的な反応トレースである。 【図１３】図１３は、ある範囲の濃度の苦味抽出物（ｘ軸）の存在下で未変性の（丸）お よびタグ付きの（四角）ヒト苦味受容体の異なる機能的活性（ｙ軸における「アッセイ反 50 (84) JP 2012-516687 A 2012.7.26 応」）を示すグラフである。 【図１４】図１４は、ヒト苦味受容体を発現する細胞株が、機能的受容体反応について最 大８９％陽性率を示したことを示す表である。各細胞は、９６ウェルプレートにおけるウ ェルを表す。黒のボックスは、存在する細胞が全くない／ほとんどないことを表す。白の ボックスは、存在する細胞を表すが、そのウェルの背景シグナルを上回るアゴニストシグ ナルがない。灰色のボックスは、存在する細胞を表し、アゴニストシグナルは、そのウェ ルの背景シグナルを上回る。 【図１５】図１５は、（１）本発明の方法に従って単離された苦味受容体発現細胞株（上 のパネル）および（２）薬剤により選択された細胞（下のパネル）における苦味アゴニス トに対する苦味受容体の反応のリアルタイム撮像の一連の蛍光顕微鏡写真である。 10 【図１６】図１６は、２５このヒト苦味受容体Ｇα１５細胞株におけるイソプロテレノー ルに対する相対的反応の用量反応曲線を示すグラフである。 【図１７】図１７は、一過性トランスフェクションアッセイにおいて同定される、大まか に調整された、中程度に調整された、および選択的な苦味受容体を示す表である。 【図１８】図１８は、機能的細胞ベースのアッセイにおいて測定され、受容体の基礎活性 を上回る％活性として表される、２５の異なるヒト苦味受容体における異なる化合物の活 性を示す表である。 【図１９】図１９は、未変性の細胞株（上の行）およびタグ付きの細胞株（下の行）を用 いる異なる苦味受容体の割り当てを示す表である。 【図２０】図２０は、１２．５ｍＭフルクトース（甘味アゴニスト）または２５ｍＭ Ｍ 20 ＳＧ（旨味アゴニスト）のいずれかを試験化合物として用いる甘味受容体発現（ＲＮＡ） 細胞ベースのアッセイの棒グラフ提示である。培養物を種々の条件下で増殖させ、これら の条件のうちの３つ（１、２、および「最終」）において試験された同じ細胞の一定分量 からのアッセイ結果をこの図に示す。アッセイ反応を対照細胞の値に対して標準化する。 【図２１】図２１は、甘味受容体ヒトＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニット（それぞれ配 列番号３１および３２）ならびにマウスＧα１５タンパク質（配列番号３３）を発現する 本発明の細胞株の定量的遺伝子発現分析のグラフ提示である。全ＲＮＡを細胞株から抽出 し、遺伝子特異的プライマーと、ヒトＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３、ならびにマウスＧα１５ についてのプローブを用いた遺伝子発現について、ＴａｑＭａｎによって分析した。対照 細胞を上回る相対的発現レベルを表す。 30 【図２２】図２２は、培養物における９ヶ月後の本発明の細胞株における甘味受容体発現 の安定性を分析する代表的なゲルを示す。単一の終点ＲＴ‐ＰＣＲを用いて、甘味受容体 発現細胞株の１および９ヶ月培養物におけるヒトＴ１Ｒ２、ヒトＴ１Ｒ３、およびマウス Ｇα１５遺伝子発現を評価した。逆転写酵素を有するおよび有さない（「＋ＲＴ」または 「−ＲＴ」）、かつ対照細胞（「対照」）または水のみ（「なし」）の試料を用いる反応 も実施し、ポジティブコントロールとして、ネオマイシン耐性遺伝子（「ｎｅｏ」）をコ ードしたプラスミドの発現を用いた。矢印は、陽性の結果を期待したレーンを示す。多数 の反応により、異なるゲルからのデータをデジタル方式に並置した。ヒトＴ１Ｒ３サブユ ニットについてのデータをそれ自体のパネルにおいて、独立したＰＣＲ条件が必要とされ るこれらの反応として示す。 40 【図２３】図２３は、他のウェルにおいて対照として用いられる緩衝液単独を有するウェ ルを互い違いにする上で、甘味受容体の公知のアゴニストである７５ｍＭのフルクトース の甘味受容体発現細胞ベースのアッセイ（本発明の細胞を使用）を実施した後に生じた一 連の代表的な反応トレースである。細胞株は、０．８以上のＺ’値を生じる。 【図２４Ａ−２４Ｃ）】図２４（Ａ∼Ｃ）は、甘味受容体発現細胞ベースのアッセイ（本 発明の細胞を使用）において甘味受容体アゴニストを用いる種々の用量反応実験において 得られたデータを表す一連の線グラフである。（Ａ）天然カロリー甘味料に対する甘味受 容体発現細胞株の応答を、アゴニスト濃度の関数としてプロットした。（Ｂ）甘味受容体 発現細胞ベースのアッセイにおける一般の人工甘味料の用量反応曲線。（Ｃ）甘味受容体 発現細胞ベースのアッセイにおける天然の高強度甘味料の用量反応曲線。 50 (85) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【図２５】図２５は、本発明の細胞を用いる甘味受容体発現細胞ベースのアッセイを実施 した後に生じた一連の代表的な反応トレースである。たいていのアゴニストを用いて観ら れる典型的なベル型のＧＰＣＲ反応とは対照的に、ステビアアゴニストは、カルシウムフ ラックスＦＤＳＳアッセイにおいて延長した反応を示した。 【図２６Ａ−２６Ｂ）】図２６（Ａ∼Ｂ）は、Ｔ１Ｒ２のゲノム遺伝子座を示す。図２６ Ａは、第１染色体内のＴ１Ｒ２遺伝子座の位置を示す。図２６Ｂは、Ｔ１Ｒ２遺伝子につ いての１つの考えられ得るイントロン‐エクソンコード化構造を示す。情報は、Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚのゲノムブラウザ から得た。Ｔ１Ｒ２に対応するエクソンおよびイントロンを５’から３’の方向に数値的 に示す。尺度および染色体の位置を示す。情報は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌ 10 ｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚのゲノムブラウザから得た。 【図２７Ａ−２７Ｂ）】図２７（Ａ∼Ｂ）は、Ｔ１Ｒ３のゲノム遺伝子座を示す。図２７ Ａは、第１染色体内のＴ１Ｒ３遺伝子座の位置を示す。情報は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚのゲノムブラウザから得た。図２ ７Ｂは、Ｔ１Ｒ３遺伝子について１つの考えられ得るイントロン‐エクソンコード化構造 を示す。Ｔ１Ｒ３に対応するエクソンおよびイントロンを５’から３’の方向に数値的に 示す。エクソン数を黒色で示し、イントロン数を灰色で示す。尺度および染色体の位置を 示す。情報は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎｔａ Ｃ ｒｕｚのゲノムブラウザから得た。 【図２８Ａ−２８Ｃ）】図２８（Ａ∼Ｂ）は、背景と比較してフルクトースの添加（１５ 20 ｍＭの終濃度まで）に対する本発明の細胞の機能的細胞ベースの応答の代表的なトレース を示す。個々の単離された細胞から培養された細胞を対照細胞（灰色のトレース）と比較 して試験した（黒色のトレース）。細胞は、試験および対照の両細胞試料から、対照応答 または背景を減算することによって示されるものとして、フルクトースに対するより高い 応答を示した。細胞ベースのアッセイは、蛍光カルシウムシグナル伝達色素を用いたカル シウムフラックスを報告するよう設計された。蛍光アッセイ応答は、Ｙ軸にそってプロッ トされ、時間はＸ軸に沿って示される。矢印は、フルクトースが添加された時点を示す。 図２８Ａは、対照と比較した個々のＨｕＴｕ細胞から培養された細胞からのトレースを示 す。図２８Ｂは、対照と比較した個々のＨ７１６細胞から培養された細胞からのトレース を示す。図２８Ｃは、対照と比較した個々の２９３Ｔ細胞から培養された細胞からのトレ 30 ースを示す。 【図２９Ａ−２９Ｂ）】図２９（Ａ∼Ｂ）は、背景と比較したヘリオナール（Ｈｅｌｉｏ ｎａｌ）およびボージュナール（Ｂｏｕｒｇｅｏｎａｌ）に対するヒト匂い受容体を発現 する細胞の機能的細胞ベースの応答の代表的なトレースを示す。図２９Ａは、対照として のＤＭＳＯビヒクル背景シグナルと比較したヘリオナール（４．５ｍＭの終濃度まで）に 対するヒト匂い受容体ＯＲ３Ａ１を発現する本明細書に説明された細胞株の機能的細胞ベ ースの応答の代表的なトレースを示す。試験（黒色）および対照（灰色）のトレースが重 なっている。細胞は、背景を上回るヘリオナールに対する応答を示した。細胞ベースのア ッセイは、蛍光カルシウムシグナル伝達色素を用いたカルシウムフラックスを報告するよ う設計された。蛍光アッセイ応答は、Ｙ軸に沿ってプロットされ、時間はＸ軸に沿って示 40 される。矢印は、ヘリオナールまたはＤＭＳＯが添加された時点を示す。 図２９Ｂは、 対照としてのＤＭＳＯビヒクル背景シグナルと比較したボージュナール（０．３ｍＭの終 濃度まで）に対するヒト匂い受容体ＯＲ１Ｄ２を発現する本明細書に説明された細胞株の 機能的細胞ベースの応答の代表的なトレースを示す。試験（黒色）および対照（灰色）の トレースが重なっている。細胞は、背景を上回るボージュナールに対する応答を示した。 細胞ベースのアッセイは、蛍光カルシウムシグナル伝達色素を用いたカルシウムフラック スを報告するよう設計された。蛍光アッセイ応答は、Ｙ軸に沿ってプロットされ、時間は Ｘ軸に沿って示される。矢印は、ボージュナールまたはＤＭＳＯが添加された時点を示す 。 【発明を実施するための形態】 50 (86) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０２６８】 別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本 発明の属する分野の当業者によって普遍的に理解されるのと同じ意味を有する。典型的な 方法および材料が下記に説明されているが、本明細書に説明されているものと類似のまた は等価の方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができる。対 立する場合、定義を含めた本明細書が支配するであろう。 【０２６９】 本明細書に記載されたすべての刊行物および他の引用文献は、それらのすべての内容が 全体として引用により組み込まれている。多くの文書が本明細書で引用されているが、本 引用は、これらの任意の文書が当技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成する 10 という承認を構成しない。 【０２７０】 本明細書および特許請求の範囲を通じて、語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「 を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「を含んでいる」などの語尾変化は、記載され た整数または整数の群の含むことをがその他の整数または整数の群を排除しないことを強 調するものとして理解されるであろう。文脈によって別段に必要とされない限り、単数形 は複数形を含んでいるはずであり、複数形は単数形を含んでいるはずである。材料、方法 、および例は、説明のためにのみであり、制限しているよう意図されるものではない。 【０２７１】 本発明がより容易に理解され得るために、ある用語がまず定義される。追加的な定義は 20 、詳細な説明を通じて示される。 【０２７２】 用語「安定な」または「安定して発現する」は、用語「安定な発現」および「一過性発 現」が当業者によって理解されるであろうように、タンパク質を一過性に発現する細胞か ら本発明の細胞および細胞株を区別するよう意図される。本明細書で使用する場合、「同 じ種類の細胞において発現しない」には、同じ種類のその他の細胞において、または同じ 種類の細胞の少なくとも９９％において、または同じ種類の細胞の少なくとも９８％にお いて、または同じ種類の細胞の少なくとも９７％において、または同じ種類の細胞の少な くとも９６％において、または同じ種類の細胞の少なくとも９５％において、または同じ 種類の細胞の少なくとも９４％において、または同じ種類の細胞の少なくとも９３％にお 30 いて、または同じ種類の細胞の少なくとも９２％において、または同じ種類の細胞の少な くとも９１％において、または同じ種類の細胞の少なくとも９０％において、または同じ 種類の細胞の少なくとも８５％において、または同じ種類の細胞の少なくとも８０％にお いて、または同じ種類の細胞の少なくとも７５％において、または同じ種類の細胞の少な くとも７０％において、または同じ種類の細胞の少なくとも６０％において、または同じ 種類の細胞の少なくとも５０％において発現しないが含まれる。 【０２７３】 本明細書で使用する場合、関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベー スのアッセイにおいて１：１を超えるシグナル対ノイズ比を有するものである。いくつか の実施態様において、関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベースのア 40 ッセイにおいて２を超えるシグナル対ノイズ比を有する。いくつかの実施態様において、 関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいて３を超 えるシグナル対ノイズ比を有する。いくつかの実施態様において、関心対象の「機能的」 ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいて４を超えるシグナル対ノイズ 比を有する。いくつかの実施態様において、関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタンパク 質は、細胞ベースのアッセイにおいて５を超えるシグナル対ノイズ比を有する。いくつか の実施態様において、関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベースのア ッセイにおいて１０を超えるシグナル対ノイズ比を有する。いくつかの実施態様において 、関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいて１５ を超えるシグナル対ノイズ比を有する。いくつかの実施態様において、関心対象の「機能 50 (87) JP 2012-516687 A 2012.7.26 的」ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいて２０を超えるシグナル対 ノイズ比を有する。いくつかの実施態様において、関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタ ンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいて３０を超えるシグナル対ノイズ比を有する。 いくつかの実施態様において、関心対象の「機能的」ＲＮＡまたはタンパク質は、細胞ベ ースのアッセイにおいて４０を超えるシグナル対ノイズ比を有する。いくつかの実施態様 において、シグナル対ノイズ比は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、 または７０％超変動しない。いくつかの実施態様において、シグナル対ノイズ比は、実験 によって１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％超変動しない 。いくつかの実施態様において、シグナル対ノイズ比は、実験の２∼２０の異なる複製物 間で１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％超変動しな 10 い。いくつかの実施態様において、シグナル対ノイズ比は、実験の２∼２０の異なる複製 物間で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％超変動しない。 いくつかの実施態様において、シグナル対ノイズ比は、実験の２∼２０の異なる複製物間 で１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％超変動しない 。いくつかの実施態様において、シグナル対ノイズ比は、１∼５、５∼１０、１０∼１５ 、１５∼２０、２０∼２５、２５∼３０、３０∼４０、４０∼５０、５０∼６０、６０∼ ７０、または７０日超試験された細胞について、１０％、２０％、３０％、４０％、５０ ％、６０％、または７０％超変動せず、この中で、細胞は継続培養にある。いくつかの実 施態様において、シグナル対ノイズ比は、１∼５、５∼１０、１０∼１５、１５∼２０、 ２０∼２５、２５∼３０、３０∼４０、４０∼５０、５０∼６０、６０∼７０、または７ 20 ０日超試験された細胞について、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９ ％、または１０％超変動せず、この中で、細胞は継続培養にある。いくつかの実施態様に おいて、関心対象の機能的タンパク質またはＲＮＡは、天然に存在するまたは内在的に発 現するタンパク質またはＲＮＡの生物活性の１つ以上を有する。 【０２７４】 用語「細胞株」または「クローン細胞株」は、単一の最初の細胞の後代である細胞の集 団をいう。本明細書で使用する場合、細胞株は、インビトロでの細胞培養において維持さ れ、クローン細胞のバンクを確立するために一定分量で凍結され得る。 【０２７５】 用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」 30 とは、１つ以上の核酸プローブを核酸試料とハイブリッド形成して、試料中の標的核酸に 特異的に結合しなかったプローブを洗い流すための温度および塩の条件を説明する。スト リンジェントな条件は、当業者に公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ ｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６において見出すことができ る。水性および非水性方法は、プロトコルにおいて説明されており、いずれかを用いるこ とができる。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の一例は、約４５℃で６×ＳＳＣ におけるハイブリッド形成、次いで、６０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける 少なくとも１回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の別の例は、約 ４５℃で６×ＳＳＣにおけるハイブリッド形成、次いで、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０． 40 １％ＳＤＳにおける少なくとも１回の洗浄である。また、ストリンジェントなハイブリッ ド形成条件には、６５℃における０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳにおけるハイブ リッド形成、次いで、６５℃における０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおける少なくとも１ 回の洗浄が含まれる。 【０２７６】 アミノ酸および／または核酸配列と関連した句「％同一の」または「％同一性」は、少 なくとも２つの異なる配列間の類似性をいう。％同一性は、標準的な配列比較アルゴリズ ム、例えばＡｌｔｓｈｕｌら（（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３−４１０）によって説明された塩基局所配列比較ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（（１９７０ 50 (88) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８： ４４４−４５３）のアルゴリズム；またはＭ ｅｙｅｒｓら（（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ４： １ １−１７）のアルゴリズムによって決定することができる。１セットのパラメータは、１ ２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャ ップペナルティを有するＢｌｏｓｕｍ６２スコア化マトリックスであり得る。また、２つ のアミノ酸またはヌクレオチドの配列間の％同一性は、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉ ｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャ ップペナルティを用いるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれたＥ ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ， ４： １１ −１７）のアルゴリズムを用いて決定することができる。％同一性は通常、類似の長さの 10 配列を比較することによって計算される。 【０２７７】 タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めた種々の置換、欠失、およ び他の修飾に割り当てられた類似性の測定結果を用いて類似のアミノ酸配列を対応させる 。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓｍ Ｉｎｃ ．）は、異なる種由来の相同なポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間の、ま たは野生型タンパク質とその変異タンパク質間の配列同一性を決定するために、初期設定 パラメータとともに使用することのできる「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプ ログラムを含む。例えば、ＧＣＧのバージョン６．１を参照されたい。また、ポリペプチ ド配列は、初期設定のまたは推奨されたパラメータを用いるＦＡＳＴＡを用いて比較する 20 ことができる。ＧＣＧのバージョン６．１ ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦ ＡＳＴＡ３）におけるプログラムは、問い合わせ配列と検索配列の間の最良の重なりの領 域の配列比較および％配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ ｚｙｍｏｌ． １８３： ６３−９８ （１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄ ｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３２： １８５−２１９ （２０００））。 【０２７８】 同一性について比較されるポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ 酸残基、通常少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少 なくとも約２８残基、および好ましくは約３５残基超であろう。同一性について比較され るＤＮＡ配列の長さは、少なくとも約４８核酸残基、通常少なくとも約６０核酸残基、よ 30 り通常には少なくとも約７２核酸残基、典型的には少なくとも約８４核酸残基、および好 ましくは約１０５核酸残基超であろう。 【０２７９】 句「実質的に示されているものとして」、「実質的に同一の」または「実質的に相同の 」は、アミノ酸またはヌクレオチドの配列と関連して、関連するアミノ酸またはヌクレオ チドの配列が、比較子配列との比較で同一であろうかまたは非実質的な差（例えば、保存 されたアミノ酸置換またはこのような置換をコードする核酸）を有することを意図する。 非実質的な差には、指定された領域における５０のアミノ酸配列および該配列をコードす る核酸における１または２の置換など、少数のアミノ酸の変化が含まれる。 【０２８０】 40 修飾因子には、関心対象のタンパク質、例えば味覚受容体（例えば、苦味受容体、旨味 受容体、または甘味受容体）の活性を変化させる任意の物質または化合物が含まれる。修 飾因子は、部分的なアゴニストまたはアンタゴニスト、選択的アゴニストまたはアンタゴ ニスト、および逆のアゴニストを含めたアゴニスト（増強物質もしくは活性化因子）また はアンタゴニスト（阻害薬または遮断薬）であり得、また、アロステリックな修飾因子で もあり得る。物質または化合物は、その修飾活性が、異なる条件もしくは濃度下で、また は関心対象のタンパク質、例えば味覚受容体（例えば、苦味受容体、旨味受容体、もしく は甘味受容体）の異なる形態に関して変化する場合でさえ、修飾因子である。他の態様に おいて、修飾因子は、関心対象のタンパク質、例えば、味覚受容体（例えば、苦味受容体 、旨味受容体、または甘味受容体）の機能に影響する別の修飾因子の能力を変化させ得る 50 (89) JP 2012-516687 A 2012.7.26 。具体的な実施態様において、修飾因子は、味覚受容体（例えば、苦味受容体、旨味受容 体、または甘味受容体）の構造、立体配座、生化学的または生物物理学的特性または機能 性を正または負のいずれかに変化させることができる。 【０２８１】 用語「増強物質」、「アゴニスト」、または「活性化因子」は、関心対象のタンパク質 、例えば、味覚受容体（例えば、苦味受容体、旨味受容体、もしくは甘味受容体）の１つ 以上の活性を増大させる化合物または物質をいう。具体的な実施態様において、味覚受容 体の文脈における用語「増強物質」、「アゴニスト」、または「活性化因子」は、味覚受 容体（例えば、苦味受容体、旨味受容体、または甘味受容体）と関連した下流のシグナル 伝達反応を増大させる化合物または物質をいう。特定の実施態様において、味覚受容体の 10 活性の増大は、苦味受容体についての細胞内シグナル伝達経路の一部である細胞内分子の 量もしくは分布または酵素の活性における変化を結果として生じることができる。細胞内 分子の例には、遊離カルシウム、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、イノシトール一 リン酸、二リン酸、または三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。酵素の例に は、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼ‐Ｃ、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼが挙 げられるが、これらに限定されない。 【０２８２】 用語「阻害剤」、「アンタゴニスト」、または「遮断薬」は、関心対象のタンパク質、 例えば味覚受容体（例えば、苦味受容体、旨味受容体、または甘味受容体）の１つ以上の 活性を低下または遮断する化合物または物質をいう。具体的な実施態様において、味覚受 20 容体の文脈における用語「阻害薬」、「アンタゴニスト」、または「遮断薬」は、味覚受 容体（例えば、苦味受容体、旨味受容体、または甘味受容体）と関連した下流のシグナル 伝達反応を低下させる化合物または物質をいう。特定の実施態様において、味覚受容体の 活性の低下は、苦味受容体についての細胞内シグナル伝達経路の一部である細胞内分子の 量もしくは分布または酵素の活性における変化を結果として生じることができる。細胞内 分子の例には、遊離カルシウム、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、イノシトール一 リン酸、二リン酸、または三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。酵素の例に は、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼ‐Ｃ、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼが挙 げられるが、これらに限定されない。 【０２８３】 30 甘味受容体は、口腔、肺、および腸の上皮細胞を含めた多くの哺乳類組織に存在するタ ンパク質である。理論によって結びつけられることなく、本発明者らは、甘味受容体の調 節不全または機能不全が、糖尿病および肥満を含めた多くの疾患状態と連関し得ると考え ている。 【０２８４】 句「機能的甘味受容体」は、少なくとも１つのＴ１Ｒ２サブユニットおよび１つのＴ１ Ｒ３サブユニットを含み、かつフルクトース、グルコース、スクロース、モネリン／ミラ クリン、モグロシド（ｍｏｃｒｏｓｉｄｅ）、ステビア、レバウジオシド（ｒｅｂａｕｄ ｉｏｓｉｄｅ）Ａ、サッカリン、アスパルテーム、シクラミン酸ナトリウム、スクラロー ス、ソルビタル（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、アセスルファムＫ、もしくはギムネマ甘味受容体 40 などの公知の活性化因子に対して、またはメチル４，６−ジクロロ−４，６−ジデオキシ −α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＡＤ‐ジＣｌ‐Ｇａｌ）、ＰＮＰ／ラクチゾール（ｌ ａｃｔｉｓｏｌｅ）（異なる濃度で異なって作用し得る。）、１型ギムネマ酸、ホズロシ ド、ジジフィン、およびグルマリンなどの公知の阻害薬に対して、細胞の遺伝子操作なし で甘味受容体を正常に発現して該受容体を産生する細胞において産生される該受容体と類 似の方法で（すなわち、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および９ ５％同じに）反応する甘味受容体をいう。甘味受容体の挙動は、例えば生理学的活性また は薬理学的反応によって決定することができる。生理学的活性には、Ｇタンパク質の活性 化および関連する下流のシグナル伝達が挙げられるが、これらに限定されない。薬理学的 反応には、受容体の阻害、活性化、および修飾が挙げられるが、これらに限定されない。 50 (90) JP 2012-516687 A 2012.7.26 このような反応は例えば、活性化された甘味受容体によるＧ水性タンパク質の活性化の際 の小胞体からの細胞内カルシウムの放出をモニターするアッセイにおいてアッセイするこ とができる。 【０２８５】 旨味受容体は、口腔、肺、および腸の上皮細胞を含めた多くの哺乳類組織に存在するタ ンパク質である。理論によって結びつけられることなく、本発明者らは、旨味受容体の調 節不全または機能不全が、糖尿病および肥満を含めた多くの疾患状態と連関し得ると考え ている。 【０２８６】 句「機能的旨味受容体」とは、少なくとも１つのＴ１Ｒ１および１つのＴ１Ｒ３サブユ 10 ニットを含み、かつグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）などの公知の活性化因子、また は固有濃度で旨味受容体阻害薬として作用することが公知であるラクチゾール、もしくは ＰＭＰ（２−（４−メトキシフェノキシ）−プロピオン酸）などの公知の阻害薬に対して 、細胞の遺伝子操作なしで旨味受容体を正常に発現して該受容体を産生する細胞において 産生される該受容体と類似の方法で（すなわち、少なくとも５０％、６０％、７０％、８ ０％、９０％、および９５％同じに）反応する旨味受容体をいう。旨味受容体の挙動は、 例えば、生理学的活性または薬理学的反応によって決定することができる。生理学的活性 には、Ｇタンパク質の活性化および関連する下流のシグナル伝達が挙げられるが、これら に限定されない。薬理学的活性には、受容体の阻害、活性化、および修飾が挙げられるが 、これらに限定されない。このような反応は、例えば、活性化された旨味受容体によるＧ 20 水性タンパク質の活性化の際の小胞体からの細胞内カルシウムの放出をモニターするアッ セイにおいてアッセイすることができる。 【０２８７】 句「機能的苦味受容体」とは、操作なしで苦味受容体を正常に発現する細胞における苦 味受容体と実質的に同じ方法で公知の活性化因子または公知の阻害薬に対して反応する苦 味受容体をいう。苦味受容体の挙動は、例えば、生理学的活性および薬理学的反応によっ て決定することができる。生理学的活性には苦味の感覚が挙げられるが、これに限定され ない。薬理学的反応には、苦味受容体が修飾因子と接触した場合に苦味受容体についての 細胞内シグナル伝達経路の一部である細胞内分子の量もしくは分布または酵素の活性にお ける変化が挙げられるが、これに限定されない。例えば、薬理学的反応には、苦味受容体 30 が活性化された場合の細胞内遊離カルシウムの増加、または苦味受容体が遮断された場合 の細胞内遊離カルシウムの低下が含まれてよい。 【０２８８】 本明細書で使用される用語「苦味受容体」は、味覚受容体細胞の表面に発現し、かつ二 次メッセンジャー経路を介して苦味知覚を仲介するＧタンパク質共役受容体の任意の１つ をいう。 【０２８９】 関心対象の「異種性の」または「導入された」タンパク質、例えば、味覚受容体サブユ ニット（例えば、苦味受容体サブユニット、旨味受容体サブユニット、もしくは甘味受容 体サブユニット）またはＧタンパク質は、関心対象のタンパク質、例えば、味覚受容体サ 40 ブユニット（例えば、苦味受容体サブユニット、旨味受容体サブユニット、もしくは甘味 受容体サブユニット）またはＧタンパク質が、宿主細胞に導入された核酸によってコード されることを意味する。 【０２９０】 関心対象の「遺伝子により活性化された」タンパク質、例えば、味覚受容体サブユニッ ト（例えば、苦味受容体サブユニット、旨味受容体サブユニット、もしくは甘味受容体サ ブユニット）またはＧタンパク質は、サブユニットまたはタンパク質をコードする内在性 核酸が発現制御配列の該核酸への導入および操作上の連関によって発現のために活性化さ れたことを意味する。 【０２９１】 50 (91) JP 2012-516687 A 2012.7.26 本発明は、関心対象の機能的ＲＮＡまたはヘテロ多量体タンパク質およびリガンドが公 知ではないタンパク質などの複合体タンパク質を含めた関心対象の機能的タンパク質を安 定して発現する細胞について火急の必要性に見合った細胞から作製される新規の細胞およ び細胞株を初めて提供する。本発明の細胞および細胞株は、関心対象のＲＮＡまたはタン パク質の一貫した機能的な発現が望まれるいずれの使用にも適している。出願者らは、膜 タンパク質、細胞質タンパク質、および分泌型タンパク質を含めた、単一のサブユニット およびヘテロ多量体（ヘテロ二量体および３つ以上の異なるサブユニットを有するタンパ ク質を含む。）の両方の種々のタンパク質、ならびにこれらの種々の組み合わせについて のこの説明に見合う細胞株を作製した。 【０２９２】 10 関心対象のタンパク質の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：受容体（例 えば、サイトカイン受容体、免疫グロブリン受容体ファミリーメンバー、リガンド開口型 イオンチャネル、プロテインキナーゼ受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、核 ホルモン受容体、および他の受容体）、シグナル伝達分子（例えば、サイトカイン、増殖 因子、ペプチドホルモン、ケモカイン、膜結合型シグナル伝達分子、および他のシグナル 伝達分子）、キナーゼ（例えば、アミノ酸キナーゼ、炭水化物キナーゼ、ヌクレオチドキ ナーゼ、プロテインキナーゼ、および他のキナーゼ）、ホスファターゼ（例えば、炭水化 物ホスファターゼ、ヌクレオチドホスファターゼ、プロテインホスファターゼ、およびた のホスファターゼ）、プロテアーゼ（例えば、アスパラギン酸プロテアーゼ、システイン プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、および他のプロテアーゼ）、 20 調節分子（例えば、Ｇタンパク質修飾因子、高分子量Ｇタンパク質、低分子量ＧＴＰａｓ ｅ、キナーゼ修飾因子、ホスファターゼ修飾因子、プロテアーゼ阻害薬、および他の酵素 調節因子）カルシウム結合タンパク質（例えば、アネキシン、カルモジュリン関連タンパ ク質、および他の選択的カルシウム結合タンパク質）、転写因子（例えば、核ホルモン受 容体、基本転写因子、ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子、ｃｒｅｂ 転写因子、ｈｍｇボックス転写因子、ホメオボックス転写因子、他の転写因子、転写補助 因子、およびＺｎフィンガー転写因子）、核酸結合タンパク質（例えば、ヘリカーゼ、Ｄ ＮＡリガーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、二 本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、エンドデオキシリボヌクレアーゼ、複製起点結合タンパク質 、逆転写酵素、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質 30 、セントロメアＤＮＡ結合タンパク質、染色質／染色質結合タンパク質、ＤＮＡグリコシ ラーゼ、ＤＮＡ光回復酵素、ＤＮＡポリメラーゼ処理能力因子、ＤＮＡ鎖対形成タンパク 質、ＤＮＡトポイソメラーゼ、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ指向性ＲＮＡポ リメラーゼ、傷害性ＤＮＡ結合タンパク質、ヒストン、プライマーゼ、エンドリボヌクレ アーゼ、エキソデオキシリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ、翻訳伸長因子、翻 訳開始因子、翻訳終結因子、ｍＲＮＡポリアデニル化因子、ｍＲＮＡスプライシング因子 、他のＤＮＡ結合タンパク質、他のＲＮＡ結合タンパク質、および他の核酸結合タンパク 質）、イオンチャネル（例えば、陰イオンチャネル、リガンド開口型イオンチャネル、電 位開口型イオンチャネル、および他のイオンチャネル）、輸送体（例えば、陽イオン輸送 体、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体、アミノ酸輸送体、炭水化物輸送体、および他 40 の輸送体）、転移／担体タンパク質（例えば、アポリポタンパク質、ミトコンドリア担体 タンパク質、および他の転移／担体タンパク質）、細胞接着分子（例えば、ｃａｍファミ リー接着分子、カドヘリン、および他の細胞接着分子）、細胞骨格タンパク質（例えば、 アクチンおよびアクチン関連タンパク質、アクチン結合モータータンパク質、非モーター アクチン結合タンパク質、他のアクチンファミリー細胞骨格タンパク質、中間径フィラメ ント、微小管ファミリー細胞骨格タンパク質、および他の細胞骨格タンパク質）、細胞外 マトリックス（例えば、細胞外マトリックス糖タンパク質、細胞外マトリックスリンカー タンパク質、細胞外マトリックス構造タンパク質、および他の細胞外マトリックス）、細 胞間結合タンパク質（例えば、ギャップ結合タンパク質、緊密結合（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎ ｃｔｉｏｎ）タンパク質、および他の細胞間結合タンパク質）、シンターゼ、シンテター 50 (92) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ゼ、オキシドレダクターゼ（例えば、脱水素酵素、ヒドロキシラーゼ、オキシダーゼ、オ キシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、還元酵素、および他の酸化還元酵素）、トランスフェ ラーゼ（例えば、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アシルトラ ンスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、 ホスホリラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスアミナーゼ、トランスケトラーゼ、お よび他のトランスフェラーゼ）、ヒドロリアーゼ（例えば、デアセチラーゼ、デアミナー ゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ホ スホジエステラーゼ、ピロホスファターゼ、アミラーゼ、および他のヒドロラーゼ）、リ アーゼ（例えば、アデニラートシクラーゼ、グアニラートシクラーゼ、アルドラーゼ、デ カルボキシラーゼ、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、および他のリアーゼ）、イソメラー 10 ゼ（例えば、エピメラーゼ／ラセマーゼ、ムターゼ、および他のイソメラーゼ）、リガー ゼ（例えば、ＤＮＡリガーゼ、ユビキチン‐タンパク質リガーゼ、および他のリガーゼ） 、防御／免疫タンパク質（例えば、抗菌反応タンパク質、補体成分、免疫グロブリン、免 疫グロブリン受容体ファミリーメンバー、主要な組織適合性複合体抗原、ならびに他の防 御および免疫タンパク質）、膜輸送タンパク質（例えば、膜輸送調節タンパク質、ＳＮＡ ＲＥタンパク質、小胞コーティングタンパク質、および他の膜輸送タンパク質）、シャペ ロン（例えば、シャペロニン、ｈｓｐ７０ファミリーシャペロン、ｈｓｐ９０ファミリー シャペロン、および他のシャペロン）、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスコーティ ングタンパク質および他のウイルスタンパク質）、ミエリンタンパク質、他の種々の機能 タンパク質、貯蔵タンパク質、構造タンパク質、界面活性剤、ならびに膜貫通受容体調節 20 ／アダプタータンパク質。タンパク質およびそれらの機能に関する他の例には、Ｐａｕｌ Ｄ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ａｎｉｓｈ Ｋ ｅｊａｒｉｗａｌ， Ｈｕａｉｙｕ Ｍｉ， Ｂｒｉａｎ Ｋａｒｌａｋ， Ｒｏｂｉｎ Ｄａｖｅｒｍａｎ， Ｋａｒｅｎ Ｄｉｅｍｅｒ， Ａｎｕｓｈｙａ Ｍｕｒｕｇａｎ ｕｊａｎ， Ａｐｕｒｖａ Ｎａｒｅｃｈａｎｉａ． ２００３． ＰＡＮＴＨＥＲ： ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｆａｍ ｉｌｉｅｓ ｉｎｄｅｘｅｄ ｂｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １３： ２１２９−２１４１において同定されているものが含まれ、それらのすべての内 容は全体として引用により本明細書に組み込まれている。 【０２９３】 30 ＧＰＣＲの例には以下が含まれるが、これらに限定されない： 【０２９４】 以下を含むがこれらに限定されないクラスＡのＧＰＣＲ：５−ヒドロキシトリプタミン 受容体（例えば、ＨＴＲ１Ａ、ＨＴＲ１Ｂ、ＨＴＲ１Ｄ、ＨＴＲ１Ｅ、ＨＴＲ１Ｆ、ＨＴ Ｒ２Ａ、ＨＴＲ２Ｂ、ＨＴＲ２Ｃ、ＨＴＲ４、ＨＴＲ５Ａ、ＨＴＲ６、およびＨＴＲ７） 、ムスカリン性アセチルコリン受容体（例えば、ＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ３、 ＣＨＲＭ４、およびＣＨＲＭ５）、アデノシン受容体（例えば、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲ Ａ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、およびＡＤＯＲＡ３）、α−アドレナリン受容体（例えば、Ａ ＤＲＡ１Ａ、ＡＤＲＡ１Ｂ、ＡＤＲＡ１Ｄ、ＡＤＲＡ２Ａ、ＡＤＲＡ２Ｂ、およびＡＤＲ Ａ２Ｃ）、β−アドレナリン受容体（例えば、ＡＤＲＢ１、ＡＤＲＢ２、およびＡＤＲＢ 40 ３）、アナフィラトキシン受容体（例えば、ＧＰＲ７７、Ｃ５Ｒ１、およびＣ３ＡＲ１） 、アンギオテンシン受容体（例えば、ＡＧＴＲ１およびＡＧＴＲ２）、アペリン受容体（ 例えば、ＡＧＴＲＬ１）、胆汁酸受容体（例えば、ＧＰＢＡＲ１）、ボンベシン受容体（ 例えば、ＮＭＢＲ、ＧＲＰＲ、およびＢＲＳ３）、ブラジキニン受容体（例えば、ＢＤＫ ＲＢ１およびＢＤＫＲＢ２）、カンナビノイド受容体（例えば、ＣＮＲ１およびＣＮＲ２ ）、ケモカイン受容体‐インターロイキン（例えば、８ＩＬ８ＲＡおよびＩＬ８ＲＢ）、 ケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２ 、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１ ０、ＣＸ３ＣＲ１、ＸＣＲ１、およびＣＸＣＲ６）、コレシストキニン受容体（例えば、 ＣＣＫＡＲおよびＣＣＫＢＲ）、ドーパミン受容体（例えば、ＤＲＤ、ＤＲＤ２、ＤＲＤ 50 (93) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ３、ＤＲＤ４、およびＤＲＤ５）、エンドセリン受容体（例えば、ＥＤＮＲＡおよびＥＤ ＮＲＢ）、エストロゲン受容体（例えば、ＧＰＥＲ）、ホルミルペプチド受容体（例えば 、ＦＰＲ２、ＦＰＲ３、およびＦＰＲ１）、遊離脂肪酸受容体（例えば、ＦＦＡＲ１、Ｆ ＦＡＲ３、ＦＦＡＲ２、およびＧＰＲ４２）、ガラニン受容体（例えば、ＧＡＬＲ１、Ｇ ＡＬＲ２、およびＧＡＬＲ３）、グレリン受容体（例えば、ＧＨＳＲ）、糖タンパク質ホ ルモン受容体（例えば、ＦＳＨＲ、ＬＨＣＧＲ、およびＴＳＨＲ）、ゴナドトロピン放出 ホルモン受容体（例えば、ＧＮＲＨＲおよびＧＮＲＨＲ２）、ヒスタミン受容体（例えば 、ＨＲＨ１、ＨＲＨ２、ＨＲＨ３、およびＨＲＨ４）、ＫｉＳＳ１由来ペプチド受容体（ 例えば、ＫＩＳＳ１Ｒ）、ロイコトリエン受容体（例えば、ＬＴＢ４Ｒ２、ＦＰＲＬ１、 ＯＸＥＲ１、ＬＴＢ４Ｒ、ＣＹＳＬＴＲ１、およびＣＹＳＬＴＲ２）、リゾリン脂質受容 10 体（例えば、ＬＰＡＲ１、ＬＰＡＲ２、ＬＰＡＲ３、Ｓ１ＰＲ１、Ｓ１ＰＲ２、Ｓ１ＰＲ ３、Ｓ１ＰＲ４、およびＳ１ＰＲ５）、メラニン凝集ホルモン受容体（例えば、ＭＣＨＲ １およびＭＣＨＲ２）、メラノコルチン受容体（例えば、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ２Ｒ、ＭＣ３Ｒ 、ＭＣ４Ｒ、およびＭＣ５Ｒ）、メラトニン受容体（例えば、ＭＴＮＲ１ＡおよびＭＴＮ Ｒ１Ｂ）、モチリン受容体（例えば、ＭＬＮＲ）、ニューロメジンＵ受容体（例えば、Ｎ ＭＵＲ１およびＮＭＵＲ２）、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体（例 えば、ＮＰＦＦＲ１およびＮＰＦＦＲ２）、ニューロペプチドＳ受容体（例えば、ＮＰＳ Ｒ１）、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体（例えば、ＮＰＢＷＲ１および ＮＰＢＷＲ２）、ニューロペプチドＹ受容体（例えば、ＮＰＹ１Ｒ、ＮＰＹ２Ｒ、ＰＰＹ Ｒ１、およびＮＰＹ５Ｒ）、ニューロテンシン受容体（例えば、ＮＴＳＲ１およびＮＴＳ 20 Ｒ２）、ニコチン酸受容体ファミリー（例えば、ＧＰＲ１０９Ｂ、ＧＰＲ１０９Ａ、およ びＧＰＲ８１）、非シグナル伝達７ＴＭケモカイン結合タンパク質（例えば、ＤＡＲＣ、 ＣＣＢＰ２、およびＣＣＲＬ１）、オピオイド受容体（例えば、ＯＰＲＭ１、ＯＰＲＤ１ 、ＯＰＲＫ１、およびＯＰＲＬ１）、オレキシン受容体（例えば、ＨＣＲＴＲ１およびＨ ＣＲＴＲ２）、Ｐ２Ｙ受容体（例えば、Ｐ２ＲＹ１、Ｐ２ＲＹ２、Ｐ２ＲＹ４、Ｐ２ＲＹ ６、Ｐ２ＲＹ１１、Ｐ２ＲＹ１２、Ｐ２ＲＹ１４、およびＰ２ＲＹ１３）、ペプチドＰ５ １８受容体（例えば、ＱＲＦＰＲ）、血小板活性化因子受容体（例えば、ＰＴＡＦＲ）、 プロキネチシン受容体（例えば、ＰＲＯＫＲ１およびＰＲＯＫＲ２）、プロラクチン放出 ペプチド受容体（例えば、ＰＲＬＨＲ）、プロスタノイド受容体（例えば、ＰＴＧＤＲ、 ＰＴＧＥＲ１、ＰＴＧＥＲ２、ＰＴＧＥＲ３、ＰＴＧＥＲ４、ＰＴＧＦＲ、ＰＴＧＩＲ、 30 ＴＢＸＡ２Ｒ、およびＧＰＲ４４）、プロテアーゼ活性化受容体（トロンビン（Ｆ２Ｒ） ）、プロテアーゼ活性化受容体（例えば、Ｆ２ＲＬ１、Ｆ２ＲＬ２、およびＦ２ＲＬ３） 、リラキシンファミリーペプチド受容体（例えば、ＲＸＦＰ１、ＲＸＦＰ２、ＲＸＦＰ３ 、およびＲＸＦＰ４）、ソマトスタチン受容体（例えば、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ５、ＳＳ ＴＲ３、ＳＳＴＲ１、およびＳＳＴＲ４）、タキキニン受容体（例えば、ＴＡＣＲ１、Ｔ ＡＣＲ２、およびＴＡＣＲ３）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体（例えば、ＴＲ ＨＲ）、微量アミン受容体（例えば、ＴＡＡＲ１）、ウロテンシン受容体（例えば、ＵＴ Ｓ２Ｒ）、バソプレッシンおよびオキシトシン受容体（例えば、ＡＶＰＲ１Ａ、ＡＶＰＲ ２、ＡＶＰＲ１Ｂ、およびＯＸＴＲ）、クラスＡオーファン（例えば、ＧＰＲ８２、ＧＰ Ｒ１８２、ＣＣＲＬ２、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１、ＧＰＲ１８３、ＧＰＲ１、ＧＰＲ 40 ３、ＧＰＲ４、ＧＰＲ６、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１ ９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ２２、ＧＰＲ２３、ＧＰＲ２５、ＧＰＲ２６、ＧＰ Ｒ２７、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３３、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ３７、 ＧＰＲ３７Ｌ１、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ５０、ＧＰＲ５２、ＧＰＲ５５、ＧＰ Ｒ６１、ＧＰＲ６２、ＧＰＲ６３、 ＧＰＲ６５、ＧＰＲ６８、ＧＰＲ７５、ＧＰＲ７８、ＧＰＲ７９、ＧＰＲ８３、ＧＰＲ８ ４、ＧＰＲ８５、ＧＰＲ８７， ＧＰＲ８８、ＧＰＲ９２、ＧＰＲ１０１、ＧＰＲ１１９、ＧＰＲ１２０、ＧＰＲ１３２、 ＧＰＲ１３５、ＧＰＲ１３９， ＧＰＲ１４１、ＧＰＲ１４２、ＧＰＲ１４６、ＧＰＲ１４８、ＧＰＲ１４９、ＧＰＲ１５ 50 (94) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ０、ＧＰＲ１５１、ＧＰＲ１５２， ＧＰＲ１５３、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ１６１、ＧＰＲ１７１、ＧＰＲ１７３、ＧＰＲ１７ ４、ＧＰＲ１６２、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５， ＬＧＲ６、ＭＡＳ１、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＥ、ＭＲＧＰＲＦ、ＭＲＧ ＰＲＧ、ＭＲＧＰＲＸ１， ＭＲＧＰＲＸ２、ＭＲＧＰＲＸ３、ＭＲＧＰＲＸ４、ＯＰＮ３、ＯＰＮ５、ＯＸＧＲ１、 Ｐ２ＲＹ１０、Ｐ２ＲＹ５， Ｐ２ＲＹ８、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＡＲ２、ＴＡＡＲ３、ＴＡＡＲ５、ＴＡＡＲ６、ＴＡＡ Ｒ８、ＴＡＡＲ９、およびＧＰＲ４２）； 【０２９５】 10 以下を含むがこれらに限定されないクラスＢのＧＰＣＲ： カルシウム感知受容体（例えば、ＣＡＳＲおよびＧＰＲＣ６Ａ）、ＧＡＢＡ‐Ｂ受容体 （例えば、ＧＡＢＢＲ１およびＧＡＢＢＲ２）、ＧＰＲＣ５受容体（例えば、ＧＰＲＣ５ Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、およびＧＰＲＣ５Ｄ）、代謝型グルタミン酸受容体（ 例えば、ＧＲＭ１、ＧＲＭ２、ＧＲＭ３、ＧＲＭ４、ＧＲＭ５、ＧＲＭ６、ＧＲＭ７、お よびＧＲＭ８、）、クラスＣオーファン（例えば、ＧＰＲ１５６、ＧＰＲ１５８、ＧＰＲ １７９、ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＧＰＲＣ５Ｃ、およびＧＰＲＣ５Ｄ）； 【０２９６】 以下を含むがこれらに限定されないクラスＣのＧＰＣＲ： カルシトニン受容体（例えば、ＣＡＬＣＲ／ＣＴ、ＡＭＹ１、ＡＭＹ２、ＡＭＹ３、Ｃ 20 ＡＬＣＲＬ、ＣＧＲＰ、ＡＭ１、およびＡＭ２）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体 （例えば、ＣＲＨＲ１およびＣＲＨＲ２）、グルカゴン受容体ファミリー（例えば、ＧＣ ＧＲ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＬＰ２Ｒ、ＧＩＰＲ、ＳＣＴＲ、およびＧＨＲＨＲ）、副甲状腺ホ ルモン受容体（例えば、ＰＴＨ１ＲおよびＰＴＨＲ２）、ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ受容体 （例えば、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１、ＶＩＰＲ１、およびＶＩＰＲ２）、クラスＢオーファン （例えば、ＢＡｌ１、ＢＡｌ２、ＢＡｌ３、ＣＤ９７、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＳＲ２、Ｃ ＥＬＳＲ３、ＥＬＴＤ１、ＥＭＲ１、ＥＭＲ２、ＥＭＲ３、ＥＭＲ４、ＧＰＲ５６、ＧＰ Ｒ６４、ＧＰＲ９７、ＧＰＲ１１０、ＧＰＲ１１１、ＧＰＲ１１２、ＧＰＲ１１３、ＧＰ Ｒ１１４、ＧＰＲ１１５、ＧＰＲ１１６、ＧＰＲ１２３、ＧＰＲ１２４、ＧＰＲ１２５、 ＧＰＲ１２６、ＧＰＲ１２８、 30 ＧＰＲ１３３、ＧＰＲ１４３、ＧＰＲ１４４、ＧＰＲ１５７、ＬＰＨＮ１、ＬＰＨＮ２、 ＬＰＨＮ３、およびＧＰＲ９８）； 【０２９７】 真菌接合ホルモン（例えば、ＳＴＥ２およびＳＴＥ３）を含むがこれらに限定されない クラスＤのＧＰＣＲ； 【０２９８】 ｃＡＭＰ受容体（例えば、タマホコリカビ類）を含むがこれらに限定されないクラスＥ のＧＰＣＲ； 【０２９９】 Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体（ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺ 40 Ｄ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、およびＳＭＯ）を含むがこれらに限 定されないクラスＦのＧＰＣＲ；ならびに 【０３００】 未分類のＧＰＣＲ（例えば、ＯＰＣＭＬ、ＯＧＦＲ、ＯＧＦＲＬ１、およびＯＰＲＳ１ ）。 【０３０１】 電位開口型イオンチャネルの例には以下を含むがこれらに限定されない： 【０３０２】 ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＮ１．ＫＣＮＮ２、ＫＣＮＮ３、ＫＣＮＮ４、ＫＣＮＴ１、ＫＣ ＮＴ２、およびＫＣＮＵ１を含むがこれらに限定されないカルシウム活性化カリウムチャ 50 (95) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ネル； 【０３０３】 ＣＡＴＳＰＥＲ１、ＣＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＴＳＰＥＲ３、ＣＡＴＳＰＥＲ４、ＴＰＣ Ｎ１、およびＴＰＣＮ２を含むがこれらに限定されないＣａｔＳｐｅｒおよび２ポアチャ ネル； 【０３０４】 ＣＮＧＡ１、ＣＮＧＡ２、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＡ４、ＣＮＧＢ１、ＣＮＧＢ３、ＨＣＮ １、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、およびＨＣＮ４を含むがこれらに限定されない環状ヌクレオチ ド調節チャネル； 【０３０５】 10 ＫＣＮＪ１、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ１２、ＫＣＮＪ４、ＫＣＮＪ１４、ＫＣＮＪ３、Ｋ ＣＮＪ６、ＫＣＮＪ９、ＫＣＮＪ５、 ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＪ１５、ＫＣＮＪ１６、ＫＣＮＪ８、ＫＣＮＪ１１、およびＫＣＮ Ｊ１３を含むがこれらに限定されない内向き整流性カリウムチャネル； 【０３０６】 ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ２、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ４、ＴＲＰＣ５、ＴＲＰ Ｃ６、ＴＲＰＣ７、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ２、 ＴＲＰＭ３、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ６、ＴＲＰＭ７、ＴＲＰＭ８、ＭＣＯＬ Ｎ１、ＭＣＯＬＮ２、ＭＣＯＬＮ３、 ＰＫＤ２、ＰＫＤ２Ｌ１、ＰＫＤ２Ｌ２、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＶＰ３、ＴＲＰ 20 Ｖ４、ＴＲＰＶ５、およびＴＲＰＶ６を含むがこれらに限定されない一過性受容器電位チ ャネル； 【０３０７】 ＫＣＮＫ１、ＫＣＮＫ２、ＫＣＮＫ３、ＫＣＮＫ４、ＫＣＮＫ５、ＫＣＮＫ６、ＫＣＮ Ｋ７、ＫＣＮＫ９、ＫＣＮＫ１０、ＫＣＮＫ１２、ＫＣＮＫ１３、 ＫＣＮＫ１５、ＫＣＮＫ１６、ＫＣＮＫ１７、およびＫＣＮＫ１８を含むがこれらに限定 されない２Ｐカリウムチャネル； 【０３０８】 ＣＡＣＮＡ１Ｓ、ＣＡＣＮＡ１Ｃ、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＣＮＡ１Ｆ、ＣＡＣＮＡ１Ａ 、ＣＡＣＮＡ１Ｂ、ＣＡＣＮＡ１Ｅ、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、 30 ＣＡＣＮＡ１Ｈ、およびＣＡＣＮＡ１ｌを含むがこれらに限定されない電位開口型カルシ ウムチャネル； 【０３０９】 ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ２、ＫＣＮＡ３、ＫＣＮＡ４、ＫＣＮＡ５、ＫＣＮＡ６、ＫＣＮ Ａ７、ＫＣＮＡ１０、ＫＣＮＢ１、ＫＣＮＢ２、 ＫＣＮＣ１、ＫＣＮＣ２、ＫＣＮＣ３、ＫＣＮＣ４、ＫＣＮＤ１、ＫＣＮＤ２、ＫＣＮＤ ３、ＫＣＮＦ１、ＫＣＮＧ１、 ＫＣＮＧ２、ＫＣＮＧ３、ＫＣＮＧ４、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ ４、ＫＣＮＱ５、ＫＣＮＶ１、 ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＳ１、ＫＣＮＳ２、ＫＣＮＳ３、ＫＣＮＨ１、ＫＣＮＨ５、ＫＣＮＨ 40 ２、ＫＣＮＨ６、ＫＣＮＨ７、 ＫＣＮＨ８、ＫＣＮＨ３、およびＫＣＮＨ４を含むがこれらに限定されない電位開口型カ リウムチャネル； 【０３１０】 ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ８Ａ、ＳＣＮ ９Ａ、ＳＣＮ１０Ａ、およびＳＣＮ１１Ａを含むがこれらに限定されない電位開口型ナト リウムチャネル；ならびに 【０３１１】 ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ１Ｌ、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＥ３、ＫＣＮＩＰ１、ＫＣＮＩＰ２、 ＫＣＮＩＰ３、ＫＣＮＩＰ４、ＫＣＮＭＢ１、 50 (96) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＣＮＭＢ３Ｌ、およびＫＣＮＭＢ４を含むがこれらに限定 されない他の電位開口型イオンチャネル。 【０３１２】 リガンド開口型イオンチャネルの例には以下を含むが、これらに限定されない： 【０３１３】 ５ＨＴ３Ａｃａｐｏ、５ＨＴ３Ａｈｏｓａ、５ＨＴ３Ａｍｕｍｕ、５ＨＴ３Ａｍｕｐｕ 、５ＨＴ３Ａｏｒｃｕ、５ＨＴ３Ａｐａｔｒ、５ＨＴ３Ａｒａｎｏ、 ５ＨＴ３Ｂｈｏｓａ、５ＨＴ３Ｂｍｕｍｕ、５ＨＴ３Ｂｏｒｃｕ、５ＨＴ３Ｂｐａｔｒ、 ５ＨＴ３Ｂｒａｎｏ、５ＨＴ３Ｃｈｏｓａ、５ＨＴ３Ｃｐａｔｒ、５ＨＴ３Ｄｈｏｓａ、 ５ＨＴ３Ｄｐａｔｒ、５ＨＴ３Ｅｈｏｓａ、５ＨＴ３ｇａｇａ、ａｎｄおよび５ＨＴｍｏ 10 ｄ１ｃａｅｌ；以下を含む５−ＨＴ受容体：５‐ＨＴ１Ａ；５‐ＨＴ１Ｂ；５‐ＨＴ１Ｄ ；５‐ＨＴ１Ｅ；５‐ＨＴ１Ｆ；５‐ＨＴ２Ａ；５‐ＨＴ２Ｂ；５‐ＨＴ２Ｃ；５ＨＴ４ スプライスアイソフォームａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｎ；５‐ＨＴ５Ａ；５‐ＨＴ６ ；５‐ＨＴ７スプライスフォームａ、ｂ、ｃを含むがこれらに限定されないセロトニン受 容体サブユニット。 【０３１４】 ＡＣＨａ１０ｇａｇａ、ＡＣＨａ１０ｈｏｓａ、ＡＣＨａ１０ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ１０ ｐａｔｒ、ＡＣＨａ１０ｒａｎｏ、ＡＣＨａ１ａｎｇａ、ＡＣＨａ１ａｐｃａ、ＡＣＨａ １ａｔａｒｕ、ＡＣＨａ１ａｘｅｌａ、ＡＣＨａ１ｂｏｔａ、ＡＣＨａ１ｂｔａｒｕ、Ａ ＣＨａ１ｂｘｅｌａ、ＡＣＨａ１ｃａｆａ、ＡＣＨａ１ｄａｒｅ、ＡＣＨａ１ｇａｇａ、 20 ＡＣＨａ１ｈｅｖｉ、ＡＣＨａ１ｈｏｓａ、ＡＣＨａ１ｌｏｍｉ、ＡＣＨａ１ｍｕｍｕ、 ＡＣＨａ１ｍｙｐｅ、ＡＣＨａ１ｎａｈａ、ＡＣＨａ１ｎａｎａ、ＡＣＨａ１ｎａｔｅ、 ＡＣＨａ１ｐａｔｒ、ＡＣＨａ１ｒａｎｏ、ＡＣＨａ１ｔｏｃａ、ＡＣＨａ１ｔｏｍａ、 ＡＣＨａ２ａｎｇａ、ＡＣＨａ２ａｐｃａ、ＡＣＨａ２ａｐｇｏ、ＡＣＨａ２ｄａｒｅ、 ＡＣＨａ２ｇａｇａ、ＡＣＨａ２ｈｅｖｉ、ＡＣＨａ２ｈｏｓａ、ＡＣＨａ２ｌｏｍｉ、 ＡＣＨａ２ｍａｍｕ、ＡＣＨａ２ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ２ｍｙｐｅ、ＡＣＨａ２ｐａｔｒ、 ＡＣＨａ２ｒａｎｏ、ＡＣＨａ２ｔａｒｕ、ＡＣＨａ３ａｎｇａ、ＡＣＨａ３ａｐｍｅ、 ＡＣＨａ３ｂｏｔａ、ＡＣＨａ３ｃａａｕ、ＡＣＨａ３ｄｒｍｅ、ＡＣＨａ３ｇａｇａ、 ＡＣＨａ３ｈｅｖｉ、ＡＣＨａ３ｈｏｓａ、ＡＣＨａ３ｌｏｍｉ、ＡＣＨａ３ｍａｍｕ、 ＡＣＨａ３ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ３ｍｙｐｅ、ＡＣＨａ３ｐａｔｒ、ＡＣＨａ３ｒａｎｏ、 30 ＡＣＨａ３ｔａｒｕ、ＡＣＨａ４ａｎｇａ、ＡＣＨａ４ｄｒｍｅ、ＡＣＨａ４ｇａｇａ、 ＡＣＨａ４ｈｏｓａ、ＡＣＨａ４ｍａｍｕ、ＡＣＨａ４ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ４ｍｙｐｅ、 ＡＣＨａ４ｐａｔｒ、ＡＣＨａ４ｒａｎｏ、ＡＣＨａ４ｔａｒｕ、ＡＣＨａ５ａｎｇａ、 ＡＣＨａ５ｄｒｍｅ、ＡＣＨａ５ｇａｇａ、ＡＣＨａ５ｈｏｓａ、ＡＣＨａ５ｍａｍｕ、 ＡＣＨａ５ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ５ｍｙｐｅ、ＡＣＨａ５ｐａｔｒ、ＡＣＨａ５ｒａｎｏ、 ＡＣＨａ６ａｔａｒｕ、ＡＣＨａ６ｂｔａｒｕ、ＡＣＨａ６ｄｒｍｅ、ＡＣＨａ６ｇａｇ ａ、ＡＣＨａ６ｈｏｓａ、ＡＣＨａ６ｍａｍｕ、ＡＣＨａ６ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ６ｐａｔ ｒ、ＡＣＨａ６ｒａｎｏ、ＡＣＨａ７＿１ｈｅｖｉ、ＡＣＨａ７＿２ｈｅｖｉ、ＡＣＨａ ７ａｎｇａ、ＡＣＨａ７ａｔａｒｕ、ＡＣＨａ７ｂｏｔａ、ＡＣＨａ７ｂｔａｒｕ、ＡＣ Ｈａ７ｃｔａｒｕ、ＡＣＨａ７ｄａｒｅ、ＡＣＨａ７ｄｒｍｅ、ＡＣＨａ７ｇａｇａ、Ａ 40 ＣＨａ７ｈｏｓａ、ＡＣＨａ７ｍａｍｕ、ＡＣＨａ７ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ７ｐａｔｒ、Ａ ＣＨａ７ｒａｎｏ、ＡＣＨａ７ｒａｓｐ、ＡＣＨａ８ａｔａｒｕ、ＡＣＨａ８ｂｔａｒｕ 、ＡＣＨａ８ｇａｇａ、ＡＣＨａ９ａｔａｒｕ、ＡＣＨａ９ｂｔａｒｕ、ＡＣＨａ９ｃｔ ａｒｕ、ＡＣＨａ９ｄａｒｅ、ＡＣＨａ９ｄｔａｒｕ、ＡＣＨａ９ｇａｇａ、ＡＣＨａ９ ｈｏｓａ、ＡＣＨａ９ｍｕｍｕ、ＡＣＨａ９ｐａｔｒ、ＡＣＨａ９ｒａｎｏ、ＡＣＨａａ ｓｓｕ、ＡＣＨａｃｒ１０ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ１１ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ１２ｃａ ｅｌ、ＡＣＨａｃｒ１３ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ１４ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ１５ｃａｅ ｌ、ＡＣＨａｃｒ１６ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ１７ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ１８ｃａｅｌ 、ＡＣＨａｃｒ１９ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ２０ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ２１ｃａｅｌ、 ＡＣＨａｃｒ２２ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ２３ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ２ｃａｅｌ、ＡＣ 50 (97) JP 2012-516687 A 2012.7.26 Ｈａｃｒ３ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ４ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ５ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ ６ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ７ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ８ｃａｅｌ、ＡＣＨａｃｒ９ｃａｅ ｌ、ＡＣＨａｈａｃｏ、ＡＣＨａｌ１ａｃｄｏ、ＡＣＨａｌ１ｓｃｇｒ、ＡＣＨａｌｓｄ ｒｍｅ、ＡＣＨａｌｓｍａｓｅ、ＡＣＨａｌｙｓｔ、ＡＣＨａｒｄｄｒｍｅ、ＡＣＨｂ１ ａｔａｒｕ、ＡＣＨｂ１ｂｏｔａ、ＡＣＨｂ１ｂｔａｒｕ、ＡＣＨｂ１ｈｅｖｉ、ＡＣＨ ｂ１ｈｏｓａ、ＡＣＨｂ１ｍａｓｅ、ＡＣＨｂ１ｍｕｍｕ、ＡＣＨｂ１ｐａｔｒ、ＡＣＨ ｂ１ｒａｎｏ、ＡＣＨｂ１ｔｏｃａ、ＡＣＨｂ１ｘｅｌａ、ＡＣＨｂ２ｃａａｕ、ＡＣＨ ｂ２ｇａｇａ、ＡＣＨｂ２ｈｏｓａ、ＡＣＨｂ２ｍａｍｕ、ＡＣＨｂ２ｍｕｍｕ、ＡＣＨ ｂ２ｐａｔｒ、ＡＣＨｂ２ｒａｎｏ、ＡＣＨｂ３ａｃａａｕ、ＡＣＨｂ３ａｄａｒｅ、Ａ ＣＨｂ３ｂｃａａｕ、ＡＣＨｂ３ｇａｇａ、ＡＣＨｂ３ｈｏｓａ、ＡＣＨｂ３ｍａｍｕ、 10 ＡＣＨｂ３ｍｕｍｕ、ＡＣＨｂ３ｐａｔｒ、ＡＣＨｂ３ｒａｎｏ、ＡＣＨｂ４ｂｏｔａ、 ＡＣＨｂ４ｇａｇａ、ＡＣＨｂ４ｈｏｓａ、ＡＣＨｂ４ｍａｍｕ、ＡＣＨｂ４ｍｕｍｕ、 ＡＣＨｂ４ｐａｔｒ、ＡＣＨｂ４ｒａｎｏ、ＡＣＨｂ４ｔａｒｕ、ＡＣＨｂδｔａｒｕ、 ＡＣＨｂθｔａｒｕ、ＡＣＨｂ７ｔａｒｕ、ＡＣＨｂｌｏｍｉ、ＡＣＨｂｌｙｓｔ、ＡＣ ＨｃＯ４ｃ３＿２ｃａｅｌ、ＡＣＨｃ１５ａ７＿１ｃａｅｌ、ＡＣＨｃｇ７５８９ｄｒｍ ｅ、ＡＣＨｃｌｙｓｔ、ＡＣＨｃｕｐ４ｃａｅｌ、ＡＣＨｄｂｏｔａ、ＡＣＨｄｄａｒｅ 、ＡＣＨｄｅｇ３ｃａｅｌ、ＡＣＨｄｇａｇａ、ＡＣＨｄｈｏｓａ、ＡＣＨｄｌｙｓｔ、 ＡＣＨｄｍｕｍｕ、ＡＣＨｄｐａｔｒ、ＡＣＨｄｒａｒａ、ＡＣＨｄｔａｒｕ、ＡＣＨｄ ｔｏｃａ、ＡＣＨｄｘｅｌａ、ＡＣＨｅａｔ２ｃａｅｌ、ＡＣＨｅｂｏｔａ、ＡＣＨｅｈ ｏｓａ、ＡＣＨｅｌｙｓｔ、ＡＣＨｅｍｕｍｕ、ＡＣＨｅｐａｔｒ、ＡＣＨｅｒａｒａ、 20 ＡＣＨｅｔａｒｕ、ＡＣＨｅｘｅｌａ、ＡＣＨｆ１１ｃ７＿１ｃａｅｌ、ＡＣＨｆ１７ｅ ９＿７ｃａｅｌ、ＡＣＨｆ１７ｅ９＿８ｃａｅｌ、ＡＣＨｆ１８ｇ５＿４ｃａｅｌ、ＡＣ Ｈｆ２１ａ３＿７ｃａｅｌ、ＡＣＨｆ５８ｈ７＿３ｃａｅｌ、ＡＣＨｆｌｙｓｔ、ＡＣＨ ｇｂｏｔａ、ＡＣＨｇｇａｇａ、ＡＣＨｇｈｏｓａ、ＡＣＨｇｌｙｓｔ、ＡＣＨｇｍｕｍ ｕ、ＡＣＨｇｐａｔｒ、ＡＣＨｇｒａｒａ、ＡＣＨｇｔａｒｕ、ＡＣＨｇｔｏｃａ、ＡＣ Ｈｇｘｅｌａ、ＡＣＨｈｌｙｓｔ、ＡＣＨｉｌｙｓｔ、ＡＣＨｊｌｙｓｔ、ＡＣＨｋｌｙ ｓｔ、ＡＣＨＩｅｖ１ｃａｅｌ、ＡＣＨｌｌｙｓｔ、ＡＣＨｎａａｐｃａ、ＡＣＨｒＯ３ ｅ１＿３ｃａｅｌ、ＡＣＨｒ１３ａ５＿４ｃａｅｌ、ＡＣＨｒｏｎｖｏ、ＡＣＨｓａｄｄ ｒｍｅ、ＡＣＨｓｂｄｄｒｍｅ、ＡＣＨｓｓｕ１ｏｓｃｉ、ＡＣＨｓｓｕ２ｏｓｃｉ、Ａ ＣＨｔＯ１ｈ１０＿１ｃａｅｌ、ＡＣＨｔＯ１ｈ１０＿２ｃａｅｌ、ＡＣＨｔＯ１ｈ１０ 30 ＿３ｃａｅｌ、ＡＣＨｔＯ１ｈ１０＿５ｃａｅｌ、ＡＣＨｔＯ１ｈ１０＿６ｃａｅｌ、Ａ ＣＨｔＯ１ｈ１０＿７ｃａｅｌ、ＡＣＨｔＯ５ｂ４＿１ｃａｅｌ、ＡＣＨｔａｒ１ｔｒｃ ｏ、ＡＣＨｕｎｃ２９ｃａｅｌ、ＡＣＨｕｎｃ３８ｃａｅｌ、ＡＣＨｕｎｃ６３ｃａｅｌ 、ＡＣＨｙ４４ａ６ｅ＿１ｃａｅｌ、ＡＣＨｙ５７ｇ１１ｃ＿２ｃａｅｌ、ＡＣＨｙ５７ ｇ１１ｃ＿４９ｃａｅｌ、ＡＣＨｙ５８ｇ８ａ＿１ｃａｅｌ、ＡＣＨｙ７３ｂ６ｂｌ＿２ ６ｃａｅｌ、およびＡＣＨｙ７３ｆ８ａ＿３０ｃａｅｌを含むがこれらに限定されないア セチルコリン状態サブユニット； 【０３１５】 ＧＡＢａ１ｂｏｔａ、ＧＡＢａ１ｇａｇａ、ＧＡＢａ１ｈｏｓａ、ＧＡＢａ１ｍｕｍｕ 、ＧＡＢａ１ｒａｒａ、ＧＡＢａ２ｂｏｔａ、ＧＡＢａ２ｈｏｓａ、ＧＡＢａ２ｍｕｍｕ 40 、ＧＡＢａ２ｒａｒａ、ＧＡＢａ３ｂｏｔａ、ＧＡＢａ３ｈｅｖｉ、ＧＡＢａ３ｈｏｓａ 、ＧＡＢａ３ｍｕｍｕ、ＧＡＢａ３ｒａｒａ、ＧＡＢａ４ｂｏｔａ、ＧＡＢａ４ｈｏｓａ 、ＧＡＢａ４ｍｕｍｕ、ＧＡＢａ４ｒａｒａ、ＧＡＢａ５ｈｏｓａ、ＧＡＢａ５ｒａｒａ 、ＧＡＢａ６ｃａａｕ、ＧＡＢａ６ｈｏｓａ、ＧＡＢａ６ｍｕｍｕ、ＧＡＢａ６ｒａｒａ 、ＧＡＢｂ１ｂｏｔａ、ＧＡＢｂ１ｈｏｓａ、ＧＡＢｂ１ｍｕｍｕ、ＧＡＢｂ１ｒａｓｐ 、ＧＡＢｂ２ｄａｒｅ、ＧＡＢｂ２ｈｏｓａ、ＧＡＢｂ２ｍｕｍｕ、ＧＡＢｂ２ｒａｓｐ 、ＧＡＢｂ３ｇａｇａ、ＧＡＢｂ３ｈｏｓａ、ＧＡＢｂ３ｍｕｍｕ、ＧＡＢｂ３ｒａｓｐ 、ＧＡＢｂ４ｇａｇａ、ＧＡＢｂｄｒｍｅ、ＧＡＢｂｌｙｓｔ、ＧＡＢｂｓｅｏｆ、ＧＡ ＢｃＯ９ｇ５＿１ｃａｅｌ、ＧＡＢｃ２７ｈ５＿４ｃａｅｌ、ＧＡＢｃ３９ｂ１０＿２ｃ ａｅｌ、ＧＡＢｃ５３ｄ６＿３ｃａｅｌ、ＧＡＢｄｈｏｓａ、ＧＡＢｄｍｕｍｕ、ＧＡＢ 50 (98) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｄｒａｒａ、ＧＡＢｅｈｏｓａ、ＧＡＢｅｍｕｍｕ、ＧＡＢｅｒａｎｏ、ＧＡＢｆＯ９ｃ １２＿１ｃａｅｌ、ＧＡＢｆ１１ｈ８＿２ｃａｅｌ、ＧＡＢｆ４７ａ４＿１ｃａｅｌ、Ｇ ＡＢｆ５５ｄ１０＿５ｃａｅｌ、ＧＡＢｆ５８ｇ６＿４ｃａｅｌ、ＧＡＢｇ１ｇａｇａ、 ＧＡＢｇ１ｈｏｓａ、ＧＡＢｇ１ｍｕｍｕ、ＧＡＢｇ１ｒａｎｏ、ＧＡＢｇ２ｂｏｔａ、 ＧＡＢｇ２ｇａｇａ、ＧＡＢｇ２ｈｏｓａ、ＧＡＢｇ２ｍｕｍｕ、ＧＡＢｇ２ｒａｒａ、 ＧＡＢｇ３ｈｏｓａ、ＧＡＢｇ３ｍｕｍｕ、ＧＡＢｇ３ｒａｎｏ、ＧＡＢｇ４ｇａｇａ、 ＧＡＢｇ４ｈｏｓａ、ＧＡＢｇ４ｍｕｍｕ、ＧＡＢｇｂｒ２ｃａｅｌ、ＧＡＢｇｒｄｄｒ ｍｅ、ＧＡＢｈｇｉｈａｃｏ、ＧＡＢｋＩ０ｄ６＿１ｃａｅｌ、ＧＡＢｐｈｏｓａ、ＧＡ Ｂｐｍｕｍｕ、ＧＡＢｒ１ａｍｏａｍ、ＧＡＢｒ１ｂｍｏａｍ、ＧＡＢｒ１ｈｏｓａ、Ｇ ＡＢｒ１ｍｕｍｕ、 10 ＧＡＢｒ１ｒａｎｏ、ＧＡＢｒ２ａｍｏａｍ、ＧＡＢｒ２ｂｍｏａｍ、ＧＡＢｒ２ｈｏｓ ａ、ＧＡＢｒ２ｍｕｍｕ、ＧＡＢｒ２ｒａｒａ、ＧＡＢｒ３ｈｏｓａ、ＧＡＢｒ３ｍｏａ ｍ、ＧＡＢｒ３ｍｕｍｕ、ＧＡＢｒ３ｒａｎｏ、ＧＡＢｒｄｌａｅａｅ、ＧＡＢｒｄｌｃ ｅｃａ、ＧＡＢｒｄｌｄｒｍｅ、ＧＡＢｔ２０ｂ１２＿９ｃａｅｌ、ＧＡＢｔ２１ｆ２＿ １ｃａｅｌ、ＧＡＢｔ２４ｄ８＿１ｃａｅｌ、ＧＡＢｔｈｏｓａ、ＧＡＢｔｍｕｍｕ、Ｇ ＡＢｔｒａｎｏ、ＧＡＢｕｎｃ４９ｂｃａｅｌ、ＧＡＢｕｎｃ４９ｃａｅｌ、およびＧＡ Ｂｚｌｙｓｔを含むがこれらに限定されないＧＡＢＡＡ受容体サブユニット； 【０３１６】 ＧＬＹａ１ｄａｒｅ、ＧＬＹａ１ｈｏｓａ、ＧＬＹａ１ｍｕｍｕ、ＧＬＹａ１ｒａｎｏ 、ＧＬＹａ２ｄａｒｅ、ＧＬＹａ２ｈｏｓａ、ＧＬＹａ２ｍｕｍｕ、ＧＬＹａ２ｒａｎｏ 20 、ＧＬＹａ３ｄａｒｅ、ＧＬＹａ３ｈｏｓａ、ＧＬＹａ３ｍｏａｍ、ＧＬＹａ３ｍｕｍｕ 、ＧＬＹａ３ｒａｎｏ、ＧＬＹａ４ａｄａｒｅ、ＧＬＹａ４ｂｄａｒｅ、ＧＬＹａ４ｈｏ ｓａ、ＧＬＹａ４ｍｕｍｕ、ＧＬＹｂｄａｒｅ、ＧＬＹｂｈｏｓａ、ＧＬＹｂｍｕｍｕ、 ＧＬＹｂｒａｎｏ、およびＨＩＳｃｌ１ｄｒｍｅを含むがこれらに限定されないグリシン ／ヒスタミン受容体サブユニット； 【０３１７】 ＡＴＰｐ２ｘ１ｈｏｓａ、ＡＴＰｐ２ｘ１ｒａｎｏ、ＡＴＰｐ２ｘ２ｃａｐｏ、ＡＴＰ ｐ２ｘ２ｈｏｓａ、ＡＴＰｐ２ｘ２ｍｕｍｕ、ＡＴＰｐ２ｘ２ｒａｎｏ、ＡＴＰｐ２ｘ３ ｈｏｓａ、ＡＴＰｐ２ｘ３ｍｕｍｕ、ＡＴＰｐ２ｘ３ｒａｎｏ、ＡＴＰｐ２ｘ４ｂｏｔａ 、ＡＴＰｐ２ｘ４ｇａｇａ、ＡＴＰｐ２ｘ４ｈｏｓａ、ＡＴＰｐ２ｘ４ｍｕｍｕ、ＡＴＰ 30 ｐ２ｘ４ｏｒｃｕ、ＡＴＰｐ２ｘ４ｒａｎｏ、ＡＴＰｐ２ｘ５ｂｏｔａ、ＡＴＰｐ２ｘ５ ｈｏｓａ、ＡＴＰｐ２ｘ５ｍｕｍｕ、ＡＴＰｐ２ｘ５ｒａｎｏ、ＡＴＰｐ２ｘ６ｈｏｓａ 、ＡＴＰｐ２ｘ６ｍｕｍｕ、ＡＴＰｐ２ｘ６ｒａｎｏ、ＡＴＰｐ２ｘ７ｂｏｔａ、ＡＴＰ ｐ２ｘ７ｈｏｓａ、ＡＴＰｐ２ｘ７ｍｕｍｕ、ＡＴＰｐ２ｘ７ｒａｎｏ、およびＡＴＰｐ ２ｘｓｃｍａを含むがこれらに限定されないＡＴＰ受容体サブユニット； 【０３１８】 ＧＬＵ１＿１ａｒｔｈ、ＧＬＵ１＿２ａｒｔｈ、ＧＬＵ１＿３ａｒｔｈ、ＧＬＵ１＿４ ａｒｔｈ、ＧＬＵ２＿１ａｒｔｈ、ＧＬＵ２＿２ａｒｔｈ、ＧＬＵ２＿３ａｒｔｈ、ＧＬ Ｕ２＿４ａｒｔｈ、ＧＬＵ２＿５ａｒｔｈ、ＧＬＵ２＿６ａｒｔｈ、ＧＬＵ２＿７ａｒｔ ｈ、ＧＬＵ２＿８ａｒｔｈ、ＧＬＵ２＿９ａｒｔｈ、ＧＬＵ３＿１ａｒｔｈ、ＧＬＵ３＿ 40 ２ａｒｔｈ、ＧＬＵ３＿３ａｒｔｈ、ＧＬＵ３＿４ａｒｔｈ、ＧＬＵ３＿５ａｒｔｈ、Ｇ ＬＵ３＿６ａｒｔｈ、ＧＬＵ３＿７ａｒｔｈ、ＧＬＵｄＩｈｏｓａ、ＧＬＵｄＩｍｕｍｕ 、ＧＬＵｄＩｒａｎｏ、ＧＬＵｄ２ｈｏｓａ、ＧＬＵｄ２ｍｕｍｕ、ＧＬＵｄ２ｒａｎｏ 、ＧＬＵｇＩｒＩＯｃａｅｌ、ＧＬＵｇＩｒＩｃａｅｌ、ＧＬＵｇｌｒ２ｃａｅｌ、ＧＬ Ｕｇｌｒ４ｃａｅｌ、ＧＬＵｇｌｒ５ｃａｅｌ、ＧＬＵｇｌｒ６ｃａｅｌ、ＧＬＵｇｌｒ ７ｃａｅｌ、ＧＬＵｇｌｒ８ｃａｅｌ、ＧＬＵｇｌｒ９ｃａｅｌ、ＧＬＵｋ１０ｄ３＿１ ｃａｅｌ、ＧＬＵｋａｌｈｏｓａ、ＧＬＵｋａ１ｍｕｍｕ、ＧＬＵｋａ１ｒａｎｏ、ＧＬ Ｕｋａ２ｈｏｓａ、ＧＬＵｋａ２ｍｕｍｕ、ＧＬＵｋａ２ｒａｎｏ、ＧＬＵｋａ４ｍｕｍ ｕ、ＧＬＵｋｂｐａｃａａｕ、ＧＬＵｋｂｐａｎｓｐ、ＧＬＵｋｂｐｂｃａａｕ、ＧＬＵ ｋｂｐｇａｇａ、ＧＬＵｋｂｐｒａｐｉ、ＧＬＵｋｂｐｘｅｌａ、ＧＬＵｎｒ１ａｎｐｌ 50 (99) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、ＧＬＵｎｒ１ａｐｌｅ、ＧＬＵｎｒ１ｃａａｕ、ＧＬＵｎｒ１ｄｒｍｅ、ＧＬＵｎｒ１ ｈｏｓａ、ＧＬＵｎｒ１ｍｕｍｕ、ＧＬＵｎｒ１ｒａｎｏ、ＧＬＵｎｒ１ｓｕｓｃ、ＧＬ Ｕｎｒ１ｘｅｌａ、ＧＬＵｎｒ２ａｈｏｓａ、ＧＬＵｎｒ２ａｍｕｍｕ、ＧＬＵｎｒ２ａ ｒａｎｏ、ＧＬＵｎｒ２ｂｈｏｓａ、ＧＬＵｎｒ２ｂｍｕｍｕ、ＧＬＵｎｒ２ｂｒａｎｏ 、ＧＬＵｎｒ２ｃｈｏｓａ、ＧＬＵｎｒ２ｃｍｕｍｕ、ＧＬＵｎｒ２ｃｒａｎｏ、ＧＬＵ ｎｒ２ｄｈｏｓａ、ＧＬＵｎｒ２ｄｍｕｍｕ、ＧＬＵｎｒ２ｄｒａｎｏ、ＧＬＵｎｒ３ａ ｈｏｓａ、ＧＬＵｎｒ３ａｍｕｍｕ、ＧＬＵｎｒ３ａｒａｎｏ、ＧＬＵｎｒ３ｂｈｏｓａ 、ＧＬＵｎｒ３ｂｍｕｍｕ、ＧＬＵｎｒ３ｂｒａｎｏ、ＧＬＵｒＯ、ＧＬＵｒ１ｇａｇａ 、ＧＬＵｒ１ｈｏｓａ、ＧＬＵｒ１ｍｏｃｈ、ＧＬＵｒ１ｍｕｍｕ、ＧＬＵｒ１ｒａｎｏ 、ＧＬＵｒ２ａｃｏｒｎｉ、ＧＬＵｒ２ｂｏｒｎｉ、ＧＬＵｒ２ｃｏｌｉ、ＧＬＵｒ２ｇ 10 ａｇａ、ＧＬＵｒ２ｈｏｓａ、ＧＬＵｒ２ｍｕｍｕ、ＧＬＵｒ２ｒａｎｏ、ＧＬＵｒ３ａ ｏｒｍｏ、ＧＬＵｒ３ｃａａｕ、ＧＬＵｒ３ｃｏｌｉ、ＧＬＵｒ３ｇａｇａ、ＧＬＵｒ３ ｈｏｓａ、ＧＬＵｒ３ｍｕｍｕ、ＧＬＵｒ３ｒａｎｏ、ＧＬＵｒ４ｃａａｕ、ＧＬＵｒ４ ｃｏｌｉ、ＧＬＵｒ４ｇａｇａ、ＧＬＵｒ４ｈｏｓａ、ＧＬＵｒ４ｍｕｍｕ、ＧＬＵｒ４ ｒａｎｏ、ＧＬＵｒ５ｄａａｅ、ＧＬＵｒ５ｈｏｓａ、ＧＬＵｒ５ｍｕｍｕ、ＧＬＵｒ５ ｒａｎｏ、ＧＬＵｒ６ｈｏｓａ、ＧＬＵｒ６ｍｕｍｕ、ＧＬＵｒ６ｒａｎｏ、ＧＬＵｒ６ ｘｅｌａ、ＧＬＵｒ７ｈｏｓａ、ＧＬＵｒ７ｍｕｍｕ、ＧＬＵｒ７ｒａｎｏ、ＧＬＵｒｌ ｄｒｍｅ、ＧＬＵｒｌｌＡｄｒｍｅ、ＧＬＵｒｌｌＢｄｒｍｅ、ＧＬＵｒｌｌｌｙｓｔ、 ＧＬＵｒｌｌｙｓｔ、ＧＬＵｒｋｉｌｙｓｔ、ＧＬＵｃｌ３ｃａｅｌ、ＧＬＵｃｌａｃａ ｅｌ、ＧＬＵｃｌｂｃａｅｌ、ＧＬＵｃｌｂｈａｃｏ、ＧＬＵｃｌｄｒｍｅ、ＧＬＵｃｌ 20 ｈａｃｏ、ＧＬＵｃｌｘｃａｅｌ、およびＧＬＵｃｌｘｏｎｖｏを含むがこれらに限定さ れないグルタミン酸受容体サブユニット。 【０３１９】 他のチャネルタンパク質の例には、以下を含むがこれらに限定されない： 【０３２０】 ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＣＮＮ１Ｂ、ＳＣＮＮ１Ｇ、ＳＣＮＮ１Ｄ、ＡＣＣＮ２、ＡＣＣＮ１ 、ＡＣＣＮ３、ＡＣＣＮ４、およびＡＣＣＮ５を含むがこれらに限定されないＥＮａＣ／ ＤＥＧファミリータンパク質； 【０３２１】 ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ３、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５、ＡＱＰ６、ＡＱＰ７、ＡＱＰ７Ｐ 30 １、ＡＱＰ７Ｐ２、ＡＱＰ７Ｐ３、ＡＱＰ７Ｐ４、ＡＱＰ８、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０、Ａ ＱＰ１１、ＡＱＰ１２Ａ、およびＡＱＰ１２Ｂを含むがこれらに限定されないアクアポリ ン；ならびに 【０３２２】 ＣＬＣＡ１、ＣＬＣＡ２、ＣＬＣＡ３Ｐ、ＣＬＣＡ４、ＣＬＣＣ１、ＣＬＣＦ１、ＣＬ ＣＮ１、ＣＬＣＮ２、ＣＬＣＮ３、ＣＬＣＮ４、ＣＬＣＮ５、ＣＬＣＮ６、ＣＬＣＮ７、 ＣＬＣＮＫＡ、およびＣＬＣＮＫＢを含むがこれらに限定されない塩素イオンチャネル。 【０３２３】 膜担体／輸送体タンパク質の例には、以下を含むがこれらに限定されない： 【０３２４】 40 ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＡ５、ＡＢＣＡ６、ＡＢＣ Ａ７、ＡＢＣＡ８、ＡＢＣＡ９、ＡＢＣＡ１０、ＡＢＣＡ１１Ｐ、ＡＢＣＡ１２、ＡＢＣ Ａ１３、ＡＢＣＡ１７Ｐ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＢ６、ＡＢＣＢ ７、ＡＢＣＢ８、ＡＢＣＢ９、ＡＢＣＢ１０、ＡＢＣＢ１０Ｐ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣ Ｃ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＣ６Ｐ１ 、ＡＢＣＣ６Ｐ２、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＣ９、ＡＢＣＣ１０、ＡＢＣＣ１１、ＡＢＣＣ１ ２、ＡＢＣＣ１３、ＡＢＣＤ１、ＡＢＣＤ１Ｐ１、ＡＢＣＤ１Ｐ２、ＡＢＣＤ１Ｐ３、Ａ ＢＣＤ１Ｐ４、ＡＢＣＤ２、ＡＢＣＤ３、ＡＢＣＤ４、ＡＢＣＥ１、ＡＢＣＦ１、ＡＢＣ Ｆ２、ＡＢＣＦ３、ＡＢＣＧ１、ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＧ４、ＡＢＣＧδ、ＡＢＣＧ８、Ｔ ＡＰ１、ＴＡＰ２、ＣＦＴＲＴＡＰＢＰ、およびＴＡＰＢＰＬを含むがこれらに限定され 50 (100) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ないＡＢＣＣファミリーのタンパク質； 【０３２５】 ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ１Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣＩＡ５、ＳＬＣ１ Ａ６、ＳＬＣ１Ａ７、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ２Ａ３Ｐ１、 ＳＬＣ２Ａ３Ｐ２、ＳＬＣ２Ａ３Ｐ４、ＳＬＣ２Ａ４、ＳＬＣ２Ａ４ＲＧ、ＳＬＣ２Ａ５ 、ＳＬＣ２Ａ６、ＳＬＣ２Ａ７、ＳＬＣ２Ａ８、ＳＬＣ２Ａ９、ＳＬＣ２Ａ１０、ＳＬＣ ２Ａ１１、ＳＬＣ２Ａ１２、ＳＬＣ２Ａ１３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ２ＡＸＰ１、ＳＬ Ｃ３Ａ１、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１ＡＰ、ＳＬＣ４Ａ２、ＳＬＣ４Ａ ３、ＳＬＣ４Ａ４、ＳＬＣ４Ａ５、ＳＬＣ４Ａ７、ＳＬＣ４Ａ８、ＳＬＣ４Ａ９、ＳＬＣ ４Ａ１０、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＬＣ５Ａ２、ＳＬＣ５Ａ３、ＳＬＣ５Ａ４ 10 、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ５Ａ６、ＳＬＣ５Ａ７、ＳＬＣ５Ａ８、ＳＬＣ５Ａ９、ＳＬＣ５ ＡＩ０、ＳＬＣ５Ａ１１、ＳＬＣ５Ａ１２、ＳＬＣ６Ａ１、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＬＣ６Ａ３ 、ＳＬＣ６Ａ４、ＳＬＣ６Ａ５、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ６Ａ６Ｐ、ＳＬＣ６Ａ７、ＳＬＣ ６Ａ８、ＳＬＣ６Ａ９、ＳＬＣ６Ａ１０Ｐ、ＳＬＣ６Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１２、ＳＬＣ６ Ａ１３、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ６Ａ１５、ＳＬＣ６Ａ１６、ＳＬＣ６Ａ１７、ＳＬＣ６ Ａ１８、ＳＬＣ６Ａ１９、ＳＬＣ６Ａ２０、ＳＬＣ６Ａ２１Ｐ、ＳＬＣ７Ａ１、ＳＬＣ７ Ａ２、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＬＣ７Ａ４、ＳＬＣ７Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５Ｐ１、ＳＬＣ７Ａ６、 ＳＬＣ７Ａ６ＯＳ、ＳＬＣ７Ａ７、ＳＬＣ７Ａ８、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＬＣ７Ａ１０、ＳＬ Ｃ７Ａ１１、ＳＬＣ７Ａ１３、ＳＬＣ７Ａ１４、ＳＬＣ８Ａ１、ＳＬＣ８Ａ２、ＳＬＣ８ Ａ３、ＳＬＣ９Ａ１、ＳＬＣ９Ａ２、ＳＬＣ９Ａ３、ＳＬＣ９Ａ３Ｐ、ＳＬＣ９Ａ３Ｐ２ 20 、ＳＬＣ９Ａ３Ｐ３、ＳＬＣ９Ａ３Ｐ４、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２、ＳＬＣ ９Ａ４、ＳＬＣ９Ａ５、ＳＬＣ９Ａ６、ＳＬＣ９Ａ７、ＳＬＣ９Ａ８、ＳＬＣ９Ａ９、Ｓ ＬＣ９Ａ１０、ＳＬＣ９Ａ１１、ＳＬＣ１０Ａ１、ＳＬＣ１０Ａ２、ＳＬＣ１０Ａ３、Ｓ ＬＣ１０Ａ４、ＳＬＣ１０Ａ５、ＳＬＣ１０Ａ６、ＳＬＣ１０Ａ７、ＳＬＣ１１Ａ１、Ｓ ＬＣ１１Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ１、ＳＬＣ１２Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＬＣ１２Ａ４、Ｓ ＬＣ１２Ａ５、ＳＬＣ１２Ａ６、ＳＬＣ１２Ａ７、ＳＬＣ１２Ａ８、ＳＬＣ１２Ａ９、Ｓ ＬＣ１３Ａ１、ＳＬＣ１３Ａ２、ＳＬＣ１３Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ４、ＳＬＣ１３Ａ５、Ｓ ＬＣ１４Ａ１、ＳＬＣ１４Ａ２、ＳＬＣ１５Ａ１、ＳＬＣ１５Ａ２、ＳＬＣ１５Ａ３、Ｓ ＬＣ１５Ａ４、ＳＬＣ１５Ａ５、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１６Ａ３、Ｓ ＬＣ１６Ａ４、ＳＬＣ１６Ａ５、ＳＬＣ１６Ａ６、ＳＬＣ１６Ａ７、ＳＬＣ１６Ａ８、Ｓ 30 ＬＣ１６Ａ９、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ１１、ＳＬＣ１６Ａ１２、ＳＬＣ１６Ａ １３、ＳＬＣ１６Ａ１４、ＳＬＣ１７Ａ１、ＳＬＣ１７Ａ２、ＳＬＣ１７Ａ３、ＳＬＣ１ ７Ａ４、ＳＬＣ１７Ａ５、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＬＣ１７Ａ７、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ１ ７Ａ９、ＳＬＣ１８Ａ１、ＳＬＣ１８Ａ２、ＳＬＣ１８Ａ３、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ１ ９Ａ２、ＳＬＣ１９Ａ３、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＬＣ２０Ａ１Ｐ１、ＳＬＣ２０Ａ２、ＳＬ Ｃ２２Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣ２２Ａ３、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２２Ａ５、ＳＬ Ｃ２２Ａ６、ＳＬＣ２２Ａ７、ＳＬＣ２２Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ９、ＳＬＣ２２Ａ１０、Ｓ ＬＣ２２Ａ１１、ＳＬＣ２２Ａ１２．ＳＬＣ２２Ａ１３、ＳＬＣ２２Ａ１４、ＳＬＣ２２ Ａ１５、ＳＬＣ２２Ａ１６、ＳＬＣ２２Ａ１７、ＳＬＣ２２Ａ１８、ＳＬＣ２２Ａ１８Ａ Ｓ、ＳＬＣ２２Ａ２０、ＳＬＣ２２Ａ２３、ＳＬＣ２２Ａ２４、ＳＬＣ２２Ａ２５、ＳＬ 40 Ｃ２３Ａ１、ＳＬＣ２３Ａ２、ＳＬＣ２３Ａ３、ＳＬＣ２３Ａ４、ＳＬＣ２４Ａ１、ＳＬ Ｃ２４Ａ２、ＳＬＣ２４Ａ３、ＳＬＣ２４Ａ４、ＳＬＣ２４Ａ５、ＳＬＣ２４Ａ６、ＳＬ Ｃ２５Ａ１、ＳＬＣ２５Ａ２、ＳＬＣ２５Ａ３、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＬＣ２５Ａ５、ＳＬ Ｃ２５Ａ５Ｐ１、ＳＬＣ２５Ａ５Ｐ２、ＳＬＣ２５Ａ５Ｐ３、ＳＬＣ２５Ａ５Ｐ４、ＳＬ Ｃ２５Ａ５Ｐ５、ＳＬＣ２５Ａ５Ｐ６、ＳＬＣ２５Ａ５Ｐ７、ＳＬＣ２５Ａ５Ｐ８、ＳＬ Ｃ２５Ａ５Ｐ９、ＳＬＣ２５Ａ６、ＳＬＣ２５Ａ６Ｐ１、ＳＬＣ２５Ａ１０、ＳＬＣ２５ Ａ１１、ＳＬＣ２５Ａ１２、ＳＬＣ２５Ａ１３、ＳＬＣ２５Ａ１４、ＳＬＣ２５Ａ１５、 ＳＬＣ２５Ａ１５Ｐ、ＳＬＣ２５Ａ１６、ＳＬＣ２５Ａ１７、ＳＬＣ２５Ａ１８、ＳＬＣ ２５Ａ１９、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＳＬＣ２５Ａ２０Ｐ、ＳＬＣ２５Ａ２１、ＳＬＣ２５Ａ ２２、ＳＬＣ２５Ａ２３、ＳＬＣ２５Ａ２４、ＳＬＣ２５Ａ２５、ＳＬＣ２５Ａ２６、Ｓ 50 (101) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＬＣ２５Ａ２７、ＳＬＣ２５Ａ２８、ＳＬＣ２５Ａ２９、ＳＬＣ２５Ａ３０、ＳＬＣ２５ Ａ３１、ＳＬＣ２５Ａ３２、ＳＬＣ２５Ａ３３、ＳＬＣ２５Ａ３４、ＳＬＣ２５Ａ３５、 ＳＬＣ２５Ａ３６、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＳＬＣ２５Ａ３８、ＳＬＣ２５Ａ３９、ＳＬＣ２ ５Ａ４０、ＳＬＣ２５Ａ４１、ＳＬＣ２５Ａ４２、ＳＬＣ２５Ａ４３、ＳＬＣ２５Ａ４４ 、ＳＬＣ２５Ａ４５、ＳＬＣ２５Ａ４６、ＳＬＣ２６Ａ１、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＣ２６ Ａ３、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＬＣ２６Ａ６、ＳＬＣ２６Ａ７、ＳＬＣ２６ Ａ８、ＳＬＣ２６Ａ９、ＳＬＣ２６Ａ１０、ＳＬＣ２６Ａ１１、ＳＬＣ２７Ａ１、ＳＬＣ ２７Ａ２、ＳＬＣ２７Ａ３、ＳＬＣ２７Ａ４、ＳＬＣ２７Ａ５、ＳＬＣ２７Ａ６、ＳＬＣ ２８Ａ１、ＳＬＣ２８Ａ２、ＳＬＣ２８Ａ３、ＳＬＣ２９Ａ１、ＳＬＣ２９Ａ２、ＳＬＣ ２９Ａ３、ＳＬＣ２９Ａ４、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ３０Ａ２、ＳＬＣ３０Ａ３、ＳＬＣ 10 ３０Ａ４、ＳＬＣ３０Ａ５、ＳＬＣ３０Ａ６、ＳＬＣ３０Ａ７、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＬＣ ３０Ａ９、ＳＬＣ３０Ａ１０、ＳＬＣ３１Ａ１、ＳＬＣ３１Ａ１Ｐ、ＳＬＣ３１Ａ２、Ｓ ＬＣ３２Ａ１、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ３４Ａ１、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ３４Ａ３、Ｓ ＬＣ３５Ａ１、ＳＬＣ３５Ａ２、ＳＬＣ３５Ａ３、ＳＬＣ３５Ａ４、ＳＬＣ３５Ａ５、Ｓ ＬＣ３５Ｂ１、ＳＬＣ３５Ｂ２、ＳＬＣ３５Ｂ３、ＳＬＣ３５Ｂ４、ＳＬＣ３５Ｃ１、Ｓ ＬＣ３５Ｃ２、ＳＬＣ３５Ｄ１、ＳＬＣ３５Ｄ２、ＳＬＣ３５Ｄ３、ＳＬＣ３５Ｅ１、Ｓ ＬＣ３５Ｅ２、ＳＬＣ３５Ｅ３、ＳＬＣ３５Ｅ４、ＳＬＣ３５Ｆ１、ＳＬＣ３５Ｆ２、Ｓ ＬＣ３５Ｆ３、ＳＬＣ３５Ｆ４、ＳＬＣ３５Ｆ５、ＳＬＣ３６Ａ１、ＳＬＣ３６Ａ２、Ｓ ＬＣ３６Ａ３、ＳＬＣ３６Ａ４、ＳＬＣ３７Ａ１、ＳＬＣ３７Ａ２、ＳＬＣ３７Ａ３、Ｓ ＬＣ３７Ａ４、ＳＬＣ３８Ａ１、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ３８Ａ３、ＳＬＣ３８Ａ４、Ｓ 20 ＬＣ３８Ａ５、ＳＬＣ３８Ａ６、ＳＬＣ３８Ａ７、ＳＬＣ３８Ａ８、ＳＬＣ３８Ａ９、Ｓ ＬＣ３８Ａ１０、ＳＬＣ３８Ａ１１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ３ 、ＳＬＣ３９Ａ４、ＳＬＣ３９Ａ５、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＬＣ３９Ａ７、ＳＬＣ３９Ａ８ 、ＳＬＣ３９Ａ９、ＳＬＣ３９Ａ１０、ＳＬＣ３９Ａ１１、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＳＬＣ３ ９Ａ１３、ＳＬＣ３９Ａ１４、ＳＬＣ４０Ａ１、ＳＬＣ４１Ａ１、ＳＬＣ４１Ａ２、ＳＬ Ｃ４１Ａ３、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＬＣ４４Ａ１、ＳＬＣ ４４Ａ２、ＳＬＣ４４Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ４５Ａ１、ＳＬＣ ４５Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＬＣ４５Ａ４、ＳＬＣ４６Ａ１、ＳＬＣ４６Ａ２、ＳＬＣ ４６Ａ３、ＳＬＣ４７Ａ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＬＣ４８Ａ１、ＳＬＣＯ１Ａ２、ＳＬＣ Ｏ１Ｂ１、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＳＬＣＯ１Ｃ１、ＳＬＣＯ２Ａ１、ＳＬＣＯ２Ｂ１、ＳＬＣ 30 Ｏ３Ａ１、ＳＬＣＯ４Ａ１、ＳＬＣＯ４Ｃ１、ＳＬＣＯ５Ａ１、およびＳＬＣＯ６Ａ１を 含むがこれらに限定されない可溶性担体ファミリーのタンパク質； 【０３２６】 ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＴＰ１ Ｂ２、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ１Ｂ３Ｐ１、ＡＴＰ１Ｂ４、ＡＴＰ１Ｌ１、ＡＴＰ２Ａ１、 ＡＴＰ２Ａ２、ＡＴＰ２Ａ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ ４、ＡＴＰ２Ｃ１、ＡＴＰ２Ｃ２、ＡＴＰ３、ＡＴＰ４Ａ、ＡＴＰ４Ｂ、ＡＴＰ５Ａ１、 ＡＴＰ５ＡＬ１、ＡＴＰ５ＡＰ１、ＡＴＰ５ＡＰ２、ＡＴＰ５ＡＰ３、ＡＴＰ５ＡＰ４、 ＡＴＰ５Ｂ、ＡＴＰ５ＢＬ１、ＡＴＰ５ＢＬ２、ＡＴＰ５Ｃ１、ＡＴＰ５Ｃ２、ＡＴＰ５ Ｄ、ＡＴＰ５Ｅ、ＡＴＰ５ＥＰ１、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＡＴＰ５Ｆ１、ＡＴＰ５Ｇ１、ＡＴ 40 Ｐ５Ｇ２、ＡＴＰ５Ｇ３、ＡＴＰ５ＧＰ１、ＡＴＰ５ＧＰ２、ＡＴＰ５ＧＰ３、ＡＴＰ５ ＧＰ４、ＡＴＰ５Ｈ、ＡＴＰ５ＨＰ１、ＡＴＰ５Ｉ、ＡＴＰ５Ｊ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＡＴＰ ５Ｊ２ＬＰ、ＡＴＰ５Ｊ２Ｐ２、ＡＴＰ５Ｊ２Ｐ３、ＡＴＰ５Ｊ２Ｐ４、ＡＴＰ５Ｊ２Ｐ ５、ＡＴＰ５Ｊ２Ｐ６、ＡＴＰ５Ｌ、ＡＴＰ５ＬＰ１、ＡＴＰ５ＬＰ２、ＡＴＰ５ＬＰ３ 、ＡＴＰ５Ｏ、ＡＴＰ５Ｓ、ＡＴＰ５ＳＬ、ＡＴＰ６ＡＰ１、ＡＴＰ６ＡＰ１Ｌ、ＡＴＰ ６ＡＰ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、 ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｄ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｅ２、ＡＴＰ６Ｖ １ＥＬ１、ＡＴＰ６Ｖ１ＥＰ１、ＡＴＰ６Ｖ１ＥＰ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ １、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ３、ＡＴＰ６Ｖ１ＧＰ１、ＡＴＰ６Ｖ１ＧＰ２、 ＡＴＰ６Ｖ１Ｈ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ４、ＡＴＰ６Ｖ 50 (102) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ０Ｂ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｃ、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ１、ＡＴＰ６Ｖ０Ｄ２、ＡＴＰ６Ｖ０Ｅ１、ＡＴ Ｐ６Ｖ０Ｅ２、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、およびＡＴＰ８Ａ１を含むがこれらに限定され ないＡＴＰ輸送体；ならびに 【０３２７】 ＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰ２、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ３Ｐ２、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、Ｆ ＡＢＰ５Ｌ１、ＦＡＢＰ５Ｌ２、ＦＡＢＰ５Ｌ３、ＦＡＢＰ５Ｌ４、ＦＡＢＰ５Ｌ５、Ｆ ＡＢＰ５Ｌ６、ＦＡＢＰ５Ｌ７、ＦＡＢＰ５Ｌ８、ＦＡＢＰ５Ｌ９、ＦＡＢＰ５Ｌ１０、 ＦＡＢＰ５Ｌ１１、ＦＡＢＰ５Ｌ１２、ＦＡＢＰ６、ＦＡＢＰ７、ＦＡＢＰ９、およびＦ ＡＢＰ１２を含むがこれらに限定されない脂肪酸結合タンパク質； 【０３２８】 10 ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦ２ＡＳ、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、 ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＧＦＡＬＳ、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、 ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦＢＰ７、ＩＧＦＢＰ Ｌ１、ＩＧＦＬ１、ＩＧＦＬ１Ｐ１、ＩＧＦＬ１Ｐ２、 ＩＧＦＬ２、ＩＧＦＬ３、ＩＧＦＬ４、およびＩＧＦＮ１を含むがこれらに限定されない インスリン様増殖因子； 【０３２９】 ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ１１１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧ ＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＧＦＢＲＡＰ１、 ＴＧＦＢＲＥ、ＬＥＦＴＹ１、ＬＥＦＴＹ２、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１ＡＰＳ１、ＢＭ 20 ＰＲ１ＡＰＳ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、 ＢＭＰＲ２、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ１Ｃ、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＣＶＲ２Ｂ、 およびＡＣＶＲＬ１を含むがこれらに限定されないトランスフォーミング増殖因子； 【０３３０】 ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｈ５Ｐ、ＮＲ １Ｉ１．ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ１Ｉ４、ＮＲ２Ａ１、ＮＲ２Ａ２、ＮＲ２Ｂ１、 ＮＲ２Ｂ２、ＮＲ２Ｂ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｃ２ＡＰ、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ１Ｐ、ＮＲ３Ｃ２ 、ＮＲ３Ｃ３、ＮＲ３Ｃ４、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５ Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＡＰ、ＮＲＡＲＰ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲＢＦ２、ＮＲ 30 ＢＰ１、ＮＲＢＰ２、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＩＰ１、ＮＲＩＰ２、およびＮＲＩＰ３を含むが これらに限定されない核受容体； 【０３３１】 ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＲＡＲＲＥＳ２、およびＲＡＲＲＥ Ｓ３を含むがこれらに限定されないレチノイン酸受容体； 【０３３２】 ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＯＲＡ、ＲＯＲＢ、およびＲＯＲＣを含むがこれらに限定され ない受容体チロシンキナーゼオーファンおよびＲＡＲ関連タンパク質； 【０３３３】 ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、およびＰＰＡＲＧＣ１Ｂを 40 含むがこれらに限定されないぺルオキシソーム増殖因子活性化受容体； 【０３３４】 ＴＨＲＡ、ＴＨＲＡＰ３、ＴＨＲＡＰ３Ｌ、ＴＨＲＢ、およびＴＨＲＳＰを含むがこれ らに限定されない甲状腺ホルモン受容体； 【０３３５】 ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＳＲＰ１、ＥＳＲＰ２、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＡＰ１、ＥＳＲ ＲＡＰ２、ＥＳＲＲＢ、およびＥＳＲＲＧを含むがこれらに限定されないエストロゲン受 容体、上皮スプライシング調節タンパク質、およびエストロゲン関連受容体； 【０３３６】 ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ２ＩＰ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、およびＥＧＦＲを含むがこれ 50 (103) JP 2012-516687 A 2012.7.26 らに限定されない赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子； 【０３３７】 ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、お よびＰＤＧＦＲＬを含むがこれらに限定されない血小板由来増殖因子； 【０３３８】 ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ１ＯＰ２、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ ３Ｐ、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ６、およびＦＧＦＲＬ１を含むがこれらに限定されない線維 芽細胞由来増殖因子； 【０３３９】 ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ２、ＬＴＢＰ３、およびＬＴＢＰ４を含むがこれらに限定されな 10 い潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質； 【０３４０】 ＲＢＰ１、ＲＢＰ２、ＲＢＰ３、ＲＢＰ４、ＲＢＰ５、ＲＢＰ７、ＲＢＰＪ、ＲＢＰＪ Ｌ、ＲＢＰＪＰ１、ＲＢＰＪＰ２、ＲＢＰＪＰ３、ＲＢＰＪＰ４、ＲＢＰＭＳ、ＲＢＰＭ Ｓ２、およびＲＢＰＭＳＬＰを含むがこれらに限定されないビタミン担体タンパク質； 【０３４１】 ＳＴＡＲ、ＳＴＡＲＤ３、ＳＴＡＲＤ３ＮＬ、ＳＴＡＲＤ４、ＳＴＡＲＤ５、ＳＴＡＲ Ｄ６、ＳＴＡＲＤ７、ＳＴＡＲＤ８、ＳＴＡＲＤ９、ＳＴＡＲＤ１０、ＳＴＡＲＤ１３、 およびＳＴＡＲＰ１を含むがこれらに限定されないステロイド産生急性調節タンパク質； 【０３４２】 20 ＳＣＰ２およびＳＣＰＥＰ１を含むがこれらに限定されないステロール担体タンパク質 ； 【０３４３】 ＧＬＴＰ、ＧＬＴＰＤ１、ＧＬＴＰＤ２、およびＧＬＴＰＰ１を含むがこれらに限定さ れない糖脂質転移タンパク質；ならびに 【０３４４】 他の輸送タンパク質、例えばＣＥＴＰ。 【０３４５】 関心対象のタンパク質の他の例には下記を含むが、これらに限定されない： 【０３４６】 30 ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＢＤ１、ＴＲＢＤ２、ＴＲＢＪ１−１、ＴＲＢＪ１−２ 、ＴＲＢＪ１−３、ＴＲＢＪ１−４、ＴＲＢＪ１−５．ＴＲＢＪ１−６．ＴＲＢＪ２−１ 、ＴＲＢＪ２−２、ＴＲＢＪ２−２Ｐ．ＴＲＢＪ２−３、ＴＲＢＪ２−４、ＴＲＢＪ２− ５、ＴＲＢＪ２−６、ＴＲＢＪ２−７、ＴＲＢＶ１、ＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３−１、ＴＲ ＢＶ３−２、ＴＲＢＶ４−１、ＴＲＢＶ４−２、ＴＲＢＶ４−３、ＴＲＢＶ５−１、ＴＲ ＢＶ５−２、ＴＲＢＶ５−３、ＴＲＢＶ５−４、ＴＲＢＶ５−５、ＴＲＢＶ５−６、ＴＲ ＢＶ５−７、ＴＲＢＶ５−８、ＴＲＢＶ６−１、ＴＲＢＶ６−２、ＴＲＢＶ６−３、ＴＲ ＢＶ６−４、ＴＲＢＶ６−５、ＴＲＢＶ６−６、ＴＲＢＶ６−７、ＴＲＢＶ６−８、ＴＲ ＢＶ６−９、ＴＲＢＶ７−１、ＴＲＢＶ７−２、ＴＲＢＶ７−３、ＴＲＢＶ７−４、ＴＲ ＢＶ７−５、ＴＲＢＶ７−６、ＴＲＢＶ７−７、ＴＲＢＶ７−８、ＴＲＢＶ７−９、ＴＲ 40 ＢＶ８−１、ＴＲＢＶ８−２、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０−１、ＴＲＢＶ１０−２、ＴＲ ＢＶ１０−３、ＴＲＢＶ１１−１、ＴＲＢＶ１１−２、ＴＲＢＶ１１−３、ＴＲＢＶ１２ −１、ＴＲＢＶ１２−２、ＴＲＢＶ１２−３、ＴＲＢＶ１２−４、ＴＲＢＶ１２−５、Ｔ ＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１７、ＴＲＢＶ１８ 、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０−１、ＴＲＢＶ２０ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ２１−１、ＴＲ ＢＶ２１ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ２２−１、ＴＲＢＶ２２ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ２３−１、 ＴＲＢＶ２３ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ２４−１、ＴＲＢＶ２４ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ２５− １、ＴＲＢＶ２５ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ２６、ＴＲＢＶ２６ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ２７、 ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９−１、ＴＲＢＶ２９ＯＲ９−２、ＴＲＢＶ３０、ＴＲＢＶＡ 、ＴＲＢＶＡＯＲ９−２、ＴＲＢＶＢ、およびＴＲＢＶＯＲ９を含むがこれらに限定され 50 (104) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ないＴ細胞受容体β定常部１； 【０３４７】 ＡＤＡＭ１、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３Ａ、ＡＤＡＭ３Ｂ、ＡＤＡＭ５Ｐ、ＡＤＡＭ６、 ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２、Ａ ＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１ 、ＡＤＡＭ２１Ｐ、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡ Ｍ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴ Ｓ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴ Ｓ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡ ＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１ 10 ７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳＩ９、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤ ＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＤＡＭＴＳＬ４、およびＡＤＡＭＴＳＬ５を含むが これらに限定されないディスインテグリン； 【０３４８】 ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２．ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ５、ＩＴ ＧＡ６、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ８、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ１０、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ Ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＡＷ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴ ＧＢ１、ＩＴＧＢ１ＢＰ１、ＩＴＧＢ１ＢＰ２、ＩＴＧＢ１ＢＰ３、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧ Ｂ３、ＩＴＧＢ３ＢＰ、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＩＴＧＢ８ 、およびＩＴＧＢＬ１を含むがこれらに限定されないインテグリン； 20 【０３４９】 ＮＣＡＭ１、ＮＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＩＣＡ Ｍ４、ＩＣＡＭ５、ＰＥＣＡＭ１、Ｌ１ＣＡＭ、ＣＨＬ１、ＭＡＧ、ＣＡＤＭ１、ＣＡＤ Ｍ２、ＣＡＤＭ３、およびＣＡＤＭ４を含むがこれらに限定されない細胞接着分子； 【０３５０】 ＯＲ１０Ａ１、ＯＲ１０Ａ３、ＯＲ１０Ａ４、ＯＲ１０Ａ５、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ１０ Ａ７、ＯＲ１０Ｃ１、ＯＲ１０Ｃ２、ＯＲ１０Ｄ４、ＯＲ１０Ｇ２、ＯＲ１０Ｇ３、ＯＲ １０Ｇ４、ＯＲ１０Ｇ７、ＯＲ１０Ｇ８、ＯＲ１０Ｇ９、ＯＲ１０Ｈ１、ＯＲ１０Ｈ２、 ＯＲ１０Ｈ３、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｊ１、ＯＲ１０Ｊ３、ＯＲ１０Ｊ ５、ＯＲ１０Ｊ６、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ１０Ｋ２、ＯＲ１０Ｑ１、ＯＲ１０Ｒ２、ＯＲ１ 30 ０Ｓ１、ＯＲ１０Ｔ２、ＯＲ１０Ｖ１、ＯＲ１０Ｚ１、ＯＲ１１Ａ１、ＯＲ１１Ｇ２．Ｏ Ｒ１１Ｈ１、ＯＲ１１Ｈ４、ＯＲ１１Ｈ６、ＯＲ１１Ｈ７Ｐ、ＯＲ１１Ｌ１、ＯＲ１２Ｄ ３、ＯＲ１３Ａ１、ＯＲ１３Ｃ２、ＯＲ１３Ｃ３、ＯＲ１３Ｃ４、ＯＲ１３Ｃ５、ＯＲ１ ３Ｃ７、ＯＲ１３Ｃ８、ＯＲ１３Ｃ９、ＯＲ１３Ｄ１、ＯＲ１３Ｅ２、ＯＲ１３Ｆ１、Ｏ Ｒ１３Ｇ１、ＯＲ１３Ｈ１、ＯＲ１３Ｊ１、ＯＲ１４Ａ１６、ＯＲ１４Ａ２、ＯＲ１４Ｃ ３６、ＯＲ１４Ｊ１．ＯＲ１Ａ１、ＯＲ１Ａ２、ＯＲ１Ａ２、ＯＲ１Ｂ１、ＯＲ１Ｃ１、 ＯＲ１Ｄ２、ＯＲ１Ｄ４、ＯＲ１Ｄ５、ＯＲ１Ｅ１、ＯＲ１Ｅ２、ＯＲ１Ｅ２、ＯＲ１Ｅ ５、ＯＲ１Ｅ５、ＯＲ１Ｅ６、ＯＲ１Ｅ７、ＯＲ１Ｆ１、ＯＲ１Ｆ１０．ＯＲ１Ｆ１１、 ＯＲ１Ｆ１２、ＯＲ１Ｆ２、ＯＲ１Ｇ１、ＯＲ１１１、ＯＲ１Ｊ１、ＯＲ１Ｊ２、ＯＲ１ Ｊ２、ＯＲ１Ｊ４、ＯＲ１Ｊ５、ＯＲ１Ｋ１、ＯＲ１Ｌ１、ＯＲ１Ｌ３、ＯＲ１Ｌ４、Ｏ 40 Ｒ１Ｌ６、ＯＲ１Ｌ８、ＯＲ１Ｍ１、ＯＲ１Ｍ１、ＯＲ１Ｎ１、ＯＲ１Ｎ２、ＯＲ１Ｎ３ 、ＯＲ１Ｑ１、ＯＲ１Ｓ１、ＯＲ１Ｓ２、ＯＲ２Ａ１、ＯＲ２Ａ１０、ＯＲ２Ａ１９、Ｏ Ｒ２Ａ２０、ＯＲ２Ａ２１、ＯＲ２Ａ４、ＯＲ２Ａ４２、ＯＲ２Ａ５、ＯＲ２Ａ６、ＯＲ ２Ａ７、ＯＲ２ＡＥ１、ＯＲ２ＡＪ１、ＯＲ２ＡＫ２、ＯＲ２Ｂ１、ＯＲ２Ｂ２、ＯＲ２ Ｂ３、ＯＲ２Ｂ６、ＯＲ２Ｂ９、ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｄ１、ＯＲ２Ｄ２、ＯＲ２Ｄ３、Ｏ Ｒ２Ｆ１、ＯＲ２Ｆ２、ＯＲ２Ｆ３、ＯＲ２Ｇ２、ＯＲ２Ｇ３、ＯＲ２Ｈ１、ＯＲ２Ｈ２ 、ＯＲ２Ｈ３、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｊ３、ＯＲ２Ｋ１、ＯＲ２Ｋ２、ＯＲ２Ｌ１、ＯＲ２ Ｌ２、ＯＲ２Ｌ３、ＯＲ２Ｌ５、ＯＲ２Ｌ８、ＯＲ２Ｍ１、ＯＲ２Ｍ２、ＯＲ２Ｍ４、Ｏ Ｒ２Ｓ２、ＯＲ２Ｔ１、ＯＲ２Ｔ３、ＯＲ２Ｔ４、ＯＲ２Ｔ５、ＯＲ２Ｔ６、ＯＲ２Ｔ７ 、ＯＲ２Ｔ８、ＯＲ２Ｖ１、ＯＲ２Ｖ２、ＯＲ２Ｖ３、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ２Ｗ３、ＯＲ２ 50 (105) JP 2012-516687 A 2012.7.26 Ｙ１、ＯＲ２Ｚ１、ＯＲ３Ａ１、ＯＲ３Ａ２、ＯＲ３Ａ３、ＯＲ３Ａ４、ＯＲ４Ａ１５、 ＯＲ４Ａ１６、ＯＲ４Ａ４、ＯＲ４Ａ５、ＯＲ４Ｂ１、ＯＲ４Ｃ１２、ＯＲ４Ｃ１３、Ｏ Ｒ４Ｃ１５、ＯＲ４Ｃ１６、ＯＲ４Ｃ３、ＯＲ４Ｃ６、ＯＲ４Ｄ１、ＯＲ４Ｄ２、ＯＲ４ Ｄ５、ＯＲ４Ｄ６、ＯＲ４Ｄ９、ＯＲ４Ｅ２、ＯＲ４Ｆ１０、ＯＲ４Ｆ１５、ＯＲ４Ｆ１ ６、ＯＲ４Ｆ１６、ＯＲ４Ｆ１７、ＯＲ４Ｆ１８、ＯＲ４Ｆ１９、ＯＲ４Ｆ３、ＯＲ４Ｆ ６、ＯＲ４Ｋ１、ＯＲ４Ｋ１３、ＯＲ４Ｋ１４、ＯＲ４Ｋ１５、ＯＲ４Ｋ１７、ＯＲ４Ｋ ２、ＯＲ４Ｋ３、ＯＲ４Ｋ５、ＯＲ４Ｌ１、ＯＲ４Ｍ１、ＯＲ４Ｍ２、ＯＲ４Ｎ２、ＯＲ ４Ｎ４、ＯＲ４Ｎ５、ＯＲ４Ｐ４、ＯＲ４Ｑ３、ＯＲ４Ｓ１、ＯＲ４Ｘ１、ＯＲ４Ｘ２、 ＯＲ５１Ａ２、ＯＲ５１Ａ４、ＯＲ５１Ａ７、ＯＲ５１Ｂ２、ＯＲ５１Ｂ４、ＯＲ５１Ｄ １、ＯＲ５１Ｅ１、ＯＲ５１Ｅ２、ＯＲ５１Ｆ２、ＯＲ５１Ｇ１、ＯＲ５１Ｇ２、ＯＲ５ 10 １Ｈ１、ＯＲ５１１１、ＯＲ５１１２、ＯＲ５１Ｌ１、ＯＲ５１Ｍ１、ＯＲ５１Ｑ１、Ｏ Ｒ５１Ｓ１、ＯＲ５１Ｔ１、ＯＲ５２Ａ１、ＯＲ５２Ａ２、ＯＲ５２Ｂ２、ＯＲ５２Ｂ４ 、ＯＲ５２Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ４、ＯＲ５２Ｂ６、ＯＲ５２Ｄ１、ＯＲ５２Ｅ２、ＯＲ５２ Ｅ４、ＯＲ５２Ｅ５、ＯＲ５２Ｅ６、ＯＲ５２Ｅ８、ＯＲ５２Ｈ１、ＯＲ５２Ｉ１、ＯＲ ５２Ｉ２、ＯＲ５２Ｊ３、ＯＲ５２Ｋ１、ＯＲ５２Ｋ２、ＯＲ５２Ｌ１、ＯＲ５２Ｌ２、 ＯＲ５２Ｎ１、ＯＲ５２Ｎ２、ＯＲ５２Ｎ４、ＯＲ５２Ｎ５、ＯＲ５２Ｐ１、ＯＲ５２Ｒ １、ＯＲ５６Ａ４、ＯＲ５６Ａ６、ＯＲ５６Ｂ２、ＯＲ５６Ｂ４、ＯＲ５Ａ１、ＯＲ５Ａ ２、ＯＲ５ＡＣ２、ＯＲ５ＡＫ２、ＯＲ５ＡＫ３、ＯＲ５ＡＮ１、ＯＲ５ＡＰ２、ＯＲ５ ＡＲ１、ＯＲ５ＡＳ１、ＯＲ５ＡＵ１、ＯＲ５ＡＵ１、ＯＲ５Ｂ１３、ＯＲ５Ｂ１６、Ｏ Ｒ５Ｂ１７、ＯＲ５Ｂ２、ＯＲ５Ｂ３、ＯＲ５Ｃ１、ＯＲ５Ｄ１３、ＯＲ５Ｄ１４、ＯＲ 20 ５Ｄ１６、ＯＲ５Ｄ１８、ＯＲ５Ｆ１、ＯＲ５Ｇ３、ＯＲ５Ｈ１、ＯＲ５Ｈ２、ＯＲ５Ｈ ６、ＯＲ５Ｉ１、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ５Ｋ２、ＯＲ５Ｌ１、ＯＲ５Ｌ２、ＯＲ５Ｍ１、ＯＲ ５Ｍ１０、ＯＲ５Ｍ１１、ＯＲ５Ｍ１１、ＯＲ５Ｍ３、ＯＲ５Ｍ３、ＯＲ５Ｍ８、ＯＲ５ Ｍ９、ＯＲ５Ｐ２、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５Ｔ２、ＯＲ５Ｔ３、ＯＲ５Ｖ１、ＯＲ６Ａ１、Ｏ Ｒ６Ｂ１、ＯＲ６Ｂ２、ＯＲ６Ｃ１、ＯＲ６Ｃ２、ＯＲ６Ｃ３、ＯＲ６Ｆ１、ＯＲ６Ｊ２ 、ＯＲ６Ｋ３、ＯＲ６Ｋ６、ＯＲ６Ｍ１、ＯＲ６Ｎ１、ＯＲ６Ｎ２、ＯＲ６Ｐ１、ＯＲ６ Ｑ１、ＯＲ６Ｓ１、ＯＲ６Ｔ１、ＯＲ６Ｖ１、ＯＲ６Ｘ１、ＯＲ６Ｙ１、ＯＲ７Ａ１０、 ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ａ２、ＯＲ７Ａ５、ＯＲ７Ｃ１、ＯＲ７Ｃ２、ＯＲ７Ｄ２、ＯＲ７ Ｄ２、ＯＲ７Ｄ４Ｐ、ＯＲ７Ｅ１０２、ＯＲ７Ｅ１２０、ＯＲ７Ｇ１、ＯＲ７Ｇ２、ＯＲ ７Ｇ３、ＯＲ８Ａ１、ＯＲ８Ｂ１２、ＯＲ８Ｂ２、ＯＲ８Ｂ３、ＯＲ８Ｂ４、ＯＲ８Ｂ８ 30 、ＯＲ８Ｄ１、ＯＲ８Ｄ２、ＯＲ８Ｄ４、ＯＲ８Ｇ１、ＯＲ８Ｇ２、ＯＲ８Ｈ１、ＯＲ８ Ｈ２、ＯＲ８Ｈ３、ＯＲ８Ｉ２、ＯＲ８Ｊ１、ＯＲ８Ｊ３、ＯＲ８Ｋ１、ＯＲ８Ｋ３、Ｏ Ｒ８Ｋ５、ＯＲ９Ａ２、ＯＲ９Ａ４、ＯＲ９Ｇ１、ＯＲ９Ｇ４、ＯＲ９Ｇ５、ＯＲ９Ｉ１ 、ＯＲ９Ｋ２、およびＯＲ９Ｑ１を含むがこれらに限定されないヒト匂い受容体；ならび に 【０３５１】 ＩＯＲ１００、ＩＯＲ１０１、ＩＯＲ１０２、ＩＯＲ１０３、ＩＯＲ１０４、ＩＯＲ１ ０５、ＩＯＲ１０６、ＩＯＲ１０７、ＩＯＲ１０８、ＩＯＲ１０９、ＩＯＲ１１０、ＩＯ Ｒ１１１、ＩＯＲ１１２、ＩＯＲ１１３、ＩＯＲ１１４、ＩＯＲ１１５、ＩＯＲ１１６、 ＩＯＲ１１７、ＩＯＲ１１８、ＩＯＲ１１９、ＩＯＲ１２０、ＩＯＲ１２１、ＩＯＲ１２ 40 ２、ＩＯＲ１２３、ＩＯＲ１２４、ＩＯＲ１２５、ＩＯＲ１２６、ＩＯＲ１２７、ＩＯＲ ４９、ＩＯＲ５０、ＩＯＲ５１、ＩＯＲ５２、ＩＯＲ５３、ＩＯＲ５４、ＩＯＲ５５、Ｉ ＯＲ５６、ＩＯＲ５７、ＩＯＲ５８、ＩＯＲ５９、ＩＯＲ６０、ＩＯＲ６１、ＩＯＲ６２ 、ＩＯＲ６３、ＩＯＲ６４、ＩＯＲ６５、ＩＯＲ６６、ＩＯＲ６７、ＩＯＲ６８、ＩＯＲ ６９、ＩＯＲ７０、ＩＯＲ７１、ＩＯＲ７２、ＩＯＲ７３、ＩＯＲ７４、ＩＯＲ７５、Ｉ ＯＲ７６、ＩＯＲ７７、ＩＯＲ７８、ＩＯＲ７９、ＩＯＲ８０、ＩＯＲ８１、ＩＯＲ８２ 、ＩＯＲ８３、ＩＯＲ８４、ＩＯＲ８５、ＩＯＲ８６、ＩＯＲ８７、ＩＯＲ８８、ＩＯＲ ８９、ＩＯＲ９０、ＩＯＲ９１、ＩＯＲ９２、ＩＯＲ９３、ＩＯＲ９４、ＩＯＲ９５、Ｉ ＯＲ９６、ＩＯＲ９７、ＩＯＲ９８、ＩＯＲ９９、ＯＲＬ７０７７、ＯＲＬ７０７８、Ｏ ＲＬ７０７９、ＯＲＬ７０８０、ＯＲＬ７０８１、ＯＲＬ７０８２、ＯＲＬ７０８３、Ｏ 50 (106) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＲＬ７０８４、ＯＲＬ７０８５、ＯＲＬ７０８６、ＯＲＬ７０８７、ＯＲＬ７０８８、Ｏ ＲＬ７０８９、ＯＲＬ７０９０、ＯＲＬ７０９１、ＯＲＬ７０９２、ＯＲＬ７０９３、Ｏ ＲＬ７０９４、ＯＲＬ７０９５、ＯＲＬ７０９６、ＯＲＬ７０９７、ＯＲＬ７０９８、Ｏ ＲＬ７０９９、ＯＲＬ７１００、ＯＲＬ７１０１、ＯＲＬ７１０２、ＯＲＬ７１０３、Ｏ ＲＬ７１０４、ＯＲＬ７１０５、ＯＲＬ７１０６、ＯＲＬ７１０７、ＯＲＬ７１０８、Ｏ ＲＬ７１０９、ＯＲＬ７１１０、ＯＲＬ７１１１、ＯＲＬ７１１２、ＯＲＬ７１１３、Ｏ ＲＬ７１１４、ＯＲＬ７１１５、ＯＲＬ７１１６、ＯＲＬ７１１７、ＯＲＬ７１１８、Ｏ ＲＬ７１１９、ＯＲＬ７１２０、ＯＲＬ７１２１、ＯＲＬ７１２２、ＯＲＬ７１２３、Ｏ ＲＬ７１２４、ＯＲＬ７１２５、ＴＰＲ２３０７、ＴＰＲ２３０８、ＴＰＲ２３０９、Ｔ ＰＲ２３１０、ＴＰＲ２３１２、ＴＰＲ２３１４、ＴＰＲ２３１５、ＴＰＲ２３１６、Ｔ 10 ＰＲ２３１７、ＴＰＲ２３１８、ＴＰＲ２３１９、ＴＰＲ２３２０、ＴＰＲ２３２１、Ｔ ＰＲ２３２１、ＴＰＲ６９８、ＴＰＲ６９９、ＴＰＲ７００、ＴＰＲ７０１、ＴＰＲ７０ ２、ＴＰＲ７０３、ＴＰＲ７０４、ＴＰＲ７０５、ＴＰＲ７０６、ＴＰＲ７０７、ＴＰＲ ７０８、ＴＰＲ７０９、ＴＰＲ７１０、ＴＰＲ７１１、ＴＰＲ７１２、ＴＰＲ７１３、Ｔ ＰＲ７１４、ＴＰＲ７１５、ＴＰＲ７１６、ＴＰＲ７１７、ＴＰＲ７１８、ＴＰＲ７１９ 、ＴＰＲ７２０、ＴＰＲ７２１、ＴＰＲ７２２、ＴＰＲ７２３、ＴＰＲ７２４、ＴＰＲ７ ２５、ＴＰＲ７２５、ＴＰＲ７２６、ＴＰＲ７２７、ＴＰＲ７２８、ＴＰＲ７２９、ＴＰ Ｒ７３０、ＴＰＲ７３１、ＴＰＲ７３２、ＴＰＲ７３３、ＴＰＲ７３４、ＴＰＲ７３５、 ＴＰＲ７３６、ＴＰＲ７３７、ＴＰＲ７３８、ＴＰＲ７３９、ＴＰＲ７４０、ＴＰＲ７４ １、ＴＰＲ７４２、ＴＰＲ７４３、ＴＰＲ７４４、ＴＰＲ７４５、ＴＰＲ７４６、ＴＰＲ 20 ７４７、ＴＰＲ７４８、ＴＰＲ７４９、ＴＰＲ７５０、ＴＰＲ７５１、ＴＰＲ７５２、Ｔ ＰＲ７５３、ＴＰＲ７５４、ＴＰＲ７５５、ＴＰＲ７５６、ＴＰＲ７５７、ＴＰＲ７５８ 、ＴＰＲ７５９、ＴＰＲ７６０、ＴＰＲ７６１、ＴＰＲ７６２、ＴＰＲ７６３、ＴＰＲ７ ６４、ＴＰＲ７６５、ＴＰＲ７６６、ＴＰＲ７６７、ＴＰＲ７６８、ＴＰＲ７６９、ＴＰ Ｒ７７０、ＴＰＲ７７１、およびＴＰＲ７７２を含むがこれらに限定されない蚊（ガンビ アハマダラカ）匂い受容体。 【０３５２】 関心対象のタンパク質のさらなる例は、下記の表７∼２２において見出されることがで きる。具体的な実施態様において、表７∼２２に列挙されたタンパク質のスプライスした 形態および／または一塩基多型が発現され得る。特定の実施態様において、表７∼２２に 30 列挙された任意のタンパク質の任意の組み合わせは、細胞において同時発現され得る。 【０３５３】 一態様において、本発明の細胞および細胞株は、細胞ベースのアッセイにおいて使用す るのに適している。このような細胞および細胞株は、関心対象のタンパク質の一貫しかつ 再生可能な発現を経時的に提供し、従って、このようなアッセイにおいて特に有利である 。 【０３５４】 別の態様において、本発明は、生物学的分子の産生に適した細胞および細胞株を提供す る。このような使用のための細胞および細胞株は、例えば、機能的であるかまたは機能的 となることのできるタンパク質またはポリペプチドの一貫した発現を特徴とする。本発明 40 はさらに、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を安定して発現する細胞および細胞株を作 製するための方法を提供する。本発明の方法を用いて、当業者は、多量体タンパク質（例 えば、ヘテロ多量体タンパク質）などの複合体タンパク質および細胞毒性であるタンパク 質を含めた機能的形態の任意の所望のタンパク質を発現する細胞および細胞株を作製する ことができる。本明細書に開示された方法によって、本発明に先立ってまだ作製されてい ない機能的タンパク質を安定して発現する操作された細胞および細胞株の作製が可能とな る。理論によって結びつけられることなく、方法は、任意の所望のセットの条件下で非常 に多数の細胞または細胞株の研究を可能にするので、より少数の集団では作製されないで あろう、またはさもなくば、所望の条件下で機能的形態にある所望のタンパク質を発現す ることが、認められ得ずかつ最適に適した、稀有な細胞の同定を可能にすることができる 50 (107) JP 2012-516687 A 2012.7.26 と考えられる。理論によって制限されることなく、関心対象の多くのＲＮＡおよびタンパ ク質は通常、特化した細胞（例えば、特異的な組織の細胞、特化した組織の細胞、特化し た機能の細胞、特化した細胞ドメインまたは細胞内区画を有する細胞、感覚細胞、ニュー ロン、味蕾、上皮細胞、幹細胞、癌細胞、筋肉細胞、眼の細胞、抗体を産生する細胞、高 レベルのタンパク質を産生する細胞、および本明細書に開示された種々の細胞種類）にお いて発現する。特化した細胞は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の非毒性のまたは天 然の機能的なまたは生理学的な発現のための特異的な生物学的または細胞の状況の、背景 の、または遺伝子的な構造を提供し得る。例えば、特化した細胞は、関心対象のＲＮＡま たはタンパク質の充分な、適切な、もしくは最適な発現、量子論、酸性、折りたたみ、組 み立て、翻訳後修飾、ターゲティング、膜への組み込み、分泌、機能、薬理学または生理 10 学のためのアクセサリー因子、またはシャペロン、または特化した細胞区画を含めた因子 を提供し得る。通常では発現しない関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を発現するよう細 胞または細胞株を操作すると、結果として、これらの条件が、関連する細胞毒性なしに関 心対象のＲＮＡまたはタンパク質の最適な発現または機能について繰り返しも近似もしな い細胞または細胞株の作製を生じ得る。 【０３５５】 関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を発現するよう操作され得る細胞の多くの集団は、 染色体数が細胞間で変動し得ても個々の細胞の遺伝的に多様な集団から構成される。（こ のような集団の平均的な細胞と比較して）これらの集団に含まれる稀有な細胞は、細胞の 集団の平均的な細胞では通常発現しない関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の天然のまた 20 は非細胞毒性の発現、機能、薬理学、または生理学に対して充分な、好ましい、平均を上 回る、改善された、または最適である生物学的もしくは細胞の状況の、または背景の、ま たは遺伝子的な構造を提供し得る。 【０３５６】 いくつかの実施態様において、本発明によって、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を 含むよう操作された細胞の集団の個々の細胞数百個の分析が可能となり、それにより、関 心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現に適合性のある個々の細胞が迅速にまたは個々に 検出または単離することができ、このことは細胞の集団において稀有な細胞のみを呈する 場合でさえそうである。いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡまたはタンパク 質を発現するよう操作された細胞の集団の平均的な細胞における細胞毒性または細胞死を 30 通常結果として生じる関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の可視化した、非細胞毒性の、 機能的な、または未変性の発現と適合性のある稀有な細胞が検出および単離され得る。い くつかの実施態様において、本発明によると、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を発現 するよう操作された細胞の集団から検出または単離された各陽性細胞は、異なる絶対的な または相対的なレベルの関心対象の各ＲＮＡまたはタンパク質を含み得る。いくつかの実 施態様において、各陽性細胞はさらに、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現または 機能についての細胞背景として、異なる細胞状況または遺伝子状況（例えば、異なる数の 染色体もしくは染色体断片、遺伝子、遺伝子配列、発現特性、またはｍＲＮＡもしくはｓ ｉＲＮＡを含めた内在的に発現したタンパク質もしくはＲＮＡ、または関心対象のＲＮＡ もしくはタンパク質についてのアクセサリー因子）を提供または含み得る。いくつかの実 40 施態様において、本発明は、培養において単離された細胞の維持を可能にする新規の方法 と連関した関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現について陽性である多くの操作され た細胞の単離を提供する。いくつかの実施態様において、培養における単離された細胞の 維持は、維持される細胞のすべてについて実質的に同一である条件を用いて実施され得る 。いくつかの実施態様において、このことによって、順に、関心対象の発現したＲＮＡま たはタンパク質の所望のまたは改善された発現、機能、生理学、または薬理学を含む機能 的な安定した細胞または細胞株を同定および作製するために、培養において単離された細 胞の経時的な機能的試験を含めた試験が可能となる。いくつかの実施態様において、関心 対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現について陽性である多くの細胞を単離、維持、およ び機能的に試験することによって、方法は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を発現す 50 (108) JP 2012-516687 A 2012.7.26 るよう操作された細胞の集団の平均的な細胞において通常発現しない関心対象のＲＮＡま たはタンパク質についてさえ、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を機能的に、可視的に 、および安定して発現する細胞の同定または作製を可能にする。 【０３５７】 実際、いくつかの実施態様において、方法は、操作された細胞において発現する場合に 細胞毒性と以前から考えられているＲＮＡまたはタンパク質の機能的かつ安定した発現を 結果として生じることが認められており、方法が、操作された細胞において以前ではモデ ル化できなかったこのようなタンパク質の非細胞毒性発現および機能を必要としかつ適合 性のある条件を含む細胞を作製するために使用され得る有効性を示す。 【０３５８】 10 さらなる態様において、本発明は、細胞株の対応したパネル、すなわち、１つ以上の生 理学的特性に対応したクローン細胞株の回収物を提供する。本発明の方法は、同一条件下 で多数の細胞株を維持および特徴づけることができるので、類似の生理学的特性を有する 任意の数の細胞株を同定することが可能である。本発明の方法を用いて、任意の所望の数 の細胞株または構造を含む対応したパネルを作製することが可能である。このような対応 したパネルは、細胞密度を含めた同一条件下で維持され得、従って、ハイスループットス クリーニング、および細胞株間の差を比較および同定することが望まれる他の用途に有用 である。また、増殖速度に対応した細胞株の対応したパネルも本発明内である。 【０３５９】 別の態様において、本発明は、以前では未知の機能のタンパク質を発現する、および／ 20 またはリガンドが以前に同定されていなかった細胞または細胞株を作製するための方法を 提供する。このようなタンパク質は、公知の天然のタンパク質、以前では未知の天然のタ ンパク質、以前では未知の形態の公知の天然のタンパク質、または修飾された形態の任意 の前述のものであり得る。 【０３６０】 任意の所望の細胞種類は、本発明の細胞に使用され得る。細胞は原核細胞または真核細 胞であり得る。細胞は、それらの未変性状態またはそうでないものにおいて関心対象のタ ンパク質を発現し得る。使用され得る真核細胞には、酵母細胞などの真菌細胞、植物細胞 、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用することので きる動物細胞には、哺乳類細胞が挙げられるが、これに限定されない。初代細胞または不 30 死化細胞は、真核生物の中胚葉、外胚葉、内胚葉の層に由来し得る。細胞は、上皮細胞、 表皮細胞、間葉系細胞、神経細胞、腎細胞、肝細胞、造血細胞、または免疫細胞であり得 る。方法において有用な哺乳類細胞には、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツ ジ、ブタ、齧歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットを含む。）、有袋類、ウサ ギ、イヌ、およびネコが挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、分化した細胞、 または胚性幹細胞を含む幹細胞であることができる。 【０３６１】 本発明の細胞は、形質転換された、発癌性形質転換された、ウイルスで形質転換された 、不死化した、条件的に形質転換された、外植片、組織切片の細胞、動物、植物、真菌、 原生生物、古細菌および真正細菌、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類、および節足動 40 物、トリ、ニワトリ、爬虫類、両生類、カエル、トカゲ、ヘビ、魚、虫、ヤリイカ、ロブ スター、ウニ、ウミウシ、ホヤ、ハエ、ヤリイカ、ヒドラ、節足動物、カブトムシ、ニワ トリ、ヤツメウナギ、メダカ、キンカチョウ、フグ、およびゼブラフィッシュであること ができる。 【０３６２】 追加的に、血液／免疫細胞などの細胞、内分泌（甲状腺、副甲状腺、副腎）、胃腸（口 腔、胃、腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、呼吸器（肺、気管、咽頭）、軟骨、骨、筋肉、皮膚、 毛髪、泌尿器（腎臓、膀胱）、生殖系（精子、卵子、精巣、子宮、卵巣、陰茎、膣）、感 覚器（眼、耳、鼻、口、舌、感覚ニューロン）、Ｂ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナ チュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー 50 (109) JP 2012-516687 A 2012.7.26 細胞）；顆粒球（好塩基性顆粒球、好酸球性顆粒球、好中球性顆粒球／過分葉核好中球） 、単球／マクロファージ、赤血球細胞（網状赤血球）、マスト細胞、血小板／巨核球、樹 状細胞などの血液／免疫細胞；甲状腺（甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、副甲状腺（副甲 状腺主細胞、好酸性細胞）、副腎（クロム親和性細胞）などの内分泌細胞、グリア細胞（ 星状膠細胞、ミクログリア）、巨大細胞神経分泌細胞、星細胞、核鎖細胞（ｎｕｃｌｅａ ｒ ｃｈａｉｎ ｃｅｌｌ）、ベッチェル細胞、下垂体（性腺刺激ホルモン産生細胞、副 腎皮質刺激因子、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモ ン分泌細胞）などの神経系細胞、肺細胞（Ｉ型肺細胞、ＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯 細胞などの呼吸器系細胞；心筋細胞、周皮細胞などの循環器系細胞；胃（胃主細胞、壁細 胞）、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、腸内分泌 10 細胞、腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ系細胞、肝臓（肝細胞、クッパー細胞）、膵臓（β 細胞、α細胞）、胆嚢などの消化器系細胞；骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、歯細胞（セメ ント芽細胞、エナメル芽細胞）、軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌ）；軟骨芽細 胞、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、皮膚／毛髪細胞：糸胞、ケラチノサイト、メ ラニン形成細胞、筋肉細胞：筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、有足細胞、傍糸球体、糸球 体内メサンギウム細胞／糸球体外メサンギウム細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、密集斑細 胞などの泌尿器系細胞；精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子、卵胞細胞などの 生殖系細胞；皮質細胞の臓器、嗅上皮、温度感受性感覚ニューロン、メルケル細胞、嗅覚 受容神経、疼痛感受性ニューロン、視細胞、味蕾細胞、前庭器の有毛細胞、頚動脈小体細 胞などの感覚細胞は、本発明の細胞または細胞株を作製するのに有用である。 20 【０３６３】 有用な植物細胞には、根、茎、および葉が挙げられ、植物組織には、成長点組織、柔組 織厚角組織、厚壁組織、分泌組織、木部、師部、表皮、周皮（樹皮）が挙げられる。 【０３６４】 また、本発明の細胞および細胞株に有用な細胞には以下が挙げられるが、これらに限定 されない：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、確立されたニューロン細胞株、 褐色細胞腫、神経芽腫線維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳ０細胞、ＣＶ−１ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ 30 （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、Ｌ細胞、ＨＥ Ｋ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）、およびＰＣ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２ １）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ １２６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ −１３７８）、ＳＨ− ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴ ＣＣ ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（Ｅ ＣＡＣＣ ８５０５０３０２）、ベロ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴ ＣＣ ＨＴＢ ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）、ジャーカット（ＡＴＣ Ｃ ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、ライデン、オランダ）、ヒト臍 40 帯静脈内皮細胞（ＡＴＣＣヒト初代ＰＣＳ １００−０１０、マウスＣＲＬ ２５１４、 ＣＲＬ ２５１５、ＣＲＬ ２５１６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ ０１０４２７ １２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８ ５）、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８６）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣ ＨＴＢ−２２ ）、Ｕ−２ ＯＳ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６）、Ｔ８４（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４８）、 または任意の確立された細胞株（極性化型または非極性化型）、またはアメリカ培養細胞 系統保存機関（ＡＴＣＣ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ． Ｍａｎａ ｓｓａｓ， Ｖａ． ２０１ １０−２２０９ ＵＳＡ）もしくは欧州培養細胞コレクシ ョン（ＥＣＡＣＣ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ Ｅｎ ｇｌａｎｄ）などの貯蔵所から入手可能な任意の細胞株。 50 (110) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０３６５】 さらに、本発明の方法において有用な細胞は、血清含有培地、無血清培地、任意の動物 由来の生成物を有さない完全に定義された培地において増殖に受け入れられる哺乳類細胞 、およびこれらの条件のうちの１つから別の条件に変換することのできる細胞である。 【０３６６】 本発明の細胞には、関心対象のタンパク質をコードする核酸（またはヘテロ多量体タン パク質の場合、タンパク質の１つ以上のサブユニットをコードする核酸）が導入された細 胞が含まれる。また、操作された細胞には、関心対象のタンパク質をコードする内在性配 列の転写活性化のための核酸が導入された細胞が含まれる。また、操作された細胞には、 活性化する化合物との接触によって、または翻訳後修飾、プロテアーゼを含むがこれに限 10 定されない酵素による処理もしくは酵素との接触後に活性化される関心対象のタンパク質 をコードする核酸を含む細胞も含まれる。操作された細胞にはさらに、前述の組み合わせ 、すなわち、ヘテロ多量体タンパク質の１つ以上のサブユニットをコードする導入された 核酸からヘテロ多量体タンパク質の１つ以上のサブユニットを発現し、および遺伝子活性 化によってタンパク質の１つ以上のサブユニットを発現する細胞が含まれる。 【０３６７】 任意の核酸は、公知の手段を用いて細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するための 技術は周知であり、当業者によって容易に認識される。方法には、トランスフェクション 、ウイルス送達、タンパク質またはペプチド仲介性挿入、共沈法、脂質ベースの送達試薬 （リポフェクション）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試 20 薬、電気穿孔法、または機械的送達が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフ ェクション試薬の例は、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ２、ＬＩＰＯＦＥ ＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００、ＦＵＧＥＮＥ６、ＦＵＧＥＮＥ ＨＤ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、ＴＦＸ−５０、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、Ｔ ＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ、ＧＥＮＥＳＨＵＴＴＬＥ、ＴＲＯＪＥＮＥ 、ＧＥＮＥＳＩＬＥＮＣＥＲ、Ｘ−ＴＲＥＭＥＧＥＮＥ、ＰＥＲＦＥＣＴＩＮ、ＣＹＴＯ ＦＥＣＴＩＮ、ＳＩＰＯＲＴ、ＵＮＩＦＥＣＴＯＲ、ＳＩＦＥＣＴＯＲ、ＴＲＡＮＳＩＴ −ＬＴ１、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ２、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ＩＦＥＣＴ、Ｒ ＮＡＩＳＨＵＴＴＬＥ、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ、ＬＹＯＶＥＣ、ＬＩＰＯＴＡＸＩ、Ｇ ＥＮＥＥＲＡＳＥＲ、ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ、ＣＹＴＯＰＵＲＥ、ＪＥＴＳＩ、ＪＥＴＰＥ 30 Ｉ、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ、ＰＯＬＹＦＥＣＴ、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＡＮＧＥＲ、ＲＮＡ ｉＦＥＣＴ、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ、ＴＦ−ＰＥＩ−ＫＩＴ、ＣＬＯ ＮＦＥＣＴＩＮ、およびＭＥＴＡＦＥＣＴＩＮＥである。 【０３６８】 ヘテロ多量体タンパク質の２つ以上のサブユニットをコードする配列または関心対象の ２つ以上の異なるタンパク質をコードする配列など、２つ以上のヌクレオチド配列を導入 する場合、配列は、同じベクター上で、または好ましくは別個のベクター上で導入され得 る。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、「ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物であるこ とができる。いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質または関心対象の部分 タンパク質をコードする核酸は、関心対象のタンパク質が、該タンパク質の生理学的機能 40 と比較して、細胞の機能を変化させ得る追加的なアミノ酸とともに発現するような追加的 な配列を含まない。 【０３６９】 いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質をコードする核酸は、野生型タン パク質をコードする核酸配列と比較して、１つ以上の置換、挿入、突然変異、または欠失 を含む。突然変異を含む核酸を含む実施態様において、突然変異は、無作為突然変異また は部位特異的突然変異であり得る。これらの核酸変化は、アミノ酸置換を結果として生じ てよくまたは生じなくてよい。いくつかの実施態様において、核酸は、関心対象のタンパ ク質をコードする核酸の断片である。断片であるかまたはこのような修飾を有する核酸は 、関心対象のタンパク質の少なくとも１つの生物学的異特性を保有するポリペプチドをコ 50 (111) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ードする。 【０３７０】 また、本発明は、核酸を安定して発現する細胞および細胞株も包含し、核酸の配列は、 関心対象のタンパク質をコードする「野生型」の配列と、もしくはヒト以外の種に由来す る対応物の核酸と、または該核酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核酸と、少 なくとも約８５％同一である。いくつかの実施態様において、配列同一性は、該配列と比 較して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそ れより高い。また、本発明は、関心対象のタンパク質をコードする核酸が、ストリンジェ ントな条件下で、野生型配列もしくはヒト以外の種に由来する対応物の核酸、または該核 酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核酸とハイブリッド形成する細胞および細 10 胞株も包含する。 【０３７１】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、野生型配列もしくはヒト以外の種 に由来する対応物の核酸、または該核酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核酸 と比較した場合、少なくとも１つの置換を含むタンパク質コード化核酸配列を含む。置換 は、１０、２０、３０、もしくは４０未満のヌクレオチドを含み得、またはヌクレオチド 配列の１％、５％、１０％、もしくは２０％までもしくはそれらに等しくあり得る。いく つかの実施態様において、置換された配列は、野生型配列もしくは、ヒト以外の種に由来 する対応物の核酸、該核酸のいずれかと同じアミノ酸配列（例えば、それと少なくとも８ ５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い同一性の 20 配列）をコードする核酸と実質的に同一であり得、あるいは、ストリンジェントな条件下 で野生型配列もしくはヒト以外の種に由来する対応物の核酸、または該核酸のいずれか１ つと同じアミノ酸配列をコードする核酸とハイブリッド形成することのできる配列であり 得る。 【０３７２】 いくつかの実施態様において、細胞または細胞株は、野生型配列への挿入もしくはそれ からの欠失を含むタンパク質コード化核酸配列、またはヒト以外の種に由来する対応物の 核酸、あるいは該核酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核酸を含む。挿入もし くは欠失は、１０、２０、３０、もしくは４０未満のヌクレオチドであり得、またはヌク レオチド配列の１％、５％、１０％、もしくは２０％までもしくはそれに等しくあり得る 30 。いくつかの実施態様において、挿入もしくは欠失の配列は実質的に、野生型配列、もし くはヒト以外の種に由来する対応物の核酸、または該核酸のいずれかと同じアミノ酸配列 （例えば、それと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 、またはそれより高い同一性の配列）をコードする核酸と実質的に等しくあり得、あるい は野生型配列もしくはヒト以外の種に由来する対応物の核酸、または該核酸のいずれかと 同じアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する ことのできる配列であり得る。 【０３７３】 いくつかの実施態様において、核酸の置換もしくは修飾は結果として、アミノ酸置換な どのアミノ酸の変化を生じる。例えば、関心対象の野生型タンパク質のアミノ酸残基、ま 40 たはヒト以外の種に由来する対応物のアミノ酸は、保存的もしくは非保存的置換によって 置き換えられ得る。いくつかの実施態様において、元のアミノ酸配列と修飾されたアミノ 酸配列との間の配列同一性は、約１％、５％、１０％、もしくは２０％ほど異なり得るか 、またはそれと実質的に同一の配列（例えば、それと少なくとも８５％、９０％、９５％ 、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれより高い同一性の配列）とは異なり得 る。 【０３７４】 「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、親アミノ酸残基と類似の化学特性（例 えば、帯電または疎水性）を備えた側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によって置換され るものである。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、％配列 50 (112) JP 2012-516687 A 2012.7.26 同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するよう上向きに調整され得る。 この調整をなすための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔ ｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４３：３０７−３１（１９９４）を参照されたい。 【０３７５】 類似の化学特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例には、１）脂肪族側鎖：グリシ ン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族‐ヒドロキシル側鎖 ：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４） 芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リ シン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン 酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保 10 存的アミノ酸置換の基は、バリン‐ロイシン‐イソロイシン、フェニルアラニン‐チロシ ン、リシン‐アルギニン、アラニン‐バリン、グルタミン酸‐アスパラギン酸、およびア スパラギン‐グルタミンである。あるいは、保存的アミノ酸置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−４５ （１９９２）において開示され たＰＡＭ２５０ログ類似性マトリックスにおける正の値を有する任意の変化である。「中 程度に保存された」置換とは、ＰＡＭ２５０ログ類似性マトリックスにおける負でない値 を有する任意の変化である。 【０３７６】 関心対象のタンパク質における保存的修飾は、修飾されていないタンパク質のものと類 似の（すなわち、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同 20 じである）機能的および化学的特徴を有するタンパク質を生じるであろう。 【０３７７】 一実施態様において、宿主細胞は胚性幹細胞であり、それはその後、関心対象のタンパ ク質を産生するトランスジェニック動物の作出のための基礎として用いられる。関心対象 の機能的タンパク質を安定して発現する胚性幹細胞は、臓器に直接移植され得、またはそ れらの核が他のレシピエント細胞へと転移され得た後にこれらは次に移植され得、または 該胚性幹細胞は、トランスジェニック動物を作出するために用いられ得る。いくつかの実 施態様において、タンパク質は、所望の一時的なおよび／または組織特異的な発現で動物 において発現され得る。 【０３７８】 30 当業者によって認められるであろうように、選択された宿主細胞とともに使用するのに 適した任意のベクターを用いて、関心対象のタンパク質をコードする核酸を宿主細胞へと 導入してよい。２つ以上のベクターを用いて、例えば、関心対象の２つ以上の異なるサブ ユニットまたは２つ以上のタンパク質を導入する場合、ベクターは、同じ種類であり得る かまたは異なる種類であり得る。 【０３７９】 核酸を宿主細胞へと導入するのに使用され得るベクターの例には、プラスミド、レトロ ウイルスおよびレンチウイルスを含むウイルス、コスミド、人工染色体が挙げられるが、 これらに限定されず、例えば、ｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ、ｐ ｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｐｕｒ 40 ｏ、ｐＳＶ２ｚｅｏを含み得る。本発明の細胞および細胞株を作製するのに有用な典型的 な哺乳類発現ベクターには、以下が挙げられる：ｐＦＮ１１Ａ（ＢＩＮＤ）Ｆｌｅｘｉ（ 登録商標）、ｐＧＬ４．３１、ｐＦＣ１４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＣ１４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ Ｆｌ ｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３ Ｆｌ ｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３ Ｆｌ ｅｘｉ（登録商標）、ＨａｌｏＴａｇ（商標）ｐＨＴ２、ｐＡＣＴ、ｐＡｄＶＡｎｔａｇ ｅ（商標）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−ＭＡＸ、ｐＢＩＮＤ、ｐＣＡＴ（登録商標）３ −Ｂａｓｉｃ、ｐＣＡＴ（登録商標）３− Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＣＡＴ（登録商標）３− Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶＴＮ 50 (113) JP 2012-516687 A 2012.7.26 Ｔ（商標）、ｐＧ５ｌｕｃ、ｐＳＩ、ｐＴＡＲＧＥＴ（商標）、ｐＴＮＴ（商標）、ｐＦ １２Ａ ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦ１２Ｋ ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、 ｐＲｅｇ ｎｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ Ｇａｔｅｗａ ｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商 標）Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２７ Ｖｅｃｔｏｒ 、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（ 登録商標）ｐｃＤＮＡ（商標）−ＤＥＳＴ４７ベクター、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ Ｖｅｃｔｏ ｒ、ｐＥＦ６／Ｈｉｓ Ａ、Ｂ、およびｃ、ｐｃＤＮＡ（商標）６．２− ＤＥＳＴ、ｐ Ｌｅｎｔｉ６／ＴＲ、ｐＬＰ−ＡｃＧＦＰ１−Ｃ、ｐＬＰＳ−ＡｃＧＦＰ１−Ｎ、ｐＬＰ −ＩＲＥＳｎｅｏ、ｐＬＰ−ＴＲＥ２、ｐＬＰ−ＲｅｖＴＲＥ、ｐＬＰ−ＬＮＣＸ、ｐＬ 10 Ｐ−ＣＭＶ−ＨＡ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ、ｐＬＰ−ＲｅｔｒｏＱ、およびｐＬＰ− ＣＭＶｎｅｏ。 【０３８０】 いくつかの実施態様において、ベクターは、構成的または条件的プロモータなどの発現 制御配列を含み、好ましくは構成的プロモータが用いられる。当業者は、このような配列 を選択することができるであろう。例えば、適切なプロモータには、ＣＭＶ、ＴＫ、ＳＶ ４０、およびＥＦ−１αが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様に おいて、プロモータは、誘導性、温度調節型、組織特異的、抑圧可能な、熱ショック性、 発生性、細胞系譜特異的、真核、原核、もしくは一時的なプロモータ、または上記の任意 の１つ以上の修飾されていないもしくは変異誘発された、無作為化された、シャッフルさ 20 れた配列の組み合わせもしくは組換えである。他の実施態様において、関心対象のタンパ ク質は、遺伝子活性化によってまたは遺伝子副体に発現する。 【０３８１】 いくつかの実施態様において、ベクターは、選択可能なマーカーまたは薬剤耐性遺伝子 を欠失する。他の実施態様において、ベクターは任意に、薬剤もしくは抗生物質に耐性を 与えるタンパク質、またはより一般的には、細胞に選択的圧力を発揮する任意の製剤など 、センタ可能なマーカーをコードする核酸を含む。２つ以上のベクターを使用する場合、 各ベクターは、同じかもしくは異なる薬剤耐性または他の選択的圧力マーカーを有し得る 。２つ以上の薬剤耐性マーカーもしくは選択的圧力マーカーが同じである場合、薬剤のレ ベルを増大させることによって同時選択が達成され得る。適切なマーカーは、当業者に周 30 知であり、以下の任意の１つに対して耐性を与えるポリペプチド製剤を含むがこれらに限 定されない：ネオマイシン／Ｇ４１８、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ゼオシン、 メトトレキサート、およびブラストサイジン。薬剤選択（または任意の他の適切な選択マ ーカーを用いた選択）は、本発明の細胞および細胞株を作製する上で必要な工程ではない が、安定してトランスフェクトした細胞のためのトランスフェクトした細胞集団を濃縮す るために使用され得、但し、トランスフェクトしたコンストラクトが、薬剤耐性を与える よう設計されることとする。関心対象のタンパク質を発現する細胞のその後の選択芽、シ グナル伝達プローブを用いて達成される場合、トランスフェクション直後の選択は、いく つかの陽性細胞を結果として生じることができ、該細胞は一過性であり得、かつ安定して トランスフェクトされ得ない。しかしながら、この効果は、トランスフェクトした細胞に 40 おける一過性発現の希釈を可能にするのに十分な細胞継代を許容することによって最小化 することができる。 【０３８２】 選択的圧力は、当業者に公知であろう種々の化合物または処理を用いて、細胞に適用す ることができる。理論によって制限されることなく、選択的圧力は、細胞増殖、細胞周期 の進行、または生存率に最適下のまたは有害な条件に細胞を曝露することによって適用さ れることができ、それによりこれらの条件に耐性のあるまたは抵抗性のある細胞が、これ らの条件に対応性のないまたは抵抗性のない細胞と比較されるために選択されるようにな っている。選択的圧力を発揮または適用するために用いることのできる条件には、抗生物 質、薬剤、変異原、細胞増殖もしくは生物学的構築ブロックの合成を遅延または停止させ 50 (114) JP 2012-516687 A 2012.7.26 る化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはタンパク質の合成を混乱させる化合物、細胞増殖お よび細胞増殖もしくは培地からの生存率に必要な栄養物質、アミノ酸、炭水化物、もしく は化合物の欠乏もしくは制限、細胞増殖のための最適下の条件で、例えば、最適下の温度 、大気条件（例えば、％二酸化炭素、酸素、もしくは窒素または湿度）、あるいは結合し た培地条件での細胞の増殖もしくは維持などの処理が挙げられるが、これらに限定されな いい。理論によって制限されることなく、選択的圧力は、選択的圧力に対する抵抗性また は耐性を与えまたはコードするマーカー、因子、または遺伝子を選択するために用いるこ とができる。例えば、（ｉ）細胞集団はまず、選択的圧力に対する抵抗性または耐性を与 えるこのようなマーカー、因子、または遺伝子に曝露されまたはこれらを導入することが でき、それにより各細胞は、異なるレベルのマーカーを含むよう、またはマーカーをいず 10 れも含まないよう取り込みまたは修飾されるであろうし、（ｉｉ）次に、集団は、マーカ ー、因子、または遺伝子が抵抗性または耐性を与える選択的圧力に曝露されることができ 、それによりマーカー、因子、または遺伝子を含む細胞が、そうでない細胞と比較して増 殖の利点を含むようになる。理論によって制限されることなく、上昇したレベルのマーカ ー、因子、または遺伝子を含む細胞は、対応する選択的圧力に対して比例して上昇した耐 性を呈するであろう。選択的圧力は、特性、ＲＮＡ、またはタンパク質を、耐性または抵 抗性を対応する選択的圧力に与えるマーカー、因子、または遺伝子と関連付けることによ って、関心対象の所望の特性、ＲＮＡ、またはタンパク質を含む細胞を選択するために用 いることができる。理論によって制限されることなく、比例して上昇したレベルの関心対 象の所望の特性、ＲＮＡ、またはタンパク質を有する細胞は、選択過程の間に比例して上 20 昇したレベルまたは量の選択的圧力を適用することによって選択され得る。複数の特性、 ＲＮＡ、またはタンパク質を含む細胞が望まれる場合、これらの各々は、同じかまたは異 なる形態の選択的圧力に抵抗性を与えるマーカー、因子、または遺伝子と関連付けること ができ、これらの選択的圧力のすべてを用いた選択は、関心対象の所望の特性、ＲＮＡ、 またはタンパク質のすべてを含む細胞を選択するために用いてよい。関心対象の所望の特 性、ＲＮＡ、またはタンパク質を有する細胞の選択後、選択された細胞は、同じ、上昇し た、または低下したレベル、濃度、用量、または処理の、選択中に用いられた選択的圧力 の下で維持されてよい。いくつかの場合、選択的圧力のレベル、濃度、用量、または処理 の周期的上昇は、対応して上昇するレベルの関心対象の所望の特性、ＲＮＡ、またはタン パク質を含む細胞の増殖を選択するために用いることができる。いくつかの場合、選択的 30 圧力を用いた細胞の選択後、選択された細胞は、低下したレベル、濃度、用量、または処 理の選択的圧力を用いて維持され、選択された所望の特性、ＲＮＡ、またはタンパク質が 、維持される細胞において維持されるのを確実にするのを助ける。 【０３８３】 用いられる選択的圧力のレベルは、当業者によって決定することができる。このことは 、例えば、殺滅曲線（ｋｉｌｌ ｃｕｒｖｅ）実験を実施することによってなされること ができ、ここで、対照細胞および抵抗性マーカー、因子、または遺伝子を含む細胞は、上 昇するレベル、用量、濃度、または処理の選択的圧力、および陰性細胞のみに対してまた は所望の時間範囲（例えば、１∼２４時間、１∼３日、３∼５日、４∼７日、５∼１４日 、１∼３週間、２∼６週間、１∼２ヶ月間、１∼３ヶ月間、４、５、６、７、８、９、ま 40 たは１０ヶ月間超）にわたって優先的に選択された範囲を用いて試験される。使用するこ とのできる選択的圧力の実際のレベル、濃度、用量、または処理は、使用される細胞、所 望の特性自体、選択的圧力に抵抗性または耐性を与えるマーカー、因子、または遺伝子、 および選択される細胞において望まれる所望の特性のレベルに依存し、当業者は、これら の考慮に基づいて適切な範囲を決定する方法を容易に認めるであろう。選択後のいくつか の場合、選択過程の間に用いられる１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０ 、８０、９０、または１００％未満のレベル、濃度、用量、または処理が、選択される細 胞のその後の維持において用いられる。複数の異なる選択的圧力が用いられるいくつかの 場合、選択過程の間に用いられる各選択的圧力のレベル、濃度、用量、または処理は、選 択される細胞のその後の維持において、例えば、選択過程自体の間に用いられるものの１ 50 (115) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％未満ま で下げることができる。いくつかの実施態様において、これらの低下したレベル、濃度、 用量、または処理は、所望の特性、ＲＮＡ、またはタンパク質を含むよう選択された細胞 が、培養において経時的に所望の特性を含み続けるよう選択される。いくつかの実施態様 において、選択された細胞における所望の特性の損失または低下に必要なレベル、濃度、 用量、または処理のみが、培養において経時的に細胞の維持の間に用いられ、例えば、選 択された特性、ＲＮＡ、またはタンパク質を維持するために細胞に必要なものよりも高い レベルの濃度、用量、または処理の使用から細胞に対するすべての考えられ得る有害な効 果に細胞を曝露するのを最小化する。 【０３８４】 10 いくつかの実施態様において、本発明の細胞および細胞株は、選択的圧力の不在下で選 択される特性、ＲＮＡ、またはタンパク質を少なくとも１５日、３０日、４５日、６０日 、７５日、１００日、１２０日、または１５０日維持することができる。このような細胞 および細胞株は、選択過程において使用されるものと比較して、選択的圧力の同じ、上昇 した、または低下したレベル、濃度、用量、または処理の存在下で培養され得る。このよ うな細胞および鎖ｋ棒株はまた、任意の選択的圧力の不在下でも培養することができる。 レベル、濃度、用量、または処理を低下させる場合、選択過程の間に用いられる個々のレ ベル、濃度、用量、または処理の１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、 ８０、９０、または１００％未満まで低下させることができる。細胞および細胞株が、関 心対象の２つ以上のタンパク質またはＲＮＡを発現し、関心対象の各タンパク質またはＲ 20 ＮＡの発現が、異なる選択的圧力を用いて選択される場合、各選択的圧力のレベル、濃度 、用量、または処理は、選択後の細胞および細胞株の培養中に独立して選択され得、例え ば、各選択的圧力は、細胞培養において不在であるよう、または選択過程の間に用いられ る個々のレベル、濃度、用量、または処理と比較して、同じ、または上昇した、または低 下したレベル、濃度、用量、または処理であるよう、独立して選択され得る。レベル、濃 度、用量、または処理が低下した場合、これらは、選択過程の間に用いられる個々のレベ ル、濃度、用量、または処理の１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８ ０、９０、または１００％未満まで低下することができる。 【０３８５】 いくつかの実施態様において、タンパク質コード化核酸配列はさらにタグを含む。この 30 ようなタグは、例えば、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、プロテイ ンＣ、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＬＵ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）緑色蛍光タンパク質、ＦＬＡ Ｇ、ＢＣＣＰ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆ ｔａｇ−２、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｓ−タグ、チオレドキシン、ＧＳＴ、Ｖ５、ＴＡＰ、ま たはＣＢＰをコードし得る。タグは、タンパク質発現レベル、細胞内局在化、タンパク質 間相互作用、関心対象のタンパク質の調節、またはタンパク質の機能を決定するためのマ ーカーとして用いてよい。タグはまた、タンパク質を精製または分画するために用いても よい。 【０３８６】 関心対象のＲＮＡを発現する細胞および細胞株の場合、ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ 40 、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、構造ＲＮＡ、リボソーム ＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）および低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、伝令ＲＮ Ａ（ｍＲＮＡ）、ステムループ構造を採用するＲＮＡ、ヘアピン構造を採用するＲＮＡ、 一本鎖ＲＮＡを含むＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡを含むＲＮＡ、タンパク質を結合するＲＮＡ， 蛍光化合物を結合するＲＮＡ、生物活性を有するＲＮＡ、生物活性のある生成物をコード するＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉを仲介することのできる ＲＮＡ、または少なくとも第二のＲＮＡのレベルもしくは活性を調節することのできるＲ ＮＡを含む任意の種類であることができる。 【０３８７】 本発明の細胞および細胞株が、関心対象の機能的タンパク質を発現する実施態様におい 50 (116) JP 2012-516687 A 2012.7.26 て、タンパク質は、一本鎖タンパク質、複数鎖タンパク質、ヘテロ多量体タンパク質を含 むがこれらに限定されない任意のタンパク質であることができる。多量体タンパク質の場 合、いくつかの実施態様において、細胞は、未変性タンパク質を構成するサブユニットを すべて発現する。タンパク質は、「野生型」配列を有することができるか、またはバリア ントであり得る。いくつかの実施態様において、細胞は、対立遺伝子バリアントを含めた サブユニットの１つ以上のバリアント、スプライスバリアント、切断型、アイソフォーム 、異なる化学量論のサブユニット、異なる組み立てのサブユニット、異なって折りたたま れた形態、異なって活性化する形態、異なる機能性を有する形態、異なる結合特性を有す る形態、異なるアクセサリー因子と関連した形態、異なる細胞背景において発現した形態 、異なる細胞遺伝子背景において発現した形態、異なる内在性発現特性を有する細胞にお 10 いて発現した形態、異なって局在した形態、キメラもしくは化学修飾した形態、酵素的に 修飾された形態、翻訳後修飾された形態、グリコシル化した形態、タンパク質分解した形 態、キメラサブユニット、およびアミノ酸置換（保存的もしくは非保存的）、化学的に修 飾されたアミノ酸を含めた修飾されたアミノ酸、および非天然アミノ酸を含む突然変異し た形態、ならびにそれらの組み合わせを含むタンパク質を発現する。本発明の細胞または 細胞株によって発現したヘテロ多量体タンパク質は、関心対象のタンパク質の種ホモログ からなど、２つ以上の種からのサブユニットを含んでよい。 【０３８８】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞は、関心対象の２つ以上の機能的タンパク 質を発現する。本発明によると、このような発現は、関心対象のタンパク質の全部もしく 20 は部分をコードする核酸の導入から、内在性配列由来の関心対象のタンパク質の全部もし くは部分の転写を活性化する核酸の導入から、またはそれらの任意の組み合わせからであ ることができる。細胞は、関心対象の任意の所望の数のタンパク質を発現し得る。種々の 実施態様において、細胞は、関心対象の３、４、５、６、またはそれより多くのタンパク 質を発現する。例えば、本発明は、関心対象の経路における機能的タンパク質、酵素経路 、シグナル伝達経路調節経路を含めた交差経路由来のタンパク質、およびそれらに類する ものを安定して発現する細胞および細胞株を熟慮する。いくつかの実施態様において、本 発明の細胞または細胞株は、関心対象の生物経路に関与する１つ以上の機能的ＲＮＡおよ び／またはタンパク質、例えば、生物学的経路のタンパク質および／またはＲＮＡ構成要 素、ならびに生物学的経路のタンパク質および／またはＲＮＡ調節因子、ならびに／また 30 は１つ以上のその構成要素を安定して発現する。いくつかの実施態様において、生物学的 経路は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ 、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または少なくとも５０のタ ンパク質構成要素からなる。いくつかの実施態様において、生物学的経路は、２、３、４ 、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９ 、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または少なくとも５０のＲＮＡ構成要素からな る。機能的タンパク質が本発明の細胞および細胞株によって安定して発現することができ る生物学的経路の例には以下が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：２−ア ラキドノイルグリセロール生合成経路、５−ヒドロキシトリプタミン生合成経路、５−ヒ ドロキシトリプタミン分解経路、５ｈｔ１型受容体仲介性シグナル伝達経路、５ｈｔ２型 40 受容体仲介性シグナル伝達経路、５ｈｔ３型受容体仲介性シグナル伝達経路、５ｈｔ４型 受容体仲介性シグナル伝達経路、酢酸利用経路、アデニンおよびヒポキサンチンサルベー ジ経路、アドレナリンおよびノルアドレナリン生合成経路、アラニン生合成経路、アラン トイン分解経路、αアドレナリン受容体シグナル伝達経路、アルツハイマー病‐アミロイ ドセクレターゼ経路、アルツハイマー病‐プレセニリン経路、アミノ酪酸分解経路、アナ ンダミド生合成経路、アナンダミド分解経路、アンドロゲン／エストロゲン／プロゲステ ロン生合成経路、血管新生経路、Ｇタンパク質およびβ‐アレスチンを通じたアンギオテ ンシンｉｉ刺激性シグナル伝達経路、アポトーシスシグナル伝達経路、アルギニン生合成 経路、アスコルビン酸分解経路、アスパラギンおよびアスパラギン酸生合成経路、ＡＴＰ 合成経路、ネトリンによって仲介される軸索誘導、セマフォリンによって仲介される軸索 50 (117) JP 2012-516687 A 2012.7.26 誘導、スリット（ｓｌｉｔ）／ロボ（ｒｏｂｏ）によって仲介される軸索誘導、Ｂ細胞活 性化経路、β１アドレナリン受容体シグナル伝達経路、β２アドレナリン受容体シグナル 伝達経路、β３アドレナリン受容体シグナル伝達経路、ビオチン生合成経路、血液凝固経 路、ブプロピオン分解経路、カドへリンシグナル伝達経路、カルニチン代謝経路、細胞周 期経路、コレステロール生合成経路、コリスミン酸生合成経路、概日時計系経路、コバラ ミン生合成経路、補酵素Ａ生合成経路、補酵素Ａ連関カルニチン代謝経路、コルチコトロ ピン放出因子受容体シグナル伝達経路、システイン生合成経路、ｒｈｏ ｇｔｐａｓｅに よる細胞骨格調節、新規プリン生合成経路、新規ピリミジンデオキシリボヌクレオチド生 合成経路、新規ピリミジンリボヌクレオチド生合成経路、ＤＮＡ複製、ドーパミン受容体 仲介性シグナル伝達、ｅｇｆ受容体シグナル伝達経路、内在性カンナビノイドシグナル伝 10 達経路、エンドセリンシグナル伝達経路、エンケファリン放出経路、ｆａｓシグナル伝達 経路、ｆｇｆシグナル伝達経路、フラビン生合成経路、ホルミルテトラヒドロギ酸生合成 経路、フルクトースガラクトース代謝経路、ＧＡＢＡ−ｂ受容体ｉｉシグナル伝達経路、 γ−アミノ酪酸合成経路、ＲＮＡポリメラーゼＩによる一般的な転写、一般的な転写調節 、グルタミングルタミン酸塩変換経路、解糖経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ヘム 生合成経路、ヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達経路−ｇｉαおよびｇｓα仲介性経 路、ヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達経路−ｇｑαおよびｇｏα仲介性経路、ヘテ ロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達経路−ｒｏｄ外節光伝達経路、ヒスタミンｈ１受容体 仲介性シグナル伝達経路、ヒスタミンｈ２受容体仲介性シグナル伝達経路、ヒスタミン合 成経路、ヒスチジン生合成経路、ハンチントン病、ｈｉｆ活性化を介した低酸素症応答、 20 ケモカインおよびサイトカインシグナル伝達経路によって仲介される炎症、インスリン／ ｉｇｆ経路−マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ／ｍａｐキナーゼカスケー ド、インスリン／ｉｇｆ経路−プロテインキナーゼＢシグナル伝達カスケード、インテグ リンシグナル伝達経路、インターフェロン−γシグナル伝達経路、インターロイキンシグ ナル伝達経路、イオンチャネル型グルタミン酸受容体経路、イソロイシン生合成経路、ｊ ａｋ／ｓｔａｔシグナル伝達経路、ロイシン生合成経路、リポ酸生合成経路、リシン生合 成経路、マンノース代謝経路、代謝型グルタミン酸受容体第ｉｉ群経路、代謝型グルタミ ン酸受容体第ｉｉｉ群経路、メチオニン生合成経路、メチルクエン酸回路、メチルマロニ ル経路、ｍＲＮＡスプライシング、ムスカリン性アセチルコリン受容体１および３シグナ ル伝達経路、ムスカリン性アセチルコリン受容体２および４シグナル伝達経路、ｎ−アセ 30 チルグルコサミン代謝、ニコチン分解経路、ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル伝 達、ノッチシグナル伝達経路、ｏ−抗原生合成経路、オピオイドプロダイノルフィン経路 、オピオイドプロエンケファリン経路、オピオイドプロオピオメラノコルチン経路、オル ニチン分解経路、参加ストレス応答経路、オキシトシン受容体仲介性シグナル伝達経路、 ｐ３８ｍａｐｋ経路、ｐ５３経路、グルコース欠乏によるｐ５３経路、ｐ５３経路フィー ドバックループ１、ｐ５３経路フィードバックループ２、パントテン酸生合成経路、パー キンソン病、ＰＤＧＦシグナル伝達経路、ペントースリン酸経路、ペプチドグリカン生合 成経路、フェニル酢酸分解経路、フェニルアラニン生合成経路、フェニルエチルアミン分 解経路、フェニルプロピオン酸分解経路、ｐｉ３キナーゼ経路、プラスミノーゲン活性化 カスケード、プロリン生合成経路、ｐｒｐｐ生合成経路、プリン代謝、ピリドキサールリ 40 ン酸エステルサルベージ経路、ピリドキサール−５−リン酸エステル生合成経路、ピリミ ジン代謝、ピルビン酸代謝、ｒａｓ経路、ｓ−アデノシルメチオニン生合成経路、サルベ ージピリミジンデオキシリボヌクレオチド、サルベージピリミジンリボヌクレオチド、セ リングリシン生合成経路、コハク酸からプロピオン酸への変換、硫酸同化経路、シナプス 小胞輸送、Ｔ細胞活性化経路、ＴＣＡ回路、テトラヒドロ葉酸生合成経路、ＴＧＦ−βシ グナル伝達経路、チアミン生合成経路、チアミン代謝、トレオニン生合成経路、甲状腺刺 激ホルモン放出ホルモン受容体シグナル伝達経路、ｔｏｌｌ受容体シグナル伝達経路、ｂ ｚｉｐ転写因子による転写調節、トリアシルグリセロール代謝、トリプトファン生合成経 路、チロシン生合成経路、ユビキチンプロテアソーム経路、バリン生合成経路、バソプレ ッシン合成経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、ビタミンＢ６生合成経路、ビタミンＢ６代 50 (118) JP 2012-516687 A 2012.7.26 謝、ビタミンＤ代謝および経路、ｗｎｔシグナル伝達経路、ならびにキサンチンおよびグ アニンサルベージ経路。 【０３８９】 機能的タンパク質が、本発明の細胞および細胞株によって安定して発現することができ る生物学的経路の他の例には、以下の生物学的過程が挙げられるが、これらに限定されな い：アミノ酸代謝（例えば、アミノ酸生合成、アミノ酸異化反応、アミノ酸代謝調節、ア ミノ酸輸送、および他のアミノ酸代謝）、輸送（例えば、アミノ酸輸送、炭水化物輸送、 ビタミン／補助因子輸送、陰イオン輸送、陽イオン輸送、脂質および脂肪酸の輸送、ヌク レオシド、ヌクレオチド、および核酸の輸送、リン酸輸送、細胞外輸送および移入、低分 子輸送、ならびに他の輸送）、アポトーシス（例えば、アポトーシスの誘導、アポトーシ 10 スの他のアポトーシスの阻害、および他のアポトーシス過程）、血液循環およびガス交換 、炭水化物代謝（例えば、炭水化物輸送、二糖代謝、糖新生、グリコーゲン代謝、解糖、 単糖代謝、他の炭水化物代謝、他の多糖代謝、ペントースリン酸シャント、炭水化物代謝 の調節、およびトリカルボン酸経路）、細胞接着、細胞周期（例えば、細胞周期制御、Ｄ ＮＡ複製、有糸分裂、および他の細胞周期過程）、細胞の増殖および分化、細胞の構造お よび運動性、補酵素および補欠分子族の代謝（例えば、補酵素代謝、ポルフィリン代謝、 プテリン代謝、ビタミン／補助因子輸送、ビタミン生合成、ビタミン異化反応、ならびに 他の補酵素および補欠分子族の代謝）、発達過程（例えば、外胚葉発達、前側／後側パタ ーン形成、背側／腹側軸の決定、胚形成、内胚葉発達、受精、減数分裂、中胚葉発達、分 節特異化、性決定、卵形成、精子形成および運動性、ならびに他の発達過程）、電子輸送 20 （例えば、フェレドキシン代謝、酸化的リン酸化、および電子輸送の他の経路）、ホメオ スタシス（カルシウムイオンホメオスタシス、グルコースホメオスタシス、成長因子ホメ オスタシス、および他のホメオスタシス活性）、免疫および防御（例えば、抗酸化および フリーラジカル除去、Ｂ細胞および抗体仲介性免疫、血液凝固、補体仲介性免疫、サイト カイン／ケモカイン仲介性免疫、解毒、顆粒球仲介性免疫、インターフェロン仲介性免疫 、マクロファージ仲介性免疫、ナチュラルキラー細胞仲介性免疫、ストレス応答、Ｔ細胞 仲介性免疫、ならびに他の免疫および防御過程）、細胞内タンパク質輸送（例えば、エキ ソサイトーシス、エンドサイトーシス、一般的な小胞輸送、リソソーム輸送、ミトコンド リア輸送、核輸送、ペルオキシソーム輸送、および他の細胞内タンパク質輸送）、脂質、 脂肪酸、およびステロイドの代謝（例えば、アシルＣｏＡ代謝、脂肪酸β酸化、脂肪酸生 30 合成、脂肪酸不飽和化、脂質および脂肪酸の結合、脂質および脂肪酸の輸送、脂質代謝、 ならびに他の脂質、脂肪酸、およびステロイドの代謝、リン脂質代謝、脂質、脂肪酸、お よびステロイドの代謝の調節、胆汁酸代謝、コレステロール代謝、ステロイドホルモン代 謝、ならびに他のステロイド代謝）筋収縮、ニューロン活性（例えば、活動電位伝播、神 経間シナプス伝達、神経筋シナプス伝達、神経伝達物質放出、および他のニューロン活性 ）窒素代謝（例えば、窒素酸化物生合成、窒素利用、および他の窒素代謝）、無脊椎動物 過程、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸の代謝（例えば、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ分 解、ＤＮＡ組換え、ＤＮＡ修復、染色質のパッケージングおよびリモデリング）環状ヌク レオチドの代謝、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸の輸送、他のヌクレオシド、 ヌクレオチド、および核酸の代謝、プリン代謝、ピリミジン代謝、ＲＮＡ異化反応、ＲＮ 40 Ａ局在化、ヌクレオシドの調節、ヌクレオチド代謝、逆転写、ＲＮＡ代謝、ｔＲＮＡ代謝 、ｍＲＮＡキャッピング、ｍＲＮＡの末端処理および安定性、ｍＲＮＡポリアデニル化、 ｍＲＮＡスプライシング、一般的なｍＲＮＡ転写活性、他のｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡ転写 伸長、ｍＲＮＡ転写開始、ｍＲＮＡ転写調節、ならびにｍＲＮＡ転写終止）、発癌（例え ば、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、および他の発癌関連過程）、リン酸代謝（例えば、リン酸 輸送、ポリリン酸生合成、ポリリン酸異化反応、リン酸代謝の調節、および他のリン酸代 謝）タンパク質の代謝および修飾（タンパク質分解、アミノ酸活性化および他のタンパク 質代謝、タンパク質生合成、タンパク質複合体組み立て、タンパク質折りたたみ、翻訳調 節、タンパク質ＡＤＰ−リボシル化、タンパク質アセチル化、タンパク質ジスルフィド− イソメラーゼ反応、タンパク質糖鎖付加、タンパク質メチル化、タンパク質リン酸化、タ 50 (119) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ンパク質−脂質修飾）、タンパク質ターゲティングおよび局在化（例えば、非対称性タン パク質局在化ならびに他のタンパク質のターゲティングおよび局在化）、感覚性知覚（例 えば、嗅覚、味覚、聴覚、疼痛知覚、フェロモン応答、視覚、および他の感覚性知覚）、 硫黄代謝（例えば、硫黄酸化還元代謝、および他の硫黄代謝）、細胞間情報伝達（例えば 、細胞接着仲介性シグナル伝達、細胞外マトリックスタンパク質仲介性シグナル伝達、リ ガンド仲介性シグナル伝達、およびステロイドホルモン仲介性シグナル伝達）、細胞表面 受容体仲介性シグナル伝達（例えば、サイトカインおよびケモカイン仲介性シグナル伝達 経路、Ｇタンパク質仲介性シグナル伝達、受容体タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ シグナル伝達経路、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、ならびに他の 受容体仲介性シグナル伝達経路）、細胞内シグナル伝達カスケード（例えば、カルシウム 10 仲介性シグナル伝達、ｊａｋ−ｓｔａｔカスケード、ＪＮＫカスケード、ＭＡＰＫＫＫカ スケード、ＮＦ−κＢカスケード、ＮＯ仲介性シグナル伝達、および他の細胞内シグナル 伝達カスケード）、ならびに他のシグナル伝達過程。 【０３９０】 本明細書に開示される種々の生物学的経路のタンパク質および／またはＲＮＡ構成要素 、ならびに互いに対するこれらの関係性は、当業者に公知であり、例えば、インターネッ ト上のＫＥＧＧ経路データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇ ｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ）において認められることができる。 【０３９１】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株は、生物学的経路に関与する 20 少なくとも１つの機能的ＲＮＡまたはタンパク質を発現する。いくつかの実施態様におい て、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を発現する本発明の細胞または細胞株はまた、生 物学的経路の少なくとも１つの機能的ＲＮＡまたはタンパク質構成要素を発現する。いく つかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株は、生物学的経路の少なくとも１つ の機能的ＲＮＡまたはタンパク質の構成要素を発現し、これらは、操作されていない同じ 種類の細胞または細胞株において発現するかもしれないしまたはしないかもしれない。い くつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株は、本明細書において「機能的生 物学的経路の発現」とも呼ばれる細胞または細胞株における経路の少なくとも１つの活性 を与えるのに十分な生物学的経路の少なくとも２つの機能的ＲＮＡまたはタンパク質構成 要素を発現する。いくつかの実施態様において、生物学的経路の発現は、生物学的経路の 30 少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の構成要素の発現を含むこ とができる。いくつかの実施態様において、生物学的経路の発現は、生物学的経路のすべ ての構成要素の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１ ０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の発現 を含むことができる。生物学的経路が天然には存在しない細胞または細胞株における生物 学的経路の少なくとも１つの機能的ＲＮＡまたはタンパク質構成要素の発現は、細胞また は細胞株における機能的生物学的経路の少なくとも１つの活性の再構成を結果として生じ 得る。生物学的経路が天然に存在する細胞または細胞株における生物学的経路の少なくと も１つの機能的ＲＮＡまたはタンパク質構成要素の発現は、細胞または細胞株における機 能的生物学的経路の少なくとも１つの活性における増大を結果として生じ得る。生物学的 40 経路が天然に存在する細胞または細胞株における生物学的経路の少なくとも１つの機能的 ＲＮＡまたはタンパク質構成要素の発現は、細胞における経路の正味のまたは全体的な活 性の変化を結果として生じ得る。いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞 株において発現した関心対象のタンパク質は、生物学的経路のＲＮＡまたはタンパク質構 成要素の少なくとも１つの同時発現によって修飾され得、翻訳後修飾され得、グリコシル 化され得、または変化し得る。いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は、 ＩｇＧまたは抗体であり、経路は、グリコシル化経路である。いくつかの実施態様におい て、関心対象の同じタンパク質を各々発現する細胞株のパネルにおける細胞株はまた、生 物学的経路（例えば、グリコシル化経路）のＲＮＡまたはタンパク質構成要素の少なくと も１つを各々発現する。いくつかの実施態様において、生物学的経路の機能的ＲＮＡまた 50 (120) JP 2012-516687 A 2012.7.26 はタンパク質構成要素の少なくとも１つは、細胞における関心対象の発現したタンパク質 と相互作用する（例えば、一過性にまたは長い期間のいずれかで修飾し、変化し、グリコ シル化し、または結合する。）。しかしながら、発現した機能的タンパク質間のタンパク 質間相互作用は必要条件ではない。例えば、本発明の細胞および細胞株は、同じ生物学的 経路の構成要素であることによって、互いに関連した２つ以上の機能的タンパク質を発現 することができるが、２つ以上の機能的タンパク質は、互いと直接的に相互作用しなくて よい。生物学的経路は、生物学的経路の２つ以上の機能的タンパク質構成要素を発現する 本発明の細胞または細胞株に天然に存在してよいかまたはしなくてよい。最初の場合、生 物学的経路の２つ以上の機能的タンパク質構成要素の発現は、細胞または細胞株における 生物学的経路の少なくとも１つの活性の増大を結果として生じ得る。後者の場合、生物学 10 的経路の２つ以上の機能的タンパク質構成要素の発現は、細胞または細胞株における生物 学的経路全体の少なくとも１つの活性の再構成を結果として生じ得る。いくつかの実施態 様において、生物学的経路の少なくとも１つ以上の構成要素は、細胞または細胞株によっ て天然に発現する。 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の生物学的経路に関与する少なくと も１つの機能的タンパク質を安定して発現する細胞または細胞株を提供し、この中で、細 胞または細胞株は、選択的圧力の不在下で培養され、かつこの中で、細胞または細胞株は 、本明細書に説明されたように少なくとも１つの機能的タンパク質を一貫して発現する。 本発明に従って用いられ得る生物学的経路の例には、折りたたまれていないタンパク質応 答（「ＵＰＲ」）に関与するそれらの生物学的経路；細胞増殖、細胞の生存率、細胞死、 20 細胞の健康；タンパク質の発現、産生、折りたたみ、分泌、膜への組み込み、グリコシル 化もしくは酵素修飾を含めた修飾もしくは翻訳後修飾；抗体産生細胞、乳腺細胞、唾液細 胞、または他の細胞種類と比較して操作されたタンパク質を高度に発現する細胞において 豊富なまたはより高度に発現したもしくは活性のある経路が挙げられるが、これらに限定 されない。 【０３９２】 本明細書に説明された任意の細胞を宿主細胞として用いて、生物学的経路に関与する機 能的ＲＮＡまたはタンパク質を発現し得る。生物学的経路に関与する少なくとも１つの機 能的ＲＮＡまたはタンパク質を発現するために用いられ得る細胞の例には以下が挙げられ るが、これらに限定されない：ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫｉＳＶ、ＰｅｒＣ６、ＮＳ 30 ０、２９３、２９３Ｔ、および昆虫細胞。いくつかの実施態様において、ＣＨＯ細胞を用 いて、ＵＰＲ経路の少なくとも１つの構成要素を発現し得る。いくつかの実施態様におい て、ＣＨＯ細胞を用いて、グリコシル化経路の少なくとも１つの構成要素を発現し得る。 いくつかのさらなる実施態様において、これらの細胞はさらに、グリコシル化された関心 対象のタンパク質（例えば、抗体）を発現し得る。 【０３９３】 いくつかの実施態様において、生物学的経路に関与する関心対象の機能的タンパク質の 転写をコードしまたは活性化する核酸の宿主細胞への導入の前に、宿主細胞は、経路の構 成要素のいずれも発現しない。他の実施態様において、生物学的経路に関与する関心対象 の機能的タンパク質の転写をコードしまたは活性化する核酸の宿主細胞への導入前に、宿 40 主細胞は、経路の少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、または少なくとも２５の構 成要素を発現する。 【０３９４】 いくつかの実施態様において、生物学的経路の１つ以上の機能的タンパク質構成要素を 発現することに加えて、本発明の細胞および細胞株はまた、例えば、生物学的経路におけ る機能的タンパク質構成要素の１つ以上の発現または機能に影響を与えることによって、 生物学的経路を調節する１つ以上の機能的タンパク質および／またはその構成要素の少な くオｔも１つを発現する。このような効果には以下が挙げられ得るが、これらに限定され ない：生物学的経路における１つ以上の機能的タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコ シル化）、収量、折りたたみ、組み立ておよび／または分泌。生物学的経路に関与し得る 50 (121) JP 2012-516687 A 2012.7.26 遺伝子またはＲＮＡ（例えば、ＵＰＲ、細胞の生存率、タンパク質の産生、折りたたみ、 組み立て、修飾、グリコシル化、タンパク質分解、分泌、細胞膜への組み込み、細胞表面 での提示、あるいいはこれらの組み合わせ）およびこれらによってコードされる発現産物 の例には以下が挙げられるが、これらに限定されない：スプライスしたＡＴＦ６ａ、スプ ライスしたＩＲＥＩａ、ＩＲＥＩｂ、ＰＥＲＣＤＣ、ＡＴＦ４、ＹＹＩ、ＮＦ−ＹＡ、Ｎ Ｆ−ＹＢ、ＮＦ−ＹＣ、ＸＢＰ１、およびＥＤＥＭ１（ＵＰＲ遺伝子）；ＮＲＦ２、ＨＥ ＲＰ、ＸＩＡＰ、ＧＡＤＤ３４、ＰＰＩ ａ、ｂ、およびｇ、ならびにＤＮＡＪＣ３（ス イッチオフ遺伝子）；スプライスしたＢＬＩＭＰ−１およびＸＢＰ１（Ｂ細胞において発 現した遺伝子）；ＣＲＴ（ＣａＢＰ３）、ＣＮＸ、ＥＲｐ５７（ＰＤＩＡ３）、ＢｉＰ、 ＢＡＰ、ＥＲｄｊ３、ＣａＢＰＩ、ＧＲＰ９４（ＣａＢＰ４）、ＥＲｐ７２（ＰＤＩＡ４ 10 ）、およびシクロフィリンＢ（折りたたみ／分泌遺伝子‐クラス１シャペロン）；ＢｉＰ 、ＢＡＰ、ＥＲｄｊ３、ＣａＢＰＩ、ＧＲＰ９４（ＣａＢＰ４）、ＥＲｐ７２（ＰＤＩＡ ４）、およびシクロフィリンＢ（クラス２シャペロン）；ＳＤＦ２−Ｌ（グリコシル化遺 伝子）；ＥＲＯ１ａおよびｂ、ＥＲＡＤ、マンノシダーゼ１、ＨＲＤ１（酸化遺伝子）； ＳＴＣ１および２、ＳＥＲＣＡ１および２、ＣＯＤ１（カルシウムポンプ）；ＩＮＯ１、 ＳＲＥＢＰ１ＤＣ、ＳＲＥＢＰ２ＤＣ、およびＰＹＣ（脂質生合成／代謝遺伝子）；Ｓｅ ｃ６１Ｐａ、ｂ、およびｇ（輸送／膜組み込み遺伝子）；ならびにＢｃｌ−２ｓｐ、Ｂｃ ｌ−ｘＬ、Ｂｉｍ、Ｋｕ７０、ＶＤＡＣ２、ＢＡＰ３１、および１４−３−３（細胞生存 率／抗アポトーシス遺伝子）。 【０３９５】 20 いくつかの実施態様において、関心対象の第一のタンパク質の発現または機能的生物学 的経路もしくはその１つ以上の構成要素に加えて、本発明の細胞および細胞株はまた、関 心対象の少なくとも１つの第二のタンパク質を発現し、この中で、関心対象の第二のタン パク質の発現は、関心対象の第一のタンパク質の発現または機能的生物学的経路もしくは その１つ以上の構成要素によって影響されまたは変化する。このような効果の例には、ｍ ＲＮＡ転写のレベルのもの、スプライシング、輸送、タンパク質翻訳、翻訳後修飾（例え ば、グリコシル化）、ならびにタンパク質の輸送、折りたたみ、組み立て、膜への組み込 み、分泌、および全体的な産生（収量）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば 、関心対象の第一のタンパク質の発現、または機能的生物学的経路もしくはその１つ以上 の構成要素は、関心対象の第二のタンパク質の増大したまたはより効率的なもしくは正確 30 なｍＲＮＡ転写、スプライシング、輸送、タンパク質翻訳、翻訳後修飾（例えば、グリコ シル化）、ならびにタンパク質の輸送、折りたたみ、組み立て、膜への組み込み、分泌、 および／または全体的な産生（収量）を結果として生じ得る。いくつかの実施態様におい て、関心対象の第二のタンパク質は生物製剤である。生物製剤の例は、下記にさらに提供 される。いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株は、抗体およびグリコ シル化経路を同時発現する。 【０３９６】 いくつかの実施態様において、特に本方法において用いられる細胞または細胞株によっ て発現したタンパク質は、機能的細胞株が、細胞または遺伝子の操作なしでタンパク質を 通常では発現しない細胞種類の細胞においてあらかじめ利用可能ではなかったタンパク質 40 である。理論によって結び付けられることなく、このような細胞株が、これまでに可能で はなかったいくつかの理由には、タンパク質が、非常に複雑であり、または細胞もしくは 遺伝子の操作の不在下で、かつタンパク質を発現する多数の細胞を調製することなく、特 化したもしくは稀有な細胞においてのみ発現することが考えられ、タンパク質がアクセサ リー因子と関連して適切に、または発現し、組み立てられ、修飾され、局在化され、機能 的であることができる起こり得る稀有な操作された細胞のうちの１つを同定することが不 可能であるか、または細胞毒性と関連しておらず；あるいはタンパク質のリガンドもしく は調節因子が、機能的形態でタンパク質を発現する細胞もしくは細胞株を同定する上で使 用することについて公知ではなく；あるいは、タンパク質が、天然では発現しない状況な ど、その天然の状況以外で発現する場合、タンパク質が細胞毒性であるからである。 50 (122) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０３９７】 細胞質に局在するタンパク質、細胞の少なくとも１つの膜に組み込まれもしくは会合し たタンパク質、細胞表面に局在したタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む がこれらに限定されない、関心対象の任意のタンパク質を一貫して発現する本発明の細胞 および細胞株を作製することができる。このようなタンパク質には、ヘテロ多量体イオン チャネル、リガンド開口型（ＧＡＢＡ Ａ受容体など）、イオンチャネル（ＣＦＴＲなど ）、ヘテロ多量体イオンチャネル、電位開口型（ＮａＶなど）、ヘテロ多量体イオンチャ ネル、非リガンド開口型（上皮ナトリウムチャネル、ＥＮａＣ）、ヘテロ二量体ＧＰＣＲ （オピオイド受容体、甘味、旨味、および苦味を含む味覚受容体）、他のＧＰＣＲ、オー ファンＧＰＣＲ、ＧＣＣ、オピオイド受容体、成長ホルモン受容体、エストロゲン／ｈｇ 10 ｈ、核または膜結合型、ＴＧＦ受容体、ＰＰＣＲ核ホルモン受容体、ニコチン性／Ａｃｈ 、Ｂ細胞／Ｔ細胞受容体などの免疫受容体、酸っぱい、冷たい、寒冷な、熱い、脂肪の、 脂肪酸の、もしくは脂質の味覚もしくは感覚、クリーム状、触覚、疼痛、口内感覚、およ び刺痛についての受容体などの化学受容性受容体が挙げられる。 【０３９８】 本発明の細胞および細胞株は、表７∼２２に列挙した任意のタンパク質またはタンパク 質の組み合わせを含む、機能的タンパク質を発現することができる（哺乳類Ｇタンパク質 、ヒトオーファンＧＰＣＲ，ヒトオピオイド受容体、ヒト嗅覚受容体、イヌ嗅覚受容体、 蚊嗅覚受容体、他のヘテロ多量体受容体、およびＧＡＢＡ受容体）。 【０３９９】 20 本発明の細胞および細胞株は、細胞が、関心対象の機能的タンパク質の一貫した発現を 経時的に提供することが望ましいすべての使用にとって特に有利となるいくつかの属性を 有する。タンパク質の発現およびタンパク質の機能に適用される用語「安定な」または「 一貫した」は、用語「安定した発現」および「一過性発現」が当業者によって理解される であろう様に、一過性発現または変動性機能を有する細胞から本発明の細胞および細胞株 を区別することを意味する。本発明の細胞または細胞株は、１、２、３、４、５、６、７ 、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０％未満の変動を有する機能 的タンパク質の安定したまたは一過性の発現を有してよい。 【０４００】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株の安定性は、一過性発現とは 30 区別することができる。 【０４０１】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株の安定性は、関心対象のＲＮ Ａまたはタンパク質の１つ以上について選択的な圧力の不在下で維持することができる。 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株の安定性は、通常用いられる、 または関心対象のＲＮＡもしくはタンパク質をコードする核酸を、操作された細胞の集団 へと導入した直後に用いられる、あるいは増幅したコピー数の拡散を用いて細胞もしくは 細胞株を選択する方法の間に通常用いられるレベルもしくは量と比較して、選択的な圧力 もしくは薬剤の最小のもしくは低下したレベルもしくは量であることができる。 【０４０２】 40 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株において観察される安定性の レベルは、同じ細胞種類の平均のまたはほとんどの細胞において作製される細胞または細 胞株において達成され得る通常レベルと比較して高い。 【０４０３】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株において観察される安定性の レベルは、同じ細胞種類の平均のまたはほとんどの細胞において作製される細胞または細 胞株において達成され得る通常値と比較して、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現 レベル、活性、または機能におけるより低い変動性を特徴とする。 【０４０４】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株における関心対象のＲＮＡま 50 (123) JP 2012-516687 A 2012.7.26 たはタンパク質の発現の安定性の期間についての時間の長さは、同じ細胞種類の平均のま たはほとんどの細胞において達成され得る通常値と比較して長い。 【０４０５】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株の安定性は、同じ細胞種類の 通常のまたはほとんどの細胞において達成され得る値と比較して、関心対象のＲＮＡまた はタンパク質の発現と関連して観察される細胞毒性を最小値で、または該細胞毒性の不在 下で維持することができる。 【０４０６】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞または細胞株の安定性は、同じ細胞種類の 通常のまたはほとんどの細胞において達成され得る値と比較して、培養物において関心対 10 象のＲＮＡまたはタンパク質の機能的形態、機能、生理学、薬理学、組み立て、局在、翻 訳後修飾、グリコシル化、酵素修飾、タンパク質分解性修飾、または化学量論の最小の変 化とともに、または変化がまったくなく、経時的に維持することができる。いくつかの実 施態様において、これらの特性は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現または機能 を調節する化合物を用いる細胞ベースのアッセイにおいて細胞または細胞株の薬理学的特 性または応答を特徴付けることによって決定されてよい。 【０４０７】 種々の実施態様において、本発明の細胞または細胞株は、関心対象の機能的ＲＮＡまた はタンパク質を発現し、すなわち、細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９ 、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、 20 ２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６ ０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１ ４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００日間増殖した後に一貫し て機能的であり、ここで、一貫した発現または一貫して機能的であるとは、以下を超える ほど変動しない発現レベルを指す：持続した細胞培養の２∼４日間にわたる１％、２％、 ３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％；持続した細胞培養の５∼１ ５日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、または１２％；持続した細胞培 養の１６∼２０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、 １６％、１８％、または２０％；持続した細胞培養の２１∼３０日間にわたる１％、２％ 、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４ 30 ％；持続した細胞培養の３０∼４０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％ 、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、または ３０％；持続した細胞培養の４５∼５０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１ ０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、ま たは３０％；持続した細胞培養の４５∼５０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％ 、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％ 、または３０％；持続した細胞培養の４５∼５０日間にわたる１％、２％、４％、６％、 ８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２ ８％、３０％、または３５％；持続した細胞培養の５０∼５５日間にわたる１％、２％、 ４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％ 40 、２６％、２８％、または３０％、または３５％；持続した細胞培養の５０∼５５日間に わたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０ ％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、または３５％；持続した細胞培養の５５ ∼７５日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、 ３０％、３５％、または４０％；持続した細胞培養の７５∼１００日間にわたる１％、２ ％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０ ％、または４５％；持続した細胞培養の１０１∼１２５日間にわたる１％、２％、３％、 ４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または ４５％；持続した細胞培養の１２６∼１５０日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％ 、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持 50 (124) JP 2012-516687 A 2012.7.26 続した細胞培養の１５１∼１７５日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１ ０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持続した細胞 培養の１７６∼２００日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５ ％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持続した細胞培養の２０ ０日間超にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５ ％、３０％、３５％、４０％、または４５％。 【０４０８】 種々の実施態様において、本発明の細胞または細胞株は安定であり、すなわち細胞また は細胞株は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の一貫した発現、量、収量、機能、また は活性を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、 10 １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２ ８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５ 、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１ ８０、１９０、または２００日間維持し、ここで、「一貫した」とは、以下を超えるほど 変動しない関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現、量、収量、機能、または活性のレ ベルを指す：持続した細胞培養の２∼４日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、６ ％、７％、８％９％、または１０％；持続した細胞培養の５∼１５日間にわたる１％、２ ％、４％、６％、８％、１０％、または１２％；持続した細胞培養の１６∼２０日間にわ たる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、または ２０％；持続した細胞培養の２１∼３０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１ 20 ０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％；持続した細胞培養の ３０∼４０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６ ％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、または３０％；持続した細胞培 養の４１∼４５日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、 １６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、または３０％；持続した細 胞培養の４５∼５０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４ ％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、または３０％；持続し た細胞培養の４５∼５０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、 １４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、または３ ５％；持続した細胞培養の５０∼５５日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０ 30 ％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、また は３０％、または３５％；持続した細胞培養の５０∼５５日間にわたる１％、２％、４％ 、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２ ６％、２８％、３０％、または３５％；持続した細胞培養の５５∼７５日間にわたる１％ 、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または ４０％；持続した細胞培養の７５∼１００日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、 ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持続 した細胞培養の１０１∼１２５日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０ ％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持続した細胞培 養の１２６∼１５０日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％ 40 、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持続した細胞培養の１５１ ∼１７５日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、 ２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持続した細胞培養の１７６∼２００日 間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３ ０％、３５％、４０％、または４５％；持続した細胞培養の２００日間超にわたる１％、 ２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４ ０％、または４５％。 【０４０９】 種々の実施態様において、本発明の細胞または細胞株は安定であり、すなわち、細胞ま たは細胞株は、関心対象の少なくとも２つのＲＮＡまたはタンパク質の一貫した発現、量 50 (125) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、収量、機能、または活性を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、 １２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２ ５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０ 、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、 １６０、１７０、１８０、１９０、または２００日間維持し、ここで、「一貫した」とは 、いかよりも超えるほど変動しない関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現、化学量論 量、量、収量、機能、または活性のレベルを指す：持続した細胞培養の２∼４日間にわた る１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％９％、または１０％；持続した細胞 培養の５∼１５日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、または１２％；持 続した細胞培養の１６∼２０日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２ 10 ％、１４％、１６％、１８％、または２０％；持続した細胞培養の２１∼３０日間にわた る１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、 ２２％、２４％；持続した細胞培養の３０∼４０日間にわたる１％、２％、４％、６％、 ８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２ ８％、または３０％；持続した細胞培養の４１∼４５日間にわたる１％、２％、４％、６ ％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％ 、２８％、または３０％；持続した細胞培養の４５∼５０日間にわたる１％、２％、４％ 、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２ ６％、２８％、または３０％；持続した細胞培養の４５∼５０日間にわたる１％、２％、 ４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％ 20 、２６％、２８％、３０％、または３５％；持続した細胞培養の５０∼５５日間にわたる １％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２ ２％、２４％、２６％、２８％、または３０％、または３５％；持続した細胞培養の５０ ∼５５日間にわたる１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、 １８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、または３５％；持続した細 胞培養の５５∼７５日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０ ％、２５％、３０％、３５％、または４０％；持続した細胞培養の７５∼１００日間にわ たる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、 ３５％、４０％、または４５％；持続した細胞培養の１０１∼１２５日間にわたる１％、 ２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４ 30 ０％、または４５％；持続した細胞培養の１２６∼１５０日間にわたる１％、２％、３％ 、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、また は４５％；持続した細胞培養の１５１∼１７５日間にわたる１％、２％、３％、４％、５ ％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％； 持続した細胞培養の１７６∼２００日間にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、 １０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％；持続した細 胞培養の２００日間超にわたる１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、 ２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％。 【０４１０】 機能的タンパク質の安定した発現に加えて所望の特性を有する細胞が選択され得る。検 40 出することのできる任意の所望の特性が選択され得る。当業者は、このような特徴に気付 くであろう。制限することのない例によって、このような特性には以下を含む： 【０４１１】 固体表面に対する脆弱性、形態、および接着、トリプシンもしくは細胞解離試薬による 単細胞分散、自動培養条件に対する適応性、血清含有条件下での挙動、無血清条件下での 挙動、無血清懸濁条件に対する変換可能性、凝集塊を形成する傾向、経代後の単細胞分散 細胞層を形成する傾向、回復力、異なる力の流体添加工程下での増殖チャンバー表面に付 着したままである傾向、非断片化核、細胞内空砲の欠失、細菌混入の欠失、マイコプラズ マの欠失、ウイルス混入の欠失、クローン性、ウェル内の細胞の大まかな物理的特性の一 貫性、室温未満／室温／室温超での増殖についての傾向、種々の時間での種々の温度の耐 50 (126) JP 2012-516687 A 2012.7.26 性についての傾向、プラスミド／オリゴヌクレオチド／蛍光発生プローブ／ペプチド／タ ンパク質／化合物を細胞が均等に取り込む傾向、ＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ／ＭｅＯＨ、有機溶 媒／洗剤とのインキュベーションに細胞が耐える傾向、維持された小胞体ストレス応答誘 導に細胞が耐える傾向、ＤＴＴへの曝露に耐える細胞の傾向、ウイルス／レンチウイルス ／コスミドベクターに細胞が感染する傾向、所望のＲＮＡ／タンパク質の内在性発現もし くはその欠失、染色体数、染色体異常、５／６／７／８／９のｐＨにおける増殖に対して 受け入れられること、紫外線／変異原／放射線に対する耐性、変化した／手動の／規模拡 大した（すなわち、反応炉を含む。）増殖条件下で先の特徴を維持する能力。 【０４１２】 本発明の細胞および細胞株は、従来の方法によって作製される細胞および細胞株と比較 10 して増大した特性を有する。例えば、本発明の細胞および細胞株は、発現の増大した安定 性および／または発現のレベルを有する（例えば、抗生物質および他の薬剤を含む選択的 圧力なしで培養物中で維持される場合でさえ）。他の実施態様において、本発明の細胞お よび細胞株は、種々のアッセイにおいて高いＺ’値を有する。なおも他の実施態様におい て、本発明の細胞および細胞株は、より従来操作された細胞と比較して生物学的に関連性 のあるタンパク質活性の発現の状況下で改良される。これらの特性は、細胞治療法のため に、タンパク質産生もしくはその他の使用のために修飾因子を同定して、同定された修飾 因子の機能的属性を改良するアッセイにおいて、本発明の細胞および細胞株が、任意の使 用に用いられる能力を亢進および改良する。 【０４１３】 20 いくつかの実施態様において、本発明の細胞および細胞株のさらなる有利な特性は、該 細胞および細胞株が、関心対象のタンパク質をコードする核酸の細胞への導入直後に典型 的に使用されるもしくは使用され得る、または増幅したコピー数の核酸を用いて細胞を選 択する手順の間に用いられ得る薬剤もしくは他の選択的圧力の不在下でまたは少量になっ た薬剤もしくは選択的圧力を用いて安定して発現する。理論によって結びつけられること なく、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を通常は発現しない細胞種類の細胞における関 心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現と関連した細胞毒性は、関心対象のＲＮＡまたは タンパク質の非細胞毒性発現に十分な条件が、操作された細胞において近似されなかった または再現されなかったことを反映し得る。いくつかの実施態様において、関心対象のこ のようなＲＮＡまたはタンパク質の発現と関連した細胞毒性を低下させまたは欠失してい 30 る操作された細胞は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の発現または機能についての改 善された条件が達成されたことを細胞毒性の低下または欠失が示すので、好ましい。ある 実施態様において、操作された細胞または細胞株は、天然には発現しない、または細胞も しくは遺伝子の操作のない細胞の同じ種類における関連した細胞毒性の不在下で天然には 発現しない関心対象のＲＮＡもしくはタンパク質を発現し得る。ある実施態様において、 操作された細胞または細胞株は、細胞または遺伝子の操作のない細胞の同じ種類において 、天然に機能的に、または適切に発現せず、折りたたまれず、組み立てられず、修飾され ず、翻訳後修飾されず、局在せず、もしくは活性のない関心対象のＲＮＡもしくはタンパ ク質を発現し得る。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、同じ細胞種類の平均 のまたはほとんどの細胞において発現する場合、祭御坊毒性であるとあらかじめ考えられ 40 ている関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の機能的な、安定した、生存可能な、または非 細胞毒性の発現を含む細胞または細胞株を結果として生じる。このように、好ましい実施 態様において、本発明の細胞および細胞株は、選択的圧力が全くないまま、培養物中で維 持される。さらなる実施態様において、細胞および細胞株は、薬剤または抗生物質を全く 用いずに維持される。本明細書で使用する場合、細胞の維持とは、タンパク質発現につい て説明されたように細胞が選択された後に該細胞を培養することを指す。維持は、選択的 圧力の下で細胞を増殖させた後地に、細胞に導入されたマーカーが、混在型集団において 安定した形質変換体が豊富となる細胞選別をする任意の工程を指さない。 【０４１４】 本発明の細胞および細胞株の無薬剤および無選択的圧力の細胞維持は、いくつかの利点 50 (127) JP 2012-516687 A 2012.7.26 を提供する。たとえｂあ、薬剤耐性細胞は、適度なレベルで関心対象の同時トランスフェ クトした導入遺伝子を発現し得ず、なぜなら、選択は、導入遺伝子を用いてまたは用いず に、薬剤耐性遺伝子を取り込んだ細胞の生存にかかっているからである。さらに、関心対 象のＲＮＡまたはタンパク質の発現または機能を維持するための薬剤選択または他の選択 的圧力についての細胞毒性または必要条件には達していない。さらに、選択的薬剤および 他の選択的圧力因子はしばしば、変異原性であるかまたはさもなければ、細胞の生理学に 干渉し、細胞ベースのアッセイにおけるひずんだ結果をもたらす。例えば、選択的薬剤は 、アポトーシスに対する感受性を低下させ得（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３６（３７）：１１１６９−１１１７８ （１９９７））、Ｄ ＮＡ修復および薬剤代謝を高め得（Ｄｅｆｆｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ 10 ｓ． ４８（１３）：３５９５−３６０２ （１９８８））、細胞のｐＨを上昇させ得（ Ｔｈｉｅｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３ ８（５）：６８５−６９０ （１９９０）； Ｒｏｅｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ． ３２（４１）：１１０４２−１ １０５６ （１９９３）； Ｓｉｍ ｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９１ （３）：１ １２８−１ １３２ （１９９４））、リソソームおよびエンドソームのｐ Ｈを低下させ得（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３５（９）：２８１１ −２８１７ （１９９６）； Ａｌｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８７（１０）：１５８３−１５９８ （１９９８））， ｄｅｃ ｒｅａｓｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ （Ｒｏｅｐｅ ｅ 20 ｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３２（４１）：１１０４２−１１０５６ （１９９３））、塩素イオン（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． ７１ （１）： ２３−３２ （１９９２）））およびＡＴＰ （Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒ ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９０（１ ）：３１２−３１６ （ １９９３））に対する細胞膜透過性を高め得、ならびに小胞輸送の速度を高め得る（Ａｌ ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９６ （８）：４４３２−４４３７ （１９９９））。このように、本発明の細胞および細胞株 は、選択的圧力によって生じる人工産物のないスクリーニングアッセイを可能にする。い くつかの好ましい実施態様において、本発明の細胞および細胞株は、細胞選別の前または 後に抗生物質などの選択的圧力因子とともに培養されず、それにより所望の特性を有する 30 細胞および細胞株は、濃度の高まった細胞集団を用いて開始しない場合でさえ、選別によ って単離される。 【０４１５】 本発明の細胞および細胞株は、発現および発現レベル（ＲＮＡまたはタンパク質）の脈 絡で従来法によって作製される細胞および細胞株と比較して亢進した安定性を有する。こ のような安定した発現を特徴とする細胞および細胞株を同定するために、関心対象のタン パク質の細胞または細胞株の発現は時間経過にわたって測定され、発現レベルが比較され る。安定した細胞株は、時間経過を通じて発現し続けるであろう（ＲＮＡまたはタンパク 質）。本発明のいくつかの態様において、時間経過は、少なくとも１週間、２週間、３週 間など、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、もし 40 くは９ヶ月間、またはそれらの間の任意の時間の長さであり得る。 【０４１６】 単離された細胞および細胞株は、発現している（ＲＮＡ）絶対量および相対量（関心対 象の複数サブユニットのタンパク質または複数のタンパク質の場合）を決定するために、 ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび単一終点（ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｄ−ｐ ｏｉｎｔ）ＲＴ−ＰＣＲなどによって特徴づけられ得る。好ましくは、複数サブユニット タンパク質のサブユニットの拡大レベルは、本発明の細胞および細胞株において実質的に 同じである。 【０４１７】 他の実施態様において、関心対象の機能的タンパク質の発現は、経時的にアッセイされ 50 (128) JP 2012-516687 A 2012.7.26 る。これらの実施態様において、安定した発現は、時間経過にわたって機能的アッセイの 結果を比較することによって測定される。機能的アッセイに基づいた細胞および細胞株の 安定性のアッセイは、タンパク質（ＲＮＡまたはタンパク質）を安定して発現するだけで なく、タンパク質を安定して産生しかつ適切に加工して（例えば、翻訳後修飾、サブユニ ット組み立て、および細胞内での局在）機能的タンパク質を産生する細胞および細胞株を 同定する利点を提供する。 【０４１８】 本発明の細胞および細胞株は、それらのＺ’因子によって立証される高い再現性を有す るアッセイを提供するさらなる有利な特性を有する。Ｚｈａｎｇ ＪＨ， Ｃｈｕｎｇ ＴＤ， Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ＫＲ， "Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ 10 Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉ ｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａ ｙｓ．" Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． １９９９；４（２）：６７−７３を 参照されたく、そのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。 Ｚ’値は、細胞または細胞株の質と関連しており、なぜなら、Ｚ’値は、細胞または細胞 株が修飾因子に対して一貫して応答するであろう程度を反映するからである。Ｚ’は、シ グナル対ノイズの範囲および多重ウェルプレートにわたる基準化合物に対する機能的応答 のシグナル変動性（すなわちウェルごと）を考慮する統計的な計算値である。ポジティブ コントロールを有する複数のウェルおよびネガティブコントロールを有する複数のウェル から得られたＺ’データを用いてＺ’が計算される。これらの平均値における差異因子に 20 対して３を乗じた組み合わせた標準偏差の比を１から減じて、下記の等式に従ったＺ’を 生じる： 【０４１９】 Ｚ’因子＝１−（（３σポジティブコントロール＋３σネガティブコントロール）／（ μポジティブコントロール−μネガティブコントロール＋）） 【０４２０】 因子が、理論的最大値を用いて理想的なアッセイを示すであろう１．０の場合、変動性 はなく、かつ動的範囲は制限されない。本明細書で使用する場合、「高いＺ」とは、少な くとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．７５、もしくは少なくとも０．８、ま たは０．６∼１．０の間の任意の小数を指す。複雑な標的の場合、高いＺ’は、少なくと 30 も０．４以上のＺ’を意味する。０に近いスコアは望ましくなく、なぜなら、ポジティブ コントロールとネガティブコントロールの間に重複があることを示すからである。産業に おいて、単純な細胞ベースのアッセイについては、０．３までのＺ’スコアは余白スコア と考えられ、０．３∼０．５のＺ’スコアは容認可能と考えられ、０．５を上回るＺ’ス コアは優れていると考えられる。無細胞アッセイまたは生化学アッセイは、細胞ベースの システムについてのスコアがより低い傾向にあることに接近し得、なぜなら、Ｚ’スコア が高ければ高いほど、しかしながら、Ｚ’細胞ベースシステムは複雑であるからである。 【０４２１】 当業者が、認識するであろうように、一本鎖タンパク質でさえ発現する従来の細胞を用 いた細胞ベースのアッセイは、０．５∼０．６よりも高いＺ’に典型的には達しない。複 40 数サブユニットタンパク質の操作された発現（導入されたコード化配列または遺伝子活性 化のいずれか）を有する細胞は、当技術分野で報告されている場合でさえ、これらの追加 された複雑性により比較的低いであろう。このような細胞は、結果が再現可能でないであ ろうことから、アッセイにおいて使用するのに信頼できないであろう。その一方で、本発 明の細胞および細胞株は、より高いＺ’値を有し、アッセイにおいて一貫した結果を有利 に生じる。実際、本発明の細胞および細胞株は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴ Ｓ）適合性アッセイについての基礎を提供し、なぜなら、該細胞および細胞株は一般的に 、従来作製された細胞よりも価値を有するからである。本発明のいくつかの態様において 、細胞および細胞株は結果として、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０ ．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、または少なくとも０．８のＺ’を生じる。 50 (129) JP 2012-516687 A 2012.7.26 本発明の細胞および細胞株について少なくとも０．３∼０．４のＺ’値でさえ有利であり 、なぜなら、関心対象のタンパク質が多重遺伝子の標的であるからである。本発明の他の 態様において、本発明の細胞および細胞株は、細胞が、複数回の継代、例えば、５∼２０ の任意の整数を含めた５∼２０回の継代について維持された後でさえ、少なくとも０．７ 、少なくとも０．７５、または少なくとも０．８のＺ’を結果的に生じる。本発明のいく つかの態様において、細胞および細胞株は、１、２、３、４、もしくはは５週間、または ２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヶ月間（それらの間の任意の期間を含む。）維 持された細胞および細胞株において少なくとも０．７、少なくとも０．７５、または少な くとも０．８のＺ’を結果的に生じる。 【０４２２】 10 いくつかの実施態様において、本発明の細胞および細胞株は、１つ以上の生理学的特性 が経時的に実質的に一定のままである関心対象のタンパク質を発現する。 【０４２３】 生理学的特性には、関心対象のタンパク質の発現とは別に細胞または細胞株の任意の観 察可能な、検出可能な、または測定可能な特性を含む。 【０４２４】 いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質の発現は、１つ以上の生理学的特 性を変化させることができる。生理学的特性の変化には、関心対象のタンパク質の発現に よる生理学的特性の任意の変化、例えば、刺激、活性化、または生理学的特性の亢進、ま たは生理学的特性の阻害、遮断、もしくは低下を含む。理論によって結びつけられること 20 なく、これらの実施態様において、１つ以上の定常の生理学的特性は、関心対象のタンパ ク質の機能的発現も定常のままであることを示す。特定の実施態様において、下記により 詳細に論議される味覚受容体（例えば、甘味受容体、旨味受容体、または苦味受容体）と 関連した１つ以上の定常の生理学的特性を用いて、機能的味覚受容体の発現をモニターす ることができる。 【０４２５】 理論によって結びつけられることなく、本発明は、定常の培養条件下で関心対象のタン パク質を発現する複数の細胞または細胞株を培養するための方法を提供し、この中で、関 心対象のタンパク質の安定した発現および／または１つ以上の実質的に定常の生理学的特 性など、１つ以上の所望の特性を有する細胞または細胞株を選択することができる。 30 【０４２６】 生理学的特性を測定することのできるいくつかの実施態様において、生理学的特性は、 複数の細胞または細胞株の複数の細胞において測定された生理学的特性の平均値として決 定される。ある具体的な実施態様において、生理学的特性は、少なくとも１０；１００； １，０００；１０，０００；１００，０００；１，０００，０００；または少なくとも１ ０，０００，０００個を上回って測定され、平均値は、経時的に実質的に定常のままであ る。 【０４２７】 いくつかの実施態様において、生理学的特性の平均は、複数の細胞または細胞株の複数 の細胞における生理学的特性を測定することによって決定され、この中で、細胞は、細胞 40 周期の異なる期にある。他の実施態様において、細胞は、細胞周期に関して同期化してい る。 【０４２８】 いくつかの実施態様において、生理学的特性は、単一の細胞レベルに関して観察、検出 、測定、またはモニターされる。ある実施態様において、生理学的特性は、単一の細胞レ ベルに関して経時的に実質的に定常のままである。 【０４２９】 ある実施態様において、生理学的特性は、それが１２時間にわたって０．１％、０．５ ％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％ 、４５％超、または５０％以下で変動しない場合、経時的に実質的に定常のままである。 50 (130) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ある実施態様において、生理学的特性は、それが１日にわたって０．１％、０．５％、１ ％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５ ％超、または５０％以下で変動しない場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実 施態様において、生理学的特性は、それが２日にわたって０．１％、０．５％、１％、２ ．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、 または５０％以下で変動しない場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様 において、生理学的特性は、それが５日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％ 、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または ５０％以下で変動しない場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様におい て、生理学的特性は、それが１０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５ 10 ％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０ ％以下で変動しない場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、 生理学的特性は、それが２０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、 １０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以 下で変動しない場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理 学的特性は、それが３０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０ ％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で 変動しない場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理学的 特性は、それが４０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、 １５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で変動 20 しない場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理学的特性 は、それが５０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５ ％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で変動しな い場合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理学的特性は、 それが６０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、 ２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で変動しない場 合、経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理学的特性は、それ が７０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０ ％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で変動しない場合、 経時的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理学的特性は、それが８ 30 ０日にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、 ２５％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で変動しない場合、経時 的に実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理学的特性は、それが９０日 にわたって０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５ ％、３０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で変動しない場合、経時的に 実質的に定常のままである。ある実施態様において、生理学的特性は、それが１継代、２ 継代、３継代、５継代、１０継代、２５継代、５０継代、または１００継代の経過にわた って０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３ ０％、３５％、４０％、４５％超、または５０％以下で変動しない場合、経時的に実質的 に定常のままである。 40 【０４３０】 細胞生理学的特性の例には以下が挙げられるが、これらに限定されない：増殖速度、サ イズ、形状、形態、体積；ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、イオン、炭水化物、また は水の特性または含有量；内在性の、操作された、導入された、遺伝子により活性化され た、または全体の遺伝子、ＲＮＡ、またはタンパク質の発現または含有量；接着、懸濁、 血清含有、無血清、動物成分非含有、振蘯、静止、またはバイオリアクタ−の増殖条件下 での増殖に対する傾向または適応性；チップ、アレイ、マイクロアレイ、スライド、ディ ッシュ、プレート、多重ウェルプレート、高密度多重ウェルプレート、フラスコ、ローラ ー瓶、バッグ、またはタンクの中または上における増殖に対する傾向または適応性；細胞 質、核小体、核、リボソーム、粗面小胞体、ゴルジ装置、細胞骨格、滑面小胞体、ミトコ 50 (131) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ンドリア、空胞、サイトゾル、リソソーム、中心子、葉緑体、細胞膜、形質膜、核膜（ｎ ｕｃｌｅａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、核エンベロープ（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｎｖｅｌｏｐ ｅ）、小胞（例えば、分泌小胞）、または少なくとも１つの小器官の膜；以下を含むがそ れらに限定されない１つ以上の具体的な細胞種類または分化した、未分化の、もしくは脱 分化した細胞種類によって共有される（１つ以上の遺伝子のうちの）少なくとも１つの機 能的特性または遺伝子発現特性を獲得したことまたは獲得する能力もしくは傾向を有する こと：肝臓、肺、皮膚、筋肉（心筋、骨格筋、横紋筋を含むがこれらに限定されない。） 、膵臓、脳、精巣、卵巣、血液、免疫系、神経系、骨、心臓脈管系、中枢神経系、胃腸管 、胃、甲状腺、舌、胆嚢、腎臓、鼻、眼、爪、毛髪、味蕾細胞もしくは味覚細胞、ニュー ロン、皮膚、膵臓、血液、免疫、赤血球細胞、白血球細胞、キラーＴ細胞、腸内分泌細胞 10 、分泌細胞、腎臓、上皮細胞、内皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、または植物細胞を含む幹 細胞、多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）、全能性細胞（ｏｍｎｉｐｏｔ ｅｎｔ ｃｅｌｌ）、または特化したもしくは組織特異的細胞；以下を含むがこれらに限 定されない天然または合成の化学物質または分子を取り込む能力または容量：核酸、ＲＮ Ａ、ＤＮＡ、タンパク質、低分子、プローブ、色素、オリゴヌクレオチド（修飾されたオ リゴヌクレオチドを含む。）、または蛍光発生オリゴヌクレオチド；以下を含むがこれら に限定されない、細胞増殖、機能、または生存可能性に負に影響する化学物質または物質 の負のまたは有害な効果に耐える抵抗性または容量：観戦、薬剤、化学物質、病原体、洗 剤、紫外線、有害な条件、冷却、温熱、極温、振蘯、撹乱、ボルテックス、酸素欠乏また は低レベルの酸素、栄養物質欠乏または低レベルの栄養物質、毒素、毒液、ウイルスまた 20 は化合物、細胞または細胞増殖に有害な効果を有する処置または薬剤；以下を含むがこれ らに限定されない、インビトロ試験、細胞ベースのアッセイ、生化学的もしくは生物学的 試験、植え込み、細胞治療法、または二次アッセイにおいて使用するための適合性：大規 模細胞培養、小型化細胞培養、自動細胞培養、ロボット細胞培養、標準化した細胞培養、 薬剤開発、ハイスループットスクリーニング、細胞ベースのアッセイ、機能的細胞ベース のアッセイ（膜電位アッセイ、カルシウムフラックスアッセイ、リポーターアッセイ、Ｇ タンパク質受容体アッセイを含むがこれらに限定されない。）、ＥＬＩＳＡ、インビトロ アッセイ、インビボ適用、二次試験、化合物試験、結合アッセイ、パニングアッセイ、抗 体パニングアッセイ、ファージディスプレイ、撮像研究、顕微鏡撮像アッセイ、免疫蛍光 研究、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、もしくは生物製剤の産生もしくは精製、ワクチン開 30 発、細胞治療法、臓器、動物、ヒト、もしくは植物への植え込み、細胞によって分泌され る因子の単離、ｃＤＮＡライブラリの調製、または病原体、ウイルス、もしくは他の媒介 物による感染；および以下などの他の観察可能な、測定可能な、または検出可能な生理学 的特性：少なくとも１つの代謝産物、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の生合成 ；染色体のサイレンシング、活性化、異質染色質化、ユークロモアチナイゼーション（ｅ ｕｃｈｒｏｍｏａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）または組換え；遺伝子発現、遺伝子サイレンシ ング、遺伝子スプライシング、遺伝子組換え、または遺伝子活性化；ＲＮＡの産生、発現 、転写、プロセシングスプライシング、輸送、局在または修飾；タンパク質の産生、発現 、分泌、折りたたみ、組み立て、輸送、局在、細胞表面提示、分泌、または細胞もしくは 小器官の膜への組み込み；翻訳後修飾、プロセシング、酵素修飾、タンパク質分解、グリ 40 コシル化、リン酸化、脱リン酸化を含むがこれらに限定されないタンパク質修飾；有糸分 裂、減数分裂、もしくは分裂を含む細胞分裂、または細胞融合；高レベルのＲＮＡまたは タンパク質の産生または収量。 【０４３１】 生理学的特性は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓシリーズなどの引用ガイドおよ びマニュアルにおいて説明された試験および方法を含むがこれらに限定されない、当技術 分野で公知の所定のアッセイを用いて観察、検出、または測定され得る。このシリーズに は、種々の分野における普遍的なプロトコルが含まれており、Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓ ｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅを通じて入手可能である。これらの引用ガイドにおけるプロトコル は、細胞の生理学的特性を観察、検出、または測定するのに使用することのできる方法を 50 (132) JP 2012-516687 A 2012.7.26 説明している。当業者は、これらの方法のうちの任意の１つ以上が、本明細書に開示され た生理学的特性を観察、検出、または測定するのに用いられ得ることを容易に認識するで あろう。 【０４３２】 細胞におけるリボソーム、ミトコンドリア、小胞体、粗面小胞体、ゴルジ、トランスゴ ルジ網、小胞、エンドソーム、および形質膜を含むがこれらに限定されない細胞内区画ま たは小器官のレベル、活性、または含有量を測定するのに使用することのできる自己蛍光 タンパク質を含む融合タンパク質として発現されるタンパク質マーカーを含めた多くのマ ーカー、色素、またはリポーターは、個々の生細胞の試験と適合性がある。いくつかの実 施態様において、蛍光標識細胞分取またはセルソーターを使用することができる。いくつ 10 かの実施態様において、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含むよう単離または作製さ れた細胞または細胞株は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含む細胞または細胞株の 単離、試験、または作製と同時に、後に、または前にこれらのマーカー、色素、またはリ ポーターを用いて試験することができる。いくつかの実施態様において、細胞内区画また は小器官の１つ以上のレベル、活性、または含有量は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク 質の改良された、増大した、未変性の、非細胞毒性の、生存可能な、または最適な発現、 機能、活性、折りたたみ、組み立て修飾、翻訳後修飾、分泌、または生理学と相関するこ とができる。いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の改良し た、増大した、未変性の、非細胞毒性の、生存可能な、または最適な発現、機能、活性、 折りたたみ、組み立て修飾、翻訳後修飾、分泌、細胞表面提示、膜への組み込み、薬理学 20 、収量、または生理学と相関している少なくとも１つの細胞内区画または小器官のレベル 、活性、または含有量を含む細胞または細胞株を単離することができる。いくつかの実施 態様において、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含む細胞または細胞株、ならびに関 心対象のＲＮＡまたはタンパク質の改良した、増大した、未変性の、非細胞毒性の、生存 可能な、または最適な発現、機能、活性、折りたたみ、組み立て修飾、翻訳後修飾、分泌 、細胞表面提示、膜への組み込み、薬理学、収量、または生理学と相関している少なくと も１つの細胞内区画または小器官のレベル、活性、または含有量を単離することができる 。いくつかの実施態様において、細胞の単離は、細胞選別または蛍光標識細胞分取を用い て実施される。 【０４３３】 30 いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含むよう操作する ことのできる多様な細胞の集団は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含むよう操作さ れた細胞または細胞株の単離、試験、または作製と同時に、前に、または後に少なくとも １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１ ７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０ 、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００の追 加的な核酸配列に曝露され、該核酸配列を導入され、または該核酸配列を含むよう操作さ れることができる。いくつかの実施態様において、追加的な核酸は、以下からなる群から 選択することができる：折りたたまれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の調節因子をコ ードするＲＮＡ、ＤＮＡ、または遺伝子；細胞増殖、細胞の生存可能性、細胞死、細胞の 40 健康を調節するＲＮＡ、ＤＮＡ、または遺伝子；ＲＮＡまたはタンパク質の発現、産生、 折りたたみ、分泌、収量、膜への組み込み、グリコシル化またはまたは酵素修飾を含めた 修飾または翻訳後修飾；他の細胞種類と比較して抗体産生細胞において豊富なＲＮＡ、Ｄ ＮＡ、または遺伝子。 【０４３４】 いくつかの実施態様において、細胞における核酸の少なくとも１つの発現は、関心対象 のＲＮＡまたはタンパク質の改良された、増大した、未変性の、非細胞毒性の、生存可能 な、または最適な発現、機能、活性、折りたたみ、組み立て修飾、翻訳後修飾、分泌、細 胞表面提示、膜への組み込み、薬理学、収量、または生理学と相関づけることができる。 いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の改良された、増大し 50 (133) JP 2012-516687 A 2012.7.26 た、未変性の、非細胞毒性の、生存可能な、または最適な発現、機能、活性、折りたたみ 、組み立て修飾、翻訳後修飾、分泌、細胞表面提示、膜への組み込み、薬理学、収量、ま たは生理学と相関づけられた少なくとも１つの核酸を含む細胞または細胞株を単離するこ とができる。いくつかの実施態様において、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含むよ う操作することのできる多様な細胞の集団は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含む よう操作された細胞または細胞株の単離、試験、または作製と同時に、前に、または後に 、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１ ５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ 、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、また は２００の追加的な核酸配列に曝露され、該配列を導入し、または該配列を含むよう操作 10 されることができ、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を含むよう操作された細胞または 細胞株、および関心対象のＲＮＡまたはタンパク質の改良された、増大した、未変性の、 非細胞毒性の、生存可能な、または最適な発現、機能、活性、折りたたみ、組み立て修飾 、翻訳後修飾、分泌、細胞表面提示、膜への組み込み、薬理学、収量、または生理学と相 関づけられた少なくとも１つの細胞内区画または小器官のレベル、活性、または含有量を 単離することができる。いくつかの実施態様において、細胞の単離は、細胞選別または蛍 光標識細胞分取を用いて実施される。 【０４３５】 細胞または細胞から作製された調製物を試験して、配列決定、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、 定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥを含めたＰＣＲ法、ノザンおよびサザンブロット、ＦＩＳ 20 Ｈ、インサイツハイブリダイゼーションを含めたハイブリダイゼーション法、蛍光、電子 、共焦点、もしくは免疫蛍光顕微鏡を含めた顕微鏡、または遺伝子チップもしくはタンパ ク質アレイなどのアレイもしくはマイクロアレイ試験を含めた方法および試験を用いてＤ ＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質含有量、組織化、発現、もしくは特性を分析し得、例えば、発 現が、例えばその機能的、生存可能的、もしくは安定した発現に影響を及ぼすことによっ て、 標的の発現にもしくは細胞の生理学的特性に衝撃を与え、利点をもたらし、もしく は有害となる発現特性もしくは１つ以上の遺伝子を同定し得る。 【０４３６】 細胞または細胞から作製された調製物は、遠心分離、超遠心分離法、浮遊（ｆｌｏａｔ ｉｎｇ）、ショ糖勾配、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、細胞下分画、代謝産物分析、化学組成分析 30 、染色体拡延、ＤＡＰＩ標識、ＮＭＲ、酵素アッセイ、ＥＬＩＳＡを含めた方法および試 験を用いて、代謝産物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、膜、脂質、炭水化物、または小器 官を含めた細胞の内容物を分析または特徴づけるために試験され得る； 【０４３７】 細胞によって産生されたタンパク質は、その配列、機能、形態、折りたたみ、膜への組 み込み、、豊富さ、収量、翻訳後修飾、グリコシル化、リン酸化、開裂、タンパク質分解 、または分解を、配列決定、抗体結合ＥＬＩＳＡ、または活性アッセイを用いて評価する ためにン試験され得る。 【０４３８】 細胞は、細胞増殖、有糸分裂、減数分裂、遺伝子組込み、遺伝子活性化、遺伝子導入、 40 または遺伝子発現もしくはサイレンシングについての試験によって試験され得、および特 徴づけられ得る。ある実施態様において、このような試験は、細胞のゲノムにおける任意 の導入遺伝子の組込みの部位を同定するために実施される。 【０４３９】 いくつかの実施態様において、本発明に従った細胞または細胞株の発現特性（例えば、 遺伝子発現またはタンパク質発現の特性）は、基準細胞または細胞株の発現特性と比較す ることができる。当業者に公知の任意の方法を用いて、１つ以上の核酸配列またはアミノ 酸配列の発現特性を測定することができる。典型的な方法は、遺伝子チップ、タンパク質 チップなどである。いくつかの実施態様において、ゲノムにおける遺伝子の少なくとも０ ．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、 50 (134) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、 ９９％、または１００％の発現がアッセイされる。いくつかの実施態様において、細胞に おける核酸配列またはアミノ酸配列の０．１％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０ ％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０ ％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％がアッセイされる。いく つかの実施態様において、ゲノムにおける遺伝子の１、２、３、４、５、１０、１５、２ ０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００、もしく は１００超の発現がアッセイされる。いくつかの実施態様において、再オブにおける核酸 配列またはアミノ酸配列の少なくとも少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０ 、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００、もしくは 10 １００超がアッセイされる。 【０４４０】 いくつかの実施態様において、基準細胞または細胞株は、本発明に従った細胞または細 胞株がそこから作製された宿主細胞である。他の実施態様において、細胞または細胞株お よび基準細胞または細胞株は同じ親クローンに由来する。いくつかの実施態様において、 細胞または細胞株および基準細胞または細胞株は、同じ親細胞に由来する。他の実施態様 において、基準細胞または細胞株は、本発明に従った細胞または細胞株が近似するよう設 計された細胞種類の細胞または細胞株である。このような細胞種類には以下が含まれるが 、これらに限定されない：表皮角化細胞（分化中の表皮細胞）、表皮基底細胞（幹細胞） 、手指爪および足指爪のケラチノサイト、爪床基底細胞（幹細胞）、髄質毛幹細胞、皮質 20 毛幹細胞、毛小皮細胞、鞘小皮細胞、ハックスレー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細 胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞（幹細胞）、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、お よび膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、およ び膣の上皮の基底細胞（幹細胞）、泌尿器上皮細胞（膀胱および尿管を裏打ちしている。 ）、唾液腺粘液細胞（多糖を豊富に分泌する。）、唾液腺漿液細胞、（糖タンパク質酵素 を豊富に分泌する。）、舌におおけるフォン・エブネル腺細胞（味蕾を洗浄する。）、乳 腺細胞（乳分泌）、涙腺細胞（涙分泌）、耳における耳道腺細胞（耳垢分泌）、エクリン 汗腺暗細胞（糖タンパク質分泌）、エクリン汗腺明細胞（低分子分泌）、アポクリン汗腺 細胞（芳香分泌、性ホルモン感受性）眼瞼におけるモル腺細胞（特化した汗腺）、皮脂線 細胞（脂質の豊富な皮脂の分泌）、鼻におけるボウマン腺細胞（嗅上皮を洗浄する。）、 30 十二指腸におけるブルンネル腺細胞（酵素およびアルカリ性粘液）、精嚢腺細胞（水泳す る精子のためのフルクトースを含む精液構成要素を分泌する。）、前立腺細胞（精液構成 要素を分泌する。）、尿道球腺細胞（粘液分泌）、バルトリン腺細胞（膣の潤滑剤分泌） 、リトレ腺細胞（粘液分泌）、子宮内膜細胞（炭水化物分泌）、気道および消化管の単離 された杯細胞（粘液分泌）、胃裏打ち粘液細胞（粘液分泌）、，胃腺酵素原細胞（ペプシ ノーゲン分泌）、胃腺酸分泌細胞（塩酸分泌）、膵臓腺房細胞（重炭酸および消化酵素分 泌）小腸のパネート細胞（リゾチーム分泌）、肺のＩＩ型肺細胞（界面活性剤分泌）、肺 のクララ細胞、下垂体前葉細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、甲 状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激因子、中間下垂体 細胞、， 分泌メラニン細胞刺激ホルモン、巨大細胞神経分泌細胞（オキシトシンを分泌 40 しおよび／またはバソプレッシンを分泌する。）、腸管細胞および気道細胞（セロトニン を分泌し、エンドルフィンを分泌し、ソマトスタチンを分泌し、ガストリンを分泌し、セ クレチンを分泌し、コレシストキニンを分泌し、インスリンを分泌し、グルカゴンを分泌 し、および／またはボンベシンを分布する。）、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細 胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞、副腎分 泌ステロイドホルモン（ミネラルコルチコイドおよびグルココルチコイド）、テストステ ロンを分泌する精巣のライディッヒ細胞、エストロゲンを分泌する卵胞の内卵胞膜細胞、 プロゲステロンを分泌する破裂卵胞の黄体細胞（顆粒膜黄体細胞および卵胞膜ルテイン細 胞）、傍糸球体細胞（レニン分泌）、腎臓の密集斑細胞、腎臓の周極細胞、腎臓のメサン ギウム細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）（肝細胞（ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ））、白 50 (135) JP 2012-516687 A 2012.7.26 色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝脂質細胞、腎糸球体壁細胞、腎糸球体有足細胞、腎近位尿 細管刷子縁細胞、ヘンレのループの細い部分の細胞、腎遠位尿細管細胞、集合管細胞、Ｉ 型肺胞細胞（肺の気腔を裏打ちする。）、膵管細胞（腺房中心細胞）、主細胞および間在 細胞などの（汗腺、唾液腺、乳腺などの）平滑筋導管細胞、（精嚢、前立腺などの）導管 細胞、腸刷子縁細胞（微絨毛あり）、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、小遠心路非 線毛細胞（Ｄｕｃｔｕｌｕｓ ｅｆｆｅｒｅｎｓ ｎｏｎｃｉｌｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ） 、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、血管およびリンパ管の内皮有窓細胞、血管および リンパ管の内皮継代細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ） 、血管およびリンパ管の内皮脾細胞、滑膜細胞（関節腔を裏打ちする。ヒアルロン酸分泌 ）、漿膜細胞（腹膜腔、胸膜腔、および囲心腔を裏打ちする。）、扁平細胞（耳の外リン 10 パ腔を裏打ちする。）、 扁平細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする。）、微絨毛を有する 内リンパ嚢の円柱細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする。）、微絨毛を有さない内リンパ嚢 の円柱細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする。）、暗細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする。 ）、前庭膜細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする。）、血管条基底細胞（耳の内リンパ腔を 裏打ちする。）、血管条周辺細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする。）、クラウジウス細胞 （耳の内リンパ腔を裏打ちする。）、ベッチェル細胞（耳の内リンパ腔を裏打ちする。） 、脈絡叢細胞（脳脊髄液分泌）、軟膜クモ膜扁平細胞、眼の色素性毛様体上皮細胞（ｐｉ ｇｍｅｎｔｅｄ ｃｉｌｉａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｅｌｌ）、眼の無色素性毛 様体上皮細胞（ｎｏｎｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｃｉｌｉａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃ ｅｌｌ）、角膜内皮細胞、気道線毛細胞、（雌における）輸卵管線毛細胞、（雌における 20 ）子宮内膜線毛細胞、（雄における）精巣網線毛細胞、（雄における）輸出管線毛細胞、 中枢神経系の線毛上衣細胞（ｃｉｌｉａｔｅｄ ｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｃｅｌｌ）（脳腔 （ｂｒａｉｎ ｃａｖｉｔｉｅｓ）を裏打ちする。）、エナメル芽細胞上皮細胞（歯のエ ナメル分泌）、耳の前庭器の半月面上皮細胞（プロテオグリカン分泌）、コルチ器官の歯 間上皮細胞（有毛細胞を覆っている蓋膜を分泌する。）、疎性結合組織線維芽細胞、角膜 線維芽細胞（角膜実質細胞）、腱線維芽細胞、骨髄細網組織線維芽細胞、他の非上皮線維 芽細胞、周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞／セメント細胞（歯根骨様（ｔｏ ｏｔｈ ｒｏｏｔ ｂｏｎｅｌｉｋｅ）セメントの分泌）、オントブラスト（ｏｎｔｏｂ ｌａｓｔ）／象牙細胞（ｏｄｏｎｔｏｃｙｔｅ）（歯象牙質の分泌）、硝子軟骨細胞（ｈ ｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、線維軟骨細胞（ｆｉｂ 30 ｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、弾性軟骨細胞（ｅｌａｓｔｉｃ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞／骨細胞、骨細胞前駆細胞（ 骨芽細胞の幹細胞）、眼の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星細胞、肝星細胞（伊 東細胞）、膵星細胞、骨格筋細胞（赤色骨格筋細胞（遅筋）、白色骨格筋細胞（速筋）、 中間骨格筋細胞、筋紡錘の核袋細胞など）、衛星細胞（幹細胞）、心筋細胞（普通心筋細 胞、結節性心筋細胞、およびプルキンエ線維細胞など）、平滑筋細胞（種々の種類）、虹 彩の筋上皮細胞、外分泌線の筋上皮細胞、赤血球細胞（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血 球細胞（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））、巨核球（血小板前駆体）、単球、結合織マ クロファージ（種々の種類）、表皮ランゲルハンス細胞、（骨における）破骨細胞、（リ ンパ組織における）樹状細胞、（中枢神経系における）ミクログリア細胞、好中球顆粒球 40 、好酸球顆粒球、好塩基球顆粒球、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、 細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球 、血液系および免疫系のための幹細胞および関連前駆細胞（種々の種類）、コルチ器官の 外有毛細胞、嗅上皮の基底細胞（嗅覚ニューロンのための幹細胞）、低温感受性一次感覚 ニューロン、感熱性一次感覚ニューロン、表皮のメルケル細胞（触覚センサー）、嗅覚受 容神経、疼痛感受性一次感覚ニューロン（種々の種類）、眼の網膜の視細胞（桿体視細胞 、眼の青色感受性錐体視細胞、眼の緑色感受性錐体視細胞、眼の赤色感受性錐体視細胞な ど）、固有受容性一次感覚ニューロン（種々の種類）、触角感応性一次感覚ニューロン（ 種々の種類）、Ｉ型頚動脈小体細胞（ｃａｒｏｔｉｄ ｂｏｄｙ ｃｅｌｌ）（血液ｐＨ センサー）、ＩＩ型頚動脈小体細胞（血液ｐＨセンサー）、耳の前庭器のＩ型有毛細胞（ 50 (136) JP 2012-516687 A 2012.7.26 加速および重力）、耳の前庭器のＩＩ型有毛細胞（加速および重力）、Ｉ型味蕾細胞、コ リン作動性神経細胞（種々の種類）、アドレナリン作動性神経細胞（種々の種類）、ペプ チド作動性神経細胞（種々の種類）、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コ ルチ器官の内指節細胞、コルチ器官の外指節細胞、コルチ器官の境界細胞、コルチム（Ｃ ｏｒｔｉｍ）器官前庭器支持細胞のヘンゼン細胞、Ｉ型味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、 シュワン細胞、衛星細胞（被包性の末梢神経細胞体）、腸管グリア細胞、星状細胞（種々 の種類）、ニューロン細胞（多くの種々の種類、なおも不完全に分類）、オリゴデンドロ サイト、紡錘形ニューロン、水晶体前部上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、メ ラニン形成細胞、網膜色素上皮細胞、卵原細胞／卵母細胞、精細胞、精母細胞、精原細胞 （精母細胞のための幹細胞）、精子、卵胞細胞、（精巣における）セルトリ細胞、胸腺上 10 皮細胞、ならびに間質性腎細胞。例えば、細胞または細胞株において発現する関心対象の タンパク質は、特定の種類のニューロンにおいて通常発現するイオンチャネルであり、基 準細胞は、その特定のタイプのニューロンであり得る。特定の種類のニューロンには以下 が挙げられるが、これらに限定されない：感覚ニューロン、中枢神経系のニューロン、単 極性ニューロン、偽単極性ニューロン、二極性ニューロン、多極性ニューロン、ゴルジＩ 型ニューロン、錐体細胞、プルキンエ細胞、前角細胞、ゴルジＩＩ型ニューロン、顆粒細 胞、バスケット細胞、ベッツ細胞、大型運動ニューロン、（ｌａｒｇｅ ｍｏｔｏｒ ｎ ｅｕｒｏｎｓ）、中型有棘ニューロン、レンショウ細胞、α運動ヒューロン、求心性ニュ ーロン、遠心性ニューロン、運動ニューロン、および介在ニューロン。 【０４４１】 20 いくつかの実施態様において、基準細胞は、遺伝子操作をせずに関心対象のＲＮＡまた はタンパク質を正常に発現させまたは機能的に発現させる細胞種類の細胞である。いくつ かの実施態様において、基準細胞は、関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を安定して発現 させる能力を有する細胞である。いくつかの実施態様において、基準細胞は、関連した細 胞毒性を有さずに関心対象のＲＮＡまたはタンパク質を発現する能力を有する細胞である 。 【０４４２】 さらなる態様において、本発明は、本発明の細胞および細胞株を作製するための方法を 提供する。一実施態様において、方法は、以下の工程を含む： ａ）少なくとも２つが、関心対象のＲＮＡまたは関心対象のタンパク質をコードするｍ 30 ＲＮＡを発現する複数の細胞を提供する工程； ｂ）個々の細胞容器に細胞を個々に分散させ、それにより複数の別個の細胞培養物を提 供する工程； ｃ）別個の各細胞培養物と条件が実質的に同一であることを特徴とする自動細胞培養法 を用いて、１セットの所望の培養条件下で細胞を培養し、その間、別個の各細胞培養物に おける細胞数が標準化され、およびこの中で、別個の培養物が、同じスケジュールで継代 される工程； ｄ）関心対象のＲＮＡまたは関心対象のタンパク質の少なくとも１つの所望の特徴につ いて、別個の細胞培養物を少なくとも２回アッセイする工程；ならびに ｅ）所望の特徴を有する別個の細胞培養物を両アッセイにおいて同定する工程。 40 【０４４３】 本方法によると、細胞は、所望のセットの培養条件下で培養される。条件は任意の所望 の条件であることができる。当業者は、何のパラメータが１セットの培養条件内に含まれ るかを理解するであろう。例えば、培養条件には以下が含まれるが、これらに限定されな い：培地（基礎培地（ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、無血清、血清含有、完全に化学的に 規定されたもの、動物由来の構成要素非含有）、一価および二価イオン（ナトリウム、カ リウム、カルシウム、マグネシウム）濃度、追加される追加的構成要素（アミノ酸、抗生 物質、グルタミン、グルコース、または他の炭素源、ＨＥＰＥＳ、チャネル遮断薬、他の 標的の調節因子、ビタミン、微量元素、重金属、補助因子、増殖因子、抗アポトーシス試 薬）、新鮮培地もしくは条件培地、ＨＥＰＥＳ含有、ｐＨ、欠乏したまたは制限している 50 (137) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ある栄養物質（アミノ酸、炭素源））、細胞が、分岐／継代前に達成することのできる培 養密度のレベル、細胞のフィーダー層、またはγ線照射した細胞、ＣＯ２、３つの気体系 （酸素、窒素、二酸化炭素）、湿度、温度、静止または振蘯機上、ならびにこれらに類す るものであり、これらは、当業者に周知であろう。 【０４４４】 細胞培養条件は、細胞の簡便さについてまたは特定の所望の使用について選択され得る 。有利なことに、本発明は、特定の所望の使用に際的に適した細胞および細胞株を提供す る。すなわち、細胞が、特定の所望の使用についての条件下で培養される本発明の実施態 様において、所望の使用についての条件下で所望の特徴を有する細胞が選択される。 【０４４５】 10 説明によって、細胞が、接着性であることが望まれるプレートにおけるアッセイにおい て使用されるであろう場合、アッセイの条件下で接着を示す細胞が選択され得る。同様に 、細胞が、タンパク質産生に用いられるであろう場合、細胞は、タンパク質産生に適した 条件下で培養され得、この使用に有利な特性について選択され得る。 【０４４６】 いくつかの実施態様において、方法は、個別の細胞培養の増殖速度を測定する追加的な 工程を含む。増殖速度は、当業者に周知であろう種々の技術手段のいずれかを用いて決定 され得る。このような技術には、ＡＴＰ、細胞培養密度、光散乱、光学密度（例えば、Ｄ ＮＡについてのＯＤ２６０）を測定することが含まれるが、これらに限定されない。好ま しくは、増殖速度は、選択された培養条件の外側で培養が費やす時間の量を最小化する手 20 段を用いて決定される。 【０４４７】 いくつかの実施態様において、細胞の培養密度が測定され、増殖速度は培養密度値から 計算される。いくつかの実施態様において、細胞は分散し、改良された正確性について細 胞の培養密度を測定する前に凝集塊が除去される。細胞を単一分散させるための手段は周 知であり、例えば、測定されるべき培養物に分散試薬を添加することによって達成するこ とができる。分散薬は、周知であり、容易に入手可能であり、トリプシンまたは他のプロ テアーゼなどの酵素分散薬、およびＥＤＴＡベースの分散薬を含むがこれに限定されない 非酵素細胞解離試薬を含むが、これらに限定されない。増殖速度は、ＨＡＭＩＬＴＯＮ ＶＥＣＴＯＲなど、その目的のための市販のソフトウェアを用いて、培養密度の日から計 30 算することができる。自動顕微鏡プレートリーダーを用いるなどの自動培養密度測定は、 特に有用である。培養密度を測定するプレートリーダーは市販されており、ＣＬＯＮＥ ＳＥＬＥＣＴ ＩＭＡＧＥＲ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を含むが、これに限定されない。典型的 には、細胞培養密度に関する少なくとも２回の測定が実施された後に、増殖速度が計算さ れる。増殖速度を決定するのに用いられる培養密度値の数は、培養に簡便なまたは適した 任意の数であることができる。例えば、培養密度は、例えば、１週間、２週間、３週間に わたって複数回、または所望の任意の長さの時間および任意の頻度で測定することができ る。 【０４４８】 増殖速度が公知である場合、本方法によると、複数の別個の細胞培養物は、増殖速度の 40 類似性によって群に分割される。増殖速度ビンに培養物をグループ分けすることによって 、グループにおける培養物を一緒に操作することができ、培養物間の変動を減少させる標 準化の別のレベルを提供する。例えば、１つのビンにおける培養物は、同じ時間に継代す ることができ、所望の試薬で同じ時間処理することができるなどである。さらに、機能的 アッセイの結果は、アッセイウェルにおける細胞密度に典型的に依存する。いくつかの実 施態様において、個々のクローンの真の比較は、同じ密度で蒔いてかつアッセイすること によってしか達成されない。固有増殖速度へのグループ分けによって、高処理量フォーマ ットにおいて機能的に特徴づけることができる固有密度でクローンを蒔くことができる。 【０４４９】 各グループにおける増殖速度の範囲は、任意の簡便な範囲であることができる。細胞が 50 (138) JP 2012-516687 A 2012.7.26 同じ時間で継代でき、細胞数の頻繁な再標準化を回避できる増殖速度のは二を選択するこ とは特に有利である。増殖速度の群には、きっちりしたグループ分けのための非常に幅の 狭い範囲、例えば、互いに１時間以内に平均で２倍になる時間を含むことができる。しか し、本方法によると、範囲は、互いの最長２時間、最長３時間、最長４時間、最長５時間 、また最長１０時間、またはさらにより広めの範囲であることができる。再標準化につい ての必要性は、ビンにおける増殖速度が同じでなく、それによりいくつかの培養ｂ通にお ける細胞数がその他のものよりも迅速に増加するは場合に生じる。１つのビンにおけるす べての培養物について実質的に同一の条件を維持するために、ビン間の数を再標準化する よう細胞を周期的に取り除くことが必要である。増殖速度が異なれば異なるほど、より頻 繁に再標準化が必要とされる。 10 【０４５０】 工程ｄ）において、細胞および細胞株は、以下を含むがこれらに限定されない任意の生 理学的特性について試験および選択され得る：ゲノムによってコードされる細胞プロセス の変化；ゲノムによって調節される細胞プロセスの変化；染色体活性のパターンの変化； 染色体サイレンシングのパターンの変化；遺伝子サイレンシングのパターンの変化；遺伝 子活性化のパターンのまたは効率の変化；遺伝子発現のパターンまたは効率の変化；ＲＮ Ａ発現のパターンのまたは効率の変化；ＲＮＡｉ発現のパターンのまたは効率の変化；Ｒ ＮＡプロセシングのパターンのまたは効率の変化；ＲＮＡ輸送のパターンのまたは効率の 変化；タンパク質翻訳のパターンのまたは効率の変化；タンパク質折りたたみのパターン のまたは効率の変化；タンパク質組み立てのパターンのまたは効率の変化；タンパク質修 20 飾のパターンのまたは効率の変化；タンパク質輸送のパターンのまたは効率の変化；膜タ ンパク質の細胞表面への輸送のパターンのまたは効率の変化 増殖速度の変化；細胞サイ ズの変化；細胞形状の変化；細胞形態の変化；％ＲＮＡ含有量の変化；％タンパク質含有 量の変化；％水含有量の変化；％脂質含有量の変化；リボソーム含有量の変化；ミトコン ドリア含有量の変化；小胞体質量の変化；形質膜表面積の変化；細胞体積の変化；形質膜 の脂質組成の変化；核膜の脂質組成の変化；形質膜のタンパク質組成の変化；タンパク質 の変化；核膜の組成；分泌小胞数の変化；リソソーム数の変化；空胞数の変化；以下につ いての細胞の容量または能力の変化：タンパク質産生、タンパク質分泌、タンパク質折り たたみ、タンパク質組み立て、タンパク質修飾、タンパク質の酵素修飾、タンパク質グリ コシル化、タンパク質リン酸化、タンパク質脱リン酸化、代謝産物生合成、脂質生合成、 30 ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、栄養物質吸収、細胞増殖、有糸分裂、減数分 裂、細胞分裂脱分化すること、幹細胞に形質転換すること、多能性細胞に形質転換するこ と、全能性細胞に形質転換すること、任意の臓器（すなわち、肝臓、肺、皮膚、筋肉、膵 臓、脳、精巣、卵巣、血液、免疫系、神経系、骨、心臓脈管系、中枢神経系、胃腸管、胃 、甲状腺、舌、胆嚢、腎臓、鼻、眼、爪、毛髪、味蕾）の幹細胞種類に形質転換すること 、分化した任意の細胞種類（すなわち、筋肉、心筋、ニューロン、皮膚、膵臓、血液、免 疫、赤血球細胞、白血球細胞、キラーＴ細胞、腸内分泌細胞、味覚、感覚細胞、腎臓、上 皮細胞、内皮細胞、また、核酸配列の導入に用いることのできる既に列挙された任意の動 物またはヒトの細胞種類も含む。）に形質転換すること、ＤＮＡを取り込むこと、低分子 を取り込むこと、蛍光発生プローブを取り込むこと、ＲＮＡを取り込むこと、固体表面に 40 接着させること、無血清条件に適応させること、無血清懸濁条件に適応させること、大規 模細胞培養に適応させること、大規模細胞培養のために使用のために、薬剤開発における 使用のために、ハイスループットスクリーニングにおける使用のために、機能的細胞ベー スのアッセイにおける使用のために、膜電位アッセイにおける使用のために、カルシウム フラックスアッセイにおける使用のために、Ｇタンパク質リポーターアッセイにおける使 用のために、リポーター細胞ベースのアッセイにおける使用のために、ＥＬＩＳＡ研究に おける使用のために、インビトロアッセイにおける使用のために、インビボ応用における 使用のために、二次試験における使用のために、化合物試験における使用のために、結合 アッセイにおける使用のために、パニングアッセイにおける使用のために、抗体パニング アッセイにおける使用のために、撮像アッセイにおける使用のために、顕微鏡撮像アッセ 50 (139) JP 2012-516687 A 2012.7.26 イにおける使用のために、多重ウェルプレートにおける使用のために、自動細胞培養に対 する適応のために、小型自動細胞培養に対する適応のために、大規模自動細胞培養に対す る適応のために、多重ウェルプレートにおける細胞培養（６、１２、２４、４８、９６、 ３８４、１５３６、またはより高い密度）に対する適応のために、細胞チップにおける使 用のために、スライド上での使用のために、ガラススライド上での使用のために、スライ ドもしくはガラススライド上でのマイクロアレイのために、免疫蛍光研究のために、産業 用酵素の産生における使用のために、研究用試薬の作製における使用のために、ワクチン 開発における使用のために、細胞治療法における使用のために、動物もしくはヒトへの植 え込みにおける使用のためイン、細胞によって分泌される因子の単離における使用のため に、ｃＤＮＡライブラリの調製のために、ＲＮＡの精製のために、ＤＮＡの精製のために 10 、病原体、ウイルス、もしくは他の媒介物による感染のために、病原体、ウイルス、もし くは他の媒介物による感染に対する耐性のために、薬剤に対する耐性のために、自動小型 細胞培養条件下で維持されるための適合性のために、以下を含む特徴付けのためのタンパ ク質の産生における使用のために：タンパク質結晶学、ワクチン開発、免疫系の刺激、抗 体産生、または抗体の作製もしくは試験。当業者は、先に列挙した任意の特性に適した試 験を容易に認識するであろう。 【０４５１】 本発明の細胞および細胞株ならびに／または本発明の対応したパネルを特徴づけるため に用いられ得る試験には以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸分析、Ｄ ＮＡ配列決定、タンパク質配列決定、ＮＭＲ、タンパク質輸送についての試験、核細胞質 20 間輸送についての試験、タンパク質の細胞内局在についての試験、核酸の細胞内局在につ いての試験、顕微鏡分析、超顕微鏡分析、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、レー ザー切除技術、細胞計数、および透析。当業者は、先に列挙した任意の試験の使用方法を 理解するであろう。 【０４５２】 細胞または細胞株の回収物またはパネルが、例えば、薬剤スクリーニングのために作製 される場合、回収物またはパネルにおける細胞または細胞株は、それらが、１つ以上の選 択的な生理学的特性に関して同じ（実質的に同じを含む。）であるよう対応し得る。この 文脈における「同じ生理学的特性」とは、選択された生理学的特性が、回収物またはパネ ルにおけるメンバー間で十分類似しており、それにより細胞の回収物またはパネルが、薬 30 剤スクリーニングアッセイにおいて信頼できる結果を生じることができ；例えば、薬剤ス クリーニングアッセイの読み出しにおける変動は、例えば、細胞における固有の変動によ るよりもむしろ、タンパク質の異なる形態を発現する細胞に及ぼす試験化合物の異なる生 物学的活性によるであろう。例えば、細胞または細胞株は、同じ増殖速度、すなわち、１ 、２、３、４、または５時間以下の差を有する増殖速度を細胞の回収物またはパネルのメ ンバーのうちで有するよう対応し得る。いくつかの実施態様において、このことは、例え ば、増殖速度によって細胞を５、６、７、８、９、または１０個のグループへと分け入れ ること、および同じかまたは異なる分けた群からの細胞を用いてパネルを作製することに よって達成され得る。いくつかの実施態様において、細胞は、１１、１２、１３、１４、 １５、１６、１７、１８、１９、または２０の群へと増殖速度によって分け入れることが 40 できる。いくつかの実施態様において、細胞は、少なくとも２０、２５、３０、３５、４ ０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００個超の群へと増殖速度 によって分け入れることができる。いくつかの実施態様において、細胞株のパネルは、そ れらの増殖速度に基づいて同じ群へと分け入れた細胞株を含むことができる。いくつかの 実施態様において、細胞株のパネルは、その増殖速度に基づいて異なる群へと分け入れた 細胞株を含むことができる。細胞の増殖速度を決定する方法は、当技術分野で周知である 。パネルにおける細胞または細胞株はまた、同じＺ’因子（例えば、０．１超ほどには異 ならないＺ’因子）、タンパク質発現レベル（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、 ２５％、または３０％超ほどには異ならないＣＦＴＲ発現レベル）、ＲＮＡ発現レベル、 組織培養表面への接着、およびこれらに類するものを有するよう対応することができる。 50 (140) JP 2012-516687 A 2012.7.26 対応した細胞および細胞株は、同一の条件下で増殖することができ、例えば、自動並行処 理によって選択された生理学的特性を維持するために達成することができる。いくつかの 実施態様において、本発明の細胞または細胞株は、増殖速度を含むがそれに限定されない 細胞または細胞株の生理学的特性に基づいた群へと分け入れることができる。いくつかの 実施態様において、細胞または細胞株の対応したパネルは、増殖速度を含むがそれに限定 されない細胞の少なくとも１つの生理学的特性によってグループ分けされた１つ以上のビ ンの細胞または細胞株を含むことができる。 【０４５３】 一実施態様において、パネルは、同じセットの条件下で増殖速度について対応している 。このようなパネルは、本明細書で対応したパネルとも呼ばれており、２つ以上の細胞株 10 にわたる実験変数の効果を比較することが望ましい広範な細胞ベースの研究において使用 するのに非常に望ましい。増殖速度に対応した細胞株は、ウェルあたりの大まかに同じ細 胞数を経時的に維持し、それによりパネルにおける細胞株間の栄養物質含有量などの増殖 条件における変動を減少させる。 【０４５４】 本発明によると、対応したパネルは、細胞の特徴、パネルの意図した使用、パネルのサ イズ、培養条件、およびこれらに類するものを含めた多くの因子によって、任意の所望の 範囲内に増殖速度を有し得る。このような因子は、当業者によって容易に認められるであ ろう。 【０４５５】 20 増殖速度は、任意の適切かつ簡便な手段によって決定され得、唯一の必要条件は、対応 したパネルについての細胞株のすべてについての増殖速度が同じ手段によって決定される ことである。増殖速度を決定するための数多くの手段は、本明細書に説明されるように公 知である。 【０４５６】 本発明の対応したパネルは、任意の数のクローン細胞株を含むことができる。パネルに おける最大数のクローン細胞株は、各使用およびユーザーについて異なるであろうし、維 持できるだけ多くであることができる。種々の実施態様において、パネルは、２、３、４ 、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのクローン細胞株、例えば、少なくと も１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくと 30 も３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも４８、少なくと も５０、少なくとも７５、少なくとも９６、少なくとも１００、少なくとも２００、少な くとも３００、少なくとも３８４、少なくとも４００、またはそれより多くのクローン細 胞株を含み得る。いくつかの実施態様において、対応したパネルは、少なくとも１００、 １５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、３５０、５００、５５０、６００、 ６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１，０００のクローン細胞株 を含み得る。他の実施態様において、対応したパネルは、少なくとも１，１００、１，２ ５０、１，５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７ ，０００、８，０００、９，０００、または１０，０００のクローン細胞株を含み得る。 他の実施態様において、対応したパネルは、少なくとも１１ ，０００、１５，０００、 40 ２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，００ ０、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または １００，０００のクローン細胞株を含み得る。他の実施態様において、対応したパネルは 、少なくとも１００，０００、１５０，０００、２００，０００、３００，０００、４０ ０，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９０ ０，０００、または１ ，０００，０００のクローン細胞株、または１，０００，０００ 超のクローン細胞株を含み得る。さらに他の実施態様において、対応したパネルは、少な くとも１，０００のクローン細胞株を含み得る。 【０４５７】 本発明によると、パネルは、複数のクローン細胞株、すなわち、異なる単一の親細胞か 50 (141) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ら作製された複数の細胞株を含む。いくつかの実施態様において、細胞株のパネルにおけ る複数の細胞株は、同じ種類である。いくつかの実施態様において、細胞株のパネルにお ける複数の細胞株は、少なくとも２つの異なる種類である。任意の所望の細胞種類は、対 応したパネルの作製において用いられ得る。パネルは、同じ細胞種類すべての細胞株また は異なる細胞種類の細胞株を含むことができる。 【０４５８】 パネルにおけるクローン細胞株は、関心対象の１つ以上のタンパク質を安定して発現す る。安定した発現は、パネルの望ましい使用に適しているが最小の任意の長さの時間であ ることができ、対応したパネルにおける選択および使用を可能にするのに十分長い。 【０４５９】 10 対応したパネルにおけるクローン細胞株は、関心対象の同じ１つ以上のタンパク質をす べて発現し得、またはパネルにおけるいくつかのクローン細胞株は、関心対象の異なるタ ンパク質を発現し得る。 【０４６０】 いくつかの実施態様において、対応したパネルは、関心対象の異なるタンパク質を発現 する１つ以上のクローン細胞株を含む。すなわち、関心対象の望まれるだけ多くの異なる タンパク質について、パネルにおける第一のクローン細胞株は、関心対象の第一のタンパ ク質を発現し得、パネルにおける第二のクローン細胞株は、関心対象の第二のタンパク質 を発現し得、第三の細胞株は、関心対象の第三のタンパク質を発現し得るなどである。関 心対象の異なるタンパク質は、異なるアイソフォーム、対立遺伝子バリアント、スプライ 20 スバリアント、または突然変異した（突然変異したもしくは切断型の配列を含むがこれら に限定されない。）、異なるサブユニットの化学量論、異なるサブユニット組み立て、異 なって折りたたまれた形態、異なって活性化する形態、異なる機能性を有する形態、異な る結合特性を有する形態、異なるアクセサリー因子と関連した形態、異なる細胞背景にお いて発現した形態、異なる細胞の遺伝的背景において発現した形態、異なる内在性発現特 性を有する細胞において発現した形態、異なって局在した形態、修飾された形態、キメラ 、または修飾された形態、酵素で修飾された形態、翻訳後修飾された形態、グリコシル化 した形態、タンパク質分解された形態を含めて化学的に、あるいは関心対象のタンパク質 のそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施態様において、異なるタンパク質は、 苦味受容体のパネルまたはキナーゼのパネルなど、タンパク質の機能的に規定された群の 30 メンバーであることができる。いくつかの実施態様において、異なるタンパク質は、同じ かまたは相互関連するシグナル伝達経路の一部であり得る。ヘテロ多量体タンパク質（ヘ テロ二量体を含む。）を包含するなおも他のパネルにおいて、パネルは、サブユニットの ２つ以上の異なる組み合わせからサブユニットのすべての起こり得る組み合わせまでを含 み得る。組み合わせは、サブユニット配列バリアント、サブユニットアイソフォーム組み 合わせ、サブユニットの種間組み合わせ、およびサブユニットの種類の組み合わせを含み 得る。 【０４６１】 例として、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体は典型的に、２つのαサブユニット、２ つのβサブユニット、および１つのγサブユニットを含む。６つのαアイソフォーム、５ 40 つのβアイソフォーム、４つのγアイソフォーム、ならびに１つのδ、１つのπ、１つの θ、および１つのεサブユニットがある。本発明は、α、β、γ、δ、π、ε、およびθ サブユニットのあらゆる考えられ得る組み合わせを含むパネルを含めたこれらの任意のサ ブユニットの２つ以上の組み合わせを含むパネルを熟慮する。さらに、ＧＡＢＡ受容体フ ァミリーにはまた、ＧＡＢＡＢおよびＧＡＢＡＣ受容体も含む。本発明はまた、ＧＡＢＡ Ａ、ＧＡＢＡＢ、およびＧＡＢＡＣサブユニットの任意の組み合わせを含むパネルも熟慮 する。いくつかの実施態様において、このようなパネルは、ヒトＧＡＢＡサブユニットを 含む。他の実施態様において、哺乳類ＧＡＢＡ受容体パネルは、非ヒト霊長類（例えば、 カニクイザル）ＧＡＢＡ受容体、マウス、ラット、もしくはヒトＧＡＢＡ受容体パネル、 またはこれらの組み合わせを含み得る。 50 (142) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０４６２】 さらなる例において、本発明は、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）上皮ナトリウ ムチャネル（ＥＮａＣ）、マウス、ラット、もしくはヒトＥＮａＣパネル、またはこれら の混合物などの任意の哺乳類ＥＮａＣパネルを含めた１つ以上のＥＮａＣパネルを熟慮す る。ＧＡＢＡ受容体のように、未処置のＥＮａＣは複数のサブユニット：αまたはδ、β 、およびγを含む。本発明は、ＥＮａＣサブユニットの少なくとも２つの異なる組み合わ せを有するパネルを熟慮し、また、異なる種由来のサブユニットの組み合わせ、アイソフ ォーム、対立遺伝子バリアント、一塩基多型、キメラサブユニット、修飾されたおよび／ もしくは非天然のアミノ酸ならびに酵素的に修飾されたサブユニットなど化学的に修飾さ れた形態の組み合わせを含めたＥＮａＣサブユニットのすべての考えられ得る組み合わせ 10 も熟慮する。本発明はまた、そのすべての内容が全体として引用により組み込まれている 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／３１９３６に説明された任意のＥＮａＣを含むパネルも熟慮 する。 【０４６３】 さらなる特定の実施態様において、表１０に列挙された未変性の（タグのない）機能的 苦味受容体を発現する細胞株を含む２５の苦味受容体の対応したパネルがある。いくつか の実施態様において、パネルは増殖速度について対応している。いくつかの実施態様にお いて、パネルは、増殖速度および関心対象の追加的な生理学的特性に対応している。いく つかの実施態様において、パネルにおける細胞株は、並行して生じ、および／または並行 してスクリーニングされる。 20 【０４６４】 パネルおよびその使用に関するさらなる典型だが制限のない例は以下である：例えば、 芳香の特性または修飾因子の発見に対する匂い受容体（昆虫、イヌ、ヒト、トコジラミ） のパネル；試験ペプチドに融合した遺伝子を発現させて、すなわち抗体、モノクローナル 抗体、もしくは非タンパク質薬を含めたタンパク質などのカーゴを内部移行するよう作用 するペプチドを見出す細胞のパネル（カーゴは、ＧＦＰまたはＡＰなどのリポーターであ り得る）。本実施態様に関連して、このパネルの細胞由来の上清は、内部移行の評価のた めに他の細胞に添加され得る。このような実施態様において、パネルは、異なる細胞種類 を含んで、細胞種類特異的送達を評価し得る。異なる抗体またはモノクローナル抗体重鎖 ／軽鎖の組み合わせを発現して、活性抗体またはモノクローナル抗体を同定する細胞株の 30 パネルがある。また、抗体パネルは、抗体またはモノクローナル抗体の一連の誘導体化し たバージョンを提供し、血清における安定性、結合親和性、およびこれらに類するものな どの改良された特徴を有するものを同定し得る。さらに別のパネルは、異なるＧタンパク 質など種々のシグナル分子の存在下で標的タンパク質を発現するよう使用され得る。なお も別の種類のパネルを用いて、改良された活性／安定性のために標的タンパク質のバリア ントを試験し得る。パネルは、一塩基多型（ＳＮＰ）または他の突然変異した形態の標的 タンパク質を含んで、サブセットの、多くの、またはすべての形態に採用する修飾因子を 選択し得る。他のパネルを用いて、（ＧＡＢＡＡまたは他の中枢神経系イオンチャネルな どの）タンパク質のファミリーまたはタンパク質のアイソフォームに及ぼす試験化合物の 活性のパターンを規定し得る。次に、異なって作用する化合物をさらなる研究において用 40 いて、対応するサブユニットの組み合わせの機能／役割／局在をインビボで決定し得る。 試験化合物は、外来で失敗した公知の修飾因子、または有害な非特異的効果を有する修飾 因子であり、このような効果と相関し得るサブユニットの組み合わせを決定し得る。なお も他のパネルを、複数の標的サブタイプにおける化合物の活性の信頼できる評価のための 並行したスクリーニングのために高処理スクリーニング形で用いて、所望の標的で活性が ありかつ最小の非特異的効果を有する化合物を発見する上で助け得る。 【０４６５】 パネルは、タンパク質の任意の所望の群を発現するよう操作された細胞を含むことがで き、すべてのこのようなパネルは、本発明によって熟慮される。 【０４６６】 50 (143) JP 2012-516687 A 2012.7.26 パネルは、ＲＮＡの任意の所望の群を発現するよう操作された細胞を含むことができ、 すべてのこのようなパネルは、本発明によって熟慮される。 【０４６７】 いくつかの実施態様において、本発明は、パネルが、異なる匂い受容体を各々発現する 複数の細胞または細胞株を含む細胞または細胞株のパネルを提供する。これらの匂い受容 体パネルを用いて、関心対象の化合物または組成物の匂い活性特性を生じることができる 。化合物または組成物の匂い活性特性とは、複数の匂い受容体の活性に及ぼす化合物また は組成物の効果を指す。関心対象の化合物または組成物の匂い活性特性を生じるために、 化合物または組成物は、異なる匂い受容体を各々発現する複数の細胞または細胞株と接触 している。 10 【０４６８】 いくつかの実施態様において、匂い受容体細胞パネルを用いて、化合物または組成物の 匂い活性特性を修飾、亢進、または低下させる化合物を同定する。別の化合物または組成 物の匂い活性特性を修飾、亢進、または低下させると同定された化合物は、他の化合物ま たは組成物の嗅覚効果を修飾、亢進、または低下させると予測される。 【０４６９】 いくつかの実施態様において、匂い受容体細胞パネルを用いて、関心対象の化合物また は組成物と類似の匂い活性特性を有する化合物を同定する。関心対象の化合物または組成 物と類似の匂い活性特性を有すると同定された化合物は、他の化合物または組成物と類似 の嗅覚効果、すなわち、類似のまたは同一の匂いを有すると予測される。匂い活性特性は 20 、下記に説明されるとおり比較することができる。 【０４７０】 有用な匂い受容体には、表１０∼１２に説明された嗅覚受容体が挙げられるが、これら に限定されない。ある実施態様において、匂い受容体は、クラスＩヒト嗅覚受容体、もし くはクラスＩＩヒト嗅覚受容体、またはそれらの組み合わせである。本発明の匂い受容体 パネルは、異なる匂い受容体を各々発現する少なくとも２、５、１０、２５、５０、７５ 、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、または少なくとも ２５００の異なる細胞または細胞株を有することができる。異なる匂い受容体は、異なる 種または同じ種であり得る。ある実施態様において、本発明の細胞、パネル、および方法 を用いた使用のための匂い受容体は、偽遺伝子によってコードされ得る。 30 【０４７１】 匂い受容体に及ぼす関心対象の化合物または組成物の活性は、当業者に公知の任意の技 術によって測定することができる。匂い受容体の活性に及ぼす関心対象の化合物または組 成物の効果を測定するためのアッセイには、以下が挙げられるが、これらに限定されない ：細胞ベースのアッセイ、蛍光細胞ベースのアッセイ、撮像アッセイ、カルシウムフラッ クスアッセイ、膜電位アッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイ、蛍光発生的 アッセイ、および先の組み合わせ。本発明の方法とともに使用されるべき任意のアッセイ は、高処理量フォーマットで実施することができる。 【０４７２】 本明細書で開示された任意の細胞または細胞株を用いて、本発明に従った匂い受容体パ 40 ネルを作製することができる。いくつかの実施態様において、匂い受容体パネルの作製の ための宿主細胞は、匂い受容体の機能的発現が望ましいシグナル伝達タンパク質因子また は他のタンパク質因子を内在的に発現するよう試験および検証された細胞であり得る。Ｒ Ｔ−ＰＣＲを含む試験および遺伝子チップ分析を含むマイクロアレイ法による細胞のＲＮ Ａまたはタンパク質の特徴付けを用いて、このような細胞を同定し得る。 【０４７３】 いくつかの実施態様において、本発明の細胞パネルは、複数の細胞または細胞株を含み 、この中で、各細胞または細胞株を操作して、１つ以上の昆虫匂い受容体を発現する。結 果として生じる細胞パネルを細胞ベースのアッセイにおいて用いて、匂い物質を特徴付け 、ハイスループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）のために匂い受容体修飾因子を同定す 50 (144) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ることができる。 【０４７４】 いくつかの実施態様において、、細胞または細胞株のパネルは、１つの種（例えば、１ 種の蚊）由来のすべてのまたはサブセットの匂い受容体を含む。細胞または細胞株のパネ ルは、少なくとも２つの異なる昆虫種由来の少なくとも１つの匂い受容体を含み得る。蚊 、ゴキブリ、カブトムシ、トコジラミ、ガ、チョウ、ハエ、アリ、コオロギ、ミツバチ、 スズメバチ、ショウジョウバエ、マダニ、シラミ、生殖器ジラミ（ｇｅｎｉｔａｌ ｌｉ ｃｅ）、サソリ、ヤスデ、ムカデ、バッタ、カマキリ、およびクモが挙げられるがこれら に限定されない、ヒトまたは動物の疾患を伝染させる昆虫、作物を悩ましまたは農業的損 傷もしくは植物に対する損傷を生じる昆虫を含めた任意の昆虫種由来の昆虫匂い受容体が 10 用いられ得る。嗅覚受容体としてタンパク質を同定するための普遍的な方法は、公知の嗅 覚受容体との配列比較に基づいている。いくつかの実施態様において、また、細胞ベース のアッセイを用いて、匂い受容体としての役割を決定するために、公知の揮発性物質また は匂い物質化合物に対する膜糖化タンパク質の応答性について試験し得る。 【０４７５】 昆虫を引きつけまたは駆除する化合物および抽出物を含めた物質は、応答性受容体また は活性が試験物質によって修飾される受容体を同定するために、本明細書に提供されたパ ネルに対して試験することができる。物質は、例えば、植物、花卉、食品（例えば、チー ズ）、動物、煙、廃棄物、分泌物、汗（ヒトの汗、例えば、男性の汗または女性の汗を含 む。）、産業製品、天然および合成の化学物質および生物学的調製物から回収され得る。 20 物質は、すべての試験された受容体における化合物の活性の特性を同定するために、サブ セットのまたはすべての匂い物質受容体細胞株に対して試験し得る。匂い物質受容体細胞 株に対する物質の試験から結果として生じる活性のパターンを用いて、「フィンガープリ ント」を特徴づけたり、診断薬として機能したりし得る。 【０４７６】 ハイスループットスクリーニングを用いて、類似の、増大した、または低下した活性を 有する他の物質を同定するために、物質に対して応答すると同定された昆虫匂い物質受容 体を含む細胞株またはパネルをスクリーニングし得る。ハイスループットスクリーニング を用いて、物質の存在下で受容体の活性を修飾、遮断、または増強する化合物を同定する よう物質に対して応答する昆虫匂い物質受容体を含む細胞株またはパネルをスクリーニン 30 グし得る。ハイスループットスクリーニングを用いて、物質の存在下で受容体の応答また は活性を結果として生じる化合物を同定するために、物質に対して応答しない匂い物質受 容体を含む細胞株またはパネルをスクリーニングし得る。 【０４７７】 いくつかの実施態様において、本発明の方法を用いて、昆虫匂い物質受容体に及ぼす公 知の物質（例えば、公知の化合物）と類似の活性を有する化合物または化合物の混合物を 同定する。より具体的な実施態様において、本発明の方法を用いて、ディートおよび／ま たは他の昆虫忌避物質および誘引物質の匂い物質受容体活性を模倣する化合物を同定する 。ある実施態様において、本発明の方法を用いて、昆虫忌避物質として使用することので きる化合物を同定する。ある実施態様において、昆虫忌避物質として同定された化合物は 40 、環境、ヒト、動物、および／または作物に対して揮発性でありかつ非毒性である。ある 実施態様において、ある実施態様において、本発明の方法を用いて、昆虫誘引物質として 使用することのできる化合物を同定する。ある実施態様において、昆虫誘引物質として同 定された化合物は、揮発性化合物であり、環境、ヒト、動物、および／または作物に対し て非毒性である。このような昆虫誘引物質は昆虫の捕捉において使用することができる。 ある実施態様において、昆虫誘引物質または忌避物質は、特定の昆虫種に対して特異的で あることができる。 【０４７８】 具体的な実施態様において、本発明の方法を用いて、１つ以上の匂い物質受容体に及ぼ す特定の物質の活性を遮断する化合物または化合物の混合物を同定する。より具体的な実 50 (145) JP 2012-516687 A 2012.7.26 施態様において、本方法を用いて、汗、ヒトもしくは動物の分泌物もしくはその構成要素 または二酸化炭素に対する受容体応答を遮断する化合物を同定する。 【０４７９】 いくつかの実施態様において、本発明の方法を用いて、１つ以上の匂い物質受容体に及 ぼす特定の物質（例えば、特定の化合物）、例えば、昆虫を引きつけまたは駆除する化合 物野活性を増強させる１つまたは混合物の化合物を同定する。 【０４８０】 いくつかの実施態様において、本発明の方法を用いて、１つ以上の匂い物質受容体に及 ぼす特定の物質（例えば、特定の化合物）の活性を変化させる１つまたは混合物の化合物 を同定する。他の実施態様において、本発明の方法を用いて、少なくとも２つの化合物の 10 組み合わせを同定することができ、この中で、組み合わさった場合にのみ少なくとも２つ の化合物が匂い物質受容体を活性化させ、およびこの中で、少なくとも２つの化合物の各 々は、匂い物質受容体を個々に活性化させない。受容体は、昆虫忌避物質または昆虫誘引 物質を検出する受容体であることができる。 【０４８１】 いくつかの実施態様において、本発明の方法を用いて、男性および／もしくは女性から 得たヒト汗試料およびこれらの画分、またはこれらから単離された化合物の匂い活性特性 を生じて、応答性受容体を同定し、このデータを、例えば、１つ以上の昆虫種に対する同 じ物質の試験についての結果を含む他のデータと相関づけて、昆虫の反発または誘引相関 する活性または化合物を同定する。 20 【０４８２】 いくつかの実施態様において、本発明の方法を用いて、少なくとも２つの試料の匂い物 質活性特性を試験および比較する。具体的な実施態様において、試料は、異なる植物；異 なる種の植物もしくは動物、または異なる花卉から得られた揮発性物質であることができ る。次に、異なる試料の匂い物質活性特性を比較して、応答性受容体（例えば、異なる試 料によって活性が影響される応答性受容体）を同定する。応答性受容体は、試料の化学組 成についての指標である。比較されている試料の匂い物質活性特性の類似性は、異なる試 料の化学的類似性についての測定結果である。 【０４８３】 いくつかの実施態様において、化合物の少なくとも１つを無効にし得る有望な昆虫の適 30 応もしくは進化に対処するための組み合わせたもしくは連続した使用、または導入のため に、本発明の方法を用いて、類似の活性を有する多くの化学的に異なった化合物を同定す る。 【０４８４】 １つ以上のヒト匂い物質受容体を各々含む細胞株のパネルは、細胞ベースのアッセイに おいて使用するために、および匂い物質受容体修飾因子を同定するためのハイスループッ トスクリーニングのために作製して匂い物質を特徴付けることができる。 【０４８５】 香り（ｓｃｅｎｔ）、匂い（ｏｄｏｒ）、芳香（ａｒｏｍａ）、または香気（ｆｒａｇ ｒａｎｃｅ）を有する化合物および抽出物を含めた物質は、ヒト匂い物質受容体のパネル 40 に対して試験され、応答性受容体、または活性が試験物質によって修飾された受容体を同 定することができる。化合物または混合物は、植物、花卉、食品、動物、紙巻きタバコ、 タバコ、トリュフ、麝香、バニラ、ミント、廃棄物、分泌物、汗（ヒトの汗、例えば、男 性の汗または女性の汗を含む。）産業製品、天然ならびに合成の化学物質ならびに疾患お よび腫瘍を含めた生物学的調製物から回収することができる。化合物は、ヒト匂い物質受 容体細胞株のサブセットまたはすべてに対して試験され、すべての試験された受容体に対 して化合物の活性の特性を同定し得る。ヒト匂い物質受容体細胞株に対する物質の試験か ら結果として生じる活性のパターンを用いて、「フィンガープリント」を特徴付け得、診 断薬として機能し得る。 【０４８６】 50 (146) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ハイスループットスクリーニングを用いて、物質に対して応答するよう同定されたヒト 匂い物質受容体を含む細胞株またはパネルをスクリーニングして、類似の、増大した、ま たは低下した活性を有する他の物質を同定し得る。ハイスループットスクリーニングを用 いて、物質の存在下で受容体の活性を修飾、遮断、または増強する化合物を同定するため に物質に対して応答するヒト匂い物質受容体を含む細胞株をスクリーニングし得る。ハイ スループットスクリーニングを用いて、物質の存在下で受容体の応答または活性を結果的 に生じる化合物を同定するために、物質に対して応答しないヒト匂い物質受容体を含む細 胞株をスクリーニングし得る。 【０４８７】 匂い物質受容体パネルの実例となる使用には以下が含まれる： 10 公知の物質として、１つ以上の匂い物質受容体に及ぼす類似の活性を有する化合物、例 えば麝香の活性を模倣することのできる合成化合物の１つ以上を同定すること。 １つ以上の匂い物質受容体に及ぼす公知の物質の活性を遮断する化合物、例えば、悪臭 のある物質（ヒトまたは動物の排泄物）を遮断する化合物の１つまたは混合物を同定する こと。 １つ以上の匂い物質受容体に及ぼす公知の物質の活性を増強する化合物、例えば、バラ の香りまたはステーキの芳香を模倣する化合物の１つまたは混合物を同定すること。 １つ以上の匂い物質受容体に及ぼす公知の物質の活性を変化させる化合物、例えば、タ バコの煙などの物質の存在下で悪臭を検出する受容体の活性化を結果として生じる、この 効果を通常は生じ得ない化合物の１つまたは混合物を同定すること。 20 １つ以上の匂い物質受容体に及ぼす公知の物質の活性を変化させる化合物、例えば、望 ましい香りに対応する受容体ではない他の受容体を通常活性化し得る悪臭のある物質など の物資いつの存在下で望ましい香りを検出する受容体の活性化を結果として生じる化合物 の１つまたは混合物を同定すること。 男性および女性から得られたヒト汗試料およびこれらの画分、またはこれらから単離さ れた化合物を特徴付けして、応答性受容体を同定し、このデータを例えばヒト心理物理的 研究を含めた他のデータと相関づけて、認知された悪臭または誘引と相関する活性または 化合物を同定すること。 比較することのできる１セットの試料を試験して（例えば、異なる種のバラから得られ た香気、または異なる花卉から得られた香気、または１つの物質の画分）、これらの香気 30 に応答する共通のまたは固有の受容体を同定すること。 【０４８８】 本明細書で説明された細胞、パネル、および方法は、以下を含むがこれらに限定されな い他の種に由来する匂い物質受容体に適用され得る：ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、 ネコ、ラット、有袋類、マウス、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、およびハム スターからなる群から選択される哺乳類種；またはハマダラカ属（ガンビアハマダラカお よびすべての蚊の亜種）、ヤブカ属（ネッタイシマカおよびすべての亜種）、イエカ属お よびヤブカ属の蚊を含む蚊、ブユ属、ブユ、サシチョウバエ、スナバエ、アブ属、アブ類 、メクラアブ属、メクラアブ、ツェツェバエ属、ツェツェバエ、ノミ目、ノミ、ネズミノ ミ属、ヨーロッパネズミノミ属、カメムシ目、サシガメ属およびロドニウス属（オオサシ 40 ガメ）、シラミ亜目、シラミ、ヒトジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｉｓ）、シ ラミ類、ブユ、ツツガムシ類、メブヨ（Ｅｙｅ Ｇｎａｔｓ）、サシバエ、メクラアブお よびアブ類、アブラムシ、渡りバッタ、トウモロコシウンカ（Ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｈ ｏｐｐｅｒ）、アザミウマ、ハエ、鱗翅類、線形動物、アブラムシ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ ）、鞘翅目、ダニ、シロアリ、チャバネゴキブリを含めたゴキブリ、アリ、アブラムシ科 、触角の短いバッタ、カメムシ目（Ｆｕｌｇｏｒｏｍｏｒｐｈａ）、ハゴロモ上科、アザ ミウマ科、クダアザミウマ科、ハマキガ科、ヤガ科、ツトガ科、ヤガ科、コナガ科、メイ ガ科、シストセンチュウ科、コナジラミ科、ハムシ科、ゴミムシダマシ科、ゾウムシ上科 、コクゾウムシ（ｇｒａｉｎ ｗｅｅｖｉｌ）、グラナリアコクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈ ｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ）、ココクゾウムシ（ｒｉｃｅ ｗｅｅｖｉｌ）、ココク 50 (147) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ゾウ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アルファルファコクゾウムシ（ａｌｆａ ｌｆａ ｗｅｅｖｉｌ）、アルファルファタコゾウムシ、エンドウマメにいる種子ゾウム シ、マメ種子にいるエンドウゾウムシ、インゲンゾウムシ（Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄ ｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、ハダニ科、ミゾガシラシロアリ科、レイビシロアリ科、チャ バネゴキブリ科、アリ科、カブトムシおよびトコジラミ、ならびにガからなる群から選択 される昆虫種。 【０４８９】 関心対象の化合物の匂い物質活性、目印匂い物質活性特性は、匂い物質活性特性間の類 似性の測定結果を計算することなどだがこれに限定されない匂い物質活性特性間の相関の 計算を通じて比較され得る。目印匂い物質活性特性は、データベースにおける１群の匂い 10 物質活性特性のうちの１つであり得る。目印匂い物質活性特性は歴史的特性であり得る。 関心対象の化合物の匂い物質活性特性は、パネルにおける２つ以上の匂い物質受容体の活 性に及ぼす化合物の効果を表す測定された量を含むことができる。各目印匂い活性特性は 、パネルにおける２つ以上の匂い物質受容体の活性に及ぼす個々の化合物の効果を表す測 定された量を含む。 【０４９０】 いくつかの実施態様において、目印匂い物質活性特性に相当する各個々の化合物は、公 知の匂いと関連付けることができる。すなわち、パネルにおける２つ以上の匂い物質受容 体の活性に及ぼす個々の化合物の効果の測定された量は、公知の匂いと関連付けることの できる目印転写特性を生じるよう組み立てられることができる。目印匂い物質活性特性の 20 データベースは、コンピュータ可読記憶媒体に保存することができる。具体的な実施態様 において、データベースは、少なくとも１０の目印匂い物質活性特性、少なくとも５０の 目印匂い物質活性特性、少なくとも１００の目印匂い物質活性特性、少なくとも５００の 目印匂い物質活性特性、少なくとも１，０００の目印匂い物質活性特性、少なくとも１０ ，０００の目印匂い物質活性特性、または少なくとも５０，０００の目印匂い物質活性特 性を含んでおり、各目印匂い物質活性特性は、少なくとも２、少なくとも１０、少なくと も１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２ ０００、少なくとも２５００、少なくとも７５００、少なくとも１０，０００、少なくと も２０，０００、少なくとも２５，０００、または少なくとも３５，０００の構成要素の 測定された量を含んでいる。前述の実施態様において、関心対象の化合物の匂い物質活性 30 特性は、複数の目印匂い物質活性特性と比較して、関心対象の化合物の匂い物質活性特性 と相関している１つ以上の目印匂い物質活性特性を決定することができ、関心対象の化合 物は、これら１つ以上の目印匂い物質活性特性に相当する個々の化合物と関連した公知の 匂いを有すると特徴付けることができる。 【０４９１】 他の実施形態において、関心対象の化合物は、公知の匂いと関連付けることができる。 前述の実施形態において、関心対象の化合物の匂い物質活性特性は、関心対象の化合物の 匂い物質活性特性と相関する（例えばほぼ類似する）１つ以上の目印匂い物質活性特性を 決定するために複数の目印匂い物質活性特性と比較することができ、これら１つ以上の目 印匂い物質活性特性に対応する個々の化合物は、関心対象の化合物と関連した公知の匂い 40 を有するものとして特徴づけることができる。 【０４９２】 ある実施態様において、関心対象の化合物の匂い物質活性特性と、データベースに保存 された複数の目印匂い物質活性特性の各目印匂い物質活性特性の間の相関を計算すること ができる。相関は、パネルにおける２つ以上の匂い物質受容体の選択の活性に及ぼす関心 対象の化合物の効果を表す関心対象の化合物の匂い物質活性特性における測定された量を 、パネルにおける２つ以上の匂い物質受容体の同じ選択の活性に及ぼす異なる化合物の効 果を表す目印匂い物質活性特性における相当する測定された量と比較することによって計 算することができる。関心対象の化合物の匂い物質活性特性は、目印匂い物質活性特性に おける測定された量が、関心対象の化合物の匂い物質活性特性における測定された量の約 50 (148) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ２％、約５％、約８％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％ 、または約３５％内である場合、目印匂い物質活性特性と相関するように思える。 【０４９３】 関心対象の化合物の匂い物質アッセイ特性は、関心対象の化合物の匂い物質活性特性と 目印匂い物質活性特性の間の類似性の測定結果が、あらかじめ決めておいた閾値を上回る 場合、目印匂い物質活性特性と最も類似しているように思える。具体的な実施態様におい て、あらかじめ決めておいた閾値は、目印匂い物質活性特性における測定された量が、関 心対象の化合物の匂い物質活性特性における測定された量の約２％、約５％、約８％、約 １０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または薬３５％内である ことを示す類似性の測定結果の値として決定することができる。 10 【０４９４】 いくつかの実施態様において、関心対象の化合物の匂い物質活性特性は、ベクトルｐと して表すことができる。 【数１】 【０４９５】 式中、ｐｉは、ｉ番目の構成要素の測定された量、例えば、パネルにおける与えられた 匂い物質受容体のｉ番目の生物学的活性に及ぼす関心対象の化合物の効果である。具体的 な実施態様において、ｎは、２超、１０超、１００超、２００超、５００超、１０００超 、２０００超、２５００超、７５００超、１０，０００超、２０，０００超、２５，００ 20 ０超、または３５，０００超である。また、各目印匂い物質活性特性は、ベクトルｐとし て表すことができる。相関を計算する上で、関心対象の化合物について匂い物質活性特性 を表すベクトルにおけるｉ番目の構成要素の測定された量は、各構成要素ｉ＝１…ｎにつ いて目印匂い物質活性特性を表すベクトルのｉ番目の構成要素の相当する測定された量と 比較することができる。 【０４９６】 相関は、関心対象の化合物の匂い物質活性特性と目印匂い物質活性特性の間の相関があ るかどうかを同定するために、２つのデータセットが、本発明の方法に従って使用され得 る確率を決定するために、当技術分野における任意の統計方法を用いて計算され得る。例 えば、関心対象の化合物の匂い物質活性特性（ｐｉ１）と各目印匂い物質活性特性（ｐｉ 30 ２）の間の相関は、類似性計量ｓｉｍ（ｐｉ１， ｐｉ２）を用いて計算することができ る。類似性計量ｓｉｍ（ｐｉ１， ｐｉ２）を計算する１つの方法は、ユークリッド距離 の負の平方を計算することである。代替的な実施態様において、ユークリッド距離以外の 計量は、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクトル間の角度、相関距離、標準化さ れたユークリッド距離、マハラノビス距離、平方ピアソン相関係数、またはミンコフスキ ー距離など、ｓｉｍ（ｐｉ１， ｐｉ２）を計算するのに使用することができる。いくつ かの実施態様において、ピアソン相関係数、平方ユークリッド距離、ユークリッド平方和 、または平方ピアソン相関係数を用いて類似性を決定する。このような計量は、例えば、 ＳＡＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｅ， Ｃａｒｙ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）またはＳ−Ｐｌｕｓ（Ｓｔａｔｉｓ 40 ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ）を用いて計算することができる。このような計量の使用は、Ｄｒａｇｈｉｃｉ， ２ ００３， Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒ ｒａｙｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ， 第１１章において説明されており、このような目的のために、そのすべての内容は全体と して引用により本明細書に組み込まれている。 【０４９７】 また、相関は、順位に基づいて計算することもでき、式中、ｘｉおよびｙｉは、昇べき の順または降べきの順で測定された量の値の順位である。例えば、Ｃｏｎｏｖｅｒ， Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２ｎｄ ｅ 50 (149) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｄ．， Ｗｉｌｅｙ， （１９７１）を参照されたい。また、Ｓｈａｎｎｏｎの相互情報 量は、類似性の測定として使用することができる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ， Ａｎ Ｉｎ ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ： Ｓｙｍｂｏｌ ｓ， Ｓｉｇｎａｌｓ， ａｎｄ Ｎｏｉｓｅ， Ｄｏｖｅｒ， （１９８０）を参照さ れたく、そのすべての内容は全体として引用による本明細書に組み込まれている。 【０４９８】 当技術分野で公知の種々の分類指標は、本出願において説明された方法に従ってトレー ニングすることができ、匂いを有するものとして関心対象の化合物を分類するのに使用す ることができる。アルゴリズムは、関心対象の化合物の匂い物質活性特性を用いて関心対 象の化合物の匂いを予測することのできる分類指標を生じるのに使用することができる。 10 【０４９９】 いくつかの実施態様において、分類指標は、既に特徴づけられた化合物の目印匂い物質 活性特性における測定された量および既に特徴づけられた化合物と関連した公知の匂いを 用いて化合物を匂いに分類するようトレーニングすることができる。目印匂い物質活性特 性に相当する各個々の化合物は、公知の匂いと関連付けることができる。分類指標は、既 に特徴づけられた化合物の目印匂い物質活性特性における測定された量および既に特徴づ けられた化合物と関連した公知の匂いを評価するために、目的変数なしの（ｎｏｎ−ｓｕ ｐｅｒｖｉｓｅｄ）または目的変数ありの（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）学習アルゴリズムを 適用することによる分類に用いられるアルゴリズムであり得る。関心対象の化合物の匂い 物質活性特性は、関心対象の化合物を匂いとして分類するために分類指標を用いて処理す 20 ることができる。すなわち、分類指標は、クラスをトレーニングするために用いられる複 数の目印匂い物質活性特性と関連した公知の匂いの１つ以上を有するものとして関心対象 の化合物を分類するために使用することができる。 【０５００】 いくつかの実施態様において、関心対象の化合物は、公知の匂いと関連付けることがで きる。前述の実施態様において、分類指標は、関心対象の化合物の匂い物質活性特性に基 づいて関心対象の化合物の公知の匂いと関連付けることのできる１つ以上の目印匂い物質 活性特性を同定するためにトレーニングすることができる。分類指標は、個々の化合物の 目印匂い物質活性特性における測定された量を比較するために、および関心対象の化合物 の匂い物質活性特性に基づいた関心対象の化合物の公知の匂いと関連づけることのできる 30 １つ以上の目印匂い物質活性特性を同定するために、目的変数なしのまたは目的変数あり のアルゴリズムを適用することによる分類に用いられるアルゴリズムであり得る。 【０５０１】 当技術分野で公知の任意の標準的な目的変数なしのまたは目的変数ありの学習技術は、 分類指標を生じるために使用することができる。下記は、当技術分野で公知の目的変数な しのおよび目的変数ありのアルゴリズムに関する制限のない例である。本出願における開 示を考慮すると、当業者は、他のパターン分類または回帰の技術およびアルゴリズムが分 類指標に用いられ得ることを認識するであろうし、本発明は、すべてのこのような技術を 包含する。 【０５０２】 40 ニューラルネットワーク。いくつかの実施態様において、分類指標は、ニューラルネッ トワークを用いることで学習される。ニューラルネットワークは、２段階回帰または分類 決定則である。ニューラルネットワークは、出力ユニットの層に重みの層によって接続さ れた入力ユニットの層（およびバイアス）を含む層状構造を有する。回帰のために、出力 ユニットの層には典型的に、たった１つの出力ユニットを含む。しかしながら、ニューラ ルネットワークは、継ぎ目のない様式で複数の定量的応答を取り扱うことができる。 【０５０３】 多層ニューラルネットワークには、入力ユニット（入力層）、隠れユニット（隠れ層） 、および出力ユニット（出力層）がある。さらに、入力ユニット以外の各ユニットに接続 された単一のバイアスユニットがある。ニューラルネットワークは、Ｄｕｄａ ｅｔ ａ 50 (150) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｌ．， ２００１ ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎ ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＨａｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎ ｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅ ｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに説明されており、それらの各々の内容は全体として引用 により本明細書に組み込まれている。また、ニューラルネットワークは、Ｄｒａｇｈｉｃ ｉ， ２００３， Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｍｉｃ ｒｏａｒｒａｙｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ／ＣＲＣ；および Ｍｏｕｎｔ， ２００１ ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｏ ｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ 10 ｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにも 説明されており、それらの各々の内容は全体として引用により本明細書に組み込まれてい る。下記に論議されているものは、ニューラルネットワークのいくつかの典型的な形態で ある。 【０５０４】 ニューラルネットワークの使用への基礎的なアプローチは、トレーニングされていない ネットワークで開始し、入力層に対してトレーニングパターンを呈し、ネットを通じて信 号を通過させ、出力層において出力を決定することである。これらの出力は次に、標的値 と比較され；任意の差は誤差に相当する。分類のために、この誤差は、２乗誤差またはク ロスエントロピー（偏差）のいずれかであることができる。例えば、Ｈａｓｔｉｅ ｅｔ 20 ａｌ．， ２００１ ， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照さ れたく、そのすべての内容は全体として引用により本明細書に組み込まれている。 【０５０５】 ３つの普遍的に使用されるトレーニングプロトコルは、確率的、バッチ、およびオンラ インである。確率的トレーニングにおいて、パターンは、トレーニングセットから無作為 に選択され、ネットワーク重みは各パターン提示について更新される。確率的逆伝播法な どの勾配降下法によってトレーニングされた多層非直線性ネットワークは、ネットワーク トポロジーによって規定された分類指標における重み値の最大尤度概算を実行する。バッ チトレーニングにおいて、すべてのパターンは、学習が生じる前にネットワークに提示さ 30 れる。典型的には、バッチトレーニングにおいて、いくつかの通過がトレーニングデータ を通じてなされる。オンライントレーニングにおいて、各パターンは１回提示され、１回 のみネットに提示される。 【０５０６】 ３層ネットワークの使用における再発する問題は、ネットワークにおける使用に対する 隠れユニットの最適数である。３層ネットワークの入力および出力の数は、解決されるべ き問題によって決定される。本発明において、与えられたニューラルネットワークについ ての入力数は、Ｙから選択されたバイオマーカーの数に等しいであろう。ニューラルネッ トワークについての出力数は、典型的にはちょうど１であろう。あまりにも多くの隠れユ ニットがニューラルネットワークにおいて使用される場合、ネットワークは、あまりにも 40 多くの程度の自由を有するであろうし、あまりにも長くトレーニングされる場合、ネット ワークがデータを過剰適合する（ｏｖｅｒｆｉｔ）であろう。隠れユニットがあまりにも 少ない場合、トレーニングセットは学習できない。しかしながら、一般的にいえば、あま りにも少ないことよりも、あまりにも多くの隠れユニットを有することの方がよい。あま りにも少ない隠れユニットを有すると、分類指標は、日付における非直線性を捕捉するの に十分な柔軟性を有し得ず；あまりにも多くの隠れユニットを有すると、下記に説明され るように、適切な正則化（ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）または枝刈り（ｐｒｕｎｉｎ ｇ）が用いられる場合、余分な重みは、０に縮むことができる。典型的な実施態様におい て、隠れユニットの数は、５∼１００の範囲のどこかにあり、数は、入力数およびトレー ニングケースの数とともに増大する。 50 (151) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０５０７】 クラスター化。いくつかの実施態様において、分類指標は、クラスタリングを用いて学 習される。いくつかの実施態様において、目印匂い物質活性特性を表すベクトルの選択構 成要素ｉを用いて、匂い物質活性特性をクラスター化する。いくつかの実施態様において 、クラスター化の前に、測定された量を標準化して、０の平均値およびユニット分散を有 する。 【０５０８】 トレーニング集団にわたる測定された量の類似のパターンを呈する目印匂い物質活性特 性は、互いにクラスター化する傾向にあるであろう。構成要素ｉの測定された量の特定の 組み合わせは、ベクトルが、特定の公知の匂いについてクラスターを形成する場合、本発 10 明の本態様において良好な分類指標であると考えることができる。例えば、Ｄｕｄａ ａ ｎｄ Ｈａｒｔ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｅｎ ｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， １９７３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ． ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（以後、「Ｄｕｄａ １９７３」）の２１１∼２５６ページを参照 されたく、そのすべての内容が全体として引用により本明細書により組み込まれる。Ｄｕ ｄａ １９７３の第６．７章に説明されるように、クラスター化問題は、データセットに おける自然なグループ分けを見出すことの１つとして説明されている。自然なグループ分 けを同定するために、２つの問題に対処する。第一に、２つの匂い物質活性特性間の類似 性（または相違点）を測定する方法が決定される。この計量（類似性計量）を用いて、１ つのクラスターにおける匂い物質活性特性が、他の匂い物質活性特性よりも互いにより類 20 似していることを確認する。第二に、類似性測定結果を用いてデータをクラスターに区画 化する機構が決定される。 【０５０９】 類似性の測定は、Ｄｕｄａ １９７３の第６．７章において論議されており、そこでは 、クラスター化の研究を始める１つの方法は、距離関数を規定すること、および匂い物質 活性特性の対間の距離のマトリックスを計算することであると記載されている。距離が類 似性の良好な測定結果である場合、同じクラスターにおける匂い物質活性特性間の距離は 、異なるクラスターにおける匂い物質活性特性間の距離よりも有意に短いであろう。しか しながら、Ｄｕｄａ １９７３の２１５ページに記載されているように、クラスター化は 、距離計量の使用を必要としない。例えば、非計量的類似性関数ｓ（ｘ，ｘ’）は、２つ 30 のベクトルｘおよびｘ’を比較するために使用することができる。従来、ｓ（ｘ，ｘ’） は、ｘおよびｘ’がいくぶん「類似している」場合、値が大きな対称性関数である。非計 量的類似性関数ｓ（ｘ，ｘ’）はの一例は、Ｄｕｄａ １９７３の２１６ページに提供さ れている。 【０５１０】 一旦、データセットにおける地点間で「類似性」または「相違点」を測定するための方 法が選択されると、クラスター化は、データの任意の区画のクラスター化の質を測定する 目安関数を必要とする。目安関数を極度化する（ｅｘｔｒｅｍｉｚｅ）データセットの区 画を用いて、データをクラスター化する。例えば、Ｄｕｄａ １９７３の２１７ページを 参照されたい。目安関数は、Ｄｕｄａ １９７３の第６．８章において論議されている。 40 より最近では、Ｄｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋが刊行されている。５３７∼５６３ページではクラスター化を詳細に 説明している。クラスター化技術に関する追加的な情報は、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｒ ｏｕｓｓｅｅｕｗ， １９９０， Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｄａｔａ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｗｉｌ ｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；Ｅｖｅｒｉｔｔ， １９９３， Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ （３ｄ ｅｄ．）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；お よびＢａｃｋｅｒ， １９９５， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｓｏｎ ｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， 50 (152) JP 2012-516687 A 2012.7.26 Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙにおいて認められるこ とができる。本発明において用いることのできる特定の典型的なクラスター化技術には、 階層性クラスター化（最近傍アルゴリズム、最遠傍（ｆａｒｔｈｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏ ｒ）アルゴリズム、平均連結アルゴリズム、）、ｋ平均クラスター化、ファジーｋ平均ク ラスター化アルゴリズム、およびＪａｒｖｉｓ−Ｐａｔｒｉｃｋクラスター化が挙げられ るが、これらに限定されない。 【０５１１】 主成分分析。いくつかの実施態様において、分類指標は、主成分分析を用いて学習され る。主成分分析は、データを、データの特徴を要約する新たなセットの変数に変換するこ と（主成分分析）によって、データセットの次元性を低下させる古典的な技術である。例 10 えば、Ｊｏｌｌｉｆｆｅ， １９８６， Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａ ｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたく、そのすべて の内容が全体として引用による本明細書に組み込まれている。主成分分析はまた、Ｄｒａ ｇｈｉｃｉ， ２００３， Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ／ＣＲＣにおいて説明され ており、そのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。以下は 、主成分分析に関する制限のない例である。 【０５１２】 主成分（ＰＣ）は、相関しておらず、ｋ番目のＰＣが、ＰＣ間のｋ番目の最大の変数を 有するよう順位づけられている。ｋ番目のＰＣは、第一のｋ−１ＰＣに直交するようデー 20 タ地点の投影の変数を最大化する方向として解釈することができる。第一の数個のＰＣは 、データセットにおける変数のほとんどを捕捉する。対照的に、最後の数個のＰＣはしば しば、データにおける残留「ノイズ」のみを捕捉するよう仮定される。 【０５１３】 ＰＣＡを用いて分類指標を学習することに対する１つのアプローチにおいて、目印匂い 物質活性特性を表すベクトルは、先にクラスター化することについて説明された同じ様式 で構築することができる。実際、各ベクトルが目印匂い物質活性特性を表すベクトルのセ ットは、マトリックスとして見ることができる。いくつかの実施態様において、このマト リックスは、単量体の定性的二進法説明のＦｒｅｅ−Ｗｉｌｓｏｎ法において表され（Ｋ ｕｂｉｎｙｉ， １９９０， ３Ｄ ＱＳＡＲ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ｔｈｅ 30 ｏｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐ ｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ ５８９−６３８、引用により本明細書に組み込まれ ている。）、ＰＣＡを用いて最大に圧縮された空間に分配され、それにより第一の主成分 （ＰＣ）が、起こり得る分散情報の最大量を捕捉し、第二の主成分（ＰＣ）が、すべての 分散情報の第二の最大量を捕捉するなどであり、それは、マトリックスにおけるすべての 分散情報が考慮されるまで生じる。 【０５１４】 次に、各ベクトルが（目印匂い物質活性特性などの）トレーニング集団のメンバーを表 すベクトルの各々がプロットされる。多くの異なる種類のプロットが可能である。いくつ かの実施態様において、１次元プロットがなされる。この１次元プロットにおいて、トレ 40 ーニング集団のメンバーの各々からの第一の主成分についての値がプロットされる。この 形態のプロットにおいて、期待値は、匂いに相当する匂い物質活性特性が、第一の主成分 値の１つの範囲にクラスター化するであろうこと、および別の匂いに相当する特性が、第 一の主成分値の第二の範囲にクラスター化するであろうことである。 【０５１５】 いくつかの実施態様において、トレーニング集団のメンバーは、２つ以上の主成分に対 してプロットされる。例えば、いくつかの実施態様において、トレーニング集団のメンバ ーは、第一の次元が第一の主成分であり、かつ第二の次元が第二の主成分である２次元プ ロット上にプロットされる。 【０５１６】 50 (153) JP 2012-516687 A 2012.7.26 最近傍分析。いくつかの実施態様において、分類指標は、最近傍分析を用いて学習され る。最近傍分類指標は、メモリーベースであり、適合すべき分類指標を必要としない。質 問地点ｘ０を考慮すると、ｘ０に距離において最も近いｋ個のトレーニング地点ｘ（ｒ） 、ｒ、…、ｋが同定され、次に、地点ｘ０は、ｋ個の最近傍を用いて分類される。連結は 無作為に破壊することができる。いくつかの実施態様において、特徴空間におけるユーク リッド距離を用いて、以下の通り距離を決定する： 【数２】 【０５１７】 10 典型的には、最近傍アルゴリズムを使用する場合、線形判別を計算するのに用いられる Ｙからの数度（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）データは、平均０および分散１を有するよう標準化 される。本発明において、トレーニング集団のメンバーは、トレーニングセットおよび試 験セットに無作為に分割される。例えば、一実施態様において、トレーニング集団のメン バーの２／３は、トレーニングセットに配置され、トレーニング集団のメンバーの１／３ は、試験セットに配置される。ベクトル構成要素ｉの選択組み合わせは、試験セットのメ ンバーがプロットされる特徴空間を表す。次に、試験セットのメンバーを正確に特徴づけ るトレーニングセットの能力が計算される。いくつかの実施態様において、最近傍計算が 、ベクトル構成要素ｉの所与の組み合わせについて数回実施される。計算の各反復におい て、トレーニング集団のメンバーは、トレーニングセットおよび試験セットに無作為に割 20 り当てられる。 【０５１８】 最近傍則は、等しくないクラスの事前状態、差動誤分類コスト、および特徴選択の問題 を取り扱うよう改良することができる。これらの改良の多くは、近傍についての重みを与 えられた提案のいくつかの形態を包含する。例えば、Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌ ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１ ， Ｊｏｈ ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ；およびＨａｓｔｉｅ， ２００１ ， Ｔｈ ｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたく、これらの各々は、そのすべての内容が全 体として引用により本明細書に組み込まれている。 30 【０５１９】 線形判別分析。いくつかの実施態様において、分類指標は、線形判別分析を用いて学習 される。線形判別分析（ＬＤＡ）は、ある対象の特性に基づいて２つのカテゴリーのうち の１つに対象を分類するよう試行する。言い換えれば、ＬＤＡは、実験において測定され た対象の属性が、対象のカテゴリー化を予測するかどうかを試験する。ＬＤＡは典型的に は、連続的な独立変数および二又絶対的従属変数（ｄｉｃｈｏｔｏｍｏｕｓ ｃａｔｅｇ ｏｒｉｃａｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）を必要とする。本発明において 、トレーニング集団のサブセットにわたるベクトル構成要素ｉの選択組み合わせについて の数度値は、必要な連続的な独立変数として機能する。トレーニング集団のメンバーの各 々の形質サブグループ分類（例えば、匂い）は、二又絶対的従属変数として機能する。 40 【０５２０】 ＬＤＡは、グループ化情報を用いることによって群間分散と群内分散の比を最大化うｓ る分散の線形組み合わせを探索する。暗に、ＬＤＡによって用いられる線形重みは、トレ ーニングセットにわたるベクトル構成要素ｉの測定された量が、匂いの群においてどのよ うに分離しているかによる。いくつかの実施態様において、ＬＤＡは、トレーニング集団 におけるメンバーのデータマトリックスに適用される。次に、トレーニング集団の各メン バーの線形判別がプロットされる。理想的には、匂いを表すトレーニング集団の該メンバ ーは、線形判別値の１つの範囲（例えば、負の値）へクラスター化するであろうし、別の 匂いを表すトレーニング集団の該メンバーは、線形判別値の第二の範囲（例えば、正の値 ）へとクラスター化するであろう。ＬＤＡは、判別値のクラスター間の分離がより大きな 50 (154) JP 2012-516687 A 2012.7.26 場合、より成功していると考えられる。線形判別分析に関するさらなる情報については、 例えば、Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１ ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ； およびＨａｓｔｉｅ， ２００１ ， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓ ｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＶｅ ｎａｂｌｅｓ ＆ Ｒｉｐｌｅｙ， １９９７， Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔ ａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ ｓ−ｐｌｕｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ を参照されたく、それらの各々は全体として引用により本明細書に組み込まれている。 【０５２１】 二次判別分析。いくつかの実施態様において、分類指標は、二次判別分析を用いて学習 10 される。二次判別分析（ＱＤＡ）は、同じ入力パラメータを取り、ＬＤＡと同じ結果を戻 す。ＱＤＡは、線形式よりもむしろ二次式を用いて結果を生じる。ＬＤＡおよびＱＤＡは 相互変換可能であり、いずれを使用するかは、優先性の問題および／または分析を支持す るソフトウェアの利用可能性である。ロジスティック回帰分析は、同じ入力パラメータを 取り、ＬＤＡおよびＱＤＡと同じ結果を戻す。 【０５２２】 サポートベクターマシン。いくつかの実施態様において、分類指標は、サポートベクタ ーマシンを用いて学習される。ＳＶＭは、例えば、Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ ａｎｄ Ｓ ｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ， ２０００， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｕ ｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ 20 ｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ；Ｂｏｓｅｒ ｅｔ ａｉ， １９９２， "Ａ ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｍａｒｇｉｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ，" Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ５ｔｈ Ａｎ ｎｕａｌ ＡＣＭ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｒｎ ｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ， ＡＣＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ， ｐ ｐ． １４２−１５２；Ｖａｐｎｉｋ， １９９８， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａ ｒｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｍｏｕｎｔ， ２００ １ ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｄｕｄ 30 ａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏ ｎ， ２００１ ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．；およびＨａｓ ｔｉｅ， ２００１ ， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＦｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６， ９０６−９１４に説 明されており、これらの各々は全体として引用により本明細書に組み込まれている。 【０５２３】 分類に使用する場合、ＳＶＭは、データから最大に離れているハイパー平面を用いて、 所与のセットの二進法標識したデータトレーニングデータを分離する。線形分離が可能で ない場合については、ＳＶＭは、「カーネル」の技術と組み合わせて作用することができ 40 、該技術は、特徴空間への非線形マッピングを自動的に実現させる。特徴空間におけるＳ ＶＭによって認められたハイパー平面は、入力空間における非線形決定境界に相当する。 サポートベクターマシンに関するさらなる情報については、例えば、Ｆｕｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６， ９０６−９１４ページ を参照されたく、これは引用により本明細書に組み込まれている。 【０５２４】 決定ツリー。一実施態様において、分類指標は、決定ツリーである。決定ツリーは、一 般的にＤｕｄａ， ２００１ ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３ ９５−３９６に説明されており、これは引用により本明細書に組み込まれている。用いる 50 (155) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ことのできる１つの具体的アなる互リズムは分類および回帰ツリー（ＣＡＲＴ）である。 他の具体的なアルゴリズムには、ＩＤ３、Ｃ４．５、ＭＡＲＴ、およびＲａｎｄｏｍ Ｆ ｏｒｅｓｔｓ． ＣＡＲＴ、ＩＤ３、およびＣ４．５が挙げられるが、これらに限定され ず、各々、Ｄｕｄａ， ２００１ ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３９６−４０８およびｐｐ． ４１１ − ４１２に説明されており、これは、そのす べての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。また、ＣＡＲＴ、ＭＡ ＲＴ、およびＣ４．５は、Ｈａｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｔｈｅ Ｅｌ ｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 第９章に説明されており、これはそのすべての 10 内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。ランダムフォレスツ（Ｒａｎ ｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ）技術は、Ｂｒｅｉｍａｎ， １９９９， "Ｒａｎｄｏｍ Ｆ ｏｒｅｓｔｓ − Ｒａｎｄｏｍ Ｆｅａｔｕｒｅｓ，" Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐ ｏｒｔ ５６７， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９９に説明されており、これはそのすべての内容が全体として引用により本明細書に 組み込まれている。 【０５２５】 各分岐が、相当するベクトル構成要素ｉまたはベクトル構成要素ｉの相対的な測定され た量についての測定された量に基づいている一変量決定ツリーに加えて、分類指標は、多 20 変量決定ツリーであることができる。このような多変量決定ツリーにおいて、決定のいく つかまたはすべては、複数のベクトル構成要素ｉについて測定された量の線形組み合わせ を実際に含む。多変量決定ツリーは、Ｄｕｄａ， ２００１ ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌ ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ ｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ４０８−４０９に説明されており、そのすべての内容は全体 として引用により本明細書に組み込まれている。 【０５２６】 多変量適応性回帰スプライン。対での確率関数ｇｐｑ（Ｘ， Ｗｐｑ）を学習するのに 使用することのできる別のアプローチは、多変量適応性回帰スプライン（ＭＡＲＳ）を用 いる。ＭＡＲＳは、回帰のための適応性手順であり、本発明によって対照される高次元の 30 問題に充分に適している。ＭＡＲＳは、段階的な線形回帰の一般化、または回帰設定にお けるＣＡＲＴの性能を改良するためのＣＡＲＴ法の改変として見ることができる。ＭＡＲ Ｓは、Ｈａｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２８３−２９５に説明されており、そのすべての内容は全 体として引用により本明細書に組み込まれている。 【０５２７】 重心分類技術。一実施態様において、最も近い重心の分類技術を用いる。このような技 術は、異なる匂いについて、トレーニング集団におけるベクトル構成要素ｉの平均測定量 によって与えられる重心を計算し（目印匂い物質活性特性）、次に、関心対象の化合物を 40 表すベクトルを、重心の最も近いクラスに割り当てる。このアプローチは、ｋ平均クラス ター化と類似しているが、例外は、クラスターが公知のクラスによって置き換えられるこ とである。このアプローチの一例となる実行は、マイクロアレイの予測分析、またはＰＡ Ｍである。例えば、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｐｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ ９９； ６５６７−６５７２を参照されたく、これはそのすべての内容が全体 として引用により本明細書に組み込まれている。 【０５２８】 回帰。いくつかの実施態様において、分類指標は、ロジスティック回帰分類指標などの 回帰分類指標である。このような回帰分類指標には、分類指標を構築するのに用いられる 50 (156) JP 2012-516687 A 2012.7.26 匂い物質活性特性の各々についての係数が含まれる。このような実施態様において、回帰 分類指標についての係数は、例えば最大尤度アプローチを用いて計算される。このような 計算において、ベクトル構成要素ｉの測定された量が用いられる。 【０５２９】 他の方法。いくつかの実施態様において、分類指標は、ｋ最近傍（ｋ−ＮＮ）、人工ニ ューラルネットワーク（ＡＮＮ）、パラメトリック一次方程式、パラメトリック二次方程 式、単純ベイズ分析、線形判別分析、決定ツリー、または放射基底関数を用いて学習され る。 【０５３０】 本発明のいくつかの実施態様は、図１に示されるプログラムモジュールの任意のものま 10 たはすべてを含むコンピュータプログラム産物を提供する。プログラムモジュールの態様 は、下記にさらに説明される。 【０５３１】 いくつかの実施態様において、本発明は、生物製剤、例えば分泌型タンパク質を発現す る細胞もしくは細胞株または細胞もしくは細胞株のパネルを提供する。分泌型タンパク質 には、抗体およびその活性断片、例えば、重鎖および軽鎖を含む抗体、一本鎖抗体、免疫 系において活性を有するタンパク質、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭタ ンパク質もしくはその活性断片、酵素、凝固因子、またはホルモン、またはこれらの任意 の者の断片に相当するタンパク質が挙げられ得る。生物製剤およびその商品名の例には、 以下が挙げられるが、これらに限定されない：カナキヌマブ（イラリス）、アボボツリヌ 20 ムトキシン（Ａｂｏｂｏｔｕｌｉｎｕｍｔｏｘｉｎ）Ａ（ディスポート（Ｄｙｓｐｏｒｔ ））、ゴリムマブ（シンポニー（Ｓｉｍｐｏｎｉ））、ロミプロスチム（ＮＰＬＡＴＥ） 、セルトリズマブペゴール（シムジア）、リロナセプト（アーカライスト（Ａｒｃａｌｙ ｓｔ））、メトキシポリエチレングリコール−エポエチンベータ（ミルセラ（Ｍｉｒｃｅ ｒａ））、エクリズマブ（ソリリス）、パニツムマブ（ベクティビックス）、イデュルス ルファーゼ（エラプラーゼ）、ラニビズマブ（ルセンティス）、アルグルコシダーゼアル ファ（ミオザイム）、アバタセプト（オレンシア）、ガルスルファーゼ（ナグラザイム） 、パリフェルミン（ケピバンス）、ナタリズマブ（タイサブリ）、ベバシズマブ（アバス チン）、セツキシマブ（エルビタックス）、ノフェツモマブ（ベルルマ（Ｖｅｒｌｕｍａ ））、カプロマブペンデチド（ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ）、エポエチンアルファ（プロク 30 リット、エポゲン（Ｅｐｏｇｅｎ））、ファノレソマブテクネチウム（ＮｅｕｔｒｏＳｐ ｅｃ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ−Ｓｃａｎ）、ダルベポエチンアルファ（アラネスプ（ Ａｒａｎｅｓｐ））、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、イブリツモマブチウキセタン（ゼ ヴァリン）、リツキシマブ（リツキサン）、アルデスロイキン（プロロイキン（Ｐｒｏｌ ｅｕｋｉｎ））、デニロイキンジフチトクス（オンタック（Ｏｎｔａｋ）、ペグアスパル ガーゼ（オンキャスパー（Ｏｎｃａｓｐａｒ））、フィルグラスチム（ニューポエン（Ｎ ｅｕｐｏｅｎ））、オプレルベキン（ニューメガ（Ｎｅｕｍｅｇａ））、ペグフィルグラ スチム（ヌエラスタ（（Ｎｕｅｌａｓｔａ））、サルグラモスチム（リューカイン（Ｌｅ ｕｋｉｎｅ））、パリフェルミン（ケピバンス）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、セ ツキシマブ（エルビタックス）、アスパラギナーゼ（エルスパー）、ラスブリカーゼ（エ 40 リテック）、アレムツズマブ（キャンパス）、トシツモマブ（ベキサール）、パリビズマ ブ（シナジス）、インターフェロンアルファ−２ａ（ロフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ）−Ａ ）、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ（ペグイントロン）、ペグインターフェロンア ルファ−２ａ（ペガシス）、インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロンＡ）、インタ ーフェロンアルファコン−１（インファーゲン（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ））、ペグインターフ ェロンアルファ−２（コパシスコペガス（Ｃｏｐａｓｙｓ Ｃｏｐｅｇｕｓ））、ダクリ ズマブ（ゼナパックス）、バシリキシマブ（シムレクト）、モロモナブ−ＣＤ３（オルト クローン、ＯＫＴ３）、インターフェロンガンマ−１ｂ（アクティミューン）、ドロトレ コギンアルファ−活性型（ザイグリス）、コラゲナーゼ（サンチル（Ｓａｎｔｙｌ））、 ベカプレルミン（レグラネクス）、エファリズマブ（ラプティバ）、アレファセプト（ア 50 (157) JP 2012-516687 A 2012.7.26 メビブ）、インターフェロンアルファ−ｎ３（アルフェロン（Ａｌｆｅｒｏｎ）Ｎ）、ガ ルスルファーゼ（ナグラザイム）、アガルシダーゼベータ（ファブラザイム）、ラロニダ ーゼ（アルドラザイム）、インフリキシマブ（レミケード）、アバタセプト（オレンシア ）、アナキンラ（キネレット（Ｋｉｎｅｒｅｔ））、アダリムマブ（ヒュミラ）、エタネ ルセプト（エンブレル）、オマリズマブ（ゾレア）、ドルナーゼアルファ（パルモザイム ）、ナタリズマブ（タイサブリ）、インターフェロンベータ−１−ａ（レビフ（Ｒｅｂｉ ｆ））、Ｂ型ボツリヌス毒素（マイオブロック（Ｍｙｏｂｌｏｃ））、Ａ型ボツリヌス毒 素（ボトックス）、インターフェロンベータ−１−ｂ（ベタフェロン）、インターフェロ ンベータ−１−ａ（アボネックス）、テネクテプラーゼ（ＴＮＫａｓｅ）、ストレプトキ ナーゼ（ストレプターゼ）、レテプラーゼ（レタバーゼ（Ｒｅｔａｖａｓｅ））、アブシ 10 キシマブ（レオプロ）、アルテプラーゼ（Ｃａｔｈｆｌｏ Ａｃｔｉｖａｓｅ、アクチバ ーゼ）、エポアルファ（ｅｐｏ ａｌｐｈａ）（アブシームド（Ａｂｓｅａｍｅｄ）、ビ ノクリット（Ｂｉｎｏｃｒｉｔ））、イズロン酸硫酸化酵素（エラプラーゼ）、インスリ ン（エクスベラ）、ＨＰＶワクチン（ガーダシル）、ペガプタニブ（マクジェン）、ヒト 酸性アルファグルコシダーゼ（ミオザイム）、ガルスルファーゼ（ナグラザイム）、ヒト 成長ホルモン（オムニトロープ（Ｏｍｎｉｔｒｏｐｅ））、副甲状腺ホルモン（プレオタ クト（Ｐｒｅｏｔａｃｔ））、ヒト成長ホルモン（バルトロピン（Ｖａｌｔｒｏｐｉｎ） ）、アンチトロンビン（ＡＴｒｙｎ）、ＨＰＶ 由来の主カプシドタンパク質Ｌ１（サー バリックス）、エリスロポエチンアルファ（エポエチンアルファヘキサル（ｈｅｘａｌ） ）、メカセルミンヒトＩＧＦ−１（インクレレックス（Ｉｎｃｒｅｌｅｘ））、メトキシ 20 ポリエチレングリコール−エポエチンベータ（ミルセラ）、フォリトロピンアルファ／ル トロピンアルファペルゴベリス（Ｐｅｒｇｏｖｅｒｉｓ）、エポエチンゼータ（）， （ レタクリット（Ｒｅｔａｃｒｉｔ）、サイラポ（Ｓｉｌａｐｏ）、リバビリンおよびイン ターフェロンアルファ−２ｂ（レベトロン（Ｒｅｂｅｔｒｏｎ）併用療法）、アルグルセ ラーゼ（セレデース（Ｃｅｒｅｄａｓｅ））、イミグルセラーゼ（セレザイム）、ヒトイ ンスリン（ヒューマリン、ノボリン）、ソマトロピン（ヒューマトロープ、ニュートロピ ン／ニュートロピンＡＱ）、セルモレリン（ジェレフ（Ｇｅｒｅｆ））、ソマトレム（プ ロトピン（Ｐｒｏｔｏｐｉｎ））、ヒトアルブミン（アルブテイン（Ａｌｂｕｔｅｉｎ） ）、およびゲムツズマブ（マイロターグ）。 【０５３２】 30 分泌型タンパク質の発現に最適な特性を有する細胞および細胞株は、公知のしけを用い て、以下を含むがそれらに限定されない任意の特性に関してクローンを特徴付けて選択さ れ得る：翻訳後のプロセシングまたは修飾、収量、％活性生成物、ある特性の安定性（例 えば、本明細書に説明されているように、しかし経時的に特性を試験することによる。） 、および化学量論（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはタンパク質分析）。 【０５３３】 分泌型タンパク質の翻訳後のプロセシングまたは修飾は、タンパク質配列決定、質量分 析、グリコシル化もしくはリン酸化について試験する方法、または分泌型タンパク質生成 物の具体的なもしくは所望の形態を結果として生じる細胞株および条件を選択するための 化学基もしくは残基の共有結合付加を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の試 40 験によって特徴づけられ得る。細胞および細胞株は、例えば、翻訳後のプロセシングもし くは修飾を触媒する酵素に相当する配列を導入することによって、またはこれらを内在的 に発現しもしくはこれらを発現するよう遺伝子活性化されたものについて選択するよう細 胞株を試験することによって、分泌型生成物の翻訳後のプロセシングもしくは修飾に影響 する１つ以上の因子を発現させるよう設計または選択され得る。 【０５３４】 分泌型生成物の最大の産生もしくは収量を有する細胞および細胞株は、分泌型タンパク 質産生レベルを評価する方法を用いて、例えば、ＥＬＩＳＡ法（例えば、抗体収量を評価 するためにＦＣ断片を検出するＥＬＩＳＡ）を用いて単離されたクローンを試験すること によって作製され得る。 50 (158) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０５３５】 分泌型生成物の総収量と比較した最大の％活性のある分泌型タンパク質を結果として生 じる細胞および細胞株は、タンパク質の活性もしくは結合を評価する方法を用いて、単離 されたクローンを試験することによって、例えば、活性アッセイ、機能的アッセイ、また は機能的細胞ベースのアッセイなどの結合アッセイ、結合エピトープを含む捕捉試薬を利 用するＥＬＩＳＡ、二次試験、動物研究、またはタンパク質の結合もしくは活性を測定す るために用いられる試験を用いることによって作製され得る。 【０５３６】 動物構成要素を含まない培地条件においておよび／または大規模な産生のためにリアク ターにおいて使用されるような懸濁条件において増殖のために追加的に最適化された細胞 10 株は、これらのおよび／または類似の条件下で細胞株作製に用いられる方法を操作するこ とによって、あるいはこれらの所望の条件下でクローンを試験して、所望の特性を有する 該細胞株を同定することによってのいずれかで作製することができる。いくつかの実施態 様において、細胞増殖を通常遅延させまたは妨害する細胞を選択する化合物を補充した培 地において増殖するのに追加的に最適化された細胞株は、同じ細胞種類のたいていの細胞 と比較して、これらの条件下で正常なまたは改良された増殖を呈する細胞を選択すること によって作製することができる。 【０５３７】 いくつかの実施態様において、本発明に従った関心対象のタンパク質を発現する細胞ま たは細胞株を用いて、関心対象のタンパク質を産生し得る。タンパク質産生に好ましいあ 20 る生理学的特性を有するようおよび／または１つ以上のタンパク質発現アクセサリー因子 を発現するよう操作された細胞を用いるタンパク質産生の方法が本明細書に包含される。 ある実施態様において、本明細書に説明されたように一貫してかつ再現可能に関心対象の タンパク質を（例えば、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少な くとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間少なくとも４ヶ月間、少なく とも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、および 少なくとも９ヶ月間から選択される期間）発現する細胞は、タンパク質産生のための改良 された環境を提供するようさらに修飾および／または選択される。ある実施態様において 、関心対象のタンパク質およびタンパク質発現アクセサリー因子を発現するよう操作され た細胞は、関心対象のタンパク質の産生に使用することができる。あるより具体的な実施 30 態様において、関心対象のタンパク質および／またはタンパク質発現アクセサリー因子は 、一貫してかつ再現可能に発現する。 【０５３８】 ある実施態様において、関心対象のタンパク質は、生物製剤、例えば、治療用途のため の抗体である。関心対象の任意のタンパク質またはその断片は、本明細書に説明された方 法に従って作製することができ、これには、膜タンパク質、膜貫通タンパク質、構造タン パク質、膜固定型タンパク質、細胞表面受容体、分泌型タンパク質、サイトゾルタンパク 質、ヘテロ多量体タンパク質、ホモ多量体タンパク質、二量体タンパク質、単量体タンパ ク質、翻訳後修飾型タンパク質、グリコシル化型タンパク質、リン酸化型タンパク質、お よびタンパク質分解プロセシング型タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。 40 このようなタンパク質の具体的な例には、抗体（ＦａｂおよびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ ｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、ならびにこれらの類するものなどの抗体断片、一本鎖抗 体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、重鎖、軽鎖、ならびにすべての抗体クラス、すなわ ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）、酵素、凝固因子、ホルモン、サイ トカイン、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ならびに輸送体が挙 げられるが、これらに限定されない。他の典型的な生物製剤には、先に開示されたものが 挙げられる。 【０５３９】 ある実施態様において、タンパク質産生に好ましい細胞は、基準細胞よりも関心対象の タンパク質を少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、 50 (159) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２５０％、５００％、ま たは少なくとも１０００％多く産生する。ある実施態様において、タンパク質産生に好ま しい細胞は、基準採用において発現される関心対象の同じタンパク質よりも少なくとも１ ％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、 ７０％、８０％、９０％、１００％、２５０％、５００％、または少なくとも１０００％ 高い活性を有する関心対象のタンパク質を産生する。活性とは、例えば関心対象のタンパ ク質の結合パートナーに対する酵素活性または結合活性または治療活性を指し得る。ある 実施態様において、タンパク質産生に好ましい細胞は、関心対象のタンパク質を産生し、 このなかで、関心対象のタンパク質を基準細胞と比較して少なくとも１％、２％、５％、 １０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、 10 ９０％、１００％、２５０％、５００％、または少なくとも１０００％多く産生する。あ る実施態様において、関心対象のタンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０ ％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％は、関心対象のタンパク質を遺伝 子操作なしで発現する細胞に関心対象のタンパク質が存在する細胞内区画に局在する。細 胞におけるタンパク質発現を評価するパラメータには、タンパク質収量、プロセシング、 修飾、細胞内の局在もしくは分泌、最適に折りたたまれた／加工された％総タンパク質の 定量化／分析が挙げられる。基準細胞は、関心対象のタンパク質を発現させる細胞が生じ た宿主細胞であり得る。本明細書に開示された任意の細胞を基準細胞として用いてよい。 【０５４０】 20 本明細書に提供された方法に従って産生されたタンパク質は、タンパク質配列決定、質 量分析、免疫細胞化学、グリコシル化および／またはリン酸化の程度または種類を分析す る方法、ならびに産生されるタンパク質への化学基および／または残基の共有結合付加を 決定するための方法を含む当技術分野で公知の方法を用いて特徴づけてもよい。 【０５４１】 タンパク質の最大の全体量を生じる細胞は、ＥＬＩＳＡなど、当技術分野で公知の方法 を用いて同定することができる。その上、タンパク質の総収量と比較して活性タンパク質 の最大％を結果として生じる細胞は、活性アッセイ、機能的アッセイ、結合アッセイ（例 えば、ＥＬＩＳＡ）、二次試験、動物研究、または細胞ベースのアッセイなど、タンパク 質の活性またはタンパク質の結合を検出するアッセイを用いて同定することができる。 30 【０５４２】 ある実施態様において、関心対象のタンパク質を発現する細胞におけるタンパク質発現 は、試験タンパク質を用いて試験され、この中で、試験タンパク質が、基準細胞よりも高 いレベルで発現する場合、同じ細胞における関心対象のタンパク質は、基準細胞と比較し てより高いレベルで発現すると予測される。試験タンパク質には、任意のタンパク質、膜 タンパク質、膜貫通タンパク質、膜固定型タンパク質、細胞表面受容体、分泌型タンパク 質、サイトゾルタンパク質、ヘテロ多量体タンパク質、ホモ多量体タンパク質、二量体タ ンパク質、単量体タンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、グリコシル化／リン酸化／ タンパク質分解プロセシングされたタンパク質、および先の任意の可能な組み合わせが挙 げられ得る。ある実施態様において、具体的な試験タンパク質には、抗体、イオンチャネ 40 ル、ＧＰＣＲ、輸送体が挙げられ得る。細胞は、たった１つまたは複数の試験タンパク質 であり得る。複数の試験タンパク質の場合、細胞は１つまたは複数の種類であり得る（例 えば、複数のＧＰＣＲのみ、またはＧＰＣＲ、イオンチャネル、および抗体）。 【０５４３】 タンパク質の産生に好ましい生理学的特性を有する細胞（例えば、増大した小胞体質量 を有する細胞）およびタンパク質の産生に最適化されよう操作された細胞（例えば、タン パク質産生に有益なタンパク質をコードする遺伝子の導入による。）は、当技術分野で公 知の方法、本明細書で説明された方法、またはそれらの組み合わせを用いて同定すること ができる。一旦このような細胞が同定されると、細胞は培養することができ、タンパク質 産生に有益なタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子を安定して発現する細胞株は、本 50 (160) JP 2012-516687 A 2012.7.26 明細書で説明された方法に従って作製することができる。このような細胞株は、導入遺伝 子の導入によって、またはタンパク質産生に好ましい細胞の選択の前もしくは後のいずれ かでの遺伝子活性化によって、関心対象のタンパク質を発現するよう操作することができ る。次に、関心対象のタンパク質を産生する細胞は、当技術分野で公知の方法および／ま たは本明細書で説明された方法を用いて同定することができる。 【０５４４】 タンパク質の産生に好ましい生理学的特性を有する細胞には、改良された生存率を有す る細胞；増大した細胞サイズ；内在的に発現したタンパク質の増大した産生；増大したミ トコンドリア活性；改良された安定性；選択された特性を維持する能力；タンパク質プロ セシングに関与する１つ以上の小器官の増大したサイズ（例えば、小胞体およびリボソー 10 ム）；ならびにタンパク質プロセシングに関与する１つ以上の小器官（例えば、リソソー ムおよびエンドソーム）の増大した含有量が挙げられるが、これらに限定されない。これ らの生理学的特性は、基準細胞に、または基準細胞についての履歴値（ｈｉｓｔｏｒｉｃ ａｌ ｖａｌｕｅ）に対して比較することができる。 【０５４５】 タンパク質の産生に適した生理学的特性を有する細胞は、蛍光標識したプローブについ ての標準的なアプローチと組み合わせたＦＡＣＳ分析を用いて同定することができる。特 に、ある生理学的特性についてのマーカーを用いて、タンパク質発現と関連する生理学的 特性を定量化し、該特性を基準細胞と比較する。このようなマーカーには、リボソーム、 ミトコンドリア、小胞体、粗面小胞体、ゴルジ装置、トランスゴルジ網、小胞、エンドソ 20 ーム、および形質膜など、タンパク質発現と関連している細胞構造を検出する分子が含ま れる。このようなマーカーは蛍光染色剤であることができる。例えば、ある細胞小器官の 活性、例えばミトコンドリアの活性は、蛍光代謝産物についてアッセイすることによって 評価され得る。小器官／区画の活性（例えば、ミトコンドリア活性、または（例えば、蛍 光レクチンを用いて検出することのできる）糖のタンパク質への組み込み）を報告する蛍 光代謝産物を使用することができる。タンパク質プロセシングに関与する１つ以上の細胞 小器官に特異的なタンパク質マーカーは、自己蛍光発光タンパク質タグ、例えば、緑色蛍 光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質として発現し得；ならびに膜タンパク質およ び／または分泌型タンパク質は、蛍光プローブを用いて標識され得る。内在的に発現した タンパク質に対するプローブ（例えば、抗体）は、細胞内小器官／区画の出力についての 30 マーカーとして使用され得る。具体的には、ヘテロ多量体膜タンパク質は、細胞における タンパク質発現活性の読み出しとして用いられ得る。 【０５４６】 理論によって結びつけられることなく、ＦＡＣＳによって測定されるような蛍光の増大 は、細胞が、タンパク質の産生に好ましい質を有することを示唆するであろうし、このよ うな細胞は、将来の用途のために単離され得る。これらの標準的な技術に加えて、本明細 書で説明された方法は、タンパク質の産生に好ましい生理学的特性を天然に有する細胞を 同定するために使用され得る。例えば、小胞体マーカー（例えば、ＥＲｐ２９、チトクロ ムＰ４５０、ＮＡＤＰＨ−チトクロムｃ還元酵素、カルレティキュリン）の標的配列と相 補的なシグナル伝達プローブは、本明細書で説明された方法に従って使用して、増大した 40 小胞体サイズを有する細胞を同定し得る。ＦＡＣＳによって測定されるように、高い程度 の蛍光を示す細胞は、増大した小胞体サイズおよび／または含有量を有しがちであろうし 、従って、タンパク質の産生に好ましい質を有するであろう。 【０５４７】 一実施態様において、タンパク質の産生に好ましい生理学的特性を有する細胞はが同定 され、その後、それを用いて、関心対象のタンパク質を産生するのに用いられる安定した 細胞株を開発する。別の実施態様において、細胞は、関心対象のタンパク質を発現するよ う操作された後、関心対象のタンパク質を発現する細胞を同定する。関心対象のタンパク 質を発現し、タンパク質の産生に好ましい生理学的特性を追加的に有する細胞が次に同定 される。このような細胞は次に、関心対象のタンパク質を産生する安定した細胞株を開発 50 (161) JP 2012-516687 A 2012.7.26 するのに用いられる。 【０５４８】 実例となる実施態様において、細胞は、関心対象のタンパク質をコードする核酸をトラ ンスフェクトされ；核酸の転写産物を検出できる蛍光発生オリゴヌクレオチドが細胞に導 入され；タンパク質発現と関連した生理学的特性のマーカーについての蛍光発生プローブ が、細胞へと導入され；関心対象のタンパク質を発現し、かつタンパク質発現と関連した 生理学的特性の増大したレベルを有する細胞が選択される。次に、関心対象のタンパク質 を発現する細胞株は、一貫してかつ再現可能に確立することができる。 【０５４９】 本明細書で提供されるタンパク質産生の方法において使用される細胞は、タンパク質発 10 現アクセサリー因子または２つ以上のタンパク質発現アクセサリー因子の組み合わせを発 現するよう操作され得る。ある実施態様において、細胞は、タンパク質発現アクセサリー 因子のスプライスバリアント、突然変異体、または断片を発現するよう操作される。ある 実施態様において、細胞は、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、 ５０、７５、１００、または１５０のタンパク質発現アクセサリー因子を発現するよう操 作される。実例となるタンパク質発現アクセサリー因子には以下が挙げられる：折りたた まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）を調節するタンパク質およびＵＰＲにおいて調節 されるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＡＴＦ６α（スプライス型））、ＩＲＥ １α、１ＲＥ１β、ＰＥＲＣΔＣ、ＡＴＦ４、ＹＹＩ、ＮＦ−ＹＡ、ＮＦ−ＹＢ、ＮＦ− ＹＣ、ＸＢＰ１（スプライス型）、ＥＤＥＭ１）；ＵＰＲによって誘導されるアポトーシ 20 ス経路をオフに切り替えるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＮＲＦ２、ＨＥＲＰ 、ＸＩＡＰ、ＧＡＤＤ３４、ＰＰＩα、ＰＰＩβ、ＰＰＩγ、ＤＮＡＪＣ３）；細胞の増 殖、細胞の生存率、細胞死、および細胞サイズに影響するタンパク質をコードする遺伝子 ；Ｂ細胞遺伝子（例えば、ＢＬＩＭＰ−１、ＸＢＰ１（スプライス型））、タンパク質輸 送に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＢＬＩＭＰ−１、ＸＢＰ１（スプ ライス型））；タンパク質輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｓｅ ｃ６１Ｐα、Ｓｅｃ６１Ｐβ、Ｓｅｃ６１Ｐγ）；グリコシル化に関与するタンパク質を コードする遺伝子（例えば、ＳＤＦ２−Ｌ）；酸化に関与するタンパク質をコードする遺 伝子（例えば、ＥＲＯ１α、ＥＲＯ１β）；抗アポトーシスタンパク質をコードする遺伝 子（例えば、Ｂｃｌ−２ｓｐ、Ｂｃｌ− ｘＬ、Ｂｉｍ ｔｒｕｎｋ． Ｍｕｔ．、Ｋｕ 30 ７０、１４−３−３ｑ ｍｕｔ．、ＶＤＡＣ２、ＢＡＰ３１ ｍｕｔ．）；小胞体関連分 解に関係するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、マンノシダーゼ１、ＨＲＤ１）； カルシウム輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＳＴＣ１、ＳＴＣ２ 、ＳＥＲＣＡ１、ＳＥＲＣＡ２、ＣＯＤ１）；脂質生合成／代謝に関係するタンパク質を コードする遺伝子（例えば、ＩＮＯ１、ＰＹＣ、ＳＲＥＢＰ１ΔＣ、ＳＲＥＢＰ２ΔＣ） ；ならびにタンパク質の折りたたみおよび分泌（例えば、ＣＲＴ（ＣａＢＰ３）、ＣＮＸ 、ＥＲｐ５７（ＰＤＩＡ３）、ＢｉＰ、ＢＡＰ、ＥＲｄｊ３、ＣａＢＰＩ、ＧＲＰ９４（ ＣａＢＰ４）、ＥＲｐ７２（ＰＤＩＡ４）、シクロフィリンＢ）、タンパク質の組み立て 、タンパク質の膜への組み込み、タンパク質の細胞表面提示、およびタンパク質の翻訳後 修飾に関係するタンパク質をコードする遺伝子。具体的な実施態様において、細胞は、Ｕ 40 ＰＲに関係する遺伝子の任意の１つまたは組み合わせを発現するよう操作される。別の具 体的な実施態様において、細胞は、ＵＰＲに関係する遺伝子の任意の１つまたは組み合わ せならびにタンパク質産生に有益であることが公知のタンパク質をコードする少なくとも １つの他の遺伝子を発現するよう操作される。ＵＰＲを調節するまたはＵＰＲにおいて調 節される遺伝子；細胞の増殖、生存率、アポトーシス、細胞死、細胞サイズを変化させる 遺伝子；タンパク質の折りたたみ、組み立て、膜への組み込み、細胞表面提示もしくは分 泌、グリコシル化／リン酸化／タンパク質分解を含めた翻訳後修飾に関係するシャペロン または因子をコードする遺伝子を用いることができる。ある実施態様において、タンパク 質発現アクセサリー因子は、細胞の生理学的特性を変化させる。 【０５５０】 50 (162) JP 2012-516687 A 2012.7.26 タンパク質産生に有益であることが公知のタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ または組み合わせを発現する細胞の同定は、本明細書で説明される方法を用いて達成する ことができ、例えば、関心対象の遺伝子／ｍＲＮＡにおける標的配列に結合するシグナル 伝達プローブが作製され得、次に、関心対象の遺伝子／ｍＲＮＡの存在がＦＡＣＳ分析に よって確認され得る。 【０５５１】 実例となる実施態様において、細胞は、関心対象のタンパク質をコードする第一の核酸 およびタンパク質発現アクセサリー因子をコードする第二の核酸をトランスフェクトされ ；第一の核酸の転写産物を検出できる蛍光発生オリゴヌクレオチドおよび第二の核酸の転 写産物を検出できる蛍光発生オリゴヌクレオチドが細胞に導入され；関心対象のタンパク 10 質およびタンパク質発現アクセサリー因子を発現する細胞が選択される。次に、関心対象 のタンパク質を一貫してかつ再現可能に発現する細胞株を確立することができる。細胞株 は、先に論議したように、タンパク質発現と関連した生理学的特性について試験すること ができる。 【０５５２】 一実施態様において、細胞はまず、タンパク質発現アクセサリー因子を発現するよう操 作され；タンパク質発現アクセサリー因子を発現する細胞株が確立され、次に、細胞株の 細胞が操作されて関心対象のタンパク質を発現する。別の実施態様において、細胞はまず 、関心対象のタンパク質を発現するよう操作され；関心対象のタンパク質を発現する細胞 株が確立され、次に、細胞株の細胞が操作されて、タンパク質発現アクセサリー因子を発 20 現するよう操作される。さらに別の実施態様において、細胞は、関心対象のタンパク質お よびタンパク質発現アクセサリー因子を発現するよう同時に操作される。関心対象のタン パク質および／またはタンパク質発現アクセサリー因子を発現する細胞株は次に、本明細 書で説明されるように、一貫してかつ再現可能に確立することができる。 【０５５３】 ある実施態様において、関心対象のタンパク質を発現するよう操作された複数の細胞が 提供される。これらの細胞は次に、タンパク質発現アクセサリー因子を発現するよう操作 されおよび／またはタンパク質発現に最も好ましい細胞が、先に論議されたようにタンパ ク質発現と関連した生理学的特性についてのマーカーを用いることによって複数から選択 される。 30 【０５５４】 ある実施態様において、細胞株は、動物構成要素を含まない培地において、および／ま たは本明細書で提供された方法に従って大規模作製のためのリアクターにおいて使用され るような懸濁条件下で増殖のために最適化することができる。あるより具体的な実施態様 において、細胞株は、増殖を遅延させる構成要素を含む培地における増殖のために最適化 することができる。 【０５５５】 さらなる実例となる実施態様において、（ｉ）タンパク質産生に好ましい生理学的特性 を有する細胞を同定すること；（ｉｉ）関心対象のタンパク質を発現するよう細胞を操作 すること；（ｉｉｉ）関心対象のタンパク質を安定して発現する細胞株を作製すること； 40 （ｉｖ）関心対象のタンパク質の産生に適した条件下で細胞を培養すること；および（ｖ ）関心対象のタンパク質の単離を含むタンパク質産生のための方法が提供される。 【０５５６】 別の実施態様において、（ｉ）タンパク質発現アクセサリー因子をコードする少なくと も１つの遺伝子を細胞に導入すること；（ｉｉ）タンパク質発現アクセサリー因子を発現 する細胞を同定すること；（ｉｉｉ）関心対象のタンパク質を発現するよう細胞を操作す ること；（ｉｖ）関心対象のタンパク質を安定して発現する細胞株を作製すること；（ｖ ）関心対象のタンパク質の産生に適した条件下で細胞を培養すること；および（ｖｉ）関 心対象のタンパク質の単離を含むタンパク質産生のための方法が提供される。 【０５５７】 50 (163) JP 2012-516687 A 2012.7.26 別の実施態様において、（ｉ）タンパク質発現アクセサリー因子をコードする少なくと も１つの遺伝子を細胞に導入すること；（ｉｉ）タンパク質発現アクセサリー因子を発現 する細胞を同定すること；（ｉｉｉ）タンパク質の産生に好ましい生理学的特性を有する 細胞を同定すること；（ｉｖ）関心対象のタンパク質を発現するよう細胞を操作すること ；（ｖ）関心対象のタンパク質を安定して発現する細胞株を作製すること；（ｖｉ）関心 対象のタンパク質の産生に適した条件下で細胞を培養すること；および（ｖｉｉ）関心対 象のタンパク質の単離を含むタンパク質産生のための方法が提供される。本実施態様の一 態様において、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は連続して実施される。別の態様において 、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は同時に実施される。 【０５５８】 10 別の実施態様において、（ｉ）タンパク質発現アクセサリー因子をコードする少なくと も１つの遺伝子を細胞に導入して、関心対象のタンパク質を発現するよう細胞を操作する こと；（ｉｉ）タンパク質アクセサリー因子および関心対象のタンパク質を発現する細胞 を同定すること；（ｉｉｉ）タンパク質発現アクセサリー因子および関心対象のタンパク 質を安定して発現する細胞株を作製すること；（ｉｖ）関心対象のタンパク質の産生に適 した条件下で細胞を培養すること；ならびに（ｖ）関心対象のタンパク質の単離を含むタ ンパク質産生のための方法が提供される。 【０５５９】 別の実施態様において、（ｉ）タンパク質発現アクセサリー因子をコードする少なくと も１つの遺伝子を細胞に導入し、関心対象のタンパク質を発現するよう細胞を操作するこ 20 と；（ｉｉ）タンパク質発現アクセサリー因子および関心対象のタンパク質を発現する細 胞を同定すること；（ｉｉｉ）タンパク質の産生に好ましい生理学的特性を有する細胞を 同定すること；（ｉｖ）タンパク質発現アクセサリー因子および関心対象のタンパク質を 一貫してかつ再現可能に発現する細胞株を作製すること；（ｖ）関心対象のタンパク質の 産生に適した条件下で細胞を培養すること；ならびに（ｖｉ）関心対象のタンパク質の単 離を含むタンパク質産生のための方法が提供される。本実施態様の一態様において、工程 （ｉｉ）および（ｉｉｉ）が連続して実施される。別の態様において、工程（ｉｉ）およ び（ｉｉｉ）が同時に実施される。 【０５６０】 タンパク質産生に適した細胞を作製するのに使用することのできる宿主細胞には、初代 30 細胞および不死化細胞が挙げられる。具体的な実施態様において、宿主細胞は例えば、Ｃ ＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＰｅｒＣ６細胞、酵母細胞、昆虫細胞、２９３細胞、ＣＡＣＯ細 胞、ＨＵＶＥＣ、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫｉＳＶ、ＮＳＯ、２９３Ｔ細胞、および昆虫細胞 であることができる。 【０５６１】 いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質の１Ｌあたり０．１、０．２、０ ．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１∼１．５、１．５ ∼２．０、２．０∼２．５、２．５∼３．０、３．０∼３．５、３．５∼４．０、４．０ ∼４．５、４．５∼５．０、５．０∼５．５、５．５∼６．０、６．５∼７．０、７．０ ∼７．５、７．５∼８．０、８．０∼８．５、８．５∼９．０、９．０∼９．５、９．５ 40 ∼１０．０、１０∼１１、１１∼１２、１２∼１３、１３∼１４、１４∼１５、１５∼１ ６、１６∼１７、１７∼１８、１８∼１９、１９∼２０、２０∼２５、または２５グラム 超を産生するまたは産生することのできる細胞または細胞株は、１、２、３、または５週 間未満で作製される。いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質の１Ｌあたり ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、 １∼１．５、１．５∼２．０、２．０∼２．５、２．５∼３．０、３．０∼３．５、３． ５∼４．０、４．０∼４．５、４．５∼５．０、５．０∼５．５、５．５∼６．０、６． ５∼７．０、７．０∼７．５、７．５∼８．０、８．０∼８．５、８．５∼９．０、９． ０∼９．５、９．５∼１０．０、１０∼１１、１１∼１２、１２∼１３、１３∼１４、１ ４∼１５、１５∼１６、１６∼１７、１７∼１８、１８∼１９、１９∼２０、２０∼２５ 50 (164) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、または２５グラム超を産生するまたは産生することのできる細胞または細胞株は、１、 ２、３、４、５、６、７、８、または９ヶ月未満で作製される。いくつかの実施態様にお いて、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヶ月にわたって安定であり、 この中で、タンパク質産生のレベルは３０％超ほど変動しない。いくつかの実施態様にお いて、細胞は、連続培養において１年、２年、またはそれより長くにわたって安定であり 、この中で、タンパク質産生のレベルは３０％超ほど変動しない。いくつかの実施態様に おいて、関心対象のタンパク質は、臨床適用において用いることのできる生物製剤または タンパク質である。いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は抗体である。 いくつかの実施態様において、関心対象のタンパク質は、修飾され、翻訳後修飾され、ま たはグリコシル化されている。いくつかの実施態様において、細胞によって産生されたタ 10 ンパク質は、細胞が含むよう操作された第二のタンパク質によって修飾され、翻訳後修飾 され、またはグリコシル化される。 【０５６２】 いくつかの実施態様において、本発明は、短期間で既存の生物製剤（例えば、生物学的 に等価のまたは生物学的に類似の生物製剤）の特性に対応する投下の生物製剤を生じる方 法を提供する。 【０５６３】 本発明の対応したパネルは、パネルについて異なる細胞株を連続して、並行して、また は両方の組み合わせで作製することによって生じ得る。例えば、各細胞株を個々に作製し た後、それらを対応させることができる。より好ましくは、細胞株間の差を最小化するた 20 めに、連続的に作製した細胞株を同じ段階または継代数で凍結し、並行して解凍すること ができる。さらにより好ましくは、細胞株は並行して作製される。いくつかの実施態様に おいて、対応したパネルは、実質的に同じである条件、プロトコル、または細胞培養工程 を用いて、パネルの各細胞株を作製することによって生じることができる。 【０５６４】 好ましい実施態様において、パネルにおける細胞株は、並行してスクリーニングまたは アッセイされる。 【０５６５】 本発明によると、対応したパネルの細胞株は、同じ培地、温度、およびこれらに類する ものを含むがそれらに限定されない同じ細胞培養条件下で維持される。パネルにおける細 30 胞株のすべては、細胞種類および増殖速度を含めた多くの因子に依存する任意の所望の頻 度であり得る同じ頻度で継代される。認められるであろうように、パネルの大まかに等し い細胞数を細胞株ごとに維持するために、細胞数は、周期的に標準化されるべきである。 【０５６６】 本方法によると、細胞は、細胞または細胞株が、増殖速度を測定する工程の前に個々の 培養物中に分散する限り、任意の細胞培養フォーマットにおいて培養され得る。例えば、 簡便さのために、細胞は、所望の条件下で培養のためにまずプールされ得、次に、個々の 細胞が１ウェルまたは１容器あたり１個の細胞に分離される。 【０５６７】 細胞は、任意の簡便な数のウェルを有する多重ウェル組織培養プレートにおいて培養さ 40 れ得る。このようなプレートは容易に商業的に入手可能であり、当業者に周知であろう。 いくつかの場合、細胞は好ましくは、バイアルにおいてまたはその他の簡便なフォーマッ トにおいて培養され得、種々のフォーマットは当業者に公知であろうし、容易に商業的に 入手可能である。 【０５６８】 増殖速度を測定する前に増殖速度を測定する工程を含む実施態様において、細胞は、そ れらを培養条件に順化させるのに十分な長さの時間培養される。当業者によって認められ るであろう様に、時間の長さは、細胞種類、選択された条件、培養フォーマットなどの多 くの因子に応じて変動するであろうし、１日から数日、１週間以上までの任意の量であり 得る。 50 (165) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０５６９】 好ましくは複数の個別の細胞培養物における各個々の培養物は、標準化された維持スケ ジュールを含めた下記に論議される実質的に同一の条件下で維持される。本方法の別の有 利な特徴は、多数の個々の培養物を同時に維持することができ、それにより所望のセット の形質を有する細胞が、ごくまれな場合でさえ同定され得ることである。それらのおよび 他の理由のために、本発明によると、複数の個別の細胞培養物が、自動細胞培養法を用い て培養され、それにより条件は、各ウェルについて実質的に同一である。自動細胞培養は 、手動細胞培養に固有の回避不可能な変動性を防止する。 【０５７０】 任意の自動細胞培養システムは、本発明の方法において用いられ得る。多くの自動シス 10 テムが市販されており、当業者に周知であろう。いくつかの実施態様において、これらの システムは、細胞または細胞株の複数の個別の培養物の培養を自動化または標準化するの に使用するのに適し得る。いくつかの実施態様において、これらのシステムは、実質的に 同一の条件下で細胞または細胞株の複数の個別の培養株の培養を自動化または標準化する のに使用するのに適し得る。いくつかの実施態様において、これらのシステムは、実質的 に同一の条件下で細胞または細胞株の複数の個別の培養物の並行培養を自動化または標準 化するのに使用するのに適し得る。いくつかの実施態様において、これらのシステムは、 細胞または細胞株の複数の個別の培養物の培養を自動化または標準化するのに使用するの に適し得、それにより細胞の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１ １、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４ 20 、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超の生理 学的特性が培養中に維持される。いくつかの実施態様において、これらのシステムは、細 胞または細胞株の複数の個別の培養物の培養を自動化または標準化するのに使用するのに 適し得、それにより関心対象のＲＮＡまたはタンパク質が、細胞または細胞株によって安 定して発現する。いくつかの実施態様において、これらのシステムは、細胞または細胞株 の複数の個別の培養物の培養を自動化または標準化するのに使用するのに適し得、それに より細胞の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ 、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、 ２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超の生理学的特性が維持され、かつ関 心対象のＲＮＡまたはタンパク質が細胞または細胞株によって安定して発現する。いくつ 30 かの実施態様において、自動化システムはロボットシステムである。好ましくは、システ ムには、独立して移動するチャネル、多重チェネルヘッド（例えば、９６チップヘッド） およびグリッパーもしくは摘果アーム、および手順の間に滅菌的に維持するＨＥＰＡ濾過 装置がある。ピペッターにおけるチャネル数は、培養のフォーマットに適しているべきで ある。簡便なピペッターは、例えば９６または３８４のチャネルを有する。このようなシ ステムは公知であり、市販されている。例えば、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ（商標）機 器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）は、本発明の方法において使用され得る。自動化システムは、種 々の所望の細胞培養課題を実行することができるべきである。このような課題は当業者に よって公知であろう。該課題には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：培地の 除去、培地の交換、試薬の添加、細胞洗浄、洗浄溶液の除去、分散剤の添加、培養容器か 40 らの細胞の取り出し、細胞の培養容器への付加、およびこれらに類すること。 【０５７１】 本発明の細胞または細胞株の作製には、任意の数の個別の細胞培養物が含まれ得る。し かしながら、細胞数が増加するにつれ、方法によって提供される利点が増加する。本方法 において利用することのできる細胞または個別の細胞培養物の数に理論的上限値はない。 本発明によると、個別の細胞培養物の数は、２つ以上であることができるが、より有利な ことに、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの個別の細 胞培養物があり、例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくと も２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくと も４５、少なくとも４８、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも９６、少なくと 50 (166) JP 2012-516687 A 2012.7.26 も１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも３８４、少なくとも４００ 、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００ ，０００、少なくとも５００，０００、またはそれより多い。 【０５７２】 いくつかの実施態様において、説明されるとおり培養される本発明の細胞および細胞株 は、少なくとも２つが関心対象の核酸について陽性であるとして既に選択された細胞であ り、該核酸は、関心対象のタンパク質の全部もしくは部分をコードする導入された核酸、 または関心対象のタンパク質の全部または部分をコードする配列の転写を活性化させる導 入された核酸であることができる。いくつかの実施態様において、本明細書に説明された ように培養される細胞は、少なくとも２つが関心対象のＲＮＡまたは関心対象のタンパク 10 質をコードするＲＮＡについて陽性であるとして選択された細胞である。 【０５７３】 本発明の細胞および細胞株を作製するために、例えば、米国特許第６，６９２，９６５ 号およびＷＯ／２００５／０７９４６２に説明された技術を使用することができる。これ らの文書は両方とも、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込ま れている。この技術は、任意の所望の数のクローン（数百から数千までのクローン）とな るよう細胞数百個のリアルタイム評価を提供する。フローサイトメトリー細胞選別（例え ば、ＦＡＣＳ機械を用いる。）細胞選別技術または磁気細胞選別（例えば、ＭＡＣＳ機械 を用いる。）を用いて、１ウェルあたり１個の細胞を培養容器（９６ウェル培養プレート など）に高い統計的信頼度で自動的に配置する。技術の速度および自動化によって、多重 20 遺伝子組換え細胞株が容易に単離できる。ある実施態様において、所望のシグナルについ て陽性の細胞（すなわち、所望のＲＮＡを発現する細胞）がプールされる。このようなプ ールは次に、選択に関する第二ラウンドに供することができる。ある実施態様において、 細胞のプールは、合計２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または 少なくとも５０のラウンドの選択に供される。 【０５７４】 本技術を用いて、関心対象のタンパク質についてのＲＮＡ配列は、分子ビーコンまたは 蛍光発生プローブとも呼ばれるシグナル伝達プローブを用いて検出され得る。いくつかの 実施態様において、コード配列を含むベクターは、ＲＮＡタグ配列をコードする追加的な 配列を有する。「タグ配列」とは、シグナル伝達プローブによって検出されるべき発現し 30 たＲＮＡまたはＲＮＡの部分である核酸配列を指す。シグナル伝達プローブは、種々のＲ ＮＡ配列を検出し得、そのいずれもが先に説明したペプチドおよびタンパク質のタグをコ ードするものを含めたタグとして使用され得る。シグナル伝達プローブは、タグの配列に 相補的な一部を含むようプローブを設計することによってタグに対して指向し得る。タグ 配列は、関心対象のタンパク質の転写産物と同時転写され、かつシグナル伝達プローブ結 合のための標的配列を含むプラスミドの３’非翻訳領域であり得る。タグ配列は、産生し たタンパク質にタグ付けしたいかどうかに応じて、遺伝子のメッセージのタンパク質コー ド部分を有するフレームの中に、または該フレームの外にあることができる。従って、タ グ配列は、シグナル伝達プローブによる検出のために翻訳される必要はない。タグ配列は 、同じかまたは異なる多重標的配列を含み得、この中で、１つのシグナル伝達プローブは 40 、各標的配列とハイブリッド形成する。タグ配列は、関心対象の遺伝子をコードするＲＮ Ａ内に位置し得、またはタグ配列は、５’または３’非翻訳領域内に位置し得る。タグ配 列は、二次構造を有するＲＮＡであり得る。該構造は、３アーム接合構造であり得る。い くつかの実施態様において、シグナル伝達プローブは、関心対象のタンパク質をコードす る配列内の配列を検出する。タグ配列は、化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得る。 タグ配列は、２００５年９月１日に公開された国際特許出願公報第ＷＯ２００５／０７９ ４６２号（出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０５／００５０８０）において説明されたように作製お よび使用することができる。 【０５７５】 細胞へのＤＮＡコンストラクトのトランスフェクションおよびその後の薬剤選択（使用 50 (167) JP 2012-516687 A 2012.7.26 される場合）の後、または遺伝子活性化の後、各々が異なるタグ配列を標的にし、かつ異 なって標識する分子ビーコン（例えば、蛍光発生プローブ）を細胞に導入し得、フローサ イトメトリー細胞選別装置を用いて、それらのシグナルについて陽性である細胞を単離す る（複数回の選別を実施し得る。）。一実施態様において、フローサイトメトリー細胞選 別装置は、ＦＡＣＳ機械である。また、レーザーで可能な分析およびプロセシングを用い る陰性細胞のＭＡＣＳ（磁気細胞選別）またはレーザー切除も使用することができる。ハ イスループットスクリーニングと互換性のあるものを含めた他の蛍光プレートリーダーも 使用することができる。シグナル陽性細胞が採取され、導入された配列の少なくとも１コ ピーをゲノムに組み込み得る。次に、関心対象のタンパク質についてのメッセージを導入 した細胞を同定する。例として、コード配列は、細胞におけるゲノムの異なる位置に組み 10 込まれ得る。導入された配列の発現レベルは、コピー数または組み込み部位に基づいて変 動し得る。さらに、関心対象のタンパク質を含む細胞が得られ得、この中で、導入された 核酸の１つ以上は、エピソームであり、または遺伝子活性化からの結果である。 【０５７６】 本発明において有用なシグナル伝達プローブは、当技術分野で公知であり、一般的には 、標的配列、およびプローブが標的配列に結合していない場合にシグナルが放射されず、 かつプローブが標的配列に結合する場合にシグナルが放射されるよう配置されたシグナル 放射系、と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。制限のない実例によると、シ グナル伝達プローブは、消光剤およびフルオロフォアが、結合していないプローブにおい て互いにもたらされるようプローブに配置されたフルオロフォアおよび消光剤を含み得る 20 。プローブと標的配列の間の結合の際に、消光剤およびフルオロフォアは分離し、結果的 にシグナルの放射を生じる。例えば、国際公報ＷＯ／２００５／０７９４６２は、存在す る細胞および細胞株の作製において使用され得る多くのシグナル伝達プローブを説明して いる。核酸を細胞に導入するための先に説明した方法を用いて、シグナル伝達プローブを 導入し得る。 【０５７７】 タグ配列を使用する場合、各ベクター（多重ベクターを使用する場合）は、同じかまた は異なるタグ配列を含むことができる。タグ配列が同じであろうと異なっていようと、シ グナル伝達プローブは異なる有色フルオロフォアおよびそれに類するものなど、異なるシ グナル放射因子を含み得、それにより各サブユニットの発現は別個に検出され得る。実例 30 によると、関心対象の第一のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＲＮＡオリ ゴヌクレオチド）を特異的に検出するシグナル伝達プローブは、赤色のフルオロフォアを 含むことができ、関心対象の第二のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＲＮ Ａオリゴヌクレオチド）を検出するプローブは、緑色のフルオロフォアを含むことができ 、関心対象の第三のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＲＮＡオリゴヌクレ オチド）を検出するプローブは、青色のフルオロフォアを含むことができる。当業者は、 三重にトランスフェクトした細胞においてシグナル伝達プローブを用いて３つのサブユニ ットの発現を差次的に検出するための他の手段に気づいているであろう。 【０５７８】 一実施態様において、シグナル伝達プローブは、関心対象のタンパク質をコードするＲ 40 ＮＡの一部または５’もしくは３’非翻訳領域の部分のいずれかに相補的であるよう設計 される。関心対象のメッセンジャーＲＮＡを認識するよう設計されたシグナル伝達プロー ブが、内在的に発現した標的配列を検出することができる場合でさえ、トランスフェクト した細胞によって産生される関心対象の配列の比と比較したこれらの比は、選別装置が、 ２つの細胞種類を識別できるようになっている。 【０５７９】 関心対象のタンパク質の発現レベルは、細胞ごとにまたは細胞株ごとに変動し得る。ま た、細胞または細胞株における発現レベルは、ＤＮＡメチル化および遺伝子サイレンシン グおよび導入遺伝子コピー損失などの後成的な事象によって、経時的に低下し得る。これ らの変動は、種々の因子、例えば、細胞によって取り込まれる導入遺伝子のコピー数、導 50 (168) JP 2012-516687 A 2012.7.26 入遺伝子のゲノム組み込み部位、およびゲノム組み込み後の導入遺伝子の完全性に起因す ることができる。発現レベルを評価するためにＦＡＣＳまたは他の細胞選別方法（すなわ ちＭＡＣＳ）が使用され得る。シグナル伝達プローブを導入する追加的なラウンドを用い て、例えば、細胞が元来単離されることとなるＲＮＡの任意の１つ以上について細胞が正 のままであるかどうかおよびどの程度正のままであるかを決定し得る。 【０５８０】 任意に、増殖速度群の１つ以上についての培養物の１つ以上の複製セットが調製され得 る。いくつかの場合、１つ以上の増殖ビンの複製物セットを凍結して、例えば、凍結され たストックとして機能することは有利であり得る。しかしあんがら、本方法によると、凍 結された細胞ストックは、望まれるだけおよび任意の地点でしばしば、およびその作製の 10 間の多くの地点だけしばしば作製することができる。細胞培養物を凍結するための方法は 、当業者に周知である。例によると、複製物は、任意の温度で、例えば、−７０℃∼−８ ０℃で凍結することができる。一実施態様において、細胞は、７０∼１００％細胞密度に 到達するまでインキュベートされた。次に、培地を吸引し、９０％ＦＢＳおよび１０％培 地の溶液をプレートに添加し、遮蔽し、および凍結した。 【０５８１】 本発明は、異なる培養条件を用いて任意の数の複製物を用いて本方法を実施することを 包含する。すなわち、本方法は、第一のセットの培養条件下で第一の複数（セット）の個 別の細胞培養物を用いて、および第一の条件とは異なる第二のセットの条件下で培養され た第二のセットの個別の細胞培養物を用いてなど、任意の所望の数のセットの条件につい 20 て実施することができる。異なるセットの条件を用いるほう法は、両方を同時にもしくは 連続してまたは組み合わせて実施することができる（２つのセットを同時の後に２つ以上 のセット、など）。 【０５８２】 関心対象のタンパク質の一貫した機能的発現を用いて細胞を選択するための本明細書に 説明された方法に関する１つの利点は、細胞が機能によって選択されることであり、細胞 における特定の核酸の存在によってではないということである。関心対象のタンパク質を コードする核酸を含む細胞は、該タンパク質を発現し得ず、またはタンパク質が産生され る場合でさえ、多くの理由のために、タンパク質が機能的ではないかもしれず、または「 未変性の」機能と比較して機能、すなわちタンパク質を天然に発現するその通常の状況下 30 での細胞における機能が変化している。機能に基づいて細胞を選択することによって、本 明細書に説明された方法によって、新規の機能的形態を同定することが可能となる。例え ば、同じ試験化合物を用いてもしくは一連の化合物を用いてなど、同じアッセイにおける 機能の種々の程度を有する複数の細胞を同定することが可能である。差次的機能は、一連 の機能的「特性」を提供する。このような特性は、例えば、タンパク質の異なる機能的形 態に差次的に影響する化合物を同定するのに有用である。このような化合物は、特定の組 織または疾患状態、およびこれらに類するものにおけるタンパク質の機能的形態を同定す るのに有用である。 【０５８３】 関心対象の複合体タンパク質または多重タンパク質を発現する細胞を含めた本発明の細 40 胞および細胞株を作製するための方法に関するさらなる利点は、細胞が、従来の方法によ るものよりも有意に短い時間で作製することができることである。例えば、機能的アッセ イに必要な細胞数を含めた多くの因子に応じて、増殖速度ビニングおよび他の因子を実施 しようとなかろうと、明白に機能的なタンパク質を発現する細胞は、２日、または１週間 で作製され得るが、さらに２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、またはさらには６ ヶ月の作製時間が複合体タンパク質または多重タンパク質についてでさえ従来法によって 可能であったよりも有意に迅速である。 【０５８４】 別の態様において、本発明は、本発明の細胞および細胞株を用いる方法を提供する。本 発明の細胞および細胞株は、関心対象の機能的タンパク質が必要とされる任意の適用にお 50 (169) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いて用いられ得る。細胞および細胞株は、例えば、インビトロでの細胞ベースのアッセイ もしくは細胞が動物に植え込まれるインビボアッセイにおいて、例えば修飾因子をスクリ ーニングするために；結晶学研究および結合研究のためのタンパク質を産生するために； ならびに化合物の選択性および投与、受容体／化合物結合動態および安定性、ならびに細 胞の生理学（例えば、電気生理学、タンパク質の輸送、タンパク質の折りたたみ、および タンパク質調節）に及ぼす受容体発現の効果を研究するために使用され得る。また、本発 明の細胞および細胞株をノックダウン研究に用いて、関心対象のタンパク質の役割を検討 することもできる。 【０５８５】 また、本発明の細胞および細胞株を用いて、機能的アッセイ、生体パニング（例えば、 10 ファージディスプレイライブラリを用いる。）、遺伝子発現において結果として生じる変 化を評価する遺伝子チップ研究、タンパク質間相互作用を同定する２ハイブリッド研究、 細胞株における具体的なサブユニットの役割を評価するための該サブユニットのノックダ ウン、電気生理学、タンパク質輸送の研究、タンパク質折りたたみの研究、タンパク質調 節の研究、タンパク質に対する抗体の産生、タンパク質に対するプローブの単離、タンパ ク質に対する蛍光プローブの単離、全体的な遺伝子発現／プロセシングに及ぼすタンパク 質の発現の効果に関する研究、全体的なタンパク質発現およびプロセシングに及ぼすタン パク質の発現の効果に関する研究、ならびに細胞の構造、特性、特徴に及ぼすタンパク質 の発現の効果に関する研究のたえに、可溶性の生物学的競合因子を同定し得る。 【０５８６】 20 本発明の細胞および細胞株はさらに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の化学量、タ ンパク質折りたたみ、組み立て、膜への組み込み、または表面提示、立体配座、活性状態 、活動電位、応答、機能、および細胞ベースのアッセイ機能を含めた関心対象（ＤＮＡ、 ＲＮＡ、またはタンパク質）のタンパク質を特徴付けるのに有用であり、ここで、関心対 象のタンパク質は、これらのすべての構成要素が、細胞に導入された１つ以上の標的遺伝 子によって提供されようと、導入されかつ内在的に発現した配列の任意の組み合わせによ って提供されようとにかかわらず、多重遺伝子系、複合体、または経路を含む。 【０５８７】 多量体（二量体、三量体、またはより高次の多量体化）タンパク質の１つ以上のサブユ ニットを発現するよう操作された細胞および細胞株は、この多量体タンパク質の異なる形 30 態を産生することができる。本発明は、多量体タンパク質の異なる形態で細胞を識別する 方法を提供する。多量体タンパク質の機能的形態は、細胞の生理学的状態、選択的スプラ イシング、またはタンパク質分解、アクセサリー因子もしくは相互作用因子とのその会合 、またはその折りたたみ、組み立て、もしくは細胞膜における組み込みを含めた標的の翻 訳後修飾に応じて変動することができる。異なるサブユニットの組み立ておよび化学量論 はさらに、ヘテロ多量体標的について考えられ得る機能的形態の数を増大させる。機能的 形態は、その応答に関して異なって、化合物またはその活性の動態を経時的に試験するこ とができる。異なる機能的形態の多量体タンパク質を発現する細胞の比較分析によって、 特異的機能形態を含む細胞を同定することができる。 【０５８８】 40 いくつかの実施態様において、多量体タンパク質は、少なくとも２つのタンパク質サブ ユニットの物理的または生化学的会合である。いくつかの実施態様において、多量体タン パク質は、１つのタンパク質サブユニットおよびタンパク質サブユニットの１つのアクセ サリー因子のの物理的または生化学的会合である。いくつかの実施態様において、多量体 タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のサブユニット を有する。サブユニットは、同じポリペプチドもしくは異なるポリペプチドまたはそれら の組み合わせであることができる。多量体タンパク質は、本明細書に開示された任意の多 量体タンパク質であることができる。 【０５８９】 本明細書に説明された機能的活性、または薬理学的特性は、細胞株における標的の活性 50 (170) JP 2012-516687 A 2012.7.26 に及ぼす１つ以上の化合物の効果を試験することによって、関心対象の標的を発現する細 胞株について規定することができる。これらの薬理学的統制に従ってクローンをグループ 分けすることまたはカテゴリー分けすることは、標的の起こり得る各形態を表す細胞株の パネルを結果として生じるために使用することができる。すべての起こり得る機能的形態 の提示は、スクリーンを飽和させることによって、すなわち、その薬理学的特性によって 規定される各形態が、少なくとも２、３、５、１０、２５、５０、または少なくとも１０ ０の細胞株によって表されるよう、少なくとも多くの細胞株を試験することによって遂行 され得る。 【０５９０】 いくつかの実施態様において、関心対象の標的に及ぼす化合物の効果は、細胞周期の特 10 定の地点（例えば、Ｍ、Ｓ、Ｇ１、またはＧ２期）でアッセイされる。他の実施態様にお いて、関心対象の標的に及ぼす化合物の効果は、経時的にモニターされる（例えば、１、 ５、１０、１５、２０、３０、４０、５０秒間にわたる；１、５、１０、１５、２０、３ ０、４０、５０分間にわたる。；１、５、１０、１５、２０時間、１、２、５、１０、２ ０、３０日にわたる、または１、２、５、１０ヶ月間にわたる）。 【０５９１】 いくつかの実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質について、すべてのサブユニッ トを各々含む複数の細胞株を用いて、関心対象のヘテロマータンパク質の複数の薬理学的 特性、すなわち、細胞株あたり１つの特性を生じることができる。細胞株間の薬理学的特 性における差は、関心対象のヘテロマータンパク質の異なる形態、例えば、サブユニット 20 の化学量論の変動し得る組み立てを識別する。 【０５９２】 異なるまたはすべてよりも少ないサブユニットを発現する細胞との比較を用いて、機能 性を個々の細胞ユニットに帰することができる。 【０５９３】 異なるサブユニットの組み合わせが得られ得かつ機能的に試験され得るヘテロ多量体タ ンパク質の例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない： 【０５９４】 ＧＡＢＡ（Ａ）受容体ヘテロ多量体組み合わせ（例えば、Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ｓｉｅ ｇｈａｒｔ， "Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ 30 ｏｇｙ． ＬＸＸ． Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ γ−Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉ ｄＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｓｉ ｓ ｏｆ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｕｐｄａｔｅ"， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒ ｅｖｉｅｗｓ， ６０：２４３−２６０， ２００８を参照されたく、そのすべての内容 が全体として引用により本明細書に組み込まれている。）： 【０５９５】 ＧＡＢＡ（Ａ）サブユニットには、ＧＡＢＲＡ１ （α１ ）、ＧＡＢＲＡ２（α２） 、ＧＡＢＲＡ３ （α３）、ＧＡＢＲＡ４ （α４）、ＧＡＢＲＡ５ （α５）、ＧＡＢ ＲＡ６ （α６）、ＧＡＢＲＢ１ （β１）、ＧＡＢＲＢ２ （β２）、ＧＡＢＲＢ３（ 40 β３）、ＧＡＢＲＧ１ （γ１）、ＧＡＢＲＧ２ （γ２）、ＧＡＢＲＧ３ （γ３）、 ＧＡＢＲＤ（δ）、ＧＡＢＲＥ （ε）、ＧＡＢＲＰ （π）、およびＧＡＢＲＱ （θ ）が挙げられるが、これらに限定されない； 【０５９６】 ＧＡＢＡ（Ａ）サブユニットの組み合わせには、αｌβ２γ２、α２βγ２、α３βγ ２、α４βγ２、α４β２δ、α４β３δ、α５βγ２、α６βγ２、α６β２δ、α６ β３δ、ρ、αｌβ３γ２、αｌ βδ、α５β３γ２、αβｌγ、αβｌδ、αβ、αｌα６βγ、αｌα６βδ、ρ１、 ρ２、ρ３、αβγｌ、αβγ３、αβθ、αβε、およびαβπが挙げられるが、これ らに限定されない； 50 (171) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０５９７】 ｎＡＣｈＲヘテロ多量体受容体の組み合わせ（例えば、Ｇｏｔｔｉ， Ｚｏｌｉ ａｎ ｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｉ， "Ｂｒａｉｎ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉ ｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： ｎａｔｉｖｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ"， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃ ｉｅｎｃｅｓ， ２７：４８２−４９１ ， ２００６、およびＮ． Ｍｉｌｌａｒ Ｎ ｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ５６， Ｉｓｓｕｅ １ ， Ｊａ ｎｕａｒｙ ２００９， Ｐａｇｅｓ ２３７−２４６を参照されたく、それらのすべて の教示は、引用により本明細書に組み込まれている。）： 【０５９８】 10 ｎＡＣｈＲサブユニットには、ＣＨＲＮＡ１ （α１）、ＣＨＲＮＡ２ （α２）、Ｃ ＨＲＮＡ３ （α３）、ＣＨＲＮＡ４ （α４）、ＣＨＲＮＡ５ （α５）、ＣＨＲＮＡ ６ （α６）、ＣＨＲＮＡ７（α７）、ＣＨＲＮＡ８（α８）、ＣＨＲＮＡ９（α９）、 ＣＨＲＮＡ１０（α１０）、ＣＨＲＮＢ１ （β１）、ＣＨＲＮＢ２ （β２）、ＣＨＲ ＮＢ３（β３）、ＣＨＲＮＢ４（β４）、ＣＨＲＮＤ （δ）、およびＣＨＲＮＥ （ε ）が挙げられるが、これらに限定されない； 【０５９９】 ｎＡＣｈＲサブユニットの組み合わせには、α１ β１ ｖδ、α１β１δ、αｌβｌ δε、α２α４β２、α２α５β２、α２β２、α２β４、α２α６β２、α３α４β２ 、α３α４α６β２、α３α５β２、α３α４β４、α３α５β２β４、α３α５β４、 20 α３α６β２、α３β２、α３β３、α３β２β３、α３β２β４、α３β３β４、α３ β４、α４α５β２、α４α６β２β３、α４β２、α４β４、α６β２、α６β２β３ 、α６α４β２、α６β２β３、α６β３β４、α６β４、α７、α７α８、α８、およ びα９α１０が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６００】 ５−ＨＴ３ヘテロマー受容体（例えば、Ｎ． Ｍ． Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５６ （２００９） ２７３−２８４を参照され たく、そのすべての内容は全体として引用により本明細書に組み込まれている。）： 【０６０１】 ５−ＨＴ３サブユニットには、ＨＴＲ３Ａ （Ａ） 、ＨＴＲ３Ｂ （Ｂ）、ＨＴＲ３ 30 Ｃ （Ｃ）、ＨＴＲ３Ｄ （Ｄ）、およびＨＴＲ３Ｅ （Ｅ）が挙げられるが、これらに 限定されない； 【０６０２】 ５−ＨＴ３サブユニットの組み合わせには、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、およびＡＥが挙げられ るが、これらに限定されない； 【０６０３】 グリシンヘテロマー受容体（例えば、ＪＷ Ｌｙｎｃｈ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏ ｌｏｇｙ ５６ （２００９） ３０３−３０９を参照されたく、そのすべての内容が引 用により本明細書に組み込まれている。）： 【０６０４】 40 グリシン受容体サブユニットには、ＧＬＲＡ１ （α１ ）、ＧＬＲＡ２ （α２）、 ＧＬＲＡ３ （α３）、ＧＬＲＡ４ （α４）、およびＧＬＲＢ （β）が挙げられるが 、これらに限定されない； 【０６０５】 グリシン受容体サブユニットの組み合わせには、α１α３、αｌβ、α２β、α３β、 およびα４βが挙げられるが、これらに限定されない； 【０６０６】 グルタミン酸ヘテロマー受容体（例えば、Ｐｅｒｒａｉｓ， Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａ ｃｏｌｏｇｙ ５６ （２００９） １３１ −１４０； Ｊａｎｅ， Ｎｅｕｒｏｐｈ ａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５６ （２００９） ９０−１ １３；およびＷ． Ｌｕ， Ｎ 50 (172) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｅｕｒｏｎ， ６２， （２００９） ２， ２５４−２６８を参照されたく、それらの すべての教示は引用により本明細書に組み込まれている。）： 【０６０７】 グルタミン酸受容体サブユニットには、ＧＲＩＫ１ （Ｋ１）、ＧＲＩＫ２ （Ｋ２） 、ＧＲＩＫ３ （Ｋ３）、ＧＲＩＫ５ （Ｋ５）、ＧＲＩＡ１ （Ａ１） ＧＲＩＡ２ （Ａ２）、およびＧＲＩＡ３ （Ａ３）が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６０８】 グルタミン酸受容体サブユニットの組み合わせには、Ｋ２Ｋ３、Ｋ１Ｋ２、Ｋ１Ｋ５、 Ｋ２Ｋ５、Ａ１Ａ２、Ａ１Ａ３、およびＡ２Ａ３が挙げられるが、これらに限定されない ； 10 【０６０９】 ＡＴＰ開口型Ｐ２Ｘヘテロマー受容体（例えば、Ｍ． Ｆ． Ｊａｒｖｉｓ， Ｂ． Ｓ． Ｋｈａｋｈ， Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５６ （２００９） ２０ ８−２１５；およびＳ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １１， ２００１， ３７８−３８６を参照されたく、そ れらのすべての教示は引用により本明細書に組み込まれている。）： 【０６１０】 ＡＴＰ開口型Ｐ２Ｘ受容体サブユニットには、Ｐ２ＲＸ１ （Ｘ１）、Ｐ２ＲＸ２ （ Ｘ２）、Ｐ２ＲＸ３ （Ｘ３）、Ｐ２ＲＸ４ （Ｘ４）、Ｐ２ＲＸ５ （Ｘ５）、Ｐ２Ｒ Ｘ６ （Ｘ６）、およびＰ２ＲＸ７ （Ｘ７）が挙げられるが、これらに限定されない； 20 【０６１１】 ＡＴＰ開口型Ｐ２Ｘ受容体サブユニットの組み合わせには、Ｘ１／Ｘ２、Ｘ１／Ｘ４、 Ｘ１／Ｘ５、Ｘ２／Ｘ３、Ｘ２／Ｘ６、Ｘ４／Ｘ６、およびＸ４／Ｘ７が挙げられるが、 これらに限定されない； 【０６１２】 味覚受容体： 味覚受容体サブユニットには、ＴＡＳ１Ｒ１ （Ｔ１Ｒ１）、ＴＡＳ１Ｒ２ （Ｔ１Ｒ ２）、ＴＡＳ１Ｒ３ （Ｔ１Ｒ３）が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６１３】 味覚受容体サブユニットの組み合わせには、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３（甘味受容体）、Ｔ１ 30 Ｒ１／Ｔ１Ｒ３（旨味受容体）が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６１４】 ＧＰＣＲヘテロ多量体、例えば、ＧＰＣＲヘテロ二量体（例えば、Ｐｒｉｎｓｔｅｒ， Ｈａｇｕｅ ａｎｄ Ｈａｌｌ， "Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ： Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ ｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ"、 Ｐｈａｒｍａｃｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、 ５７：２８９−２９８、 ２００５を参照されたく 、そのすべての内容は全体として引用により本明細書に組み込まれている。）、以下が挙 げられるが、これらに限定されない：ＨＴＲ１Ｂ （５−ＨＴ１Ｂ） ／ ＨＴＲ１Ｄ （５ＨＴ１Ｄ）、ＡＤＯＲＡ１ （アデノシンＡ１ ）／ ＤＲＤ１ （ドーパミンＤ１ 40 ）、ＡＤＯＲＡ１ （アデノシンＡ１）／ Ｐ２ＲＹ１ （Ｐ２Ｙ１）、ＡＤＯＲＡ１ （アデノシンＡ１）／ ＧＲＭ１ （ｍＧｌｕＲ１ ｛アルファ｝）、ＡＤＯＲＡ２ａ（ アデノシンＡ２Ａ）／ ＤＲＤ２ （ドーパミンＤ２）、ＡＤＯＲＡ２ａ（アデノシンＡ ２Ａ）／ ＧＲＭ５ （ｍＧｌｕＲ５）、ＡＧＴＲ１ （アンギオテンシン１ ）／ Ａ ＧＴＲ２ （アンギオテンシン２）、ＡＧＴＲ１ （アンギオテンシン１）／ ＡＤＲＢ ２（｛ベータ｝２ＡＲ）、ＡＧＴＲ１ （アンギオテンシン１）／ ＢＤＫＲＢ２ （ブ ラジキニンＢ２）、ＣＡＳＲ （カルシウム感知受容体） ／ ＧＲＭ１ （ｍＧｌｕＲ １）、ＣＡＳＲ （カルシウム感知受容体） ／ ＧＲＭ５（ｍＧｌｕＲ５）、 ＣＣＲ ２ ／ＣＸＣＲ４、 ＣＣＲ２ ／ ＣＣＲ５、 ＣＣＲ５／ＯＰＲＤ１ （オピオイド 受容体デルタ）、ＣＣＲ５／ＯＰＲＫ１ （オピオイド受容体カッパ）、ＣＣＲ５／ＯＰ 50 (173) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＲＭ１ （オピオイド受容体ミュー）、ＣＣＫＲＡ （コレシストキニンＡ）／ ＣＣＫ ＲＢ （コレシストキニンＢ）、ＤＲＤ１ （ドーパミンＤ１） ／ ＤＲＤ２（ドーパ ミンＤ２）、ＤＲＤ２（ドーパミンＤ２） ／ＳＳＴＲ５、ＤＲＤ２（ドーパミンＤ２） ／ ＤＲＤ３ドーパミンＤ３、ＥＤＮＲＡ （エンドセリンＡ）／ＥＤＮＲＢ （エン ドセリンＢ）、ＧＡＢＡＢＲ１ ／ＧＡＢＡＢＲ２、ＭＴＮＲ１Ａ （メラトニンＭＴ１ ）／ＭＴＮＲ１ Ｂ （メラトニンＭＴ２）、ＣＨＲＭ２ （ムスカリン性Ｍ２）／ ＣＨＲＭ３ （ムスカリン性Ｍ３）、ＯＸＴＲ（オキシトシン）／ＡＶＰＲ１ Ａ （バ ソプレッシンＶ１ａ）、ＯＸＴＲ（オキシトシン）／ＡＶＰＲ２（バソプレッシンＶ２） 、Ｓ１ＰＲ１ （Ｓ１Ｐ１）／ Ｓ１ＰＲ２ （Ｓ１Ｐ２）、Ｓ１ＰＲ１ （Ｓ１Ｐ１） ／ Ｓ１ＰＲ３ （Ｓ１Ｐ３）、 ＳＳＴＲ１／ＳＳＴＲ５、ＳＳＴＲ２Ａ ／ＳＳＴＲ 10 ３、ＳＳＴＲ２Ａ ／ＯＰＲＭ１ （μ−ＯＰＲ ）、ＴＡＣＲ１ （サブスタンスＰ） ／ＯＰＲＭ１ （μ−ＯＰＲ ）、ＴＲＨＲ１ ／ＴＲＨＲ２、ＡＶＰＲ１ Ａ （バソ プレッシンＶ１ａ）／ ＡＶＰＲ２（バソプレッシンＶ２）、ＡＤＲＡ１ Ｂ（アルファ１ ＢＡＲ）／ＡＤＲＡ １ Ａ （アルファｌ ＡＡＲ）、 ＡＤＲＡ１ Ｂ（アルファ１ ＢＡＲ）／ＨＲＨ１ （ヒスタミンＨ１ ）、ＡＤＲＡ１ Ｂ（アルファ１ ＢＡＲ）／ ＡＤＲＡ１ Ｄ（アルファ１ ＤＡＲ）、ＡＤＲＡ１ Ｄ（アルファ１ ＤＡＲ）／ Ａ ＤＲＢ２Ｄ（ベータ２ＡＲ）、ＡＤＲＡ２Ａ（アルファ２ＡＡＲ）／ ＡＤＲＢ１ （ベ ータｌ ＡＲ）、ＡＤＲＡ２Ａ（アルファ２ＡＡＲ）／ＯＰＲＭ１ （μ−ＯＰＲ ）、 20 ＡＤＲＢ１ （ベータ１ ＡＲ） ／ＡＤＲＢ２（ベータ２ＡＲ）、ＡＤＲＢ２（ベータ ２ＡＲ）／ＯＰＲＤ１ （δ−ＯＰＲ ）、ＡＤＲＢ２（ベータ２ＡＲ）／ ＯＰＲＫ１ （κ−ＯＰＲ ）、ＡＤＲＢ２（ベータ２ＡＲ）／ＡＤＲＢ３（ベータ３ＡＲ）、ＡＤ ＲＢ２（ベータ２ＡＲ）／ Ｍ７１−ＯＲ、ＯＰＲＫ１ （κ−ＯＰＲ ）／ ＯＰＲＤ １ （δ−ＯＰＲ ）、およびＯＰＲＭ１ （μ−ＯＰＲ ）／ＯＰＲＤ１ 【０６１５】 （δ−ＯＰＲ ）； 【０６１６】 電位開口型カルシウムチャネル（ＣａＶ）多重サブユニット複合体（例えば、ＷＡ Ｃ ａｔｔｅｒａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ２００５ ５７ ４１ 30 １−４２５、およびＪ Ａｒｉｋｋａｔｈ ａｎｄ Ｋ Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｃｕｒｒ ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３， １３：２９８ −３０７を参照されたく、それらのすべての教示は引用により本明細書に組み込まれてい る。）： 【０６１７】 ＣａＶサブユニットには、ＣＡＣＮＡ１Ｓ （α１Ｓ）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（α１Ｃ）、 ＣＡＣＮＡ１Ｄ （α１Ｄ）、ＣＡＣＮＡ１Ｆ （α１Ｆ）、ＣＡＣＮＡ１Ａ （α１Ａ ）、ＣＡＣＮＡ１Ｂ （α１Ｂ）、ＣＡＣＮＡ１Ｅ （αＩＥ）、ＣＡＣＮＢ１ （β１ ）、ＣＡＣＮＢ２ （β２）、ＣＡＣＮＢ３ （β３）、ＣＡＣＮＢ４ （β４）、ＣＡ ＣＮＡ２Ｄ１ （α２δ）、ＣＡＣＮＧ１ （γ１）、およびＣＡＣＮＧ２ （γ２）が 40 挙げられるが、これらに限定されない； 【０６１８】 ＣａＶサブユニットの組み合わせには、α１Ｓβ１ａα２δγ１、α１Ｓβ１ａα２δ 、α１Ｃβ２α２δγ、α１Ｃβ３α２δγ、α１Ｄβα２δ、α１Ｆβ３α２δ、α１ Ｆβ２α２δ、α１Ａβ３α２δ、α１Ａβ４α２δ、α１Ａβ３α２δγ１、α１Ａβ ３α２δγ２、α１Ａβ４α２δγ１、α１Ａβ４α２δγ２、α１Ｂβ１α２δ、α１ Ｂβ３α２δ、α１Ｂβ４α２δ、α１Ｂβ３α２δγ２、およびα１Ｅβα２δが挙げ られるが、これらに限定されない； 【０６１９】 電位開口型ナトリウムチャネル（ＮａＶ）多重サブユニット複合体（例えば、ＷＡ Ｃ 50 (174) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ａｔｔｅｒａｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ２００５ ５７ ３９７−４０９を参照されたく、そのすべての内容は全体として引用により本明細書に 組み込まれている。）： 【０６２０】 ＮａＶサブユニットには、ＳＣＮ１Ａ （α１ ）、ＳＣＮ２Ａ （α２）、ＳＣＮ３ Ａ（α３）、ＳＣＮ４Ａ（α４）、ＳＣＮ５Ａ（α５）、ＳＣＮ８Ａ（α６）、ＳＣＮ９ Ａ（α７）、ＳＣＮ１Ｂ （β１）、ＳＣＮ２Ｂ （β２）、ＳＣＮ３Ｂ（β３）、およ びＳＣＮ４Ｂ（β４）が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６２１】 ＮａＶサブユニットの組み合わせには、α１ ／β１、α１ ／β２、α１ ／β３、 10 α１ ／β４、α１ ／β１／β２、α１ ／β１／β３、α１ ／β１／β４、α１ ／β２／β３、α１ ／β２／β４、α１ ／β３／β４、α２／β１、α２ ／β２、 α２ ／β３、α２ ／β４、α２ ／β１／β２、α２ ／β１／β３、α２ ／β１ ／β４、α２ ／β２／β３、α２ ／β２／β４、α２ ／β３／β４、α３ ／β１ 、α３ ／β３、α４ ／β１、α５ ／β１、α５ ／β２、α５ ／β３、α５ ／ β４、α５ ／β１／β２、α５／β１／β３、α５ ／β１／β４、α５ ／β２／β ３、α５ ／β２／β４、α５ ／β３／β４、α６ ／β１、α６ ／β２、α６ ／ β１／β２、α７ ／β１、α７／β２、およびα７／β１／β２が挙げられるが、これ らに限定されない； 【０６２２】 内向き整流性カリウムチャネルサブユニットには、ＫＣＮＪ２ （Ｋｉｒ２．１ ） ＫＣＮＪ１２ （Ｋｉｒ２．２）、ＫＣＮＪ４ （Ｋｉｒ２．３）、ＫＣＮＪ１４ （Ｋ ｉｒ２．４）、ＫＣＮＪ３ （Ｋｉｒ３．１ ）、ＫＣＮＪ６ （Ｋｉｒ３．２）、ＫＣ ＮＪ９ （Ｋｉｒ３．３）、ＫＣＮＪ５ （Ｋｉｒ３．４）、およびＫＣＮＪ１０ （Ｋ ｉｒ４．１ ）が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６２３】 内向き整流性カリウムチャネルサブユニットの組み合わせには、下記の表（表１）に列 挙されたものが挙げられるが、これらに限定されない： 20 (175) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表１】 10 20 30 【０６２４】 電位開口型カリウムチャネル‐ヘテロマー／多重サブユニット複合体（例えば、Ｇ Ｇ 40 ｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ２００５ ５７ ４７ ３−５０８を参照されたく、そのすべての内容は全体として引用により本明細書に組み込 まれている。）： 【０６２５】 電位開口型カリウムチャネルサブユニットには、ＫＣＮＡ１（ＫＶ１．１）、ＫＣＮＡ ２（ＫＶ１．２）、ＫＣＮＡ３（ＫＶ１．３）、ＫＣＮＡ５（ＫＶ１．５）、ＫＣＮＡ６ （ＫＶ１．６）、ＫＣＮＡ１０（ＫＶ１．８）、ＫＣＮＢ１（ＫＶ２．１）ＫＣＮＢ２（ ＫＶ２．２）、ＫＣＮＣ４（ＫＶ３．４）、ＫＣＮＤ１（ＫＶ４．１）、ＫＣＮＤ２（Ｋ Ｖ４．２）、ＫＣＮＤ３（ＫＶ４．３）、ＫＣＮＦ１（ＫＶ５．１）ＫＣＮＧ１（ＫＶ６ ．１）、ＫＣＮＧ２（ＫＶ６．２）、ＫＣＮＧ３（ＫＶ６．３）、ＫＣＮＧ４（ＫＶ６． 50 (176) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ４）、ＫＣＮＱ１（ＫＶ７．１）、ＫＣＮＱ２（ＫＶ７．２）、ＫＣＮＱ３（ＫＶ７．３ ）、ＫＣＮＱ４（ＫＶ７．４）、ＫＣＮＱ５（ＫＶ７．５）、ＫＣＮＶ１（ＫＶ８．１） 、ＫＣＮＶ２（ＫＶ８．２）、ＫＣＮＳ１（ＫＶ９．１）、ＫＣＮＳ２（ＫＶ９．２）、 ＫＣＮＳ３（ＫＶ９．３）、ＫＣＮＨ１（ＫＶ１０．１）、ＫＣＮＨ５（ＫＶ１０．２） 、ＫＣＮＨ２（ＫＶ１１．１）、ＫＣＮＨ６（ＫＶ１１．２）、ＫＣＮＨ７（ＫＶ１１． ３）、ＫＣＮＡＢ１（ＫＶβ１）、ＫＣＮＡＢ２（ＫＶβ２）、ＫＣＮＡＢ３（ＫＶβ３ ）ＫＣＮＥ１（ｍｉｎＫ）、ＫＣＮＥ２（ＭｉＲＰ１）、ＫＣＮＥ３（ＭｉＲＰ２）、Ｋ ＣＮＥ４（ＭｉＲＰ３）、ＫＣＮＥ１Ｌ（ＫＣＮＥ１様）、ＫＣＮＩＰ１、ＫＣＮＩＰ２ 、ＫＣＮＩＰ３、およびＫＣＮＩＰ４が挙げられるが、それらに限定されない； 【０６２６】 10 電位開口型カリウムチャネルサブユニットの組み合わせには、下記の表（表２）に列挙 されたものが挙げられるが、これらに限定されない： 【表２】 20 30 40 (177) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (178) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 【０６２７】 カルシウム活性化型カリウムチャネル‐ヘテロマーおよび多重サブユニット複合体（例 えば、Ａ Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ２００５； ５ ７： ４６３−４７２を参照されたく、そのすべての内容は全体として引用により本明細 30 書に組み込まれている。）： 【０６２８】 カルシウム活性化型カリウムチャネルサブユニットには、ＫＣＮＭＡ１（ＫＣａ１．１ ）、ＫＣＮＮ１（ＫＣａ２．１）、ＫＣＮＮ２（ＫＣａ２．２）、ＫＣＮＮ３（ＫＣａ２ ．３）、ＫＣＮＮ４（ＫＣａ３．１）、ＫＣＮＴ１（ＫＣａ４．１）、ＫＣＮＴ２（ＫＣ ａ４．２）、およびＫＣＮＵ１（ＫＣａ５．１）が挙げられるが、これらに限定されない ； 【０６２９】 カルシウム活性化型カリウムチャネルサブユニットの組み合わせには、下記の表（表３ ）に列挙されたものが挙げられるが、これらに限定されない： 40 (179) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表３】 10 20 【０６３０】 30 一過性受容器電位チャネル‐ヘテロマー／多重サブユニット複合体（例えば、ＤＥ Ｃ ｌａｐｈａｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ２００５； ５７（ ４）： ４２７−４５０を参照されたく、そのすべての内容は全体として引用により本明 細書に組み込まれている。）： 【０６３１】 一過性受容器電位チャネルサブユニットには、ＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ４、 ＴＲＰＣ５、ＴＲＰＣ６、ＴＲＰＣ７、ＴＲＰＶ−５、ＴＲＰＭ１、およびＴＲＰＭ１− Ｓが挙げられるが、これらに限定されない； 【０６３２】 一過性受容器電位チャネルサブユニットの組み合わせには、下記の表（表４）に列挙さ れたものが挙げられるが、これらに限定されない： 40 (180) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表４】 10 20 30 40 【０６３３】 環状ヌクレオチド調節型チャネル‐ヘテロマー／多重サブユニット複合体（例えば、Ｆ Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ２００５； ５ ７（４）： ４５５−４６２を参照されたく、それらのすべての内容が全体として引用に より本明細書に組み込まれている）； 【０６３４】 環状ヌクレオチド調節型チャネルサブユニットには、ＣＮＧＡ、ＣＮＧＢ１ａ、ＣＮＧ Ａ２、ＣＮＧＢ１ｂ、ＣＮＧＡ４、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＣＮＧ４Ａ、およびＣＮＧ Ａ１が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６３５】 50 (181) JP 2012-516687 A 2012.7.26 環状ヌクレオチド調節型チャネルサブユニットの組み合わせには、ＣＮＧＡ１／ＣＮＧ Ｂ１ａ、ＣＮＧＡ２／ＣＮＧＢ１ｂ／ＣＮＧＡ４、ＣＮＧＡ３／ＣＮＧＢ３、ＣＮＧ４Ａ ／ＣＮＧＡ２／ＣＮＧＢ１ｂ、ＣＮＧＢ１ａ／ＣＮＧＡ１、ＣＮＧＢ１ｂ／ＣＮＧＡ２／ ＣＮＧＡ４、およびＣＮＧＢ３／ＣＮＧＡ３が挙げられるが、これらに限定されない； 【０６３６】 上皮ナトリウムチャネル／デジェネリン‐ヘテロマー／多重サブユニット複合体（例え ば、Ａ Ｓｔａｒｕｓｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ， ２００５； ８８， ３９６６−３９７５、Ｈ Ｙａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ．， ２００８， ６００， ３２−３６、およびＳ Ｋｅｌｌｅｎｂｅ ｒｇｅｒ ａｎｄ Ｌ Ｓｃｈｉｌｄ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ， ２００２， ８２， 10 ７３５−７６７を参照されたく、そのすべての教示は、引用により本明細書に組み込ま れている。）： 【０６３７】 上皮ナトリウムチャネル／デジェネリンサブユニットには、が挙げられるが、これらに 限定されない；ＳＣＮＮ１Ａ （ＥＮａＣａ）；ＳＣＮＮ１Ｂ （β）、ＳＣＮＮ１Ｇ （γ）、ＳＣＮＮ１Ｄ （ＥＮａＣδ）、ＡＣＣＮ１（ＡＳＩＣ２、２つのスプライスバ リアント２ａおよび２ｂ）、ＡＣＣＮ３ （ＡＳＩＣ３）； 【０６３８】 上皮ナトリウムチャネル／デジェネリンサブユニットの組み合わせには、ＥＮａＣαβ γ、ＥＮａＣαδβγ、ＥＮａＣδβγ、ＡＳＩＣ２ａ／ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ２ａ／ 20 ＡＳＩＣ３、およびＡＳＩＣ２ｂ／ＡＳＩＣ３が挙げられるが、これらに限定されない。 【０６３９】 先に列挙したヘテロマータンパク質および本明細書のその他の箇所に開示したものにつ いて、なおも規定されるべきサブユニットのより多くの組み合わせが存在し得る。先に列 挙した組み合わせを含む細胞株は、新規の組み合わせを発現し得る該細胞株に対する基準 として使用され得、それにより、新規の組み合わせが確かめられ得る。例えば、異なるサ ブユニットの組み合わせは、同じセットの化合物に対する同じセットのサブユニットを各 々発現する異なる細胞株の異なる応答特性を特徴とし得る。例えば、下記の実施例２３を 参照されたい。 【０６４０】 30 大きな遺伝子ファミリー（例えば、ＧＡＢＡまたはアセチルコリンイオンチャネル）に よって規定されるヘテロ多量体標的に適用される方法の大規模適用によって、考えられ得 るサブユニットの組み合わせのすべてまたはサブセットについての複数の細胞株の交差比 較分析が可能となる。 【０６４１】 ある実施態様において、遺伝子活性化は、本発明の方法、細胞、および細胞株を用いて 使用される。遺伝子活性化は、例えば国際出願公報ＷＯ９４／１２６５０に説明されてお り、該公報は、引用により本明細書に組み込まれている。ある実施態様において、相同組 換えを用いて、ＥＮａＣの受容体もしくは受容体サブユニット（上皮ナトリウムチャネル ）、ＧＡＢＡＡ（Ａ型γ‐アミノ酪酸）、ＮａＶ（電位開口型ナトリウムイオンチャネル 40 ）、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制 御因子）、またはＧＣＣ（グアニル酸シクラーゼＣ）をコードする細胞における１つ以上 の内在性遺伝子の調節領域を遺伝子修飾することができ、それにより遺伝子修飾は結果的 に、遺伝子修飾の前に細胞における受容体もしくは受容体サブユニットの発現レベルに対 する、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、 ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴ Ｒ、もしくはＧＣＣの受容体もしくは受容体サブユニットの増大した発現を生じる。ある 実施態様において、遺伝子修飾は結果的に、発現の増大を少なくとも１０％、５０％、１ ００％、５００％、１０００％、５０００％、または少なくとも１０，０００％ほど生じ る。ある実施態様において、細胞は、遺伝子活性化の前の背景レベルにおいて受容体また は受容体サブユニットを発現する。 50 (182) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０６４２】 ある実施態様において、プロモータは、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、 旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣの受容体または１つ以上の受容体サブ ユニットをコードし細胞に対して内在性である配列と作用可能に連結されるよう相同組換 えを介して導入される。プロモータは、構成的に活性のあるプロモータであることができ る。特に、プロモータは、細胞において構成的に活性のあるプロモータであることができ る。他の実施態様において、プロモータは条件的プロモータである。これらの方法ととも に使用することのできる細胞は、先に説明されている。ある実施態様において、プロモー タは、細胞のゲノムへと無作為に挿入することができる。次に、蛍光発生オリゴヌクレオ チドを用いて、無作為に挿入されたプロモータが関心対象のＲＮＡの発現を活性化する細 10 胞を選択することができる。ある実施態様において、関心対象のＲＮＡは、ＥＮａＣ、Ｇ ＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣの受 容体または受容体の１つ以上のサブユニットについてであり得る。ある実施態様において 、エンハンサーまたはリプレッサーなどの調節ＤＮＡエレメントをゲノムへと無作為な位 置で挿入して、関心対象のＲＮＡがアップレギュレートもしくはダウンレギュレートする 細胞を選択する。 【０６４３】 ある実施態様において、相同組換えを用いて、細胞のゲノムへとＤＮＡを導入し、それ により内在性遺伝子を発現させる。いくつかの実施態様において、内在性遺伝子は、ＥＮ ａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧ 20 ＣＣの受容体または１つ以上の受容体サブユニットをコードする遺伝子であってよい。あ る実施態様において、導入されたＤＮＡには、抗生物質耐性（例えば、ＤＨＦＲ）をコー ドする遺伝子など、選択可能なマーカーが含まれる。ある実施態様において、内在性遺伝 子は細胞のゲノムにおいて増幅される。ある実施態様において、内在性遺伝子は、細胞の ゲノムが内在性遺伝子の２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー 、８コピー、９コピー、１０コピー、少なくとも２コピー、少なくとも５コピー、少なく とも１０コピー、少なくとも１５コピー、少なくとも２０コピー、または少なくとも２５ コピーを含むよう増幅される。ある実施態様において、増幅された遺伝子の安定した機能 的発現を有する細胞が選択される。 【０６４４】 30 また、調節配列は修飾されることができ、発現は下記に説明される遺伝的変異法によっ て達成することができる。遺伝的変異は、細胞株において生じ得、その後、ＥＮａＣ、Ｇ ＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣの受 容体または受容体の１つ以上のサブユニットを発現する細胞が、本明細書に説明される蛍 光発生オリゴヌクレオチドを用いて選択される。 【０６４５】 ある実施態様において、細胞は、遺伝子活性化または遺伝的変動の発生の適用の前に、 ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、また はＧＣＣの受容体または１つ以上の受容体サブユニットを発現する。次に、遺伝子活性化 および／または遺伝的変動の発生ならびにに選択を用いて、別の受容体もしくは同じ受容 40 体の少なくとも追加的なサブユニットを発現しおよび／または遺伝子活性化の適用もしく は遺伝的変動野発生の前に発現した受容体もしくは１つ以上の受容体サブユニットの発現 の低下したレベルを有する細胞を発生および選択する。 【０６４６】 ある実施態様において、アクセサリー因子も細胞において発現する。アクセサリー因子 は、遺伝子修飾なしで細胞において発現することができ；アクセサリー因子は導入遺伝子 として発現することができ；またはアクセサリー因子は、先に説明した遺伝子活性化およ び／もしくは遺伝的変動の発生ならびに選択を介して発現することができる。アクセサリ ー因子は、関心対象の受容体または受容体のサブユニットの転写および／または翻訳およ び／または折りたたみおよび／または細胞内局在および／または機能を促進する因子であ 50 (183) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ることができる。アクセサリー因子は、多重サブユニット受容体の組み立てを促進するこ とができる。 【０６４７】 ある実施態様において、関心対象の完全な受容体を発現する、または多重サブユニット 受容体の１、２、３、４、または５個のサブユニットを発現する細胞株が本明細書に提供 される。関心対象の多重サブユニット受容体は、例えば、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ 、甘味受容体、旨味受容体、または苦味受容体であり得る。ある実施態様において、関心 対象の受容体も多重サブユニット受容体の任意の受容体サブユニットも導入遺伝子から発 現しない。ある実施態様において、関心対象の多重サブユニット受容体の１、２、３、４ 、または５個のサブユニットは導入遺伝子から発現しない。ある実施態様において、関心 10 対象の完全な受容体または多重サブユニット受容体の１、２、３、４、または５個のタブ ユニットが、受容体または受容体サブユニットをコードする内在性遺伝子の増幅されたゲ ノム領域から発現する。 【０６４８】 ある実施態様において、ゲノムＤＮＡは、細胞の集団へとトランスフェクトまたは微量 注入され、関心対象のＲＮＡを発現する細胞が選択される。いくつかの実施態様において 、関心対象のＲＮＡは、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、苦味 受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣの受容体または受容体の１つ以上のサブユニットについ てであり得る。ゲノムＤＮＡは、関心対象のＲＮＡを発現する細胞から得られ得る。ある 実施態様において、ゲノムＤＮＡのドナー細胞は、アクセプター細胞と同じ種である。あ 20 る実施態様において、ドナー細胞は、アクセプター細胞とは異なる種である。 【０６４９】 ある実施態様において、ゲノムＤＮＡ野ドナー細胞は、ヒト、マウス、昆虫、イヌ、ロ バ、ウマ、ラット、モルモット、トリ、またはサルの細胞であることができる。ある実施 態様において、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なる種に由来するゲ ノムＤＮＡが導入される。あるより具体的な実施態様において、ゲノムＤＮＡの異なるド ナー種は、関心対象の遺伝子のオルトログを有する。他の実施態様において、ドナー種は 、関心対象の遺伝子のオルトログを有さない。 【０６５０】 ある実施態様において、ゲノムＤＮＡ断片は、ゲノムの規定された領域であり、関心対 30 象の遺伝子を含む。ある実施態様において、ゲノムＤＮＡ断片は、少なくとも１ｋｂ、５ ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、５００ｋｂ、または１０００ｋｂのサイズである。 【０６５１】 当業者に公知の任意の方法を用いて、細胞からゲノムＤＮＡを抽出することができる。 ゲノムＤＮＡを単離するための実例となる方法は、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｉ ｔｏｒｓ）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９９の第２． ２単元に説明されている。ある実施態様において、ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡの剪断を回避 するために非常に穏やかに処理される。他の実施態様において、ゲノムＤＮＡは、より小 さなＤＮＡ断片を得るために剪断される。ある実施態様において、ＤＮＡは、ＤＮＡから 40 任意のタンパク質性物質を除去するためにＤＮＡｓｅ非含有プロテアーゼで処理される。 他の実施態様において、ゲノムＤＮＡはプロテアーゼで処理されず、替わりに、ゲノムＤ ＮＡと会合したタンパク質を乱さないままにする取り扱いがとられる。ある実施態様にお いて、ＤＮＡは、ＤＮＡｓｅ非含有ＲＮＡｓｅで処理される。 【０６５２】 ゲノムＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法を用いて、細胞へと導入することができる 。ある実施態様において、ゲノムＤＮＡは、細胞へとトランスフェクトされる。より具体 的な実施態様において、ゲノムＤＮＡは、リポフェクションを用いて細胞へとトランスフ ェクトされる。ゲノムＤＮＡを細胞へと導入するための実例となる方法は、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ 50 (184) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｅｔ ａｌ． （ｅｄｉｔｏｒｓ）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ ．， １９９９の第９章において説明されている。 【０６５３】 細胞へと導入されるべきゲノムＤＮＡの最適量は、関心対象のＲＮＡを発現する細胞数 を同定することによって決定することができる。ある実施態様において、細胞あたりに導 入されるゲノムＤＮＡの量は、少なくとも１ゲノム当量、少なくとも１０−１ゲノム当量 、少なくとも１０−２ゲノム当量、少なくとも１０−３ゲノム当量、少なくとも１０−４ ゲノム当量、少なくとも１０−５ゲノム当量、少なくとも１０−６ゲノム当量、少なくと も１０−７ゲノム当量に相当する。ある実施態様において、細胞あたりに導入されるゲノ ムＤＮＡの量は、多くとも１ゲノム当量、多くとも１０−１ゲノム当量、多くとも１０− 10 ２ ゲノム当量、多くとも１０−３ゲノム当量、多くとも１０−４ゲノム当量、多くとも１ ０−５ゲノム当量、多くとも１０−６ゲノム当量、多くとも１０−７ゲノム当量に相当す る。 【０６５４】 ある実施態様において、ゲノムＤＮＡは、当業者に公知の任意の技術によって増幅する ことができる。あるより具体的な実施態様において、ゲノムＤＮＡは、全ゲノム増幅によ って増幅される。 【０６５５】 ゲノムＤＮＡが導入された細胞を同定および単離するために任意の方法を用いることが できる。ある実施態様において、マーカー遺伝子をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡと 20 同時に細胞へと導入される。マーカー遺伝子に対して陽性である細胞はまた、ゲノムＤＮ Ａを有する。当業者に公知の任意のマーカー遺伝子は、遺伝子産物が細胞に対して特定の 抗生物質に対する耐性を与える遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性）、遺伝子産物によっ て細胞が、増殖のためにこの細胞によって通常必要とされる物質を欠失している培地にお いて増殖できる遺伝子、または遺伝子産物が視覚的マーカーをコードする遺伝子が挙げら れる。本発明の方法とともに使用することのできる視覚的マーカーは、例えばＧＦＰであ る。視覚的マーカーをコードするＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが導入された細胞は、ＦＡＣ Ｓを用いて単離することができる。 【０６５６】 ある実施態様において、ゲノムＤＮＡは、微量注入を用いて細胞へと導入される。 30 【０６５７】 ある実施態様において、ゲノムＤＮＡの断片は、ゲノムＤＮＡの伝播のためにベクター へとパッケージされる。このようなベクターには、バクテリオファージ、コスミド、また はＹＡＣが挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知の任意の方法を用いて、 ゲノムＤＮＡをパッケージおよび伝播することができる。 【０６５８】 ある実施態様において、非組換え生物における関心対象の多重サブユニット受容体のサ ブユニットの化学量論と同じ化学量論のサブユニットとともに関心対象の多重サブユニッ ト受容体を発現する細胞株が本明細書に提供され、この中で、細胞株が派生した細胞は、 関心対象の多重サブユニット受容体を発現しない。ある実施態様において、多重サブユニ 40 ット受容体を発現する細胞株を含めた、受容体を発現する細胞株が本明細書に提供され、 この中で、細胞株における受容体の薬理学的特性は、生物において標的を通常発現する細 胞において受容体の薬理学的特性に対応する。関心対象の受容体または多重サブユニット 受容体は、例えば、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、苦味受容 体、ＣＦＴＲ、または ＧＣＣであることができる。ある実施態様において、細胞株は、 先に説明したとおり選択的圧力の不在下で受容体または多重サブユニット受容体を安定し て発現する。 【０６５９】 ある態様において、本発明は、天然でありかつ、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味 受容体、旨味受容体、または苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣの受容体または１つ以 50 (185) JP 2012-516687 A 2012.7.26 上の受容体サブユニットを発現する細胞を同定、単離、および濃縮するための方法を提供 する。いくつかの実施態様において、天然の細胞は、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘 味受容体、旨味受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣの受容体または１つ以上の 受容体サブユニットを天然に発現する。 【０６６０】 ある実施態様において、本明細書で説明された方法は、天然に存在する遺伝的変動およ び多様性に依存する。ある実施態様において、単離された細胞は、細胞の集団において１ ０中１、１００中１、１０００中１、１０，０００中１、１００，０００中１、１，００ ０，０００中１、または１０，０００，０００中１以下の細胞集団中の細胞個数によって 表される。細胞集団は、生物から回収された初代細胞であることができる。ある実施態様 10 において、遺伝的変動および多様性はまた、当業者に公知の天然のプロセスを用いて増大 し得る。遺伝的変動および／または多様性を作製または増大させるのに適した任意の方法 は、宿主細胞に関して実施され得る。理論によって限定されることなく、遺伝的変動に関 するこのような作製は、遺伝子コード化の調節領域、例えばＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、Ｎａ Ｖ、甘味受容体、旨味受容体、または苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣにおける修飾 を生じる。次に、このようなサブユニットを発現する細胞は、本明細書で説明されるとお り選択することができる。ある実施態様において、関心対象のタンパク質を内在的に発現 する細胞は、少なくとも５０、１００、５００、７５０、もしくは少なくとも１０００回 の継代に供した；あるいは少なくとも１、２、５、もしくは１０ヶ月間、または少なくと も１、２、５、１０年の連続増殖に供したクローン細胞株から単離される。 20 【０６６１】 他の実施態様において、遺伝的変動は、細胞を紫外線光および／またはｘ線（例えば、 γ線）に曝露することによって達成され得る。また、遺伝的変動は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤ ＮＡ、および／またはｍＲＮＡを細胞集団の細胞に導入することによって細胞集団におい て達成することができる。特定の実施態様において、ゲノムＤＮＡの断片は、先に論議し たとおり導入される。特定の実施態様において、ゲノムＤＮＡのライブラリが導入される 。特定の実施態様においてｃＤＮＡが導入される。特定の実施態様において、発現ＤＮＡ ライブラリが導入される。ある実施態様において、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／ま たはｍＲＮＡは、レシピエント細胞の細胞種類とは異なる細胞種類に由来する。特定の実 施態様において、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／またはｍＲＮＡは味覚細胞に由来す 30 る。 【０６６２】 他の実施態様において、遺伝的変動は、細胞をＥＭＳ（エチルメタンスルトナート（ｓ ｕｌｔｏｎａｔｅ））に曝露することによって達成され得る。いくつかの実施態様におい て、遺伝的変動は、細胞を突然変異原、発癌物質、または化学的作用因に曝露することに よって達成され得る。このような作用因に関する制限のない例には、亜硝酸、挿入剤、お よびアルキル化剤などの脱アミノ化剤が挙げられる。このような作用因に関する他の制限 のない例には、臭素、アジ化ナトリウム、およびベンゼンが挙げられる。 【０６６３】 具体的な実施態様において、遺伝的変動は、細胞を最適以下である増殖条件、例えば、 40 低酸素、低栄養物質、酸化的ストレス、または低窒素に曝露することによって達成され得 る。 【０６６４】 ある実施態様において、ＤＮＡ損傷を結果的に生じまたはＤＮＡ複製もしくは修復（例 えば、ミスマッチ修復）の忠実度を低下させる酵素を用いて、遺伝的変動を増大させるこ とができる。ある実施態様において、ＤＮＡ修復に関与する酵素の阻害剤が用いられる。 ある実施態様において、ＤＮＡ複製に関与する酵素の忠実度を低下させる化合物が用いら れる。ある実施態様において、ＤＮＡ損傷を結果的に生じおよび／またはＤＮＡの複製も しくは修復の忠実度を低下させるタンパク質が細胞に導入される（同時発現され、注入さ れ、トランスフェクトされ、電気穿孔される）。 50 (186) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０６６５】 ある条件または作用因への曝露の時間は、使用される条件または作用因による。いくつ かの実施態様において、数秒または数分の曝露が十分である。他の実施態様において、数 時間、数日、または数ヶ月間の曝露が必要である。当業者は、条件のどのような時間およ び強度が使用できるかに気付いているであろう。 【０６６６】 理論によって結びつけられることなく、遺伝的変動を増大させる方法は、遺伝子の転写 産物調節、例えば遺伝子活性化における変化をもたらす遺伝子のプロモータ領域における 突然変異または変化を生じ、この中で、遺伝子は、変化していないプロモータ領域を有す る遺伝子よりも高度に発現する。ある実施態様において、遺伝子は、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡ 10 Ａ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味受容体、または苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣの受 容体または受容体サブユニットをコードする。一般的に、プロモータ領域には、遺伝子転 写を調節する転写開始部位の上流のゲノムＮＤＡ配列があり、最小のプロモータおよび／ またはエンハンサーおよび／またはリプレッサー領域を含み得る。プロモータ領域は、約 ２０塩基対（ｂｐｓ）∼約１０，０００ｂｐｓまたはそれより多くにおよび得る。具体的 な実施態様において、遺伝的変動を増大させる方法は、遺伝子の転写調節における変化、 例えば、遺伝子活性化をもたらす関心対象の遺伝子のイントロンにおける突然変異または 変化を生じ、この中で、遺伝子は、変化していないイントロンを有する遺伝子よりも高度 に発現する。ある実施態様において、転写されていないゲノムＤＮＡが修飾される。例え ば、プロモータ、エンハンサー、モディファイヤー、またはリプレッサー領域が付加され 20 、欠失され、または修飾されることができる。これらの場合、修飾された調節領域の制御 下にある転写産物の転写は、読み出しとして用いることができる。例えば、リプレッサー が欠失する場合、リプレッサーによって抑制される遺伝子の転写産物は、増大した転写レ ベルについて試験される。 【０６６７】 ある実施態様において、細胞または生物のゲノムは、部位特異的変異原性または相同組 換えによって突然変異させることができる。ある実施態様において、オリゴヌクレオチド 仲介性または三重鎖仲介性組換えを採用することができる。例えば、Ｆａｒｕｑｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ ２０：９９０−１０００、およびＳｃｈｌｅｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００ 30 ８， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４３５：１７５−９０を 参照されたい。 【０６６８】 ある実施態様において、蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブまたは分子ビーコンを用 いて、遺伝子修飾が成功した細胞、すなわち、関心対象の導入遺伝子または遺伝子が発現 する細胞を選択することができる。変異原性または相同組換え事象が成功した細胞を同定 するために、突然変異誘発したまたは組換えた転写産物に特異的にハイブリッド形成する 蛍光発生オリゴヌクレオチドを使用することができる。ある実施態様において、関心対象 のタンパク質を内在的に発現する細胞が選択され、かつ細胞が関心対象のタンパク質を発 現しない細胞種類である場合、関心対象のタンパク質をコードするＲＮＡに特異的にハイ 40 ブリッド形成して、所望のタンパク質を発現する細胞を単離する蛍光発生オリゴヌクレオ チドを使用することができる。細胞の単離は、２００４年２月１７日に出されたＳｈｅｋ ｄａｒらによる米国特許第６，６９２，９６５号、およびＷＯ／２００５／０７９４６２ として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００５０８０に説明されたとおり実 施することができる。ある実施態様において、所望のシグナルに対して陽性である細胞（ すなわち、所望のＲＮＡを発現する細胞）がプールされる。このようなプールは次に、選 択の第二ラウンドに供することができる。ある実施態様において、細胞のプールは、選択 の合計少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または少 なくとも５０ラウンドに供される。 【０６６９】 50 (187) JP 2012-516687 A 2012.7.26 多量体タンパク質を発現するよう操作された細胞および細胞株は、多量体タンパク質の 複数の異なる機能的形態を含み得る。多量体タンパク質複合体を含むよう操作された同じ 細胞または細胞株は、異なる細胞培養条件下で培養する場合に、異なる機能的形態または 同じかもしくは異なる機能的形態の異なる部分を含み得る。培養条件は、温度、栄養物質 濃度、血清添加、イオン濃度、細胞密度、細胞周期の同期化、ｐＨ、酸性度、炭酸ガス飽 和、大気条件、％二酸化炭素、振蘯、撹拌、紫外線曝露、代謝産物、血清、アミノ酸、糖 類、炭水化物、タンパク質類、脂質、洗剤、増殖因子、補助因子、ビタミン、変異原、化 学物質、化合物、もしくは微量金属の活性もしくは濃度に関して変動し得る。同じ標的を 含むよう操作された異なる細胞または細胞株は、異なる機能的形態または同じかもしくは 異なる機能的形態の異なる比を含み得る。説明された方法は、同じかまたは異なる細胞培 10 養条件下で培養された同じかまたは異なる多量体タンパク質を含むよう操作された細胞ま たは細胞株の比較分析に用いられ得る。 【０６７０】 いくつかの実施態様において、多量体タンパク質を特徴付けるための、および関心対象 の多量体タンパク質の異なる形態を発現する細胞または細胞株のパネルを作製するための 方法とともに使用されるべき細胞または細胞株は、本明細書に説明されるような細胞また は細胞株であり、例えば、実質的に定常な生理学的特性を有する細胞または細胞株、タン パク質タグを含まない関心対象のタンパク質を発現する細胞または細胞株、あるいは、機 能的アッセイにおいて少なくとも０．４のＺ’因子を有する細胞または細胞株、あるいは 、選択的圧力の不在下で培養される細胞または細胞株、あるいはそれらの任意の組み合わ 20 せである。いくつかの実施態様において、使用されるべき異なる細胞株は、実質的に同一 の培養条件下で並行して維持される。本明細書に説明されたロボット法を用いて、関心対 象の多量体タンパク質の異なる形態を発現する細胞または細胞株を維持および操作し得る 。いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象の多量体タンパク質（二量体、三量 体またはより高次の多量体化）またはその１つ以上のサブユニットをコードする導入され た核酸から関心対象の該多量体タンパク質を発現する細胞または細胞株を提供し、この中 で、細胞は、選択的圧力の不在下で培養され、および／またはこの中で、タンパク質は、 本明細書に説明されるとおり一貫して発現する。 【０６７１】 いくつかの実施態様において、本発明は、複数の細胞株を含む細胞株のパネルを生じる 30 ための方法を提供し、この中で、複数の各細胞株は、関心対象の多量体タンパク質の異な る形態を合成する。関心対象の多量体タンパク質の例は、先にさらに開示されている。理 論によって結びつけられることなく、多量体タンパク質の異なる形態は、例えば、そのサ ブユニット組み合わせ、個々のサブユニットの翻訳後修飾、および／または細胞内局在に おいて異なる（例えば、細胞骨格に関して；膜貫通タンパク質について：膜への組み込み ／局在、小胞体からの出口、ゴルジ装置からの出口；および分泌型タンパク質について： 小胞体からの出口、ゴルジ装置からの出口）。いくつかの実施態様において、このような パネルは、宿主細胞の具体的なクローンまたは株を用いて出発し、該宿主細胞を操作して 、関心対象の多量体タンパク質の１つ以上のサブユニットを発現させることによって生じ ることができる。いくつかの実施態様において、１つ以上のサブユニットをコードする導 40 入遺伝子が導入される。他の実施態様において、遺伝子の活性化が採用される。１つ以上 のサブユニットを発現するよううまく操作された細胞は、当業者に公知の任意の方法によ って選択することができる。いくつかの実施態様において、陽性細胞は、蛍光発生オリゴ ヌクレオチドまたは分子ビーコンを用いて選択される（例えば、ＷＯ／２００５／０７９ ４６２として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００５０８０を参照されたい ）。細胞株は、同定された細胞から確立される。いくつかの実施態様において、結果とし て生じる細胞株は、同じ材料（例えば、同じ宿主親クローン、１つ以上のサブユニットの 発現を操作するための同じ核酸）、および同じプロトコル（例えば、同じ細胞培養法、同 じ遺伝子操作法）から生じる。理論によって結びつけられることなく、結果として生じる 細胞株は、宿主細胞のゲノムにおける任意の導入遺伝子の挿入部位に関して、および／ま 50 (188) JP 2012-516687 A 2012.7.26 たはゲノムにおける任意の導入遺伝子のコピー数に関して変動し得る。驚くべきことに、 結果として生じる細胞株が多量体タンパク質の異なる形態を合成し得ることが発見された 。多量体タンパク質の異なる形態を合成する細胞株は、各細胞株の薬理学的特性を確立す ることによって同定され得る。ある化合物は、種々の細胞株において多量体タンパク質に 及ぼすその効果について試験される。活性は、経時的にモニターされ得る。用量反応曲線 を確立することができる。ある実施態様において、少なくとも２、５、１０、２５、５０ 、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３００ ０、４０００、５０００、７５００、または少なくとも１００００の異なる化合物を細胞 株あたりで試験して、特定の細胞株によって合成された多量体タンパク質についての薬理 学的フィンガープリントを生じる。次に、各細胞株について結果として生じた薬理学的フ 10 ィンガープリントを互いに比較する。薬理学的フィンガープリントが実質的に同じである 場合、細胞株における多量体タンパク質の形態は同じである。薬理学的フィンガープリン トが実質的に同じでない場合、これらの細胞株における多量体タンパク質の形態は異なる 。 【０６７２】 ある実施態様において、多量体タンパク質の応答の質が各化合物について同じである場 合（例えば、活性化されている、阻害されている、または中性である）、形態は同じであ る。 【０６７３】 他の実施態様において、応答の質が各化合物について５０％、２５％、１０％、５％、 20 １％、または０．５％の限度内で同じである場合、形態は同じである。 【０６７４】 ある実施態様において、多量体タンパク質の応答の質が少なくとも１つの化合物につい て異なる場合（例えば、活性化されている、阻害されている、または中性である）、形態 は異なる。ある実施態様において、多量体タンパク質の応答の質が試験した化合物の少な くとも５０％、２５％、１０％、５％、１％、または０．５％異なる場合（例えば、活性 化されている、阻害されている、または中性である）、形態は異なる。他の実施態様にお いて、少なくとも１つの化合物についての応答の質が、少なくとも５０％、２５％、１０ ％、５％、１％、または０．５％の限度内にない場合、形態は異なる。他の実施態様にお いて、試験した化合物の少なくとも５０％、２５％、１０％、５％、１％、または０．５ 30 ％についての応答の質が、少なくとも５０％、２５％、１０％、５％、１％、または０． ５％の限度内にない場合、形態は異なる。当業者に公知の任意のアルゴリズムを使用して 、異なる細胞株の多量体タンパク質の薬理学的フィンガープリントを定量および比較する ことができる。 【０６７５】 いくつかの実施態様において、第一のサブユニットおよび第二のサブユニットを同時発 現する細胞における関心対象の生物活性のある多量体タンパク質の組成は、第一のサブユ ニットの薬理学的特性、第二のサブユニットの薬理学的特性、および混合型サブユニット の薬理学的特性を比較することによって分類することができる。第一のサブユニットの薬 理学的特性は、多量体タンパク質の第一のサブユニットを発現しかつ第二のサブユニット 40 を発現しない細胞において発現するであろうように、多量体タンパク質の生物活性に及ぼ す化合物の効果を表す測定された量を含むことができる。第二のサブユニットの薬理学的 特性は、多量体タンパク質の第二のサブユニットを発現しかつ第一のサブユニットを発現 しない細胞において発現するであろうように、多量体タンパク質の生物活性に及ぼす化合 物の効果を表す測定された量を含むことができる。混合型サブユニットの薬理学的特性は 、多量体タンパク質の第一のサブユニットおよび第二のサブユニットの両方を発現する細 胞において発現するであろうように、多量体タンパク質の生物活性に及ぼす化合物の効果 を表す測定された量を含むことができる。いくつかの実施態様において、関心対象の生物 活性のある多量体タンパク質は、（ｉ）第一のサブユニットの薬理学的特性が、混合型サ ブユニットの薬理学的特性と高い類似性を有し、かつ第二のサブユニットの薬理学的特性 50 (189) JP 2012-516687 A 2012.7.26 が、混合型サブユニットの薬理学的特性と低い類似性を有する場合、第一のサブユニット のホモ二量体；（ｉｉ）第二のサブユニットの薬理学的特性が、混合型サブユニットの薬 理学的特性と高い類似性を有し、かつ第一のサブユニットの薬理学的特性が混合型サブユ ニットの薬理学的特性と低い類似性を有する場合、第二のサブユニットのホモ二量体；（ ｉｉｉ）第一のサブユニットの薬理学的特性が混合型サブユニットの薬理学的特性と低い 類似性を有し、かつ第二のサブユニットの薬理学的特性が混合型サブユニットの薬理学的 特性と低い類似性を有する場合、第一のサブユニットおよび第二のサブユニットのヘテロ 二量体；または（ｉｖ）混合型サブユニットの薬理学的特性が、第一のサブユニットの薬 理学的特性および第二のサブユニットの薬理学的特性の組み合わせである場合、第一のサ ブユニットのホモ二量体と第二のサブユニットのホモ二量体との組み合わせとして分類す 10 ることができる。 【０６７６】 別の実施態様において、第一のサブユニットおよび第二のサブユニットを同時発現する 細胞における関心対象の生物活性のある多量体タンパク質の組成は、関心対象の細胞の薬 理学的特性を、第一のサブユニットの薬理学的特性、第二のサブユニットの薬理学的特性 、および混合型サブユニットの薬理学的特性と比較することによって分類することができ る。いくつかの実施態様において、関心対象の生物学的に活性のある多量体タンパク質は 、（ｉ）該第一の薬理学的特性が、該第二のサブユニットの薬理学的特性と低い類似性を 、かつ該第一のサブユニットの薬理学的特性および該混合型サブユニットの薬理学的特性 と高い類似性を有する場合、第一のサブユニットのホモ二量体；（ｉｉ）該第一の薬理学 20 的特性が、該第一のサブユニットの薬理学的特性と低い類似性を、かつ該第二のサブユニ ットの薬理学的特性および該混合型サブユニットの薬理学的特性と高い類似性を有する場 合、第二のサブユニットのホモ二量体；（ｉｉｉ）該第一の薬理学的特性が該第一のサブ ユニットの薬理学的特性と低い類似性を、該第二のサブユニットの薬理学的特性と低い類 似性を、および該混合型サブユニットの薬理学的特性と低い類似性を有する場合、第一の サブユニットおよび第二のサブユニットのヘテロ二量体；または（ｉｖ）該第一の薬理学 的特性が該混合型サブユニットの薬理学的特性と高い類似性を有し、かつ該第一の薬理学 的特性が該第一のサブユニットの薬理学的特性および該第二のサブユニットの薬理学的特 性の組み合わせである場合、第一のサブユニットのホモ二量体と第二のサブユニットのホ モ二量体との組み合わせとして分類することができる。 30 【０６７７】 ある実施態様において、細胞における多量体タンパク質の生物活性に及ぼすサブユニッ トの効果は、関心対象のサブユニットを発現する細胞由来の薬理学的特性を、関心対象の サブユニットを発現しない細胞由来の薬理学的特性と比較することによって特徴づけるこ とができる。いくつかの実施態様において、試験薬理学的特性を基準薬理学的特性と比較 して、その効果を特徴付けることができる。先の実施態様において、試験薬理学的特性は 、あらかじめ選択されたサブユニットの組み合わせおよび加えて関心対象のサブユニット を発現する細胞における生物活性のある多量体タンパク質に及ぼす化合物の効果を表す測 定された量を含むことができる；基準薬理学的特性は、あらかじめ選択ｓら得たサブユニ ットの組み合わせを発現するが、関心対象のサブユニットを発現しない細胞における生物 40 活性のある多量体タンパク質に及ぼすその化合物の効果を表す測定された量を含むことが できる。関心対象のサブユニットは、あらかじめ選択されたサブユニットの組み合わせの サブユニットのうちの１つではない。関心対象のサブユニットは、試験薬理学的特性が、 基準薬理学的特性と低い類似性を有する場合、多量体タンパク質の生物活性に及ぼす効果 を有するものとして、または、試験薬理学的特性が基準薬理学的特性と高い類似性を有す る場合、多量体タンパク質の生物活性に何ら効果を及ぼさないものとして特徴づけること ができる。 【０６７８】 薬理学的特性は、薬理学的特性間の類似性の測定結果を計算することなどだがそれに限 定されない、薬理学的特性間の相関を計算ことによって比較することができる。 50 (190) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０６７９】 ある実施態様において、２つの薬理学的特性は、薬理学的特性のうちの１つにおける測 定された量が、他の薬理学的特性における測定された量の少なくとも２％、約５％、約８ ％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％内 である場合、相関していると考えることができる。 【０６８０】 ある実施態様において、２つの薬理学的特性は、該特性間で計算された類似性の測定結 果が、所定の閾値を上回る場合、互いに対して高い類似性を有すると考えることができ、 または該特性間で計算された類似性の測定結果が所定の閾値を下回る場合、互いに対して 低い類似性を有すると考えることができる。いくつかの実施態様において、所定の閾値は 10 、薬理学的特性のうちの１つにおける測定された量が、他の薬理学的特性における測定さ れた量の約２％、約５％、約８％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％ 、約３０％、または約３５％内であることを示す類似性の測定結果の値として決定するこ とができる。 【０６８１】 いくつかの実施態様において、関心対象の化合物の薬理学的特性は、ベクトルｐとして 表すことができ、 【数３】 【０６８２】 20 式中、ｐｉは、ｉ番目の構成要素、例えば、多量体タンパク質の関心対象のサブユニッ トを発現する細胞のｉ番目の生物活性に及ぼす化合物の効果の測定された量である。いく つかの実施態様において、ｎは、２超、１０超、１００超、２００超、５００超、１００ ０超、２０００超、２５００超、７５００超、１０，０００超、２０，０００超、２５， ０００超、または３５，０００超である。また、各薬理学的特性は、ベクトルｐとして表 すことができる。相関を計算する上で、関心対象の化合物についての薬理学的特性を表す ベクトルにおけるｉ番目の構成要素の測定された量は、各構成要素についての薬理学的特 性を表すベクトルのｉ番目の構成要素の相当する測定された量と比較することができ、ｉ ＝１…ｎである。しかしながら、相関を計算することのできる多くの方法がある。実際、 関心対象の化合物の薬理学的特性と薬理学的特性間に相関があるかどうかを同定するため 30 に、２つのデータセットが関連している確率を決定するための当技術分野における任意の 統計方法が本発明の方法に従って使用され得る。例えば、関心対象の化合物の薬理学的特 性（ｐｉ１）と各薬理学的特性（ｐｉ２）との間の相関は、類似性計量ｓｉｍ（ｐｉ１， ｐｉ２）を用いて計算することができる。類似性計量ｓｉｍ（ｐｉ１， ｐｉ２）を計 算する１つの方法は、ユークリッド距離の負の平方を計算することである。代替的な実施 態様において、ユークリッド距離以外の計量は、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、 ベクトル間の角度、相関距離、標準化されたユークリッド距離、マハラノビス距離、平方 ピアソン相関係数、またはミンコフスキー距離など、ｓｉｍ（ｐｉ１， ｐｉ２）を計算 するのに使用することができる。いくつかの実施態様において、ピアソン相関係数、平方 ユークリッド距離、ユークリッド平方和、または平方ピアソン相関係数を用いて類似性を 40 決定する。このような計量は、例えば、ＳＡＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉ ｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃａｒｙ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎ ａ）またはＳ−Ｐｌｕｓ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて計算することができる。このような 計量の使用は、Ｄｒａｇｈｉｃｉ， ２００３， Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏ ｌｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ， 第１１章において説明されており、このような目 的のために、そのすべての内容は全体として引用により本明細書に組み込まれている。 【０６８３】 また、相関は、順位に基づいて計算することもでき、式中、ｘｉおよびｙｉは、昇べき 50 (191) JP 2012-516687 A 2012.7.26 の順または降べきの順で測定された量の値の順位である。例えば、Ｃｏｎｏｖｅｒ， Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２ｎｄ ｅ ｄ．， Ｗｉｌｅｙ， （１９７１）を参照されたい。また、Ｓｈａｎｎｏｎの相互情報 量は、類似性の測定として使用することができる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ， Ａｎ Ｉｎ ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ： Ｓｙｍｂｏｌ ｓ， Ｓｉｇｎａｌｓ， ａｎｄ Ｎｏｉｓｅ， Ｄｏｖｅｒ， （１９８０）を参照さ れたく、そのすべての内容は全体として引用による本明細書に組み込まれている。 【０６８４】 本発明のいくつかの実施態様は、図２に示されるプログラムモジュールの任にまたはす べてを含むコンピュータプログラム産物を提供する。プログラムモジュールの態様は、下 10 記にさらに説明する。 【０６８５】 当業者に公知の任意のアッセイを用いて、関心対象の多量体タンパク質の活性をアッセ イすることができ、それにより薬理学的フィンガープリントを確立することができる。こ のようなアッセイの例は、下記にさらに説明される。本発明の方法とともに使用されるべ き任意のアッセイは、高処理量フォーマットで実施することができる。 【０６８６】 いくつかの実施態様において、本発明のパネルは、ＨＴＳにおいてまたは医薬化学との 併用で使用して、１つまたは１セットの標的に対して選択的である化合物を試験および同 定し得；特に活性が関心対象の多量体タンパク質の特定の形態に特異的である化合物を同 20 定し得、または活性のあるパターンまたは特性を有し得る。化合物を用いるインビボ試験 を含めた二次試験を用いて、インビボでの相当する標的（ｔａｒｇｅｔ）または標的（ｔ ａｒｇｅｔｓ）の存在、役割、および機能を決定し得る。（試験方法は多様であり、脳撮 像研究、動物研究、結合研究、行動モデル、ＰＥＴ走査、ＮＭＲＩなどを含む。） 【０６８７】 本発明は、多量体タンパク質の組成を特徴付けることを提供する。理論によって結びつ けられることなく、機能的基準によって特徴づけられる多量体タンパク質は、多量体タン パク質の特異的化学量論または異なる特異的化学量論の組み合わせもしくはレベルを反映 し得る。ある実施態様において、多量体タンパク質は、多量体タンパク質を発現するよう 操作された細胞において発現する。 30 【０６８８】 いくつかの実施態様において、二量体の組成は、本発明の方法を用いて決定される。 【０６８９】 いくつかの実施態様において、本発明の方法によって、特定の細胞における二量体が、 ａ）第一のサブユニットのホモ二量体；ｂ）第二のサブユニットのホモ二量体；またはｃ ）第一および第二のサブユニットのヘテロ二量体であるかどうかの決定が可能となる。例 えば、このような方法は、以下の工程を含み得る： 【０６９０】 工程Ａ）第二のサブユニットを発現しない細胞における第一のサブユニットの活性が試 験される。 40 【０６９１】 工程Ｂ）第一のサブユニットを発現しない細胞における第二のサブユニットの活性が試 験される。 【０６９２】 工程Ｃ）第一のサブユニットおよび第二のサブユニットの活性は、第一および第二の両 サブユニットを発現する細胞において試験される。 【０６９３】 工程Ａ、Ｂ、およびＣにおいて得られた活性を比較して、第一および第二の両サブユニ ットを発現する細胞における二量体タンパク質の組成を推定する。工程Ａにおいて決定し た活性が、工程Ｃにおいて決定した活性と等しい場合、第一および第二のサブユニットを 50 (192) JP 2012-516687 A 2012.7.26 同時発現する細胞において形成された二量体は、第一のサブユニットのホモ二量体である 。工程Ｂにおいて決定された活性が、工程Ｃにおいて決定された活性と等しい場合、第一 および第二のサブユニットを同時発現する細胞において形成された二量体は、第二のサブ ユニットのホモ二量体である。工程Ａにおいて決定された活性および工程Ｂにおいて決定 された活性が両方とも、工程Ｃにおいて決定された活性とは異なる場合、第一および第二 のサブユニットを同時発現する細胞において形成された二量体は、第一および第二のサブ ユニットのヘテロ二量体である。工程Ｃにおいて決定された活性が、工程Ａおよび工程Ｂ において観察された活性の組み合わせである場合、第一および第二のサブユニットを同時 発現する細胞は、第一のサブユニットのホモ二量体および第二のサブユニットのホモ二量 体を産生する。 10 【０６９４】 いくつかの実施態様において、化合物の経時的な活性特性を測定する。 【０６９５】 類似の工程は、三量体および他の多量体タンパク質とより高次の多量体化とのサブユニ ットの組み合わせを決定するためにとられることができる。いくつかの実施態様において 、本発明は、複数の細胞株を含む細胞株のパネルを提供し、この中で、複数の細胞株の各 細胞株は、同じプロトコルおよび同じ宿主細胞を用いて多量体タンパク質の同じサブユニ ット（ｓｕｂｕｎｉｔ）またはサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔｓ）を発現するよう操作さ れており、この中で、結果として生じる多量体タンパク質は、細胞株間で異なる。多量体 タンパク質間の差は以下であることができる：異なるサブユニットの組み合わせ、異なる 20 サブユニットの化学量論、タンパク質分解を含めた異なる翻訳後修飾、および／または１ つ以上のサブユニットの異なるスプライシング。理論によって結びつけられることなく、 細胞株間の多量体タンパク質における差は結果的に、例えば、細胞に導入されている導入 された配列のサブユニットの異なる挿入部位またはコピー数から生じ得る。いくつかの実 施態様において、多量体タンパク質は、多量体タンパク質に対して少なくとも２、５、１ ０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００、５０００、または少なくとも １０，０００の化合物の活性を測定することによって薬理学的特性を生じることを特徴と する。各細胞株のこれらの薬理学的特性を互いに比較する。薬理学的特性が同一である場 合、多量体タンパク質の組成は同じであると予測される。薬理学的特性が異なる場合、多 量体タンパク質の組成は異なると予測される。 30 【０６９６】 いくつかの実施態様におおいて、本発明は、細胞株のパネルを提供し、この中で、各パ ネルは、先に論議されるような異なる薬理学的特性によって定義されるような異なる多量 体タンパク質を各々発現する複数の細胞株を含んでおり、この中で、異なる細胞株は、同 じプロトコルおよび同じ宿主細胞株を用いて生じた。いくつかの実施態様において、細胞 培養について実質的に同じプロトコルを使用し得る。いくつかの実施態様において、パネ ルの細胞株は、並行してまたは異なる回数で、しかし一貫したまたは類似の細胞、条件、 またはプロトコルを用いて処理され得る。 【０６９７】 いくつかの実施態様において、方法は、異なる宿主細胞株から産生されるクローンに適 40 用することができる。ある具体的な実施態様において、宿主細胞株は、それらの遺伝子発 現特性において異なる。これらの実施態様において、異なる細胞株を用いて、関心対象の 多量体タンパク質のある形態の形成に及ぼす特異的補助因子または内在性に提供される因 子の効果を特徴付けることができる。 【０６９８】 特定の実施態様において、多量体タンパク質の活性は、多量体タンパク質を発現する細 胞を、多量体タンパク質を活性化しまたは阻害する化合物と接触させることによって試験 することができる。 【０６９９】 いくつかの実施態様において、ある条件下での多量体タンパク質の活性特性が決定され 50 (193) JP 2012-516687 A 2012.7.26 る。理論によって結びつけられることなく、同じ条件は、多量体タンパク質の異なる形態 に及ぼす異なる効果を有することができると考えられる。例えば、複数の異なる条件が、 多量体タンパク質に及ぼすそれらの効果について試験される。典型的な条件には以下が挙 げられる：温度、細胞培地中のイオン濃度、ＣＯ２濃度、細胞密度、細胞周期の同期化、 ｐＨ、酸性度、炭酸ガス飽和、大気条件、％二酸化炭素、振蘯、撹拌、紫外線曝露、代謝 産物、栄養物質、血清、アミノ酸、糖類、炭水化物、タンパク質、脂質、洗剤、増殖因子 、補助因子、ビタミン、変異原、化学物質、化合物、または微量金属の活性または濃度。 次に、活性特性を用いて、多量体タンパク質の組成を推定することができる。 【０７００】 いくつかの実施態様において、多量体タンパク質の薬理学的特性が決定される。例えば 10 、複数の異なる化合物を、多量体タンパク質に及ぼすそれらの効果について試験する。典 型的な化合物には、タンパク質または同じクラスもしくはファミリーのタンパク質を調節 することが公知の化合物、臨床研究において副作用を有することが公知の化合物、臨床効 能を有する化合物、薬理学的に活性があり得る化合物、組み合わせ化合物ライブラリの化 合物、化学物質化合物、合成化合物、天然化合物、ペプチド、脂質、洗剤、変異原、蛍光 化合物、またはポリマーが挙げられる。次に、薬理学的特性を用いて、多量体タンパク質 の組成を推定することができる。 【０７０１】 本発明は、関心対象のタンパク質を発現する複数の細胞株の作製を可能とする。本発明 のクローン細胞株は、このような発現の異なる絶対的および相対的なレベルを有するであ 20 ろう。このようなクローンの大きなパネルは、多くの公知の基準化合物を用いて活性につ いてスクリーニングすることができる。このように、単離された各細胞株は、タンパク質 の差次的機能的発現の活性を表す試験化合物に対する応答の「フィンガープリント」を有 するであろう。次に、細胞株は、化合物に対するこのような応答の類似性に基づいてグル ープ分けすることができる。機能的に異なる各発現特性を表す少なくとも１つの細胞株が さらなる研究のために選択することができる。次に、これらの細胞株の回収物を用いて、 多数の化合物をスクリーニングすることができる。このように、タンパク質の相当する異 なる機能的形態の１つ以上を選択的に調節する化合物が同定され得る。次に、これらの調 節剤を二次アッセイまたはインビボモデルにおいて試験して、どれがこれらのアッセイま たはモデルにおける活性を示すかを決定することができる。この関係において、調節剤を 30 基準化合物として使用して、タンパク質のどの相当する機能的形態が、採用される二次ア ッセイまたはモデル系において存在し得または役割を担い得るかを同定するであろう。こ のような試験を用いて、インビボで存在し得るタンパク質の機能的形態および生理学的に 関連のあり得る該形態を決定し得る。これらの調節剤を用いて、特定の表現型または疾患 などの生理学的機能に機能的に異なる形態のいずれが関与するかを識別し得る。 【０７０２】 いくつかの実施態様において、本発明は、関心対象のインビボでの生理学的特性につい てのインビトロ相関（「ＩＶＣ」）を生じるための方法を提供する。ＩＶＣは、異なるタ ンパク質に関するインビボでの生理学的特性、例えば、異なるタンパク質の生理学的特性 に及ぼす化合物の効果の特性を用いて化合物の活性特性を確立することによって生じる。 40 この活性特性は、インビボでの生理学的特性の代表であり、従って、生理学的特性につい てのフィンガープリントのＩＶＣである。 【０７０３】 いくつかの実施態様において、インビトロ相関は、薬剤の負の副作用についてのインビ トロ相関である。他の実施態様において、インビトロ相関は、薬剤の有益な効果について のインビトロ相関である。 【０７０４】 いくつかの実施態様において、ＩＶＣを用いて、関心対象の化合物の１つ以上の生理学 的特性を予測または確認することができる。化合物は、異なるタンパク質に対してその活 性について試験され得、結果として生じる活性特性は、本明細書で説明されたように生じ 50 (194) JP 2012-516687 A 2012.7.26 たＩＶＣの活性特性と比較される。関心対象の化合物の活性特性と最も類似の活性特性を 有するＩＶＣの生理学的特性は、関心対象の化合物の生理学的特性であると予測および／ または確認される。 【０７０５】 いくつかの実施態様において、ＩＶＣは、異なるタンパク質もしくは生物学的経路、ま たはそれらの組み合わせに対して化合物の活性をアッセイすることによって確立される。 同様に、化合物の生理学的活性を予測または確認するために、化合物のアッセイは、異な るタンパク質もしくは生物学的経路、またはそれらの組み合わせに対して試験することが できる。 【０７０６】 10 いくつかの実施態様において、本発明の方法を用いて、特定の生理学的効果が関心対象 の化合物によってどの程度生じるかを決定および／または予測および／または確認するこ とができる。ある実施態様において、本発明の方法を用いて、関心対象の化合物の生理学 的効果の組織特異性を決定および／または予測および／または確認することができる。 【０７０７】 本方法とともに使用するための細胞株は、遺伝子活性化（例えば、ＰＣＴ出願公報ＷＯ ／１９９４／０１２６５０参照）または導入遺伝子の導入を用いて操作することができる 。関心対象のタンパク質を発現する細胞は、分子ビーコンまたは蛍光発生オリゴヌクレオ チドを用いて同定することができる（例えば、２００４年２月１７日に公開されたＳｈｅ ｋｄａｒ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，６９２，９６５号およびＷＯ／２００５／ 20 ０７９４６２として公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００５０８０号参照） 。いくつかの実施態様において、細胞または細胞株を操作して、多量体タンパク質の一部 であるタンパク質サブユニットを発現させる。あるより具体的な実施態様において、細胞 または細胞株は、多量体タンパク質の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少な くとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０ 、少なくとも１１、または少なくとも１２のサブユニットを発現するよう操作される。特 定の実施態様において、活性特性は、複数の細胞株に対して生じ、この中で、各々は、多 量体タンパク質のサブユニットの異なる組み合わせを発現するよう操作されている。 【０７０８】 いくつかの実施態様において、ＩＶＣを生じるための方法とともに用いられるべき細胞 30 もしくは細胞株は、本明細書に説明された細胞もしくは細胞株であり、例えば、実質的に 定常の生理学的特性を有する細胞もしくは細胞株、タンパク質タグを含まない関心対象の タンパク質を発現する細胞もしくは細胞株、または機能的アッセイにおいて少なくとも０ ．４のＺ’因子を有する細胞もしくは細胞株、または選択的圧力の不在下で培養された細 胞もしくは細胞株、あるいはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施態様にお いて、使用されるべき異なる細胞または細胞株は、実質的に同一の培養条件下で並行して 維持される。本明細書に説明されるロボット法を用いて、細胞または細胞株を維持および 操作して、ＩＶＣを生じることができる。いくつかの実施態様において、本発明は、ＩＶ Ｃを生じるための細胞または細胞株を提供し、この中で、細胞または細胞株は、選択的圧 力の不在下で培養され、およびこの中で、細胞の少なくとも１つのタンパク質の発現は、 40 ３ヶ月間にわたって１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％ ３０％ ３５％また は４０％超ほど変動しない。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのタンパク質 の発現は、４、５、６ヶ月間、またはそれより長くにわたって、１％、５％、１０％、１ ５％、２０％、２５％ ３０％ ３５％または４０％超ほど変動しない。 【０７０９】 より具体的な実施態様において、関心対象の化合物の活性特性は、多量体タンパク質を 発現するよう操作された細胞株を用いた複数のインビトロアッセイにおいて化合物の活性 を試験することによって確立され、この中で、少なくとも２つの細胞株は、異なる多量体 タンパク質を発現する。特定の実施態様において、異なる多量体タンパク質は、多量体タ ンパク質のサブユニットの異なる組み合わせである。あるより具体的な実施態様において 50 (195) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、ＩＶＣは、多量体タンパク質の考えられ得るサブユニットの組み合わせの少なくとも０ ．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、２５％、５ ０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％に対して関心 対象の化合物を試験することによって生じる。さらにより具体的な実施態様において、す べての考えられ得るサブユニットの組み合わせが試験される。ある実施態様において、少 なくとも５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００、 ２５００、５０００、７５００、または少なくとも１００００サブユニットの組み合わせ が試験される。 【０７１０】 いくつかの実施態様において、異なる細胞株の異なる多量体タンパク質は、多量体タン 10 パク質の異なる形態であり、この中で、異なる形態は、タンパク質分解を含め、それらの サブユニットの組み合わせ、化学量論、スプライシング、および／または翻訳後修飾にお いて異なる。 【０７１１】 いくつかの実施態様において、標的または関連標的の複数の機能的形態を表すパネルに 対する失敗したおよび成功した候補薬剤の試験を用いて、特異的な標的を、臨床において 観察される有害なもしくは望ましくない副作用または治療有効性と相関させることができ る。この情報を用いて、ＨＴＳにおいて、または最大の所望のおよび最小のオフターゲッ トの活性を有する薬剤に向けての化合物の開発の間に充分に規定された標的を選択し得る 。 20 【０７１２】 あるより具体的な実施態様において、化合物のＩＶＣは、多量体タンパク質の異なるサ ブユニットの組み合わせを発現する異なる細胞株に対して化合物を試験することによって 生じる。より具体的な実施態様において、このような多量体タンパク質には、ＧＡＢＡＡ ；ＮａＶ；ＧＡＢＡＢ；ＥＮａＣ；甘味受容体；旨味受容体、および本明細書に説明され た他の多量体タンパク質など、受容体タンパク質複合体が挙げられるが、これらに限定さ れない。 【０７１３】 ある実施態様において、ＩＶＣは、ＥＮａＣ、ＧＡＢＡＡ、ＮａＶ、甘味受容体、旨味 受容体、苦味受容体、ＣＦＴＲ、またはＧＣＣを用いて生じる。下記に説明されるように 30 、化合物のＩＶＣは、特定の生理学的パラメータに及ぼす化合物の効果を表し得る。ある 実施態様において、生理学的パラメータは、機能的磁気共鳴画像法（「ｆＭＲＩ」）を用 いて測定される。また、他の撮像法も使用することができる。このような他の撮像法には 、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）；断層撮影レントゲン写真術（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ａｘ ｉａｌ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）走査；拡散光学撮像法（ｄｉｆｆｕｓｅ ｏ ｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ）（ＤＯＩ）；拡散光学断層撮影（ｄｉｆｆｕｓｅ ｏｐ ｔｉｃａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＤＯＴ）；事象関連光信号（ｅｖｅｎｔ−ｒｅｌ ａｔｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌ）（ＥＲＯＳ）；近赤外線分光法（ＮＩＲＳ） ；磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）；脳磁気図検査（ＭＥＧ）；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ） 、および単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。ある実施 40 態様において、ＩＶＣが中枢神経系（「ＣＮＳ」）に及ぼす化合物の効果を表す場合、Ｃ ＮＳにおけるｆＭＲＩパターンと相関するＩＶＣが確立され得る。ＩＶＣは、ヒトおよび 動物（家畜およびペットなど）を含めた種々の試験およびモデルにおける化合物の活性と 相関するＩＶＣが生じ得る。ヒトの疾患および傷害は、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍ ａｎｕａｌ 第１８版（ハードカバー）Ｍａｒｋ Ｈ． Ｂｅｅｒｓ（著者）Ｒｏｂｅｒ ｔ Ｓ． Ｐｏｒｔｅｒ（編者）、Ｔｈｏｍａｓ Ｖ． Ｊｏｎｅｓ（編者）に列挙され ている。精神疾患および障害は、例えばアメリカ精神医学会（共著）によるＤｉａｇｎｏ ｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉ ｓｏｒｄｅｒｓ ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ第４版（テキスト改訂版）に列挙されている。 【０７１４】 50 (196) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＧＡＢＡを用いて生じたＩＶＣは、中枢神経系傷害、不安、鎮静、外傷後ストレス障害 （ＰＴＳＤ）、記憶、学習、自閉症、てんかん、アルコール依存症、気分障害、中枢神経 系機能、中枢神経系生理学、中枢神経系発達、および／または中枢神経系の加齢に及ぼす 化合物の生理学的効果についてであり得る。生理学的効果は、疾患の少なくとも１つの症 状の低下の増大であることができる。 【０７１５】 また、ＧＡＢＡについてのＩＶＣは、以下を含む情動、気分、心の状態、感情、感覚、 または知覚についても生じ得る：幸福、満足、多幸感、躁病、興奮、期待、自己満足、不 安、うつ病、怒り、恐怖（ｆｅａｒ）、恐怖（ｔｅｒｒｏｒ）、疑い、愛、嫌悪、両価性 、感情鈍麻、嗜眠、罪悪感、専心（ｄｅｖｏｔｉｏｎ）、悲嘆、不幸感、気難しいこと（ 10 ｇｒｕｍｐｉｎｅｓｓ）、易怒性、衝動、意欲、攻撃性、敵意、激怒、傲慢、自信または その欠如、信頼、信頼の欠如、心配（ｕｎｅａｓｉｎｅｓｓ）、遅疑；楽観的な、悲観的 な、協調的な、非協調的な、役に立つ、または役に立たない態度；解放感（ａ ｓｅｎｓ ｅ ｏｆ ｆｒｅｅｄｏｍ）、精神的幸福感（ｗｅｌｌ ｂｅｉｎｇ）、達成、妥当性、 不適性、または限界；魅力的、非魅力的、性的、非性的、好ましい、好きになりにくい、 愛すべき、愛されそうにない、望ましい、または望ましくない感情；孤独の、または含ま れている／包含性の感情；社会的なグループに属しているまたは属していない；陥れられ ている、騙されている、操作されている、誤誘導されている、助けられている、励まされ ている、または落胆させられている感情；自殺の感情；リスクを取る、罪を犯す、法を破 る、責任を回避する感情；あるいは殺人を犯す感情。 20 【０７１６】 また、ＧＡＢＡについてのＩＶＣは、正または負の気分を刺激する感覚刺激についても 生じ得る。正の感覚刺激には、海風、森林、食品など、匂い感覚が含まれ得る。いくつか の実施態様において、ＧＡＢＡについてのＩＶＣは、平穏な、連続した、深い、浅い、も しくはＲＥＭ睡眠、平穏、睡眠の欠如、不眠症、不眠、睡眠障害、または睡眠中の歩行、 会話、もしくは食事を含めた鎮静または睡眠；記憶（ｍｅｍｏｒｙ）、学習、解釈、分析 、思考、記憶（ｒｅｍｅｍｂｅｒｉｎｇ）、配置、関係づけ、過去の事象の想起、短期記 憶、長期記憶もしくは認知；アルコール依存もしくは嗜癖またはアルコール依存症；内分 泌／ホルモン徴候、まばたき条件付け例、肺癌、前立腺癌、乳癌、ならびに他の癌および 癌腫；グルコース代謝応答、無酸素症、プロスタグランジン誘発性熱産生、心臓圧受容器 30 反射、ならびに他の反射異常；ならびに自閉症を含めた精神障害について生じ得る。 【０７１７】 苦味受容体を用いて生じたＩＶＣは、肥満、糖吸収、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ） 分泌、または血中グルコース調節に及ぼす生理学的効果についてであり得る。生理学的効 果は、食欲、全体的な栄養状態、栄養物質吸収の程度もしくは速度、肥満（増加もしくは 減少）、糖吸収の程度もしくは速度、ＧＬＰ分泌、または血中グルコース調節のアップレ ギュレーションまたはダウンレギュレーションであり得る。あるいは、ＩＶＣはまた、食 品および／または薬剤における苦味と相関し得る。 【０７１８】 いくつかの実施態様において、苦味受容体を用いるＩＶＣは、腸における活性（例えば 40 、ＧＬＰ分泌もしくは他の腸ホルモンの分泌）、血中グルコースの制御もしくは平衡、糖 尿病、摂食、飢餓、食欲、栄養物質吸収、体重減少、エネルギーについて生じ得る。他の 実施態様において、苦味受容体を用いたＩＶＣは、大衆薬および異なる異性体の薬剤を含 めた、所望のもしくは望ましくない苦味／飲料もしくは食品成分もしくは薬剤の無味化（ ｏｆｆ−ｔａｓｔｅ）のために；食品の好みのために；摂食障害（例えば、過食症、食欲 不振、ダイエット）のために；化合物の感覚知覚もしくは味覚のために；または味覚もし くは苦味受容体の質の制御または飲料もしくは食品成分もしくは薬剤のＧＰＣＲ活性のた めに生じ得る。他の実施態様において、苦味受容体を用いるＩＶＣは、以下のために生じ 得る：活性化合物に応じたニューロンの発火もしくは中枢神経系の活性；悪心、嘔吐（薬 剤もしくは他の化合物によって引き起こされる悪心、例えば、化学療法誘発性の悪心およ 50 (197) JP 2012-516687 A 2012.7.26 び嘔吐（ＣＩＮＶ）を含む。）；苦くないＧＰＣＲにおける化合物の活性；口腔において 活性があるが他所ではなく（例えば、腸内では活性がない）、およびその逆もまた真であ る苦味化合物または苦味調節化合物。ある実施態様において、組織特異的様式で苦味受容 体を活性化し、阻害し、または調節する化合物を用いて、血中グルコースレベル、グルコ ース吸収を調節し、および／または嘔吐もしくはＣＩＮＶを予防することができ、ここで 、調節活性は、腸においては望ましいが口腔においては望ましくない。ある実施態様にお いて、口腔においてのみ活性のある苦味調節化合物は、腸における生理学的活性を望まな い風味適用において使用することができる。 【０７１９】 甘味受容体を用いて生じたＩＶＣは、食欲、栄養状態、栄養物質吸収、肥満、糖吸収、 10 ＧＬＰ分泌、または血中グルコース調節に及ぼす生理学的効果についてであり得る。生理 学的効果は、食欲、全体的な栄養状態、栄養物質吸収の程度もしくは速度、肥満（増加も しくは減少）、糖吸収の程度もしくは速度、またはＧＬＰ分泌、または血中グルコース調 節のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであり得る。 【０７２０】 いくつかの実施態様において、甘味受容体を用いるＩＶＣは、以下について生じ得る： 天然および人工の高強度甘味料（例えば、サッカリン、アスパルテーム、シクラミン酸、 モグロシド（ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ）、ステビアおよびその構成要素、アセスルファムＫ、 ネオテーム、スクラロース、およびこれらの混合物）を含めた、長引く／長く持続する／ 長時間の／無味化したもしくは後味の甘味化合物；食品の好みのために；摂食障害（例え 20 ば、過食症、食欲不振、もしくはダイエット）のために；腸における活性（例えば、ＧＬ Ｐ分泌もしくは他の腸ホルモンの分泌）、血中グルコースの制御もしくは平衡、糖尿病、 摂食、飢餓、食欲、栄養物質の吸収、体重減少、またはエネルギー；大衆薬および異なる 立体異性体の薬剤を含めた、所望の、望ましくない、もしくは無味化した飲料、食品、も しくは薬剤成分；科ｋ号物の感覚知覚もしくは味覚；活性化合物に応じたニューロンの発 火もしくは中枢神経系の活性；薬剤もしくは他の化合物によって生じた悪心を含めた嘔吐 （例えば、ＣＩＮＶ）；飲料、食品、もしくは薬剤成分の味もしくはＧＰＣＲ惹起活性の 質的制御；口腔において活性があるが他所ではなく（例えば、腸内では活性がない）、お よびその逆もまた真である甘味化合物もしくは甘味調節化合物。ある実施態様において、 組織特異的様式で甘味受容体を活性化し、阻害し、または調節する化合物を用いて、血中 30 グルコースレベル、グルコース吸収を調節し、および／または嘔吐もしくはＣＩＮＶを予 防することができ、ここで、調節活性は、腸においては望ましいが口腔においては望まし くない。ある実施態様において、口腔においてのみ活性のある苦味調節化合物は、腸にお ける生理学的活性を望まない風味適用において使用することができる。 【０７２１】 旨味受容体を用いてＩＶＣを生じる場合、ＩＶＣは、食欲、栄養状態、栄養物質の吸収 、肥満、糖吸収、ＧＬＰ分泌、血中グルコースの調節、またはアミノ酸吸収に及ぼす生理 学的効果のためであり得る。生理学的効果は、食欲、全体的な栄養状態、栄養物質吸収の 程度もしくは速度、肥満（増加もしくは減少）、糖吸収の程度もしくは速度、またはＧＬ Ｐ分泌、または血中グルコースの調節であり得る。 40 【０７２２】 旨味受容体を用いるＩＶＣは、以下について生じることができる：食品の好み；摂食障 害（例えば、過食症、食欲不振、もしくはダイエット）；腸における活性（例えば、（例 えば、ＧＬＰ分泌もしくは他の腸ホルモンの分泌）、血中グルコースの制御もしくは平衡 、糖尿病、摂食、飢餓、食欲、栄養物質の吸収、体重減少、またはエネルギー；所望の、 望ましくない、もしくは無味化した飲料、食品、もしくは大衆薬および異なる立体異性体 の薬剤を含めた薬剤成分；化合物の感覚知覚もしくは味覚；活性化合物に応じたニューロ ンの発火もしくは中枢神経系活性；薬剤もしくは他の化合物によって生じた悪心を含めた 悪心／嘔吐（例えば、ＣＩＮＶ）；飲料、食品、もしくは薬剤成分の味もしくはＧＰＣＲ 惹起活性の質的制御；口腔において活性があるが他所ではなく（例えば、腸内では活性が 50 (198) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ない）、およびその逆もまた真である旨味化合物もしくは旨味調節化合物。ある実施態様 において、組織特異的様式で旨味受容体を活性化し、阻害し、または調節する化合物を用 いて、血中グルコースレベル、グルコース吸収を調節し、および／または嘔吐もしくはＣ ＩＮＶを予防することができ、ここで、調節活性は、腸においては望ましいが口腔におい ては望ましくない。ある実施態様において、口腔においてのみ活性のある旨味調節化合物 は、腸における生理学的活性を望まない風味適用において使用することができる。 【０７２３】 ＥＮａＣを用いて生じたＩＶＣは、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、ＣＦ（嚢胞性線維 症）、受精能、ＩＢＳ（過敏性腸症候群）、クローン病、肺水腫、または高血圧症に及ぼ す化合物の生理学的効果についてであり得る。生理学的効果は、疾患の悪化または疾患の 10 少なくとも１つの症状の低下もしくは寛解であることができる。ＩＶＣはまた、化合物の 異なる塩味も表し得る。 【０７２４】 また、ＥＮａＣを用いるＩＶＣは、以下についても生じることができる：食品の好み； 摂食障害（例えば、過食症、食欲不振、ダイエット）；粘液の調節、分泌、質、クリアラ ンス、産生量、粘度、または濃厚度；上皮組織を通じての水の吸収、保持、平衡、通過、 または輸送（特に、肺、腎臓、脈管組織、眼、腸、小腸、および大腸）；活性化合物に応 じたニューロンの発火またはＣＮＳ活性；肺の徴候；腸の洗浄、過敏性腸症候群（ＩＢＳ ）、薬剤誘発性（すなわち、オピオイド）便秘、寝たきり患者の便秘／ＣＩＣ、急性感染 性下痢症、大腸菌、コレラ、ウイルス性胃腸炎、ロタウイルス、吸収不良症候群の調節、 20 小児下痢症（ウイルス性、細菌性、原生動物性）、ＨＩＶ、または短腸症候群などの胃腸 の徴候；精子運動能または受精能獲得などの受精能の徴候；雌性生殖器の徴候、頚管粘液 ／膣分泌物の粘度（すなわち、不適な（ｈｏｓｔｉｌｅ）頚管粘液）；精子運動能または 精子運動能に関連した頚管粘液に質に負の影響を与える化合物などの避妊；あるいは口内 乾燥、ドライアイ、緑内障、または鼻汁。 【０７２５】 ＥｎａＣを用いるＩＶＣはまた、化合物の感覚知覚または味覚について生じることもで きる。特に、ＩＶＣは、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、および／またはカルシウ ムの塩の味などの、塩味についてであることができる。塩は、硫酸塩、塩化物または他の ハロゲン化物、臭化物、リン酸塩、乳酸塩、およびその他などの異なる対イオンを有し得 30 る。特定の実施態様において、塩は、塩化カリウムまたは乳酸カリウムである。ある実施 態様において、ＩＶＣは、異なる塩の組み合わせの味覚を表す。 【０７２６】 ＣＦＴＲを用いて生じたＩＶＣは、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、ＣＦ（嚢胞性線維 症）、受精能、ＩＢＳ（過敏性腸症候群）、クローン病、肺水腫、または高血圧症に及ぼ す化合物の生理学的効果についてであり得る。生理学的効果は、疾患の少なくとも１つの 症状の増大または低下であることができる。 【０７２７】 また、ＣＦＴＲを用いるＩＶＣは、以下についても生じることができる：粘液の調節、 分泌、質、クリアランス、産生量、粘度、または濃厚度；上皮組織を通じての水の吸収、 40 保持、平衡、通過、または輸送（特に、肺、腎臓、脈管組織、眼、腸、小腸、大腸）；化 合物の感覚知覚または味覚；活性化合物に応じたニューロンの発火またはＣＮＳ活性；肺 の徴候；腸の洗浄、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、薬剤誘発性（すなわち、オピオイド）便 秘、寝たきり患者の便秘／ＣＩＣ、急性感染性下痢症、大腸菌、コレラ、ウイルス性胃腸 炎、ロタウイルス、吸収不良症候群の調節、小児下痢症（ウイルス性、細菌性、原生動物 性）、ＨＩＶ、または短腸症候群などの胃腸の徴候；精子運動能または受精能獲得などの 受精能の徴候；雌性生殖器の徴候、頚管粘液／膣分泌物の粘度（すなわち、不適な頚管粘 液）；精子運動能または精子運動能に関連した頚管粘液に質に負の影響を与える化合物な どの避妊；あるいは口内乾燥、ドライアイ、緑内障、または鼻汁；あるいは内分泌徴候、 すなわち嚢胞性線維症患者における膵臓機能。 50 (199) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０７２８】 ＮａＶを用いて生じたＩＶＣは、疼痛に及ぼす生理学的効果についてであり得る。生理 学的効果は、疼痛の増大または低下であることができる。 【０７２９】 また、ＮａＶを用いたＩＶＣは、以下についても生じることができる：疼痛（慢性痛、 急性痛、心臓痛、筋肉痛、骨痛、臓器痛、疲労、過剰刺激によって生じる疼痛、擦過創、 身体に有害なまたは内部の損傷、癌由来の疼痛、身体損傷由来の疼痛、知覚された疼痛、 幻肢痛、衰弱疼痛を含む。）、活動電位、ニューロンのシグナル伝達、またはニューロン 情報の伝達の発生または伝播；あるいは、筋肉または心臓の徴候あるいは筋肉または心筋 にインビボで及ぼす化合物の活性について。 10 【０７３０】 ＧＣＣを用いて生じたＩＶＣは、以下についてであることができる：以下を含む胃腸の 徴候： 便秘症、ＩＢＳ−Ｃ（便秘症）、ＩＢＳ−Ｄ（下痢症）、またはＩＢＳ−Ｍ（混合型）を 含めたＩＢＳ（過敏性腸症候群）、慢性特発性便秘症、オピオイドまたは薬物誘発性便秘 症、寝たきり患者または老人性患者における便秘症、急性感染性下痢症（例えば、細菌、 大腸菌、サルモネラ、コレラによって仲介される、特に旅行者の下痢症）、ウイルス性胃 腸炎、ロタウイルスの臨床徴候、吸収不良症候群、小児下痢症（ウイルス性、細菌性、原 生動物性）、短腸症候群、大腸炎（コラーゲン性、リンパ球性）、クローン病、潰瘍性大 腸炎、憩室炎、嚢胞性線維症、またはペティック（ｐｅｔｉｃ）潰瘍；粘液および／また 20 は上皮性の液の吸収および分泌の調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）／調節（ｍｏｄｕｌａｔ ｉｏｎ）；嚢胞性線維症などの肺の徴候、腎機能、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂ ｒｏｓｉｓ）、心肥大、高血圧症、眼の障害（すなわち、常染色体優性網膜色素変性およ びレーバー先天黒内障）、増殖障害、低身長、脳卒中、および他の脈管損傷；記憶もしく はうつ病などの中心神経系の徴候；または炎症性障害（すなわち、関節リウマチ）。 【０７３１】 匂い物質受容体を用いて、正のまたは負の気分を刺激する感覚刺激についてＩＶＣを生 じ得る。正の気分を刺激する感覚刺激には、海風、森林の香り、または食品の香りなどの 喜ばしい匂いが含まれ得る。正の気分を刺激する感覚刺激には、喜ばしくない匂いが含ま れ得る。ＩＶＣは、以下の正のまたは負の情動を刺激する感覚刺激について生じ得る：幸 30 福、満足、多幸感、躁病、興奮、期待、自己満足、不安、うつ病、怒り、恐怖（ｆｅａｒ ）、恐怖（ｔｅｒｒｏｒ）、疑い、愛、嫌悪、両価性、感情鈍麻、嗜眠、罪悪感、専心（ ｄｅｖｏｔｉｏｎ）、悲嘆、不幸感、気難しいこと（ｇｒｕｍｐｉｎｅｓｓ）、易怒性、 衝動、意欲、攻撃性、敵意、激怒、傲慢、自信またはその欠如、信頼、信頼の欠如、心配 （ｕｎｅａｓｉｎｅｓｓ）、遅疑；楽観的な、悲観的な、協調的な、非協調的な、役に立 つ、または役に立たない態度；解放感（ａ ｓｅｎｓｅ ｏｆ ｆｒｅｅｄｏｍ）、精神 的幸福感（ｗｅｌｌ ｂｅｉｎｇ）、達成、妥当性、不適性、または限界；魅力的、非魅 力的、性的、非性的、好ましい、好きになりにくい、愛すべき、愛されそうにない、望ま しい、または望ましくない感情；孤独の、または含まれている／包含性の感情；社会的な グループに属しているまたは属していない感情；陥れられている、騙されている、操作さ 40 れている、誤誘導されている、助けられている、励まされている、または落胆させられて いる感情；自殺の感情；リスクを取る、罪を犯す、法を破る、責任を回避する感情；ある いは殺人を犯す感情。 【０７３２】 また、アセチルコリン受容体を用いて、正または負の気分を刺激する感覚刺激について ＩＶＣを生じ得る。感覚刺激には香りが含まれるが、これに限定されない。ＩＶＣは、以 下の正または負の情動、気分、心の状態、感情、感覚、または知覚を刺激する感覚市芸に ついて生じ得、以下を含む：幸福、満足、多幸感、躁病、興奮、期待、自己満足、不安、 うつ病、怒り、恐怖（ｆｅａｒ）、恐怖（ｔｅｒｒｏｒ）、疑い、愛、嫌悪、両価性、感 情鈍麻、嗜眠、罪悪感、専心（ｄｅｖｏｔｉｏｎ）、悲嘆、不幸感、気難しいこと（ｇｒ 50 (200) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｕｍｐｉｎｅｓｓ）、易怒性、衝動、意欲、攻撃性、敵意、激怒、傲慢、自信またはその 欠如、信頼、信頼の欠如、心配（ｕｎｅａｓｉｎｅｓｓ）、遅疑；楽観的な、悲観的な、 協調的な、非協調的な、役に立つ、または役に立たない態度；解放感（ａ ｓｅｎｓｅ ｏｆ ｆｒｅｅｄｏｍ）、精神的幸福感（ｗｅｌｌ ｂｅｉｎｇ）、達成、妥当性、不適 性、または限界；魅力的、非魅力的、性的、非性的、好ましい、好きになりにくい、愛す べき、愛されそうにない、望ましい、または望ましくない感情；孤独の、または含まれて いる／包含性の感情；社会的なグループに属しているまたは属していない感情；陥れられ ている、騙されている、操作されている、誤誘導されている、助けられている、励まされ ている、または落胆させられている感情；自殺の感情；リスクを取る、罪を犯す、法を破 る、責任を回避する感情；あるいは殺人を犯す感情。 10 【０７３３】 また、アセチルコリン受容体についてのＩＶＣは、中枢神経系障害、不安、鎮静、ＰＴ ＳＤ、記憶、学習、自閉症、てんかん、アルコール依存症、気分障害、および／または中 枢神経系機能、中枢神経系の生理学、中枢神経系の発達、および／または中枢神経系の加 齢に及ぼす化合物の生理学的効果についても生じ得る。生理学的効果は、疾患の少なくと も１つの症状の増大または低下であることができる。また、アセチルコリンを用いて生じ たＩＶＣは、以下についても生じることができる：平穏な、連続した、深い、浅い、もし くはＲＥＭ睡眠、平穏、睡眠の欠如、不眠症、不眠、睡眠障害、または睡眠中の歩行、会 話、もしくは食事を含めた鎮静または睡眠；記憶（ｍｅｍｏｒｙ）、学習、解釈、分析、 思考、記憶（ｒｅｍｅｍｂｅｒｉｎｇ）、配置、関係づけ、過去の事象の想起、短期記憶 20 、長期記憶もしくは認知；アルコール依存もしくは嗜癖またはアルコール依存症；内分泌 ／ホルモン徴候、まばたき条件付け例、肺癌、前立腺癌、乳癌、ならびに他の癌および癌 腫；グルコース代謝応答、無酸素症、プロスタグランジン誘発性熱産生、心臓圧受容器反 射、ならびに他の反射異常；ならびに自閉症を含めた精神障害；中枢神経系の徴候、慢性 痛、てんかん、痙攣薬（ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ）、嗜癖、依存症；内分泌／ホルモン徴候 、まばたき条件付け例、肺癌、前立腺癌、乳癌、ならびに他の癌および癌腫；グルコース 代謝応答、無酸素症、プロスタグランジン誘発性熱産生、心臓圧受容器反射、ならびに他 の反射異常；ならびに自閉症を含めた精神障害 【０７３４】 いくつかの実施態様において、本方法とともに使用するための細胞または細胞株は、本 30 明細書の表６および７∼２２に示される１つ以上のタンパク質を発現するよう操作される 。 【０７３５】 いくつかの実施態様において、ＩＶＣは、生物の組織、生物の臓器、生物の細胞外マト リックス、生物の系（例えば、生物の免疫系）、または生物全体における化合物の生理学 的特性を表す。生物は脊椎動物であり得る。生物は哺乳類であり得る。より具体的な実施 態様において、生物は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、サル、 またはヒトである。生理学的特性は、特定の細胞種類、組織、臓器、または臓器系に及ぼ す効果であることができる。例えば、生理学的特性は、哺乳類組織、健常組織、組織、罹 患した組織、癌組織、胚組織、成体組織、移植された組織、臓器組織、肝臓組織、ニュー 40 ロン組織、胃腸組織、筋肉組織、脂肪組織、皮膚、泌尿器組織、ニューロン組織、中枢神 経系、心臓脈管系、内分泌系、骨格組織、骨組織、骨、面寝器系、臓器、細胞、または特 化細胞、および本明細書に開示されたその他の細胞に及ぼす効果であることができる。い くつかの実施態様におおいて、生理学的特性は、組織保護活性、抗炎症活性、神経刺激性 であり、または、以下を含むがこれらに限定されない物質もしくは化合物の活性に類似の 活性を有する：アダマンタン抗ウイルス薬、アドレナリン性気管支拡張薬、高血圧性緊急 症のための薬剤、肺高血圧症のための薬剤、抗アメーバ薬、鎮痛薬の組み合わせ、鎮痛薬 、アンドロゲンおよびタンパク質同化ステロイド、アンギオテンシンＩＩ阻害薬、食欲抑 制薬、制酸薬、駆虫薬、抗血管新生点眼薬、抗感染薬、抗狭心症薬、抗不整脈薬、抗喘息 薬の組み合わせ、抗生物質／抗悪性腫瘍薬、抗コリン薬制吐薬、抗コリン性抗パーキンソ 50 (201) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ン病薬、抗コリン性気管支拡張薬、抗コリン薬／鎮痙薬、抗凝固薬、抗痙攣薬、抗うつ薬 、抗糖尿病薬、抗糖尿病薬の組み合わせ、止痢薬、解毒薬、制吐薬／抗めまい薬、抗真菌 薬、抗痛風薬、抗ヒスタミン薬、抗高脂血症薬、抗高脂血症薬の組み合わせ、抗高血圧症 薬の組み合わせ、尿酸降下薬、抗マラリア薬、抗マラリア薬の組み合わせ、抗マラリア性 キノリン、代謝拮抗薬、抗片頭痛薬、抗悪性腫瘍性解毒薬、抗悪性腫瘍性インターフェロ ン、抗悪性腫瘍性モノクローナル抗体、抗悪性腫瘍薬、抗パーキンソン病薬、抗血小板薬 、抗シュードモナス性ペニシリン、抗乾癬薬、統合失調症治療薬、抗リウマチ薬、消毒薬 および殺菌薬、抗毒素およびアンチベニン、抗結核薬、抗結核薬の組み合わせ、鎮咳薬、 抗ウイルス薬、抗ウイルス薬の組み合わせ、抗ウイルス性インターフェロン、抗不安薬、 鎮静薬、および睡眠薬、胆汁酸捕捉剤、気管支拡張薬、心臓緊張薬（ｃａｒｄｉａｃ ｓ 10 ｔｒｅｓｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、キレート薬、コリン性筋刺激薬、中枢神経系刺激薬、 凝固修飾因子、避妊薬、鬱血除去薬、消化酵素、利尿薬、ドーパミン性抗パーキンソン病 薬、アルコール依存に用いられる薬剤、去痰薬、第Ｘａ因子インヒビター、脂肪酸誘導性 抗痙攣薬、機能的腸障害薬、胆石可溶化薬、全身麻酔薬、尿生殖器薬、胃腸管刺激薬、グ ルコース上昇薬、糖タンパク質血小板阻害薬、成長ホルモン受容体遮断薬、造血幹細胞動 員薬、ヘパリン拮抗薬、ホルモン補充療法薬、ホルモン／抗悪性腫瘍薬、免疫抑制薬、性 交不能症薬、インビボ診断用生物製剤、インクレチン模倣薬、変力薬（ｉｎｏｔｒｏｐｉ ｃ ａｇｅｎｔ）、緩下薬、ハンセン病治療薬、注射可能な局所麻酔薬、肺界面活性物質 、リンパ性染色薬、リソソーム酵素、粘液溶解薬、筋弛緩薬、散瞳薬、点眼用緑内障薬、 点眼用の潤滑剤および洗浄液、殺精子薬、血管拡張薬、または昇圧薬。 20 【０７３６】 いくつかの実施態様において、ＩＶＣは、ウイルス、真菌、または酵母に及ぼす関心対 象の化合物の生理学的効果を表す。このような化合物は、例えば、ウイルス、細菌、真菌 、および／または酵母に対する抗生物質として有用である。 【０７３７】 関心対象の特定の多量体タンパク質に対する関心対象の化合物の活性を試験および／ま たは確認するアッセイは、多量体タンパク質の生物活性に依存する。本発明の方法ととも に使用されるべき任意のアッセイは、高処理量フォーマットにおいて実施することができ る。 【０７３８】 例示的タンパク質、それらの参考文献、および可能なアッセイを以下の表（表５）に記 載する。これらの例は、記載したアッセイを記載したもの以外の対象に使用することがで き、記載した対象を、記載したもの以外の分析法によって試験することができるので、非 限定的である。 30 (202) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表５】 10 20 30 40 (203) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (204) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 【０７３９】 対象の化合物の活性特性および目印活性特性は、活性特性間の相関性の計算、例えばこ れらに限定されるものではないが、活性特性間の類似性の目安を計算することにより比較 することができる。目印活性特性は、データベース中の活性特性の群の１つであり得る。 目印活性特性は歴史的特性であり得る。目印活性特性のデータベースをコンピュータ可読 ストレージ媒体に保存することができる。具体的な実施形態では、データベースは、少な 40 くとも１０の目印活性特性、少なくとも５０の目印活性特性、少なくとも１００の目印活 性特性、少なくとも５００の目印活性特性、少なくとも１，０００の目印活性特性、少な くとも１０，０００の目印活性特性、または少なくとも５０，０００の目印活性特性を含 み、それぞれの目印活性特性は、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１００、少 なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２０００、少な くとも２５００、少なくとも７５００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，００ ０、少なくとも２５，０００、または少なくとも３５，０００成分の測定量を含む。対象 の化合物の活性特性は、第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク質サブユニット などの異なる多量体タンパク質の生物活性に対する対象の化合物の効果を表す測定量を含 み得る。目印活性特性は、以前に特性化された化合物の既知生理学的特性に関するインビ 50 (205) JP 2012-516687 A 2012.7.26 トロ相関性を提供する。生理学的特性は、例えばこれらに限定されるものではないが、薬 物のマイナスの副作用または薬物の有益な効果などの薬理学的特性であり得る。それぞれ の目印活性特性は、多量体タンパク質の第１タンパク質サブユニットおよび第２タンパク 質サブユニットなどの異なる多量体タンパク質の生物活性に対する、それぞれの以前に特 性化された化合物の効果を表す測定量を含み得る。いくつかの実施形態では、相関性は、 対象の化合物の活性特性と、データベースに保存された複数の目印活性特性の各目印活性 特性との間で計算することができる。相関性は、所定の多量体タンパク質の生物活性に対 する対象の化合物の影響を表す対象の化合物の活性特性における測定量を、同じ多量体タ ンパク質の生物活性に対する以前に特性化された化合物の効果を表す目印活性特性におけ る対応する測定量と比較することにより、計算することができる。対象の化合物の活性特 10 性は、目印活性特性における測定量が、対象の化合物の活性特性における測定量の約２％ 、約５％、約８％、約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、ま たは約３５％以内であるならば、目印活性特性と相関すると考えることができる。 【０７４０】 対象の化合物の活性特性と目印活性特性との間の類似性の目安があらかじめ決められた 閾値より高いならば、対象の化合物の活性特性は、目印活性特性に最も類似していると考 えることができる。具体的な実施形態では、あらかじめ決められた閾値は、目印活性特性 における測定量が、対象の化合物の活性特性における測定量の約２％、約５％、約８％、 約１０％、約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％以内で あることを示す類似性の目安の値と決めることができる。 20 【０７４１】 いくつかの実施形態では、対象の化合物の活性特性は、ベクターｐ ｐ＝［ｐ１、・・・ｐｉ、・・・ｐｎ］ 【０７４２】 （式中、ｐは、ｉ番目の成分の測定量、例えば所定の多量体タンパク質のｉ番目の生物 活性に対する対象の化合物の影響である）として表すことができる。具体的な実施形態で は、ｎは、２超、１０超、１００超、２００超、５００超、１０００超、２０００超、２ ５００超、７５００超、１０，０００超、２０，０００超、２５，０００超、または３５ ，０００超である。各目印活性特性もベクターｐとして表すことができる。相関性の計算 において、対象の化合物に関する活性特性を表すベクターにおけるｉ番目の成分の測定量 30 を、各成分ｉ＝１．．．ｎについて、目印活性特性を表すベクターのｉ番目の成分の対応 する測定量と比較することができる。しかし、相関性を計算できる方法は数多くある。実 際、２つのデータセットが関連する確率を決定するための当該技術分野における任意の統 計的方法を、本発明の方法にしたがって用いて、対象の化合物の活性特性と目印活性特性 との間に相関関係があるかどうかを確認することができる。例えば、対象の化合物の活性 特性（ｐｉ１）と各目印活性特性（ｐｉ２）との間の相関関係は、類似性メトリックｓｉ ｍ（ｐｉ１，ｐｉ２）を用いて計算することができる。類似性メトリックｓｉｍ（ｐｉ１ ，ｐｉ２）を計算するための一方法は、ユークリッド距離の負の二乗を計算することであ る。別の実施形態では、マンハッタン距離、チェビシェフ距離、ベクター間の角度、相関 距離、標準化ユークリッド距離、マハラノビス距離、ピアソン相関係数の二乗、ミンコフ 40 スキー距離などのユークリッド距離以外のメトリックを用いてｓｉｍ（ｐｉ１，ｐｉ２） を計算することができる。いくつかの実施形態では、ピアソン相関係数、ユークリッド距 離の二乗、ユークリッド二乗和、またはピアソン相関係数の二乗を用いて類似性を決定す る。そのようなメトリックは、例えば、ＳＡＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉ ｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃａｒｙ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎ ａ）またはＳ−Ｐｌｕｓ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて計算することができる。そのような メトリックの使用は、Ｄｒａｇｈｉｃｉ， ２００３， Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌ ｌ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎ， ｃｈａｐｔｅｒ １１（そのような目的に 50 (206) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ついて参照することによって全体として本明細書中に組み入れられる）に記載されている 。 【０７４３】 相関性は、順位に基づいて計算することもでき、この場合、ｘｉおよびｙｉは、数字の 昇順または降順での測定量の値の順位である。例えば、Ｃｏｎｏｖｅｒ， Ｐｒａｃｔｉ ｃａｌ Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｗ ｉｌｅｙ，（１９７１）を参照。シャノン相互情報量も、類似性の目安として用いること ができる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｉｎｆｏ ｒｍａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ：Ｓｙｍｂｏｌｓ， Ｓｉｇｎａｌｓ， ａｎｄ Ｎｏｉ ｓｅ， Ｄｏｖｅｒ，（１９８０）（その全体として参照することにより本明細書に組み 10 込まれる）を参照。 【０７４４】 当該技術分野で公知の種々の分類子を、本出願で記載する方法に従ってトレーニングす ることができ、例えばこれらに限定されるものではないが、薬理学的特性などの生理学的 特性に関して対象の化合物を分類するために使用することができる。対象の化合物の活性 特性を用いて対象の化合物の生理学的特性を予測することができる分類子を得るために、 アルゴリズムを用いることができる。分類子例は前述されている。いくつかの実施形態で は、事前に特性化された化合物の目印活性特性において測定された量および事前に特性化 された化合物と関連する既知生理学的活性を用いて、分類子をトレーニングすることがで きる。 20 【０７４５】 分類子は、非管理または管理学習アルゴリズムを適用して、事前に特性化された化合物 の目印活性特性における測定された量およびこの事前に特性化された化合物と関連する既 知生理学的特性を評価することによる分類に使用されるアルゴリズムであってよい。当該 技術分野で公知の任意の標準的な非管理または管理学習技術を用いて、分類子を得ること ができる。当該技術分野で公知の非管理および管理アルゴリズムの非限定的例を以下に記 載する。本出願の開示をもとに、当業者は、他のパターン分類法または回帰法を理解し、 アルゴリズムを分類子に用いることができ、本発明はそのような全ての技術を包含する。 【０７４６】 ニューラルネットワーク。ニューラルネットワーク（例えば、二段階回帰または分類決 30 定規則）は本明細書中ですでに記載している。 【０７４７】 クラスタリング。いくつかの実施形態では、分類子は、クラスタリングを用いて学習さ せる。いくつかの実施形態では、目印活性特性を表すベクターの選択成分ｉを用いて、活 性特性をクラスター化する。いくつかの実施形態では、クラスタリングの前に、平均が０ で単位分散値を有するように正規化する。 【０７４８】 トレーニング集団全体にわたって類似したパターンの測定量を示す目印活性特性は、一 緒になってクラスター化する傾向がある。成分ｉの測定量のある特定の組み合わせは、ベ クターが特定の生理学的特性にクラスター化する場合に、本発明のこの態様では良好な分 40 類子であると見なすことができる。クラスタリングは、Ｄｕｄａ（１９７３年）の２１１ ∼２５６ページに記載されている。Ｄｕｄａ（１９７３年）の６．７章に記載されている ように、クラスタリングの問題は、データセットにおける自然的分類の知見の１つとして 記載されている。自然的分類を特定するために、２つの問題点を取り上げる。第一に、２ つの活性特性間の類似性（または相違点）を測定する方法を決定する。このメトリック（ 類似性基準）を用いて、１つのクラスターにおける活性特性が、他の活性特性に対するよ りも、互いにより類似していることを確実にする。第２に、類似性基準を用いてデータを クラスターに分割する機構を決定する。 【０７４９】 類似性基準は、Ｄｕｄａ（１９７３年）の６．７章で考察され、ここで、クラスタリン 50 (207) JP 2012-516687 A 2012.7.26 グ調査を始めるための一方法は、距離関数を定義し、活性特性対間の距離のマトリックス を計算することであると記載されている。距離が類似性の良好な目安であるならば、同じ クラスターにおける活性特性間の距離は、異なるクラスターにおける活性特性間の距離よ りも有意に小さいであろう。しかし、Ｄｕｄａ（１９７３年）の２１５ページに記載され ているように、クラスタリングは距離メトリックの使用を必要としない。例えば、非メト リック類似性関数ｓ（ｘ、ｘ’）を用いて、２つのベクターｘおよびｘ’を比較すること ができる。通常、ｓ（ｘ、ｘ’）は、ｘとｘ’とが幾分「類似」しているとその値が大き くなる、メトリック関数である。非メトリック類似性関数ｓ（ｘ、ｘ’）の一例は、Ｄｕ ｄａ（１９７３年）の２１６ページに記載されている。 【０７５０】 10 クラスタリングの他の態様は、本明細書中でさらに前述されている。 【０７５１】 主成分分析（「ＰＣＡ」）。いくつかの実施形態では、分類子は、主成分分析を用いて 学習させる。ＰＣＡは本明細書中で前述されている。 【０７５２】 ＰＣＡを用いて分類子を学習させるための一方法では、目印活性特性を表すベクターを 、クラスタリングについて前述したのと同じ方法で構築することができる。実際、各ベク ターが目印活性特性を表すベクターのセットをマトリックスと見なすことができる。いく つかの実施形態では、このマトリックスは、フリー・ウィルソンのモノマーの定性的二進 記載法（Ｋｕｂｉｎｙｉ， １９９０， ３Ｄ ＱＳＡＲ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇ 20 ｎ ｔｈｅｏｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｅｒｇａ ｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ ５８９−６３８（参照することによって 本明細書中に組み込まれる））で表され、第一の主成分（ＰＣ）が最大量の可能な分散情 報を取得し、第二の主成分（ＰＣ）は二番目に多い量の分散情報を取得するなど、マトリ ックスにおける全ての分散情報が考慮されるまで同様にして、ＰＣＡを使用して最大限に 圧縮された空間中に分散される。 【０７５３】 次いで、ベクターのそれぞれ（各ベクターはトレーニング集団（例えば、目印活性特性 ）のメンバーである）をプロットする。多種多様なプロットが可能である。いくつかの実 施形態では、一次元プロットを作製する。この一次元プロットでは、トレーニング集団の 30 メンバーのそれぞれから第１主成分の値をプロットする。この形態のプロットでは、生理 学的特性に対応する活性特性は、第１主成分値の１つの範囲に集まり、別の生理学的特性 に対応する特性は第１主成分値の第２の範囲に集まることが予想される。 【０７５４】 いくつかの実施形態では、トレーニング集団のメンバーを１より多い主成分に対してプ ロットする。例えば、いくつかの実施形態では、トレーニング集団のメンバーを二次元プ ロット上にプロットし、この場合、第１次元は第１主成分であり、第２次元は第２主成分 である。 【０７５５】 最近傍分析。最近傍分析は、本明細書中、前述されている。 40 線形判別分析。いくつかの実施形態では、分類子は線形判別分析を用いて学習させる。 線形判別分析（ＬＤＡ）は、ある目的の特性に基づいて２つのカテゴリーのうちの１つに 対象を分類することを試みる。言い換えれば、ＬＤＡは、ある実験で測定される対象属性 が当該対象のカテゴリー化を予測するかどうかを試験する。ＬＤＡは典型的には連続独立 変数および二分カテゴリー従属変数を必要とする。本発明では、トレーニング集団のサブ セット全体にわたるベクター成分ｉの選択された組み合わせについての度数は、必須の連 続独立変数としての役割を果たす。トレーニング集団の各メンバーの特性サブグループ分 類（例えば、生理学的特性）は、二分カテゴリー従属変数としての役割を果たす。 【０７５６】 ＬＤＡは、分類情報を用いて群間分散と群内分散の比率を最大にする変数の一次結合を 50 (208) JP 2012-516687 A 2012.7.26 探す。暗黙裡に、ＬＤＡにより用いられる線形加重は、トレーニングセット中のベクター 成分ｉの測定量がどのように生理学的特性の群に分かれるかに依存する。いくつかの実施 形態において、ＬＤＡはトレーニング集団中のメンバーのデータマトリックスに適用され る。次いで、トレーニング集団の各メンバーの線状判別式をプロットする。理想的には、 ある生理学的特性を表すトレーニング集団のメンバーは線形判別式値の１つの範囲（例え ば、マイナス）に集まり、そして、別の生理学的特性を表すトレーニング集団のメンバー は線形判別式値の第２の範囲（例えば、プラス）に集まる。判別式値のクラスター間の分 離がより大きいほどＬＤＡはうまくいくと考えられる。線形判別分析のさらなる情報につ いては、Ｄｕｄａ， Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ；お 10 よびＨａｓｔｉｅ， ２００１， Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉ ｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＶｅｎａ ｂｌｅｓ ＆ Ｒｉｐｌｅｙ， １９９７， Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔ ｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ ｓ−ｐｌｕｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（そ のそれぞれは、全体として参照することによって本明細書中に組み込まれる）を参照。 【０７５７】 二次判別分析。二次判別分析は、本明細書中、前述されている。 【０７５８】 サポートベクターマシン。サポートベクターマシンは本明細書中、前述されている。 【０７５９】 20 決定ツリー。決定ツリーは、本明細書中、前述されている。 【０７６０】 多変量適応性回帰スプライン。多変量適応性回帰スプラインは、前述されている。 【０７６１】 重心分類子技術（ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）。 一実施形態では、最近傍重心分類子技術を使用する。そのような技術は、様々な生理学的 特性に関して、トレーニング集団（目印活性特性）におけるベクター成分ｉの平均測定量 によって得られる重心を計算し、次いで、対象の化合物を表すベクターをそれらの重心が 最も近いクラスに割り当てる。この方法は、クラスターを既知クラスで置換する以外は、 ｋ平均クラスタリングと類似している。この方法の一例は、マイクロアレイの予測解析、 30 すなわちＰＡＭである。例えば、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ ９９；６５６７−６５７２（その全体として参照することによっ て本明細書中に組み込まれる）を参照。 【０７６２】 回帰。いくつかの実施形態では、分類子は回帰分類子、例えばロジスティック回帰分類 子である。そのような回帰分類子には、分類子を構築するために用いられる活性特性のそ れぞれの係数が含まれる。そのような実施形態では、回帰分類子の係数は、例えば最尤法 を用いて計算する。そのような計算では、ベクター成分ｉの測定量を使用する。 【０７６３】 40 分類子を学習させるための他の方法は、さらに前述されている。 【０７６４】 本発明は、コンピュータ可読ストレージ媒体に組み込まれたコンピュータプログラムメ カニズムを含むコンピュータプログラム製品として実装することができる。さらに、本発 明の方法のいずれかを、１以上のコンピュータまたは他の形態の装置で実装することがで きる。装置の例としては、コンピュータ、および測定装置（例えば、アッセイリーダーま たはスキャナー）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の 方法のいずれかを１以上のコンピュータプログラム製品に実装することができる。本発明 のいくつかの実施形態は、本出願で開示される方法のいずれかまたはすべてをコード化す るコンピュータプログラム製品を提供する。そのような方法は、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、 50 (209) JP 2012-516687 A 2012.7.26 磁気ディスクストレージ製品、または任意の他のコンピュータ可読データもしくはプログ ラムストレージ製品に保存することができる。そのようなコンピュータで読取り可能なス トレージ媒体は、有形の物理的対象（搬送波と対照的に）であることが意図される。その ような方法は、永久的ストレージ（例えばＲＯＭ、１以上のプログラム可能なチップまた は１以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ））中に埋め込むこともできる。そのような 永久的ストレージは、サーバー、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１無線ブリ ッジ／ステーション、リピーター、ルーター、携帯電話、または他の電子装置においてロ ーカライズすることができる。コンピュータプログラム製品においてコード化されるその ような方法は、インターネットまたは他の方法により、コンピュータデータシグナル（こ の中にソフトウェアが組み込まれる）の伝送によって、デジタル的または搬送波上（搬送 10 波のそのような使用は配布のためであって、ストレージのためでないことは明らかであろ う）のいずれかで電子的に配布することもできる。 【０７６５】 本発明のいくつかの実施形態は、図３に示すプログラムモジュールの一部または全部を 含むコンピュータプログラム製品を提供する。これらのプログラムモジュールは、ＣＤ− ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスクストレージ製品、または任意の他のコンピュータ可読デー タまたはプログラムストレージ製品に保存することができる。プログラムモジュールは、 永久的ストレージ、例えばＲＯＭ、１以上のプログラム可能なチップ、または１以上の特 定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）に組み込むこともできる。そのような永久的ストレージ 媒体は、サーバー、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１無線ブリッジ／ステー 20 ション、リピーター、ルーター、携帯電話、または他の電子装置においてローカライズす ることができる。コンピュータプログラム製品におけるソフトウェアモジュールは、イン ターネットまたは他の方法を介して、デジタルでまたは搬送波でのいずれかによるコンピ ュータデータシグナル（その中にソフトウェア・モジュールが組み込まれている）の伝送 によって、電子的に配布することもできる。 【０７６６】 具体的な実施形態において、コンピュータプログラムは、ユーザー、ユーザーのインタ ーフェース機器、コンピュータ可読ストレージ媒体、モニター、ローカルコンピュータ、 またはネットワークの一部であるコンピュータに対して請求された方法の結果の出力を行 う。そのようなコンピュータ可読ストレージ媒体は、（搬送波と対照的に）有形の物理的 30 対象であることが意図される。本発明は、十分に特性化されていないタンパク質の細胞系 を作製する方法も提供する。そのようなタンパク質について、多くの場合、既知化合物に 対するそれらの機能的反応の性質に関する情報は乏しい。このようにクローンの活性を評 価するための確立された機能的基準がないことは、生理学的に関連した細胞系の産生にお ける１つの課題であり得る。前記方法は、そのような情報がない十分特性化されていない タンパク質についても、生理学的に関連した細胞系を得る方法を提供する。タンパク質の 生理学的に関連した形態を含む細胞系は、１つのタンパク質を含む遺伝子の発現から得る ことができる複数または全部の機能的形態を表すクローンを追求することにより得ること ができる。 【０７６７】 40 本発明の細胞および細胞系を用いて、タンパク質のインビボ形態の同一性を既知形態の タンパク質の同一性と種々のモジュレータに対するそれらの反応に基づいて関連付けるこ とにより、様々な形態の対象のタンパク質の様々な病状における役割を特定することがで きる。これにより、タンパク質と関連する病状の高度に標的化された治療についての疾患 特異的または組織特異的モジュレータの選択が可能になる。 【０７６８】 モジュレータを同定するために、本発明の細胞または細胞系を、タンパク質が機能的で あると予想される条件下で試験化合物に暴露し、次いで好適な対照、例えば試験化合物に 暴露されない細胞と比較して、タンパク質活性において統計的に有意な変化（例えば、ｐ ＜０．０５）を検出する。既知アゴニストまたは拮抗物質および／または対象のタンパク 50 (210) JP 2012-516687 A 2012.7.26 質を発現する細胞を用いた正および／または負の対照も用いることができる。当業者は、 種々のアッセイパラメータ、例えばシグナル対ノイズ比を最適化することができることを 理解するであろう。 【０７６９】 いくつかの実施形態では、１以上の本発明の細胞または細胞系を複数の試験化合物、例 えば、試験化合物のライブラリに暴露する。そのような試験化合物のライブラリは、本発 明の細胞系を用いてスクリーニングして、対象のタンパク質の１以上のモジュレータを同 定することができる。試験化合物は、小分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物 、抗体またはそれらの抗原結合部分、天然化合物、合成化合物、抽出物、脂質、洗剤など をはじめとする化学的部分であり得る。抗体の場合では、それらは、非ヒト抗体、キメラ 10 抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってよい。抗体は、抗体断片（例えば、Ｆａ ｂおよびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂなど）、単鎖抗体（ｓ ｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、重鎖もしくは軽鎖可変領域の全部または抗原結合部分を含 む、任意の抗体の重鎖および軽鎖または抗原結合部分の全てを含むインタクト抗体であっ てよい。 【０７７０】 いくつかの実施形態では、試験化合物に暴露する前に、本発明の細胞または細胞系は、 例えば、哺乳動物または他の動物性酵素、植物酵素、細菌酵素、タンパク質修飾酵素およ び脂質修飾酵素をはじめとする酵素での前処理によって修飾することができる。そのよう な酵素としては、例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、 20 オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、 リガーゼ細菌プロテアーゼ、腸由来のプロテアーゼ、消化管由来のプロテアーゼ、口腔中 、唾液中のプロテアーゼ、リゾール細胞／細菌由来のプロテアーゼなどを挙げることがで きる。あるいは、細胞および細胞系をまず試験化合物に暴露し、続いて酵素処理して、当 該処理によりタンパク質の修飾を変更する化合物を同定することができる。 【０７７１】 いくつかの実施形態では、大きな化合物コレクションを、細胞ベースの機能的ハイスル ープットスクリーニング（ＨＴＳ）において、例えば９６ウェル、３８４ウェル、１５３ ６ウェルまたはさらに高密度形式を用いて、タンパク質調節活性について試験する。いく つかの実施形態では、１つの試験化合物または複数の試験化合物（試験化合物のライブラ 30 リを含む）を、１つより多い本発明の細胞または細胞系を用いてスクリーニングすること ができる。 【０７７２】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系は、対象のタンパク質のモジュレー タに対して増大した感受性を有する。本発明の細胞および細胞系はまた、タンパク質の生 理学的範囲のＥＣ５０またはＩＣ５０値でモジュレータに対して反応する。本明細書中で 用いる場合、ＥＣ５０とは、細胞または細胞系において最大半量の活性化反応を誘発する ために必要な化合物または物質の濃度を指す。本明細書中で用いる場合、ＩＣ５０とは、 細胞または細胞系において最大半量の抑制反応を誘発するために必要な化合物または物質 の濃度を指す。ＥＣ５０およびＩＣ５０値は、当該技術分野で周知の技術、例えば、化合 40 物または物質の濃度とタンパク質を発現する細胞系の反応とを関連付ける用量反応曲線を 用いて決定することができる。 【０７７３】 本発明の細胞および細胞系のさらなる有利な特性は、これらの細胞および細胞系を用い た初期スクリーニングで同定されるモジュレータが、二次機能アッセイで機能的であるこ とである。当業者らが認識するように、初期スクリーニングアッセイで同定される化合物 は、典型的には、コンビナトリアルケミストリー、医薬品化学または合成化学などにより 、それらの誘導体または類似体が二次機能アッセイで機能的になるように修飾しなければ ならない。しかし、本発明の細胞および細胞系の高い生理学的関連性のために、これらの 細胞および細胞系を用いて同定される多くの化合物は、さらなる修飾なしで機能的である 50 (211) JP 2012-516687 A 2012.7.26 。いくつかの実施形態では、初期アッセイで同定されるモジュレータの少なくとも２５％ 、３０％、４０％、５０％またはそれ以上は、二次アッセイにおいて機能的である。さら に、本発明の細胞系は機能分析において「ゴールドスタンダード」アッセイと同様に機能 する。例えば、ＧＡＢＡＡ受容体を発現する本発明の細胞系は、膜電位アッセイおよび電 気生理学的機能において実質的において実質的に同じ働きをする。本発明のさらなる態様 では、本発明にしたがって生成した分化、成熟または特殊化細胞を用いて幹細胞を生成す ることができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法により同定される本発明の細胞 または細胞（細胞型または特異化が分化、成熟または特殊化細胞である）は、多能性（ｍ ｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、全能幹細胞 、人工多能性幹（「ｉＰＳ」）細胞、胚幹細胞、癌幹細胞、および臓器または組織特異的 10 幹細胞を包含するが、これらに限定されない幹細胞に分化し得る。脱分化の方法は、当業 者らに公知である。例えば、Ｐａｎａｇｉｏｔｉｓ Ａ． Ｔｓｏｎｉｓ；Ｓｔｅｍ Ｃ ｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｅａｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ４：８１−８３，（２００４）を参照。本発明の細胞 または本発明の方法により同定された細胞から産生される幹細胞は、分化、成熟、もしく は特殊化細胞型または特異化の１以上の細胞に分化し得る。本発明の細胞または本発明の 方法により同定された細胞から生成させた胚幹細胞およびｉＰＳ細胞を用いて、全非ヒト 生物、例えばマウスを産生することができる。マウス胚幹細胞を用いてマウスを産生する 方法は、当業者らに公知である。例えば、Ｓｍｉｔｈ， "ＥＭＢＲＹＯ−ＤＥＲＩＶＥ Ｄ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ：Ｏｆ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｍｅｎ”， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ 20 ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２００１， １７：４３５−６２（その全体とし て参照することによって本明細書中に組み込まれる）を参照。ｉＰＳ細胞を用いてマウス を産生する方法は、当業者らに公知である。例えば、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， “ｉＰ Ｓ Ｃｅｌｌｓ Ｃａｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｆｕｌｌ−Ｔｅｒｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔ ｏｆ Ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ Ｅｍｂｒｙｏｓ”，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ＪｕＩ ２２， ２００９ ［Ｅ ｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、およびＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．， “ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ｖｉａｂｌｅ ｍｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｔｒａ ｐｌｏｉｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ”， Ｎａｔｕｒｅ， Ｊｕｌｙ ２３， ２００９ ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］を参照。 30 いくつかの実施形態では、細胞型または特異化が、分化、成熟または特殊化細胞である本 発明の細胞または本発明の方法により同定される細胞は、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎ ｔ）幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、全能幹細胞、人工多能性幹細胞 （「ｉＰＳ」）、胚幹細胞、癌幹細胞、および臓器または組織特異的幹細胞を包含するが 、これらに限定されない幹細胞に分化する可能性があり、このようにして産生された幹細 胞は、分化、成熟、もしくは特殊化細胞型または特異化の１以上の細胞に分化する可能性 がある。 いくつかの実施形態では、細胞型または特異化が分化、成熟または特殊化細胞であるは、 本発明の細胞または本発明の方法により同定された細胞を胚幹細胞またはｉＰＳ細胞に脱 分化させることができ、このようにして産生された幹細胞を用いて、全生物、例えば、マ 40 ウスを産生することができる。いくつかの実施形態では、細胞型または特異化が分化、成 熟または特殊化細胞である本発明の細胞または本発明の方法により同定された細胞を、胚 幹細胞またはｉＰＳ細胞に脱分化させることができ、このようにして産生された幹細胞を 用いて、全生物、例えばマウスを産生することができ、この場合、同じ細胞型または特異 化生物における細胞は、本発明の細胞が選択される同じ特性、例えば、対象のタンパク質 またはＲＮＡの発現を含む。 【０７７４】 いくつかの実施形態では、ＲＮＡもしくはタンパク質またはＲＮＡもしくはタンパク質 の機能的もしくは生理学的形態を含む特殊化細胞もしくは組織型の細胞を使用して、生物 、例えば、マウスを産生するために使用することができる胚幹細胞もしくはｉＰＳ細胞を 50 (212) JP 2012-516687 A 2012.7.26 産生することができ、この場合、同じ型の生物の細胞または組織は、ＲＮＡもしくはタン パク質またはＲＮＡもしくはタンパク質の機能的もしくは生物学的形態を含む。いくつか の実施形態では、このようにして産生された生物は、同じ種のＲＮＡまたはタンパク質を 含む。他の実施形態では、このようにして産生された生物は、異なる種のＲＮＡまたはタ ンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生物はマウスであり、ＲＮＡまたはタンパク 質はヒト起源のものである。いくつかの実施形態では、このようにして産生された生物は 本発明のインビトロ相関物を含む。いくつかの実施形態では、このようにして産生された 生物は、前臨床試験をはじめとする試験において用いることができる。いくつかの実施形 態では、試験または前臨床試験を用いて、ヒトにおける試験化合物の活性を予測する。 【０７７５】 10 さらなる態様では、本発明は、インビボ生理学的特性に対するインビトロ相関関係を生 じさせる方法を提供する。インビボ生理学的特性に対するインビトロ相関関係には、１以 上の化合物のインビボでの１以上の薬理学的特性に対する影響と相関する、本発明の細胞 または細胞系において発現された１以上のタンパク質もしくはＲＮＡ（すなわち、インビ トロで発現されたもの）に対する１以上の化合物の効果が含まれる。理論により拘束され るものではないが、試験化合物は、基準化合物と比較して、インビトロで発現される１以 上のタンパク質またはＲＮＡに対して類似しているかまたは実質的に同じ効果を有するこ とが見いだされる場合、基準化合物と比較して、１以上のインビボ生理学的特性に対して 類似しているかまたは実質的に同じ効果を有すると見なすことができる。すなわち、試験 化合物は、基準化合物と比較してインビトロで類似しているかまたは実質的に同じ相関関 20 係を有すると見なされる（例えば、少なくとも９０％同一）。いくつかの実施形態では、 試験化合物は、基準化合物と比較して類似しているかまたは実質的に同じインビトロ相関 関係を有すると見なされる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０ ％、６０％、７０％、８０％または９０％同一）。インビトロ相関関係は、化合物の１以 上の活性特性を含み得る。 【０７７６】 本発明の細胞または細胞系により発現される１つのタンパク質または複数のタンパク質 は、対象の１つのインビボタンパク質または対象の複数のインビボタンパク質のインビト ロ相関関係を提供する。本発明の細胞および細胞系は、１以上のタンパク質を発現するた めのちょうど同じ条件を提供する際にインビボでこれらの細胞を正確に再現しない場合が 30 ある。例えば、インビボで発現されたタンパク質と比較して、本発明の細胞または細胞系 で発現されたタンパク質との間で翻訳後修飾、フォールディング、アセンブリ、サブユニ ットコンビネーション、輸送および／または膜統合において差があり得る。加えて、イン ビトロで発現されたタンパク質の機能の試験において用いられるパラメータは、これらの パラメータをインビボで正確に再現しない場合があり、例えば、インビトロで実施される あるタンパク質機能分析は、非生理学的と見なされるあるｐＨまたは塩濃度下で実施され る場合がある。それにもかかわらず、本発明の細胞または細胞系によって発現されたタン パク質は、これらの非生理学的条件において生理学的に活性であり得、そしてインビトロ で分析する場合、少なくとも１つの機能的または薬理学的または生理学的特性を提供し得 る。そのような機能的または薬理学的または生理学的特性は、インビボタンパク質に対応 40 し得る。例えば、インビボでタンパク質と関連する生理学的特性を調節または改変する化 合物は、インビトロで分析する場合、本発明の細胞または細胞系により発現された対応す るタンパク質の生物活性を改変することができ、これにより本発明の細胞または細胞系に より発現されたタンパク質とインビボで発現されたタンパク質との間の相関関係を確立し 、本発明の細胞または細胞系により発現されたタンパク質は、インビボで発現されたタン パク質の「インビトロ相関物」と見なされる。例えば、本発明者等は、それぞれが同じセ ットのＮａｖサブユニット（α、β１およびβ２）を発現する異なる細胞系は、同じセッ トの化合物に対して異なって反応し得ることを見いだした。例えば、以下の実施例２３を 参照。これらの別個の機能特性は、これらの細胞系における異なるサブユニットコンビネ ーションの現れであり、異なるサブユニットコンビネーションのそれぞれは、対応するイ 50 (213) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ンビボサブユニットコンビネーションのインビトロ相関物と見なすことができる。加えて 、本発明者らは、苦味受容体を発現する細胞系のパネルに対する化合物活性の特性も得た 。ヒト味覚官能検査を用いて、化合物活性特性と比較し、パネルに対して化合物活性のど のパターンがインビボの所望の味覚または味落ちと関連するのかを調べた。 【０７７７】 化合物に対する反応以外に、本発明の細胞によって発現されたタンパク質に対して他の 処理および／または条件を適用することによって、本発明のインビトロ相関物を生成およ び／または分類することができる。例えば、本発明者らは、タンパク質分解によるＥＮａ Ｃのインビトロ相関物を生成させ（例えば、ＥＮａｃの様々なタンパク質分解形態の生成 ）、様々な培地条件を適用することによって甘味／旨味受容体のインビトロ相関物を生成 10 させた。 【０７７８】 インビトロ相関物は、１つのタンパク質または複数のタンパク質を含み得る。そのよう なインビトロ相関物は、インビボでのその対応するタンパク質の機能または活性を予測す ることができる。そのようなインビトロ相関物を、本発明の細胞または細胞系によって発 現されるタンパク質（すなわち、インビトロ相関物）の１以上の生物学的活性の同一性モ ジュレータに対するハイスループットスクリーニングにおいて用いることができ、このよ うにしてインビトロ相関物のモジュレータとして同定された化合物の一部または全部は、 インビボで発現されたタンパク質を調節することもできる（例えば、インビボで治療効果 を有する）。種々の実施形態では、ハイスループットスクリーニングで同定された全ての 20 化合物の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％ 、９０％、９５％、または９９％は、治療効果を有し得る。いくつかの実施形態では、イ ンビトロ相関物は少なくとも２、３、４、５、または６サブユニットを含み得る。いくつ かの実施形態では、インビトロ相関物はヘテロ多量体であってよい。いくつかの実施形態 では、インビトロ相関物は、選択圧の非存在下で培養された細胞において安定して発現さ れる。いくつかの実施形態では、インビトロ相関物は、細胞毒性を生じることなく細胞系 において発現される。いくつかの実施形態では、インビトロ相関物は、特定のタンパク質 または複数のタンパク質を内因的に発現しない細胞において発現される。 【０７７９】 いくつかの実施形態では、本発明にしたがってインビトロ相関物を発現する細胞または 30 細胞系を用いて、例えば、当該細胞または細胞系を試験化合物と接触させ；そして試験化 合物と接触していない細胞におけるインビトロ相関物の特定のタンパク質または複数のタ ンパク質の活性と比較して、試験化合物と接触した細胞または細胞系におけるインビトロ 相関物の特定のタンパク質または複数のタンパク質の活性における変化を検出することに より、対象のインビボタンパク質のモジュレータを同定することができ、この場合、存在 しない場合と比較して存在する場合に活性において違いを生じる化合物は、対象のインビ ボタンパク質のモジュレータである。 【０７８０】 ある態様では、本発明は、本明細書中に記載される方法において使用できるキットを提 供する。一実施形態では、キットは、本明細書中に記載される方法において使用するため 40 の１以上の試薬を含む１以上の容器を含む。 【０７８１】 ある態様では、本明細書中に記載される方法において用いることができるキットが提供 される。特に、１以上の複雑な標的を安定して発現する１以上の細胞または細胞系を含む キットが提供される。ある実施形態では、本発明で提供されるキットは、本明細書中で記 載される１以上のシグナリングプローブを含む。特定の実施形態では、キットは、１以上 の複雑な標的をコードする１以上のベクターを含み得る。具体的な実施形態では、キット は、１以上の複雑な標的を安定して発現する細胞のスクリーニングおよび選択のために、 機能的細胞ベースのアッセイ（例えば、カルシウムフラックスアッセイ、膜電位アッセイ ）において用いられる１以上の色素を含む。 50 (214) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０７８２】 ある態様において、本発明では、本明細書中に記載される１以上の試薬および／または 細胞、例えば本明細書中で提供される１以上の細胞、ベクター、および／またはシグナリ ングプローブで満たした１以上の容器を含むキットを提供する。ある実施形態では、本発 明のキットは、対照試薬（例えば、対照シグナリングプローブ、色素、細胞，および／ま たはベクター）をさらに含み、この場合、そのような対照試薬は正の対照または負の対照 試薬であってよい。場合によって、キット中の成分の使用に関する指示を含む注意書をそ のような容器に添付することができる。 甘味受容体および旨味受容体 【０７８３】 10 本発明は、甘味受容体のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニット、ならびに場合によって Ｇタンパク質を安定して発現するように操作された新規細胞および細胞系に関する。本発 明は、旨味受容体のＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニット、ならびに場合によってＧタン パク質を安定して発現するように操作された新規細胞および細胞系にも関する。いくつか の実施形態では、これらの細胞および細胞系で産生された味覚受容体（例えば、甘味受容 体または旨味受容体）は、機能的および生理学的に関連する。他の態様では、本発明は、 これらの細胞および細胞系を調製し、使用する方法を提供する。味覚受容体、例えば旨味 受容体または甘味受容体を含む本発明の細胞および細胞系を用いて、味覚受容体、例えば 旨味受容体または甘味受容体のモジュレータを同定することができる。これらのモジュレ ータは、例えば、食品および医薬品の味の修飾において、ならびに味覚受容体、例えば旨 20 味受容体または甘味受容体が関与する疾患、例えば肥満および糖尿病の治療的処置におい て、有用である。 【０７８４】 本発明のいくつかの実施形態によれば、新規細胞および細胞系を、甘味受容体Ｔ１Ｒ２ サブユニットをコードする核酸および／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットをコード する核酸で１回または２回トランスフェクトする。いくつかの具体的な実施形態では、新 規細胞および細胞系を、旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットをコードする核酸および／また は旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸で１回または２回トランスフェクト する。他のサブユニットを内因性核酸から細胞において発現することができる。２つの核 酸がもし存在するならば、これらは同じベクター中にあってもよいし、または別のベクタ 30 ー中にあってもよい。別の実施形態では、本発明の新規細胞および細胞系を、甘味受容体 Ｔ１Ｒ２サブユニット、甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットおよびＧタンパク質をコードす る核酸で１回、２回または３回トランスフェクトする。別の実施形態では、本発明の新規 細胞および細胞系を、旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニット、旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニッ トおよびＧタンパク質をコードする核酸で１回、２回または３回トランスフェクトする。 前述のように、核酸は同じベクター中にあってもよいし、または別のベクター中にあって もよい。例えば、３個のベクターを使用することができるか；１個のベクターを使用する ことができるか；または２個のベクターを使用することができる。他のサブユニット、お よび任意のＧタンパク質を、内因性核酸から細胞において発現することができる。別の実 施形態では、新規細胞および細胞系は、遺伝子活性化により発現のために活性化された、 40 少なくとも１つの味覚受容体サブユニット、例えば旨味受容体サブユニットまたは甘味受 容体サブユニットを有する。他の味覚受容体サブユニット、例えば旨味受容体サブユニッ トもしくは甘味受容体サブユニット、および／または場合によって必要ならばＧタンパク 質は、これらのタンパク質をコードする導入された核酸配列から発現させることができる か、または内因的に活性な核酸からすでに発現されていてもよい。本発明の新規細胞系は 、導入および／または遺伝子活性化味覚受容体サブユニット、例えば旨味受容体サブユニ ットまたは甘味受容体サブユニット、および場合によってＧタンパク質を安定して発現す る。 【０７８５】 前述のように、本発明のいくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系を、味覚 50 (215) JP 2012-516687 A 2012.7.26 受容体の２つのサブユニット、例えば旨味受容体または甘味受容体の産生に加えて、Ｇタ ンパク質を産生するように操作する。細胞および細胞系を、Ｇタンパク質を産生するよう に操作する。なぜなら、これらは自身の操作前の状態では、活性化味覚受容体、例えば旨 味受容体または甘味受容体からの下流シグナリングを誘発するために必要なＧタンパク質 を産生しないから、または細胞が味覚受容体誘発性シグナリング、例えば旨味受容体誘発 性シグナリングまたは甘味受容体誘発性シグナリングに十分な量でＧタンパク質を産生し ないからである。 【０７８６】 第１の態様において、本発明は、味覚受容体、例えば旨味受容体または甘味受容体を発 現する細胞および細胞系を提供し、これらの細胞および細胞系は、従来の方法により作製 10 された細胞および細胞系と比較して、増強された特性を有する。例えば、本発明の味覚受 容体細胞および細胞系、例えば旨味受容体細胞および細胞系または甘味受容体細胞および 細胞系は、向上した発現安定性および／または発現レベルを有する（例えば、抗生物質お よび他の薬物を含む選択圧の無い培養中で維持される場合でも）。他の実施形態では、本 発明の細胞および細胞系は種々のアッセイで高いＺ’値を有する。さらに別の実施形態で は、本発明の細胞および細胞系は、より従来どおりに操作された細胞と比較して、生理学 的に関連する味覚受容体活性、例えば、旨味受容体活性または甘味受容体活性のそれらの 発現との関連で改善されている。これらの特性は、アッセイにおいて用いられる本発明の 細胞および細胞系が味覚受容体、例えば、旨味受容体および／または甘味受容体のモジュ レータを同定する能力を増強および改善し、そして同定されたモジュレータの機能的特性 20 を改善する。 【０７８７】 種々の実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、少なくとも２、３、４、５、６、 ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２ １、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ 、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、 １３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００日間または２００日 を越えて、一貫した発現レベルで旨味受容体Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニットまたは 甘味受容体Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニットを発現し、この場合、一貫した発現とは ：連続細胞培養の２∼４日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％ 30 、９％または１０％；連続細胞培養の１６∼２０日にわたって１％、２％、４％、６％、 ８％、１０％または１２％；１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、 １６％、１８％または２０％；連続細胞培養の２１∼３０日にわたって１％、２％、４％ 、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％；連 続細胞培養の３０∼４０日にわたって１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、 １４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；連続 細胞培養の４１∼４５日にわたって１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１ ４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；連続細 胞培養の４５∼５０日にわたって１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４ ％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；連続細胞 40 培養の４５∼５０日にわたって１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％ 、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％または３５％；連 続細胞培養の５０∼５５日にわたって１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、 １４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％または ３５％；連続細胞培養の５０∼５５日にわたって１％、２％、４％、６％、８％、１０％ 、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％ または３５％；連続細胞培養の５５∼７５日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、 １０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％；連続細胞培養の７５∼ １００日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２ ５％、３０％、３５％、４０％または４５％；連続細胞培養の１０１∼１２５日にわたっ 50 (216) JP 2012-516687 A 2012.7.26 て１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３ ５％、４０％または４５％；連続細胞培養の１２６∼１５０日にわたって１％、２％、３ ％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％また は４５％；連続細胞培養の１５１∼１７５日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、 ５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；連続細 胞培養の１７６∼２００日にわたって１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１ ５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；連続細胞培養の２００日 以上にわたって１％、２％、３％、４％、５％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％ 、３０％、３５％、４０％または４５％を超えて変わらない発現レベルを指す。 【０７８８】 10 本発明によれば、本発明の細胞または細胞系により発現された、味覚受容体、例えば旨 味受容体または甘味受容体は、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、イヌ、ウシ、ブタまたは 霊長類をはじめとする任意の哺乳動物由来であり得る。発現された甘味受容体を一緒にな って形成するＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニットは、同じかまたは異なる種由来であり 得る。例えば、任意の種由来の甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットは、本発明の細胞または 細胞系において同じ種または任意の他の種由来の甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットと同時 に発現させることができる。さらに、発現された旨味受容体を一緒になって形成するＴ１ Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニットは、同じかまたは異なる種由来であり得る。例えば、任 意の種由来の旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットは、本発明の細胞または細胞系において同 じ種または任意の他の種由来の旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットと同時発現させることが 20 できる。同様に、Ｇタンパク質も本発明の細胞および細胞系において発現される実施形態 では、Ｇタンパク質は任意の種由来であってよい。これらのＧタンパク質には、表７に記 載されるものが含まれる。キメラＧタンパク質（Ｇα１５−Ｇα１６；ＧＮＡ１５−ＧＮ Ａ１６）も、本発明の細胞および細胞系において発現され得る。任意の種由来のＧタンパ ク質を、任意の種由来の甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットと同時発現することができ、任 意の種由来の甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットまたは３者の任意の組み合わせを用いるこ とができる。具体的な実施形態において、甘味受容体はヒト甘味受容体であり、好ましく は、ヒトＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニットにより特性化される。別の具体的な実施形 態では、旨味受容体はヒト旨味受容体であり、好ましくは、ヒトＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３ サブユニットにより特性化される。本発明の一態様は、クローン細胞および細胞系のコレ 30 クションを提供し、そのそれぞれは同じ味覚受容体、例えば旨味受容体もしくは甘味受容 体、または異なる味覚受容体、例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体を発現する。コレ クションは、例えば、異なるサブユニットの組み合わせ、またはこれらのサブユニットの 完全長もしくは断片の組み合わせを発現する細胞もしくは細胞系を含み得る。 【０７８９】 味覚受容体サブユニット、例えば、旨味受容体サブユニットＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２ま たは甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３をコードする核酸ならびに任意のＧ タンパク質をコードする核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらの混 合物であり得る。いくつかの実施形態では、味覚受容体（例えば、旨味受容体または甘味 受容体）サブユニットをコードする核酸配列および場合によってＧタンパク質をコードす 40 る核酸配列は、さらにタグを含む。そのようなタグは、例えば、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグ 、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、プロテインＣ、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＬＵ、黄色蛍光タンパク 質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質、ＦＬＡＧ、ＢＣＣＰ、マルトース結合タンパク質タ グ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−２、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｓ−タグ 、チオレドキシン、ＧＳＴ、Ｖ５、ＴＡＰまたはＣＢＰをコードし得る。タグは、味覚受 容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）サブユニットおよびＧタンパク質発現レ ベル、細胞内局在性、タンパク質−タンパク質相互作用、味覚受容体（例えば、旨味受容 体もしくは甘味受容体）調整、または味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容 体）機能を決定するためのマーカーとして用いることができる。タグは、味覚受容体（例 えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）またはＧタンパク質を精製もしくは分画するため 50 (217) JP 2012-516687 A 2012.7.26 に用いることもできる。 【０７９０】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、ヒト甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブ ユニットをコードする核酸（配列番号３１）を含み得る。いくつかの実施形態では、本発 明の細胞または細胞系は、ヒト旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットをコードする核酸（配列 番号４１）を含み得る。本発明の細胞または細胞系は、ヒト甘味受容体または旨味受容体 Ｔ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸（配列番号３２）も含み得る。具体的な実施形態 において、本発明の細胞または細胞系は、Ｔ１Ｒ３およびＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２をコー ドする両核酸を含む。他の実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、Ｔ１Ｒ１および Ｔ１Ｒ３サブユニットまたはＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸に加 10 えて核酸配列（配列番号３３）を含み得る。配列番号３３はマウスＧα１５タンパク質を コードする。他の実施形態では、このＧタンパク質はヒトＧα１５である。配列番号３７ を参照。 【０７９１】 いくつかの実施形態では、味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニット または甘味受容体サブユニット）および任意のＧタンパク質をコードする核酸は、野生型 味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サブユニ ット）またはＧタンパク質をコードする核酸配列と比較して、１以上の置換、挿入、突然 変異または欠失を含む。突然変異を含む核酸を含む実施形態において、突然変異は、ラン ダム突然変異または部位特異的突然変異であり得る。これらの核酸変化は、アミノ酸置換 20 をもたらすかどうかわからない。いくつかの実施形態では、核酸は、味覚受容体サブユニ ット（例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サブユニット）またはＧタン パク質をコードする核酸の断片である。断片であるか、またはそのような修飾を有する核 酸は、味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サ ブユニット）またはＧタンパク質の少なくとも１つの生物学的特性、例えば、それぞれ自 身の他のサブユニットでＧタンパク質を活性化する能力または味覚受容体サブユニット（ 例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体）により活性化され得る能力を保有 するポリペプチドをコードする。 【０７９２】 本発明は、サブユニットをコードする核酸を安定に発現する細胞および細胞系も包含し 30 、この核酸の配列は、配列番号３１、配列番号４１、配列番号３２またはヒト以外の種由 来のカウンターパート核酸またはこれらの核酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードす る核酸の群から選択されるサブユニット配列と少なくとも約８５％同一である。いくつか の実施形態では、サブユニットをコードする配列同一性は、これらのサブユニット配列と 比較して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または それ以上である。本発明は、核酸が、ストリンジェントな条件下で、配列番号３１、配列 番号４１、配列番号３２もしくはヒト以外の種由来のカウンターパート核酸の群から選択 されるサブユニット配列にハイブリダイズする味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受 容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニット）をコードする核酸、またはこれらの核 酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核酸から選択される、細胞および細胞系も 40 包含する。 【０７９３】 いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号３１、配列番号４１、配列番 号３２またはヒト以外の種由来のカウンターパート核酸またはこれらの核酸のいずれかと 同じアミノ酸配列をコードする核酸と比較して、少なくとも１つの置換を含む味覚受容体 サブユニットをコードする核酸配列（例えば、旨味受容体サブユニットをコードする核酸 配列もしくは甘味受容体サブユニットをコードする核酸配列）を含む。置換は、１０、２ ０、３０、もしくは４０未満のヌクレオチドまたは、１％、５％、１０％または２０％以 下のヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、置換配列は、配列番号３１ 、配列番号４１、配列番号３２またはヒト以外の種由来のカウンターパート核酸これらの 50 (218) JP 2012-516687 A 2012.7.26 核酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核酸と実質的に同一（例えば、これらと 少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同 一である配列）であり得るか、または、ストリンジェントな条件下で、配列番号３１、配 列番号４１、配列番号３２またはヒト以外の種由来のカウンターパート核酸またはこれら の核酸のいずれか１つと同じアミノ酸配列をコードする核酸とハイブリダイズできる配列 であり得る。 【０７９４】 いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、配列番号３１、配列番号４１、配列番 号３２またはヒト以外の種由来のカウンターパート核酸またはこれらの核酸のいずれかと 同じアミノ酸配列をコードする核酸中に挿入を含むか、またはこれらから欠失している味 10 覚受容体サブユニットをコードする核酸配列（例えば、旨味受容体サブユニットをコード する核酸配列または甘味受容体サブユニットをコードする核酸配列）を含む。挿入または 欠失は、１０、２０、３０、もしくは４０未満のヌクレオチドまたは前記ヌクレオチド配 列の１％、５％、１０％または２０％以下と等しい。いくつかの実施形態では、挿入また は欠失の配列は、配列番号３１、配列番号４１、配列番号３２またはヒト以外の種由来の カウンターパート核酸またはこれらの核酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核 酸と実質的に同一（例えば、これらと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７ ％、９８％、９９％またはそれ以上同一である配列）であるか、またはストリンジェント な条件下で配列番号３１、配列番号４１、配列番号３２またはヒト以外の種由来のカウン ターパート核酸、またはこれらの核酸のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする核酸と 20 ハイブリダイズできる配列であり得る。 【０７９５】 前述のように、いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系は、場合によって 、Ｇタンパク質、例えば、マウスＧα１５タンパク質（配列番号３６）またはヒトＧα１ ５タンパク質（配列番号３７）を発現する。甘味受容体のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユ ニットまたは旨味受容体のＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸配列と 同様に、Ｇタンパク質（およびＧタンパク質のアミノ酸配列）をコードする核酸配列は、 甘味受容体サブユニットについて前述された置換、欠失および挿入を含み得る。 【０７９６】 いくつかの実施形態では、核酸置換または修飾の結果、アミノ酸置換などのアミノ酸変 30 化が起こる。例えば、配列番号３４（ヒトＴ１Ｒ２）、配列番号３５（ヒトＴ１Ｒ３）、 配列番号４２（旨味ヒトＴ１Ｒ１アイソフォーム１ａａ）、配列番号４３（旨味ヒトＴ１ Ｒ１アイソフォーム２ａａ）、配列番号４４（旨味ヒトＴ１Ｒ１アイソフォーム３ａａ） 、配列番号４５（旨味ヒトＴ１Ｒ１アイソフォーム４ａａ）のアミノ酸残基、またはヒト 以外の種由来のカウンターパートアミノ酸または配列番号３６（マウスＧｃＭ５）および ３７（ヒトＧｃＭ５）のアミノ酸残基または任意の種由来のＧタンパク質を、保存的もし くは非保存的置換で置換することができる。いくつかの実施形態では、もとのアミノ酸配 列と修飾アミノ酸配列との間の配列同一性は、それと実質的に同一である配列（例えば、 それと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ 以上同一である配列）と、約１％、５％、１０％または２０％異なり得る。 40 【０７９７】 「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、親アミノ酸残基と類似した化学的性質 （例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基で置換されて いるものである。２以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なっている場合、配 列同一性（％）または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方調節する ことができる。この調節をするための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓ ｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４３：３０７−３１（１９９４）を 参照。 【０７９８】 類似した化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては、１）脂肪族側鎖： 50 (219) JP 2012-516687 A 2012.7.26 グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル 側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン； ４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖 ：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタ ミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好適な 保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシ ン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、およびア スパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的アミノ酸置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−４５（１９９２）で開示されるＰＡＭ２ ５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「やや保存的」置 10 換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負値を有する任意の変化である。 【０７９９】 サブユニットＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３における保存的修飾により、非修飾甘味受容体と 類似（すなわち、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％同一 ）の構造的および化学的特性を有する甘味受容体が産生されるであろう。サブユニットＴ １Ｒ１およびＴ１Ｒ３における保存的修飾により、非修飾旨味受容体と類似（すなわち、 少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％同一）の構造的および 化学的特性を有する旨味受容体が産生されるであろう。Ｇタンパク質における保存的修飾 についても同様である。 【０８００】 20 本発明の細胞または細胞系を産生するために用いられる宿主細胞は、それらの自然の状 態で、１以上の内因性味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしく は甘味受容体サブユニット）を発現し得るか、または味覚受容体サブユニット（例えば、 旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サブユニット）の発現が欠失している。Ｇタ ンパク質についても同様である。宿主細胞は、一次細胞、生殖細胞、または胚幹細胞を含 む幹細胞であってよい。宿主細胞は、不死化細胞であってもよい。一次または不死化宿主 細胞は、真核生物の中胚葉、外胚葉または内胚葉層由来のものであってよい。宿主細胞は 内皮、表皮、間葉、神経、腎臓、肝臓、造血、または免疫細胞であってよい。例えば、宿 主細胞は、血液／免疫細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラ ーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ｇｄＴ細胞、ナチュラルキラー細胞）；顆粒 30 球（好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球／過分葉好中球）、単球／マクロファ ージ、赤血球（網状赤血球）、肥満細胞、血小板／巨大核細胞、樹状細胞；内分泌細胞、 例えば甲状腺（甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、上皮小体（上皮小体主細胞、好酸性細胞 ）、副腎（クロム親和性細胞）；神経系細胞、例えばグリア細胞（星状細胞、小膠細胞） 、巨大細胞性神経分泌細胞、星細胞、核鎖細胞、ベッチャー細胞、下垂体、（性腺刺激物 、副腎皮質刺激因子、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、増殖ホルモン産生細胞、乳腺刺激物 ）、呼吸器系細胞、例えば肺細胞（Ｉ型肺細胞、ＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞； 循環系細胞（心筋細胞、周細胞）；消化器系細胞（胃（胃主細胞、壁細胞）、杯細胞、パ ネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、腸内分泌細胞、腸クロム親 和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、肝臓（肝細胞、クッパー細胞）、膵臓（ベータ細胞、アルファ 40 細胞）、胆嚢）；軟骨／骨／筋肉／外皮系細胞、例えば骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、歯 細胞（セメント芽細胞、エナメル芽細胞）；軟骨細胞（ｃａｒｔｒｉｇｅ ｃｅｌｌ）、 例えば軟骨芽細胞、軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、皮膚／毛細胞、例えば毛疱、 ケラチン生成細胞；メラニン形成細胞筋肉細胞、例えば筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞； 泌尿器系細胞、例えば足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞／糸球体外メサ ンギウム細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、緻密斑細胞；生殖系細胞、例えば精子、セルト リ細胞、ライディッヒ細胞、卵子、濾胞細胞；感覚細胞、例えばコルチ器官細胞、嗅上皮 、温度感受性感覚ニューロン、メルケル細胞、嗅覚受容体ニューロン、痛みを感じるニュ ーロン、光受容体細胞、味蕾細胞、前庭器の毛細胞、頸動脈小体細胞であってよい。宿主 細胞は、真核性、原核性、哺乳動物、鳥類、ニワトリ、は虫類、両生類、カエル、トカゲ 50 (220) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、ヘビ、魚、蠕虫、イカ、ロブスター、ウニ、ナマコ、ホヤ、ハエ、ヒドラ、節足動物、 甲虫、ニワトリ、ヤツメウナギ、メダカ、キンカチョウ、フグ、およびゼブラフィッシュ であってよい。哺乳動物の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、ラット 、有袋類、ネズミ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモットおよびハムスターが挙げら れる。宿主細胞は、酵母、昆虫、真菌、植物、下等真核生物および原核生物などの非哺乳 動物であってもよい。そのような宿主細胞は、味覚受容体モジュレータ、例えば、旨味受 容体モジュレータまたは甘味受容体モジュレータを試験するためのさらに異なるバックグ ラウンドを提供することができ、標的と相互作用し得る細胞により提供される発現産物が 無い可能性が高い。好ましい実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。 【０８０１】 10 本発明の細胞または細胞系を産生するために用いることができる宿主細胞の例としては 、これらに限定されるものではないが：ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、確立された神経細 胞系、クロム親和性細胞腫、神経芽細胞腫線維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、Ｎ ＳＯ細胞、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６ ５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １ ６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１ ６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７ １）、Ｌ−細胞、ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）およびＰＣ１２（ＡＴＣ Ｃ ＣＲＬ−１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）、ＲＢＬ（ 20 ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１３７８）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）、ＭＤ ＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６１）、Ｈ ｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ ９２０９０９０３ ）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ ８５０５０３０２）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１）、 Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）、Ｊ ｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅ ｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍ ａｒｙ ＰＣＳ １００−０１０、マウスＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５、ＣＲＬ２５ １６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲ Ｌ １０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８５）、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ 30 ＣＣＬ １８６）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣ ＨＴＢ−２２）、Ｕ−２ ＯＳ（ＡＴＣＣ Ｈ ＴＢ−９６）、Ｔ８４（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４８）、あるいは任意の確立された細胞系 （極性化もしくは非極性化）またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ ＴＣＣ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ． Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）もしくはヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カ ルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ ｅｓ（ＥＣＡＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ Ｅｎｇ ｌａｎｄ）などの貯蔵所から入手可能な任意の細胞系が挙げられる。 【０８０２】 一実施形態では、宿主細胞は、味覚受容体、例えば旨味受容体または甘味受容体を産生 40 するトランスジェニック動物の生成の基礎としてその後に用いられる胚幹細胞である。少 なくとも１つの味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味 受容体サブユニット）、または両味覚受容体サブユニット（例えば、両旨味受容体サブユ ニットもしくは両甘味受容体サブユニット）、および好ましくは機能的味覚受容体（例え ば、旨味受容体もしくは甘味受容体）を安定して発現する胚幹細胞を、生物に直接移植す ることができるか、またはそれらの核を他のレシピエント細胞中に移すことができ、これ らを次いで移植するか、またはトランスジェニック動物を作製するために用いることがで きる。いくつかの実施形態では、１以上のサブユニットは、所望の時間的および／または 組織特異的発現で動物において発現することができる。 【０８０３】 50 (221) JP 2012-516687 A 2012.7.26 当業者らには理解されるように、選択された宿主細胞とともに用いるのに適した任意の ベクターを用いて、味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしくは 甘味受容体サブユニット）またはＧタンパク質をコードする核酸を宿主細胞中に導入する ことができる。種々の味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしく は甘味受容体サブユニット）またはＧタンパク質をコードする核酸を含むベクターは、同 じ種類のものであっても、異なる種類のものであってもよい。味覚受容体サブユニット（ 例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サブユニット）またはＧタンパク質 をコードする核酸を宿主細胞中に導入するために用いることができるベクターの例として は、プラスミド、レトロウイルスおよびレンチウイルスをはじめとするウイルス、コスミ ッド、人工染色体が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、また、例えば、ｐ 10 ＦＮ１１Ａ（ＢＩＮＤ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＧＬ４．３１、ｐＦＣ１４Ａ（Ｈａ ｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＣ１４Ｋ（Ｈａｌｏ Ｔａｇ（登録商標）７）ＣＭＶ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ａ（ＨａｌｏＴａ ｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ｋ（ＨａｌｏＴａ ｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ＨａｌｏＴａｇ（商標）ｐＨ Ｔ２、ｐＡＣＴ、ｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（商標）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−ＭＡＸ、 ｐＢＩＮＤ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｂａｓｉｃ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｃｏｎｔ ｒｏｌ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｐｒｏ ｍｏｔｅｒ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶＴＮＴ（商標）、ｐＧ５ｌｕｃ、ｐＳＩ、ｐＴＡＲＧＥＴ （商標）、ｐＴＮＴ（商標）、ｐＦ１２Ａ ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦ１２Ｋ 20 ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＲｅｇ ｎｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＡｄ／ＣＭ Ｖ／Ｖ５−ＤＥＳＴ Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳ Ｔ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤ ＥＳＴ（商標）２７ Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１ Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐｃＤＮＡ（商標）−ＤＥＳＴ４７ｖｅｃ ｔｏｒ、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ６／Ｈｉｓ Ａ、Ｂ、＆ｃ、ｐｃＤＮ Ａ（商標）６．２−ＤＥＳＴ、ｐＬｅｎｔｉ６／ＴＲ、ｐＬＰ−ＡｃＧＦＰ１−Ｃ、ｐＬ ＰＳ−ＡｃＧＦＰ１−Ｎ、ｐＬＰ−ＩＲＥＳｎｅｏ、ｐＬＰ−ＴＲＥ２、ｐＬＰ−Ｒｅｖ ＴＲＥ、ｐＬＰ−ＬＮＣＸ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−ＨＡ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ、ｐＬＰ− ＲｅｔｒｏＱ、ｐＬＰ−ＣＭＶｎｅｏ、ｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇ 30 ｒｏ、ｐＣＤＮＡ３．１ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｐｕｒｏ、ＰＳＶ２ｎｅｏ、ｐＩＲＥ Ｓｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｚｅｏを挙げることができる。いくつかの実施形態では、ベクター は、発現調節配列、例えば構成的または条件付きプロモータを含み、好ましくは、構成的 プロモータを使用する。当業者はそのような配列を選択することができるであろう。例え ば、好適なプロモータとしては、これらに限定されるものではないが、ＣＭＶ、ＴＫ、Ｓ Ｖ４０およびＥＦ−１αが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモータは、誘導性 、温度調節、組織特異性、抑制性、熱ショック、発生、細胞系特異性、真核性、原核性も しくは時間的プロモータまたは前記のいずれか１以上の非修飾もしくは突然変異、ランダ ム化、シャッフルされた配列の組み合わせもしくは組換えである。他の実施形態では、味 覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サブユニッ 40 ト）またはこれらの２以上（および場合によってＧタンパク質）は遺伝子活性化によるか 、またはエピソームにより発現される。 【０８０４】 いくつかの実施形態では、ベクターは、選択可能なマーカーまたは薬剤耐性遺伝子が欠 失している。他の実施形態では、ベクターは、場合によって、薬剤もしくは抗生物質耐性 を付与するタンパク質またはさらに一般的には細胞に対して選択圧をかける任意の生成物 などの選択可能なマーカーをコードする核酸を含む。異なる味覚受容体サブユニット（例 えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サブユニット）またはＧタンパク質を コードする配列を導入するための各ベクターは、同じかもしくは異なる薬剤耐性または他 の選択圧マーカーを有し得る。薬剤耐性または選択圧マーカーの２以上が同じであるなら 50 (222) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ば、薬物のレベルを増大させることによって、同時選択を行うことができる。好適なマー カーは当業者に周知であり、以下のいずれか１つ：ネオマイシン／Ｇ４１８、ピューロマ イシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、メトトレキサートおよびブラスチサイジンに対し て耐性を付与するポリペプチド産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。薬 剤選択（または任意の他の好適な選択マーカーを用いた選択）は、本発明の細胞および細 胞系の産生において必要な工程ではないが、トランスフェクトされた細胞集団を安定して トランスフェクトされた細胞が多くなるようにするために用いることができる。ただし、 トランスフェクトされた構築物は薬剤耐性を付与するように設計されているものとする。 両旨味受容体サブユニットを発現する細胞、および場合によってＧタンパク質、または両 甘味受容体サブユニットおよび場合によってＧタンパク質を発現する細胞のその後の選択 10 がシグナリングプローブを用いて行われる場合、トランスフェクション後の時期尚早の選 択の結果、一時的なだけであって安定してトランスフェクトされない陽性細胞が得られる 可能性がある。しかし、この影響は、トランスフェクトされた細胞における一時的発現の 希釈のために十分な細胞継代を可能にすることによって最小限に抑えることができる。 【０８０５】 いくつかの実施形態では、味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニット または甘味受容体サブユニット）または場合によってＧタンパク質をコードする核酸を誘 導するために用いられるベクターは、ＲＮＡタグ配列をコードする核酸配列を含む。「Ｒ ＮＡタグ配列」とは、発現されたＲＮＡまたはシグナリングプローブにより検出されるＲ ＮＡの一部である核酸配列を指す。シグナリングプローブは種々のＲＮＡ配列を検出する 20 ことができる。これらのＲＮＡのうちのいずれかをタグとして用いることができる。シグ ナリングプローブは、このプローブがタグのＲＮＡ配列に対して相補性である部分を含む ように設計することにより、ＲＮＡタグを対象とすることができる。タグ配列は、同時転 写され、シグナリングプローブ結合の標識配列を含むベクターの３’非翻訳領域であり得 る。対象の核酸から産生されるＲＮＡはタグ配列を含み得るか、またはタグ配列は５’− 非翻訳領域または３’−非翻訳領域内に位置し得る。いくつかの実施形態では、タグは、 対象の核酸から産生されるＲＮＡの一部ではない。タグ配列は、産生されるタンパク質を 標識したいかどうかによって、対象の核酸のメッセージのタンパク質をコードする部分と ともに、フレーム内であってもよいし、またはフレーム外であってもよい。したがって、 タグ配列は、シグナリングプローブによる検出のために翻訳される必要はない。タグ配列 30 は、同一または異なる複数の標的配列を含んでもよく、この場合、１つのシグナリングプ ローブは各標的配列とハイブリダイズする。タグ配列は、二次構造を有するＲＮＡをコー ドすることができる。この構造は、三又接合構造であってよい。本発明において使用でき るタグ配列であって、これに対するシグナリングプローブを調製することができるタグ配 列の例には、例えば、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、プロテイ ンＣ、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＬＵ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質、種々 の公知磁気タグ、ＦＬＡＧ、ＢＣＣＰ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ−タグ、 Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−２、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｓ−タグ、チオレドキシン、 ＧＳＴ、Ｖ５、ＴＡＰまたはＣＢＰなどのエピトープタグのＲＮＡ転写産物が含まれるが 、これらに限定されるものではない。本明細書中で記載するように、当業者はＲＮＡタグ 40 配列を容易に調製することができ、そして使用することができる。 【０８０６】 本発明の細胞および細胞系を作製するために、例えば、米国特許第６，６９２，９６５ 号および国際特許公開第ＷＯ／２００５／０７９４６２号に記載されている方法を用いる ことができる。これらの文書はどちらも、あらゆる目的についてそれらの全体として参照 することによって本明細書中に組み込まれる。これらの方法は、本発明の細胞および細胞 系を作製するのに好適であり、数百万個の細胞のリアルタイム予測を提供し、したがって 、対象の核酸配列を発現する（すなわち、ＲＮＡを産生する）任意の所望の数のクローン （数十ないし数百個のクローン）を選択することができる。フローサイトメトリーによる 細胞分類（例えば、ＦＡＣＳ機を使用）または磁気細胞分類（例えば、ＭＡＣＳ機を使用 50 (223) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ）などの細胞分類技術を用いて、１個のウェルあたり１個の選択された細胞を、高い統計 的信頼度で培養容器（たとえば、９６ウェル培養プレート）中に自動的に入れることがで きる。この技術の速度および自動化により、多重遺伝子細胞系（すなわち、味覚受容体（ 例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニットならび に場合によってＧタンパク質を発現するもの）を容易に単離することが可能になる。 【０８０７】 この技術を使用して、細胞または細胞系において発現された各味覚受容体サブユニット （例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニット）（および場合によっ てＧタンパク質）のＲＮＡ配列を、シグナリングプローブ（分子ビーコンまたは蛍光発生 プローブとも呼ぶ）を用いて検出することができる。いくつかの実施形態では、分子ビー 10 コンは前述のように標的配列を認識する。別の実施形態では、分子ビーコンは、味覚受容 体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニット）（ま たはＧタンパク質）自体の配列を認識する。シグナリングプローブは、プローブがそれぞ れタグまたは味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットもしくは甘味受 容体サブユニット）（またはＧタンパク質）のＲＮＡ配列に相補的である部分を含むよう に設計することによって、ＲＮＡタグまたは味覚受容体サブユニット配列（例えば、旨味 受容体サブユニット配列もしくは甘味受容体サブユニット配列）（またはＧタンパク質配 列）を対象とすることができる。 【０８０８】 味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニ 20 ット）（および場合によってＧタンパク質をコードする核酸）をコードする核酸、または 味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニッ ト）（もしくはＧタンパク質）およびタグ配列をコードする配列、ならびに場合によって 選択可能なマーカーをコードする核酸を周知の方法によって選択された宿主細胞中に導入 することができる。遺伝子活性化配列を、当該技術分野で周知の従来法を用いて同様にし て、細胞中に導入することができる。この方法としては、トランスフェクション、ウイル ス送達、タンパク質もしくはペプチド介在性挿入、共沈法、脂質系送達試薬（リポフェク ション）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試薬、エレクト ロポレーションまたは機械的送達が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ト ランスフェクション試薬の例は、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ２、ＬＩ 30 ＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００、ＦＵＧＥＮＥ６、ＦＵ ＧＥＮＥ ＨＤ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、ＴＦＸ−５０、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭ ＩＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ、ＧＥＮＥＳＨＵＴＴＬＥ、ＴＲ ＯＪＥＮＥ、ＧＥＮＥＳＩＬＥＮＣＥＲ、Ｘ−ＴＲＥＭＥＧＥＮＥ、ＰＥＲＦＥＣＴＩＮ 、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ、ＳＩＰＯＲＴ、ＵＮＩＦＥＣＴＯＲ、ＳＩＦＥＣＴＯＲ、ＴＲ ＡＮＳＩＴ−ＬＴ１、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ２、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ＩＦ ＥＣＴ、ＲＮＡＩ ＳＨＵＴＴＬＥ、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ、ＬＹＯＶＥＣ、ＬＩＰＯ ＴＡＸＩ、ＧＥＮＥＥＲＡＳＥＲ、ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ、ＣＹＴＯＰＵＲＥ、ＪＥＴＳＩ 、ＪＥＴＰＥＩ、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ、ＰＯＬＹＦＥＣＴ、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＡＮＧ ＥＲ、ＲＮＡｉＦＥＣＴ、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ、ＴＦ−ＰＥＩ−Ｋ 40 ＩＴ、ＣＬＯＮＦＥＣＴＩＮ、およびＭＥＴＡＦＥＣＴＩＮＥである。味覚受容体サブユ ニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニット）核酸配列（お よび潜在的にはＧタンパク質をコードする核酸）を細胞中のゲノムの様々な位置で組み込 むことができる。味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味 受容体サブユニット）およびＧタンパク質をコードする核酸の発現レベルは、組み込み部 位によって変わり得る。 【０８０９】 味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニ ット）をコードする配列または味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）遺 伝子活性化配列を宿主細胞中に導入（そして場合によってＧタンパク質をコードする配列 50 (224) JP 2012-516687 A 2012.7.26 をそれらの細胞中に導入または活性化）し、場合によってその後に薬剤選択した後、分子 ビーコン（例えば、蛍光発生プローブ）を当該細胞中に導入し、そして細胞分類を用いて 、それらのシグナルそしてひいては所望の核酸配列の発現（ＲＮＡ）について陽性の細胞 を単離する。熟練者は、この分類が任意の所望の発現レベルについてゲートで制御され得 ることを理解するであろう。所望により、数ラウンドの分類を実施することができる。一 実施形態では、フローサイトメトリー細胞分類器はＦＡＣＳ機である。ＭＡＣＳ（磁気細 胞分類）またはレーザー対応分析を用いた陰性細胞のレーザーアブレーションおよびプロ セッシングも使用することができる。この方法にしたがって、甘味受容体サブユニットＴ １Ｒ２およびＴ１Ｒ３（ならびに場合によってＧタンパク質）または旨味受容体サブユニ ットＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３（ならびに場合によってＧタンパク質）を発現する細胞を検 10 出し、回収する。 【０８１０】 本発明のこの実施形態において有用なシグナリングプローブは当該技術分野で公知であ る。それらは一般的に、標的配列に対して相補的な配列と、プローブが標的配列と結合し ない場合にはシグナルが放出されず、プローブが標的配列と結合する場合にシグナルが放 出されるように配列されたシグナル放出系とを含むオリゴヌクレオチドである。非限定的 例として、シグナリングプローブは、クエンチャーとフルオロフォアとが一緒になって非 結合プローブに取り込まれるようにプローブ中に配置されたフルオロフォアおよびクエン チャーを含んでもよい。プローブと標的配列とが結合すると、クエンチャーとフルオロフ ォアは分離し、その結果、シグナルが放出される。国際公開第ＷＯ／２００５／０７９４ 20 ６２号は、例えば、本発明の細胞および細胞系の産生に使用することができ、好ましくは 使用される多くのシグナリングプローブを記載する。タグ配列を使用する場合、味覚受容 体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニット）（ま たは場合によってＧタンパク質）のそれぞれのベクターは、同じかまたは異なるタグ配列 を含み得る。タグ配列が同じであるかまたは異なっているかに関わらず、シグナリングプ ローブは異なるシグナルエミッター、例えば異なる色のフルオロフォアを含んでもよく、 したがって各サブユニット（およびＧタンパク質）の（ＲＮＡ）発現を別に検出すること ができる。例として、甘味受容体Ｔ１Ｒ２ ｍＲＮＡまたは旨味受容体Ｔ１Ｒ１ ｍＲＮ Ａを特異的に検出するシグナリングプローブは、赤色フルオロフォアを含み得、甘味／旨 味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニット（ＲＮＡ）を検出するプローブは、緑色フルオロフォアを 30 含み得、場合によって、Ｇタンパク質（ＲＮＡ）を検出するプローブは、黄色蛍光フルオ ロフォアを含み得る。当業者は、トランスフェクトされた細胞においてシグナリングプロ ーブで２個（または場合によって３個）の発現されたＲＮＡの発現を異なって検出する他 の手段を知っているであろう。 【０８１１】 シグナリングプローブをコードする核酸を、選択された宿主細胞中に、これらに限定さ れるものではないが、トランスフェクション、共沈法、脂質系送達試薬（リポフェクショ ン）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試薬、エレクトロポ レーションまたは機械的送達をはじめとする、当業者に周知の多くの手段のうちのいずれ かによって導入することができる。トランスフェクション試薬の例は、ＧＥＮＥＰＯＲＴ 40 ＥＲ、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ２、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩ ＮＥ２０００、ＦＵＧＥＮＥ６、ＦＵＧＥＮＥ ＨＤ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、Ｔ ＦＸ−５０、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴ ＡＭ、ＧＥＮＥＳＨＵＴＴＬＥ、ＴＲＯＪＥＮＥ、ＧＥＮＥＳＩＬＥＮＣＥＲ、Ｘ−ＴＲ ＥＭＥＧＥＮＥ、ＰＥＲＦＥＣＴＩＮ、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ、ＳＩＰＯＲＴ、ＵＮＩＦ ＥＣＴＯＲ、ＳＩＦＥＣＴＯＲ、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ１、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ２、Ｔ ＲＡＮＳＩＴ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ＩＦＥＣＴ、ＲＮＡＩ ＳＨＵＴＴＬＥ、ＭＥＴＡＦＥ ＣＴＥＮＥ、ＬＹＯＶＥＣ、ＬＩＰＯＴＡＸＩ、ＧＥＮＥＥＲＡＳＥＲ、ＧＥＮＥＪＵＩ ＣＥ、ＣＹＴＯＰＵＲＥ、ＪＥＴＳＩ、ＪＥＴＰＥＩ、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ、ＰＯＬＹ ＦＥＣＴ、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＡＮＧＥＲ、ＲＮＡｉＦＥＣＴ、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、Ｅ 50 (225) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＦＦＥＣＴＥＮＥ、ＴＦ−ＰＥＩ−ＫＩＴ、ＣＬＯＮＦＥＣＴＩＮ、およびＭＥＴＡＦＥ ＣＴＩＮＥである。 【０８１２】 一実施形態では、シグナリングプローブを、味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受 容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニット）をコードするＲＮＡの一部またはその ５’もしくは３’非翻訳領域の一部（またはＧタンパク質をコードするＲＮＡの類似した 部分）のいずれかに対して相補性であるように設計する。対象のメッセンジャーＲＮＡを 認識するように設計されたシグナリングプローブが内因的に発現された標的配列を検出で きる場合でも、トランスフェクトされた細胞または遺伝子活性化された細胞により産生さ れた対象の配列の割合と比較したこれらの配列の割合は、ソーターが２つの細胞型を識別 10 できるようなものである。 【０８１３】 具体的な実施形態では、同じかまたは他のコーディングエクソン、非コーディングイン トロンまたは非コーディング非翻訳配列内の他の配列に対する（例えば相補性の）シグナ リングプローブも設計することができ、使用することができる。特定の実施形態では、甘 味受容体（例えば、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３）または旨味受容体（例えば、Ｔ１Ｒ１およ びＴ１Ｒ３）のシグナリング経路を含むシグナリング経路の成分に対するシグナリングプ ローブも使用することができる。 【０８１４】 味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニ 20 ット）（および場合によってＧタンパク質）の発現レベルは、細胞ごとに、または細胞系 ごとに異なり得る。細胞または細胞系における発現レベルも、ＤＮＡメチル化および遺伝 子サイレンシングならびにトランス遺伝子コピーの喪失などのエピジェネティック事象の ために時間とともに減少し得る。これらの変動は、様々な因子、例えば、細胞によって取 り込まれるトランス遺伝子のコピー数、トランス遺伝子のゲノム組み込み部位、およびゲ ノムの組み込み後のトランス遺伝子の完全性が原因であり得る。ＦＡＣＳまたは他の細胞 分類方法（すなわち、ＭＡＣＳ）を用いて発現レベルを評価することができる。シグナリ ングプローブを導入するさらなるラウンドを用いて、細胞がもともと単離されたＲＮＡの いずれか１つ以上について時間がたつにつれ、この細胞が陽性のままであるかそしてその 程度を測定することができる。 30 【０８１５】 具体的な実施形態では、少なくとも１つのシグナリングプローブについて様々な絶対的 または相対的蛍光レベルを有する細胞を、例えばＦＡＣＳにより、全細胞集団に対して好 適な蛍光レベルを有する細胞のサブセットをゲートで制御することによって、単離するこ とができる。例えば、特定のシグナリングプローブ（またはシグナリングプローブの組み 合わせ）について最高の蛍光シグナルを有する細胞の上位５％、上位１０％、上位１５％ 、上位２０％、上位２５％、上位３０％、上位３５％、上位４０％、上位４５％、上位５ ０％、上位５５％、上位６０％、または上位６５％を、例えば、ＦＡＣＳによりゲートで 制御し、そして単離することができる。他の実施形態では、特定のシグナリングプローブ （またはシグナリングプローブの組み合わせ）について最高の蛍光シグナルを有する細胞 40 の上位２％∼３％、上位５％∼１０％、上位５％∼１５％、上位５％∼２０％、上位５％ ∼３０％、上位４０％∼５０％、上位１０％∼３０％、上位１０％∼２５％、または上位 １０％∼５０％を、例えばＦＡＣＳによりゲートで制御し、そして単離することができる 。 【０８１６】 Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３、またはＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３、（ならびに場合によってＧ タンパク質）のＲＮＡを発現する細胞が単離されたら、細胞を培地中任意の条件下で、サ ブユニット（および場合によってＧタンパク質）（ＲＮＡまたはタンパク質）を安定して 発現し、さらに好ましくは機能的味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体） （および場合によってＧタンパク質）を発現する細胞を産生し、同定するために十分な時 50 (226) JP 2012-516687 A 2012.7.26 間、培養することができる。本発明の別の実施形態では、接着細胞を細胞分類および単一 細胞の単離の前または後に懸濁液にすることができる。一実施形態では、単離された細胞 を個々に増殖させるか、またはプールして、細胞の集団を生じさせることができる。個々 のまたは複数の細胞または細胞系も別々に増殖させるかまたはプールすることができる。 細胞または細胞系のプールがサブユニットを、さらに好ましくは機能的味覚受容体（例え ば、旨味受容体もしくは甘味受容体）を安定して発現する場合、この特性を有する細胞も しくは細胞系または細胞もしくは細胞系のセットが同定されるまで、さらに分画すること ができる。これにより、それぞれを別々に維持する必要が無く、多数の細胞および細胞系 を維持するのがさらに容易になる。このように、細胞または細胞系のプールを陽性細胞が 多くなるようにすることができる。濃縮されたプールは、所望の特性または活性について 10 少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少な くとも９０％、または１００％陽性である。 【０８１７】 さらなる態様では、本発明は、本発明の細胞および細胞系を産生するための方法を提供 する。一実施形態では、当該方法は次の工程： ａ）１以上の味覚受容体サブユニット、例えば旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体 サブユニット、および場合によってＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを発現する複数の 細胞を提供する工程； ｂ）細胞を個別に各培養容器中に分散させ、これにより複数の独立した細胞培養を提供す る工程； 20 ｃ）細胞を所望の培養条件のセットのもと、条件が独立した細胞培養のそれぞれと実質的 に同じであることを特徴とする自動化細胞培養法を用いて培養し、その培養の間、それぞ れの独立した細胞培養における細胞の数が標準化され、独立した培養を同じスケジュール で継代する工程； ｄ）味覚受容体、例えば旨味受容体または甘味受容体の少なくとも１つの所望の特性につ いて、少なくとも２回、独立した細胞培養を分析する工程；および ｅ）両アッセイにおいて所望の特性を有する独立した細胞培養を同定する工程 を含む。 【０８１８】 当該方法にしたがって、細胞を所望のセットの培養条件下で培養する。条件は、任意の 30 所望の条件であり得る。当業者は、どのパラメータがある培養条件のセットに含まれる他 を理解するであろう。例えば、培養条件には、これらに限定されるものではないが：培地 （基本培地（ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、無血清、含血清、完全既知組成、動物由来成 分を含まない）、一価および二価イオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシ ウム）濃度、追加されるさらなる成分（アミノ酸、抗生物質、グルタミン、グルコースま たは他の炭素源、ＨＥＰＥＳ、チャンネルブロッカー、他の標的のモジュレータ、ビタミ ン類、微量元素、重金属、補因子、増殖因子、抗アポトーシス試薬）、新鮮な培地または 馴化培地、ＨＥＰＥＳの有無、ｐＨ、ある栄養素がないかまたは少ない（アミノ酸、炭素 源））、分裂／継代前に細胞が達成し得る集密度のレベル、細胞のフィーダー層、または ガンマ照射細胞、ＣＯ２、三気体系（酸素、窒素、二酸化炭素）、湿度、温度、静置また 40 はシェーカー上など、当業者に周知のものが含まれる。 【０８１９】 簡便のため、または細胞の特定の所望の用途のために、細胞培養条件を選択することが できる。有利には、本発明は、特定の所望の用途に最適の細胞および細胞系を提供する。 すなわち、細胞を特定の所望の用途のための条件下で培養する本発明の実施形態では、所 望の用途のための条件下で所望の特性を有する細胞が選択される。 【０８２０】 例として、細胞が接着性であることが望ましいプレートにおけるアッセイで細胞を使用 する場合、アッセイの条件下で接着性を示す細胞を選択することができる。同様に、細胞 をタンパク質産生に使用する場合、細胞を、タンパク質産生に適切な条件下で培養し、こ 50 (227) JP 2012-516687 A 2012.7.26 の使用のために有利な特性について選択することができる。 【０８２１】 いくつかの実施形態では、当該方法は、独立した細胞培養の増殖速度を測定するさらな る工程を含む。増殖速度は、熟練者に周知の種々の技術のいずれかを用いて測定すること ができる。そのような技術としては、ＡＴＰ、細胞集密度、光散乱、光学密度（例えば、 ＤＮＡについてのＯＤ２６０）の測定が挙げられるが、これらに限定されるものではない 。好ましくは、増殖速度は、選択された培養条件外での培養時間を最小限に抑える手段を 用いて測定する。 【０８２２】 いくつかの実施形態では、細胞集密度を測定し、増殖速度を集密度値から計算する。い 10 くつかの実施形態では、細胞を分散させ、精度向上のために細胞集密度を測定する前に凝 集塊を除去する。細胞の単分散のための手段は周知であり、例えば、分散試薬を測定され る培養物に添加することによって行うことができる。分散剤は周知であり、容易に入手可 能であり、酵素分散剤、例えばトリプシン、およびＥＤＴＡ系分散剤が挙げられるが、こ れらに限定されるものではない。増殖速度は、ＨＡＭＩＬＴＯＮ ＶＥＣＴＯＲなどのそ の目的ための商業的に入手可能なソフトウェアを用いて集密度データから計算することが できる。自動化顕微鏡的プレートリーダーを用いるなどの自動化集密度測定が特に有用で ある。集密度を測定するプレートリーダーは商業的に入手可能であり、ＣＬＯＮＥ ＳＥ ＬＥＣＴ ＩＭＡＧＥＲ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）が挙げられるが、これに限定されるものでは ない。典型的には、少なくとも２回の細胞集密度測定を行った後、増殖速度を計算する。 20 増殖速度を決定するために用いる集密度値の数値は、培養に好都合であるかまたは好適な 任意の数値であり得る。例えば、集密度は例えば、１週間、２週間、３週間または任意の 長さの時間にわたって、望ましい任意の頻度で複数回測定することができる。 【０８２３】 増殖速度が既知の場合、当該方法にしたがって、複数の独立した細胞培養物を増殖速度 の類似性により分ける。培養を増殖速度ビンに分類することにより、群中の培養物を一緒 に操作することができ、これにより培養間のばらつきを軽減する別のレベルの標準化が提 供される。例えば、１つのビン中の培養を同時に継代することができる、所望の試薬で同 時に処理することができる等。さらに、機能的アッセイ結果は、典型的にはアッセイウェ ル中の細胞密度に依存する。個々のクローンの真の比較は、これらを同じ密度でプレーテ 30 ィングし、分析することによってのみ達成される。特定の増殖速度コホートに分類するこ とにより、クローンをハイスループット形式で機能的に特性化することを可能にする特定 の密度でクローンをプレーティングすることが可能になる。 【０８２４】 各群における増殖速度の範囲は、任意の都合のよい範囲であり得る。細胞を同時に継代 することを可能にし、細胞数の頻繁な繰り込みを回避する増殖速度の範囲を選択すること が特に有利である。増殖速度群は、厳密な分類については非常に狭い範囲を含み、例えば 互いに１時間以内の平均倍加時間を含み得る。しかし、当該方法によれば、範囲は、互い の２時間まで、３時間まで、４時間まで、５時間までまたは１０時間まで、またはさらに 広範囲であり得る。繰り込みの必要性は、ビンにおける増殖速度が同じでなく、したがっ 40 て、一部の培養における細胞数が他のものよりも速く増大する場合に生じる。あるビンに おいて全ての培養について実質的に同じ条件を維持するために、定期的に細胞を除去して 、ビン全体の数を繰り込む必要がある。増殖速度が異なるほど、より頻繁に繰り込みが必 要になる。 【０８２５】 工程ｄ）において、細胞および細胞系を：ゲノムによってコードされる細胞プロセスに おける変化；ゲノムによって調節される細胞プロセスにおける変化；染色体活性のパター ンにおける変化；染色体サイレンシングのパターンにおける変化；遺伝子サイレンシング のパターンにおける変化；遺伝子活性化のパターンまたは効率における変化；遺伝子発現 のパターンまたは効率における変化；ＲＮＡ発現のパターンまたは効率における変化；Ｒ 50 (228) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＮＡｉ発現のパターンまたは効率における変化；ＲＮＡプロセッシングのパターンまたは 効率における変化；ＲＮＡ輸送のパターンまたは効率における変化；タンパク質翻訳のパ ターンまたは効率における変化；タンパク質フォールディングのパターンまたは効率にお ける変化；タンパク質アセンブリのパターンまたは効率における変化；タンパク質修飾の パターンまたは効率における変化；タンパク質輸送のパターンまたは効率における変化； 膜タンパク質の細胞表面への輸送パターンまたは効率における変化；増殖速度における変 化；細胞サイズにおける変化；細胞形状における変化；細胞形態における変化；ＲＮＡ含 有量（％）における変化；タンパク質含有量（％）における変化；含水量（％）における 変化；脂質含有量（％）における変化；リボソーム含有量における変化；ミトコンドリア 含有量における変化；ＥＲ量における変化；細胞膜表面積における変化；細胞容積におけ 10 る変化；細胞膜の脂質組成における変化；核膜の脂質組成における変化；細胞膜のタンパ ク質組成における変化；核膜のタンパク質組成における変化；分泌小胞の数における変化 ；リソソームの数における変化；液胞の数における変化；細胞の：タンパク質産生、タン パク質分泌、タンパク質フォールディング、タンパク質アセンブリ、タンパク質修飾、タ ンパク質の酵素修飾、タンパク質グリコシル化、タンパク質リン酸化、タンパク質脱リン 酸化、代謝産物生合成、脂質生合成、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、栄養の 吸収、細胞増殖、有糸分裂、減数分裂、細胞分裂、脱分化するため、幹細胞へ変換するた め、多能性細胞へ変換するため、全能細胞へ変換するため、任意の臓器（すなわち、肝臓 、肺、皮膚、筋肉、膵臓、脳、精巣、卵巣、血液、免疫系、神経系、骨、心臓血管系、中 枢神経系、胃腸管、胃、甲状腺、舌、胆嚢、腎臓、鼻、眼、爪、毛、味蕾）を幹細胞型へ 20 変換するため、分化した任意の細胞型（すなわち、筋肉、心筋、ニューロン、皮膚、膵臓 、血液、免疫、赤血球、白血球、キラーＴ細胞、腸内分泌細胞、味覚、分泌細胞、腎臓、 上皮細胞、内皮細胞（核酸配列の導入のために使用できる、すでに記載した動物もしくは ヒト細胞型のいずれかも包含する））へ変換するため、ＤＮＡを取り込むため、小分子を 取り込むため、蛍光発生プローブを取り込むため、ＲＮＡを取り込むため、固体表面へ接 着するため、無血清条件へ適合させるため、無血清懸濁条件へ適合させるため、細胞培養 を拡大するために適合させるため、大規模細胞培養に使用するため、創薬で使用するため 、ハイスループットスクリーニングで使用するため、機能的細胞ベースのアッセイで使用 するため、カルシウムフラックスアッセイで使用するため、Ｇタンパク質レポーターアッ セイで使用するため、レポーター細胞ベースのアッセイで使用するため、ＥＬＩＳＡ研究 30 で使用するため、インビトロアッセイで使用するため、インビボ用途で使用するため、二 次試験で使用するため、化合物試験で使用するため、結合アッセイで使用するため、パニ ングアッセイで使用するため、抗体パニングアッセイで使用するため、イメージングアッ セイで使用するため、顕微鏡イメージングアッセイで使用するため、マルチウェルプレー ト中で使用するため、自動化細胞培養に適合させるため、小型自動化細胞培養に適合させ るため、大規模自動化細胞培養に適合させるため、マルチウェルプレート（６、１２、２ ４、４８、９６、３８４、１５３６またはさらに高密度）中での細胞培養に適合させるた め、細胞チップで使用するため、スライド上で使用するため、スライドガラス上で使用す るため、スライドもしくはスライドガラス上でのマイクロアレイのため、免疫蛍光研究の ため、タンパク質精製で使用するため、バイオロジー産生で使用するため、工業用酵素の 40 製造において使用するため、研究用試薬の製造において使用するため、細胞療法で使用す るため、動物もしくはヒトへの移植において使用するため、細胞により分泌される因子の 単離において使用するため、ｃＤＮＡライブラリ調製のため、ＲＮＡの精製のため、ＤＮ Ａの精製のため、病原体、ウイルスまたは他の作用物質による感染のため、病原体、ウイ ルスまたは他の作用物質に対する耐性のため、薬物に対する耐性のため、自動化小型細胞 培養条件下での維持に対する適合性のため、タンパク質結晶学、免疫系の刺激，抗体産生 または抗体の生成もしくは試験を包含する特性化のためにタンパク質産生において使用す るための能力または可能性を包含するがこれに限定されるものではない任意の生理学的特 性について試験し、選択することができる。当業者は、前記特性のいずれかについて好適 な試験を容易に理解するであろう。特定の実施形態では、これらの物理的性質の１以上は 50 (229) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、味覚受容体（例えば、甘味受容体もしくは旨味受容体）に関連する一定の物理的性質で ある可能性があり、機能的味覚受容体（例えば、甘味受容体もしくは旨味受容体）の発現 をモニタリングするために使用することができる。 【０８２６】 本発明の細胞および細胞系の特性化および／または適合したパネルにのために使用でき る試験には：アミノ酸分析、ＤＮＡシーケンシング、タンパク質シーケンシング、ＮＭＲ 、タンパク質輸送試験、核細胞質間輸送試験、タンパク質の細胞内局在化試験、核酸の細 胞内局在化試験、顕微分析、超顕微鏡的分析、蛍光顕微鏡検査法、電子顕微鏡法、共焦点 顕微鏡法、レーザーアブレーション技術、細胞計数および透析が含まれるが、これらに限 定されるものではない。熟練者は前述の試験のいずれの使用法も理解しているであろう。 10 【０８２７】 当該方法にしたがって、増殖速度を測定する工程の前に細胞または細胞系が各培養中に 分散されている限り、細胞を任意の細胞培養において培養することができる。例えば、簡 便のために、細胞をまず所望の条件下で培養するためにプールし、次いで各細胞をウェル または容器あたり１個の細胞で分けることができる。 【０８２８】 細胞を、任意の都合のよい数のウェルを有するマルチウェル組織培養プレート中で培養 することができる。そのようなプレートは容易に商業的に入手可能であり、当業者には周 知であろう。場合によって、細胞は好ましくはバイアル中または任意の都合のよい形式で 培養することができ、種々の形式が熟練者に公知であり、商業的に容易に入手可能である 20 。 【０８２９】 増殖速度を測定する工程を含む実施形態において、増殖速度を測定する前に、培養条件 に細胞が馴化するために十分な時間、細胞を培養する。当業者には理解されるように、時 間の長さは、細胞型、選択された条件、培養形式などの多くの因子によって変わり、１日 から数日、１週間までまたはそれ以上の任意の時間の長さであり得る。 【０８３０】 好ましくは、複数の独立した細胞培養における各培養を、標準化された維持スケジュー ルをはじめとする以下で議論するのと実質的に同じ条件下で維持する。当該方法の別の有 利な特性は、多数の個々の培養を同時に維持することができ、したがって所望のセットの 30 特性を有する細胞を、ごくまれな場合であっても同定できることである。これらおよび他 の理由から、本発明によれば、複数の独立した細胞培養物を、自動化細胞培養法を用いて 培養し、したがって条件は、各ウェルについて実質的に同じである。自動化細胞培養は、 手動細胞培養に内在する避けがたいバラツキを防止する。 【０８３１】 任意の自動化細胞培養系を本発明の方法で用いることができる。多くの自動化細胞培養 系が商業的に入手可能であり、当業者には周知であろう。いくつかの実施形態では、自動 化システムはロボットシステムである。好ましくは、システムには、独立して動くチャン ネル、マルチチャンネルヘッド（例えば９６チップヘッド）およびグリッパーまたはチェ リーピッキングアームおよび作業中の無菌状態を維持するためのＨＥＰＡ濾過装置が含ま 40 れる。ピペッター中のチャンネルの数は、培養の形式に適したものでなければならない。 都合のよいピペッターは、例えば、９６または３８４チャンネルを有する。そのようなシ ステムは公知であり、商業的に入手可能である。例えば、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ（ 商標）装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を本発明の方法で用いることができる。自動化システム は種々の所望の細胞培養作業を実施できるものでなければならない。そのような作業は当 業者には公知であろう。それらには：培地の除去、培地の交換、試薬の添加、細胞洗浄、 洗浄液の除去、分散剤の添加、培養容器からの細胞の除去、培養容器への細胞の添加など が含まれるが、これらに限定されるものではない。 【０８３２】 本発明の細胞または細胞系の産生は、任意の数の独立した細胞培養を含み得る。しかし 50 (230) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、方法によってもたらされる利点は、細胞の数が増えるにつれ増大する。方法において利 用できる細胞または独立した細胞培養の数に理論的上限は無い。本発明によれば、独立し た細胞培養の数は２以上であり得、さらに有利には、少なくとも３、４、５、６、７、８ 、９、１０またはそれ以上の独立した細胞培養、例えば、少なくとも１２、少なくとも１ ５、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３ ５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも４８、少なくとも５０、少なくとも７ ５、少なくとも９６、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なく とも３８４、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１ ０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００またはそれ以上であ る。 10 【０８３３】 本発明の細胞および細胞系は、発現および発現レベル（ＲＮＡまたはタンパク質）に関 して、従来法により産生される細胞および細胞系と比較して向上した安定性を有する。そ のような安定な発現により特徴づけられる細胞および細胞系を同定するために、各味覚受 容体、例えば旨味受容体または甘味受容体サブユニット、（および場合によってＧタンパ ク質）の細胞または細胞系の発現を長時間にわたって測定し、発現レベルを比較する。安 定な細胞系は、（ＲＮＡまたはタンパク質）甘味受容体Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニ ット、または旨味受容体Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニット、（および場合によってＧ タンパク質）を長時間にわたって発現し続けるであろう。本発明のいくつかの態様では、 時間経過は、少なくとも１週間、２週間、３週間など、または少なくとも１ヶ月、もしく 20 は少なくとも２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月もしくは９ヶ月 、またはその間の任意の長さの時間であり得る。 【０８３４】 単離された細胞および細胞系を、例えばｑＲＴ−ＰＣＲおよびシングルエンドポイント ＲＴ−ＰＣＲによりさらに特性化して、発現される各味覚受容体サブユニット、例えば、 旨味受容体サブユニットもしくは甘味受容体サブユニット、（またはＧタンパク質）（Ｒ ＮＡ）の絶対的量および相対量を決定することができる。好ましくは、２つのサブユニッ トの増加レベルは、本発明の細胞および細胞系において実質的に同じである。 【０８３５】 他の実施形態では、機能的味覚受容体、例えば旨味受容体または甘味受容体、（および 30 Ｇタンパク質）の発現を長時間にわたって分析する。これらの実施形態では、安定な発現 は、長時間にわたる機能分析の結果を比較することによって測定する。機能的アッセイに 基づく細胞および細胞系安定性のアッセイにより、旨味受容体のＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３ サブユニット、または甘味受容体のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニット、（および場合 によってＧタンパク質）（ＲＮＡまたはタンパク質）を安定して発現するだけでなく、サ ブユニット（およびＧタンパク質）を安定して産生し、適切に処理（例えば、翻訳後修飾 、サブユニットアセンブリ、および細胞内の局在化）して、機能的旨味受容体または甘味 受容体を産生する細胞および細胞系を同定する利点がもたらされる。 【０８３６】 本発明の細胞および細胞系は、それらのＺ’因子によって明らかになるように、高い再 40 現性のアッセイを提供するさらなる有利な特性を有する。Ｚｈａｎｇ ＪＨ， Ｃｈｕｎ ｇ ＴＤ， Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ＫＲ， “Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ ｌ パラメータ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａ ｔｉｏｎ ｏｆ ハイスループット Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ．” Ｊ． Ｂ ｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． １９９９；４（２）：６７−７３を参照。Ｚ’値は、細 胞または細胞系の質に関連する。なぜなら、この値は、細胞または細胞系がモジュレータ に対して一貫して反応する程度を反映するからである。Ｚ’は、マルチウェルプレート全 体にわたる基準化合物に対する機能的反応のシグナル対ノイズ範囲およびシグナルのバラ ツキ（すなわち、ウェルごとの）を考慮する統計的計算である。Ｚ’を、正の対照を含む 複数のウェルおよび負の対照を含む複数のウェルから得られたデータを用いて計算する。 50 (231) JP 2012-516687 A 2012.7.26 次式にしたがって、それらの標準偏差を３倍したものの合計の、それらの平均値の差に対 する比を１から引くと、Ｚ’因子が得られる： Ｚ因子＝１−（（３σ正の対照＋３σ負の対照）／（μ正の対照−μ負の対照）） 【０８３７】 Ｚ’因子の理論的最大値は１．０であり、これは、バラツキがなく、ダイナミックレン ジが無限の理想的なアッセイを示す。本明細書中で用いる場合、「高Ｚ’」とは、少なく とも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．７５もしくは少なくとも０．８、または ０．６から１．０の間の任意の小数のＺ’のＺ’因子を意味する。味覚受容体、例えば旨 味受容体または甘味受容体などの複雑な標的の場合、高Ｚ’とは、少なくとも０．４また はそれ以上のＺ’を意味する。０に近いスコアは望ましくない。なぜなら、これは正の対 10 照と負の対照との間に重なりがあることを示すからである。産業界では、簡単な細胞ベー スのアッセイに関して、０．３までのＺ’が最低限のスコアと見なされ、０．３∼０．５ のＺ’スコアは許容可能と見なされ、そして０．５を超えるＺ’スコアは優れていると見 なされる。無細胞または生化学アッセイは、さらに高いＺ’スコアに近づく可能性がある が、細胞ベースのシステムは複雑なので細胞ベースのＺ’スコアは低い傾向がある。 【０８３８】 当業者らが認識するように、１本鎖タンパク質さえも発現する従来型細胞を用いた細胞 ベースのアッセイは、典型的には０．５∼０．６より高いＺ’を達成しない。多サブユニ ットタンパク質の発現が操作された細胞（導入されたコーディング配列または遺伝子活性 化からのいずれか）は、当該技術分野で報告されていたとしても、それらの複雑さの増大 20 のために少ないであろう。そのような細胞は、アッセイで使用するには信頼性がない。な ぜなら、結果が再現可能でないからである。一方、本発明の細胞および細胞系は、より高 いＺ’値を有し、有利にはアッセイにおいて一貫した結果をもたらす。実際、味覚受容体 （例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）を発現する本発明の細胞および細胞系は、ハ イスループットスクリーニング（ＨＴＳ）適合性アッセイの基礎を提供する。なぜなら、 これらは一般的に、従来どおり産生された細胞よりも高いＺ’値を有するからである。本 発明のいくつかの態様では、細胞および細胞系は、少なくとも０．３、少なくとも０．４ 、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、または少なくとも０．８の Ｚ’をもたらす。味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）発現細胞につい て少なくとも０．３∼０．４のＺ値でも有利である。なぜなら、味覚受容体（例えば、旨 30 味受容体もしくは甘味受容体）は多重遺伝子標的であるからである。本発明の他の態様で は、本発明の細胞および細胞系は、細胞が数継代、例えば５∼２０（５∼２０の間の任意 の整数を含む）継代維持された後でも、少なくとも０．７、少なくとも０．７５または少 なくとも０．８のＺ’をもたらす。本発明のいくつかの態様では、少なくとも０．７、少 なくとも０．７５または少なくとも０．８のＺ’が、１、２、３、４もしくは５週間また は２、３、４、５、６、７、８もしくは９ヶ月（この間の任意の期間を包含する）維持さ れた細胞および細胞系において観察される。 【０８３９】 本発明の細胞および細胞系の味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）の さらなる有利な特性は、それらが甘味受容体のＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３サブユニット、ま 40 たは旨味受容体のＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３サブユニット、ならびに場合によってＧタンパ ク質を、薬物または他の選択圧の非存在下で安定して発現することである。したがって、 好適な実施形態では、本発明の細胞および細胞系は、選択圧のない培養において維持され る。さらなる実施形態では、細胞および細胞系は薬物または抗生物質なしで維持される。 本明細書中で用いる場合、細胞維持とは、それらの甘味受容体サブユニットまたは旨味受 容体サブユニット（および場合によってＧタンパク質）発現について前述のように選択し た後に細胞を培養することを指す。維持とは、細胞中に導入されたマーカーが混合集団に おいて安定な形質転換体の濃縮を可能にする細胞分類の前に選択圧（例えば、抗生物質） 下で細胞を増殖させる任意の工程を意味しない。 【０８４０】 50 (232) JP 2012-516687 A 2012.7.26 本発明の細胞および細胞系の、薬剤を使わない細胞維持および選択圧を使わない細胞維 持は多くの利点をもたらす。例えば、薬剤耐性細胞は、適切なレベルでコトランスフェク トされた対象のトランス遺伝子を発現し得ない。なぜなら、選択はトランス遺伝子の有無 に関係なく薬剤耐性遺伝子に取り込んだ細胞の生存に依存するからである。さらに、選択 的薬物および他の選択圧因子は、多くの場合変異原性であるか、または細胞の生理機能を 妨害し、細胞ベースのアッセイにおいてゆがんだ結果をもたらす。例えば、選択的薬物は アポトーシスに対する感受性を減少させ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３６（３７）：１１１６９−１１１７８（１９９７））、ＤＮＡ修 復および薬物代謝を増大させ（Ｄｅｆｆｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８（１３）：３５９５−３６０２（１９８８））、細胞のｐＨを増大させ（Ｔｈｉｅ 10 ｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３８（５） ：６８５−６９０（１９９０）；Ｒｏｅｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ． ３２（４１）：１１０４２−１１０５６（１９９３）；Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｉ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９１（３）：１１２８−１１３２（ １９９４））、リソソームおよびエンドソームのｐＨを減少させ（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３５（９）：２８１１−２８１７（１９ ９６）；Ａｌｔａｎ ｅｔ ａｉ， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８７（１０）：１５８３ −１５９８（１９９８））、細胞膜電位を減少させ（Ｒｏｅｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３２（４１）：１１０４２−１１０５６（１９９３））、塩化 物（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ． ７１（１）：２３−３２（１９９２））およ 20 びＡＴＰ（Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９０（１）：３１２−３１６（１９９３））に対する細胞膜コンダクタンスを 増大させ、そして小胞輸送の速度を増大させる（Ａｌｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９６（８）：４４３２−４４３７（１９９９ ））。このように、本発明の細胞および細胞系は、選択圧が原因の人的結果がないスクリ ーニングアッセイを可能にする。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の細胞および 細胞系を、細胞分類の前または後で、抗生物質などの選択圧因子を用いて培養しないので 、濃縮された細胞集団から始めない場合でも、所望の特性を有する細胞および細胞系が分 類によって単離される。 【０８４１】 30 別の態様では、本発明は、本発明の細胞および細胞系を使用する方法を提供する。本発 明の細胞および細胞系を、機能的味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニ ットまたは甘味受容体サブユニット）が必要とされる任意の用途で用いることができる。 細胞および細胞系を、例えば、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて、または細胞が 動物（例えば、非ヒト哺乳動物）中に移植されたインビボアッセイにおいて、例えば、味 覚受容体モジュレータ（例えば、旨味受容体モジュレータまたは甘味受容体モジュレータ ）についてスクリーニングするために；結晶学および結合研究のためにタンパク質を産生 するため；ならびに化合物選択性および投与、受容体／化合物結合反応速度および安定性 、ならびに細胞生理機能（例えば、電気生理学的機能、タンパク質輸送、タンパク質フォ ールディング、およびタンパク質調整）に対する受容体発現の影響を調査するために用い 40 ることができる。本発明の細胞および細胞系は、特異的味覚受容体サブユニット（例えば 、旨味受容体サブユニットまたは甘味受容体サブユニット）の役割を調べるためのノック ダウン研究において用いることもできる。 【０８４２】 サブユニットの種々の組み合わせを発現する細胞および細胞系を別々にまたは一緒に用 いて、味覚受容体モジュレータ（例えば、旨味受容体モジュレータまたは甘味受容体モジ ュレータ）を同定することができる。細胞および細胞系を用いて、異なる味覚受容体病理 における異なる形態の味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）の役割を、 味覚受容体のインビボ形態の同一性を種々のモジュレータに対するそれらの反応に基づい て既知形態の味覚受容体の同一性と関連づけることによって、特定することができる。こ 50 (233) JP 2012-516687 A 2012.7.26 れにより、疾患特異的または組織特異的味覚受容体モジュレータ（例えば、旨味受容体モ ジュレータまたは甘味受容体モジュレータ）の、そのような味覚受容体に関連する病理の 高度に標的化された処置に関する選択が可能になる。 【０８４３】 味覚受容体モジュレータ（例えば、旨味受容体モジュレータまたは甘味受容体モジュレ ータ）を同定するために、本発明の細胞または細胞系を、味覚受容体（例えば、旨味受容 体もしくは甘味受容体）が機能的であることが予想される条件下で試験化合物に暴露し、 次いで好適な対照、例えば、試験化合物に暴露されない細胞と比較して、味覚受容体活性 （例えば、旨味受容体活性または甘味受容体活性）における統計的に有意な変化（例えば 、ｐ＜０．０５）を検出する。既知アゴニストもしくは拮抗物質を使用する正および／ま 10 たは負の対照および／または味覚受容体サブユニット（例えば、旨味受容体サブユニット もしくは甘味受容体サブユニット）（および場合によってＧタンパク質）の異なる組み合 わせを発現する細胞も使用することができる。いくつかの実施形態では、検出および／ま たは測定される味覚受容体活性（例えば、旨味受容体活性または甘味受容体活性）は、味 覚受容体活性化（例えば、旨味受容体活性化または甘味受容体活性化）後の下流シグナリ ング事象の結果としての小胞体からのカルシウム放出である。当業者は、種々のアッセイ パラメータ、例えばシグナル対ノイズ比を最適化できることを理解するであろう。 【０８４４】 いくつかの実施形態では、本発明の１以上の細胞または細胞系を、複数の試験化合物、 例えば試験化合物のライブラリに暴露する。試験化合物のそのようなライブラリは、本発 20 明の細胞系を用いてスクリーニングして、味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味 受容体）の１以上のモジュレータを同定することができる。試験化合物は、小分子、ポリ ペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体またはそれらの抗原結合部分をはじめとする 化学的部分であってよい。抗体の場合、これらは、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体 、または完全ヒト抗体であり得る。抗体は、抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦａｂ、Ｆ ａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂなど）を含む任意の抗体の重鎖および軽鎖 または抗原結合部分の全てを含むインタクト抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン 抗体、重鎖または軽鎖可変領域の全部または抗原結合部分であってよい。 【０８４５】 いくつかの実施形態では、試験化合物に暴露する前に、本発明の細胞または細胞系を、 30 例えば、哺乳動物または他の動物の酵素、植物酵素、細菌酵素、タンパク質修飾酵素およ び脂質修飾酵素をはじめとする酵素での前処理によって修飾することができる。そのよう な酵素としては、例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、 オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、 リガーゼ細菌プロテアーゼ、腸由来のプロテアーゼ、消化管由来のプロテアーゼ、唾液中 、口腔中のプロテアーゼ、リゾール細胞／細菌由来のプロテアーゼなどを挙げることがで きる。あるいは、細胞および細胞系をまず試験化合物に暴露し、続いて酵素処理して、当 該処理により旨味受容体または甘味受容体の修飾を改変する化合物を特定することもでき る。 【０８４６】 40 いくつかの実施形態では、大きな化合物コレクションを、細胞ベースの機能的ハイスル ープットスクリーニング（ＨＴＳ）において、例えば、９６ウェル、３８４ウェル、１５ ３６ウェルまたはさらに高密度の形式を使用して、味覚受容体調節活性（例えば、旨味受 容体調節活性または甘味受容体調節活性）について試験する。いくつかの実施形態では、 試験化合物または試験化合物のライブラリを含む複数の試験化合物を、２以上の本発明の 細胞または細胞系を用いてスクリーニングすることができる。ヒト甘味受容体を発現する 本発明の細胞または細胞系の場合、細胞または細胞系を試験化合物に暴露して、望ましく ない甘味受容体活性を特徴とするか、または所望の甘味受容体活性が減少しているかまた は存在しないことを特徴とする疾患または状態の治療において使用するための甘味受容体 活性を調節する（増大させるかまたは減少させるかのいずれか）化合物を同定することが 50 (234) JP 2012-516687 A 2012.7.26 できる。さらに、本発明の方法によれば、本発明の細胞または細胞系を用いて、摂取可能 な物質において使用するための、甘味を増強するかまたは抑制する化合物もしくは物質を 同定することができる。 【０８４７】 ヒト旨味受容体を発現する本発明の細胞または細胞系において、細胞または細胞系を試 験化合物に暴露して、望ましくない旨味受容体活性、または所望の旨味受容体活性が減少 しているかもしくは存在しないことを特徴とする疾患もしくは状態の治療において使用す るための、旨味受容体活性を調節する（増大させるかまたは減少させるかのいずれか）化 合物を同定することができる。さらに、本発明の方法によれば、本発明の細胞または細胞 系を用いて、摂取可能な物質において使用するための旨味を増強または抑制する化合物も 10 しくは物質を特定することができる。 【０８４８】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系は、甘味受容体のモジュレータに 対する感受性が増大している。例えば、本発明の細胞および細胞系は、全ての既知クラス 甘味化合物、例えば、天然の甘味料（例えば、グルコース、フルクトースおよびスクロー ス）；高甘味度甘味料（例えば、ステビバ、レバウジオシドＡ、モグロシド）；ならびに 人工甘味料（例えば、アスパルテーム、サッカリン；およびアセスルファムカリウム）に 対して反応する。例えば、図２３および２４を参照。本発明の細胞および細胞系は、モジ ュレータにも反応し、Ｇタンパク質を甘味受容体の生理学的範囲のＥＣ５０またはＩＣ５ ０値で活性化する。 20 【０８４９】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系は、旨味受容体のモジュレータに 対する感受性が増大している。例えば、本発明の細胞および細胞系は、全ての既知クラス の旨味化合物、例えばＭＳＧおよびシクラミン酸ナトリウムに対して反応する。例えば、 図９∼１２を参照。本発明の細胞および細胞系は、モジュレータにも反応し、旨味受容体 の生理学的範囲のＥＣ５０またはＩＣ５０値でＧタンパク質を活性化する。 【０８５０】 本明細書中で用いる場合、ＥＣ５０とは、細胞または細胞系において最大半量の活性化 反応を誘発するために必要な化合物または物質の濃度を指す。本明細書中で用いる場合、 ＩＣ５０とは、細胞または細胞系において最大半量の抑制反応を誘発するために必要な化 30 合物または物質の濃度を指す。ＥＣ５０およびＩＣ５０値は、当該技術分野で周知の技術 、例えば、化合物または物質の濃度を旨味受容体発現細胞系または甘味受容体発現細胞系 の反応と関連づける用量反応曲線を用いて決定することができる。 【０８５１】 本発明の味覚受容体（例えば、旨味受容体もしくは甘味受容体）細胞および細胞系のさ らなる有利な特性は、これらの細胞および細胞系を用いて初期スクリーニングにおいて同 定されるモジュレータが、二次機能アッセイ、例えば、シップ／スピット、味覚試験およ び官能評価において機能的であることである。当業者らには理解されるように、初期スク リーニングアッセイにおいて同定される化合物は、典型的には、コンビナトリアルケミス トリー、医薬品化学または合成化学などにより、それらの誘導体または類似体が二次機能 40 アッセイにおいて機能的であるように修飾することができる。しかし、味覚受容体（例え ば、旨味受容体もしくは甘味受容体）を発現する本発明の細胞および細胞系の高い生理学 的関連性のために、これらの細胞および細胞系を用いて同定される多くの化合物はさらに 修飾しなくても機能的である。 【０８５２】 ある態様では、本発明で提供されるのは、細胞中に存在する自然に生じる高度の遺伝的 多様性を利用して、所望の特性（例えば、機能的味覚受容体、例えば、甘味受容体、旨味 受容体、または苦味受容体の安定および／または高発現）を付与する所望の遺伝子発現特 性を有する細胞について効率的に同定し、選択し、濃縮する方法である。本発明の方法は 、改善された特性を有する細胞を、遺伝的に多様な細胞のプールから、従来法よりも早く 50 (235) JP 2012-516687 A 2012.7.26 かつ効率的に同定、選択、および濃縮することができる。特定の実施形態では、細胞は遺 伝的に修飾されていない。他の特定の実施形態では、本発明の方法により、改善された特 性（例えば、機能的味覚受容体、例えば、甘味受容体、旨味受容体、または苦味受容体の さらに安定な、および／またはさらに高い発現）を有する新規の均一な細胞の集団の生成 が可能になる。 【０８５３】 ある実施形態では、本明細書中に記載される方法は、１以上の所望の特性（例えば、機 能的味覚受容体、例えば、甘味受容体、旨味受容体、または苦味受容体の安定および／ま たは高発現）を有する天然に存在する細胞を選択することを含む。具体的な実施形態では 、本明細書中に記載される方法は、１以上の味覚受容体遺伝子（例えば、甘味受容体遺伝 10 子または旨味受容体遺伝子）において天然に存在する変異体または突然変異を有する細胞 を選択することを含む。 【０８５４】 具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法は、遺伝子のプロモータ領域また は遺伝子の非コーディング領域（例えば、イントロン、５’非翻訳領域、および／または ３’非翻訳領域）において天然に存在する変異体または突然変異を有する細胞を選択する ことを含む。遺伝子のプロモータ領域または遺伝子の非コーディング領域における変異体 または突然変異は、遺伝子産物のさらに高い、および／または安定な発現をもたらし得る 。具体的な実施形態では、遺伝子のプロモータ領域または遺伝子の非コーディング領域中 のプロモータ領域は、ＤＮＡのメチル化もしくはアセチル化によって修飾されている。特 20 定の実施形態では、細胞は、１以上の対象の遺伝子に関してクロマチン再構築に影響を及 ぼすエピジェネティック修飾を含む。エピジェネティック修飾の非限定例としては、アセ チル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化およびＳＵＭＯ化が挙げられるが、これらに 限定されるものではない。 【０８５５】 ある別の実施形態では、本発明の方法は、前処理された細胞を選択することを含む。そ のような前処理は、太陽光または紫外線（ＵＶ）光、突然変異原、例えばエチルメタンス ルホン酸（ＥＭＳ）、および化学物質に暴露することであり得る。具体的な実施形態では 、そのような前処理には、望ましくない増殖条件、例えば、低酸素もしくは低栄養条件、 または毒性条件への暴露が含まれ得る。 30 【０８５６】 本明細書中に記載される方法は、１以上の対象の遺伝子（例えば、味覚受容体サブユニ ット遺伝子、例えば、甘味受容体サブユニット遺伝子、旨味受容体サブユニット遺伝子、 または苦味受容体サブユニット遺伝子）を発現する単離された細胞（例えば、真核細胞） の同定および／または選択を提供する。ある実施形態では、対象の遺伝子は、遺伝的変異 の結果として他の細胞よりも高いレベルで発現される。特定の実施形態では、本明細書中 で記載される方法は、（ａ）細胞（例えば、真核細胞）中に、対象のＲＮＡを検出できる （例えば、対象のＲＮＡの標的配列とハイブリダイズできる）１以上のシグナリングプロ ーブを導入し；そして（ｂ）細胞（例えば、真核細胞）が対象のＲＮＡを含むかどうかを 決定することを含む。そのような方法は、対象のＲＮＡのレベルを定量化することをさら 40 に含み得る。具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法は所望のＲＮＡ発現特 性を有する細胞を同定するためのものであって、当該方法は：（ａ）真核細胞（例えば、 真核細胞）中に、それぞれが対象のＲＮＡを検出できる複数のシグナリングプローブを導 入し；そして（ｂ）複数のシグナリングプローブにより検出されたＲＮＡレベルを定量化 することを含む。所望の遺伝子発現特性は、基準集団との比較により決定することができ る。 【０８５７】 特定の実施形態では、本明細書中で記載される方法は（ａ）細胞（例えば、真核細胞） 中に、味覚受容体（例えば、甘味受容体または旨味受容体）のＲＮＡを検出できる１以上 のシグナリングプローブを導入し；そして（ｂ）細胞（例えば、真核細胞）が味覚受容体 50 (236) JP 2012-516687 A 2012.7.26 （例えば、甘味受容体または旨味受容体）のＲＮＡを含むかどうかを決定することを含む 。そのような方法は、味覚受容体（例えば、甘味受容体または旨味受容体）のＲＮＡのレ ベルを定量化することをさらに含み得る。具体的な実施形態では、本明細書中に記載され る方法は所望のＲＮＡ発現特性を有する細胞を同定するためのものであって、当該方法は ：（ａ）真核細胞（例えば、真核細胞）中に、それぞれが対象の複数のＲＮＡを検出でき る複数のシグナリングプローブを導入し；そして（ｂ）複数のシグナリングプローブによ り検出されたＲＮＡレベルを定量化することを含む。所望の遺伝子発現特性は、基準集団 との比較によって決定することができる。特定の実施形態では、対象の複数のＲＮＡは、 次のＲＮＡ：Ｔ１Ｒ１のＲＮＡ、Ｔ１Ｒ２のＲＮＡ、Ｔ１Ｒ３のＲＮＡ、Ｇタンパク質の ＲＮＡ、および味覚受容体に関連する遺伝子のＲＮＡのいずれかの組み合わせを含み得る 10 。ある実施形態では、対象の複数のＲＮＡは、Ｔ１Ｒ１のＲＮＡおよびＴ１Ｒ３のＲＮＡ （および場合によってＧタンパク質のＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、対象の 複数のＲＮＡは、Ｔ１Ｒ２のＲＮＡおよびＴ１Ｒ３のＲＮＡ（および場合によってＧタン パク質のＲＮＡ）を含む。 【０８５８】 具体的な実施形態では、そのような方法は、細胞の定量化されたＲＮＡレベルと、基準 細胞におけるＲＮＡレベルとをそれぞれ比較する工程をさらに含む。特定の実施形態では 、複数のシグナリングプローブは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、 １５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、 １２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、５００、６００、７００、 20 ８００、９００、または少なくとも１０００のシグナリングプローブを含む。いくつかの 実施形態では、対象のＲＮＡは翻訳される。他の実施形態では、対象のＲＮＡは翻訳され ない。具体的な実施形態では、対象のＲＮＡは、味覚受容体サブユニット遺伝子（例えば 、甘味受容体サブユニット遺伝子、旨味受容体サブユニット遺伝子、または苦味受容体サ ブユニット遺伝子）によってコードされる。具体的な実施形態では、単離された細胞（例 えば、真核細胞）は対象の１以上の組換えＲＮＡを発現する。 【０８５９】 具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法によって同定および／または選択 される真核細胞は、遺伝子操作されていない（例えば、１以上のトランス遺伝子を組換え により発現しない）。他の実施形態では、本明細書中に記載される方法によって同定およ 30 び／または選択される真核細胞は、遺伝子操作されていない（例えば、１以上のトランス 遺伝子を組換えにより発現しない）．具体的な実施形態では、そのような細胞は体細胞ま たは分化細胞である。 【０８６０】 他の実施形態では、細胞は所望の遺伝子発現特性を含む。ある実施形態では、所望の遺 伝子発現特性は、遺伝子操作によるか、または遺伝的変異を増大させることにより達成さ れる。具体的な実施形態では、所望の遺伝子発現特性は、基準集団の遺伝子発現特性との 比較に基づいて決定することができる。 【０８６１】 いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、平均異種細胞集団よりも高 40 いレベルで対象のＲＮＡを発現する細胞を同定および／または選択するためのものである 。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、平均異種細胞集団（例えば 、分類されていない細胞系集団、例えば分類されていない２９３Ｔ細胞系集団）よりも高 いレベルで対象のＲＮＡ（例えば、甘味受容体または旨味受容体のＲＮＡ）を発現する細 胞を同定および／または選択するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書 中に記載される方法は、平均異種細胞集団（例えば、分類されていない細胞系集団、例え ば分類されていない２９３Ｔ細胞系集団）よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５ ０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％高いレベルで対象のＲ ＮＡ（例えば、甘味受容体または旨味受容体のＲＮＡ）を発現する細胞を同定および／ま たは選択するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法 50 (237) JP 2012-516687 A 2012.7.26 は、平均異種細胞集団（例えば、分類されていない細胞系集団、例えば分類されていない ２９３Ｔ細胞系集団）よりも少なくとも１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍 、７倍、８倍、９倍、または１０倍高いレベルで対象のＲＮＡ（例えば、甘味受容体また は旨味受容体のＲＮＡ）を発現する細胞を同定および／または選択するためのものである 。 【０８６２】 具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法は、対象のＲＮＡを平均異種細胞 集団よりも低いレベルで発現する細胞を同定および／または選択するためのものである。 異種細胞集団の例は、異なる起源の混合細胞型の細胞集団、遺伝的に異質である１つの細 胞型の細胞の細胞集団、または本明細書中に記載される方法を用いて単離された細胞が得 10 られる１つの特定の細胞系の細胞集団であり得る。 【０８６３】 特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法を用いて単離される細胞は、細胞系 由来の細胞クローンである。ある実施形態では、本明細書中に記載される方法を用いて単 離される細胞は一次細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法 を用いて単離される細胞は形質転換細胞である。 【０８６４】 ある実施形態では、細胞はヒト細胞でない。特定の実施形態では、細胞は、マウス、ラ ット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、カエル、蠕虫、昆虫（ 例えば、ハエ）、魚、甲殻類、またはウシ由来の細胞である。いくつかの実施形態では、 20 細胞は、哺乳動物細胞または真核細胞である。他の実施形態では、細胞はヒト細胞である 。いくつかの実施形態では、細胞は一次細胞である。他の実施形態では、細胞は、形質転 換細胞または細胞系の細胞クローンである。 【０８６５】 特定の態様では、甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３ サブユニットを内因的に発現する細胞を単離する方法が提供され、この場合、この方法は ： ａ）細胞の集団を提供する工程； ｂ）当該細胞中にＴ１Ｒ２の発現を検出するシグナリングプローブまたは分子ビーコンを 導入する、および／または当該細胞中にＴ１Ｒ３の発現を検出する分子ビーコンを導入す 30 る工程；および ｃ）甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを 発現する細胞を単離する工程 を含む。 【０８６６】 別の具体的な態様において、甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ ３サブユニットを内因的に発現する細胞を単離する方法が提供され、この場合、この方法 は： ａ）細胞の集団を提供する工程； ｂ）当該細胞中にＴ１Ｒ２の発現を検出する分子ビーコンを導入し、そして当該細胞中に 40 Ｔ１Ｒ３の発現を検出する分子ビーコンを導入する工程；および ｃ）甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを 発現する細胞を単離する工程 を含む。 【０８６７】 そのような方法の特定の実施態様では、細胞集団は、Ｔ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３を発現し ないと思われている。そのような方法の他の特定の実施態様では、単離された細胞におけ るＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３の任意の発現レベルは、細胞集団中の平均的細胞におけるより も少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、１０００倍、 ２５００倍、５０００倍、７５００倍、１００００倍、５００００倍、または少なくとも 50 (238) JP 2012-516687 A 2012.7.26 １０００００倍高い。味覚受容体サブユニット、例えばＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３の発現レ ベルは、当業者に公知の方法を用いて容易に決定することができる。 【０８６８】 特定の態様では、旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットおよび／または旨味受容体Ｔ１Ｒ３ サブユニットを内因的に発現する細胞を単離する方法が提供され、この方法は： ａ）細胞の集団を提供する工程； ｂ）当該細胞中にＴ１Ｒ１の発現を検出するシグナリングプローブまたは分子ビーコンを 導入する、および／または当該細胞中にＴ１Ｒ３の発現を検出する分子ビーコンを導入す る工程；および ｃ）旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットおよび／または旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを 10 発現する細胞を単離する工程 を含む。 【０８６９】 別の具体的な態様において、旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットおよび旨味受容体Ｔ１Ｒ ３サブユニットを内因的に発現する細胞を単離する方法が提供され、この方法は： ａ）細胞の集団を提供する工程； ｂ）当該細胞中にＴ１Ｒ１の発現を検出する分子ビーコンを導入し、そして当該細胞中に Ｔ１Ｒ３の発現を検出する分子ビーコンを導入する工程；および ｃ）旨味受容体Ｔ１Ｒ１サブユニットおよび／または旨味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを 発現する細胞を単離する工程 20 を含む。 【０８７０】 そのような方法の特定の実施態様では、細胞集団はＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ３を発現しな いと思われている。そのような方法の他の特定の実施態様では、単離された細胞における Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ３の任意の発現レベルは、細胞集団中の平均的細胞におけるよりも 少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、１０００倍、２ ５００倍、５０００倍、７５００倍、１００００倍、５００００倍、または少なくとも１ ０００００倍高い。味覚受容体サブユニット、例えばＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ３の発現レベ ルは、当業者に公知の方法を用いて容易に決定することができる。 【０８７１】 30 タンパク質発現レベルを決定するための方法の非限定例としては、免疫ブロット法（ウ ェスタンブロット法）、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡが挙げられる。ＲＮＡ発 現レベルを測定するための方法の非限定例としては、ノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、 およびリアルタイム定量的ＰＣＲが挙げられる。そのようなタンパク質またはＲＮＡ発現 レベルは、一般的に、集団における平均的発現レベルを決定するために細胞集団について 決定することができる。 【０８７２】 そのような方法の他の特定の実施形態では、細胞集団における遺伝的変異は、前記単離 工程の前に増大している。特定の実施形態では、そのような方法にしたがって生成した単 離された細胞が提供される。 40 苦味受容体 【０８７３】 本出願は、１以上の苦味受容体を発現するように操作された新規細胞および細胞系に関 する。いくつかの実施形態では、本発明の新規細胞または細胞系は１以上の機能的苦味受 容体を発現する。他の態様では、本発明は、新規細胞および細胞系の作製法および使用法 を提供する。 【０８７４】 本発明の一実施形態によれば、新規細胞および細胞系を天然の苦味受容体をコードする 核酸でトランスフェクトする。他の実施形態では、新規細胞および細胞系を、天然の苦味 受容体、または変異苦味受容体の対立遺伝子多型（すなわち、多型）をコードする核酸で 50 (239) JP 2012-516687 A 2012.7.26 トランスフェクトする。本発明の新規細胞系は、導入された苦味受容体を安定して発現す る。別の実施形態では、新規細胞および細胞系は、発現について遺伝子活性化によって活 性化された苦味受容体を有する。 【０８７５】 特定の実施形態では、新規細胞および細胞系は、操作された遺伝子活性化、すなわち、 内因性遺伝子の発現の活性化の結果として内因性苦味受容体を発現し、この場合、活性化 は適切な処理をしなければ細胞において自然に起こらない。操作された遺伝子活性化は、 内因性苦味受容体が適切な処理なしで細胞系において発現されない場合、内因性苦味受容 体の発現を開始させることができる。あるいは、操作された遺伝子活性化の結果、細胞系 における内因性遺伝子の発現レベルが適切な処理がなければ望ましくないほど低い場合、 10 例えば細胞系における苦味受容体の機能的アッセイに十分でない場合、内因性苦味受容の 発現レベルを増加させることができる。あるいは、操作された遺伝子活性化を用いて、例 えば、細胞系から内因性苦味受容体を単離するために、内因性苦味受容体を過剰発現させ ることができる。操作された遺伝子活性化は、当業者らに公知の多くの手段によって達成 することができる。例えば、遺伝子の転写産生の１以上の転写産生因子または転写活性化 因子は、構成的もしくは誘導性プロモータの制御下で転写産生因子または転写活性化因子 を発現する核酸を細胞中に導入することにより、過剰発現させるかまたは発現を誘発する ことができる。内因性遺伝子が誘導性プロモータの制御下にあることが知られている場合 、遺伝子の公知誘導物質に細胞を暴露することによって発現を誘発することができる。加 えて、内因性遺伝子自体をコードする核酸を細胞中に導入して、ゲノムにおけるコピー数 20 の増大により遺伝子の発現レベルを増大させることができる。さらに、細胞によって発現 させる内因性遺伝子の発現のある公知阻害物質を、当該技術分野で周知の技術、例えば、 ＲＮＡｉを用いて細胞においてノックダウンまたはさらにはノックアウトすることができ 、これにより内因性遺伝子の発現を増大させる。 【０８７６】 苦味受容体、その突然変異型、またはその天然に存在する対立遺伝子多型を含む本発明 の細胞および細胞系を用いて、特定の苦味受容体突然変異型または天然に存在する対立遺 伝子多型に対して特異的なモジュレータをはじめとする苦味受容体機能のモジュレータを 同定することができる。細胞および細胞系は、したがって、苦味受容体の個々の天然もし くは突然変異型または天然に存在する対立遺伝子多型の特性、活性および役割についての 30 情報を得るため、および特定の天然もしくは突然変異型または天然に存在する対立遺伝子 多型あるいは天然もしくは突然変異型または天然に存在する対立遺伝子多型のサブセット に対する活性を有する苦味受容体モジュレータを同定するために用いることができる。こ れらのモジュレータは、疾患状態または組織における異なって修飾された苦味受容体を標 的とする治療薬として有用である。インビボの苦味受容体の多型は、例えば、望ましくな い活性または病状の一因となり得るので、本発明の細胞および細胞系は、突然変異型また は天然に存在する対立遺伝子多型の反応の改変が望ましい可能性がある治療用のモジュレ ータについてスクリーニングするためにも用いることができる。細胞および細胞系は、苦 味受容体の天然もしくは突然変異型または天然に存在する対立遺伝子多型のサブセットの みを用いて活性を有するモジュレータを同定するためにも有用である。 40 【０８７７】 本発明はまた、安定な苦味受容体を発現する細胞および細胞系の生成における問題を特 定し、解決する。本明細書中で開示するように、本発明者らは、苦味受容体アゴニストの 誤った帰属に至る、標識された苦味受容体の発現を見いだした。特定のタグ、シグナル配 列、および／またはシャペロンは、苦味受容体の発現および／または細胞表面への輸送に 必須であるとされてきた（Ｒｅｉｃｈｌｉｎｇ， Ｍｅｙｅｒｈｏｆ ａｎｄ Ｂｅｈｒ ｅｎｓ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． １０６：１１３８−１１４８， ２００８）。 これはジレンマを生み、標識された受容体の生理学的に無関係なモジュレータの同定に至 る場合がある。したがって、本発明の生理学的に関連した細胞系は、オーファン苦味受容 体のリガンドの同定および種々の受容体−リガンド相互作用の特異性の分析を容易にする 50 (240) JP 2012-516687 A 2012.7.26 こともできる。 【０８７８】 第１の態様において、本発明は、１以上の苦味受容体を安定して発現する細胞および細 胞系を提供する。いくつかの実施形態では、発現された苦味受容体は、アゴニストにより 活性化されると細胞内遊離カルシウムを増大させる。いくつかの実施形態では、ポテンシ エーター、アゴニストまたはアクチベーターは、小分子、化学的部分、ポリペプチド、抗 体、または食物抽出物であり得る。他の実施形態では、発現された苦味受容体は、拮抗物 質により阻害されると細胞内遊離カルシウムを減少させる。いくつかの実施形態では、阻 害剤、拮抗物質またはブロッカーは、小分子、化学的部分、ポリペプチド、抗体または食 物抽出物であり得る。ポテンシエーター、アゴニスト、アクチベーター、阻害剤、拮抗物 10 質またはブロッカーは、苦味受容体の全部または特定のサブセットに対して作用し得る。 さらなる実施形態では、本発明の苦味受容体を発現する細胞および細胞系は、従来法によ って作製された細胞および細胞系と比較して向上した特性を有する。例えば、苦味受容体 を発現する細胞および細胞系は、（選択的抗生物質を含まない培養中で維持した場合でも ）向上した発現安定性を有し、その結果、高いＺ’値が得られる。他の態様では、本発明 は、苦味受容体を発現する細胞および細胞系の作製法および使用法を提供する。 【０８７９】 種々の実施形態では、本発明の細胞または細胞系は、少なくとも２、３、４、５、６、 ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２ １、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０ 20 、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、 １３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００日間または２００日 を超えて、一定の発現レベルで苦味受容体を発現し、この場合、一定の発現とは： 【０８８０】 ２∼４日の連続細胞培養にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％ ９％または１０％；５∼１５日の連続細胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０ ％または１２％；１６∼２０日の連続細胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０ ％、１２％、１４％、１６％、１８％または２０％；２１∼３０日の連続細胞培養にわた って２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２ ％、２４％；３０∼４０日の連続細胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、 30 １２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０ ％；４１∼４５日の連続細胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、 １４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；４５ ∼５０日の連続細胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、 １６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；４５∼５０日 の連続細胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、 １８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％または３５％；５０∼５５日 の連続細胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、 １８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％または３０％；５０∼５５日の連続細 胞培養にわたって２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、 40 ２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％または３５％；５５∼７５日の連続細 胞培養にわたって１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３ ０％、３５％または４０％；７５∼１００日の連続細胞培養にわたって１％、２％、３％ 、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または ４５％；１０１∼１２５日の連続細胞培養にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６ ％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；１２６∼ １５０日の連続細胞培養にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５ ％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４５％；１５１∼１７５日の連続細 胞培養にわたって１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５ ％、３０％、３５％、４０％または４５％；１７６∼２００日の連続細胞培養にわたって 50 (241) JP 2012-516687 A 2012.7.26 １％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５ ％、４０％または４５％；２００日を超える連続細胞培養にわたって１％、２％、３％、 ４％、５％、６％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％または４ ５％を超えて変化しない発現レベルを意味する。 【０８８１】 本発明によれば、細胞または細胞系によって発現される苦味受容体は、ラット、マウス 、ウサギ、ヤギ、イヌ、ウシ、ブタまたは霊長類をはじめとする任意の哺乳動物由来であ り得る。好適な実施形態では、苦味受容体はヒト苦味受容体である。 【０８８２】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は：ヒトＴＡＳ２Ｒ１をコードす 10 るヌクレオチド配列（配列番号５１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３をコードするヌクレオチド配列 （配列番号５２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）； ヒトＴＡＳ２Ｒ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号５４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ７を コードするヌクレオチド配列（配列番号５５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ８をコードするヌクレオ チド配列（配列番号５６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ９をコードするヌクレオチド配列（配列番号 ５７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１０をコードするヌクレオチド配列（配列番号５８）；ヒトＴＡ Ｓ２Ｒ１３をコードするヌクレオチド配列（配列番号５９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１４をコー ドするヌクレオチド配列（配列番号６０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１６をコードするヌクレオチ ド配列（配列番号６１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３８をコードするヌクレオチド配列（配列番号 ６２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３９をコードするヌクレオチド配列（配列番号６３）；ヒトＴＡ 20 Ｓ２Ｒ４０をコードするヌクレオチド配列（配列番号６４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４１をコー ドするヌクレオチド配列（配列番号６５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４３をコードするヌクレオチ ド配列（配列番号６６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４４をコードするヌクレオチド配列（配列番号 ６７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４５をコードするヌクレオチド配列（配列番号６８）；ヒトＴＡ Ｓ２Ｒ４６をコードするヌクレオチド配列（配列番号６９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４７をコー ドするヌクレオチド配列（配列番号７０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４８をコードするヌクレオチ ド配列（配列番号７１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４９をコードするヌクレオチド配列（配列番号 ７２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５０をコードするヌクレオチド配列（配列番号７３）；ヒトＴＡ Ｓ２Ｒ５５をコードするヌクレオチド配列（配列番号７４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ６０をコー ドするヌクレオチド配列（配列番号７５）；またはそれらの任意の組み合わせを含み得る 30 。 【０８８３】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は：ヒトＴＡＳ２Ｒ１（配列番号 ７７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３（配列番号７８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４（配列番号７９）；ヒト ＴＡＳ２Ｒ５（配列番号８０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ７（配列番号８１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ８ （配列番号８２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ９（配列番号８３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１０（配列番号 ８４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１３（配列番号８５）；ヒトＴＡＳ２Ｒ１４（配列番号８６）； ヒトＴＡＳ２Ｒ１６（配列番号８７）；ヒトＴＡＳ２Ｒ３８（配列番号８８）；ヒトＴＡ Ｓ２Ｒ３９（配列番号８９）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４０（配列番号９０）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４ １（配列番号９１）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４３（配列番号９２）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４４（配列 40 番号９３）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４５（配列番号９４）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４６（配列番号９５ ）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４７（配列番号９６）；ヒトＴＡＳ２Ｒ４８（配列番号９７）；ヒト ＴＡＳ２Ｒ４９（配列番号９８）；ヒトＴＡＳ２Ｒ５０（配列番号９９）；ヒトＴＡＳ２ Ｒ５５（配列番号１００）；ヒトＴＡＳ２Ｒ６０（配列番号１０１）；またはそれらの任 意の組み合わせのポリヌクレオチド配列を含み得る。 【０８８４】 苦味受容体をコードする核酸はゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。いくつかの実 施形態では、核酸は、野生型苦味受容体をコードする核酸配列を比較すると、１以上の突 然変異を含み、この結果、アミノ酸置換が起こる場合もあれば、起こらない場合もある。 いくつかの他の実施形態では、核酸は、所定の集団において最も頻発するある苦味受容体 50 (242) JP 2012-516687 A 2012.7.26 をコードする核酸配列と比較すると、１以上の天然に存在する対立遺伝子多型を含む。「 天然に存在する対立遺伝子多型」には、天然に存在する同じ苦味受容体の異なるアミノ酸 配列、例えば、対立遺伝子変異または多型のために所定の集団中で観察されるものが含ま れる。 【０８８５】 多型はヒトゲノムにおいて一般的な現象である。苦味受容体遺伝子内またはその付近で 起こる多型は、例えば、それらの発現レベルの上方調節もしくは下方調節によるか、また はそれらのアミノ酸配列を変更することによって、それらの発現に影響を及ぼすことがで きるか、またはそれらの機能を変更することができる。表２０は、ヒトＴＡＳ２Ｒ遺伝子 に関連する単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）を含む独自の多型の参照番号、各参照配 10 列におけるＳＮＰの位置、およびＳＮＰの説明を示す。参照番号は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（「ＮＣ ＢＩ」；Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）の単一ヌクレオチド多型データベース（「ｄｂＳＮ Ｐ」）で検索可能である。 【０８８６】 コーディング配列多様性をもたらすヒト苦味受容体遺伝子の対立遺伝子変異は、研究さ れ、文書化されている。例えば、Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐ ｈｉｓｍｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｂｉｔｔｅｒ ｔａｓｔｉｎｇ”， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏ 20 ｍｍｕｎ ２８５：１４７−１５１， ２００１；Ｗｏｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， “ Ｎａｔｕｒａｌ ｓｅｌｅｃｔｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ＰＴＣ， ａ ｂｉｔｔｅｒ−ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ，” Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍ， Ｇｅｎｅｔ． ７４：６３７−６４６， ２００４；およびＫ ｉｍ ｅｔ ａｌ．， “Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｖａｒｉａｔｏｎ ａｎｄ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｔ ｈｕｍａｎ ｂｉｔｔｅｒ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｏｃｉ”， Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ ｉｏｎ ２６：１９９−２０４， ２００５を参照。表２１は、様々なヒト苦味受容体の コーディング配列における天然のバリエーションのリストである。ヒト苦味受容体、それ らのコーディング配列の配列番号、およびタンパク質配列を最初の３列に記載する。それ 30 らの配列番号により特定されるそれぞれのコーディング配列内のヌクレオチド変化および それらの位置を、それぞれ、「ヌクレオチド変化」および「ヌクレオチド変化の位置」の 下の列に示す。それらの配列番号により特定される各苦味受容体内のアミノ酸変化は、１ 文字略号を用いて「説明」の下の列に表示する。それぞれの対応する配列番号に関するそ れらの位置は、「アミノ酸変化の位置」の下の列に表示する。加えて、「説明」の列には 、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰで検索可能なこれらの変動の識別子も含まれる。「特徴識別子」 は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂ ｒｉｄｇｅ，単位ｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）が主催するＵｎｉＰｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅによってバリエーションのいくつかに帰属される、独自で安 定な特徴識別子である。これらはＵｎｉＰｒｏｔ内で検索可能である。「ＮＡ」はＵｎｉ 40 Ｐｒｏｔによって帰属される特徴識別子がないことを示す。ヒトの味覚におけるバラツキ は周知の現象である。理論によって拘束されることを望まないが、苦味のバラツキは、苦 味受容体の多型に関連する可能性がある。例えば、ｈＴＡＳ２Ｒ３８（フェニルチオカル バミド（ＰＴＣ）の受容体）における多型は、プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）を検出 する能力と関連づけられている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｃ ｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌ ｏｃｕｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｔａｓｔｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｐｈｅ ｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｉｄｅ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：１２２１−１２２５ ， ２００３；Ｗｏｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ｈＴ２Ｒ４３遺伝子対立 遺伝子におけるある多型は、人々を天然の植物化合物であるアロインおよびアリストロキ 50 (243) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ン酸の苦味に対して非常に敏感にする。この対立遺伝子を有さない人は、低濃度ではこれ らの化合物の味が分からない。同じｈＴＡＳ２Ｒ４３遺伝子対立遺伝子のあるバリエーシ ョンは、人々をサッカリンの苦味に対してより感受性にする。加えて、密接に関連する遺 伝子の（ｈＴＡＳ２Ｒ４４の）対立遺伝子のあるバリエーションも、人々をサッカリンの 苦味に対してより感受性にする。さらに、一部の人は、あるｈＴＡＳ２Ｒ遺伝子を有さず 、これは個人間での味覚のバラツキの一因となる。苦味遺伝子における多型はまた、ある 疾患のリスクの増加と関連づけられている。異種の天然に存在する苦味受容体、またその 対立遺伝子変異体もしくは多形体を安定して発現する細胞系、あるいは天然に存在しない １以上の突然変異（例えば、ランダム突然変異または部位特異的突然変異）を有するその 突然変異型は、すべて本発明の範囲内に含まれる。 10 【０８８７】 いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書中で前述された核酸配列の断片である。断 片であるかまたはそのような修飾を有するそのような苦味受容体は、苦味受容体の少なく とも１つの生物学的特性、例えば、細胞内遊離カルシウムを増大させる能力を保持する。 本発明は、本明細書中で開示する配列と少なくとも約８５％同一である苦味受容体をコー ドするヌクレオチド配列を安定して発現する細胞および細胞系を包含する。いくつかの実 施形態では、サブユニットをコードする配列同一性は、本明細書中で提供されるサブユニ ット配列と比較して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９ ９％またはそれ以上である。本発明は、苦味受容体をコードする核酸が、ストリンジェン トな条件下で、対応する苦味受容体をコードする本明細書中で提供される核酸とハイブリ 20 ダイズする、細胞および細胞系を包含する。 【０８８８】 いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、本明細書中で提供される配列と比較し て、少なくとも１つであるが、１０、２０、３０、または４０未満のヌクレオチドによる 置換、ヌクレオチド配列の１％、５％、１０％または２０％以下の置換を含む苦味受容体 をコードする核酸配列、またはこれと実質的に同一である配列（例えば、これと少なくと も８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である か、もしくはストリンジェントな条件下で開示される配列とハイブリダイズできる配列） を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は、１０、２０、３０、もしくは４ ０未満のヌクレオチドから１％、５％、１０％または２０％以下のヌクレオチド配列まで 30 が本明細書中で提供される配列中に挿入されているか、または当該配列から欠失している 苦味受容体をコードする核酸配列、またはそれらと実質的に同一である配列例えば、それ らと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以 上同一であるか、または本明細書中に開示される配列とストリンジェントな条件下でハイ ブリダイズすることができる配列）を含む。本明細書中に記載される置換、挿入および欠 失は、本発明の細胞または細胞系において苦味受容体をコードするポリヌクレオチドのい ずれかで起こり得る。 【０８８９】 核酸置換または修飾の結果、アミノ酸置換などのアミノ酸変化が起こるいくつかの実施 形態では、天然のアミノ酸は、保存的または非保存的置換により置換されている可能性が 40 ある。いくつかの実施形態では、もとのポリペプチド配列と修飾ポリペプチド配列との間 の配列同一性は、当該ポリペプチド配列の約１％、５％、１０％または２０％が異なり得 るか、またはこれと実質的に同一である配列（例えば、これと少なくとも８５％、９０％ 、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である配列）と異なり得 る。当業者は、アミノ酸側鎖が構造および／または化学的性質において類似し、置換によ り親配列の構造的特性が実質的に変わらない、保存的アミノ酸置換を理解するであろう。 突然変異を含む核酸を含む実施形態において、突然変異はランダム突然変異または部位特 異的突然変異であり得る。 【０８９０】 保存的修飾は、非修飾苦味受容体と類似した構造的および化学的特性を有する苦味受容 50 (244) JP 2012-516687 A 2012.7.26 体を産生するであろう。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、親アミノ酸残基 と類似した化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミ ノ酸残基により置換されているものである。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク 質の機能特性を実質的に変更しない。２以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異 なる場合、配列同一性（％）または類似性の程度を上方調節して、置換の保存的性質につ いて補正することができる。この調節をするための手段は当業者に周知である。例えば、 Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４３：３０７−３１（１ ９９４）を参照。 【０８９１】 類似した化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては、１）脂肪族側鎖： 10 グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル 側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン； ４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖 ：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタ ミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好適な 保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシ ン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、およびア スパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的アミノ酸置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−４５（１９９２）で開示されるＰＡＭ２ ５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的 20 な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負値を有する任意の変化で ある。 【０８９２】 いくつかの実施形態では、苦味受容体をコードする核酸配列はさらにタグを含む。その ようなタグは、例えば、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、プロテ インＣ、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＬＵ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（Ｇ ＦＰ）、ＦＬＡＧ、ＢＣＣＰ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｏｆｔ ａｇ−１、Ｓｏｆｔａｇ−２、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｓ−タグ、チオレドキシン、ＧＳＴ、 Ｖ５、ＴＡＰまたはＣＢＰをコードすることができる。タグを、苦味受容体発現レベル、 細胞内局在性、タンパク質−タンパク質相互作用、苦味受容体調節、または苦味受容体機 30 能を測定するためのマーカーとして使用することができる。タグは、苦味受容体を精製ま たは分画するためにも使用できる。いくつかの実施形態では、タグはそれが標識する苦味 受容体から切断可能である。このことは、例えば、特異的プロテアーゼ切断部位を、苦味 受容体をコードする核酸においてタグと苦味受容体との間に導入し、そしてこの核酸によ って発現された、標識された苦味受容体を特異的プロテアーゼの処理に付すことにより達 成することができる。 【０８９３】 本発明の細胞または細胞系を産生するために使用される宿主細胞は、それらの自然の状 態において、１以上の内因性苦味受容体を発現することができるか、または苦味受容体の 発現が欠失している。細胞または細胞系が１以上の自身の苦味受容体（「内因性」苦味受 40 容体とも呼ぶ）を発現する場合、異種苦味受容体は、細胞または細胞系の内因性苦味受容 体の１つと同じであり得る。例えば、細胞または細胞系に対して内因性の苦味受容体をコ ードする核酸を細胞または細胞系中に導入して、細胞または細胞系における苦味受容体を コードする遺伝子のコピー数を増大させて、核酸を導入しない場合よりも、細胞または細 胞系において高いレベルで苦味受容体を発現させることができる。宿主細胞は、一次細胞 、生殖細胞または胚幹細胞を包含する幹細胞であってよい。宿主細胞は不死化細胞であっ てもよい。一次または不死化宿主細胞は、真核生物の中胚葉、外胚葉または内胚葉層由来 であってよい。宿主細胞は、内皮、表皮、間葉、神経、腎臓、肝臓、造血、または免疫細 胞であってよい。例えば、宿主細胞は、腸陰窩もしくは絨毛細胞、クララ細胞、結腸細胞 、腸細胞、杯細胞、腸クロム親和性細胞、腸内分泌細胞であってよい。宿主細胞は、真核 50 (245) JP 2012-516687 A 2012.7.26 性、原核性、哺乳動物、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、齧歯類、有袋類、ネズミまた は他の細胞であってよい。宿主細胞は、非哺乳動物、例えば酵母、昆虫、真菌、植物、下 等真核生物および原核生物であってもよい。そのような宿主細胞は、苦味受容体モジュレ ータの試験に関してさらに異なるバックグラウンドを提供し得、標的と相互作用し得る細 胞により提供される発現産物が存在しない可能性がさらに高い。好ましい実施形態では、 宿主細胞は哺乳動物細胞である。本発明の細胞または細胞系を産生するために使用できる 宿主細胞の例としては、これらに限定されるものではないが、次のものが挙げられる：ヒ ト胎児腎臓２９３Ｔ細胞、確立された神経細胞系、クロム親和性細胞腫、神経芽細胞腫線 維芽細胞、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０ ）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１ 10 ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、Ｃ１２７１ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）および ＰＣ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２ ６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１３７８）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ− ２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）、ＳＪ−ＲＨ３０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ −２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ８５０５０３０２）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ８１）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４ 20 ３）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌ ｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｒｙ ＰＣＳ１００−０１０、Ｍｏｕｓｅ ＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５ 、ＣＲＬ２５１６）、ＨｕＨ−７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ１０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５）、ＩＭＲ−９０（ＡＴ ＣＣ ＣＣＬ１８６）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣ ＨＴＢ−２２）、Ｕ−２ ＯＳ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６）、Ｔ８４（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４８）、あるいは任意の確立された細胞 系（極性化もしくは非極性化）またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ ＡＴＣＣ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ． Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）またはヨーロピアン・コレクションオブ・セル・カルチ 30 ャー（ＥＣＡＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ ＳＰ４ ＯＪＧ Ｅｎｇ ｌａｎｄ）などの貯蔵所から入手可能な任意の細胞系。 【０８９４】 一実施形態では、宿主細胞は、その後、トランスジェニック動物の生成の基礎として使 用される胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、１以上の苦味受容体は、所望の時間 的および／または組織特異的発現で発現することができる。少なくとも１つの苦味受容体 、そして好ましくは機能的異種苦味受容体を安定して発現する胚幹細胞を、生物に直接移 植することができるか、またはそれらの核を他のレシピエント細胞中に移すことができ、 これらを次いで移植することができるか、またはこれらを用いてトランスジェニック動物 を作製することができる。 40 【０８９５】 当業者には理解されるように、宿主細胞と共に使用するのに適した任意のベクターを用 いて、苦味受容体をコードする核酸を宿主細胞中に導入することができる。苦味受容体を コードする核酸を宿主細胞中に導入するために使用できるベクターの例としては、これら に限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス（レトロウイルスおよび抗ウイルス を包含する）、コスミッド、人工染色体が挙げられ、例えば、ｐＣＭＶＳｃｒｉｐｔ、ｐ ｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１ｐｕｒｏ、ｐ ＳＶ２ｎｅｏ、ｐＩＲＥＳ ｐｕｒｏ、ｐＳＶ２ｚｅｏ、ｐＦＮ１１Ａ（ＢＩＮＤ）Ｆｌ ｅｘｉ（登録商標）、ｐＧＬ４．３１、ｐＦＣ１４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７） ＣＭＶ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＣ１４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭ 50 (246) JP 2012-516687 A 2012.7.26 Ｖ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ ３Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦＮ２４Ｋ（ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）７）ＣＭＶｄ３ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ＨａｌｏＴａｇ（商標）ｐＨＴ２、ｐＡＣＴ、ｐＡｄＶＡｎｔ ａｇｅ（商標）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）−ＭＡＸ、ｐＢＩＮＤ、ｐＣＡＴ（登録商標 ）３−Ｂａｓｉｃ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐＣＡＴ（登録商標）３ −Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＡＴ（登録商標）３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶＴ ＮＴ（商標）、ｐＧ５ｌｕｃ、ｐＳＩ、ｐＴＡＲＧＥＴ（商標）、ｐＴＮＴ（商標）、ｐ Ｆ１２Ａ ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標）、ｐＦ１２Ｋ ＲＭ Ｆｌｅｘｉ（登録商標） 、ｐＲｅｇ ｎｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ Ｇａｔｅｗ ａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＡｄ／ＰＬ−ＤＥＳＴ（商標）Ｇａｔｅｗａｙ（登録 10 商標）Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２７ ベクター、 Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１Ｖｅｃｔｏｒ、Ｇａｔｅｗａｙ（登録 商標）ｐｃＤＮＡ（商標）−ＤＥＳＴ４７Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＣＭＶ／Ｂｓｄ Ｖｅｃｔｏ ｒ、ｐＥＦ６／Ｈｉｓ Ａ、Ｂ、＆ ｃ、ｐｃＤＮＡ（商標）６．２−ＤＥＳＴ、ｐＬｅ ｎｔｉ６／ＴＲ、ｐＬＰ−ＡｃＧＦＰ１−Ｃ、ｐＬＰＳ−ＡｃＧＦＰ１−Ｎ、ｐＬＰ−Ｉ ＲＥＳｎｅｏ、ｐＬＰ−ＴＲＥ２、ｐＬＰ−ＲｅｖＴＲＥ、ｐＬＰ−ＬＮＣＸ、ｐＬＰ− ＣＭＶ−ＨＡ、ｐＬＰ−ＣＭＶ−Ｍｙｃ、ｐＬＰ−ＲｅｔｒｏＱ、ｐＬＰ−ＣＭＶｎｅｏ を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、構成的または条件付きプロモー タなどの発現調節配列を含む。当業者はそのような配列を選択することができるであろう 。例えば、好適なプロモータとしては、ＣＭＶ、ＴＫ、ＳＶ４０およびＥＦ−１αが挙げ 20 られるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、プロモータは、 誘導性、温度調節、組織特異性、抑制性、熱ショック、発生、細胞系特異性、または時間 的プロモータまたは非修飾もしくは前記のいずれか１以上の突然変異、ランダム化、シャ ッフル配列の組み合わせもしくは組換えである。他の実施形態では、苦味受容体は遺伝子 活性化によって発現されるか、または苦味受容体をコードする遺伝子がエピソームである 場合に発現される。苦味受容体をコードするＲＮＡまたはそれらの突然変異型もしくは天 然に存在する対立遺伝子多型は、好ましくは構成的に発現される。 【０８９６】 いくつかの実施形態では、ベクターは、選択可能なマーカーまたは薬剤耐性遺伝子が欠 失している。他の実施形態では、ベクターは、場合によって、薬剤もしくは抗生物質耐性 30 を付与するタンパク質などの選択可能なマーカーをコードする核酸を含む。選択圧を細胞 培養において適用して、所望の配列または特性を有する細胞を選択することができ、選択 圧は、通常、対象のポリペプチドの発現と、対応する選択剤または選択圧に対する耐性を 細胞に付与する選択マーカーの発現とを連結させることによって達成される。抗生物質選 択には、制限なく、抗生物質（例えば、ピューロマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、ハ イグロマイシン、ブレオマイシンなど）の使用が含まれる。非抗生物質選択には、制限無 く、栄養枯渇、選択温度への暴露、および選択マーカーが、例えばグルタミンシンテター ゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、オアバイン（ｏａｂａｉｎ）、チミジンキナー ゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲ Ｔ）であり得る変異原性条件への暴露の使用が含まれる。異なる苦味受容体をコードする 40 配列の各ベクターは、同じかもしくは異なる薬剤耐性または他の選択可能なマーカーを有 し得る。２以上の薬剤耐性マーカーが同じであるならば、薬物のレベルを増加させること によって同時選択を達成することができる。好適なマーカーは当業者に周知であり、以下 のいずれか１つに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるもの ではない：ネオマイシン／Ｇ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、 メトトレキサートおよびブラスチサイジン。薬剤選択（または任意の他の好適な選択マー カーを用いた選択）は必要な工程ではないが、トランスフェクトされた細胞集団を、安定 にトランスフェクトされた細胞について濃縮することができる。ただし、トランスフェク トされた構築物は、薬剤耐性を付与するように設計されているものとする。苦味受容体を 発現する細胞のその後の選択が、シグナリングプローブを用いて達成される場合、選択が 50 (247) JP 2012-516687 A 2012.7.26 トランスフェクション後早すぎるので、その結果、一時的にしか発現されず、かつ安定し て発現されない陽性細胞が生じ得る。しかし、このことは、トランスフェクトされた細胞 における一時的発現の希釈を可能にする十分な細胞継代を許容することによって最小限に 抑えることができる。 【０８９７】 いくつかの実施形態では、ベクターは、ＲＮＡタグ配列をコードする核酸配列を含む。 「タグ配列」とは、シグナリングプローブにより検出される発現されたＲＮＡまたはＲＮ Ａの一部である核酸配列を意味する。シグナリングプローブは、種々のＲＮＡ配列を検出 することができる。これらのＲＮＡのうちのいずれかをタグとして用いることができる。 プローブがタグの配列に対して相補性である部分を含むように設計することにより、シグ 10 ナリングプローブをＲＮＡタグに対するものとすることができる。具体的な実施形態では 、シグナリングプローブは、ＲＮＡの同じかまたは異なるコーディングエクソン、非コー ディングイントロンまたは非コーディング非翻訳配列内の配列を対象とする（例えば相補 性である）。特定の実施形態では、シグナリングプローブは、苦味受容体のシグナリング 経路を含むシグナリング経路の成分のＲＮＡを対象とし得る。タグ配列は、同時転写され 、シグナリングプローブ結合の標的配列を含むプラスミドの３’非翻訳領域であり得る。 対象の遺伝子をコードするＲＮＡは、タグ配列を含み得るか、またはタグ配列は５’−非 翻訳領域または３’−非翻訳領域内に位置し得る。いくつかの実施形態では、タグは、対 象の遺伝子をコードするＲＮＡを有さない。タグ配列は、産生されたタンパク質を標識し たいかどうかによって、遺伝子のメッセージのタンパク質をコードする部分を含むフレー 20 ム中にあり得るか、またはこれを含むフレーム外にあり得る。このように、タグ配列はシ グナリングプローブによる検出のために翻訳される必要がない。タグ配列は、同一または 異なる複数の標的配列を含むことができ、この場合、１つのシグナリングプローブは各標 的配列とハイブリダイズする。タグ配列は二次構造を有するＲＮＡをコードすることがで きる。構造は３アームの接合構造であってよい。本発明において使用することができ、こ れに対するシグナリングプローブを調製することができるタグ配列の例としては、例えば 、ＨＩＳタグ、ｍｙｃタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、プロテインＣ、ＶＳＶ−Ｇ、 ＦＬＵ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＦＬＡＧ、Ｂ ＣＣＰ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ−タグ、Ｓｏｆｔａｇ−１、Ｓｏｆｔａ ｇ−２、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｓ−タグ、チオレドキシン、ＧＳＴ、Ｖ５、ＴＡＰまたはＣ 30 ＢＰなどのエピトープタグのＲＮＡ転写産物が挙げられるが、これらに限定されるもので はない。本明細書中で記載するように、当業者は独自のＲＮＡタグ配列を作製することが できる。 【０８９８】 別の態様では、本発明の細胞および細胞系はＧタンパク質を安定して発現する。Ｇタン パク質の２つのファミリー、ヘテロ三量体Ｇタンパク質およびモノマーＧタンパク質があ る。ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、Ｇタンパク質 共役受容体（「ＧＰＣＲ」）によ って活性化され、これには３つのサブユニット：Ｇα、ＧβおよびＧγが含まれる。本明 細書中で用いる場合、Ｇタンパク質という用語は、３つのサブユニットのいずれか１つ、 例えばＧα、またはそれらの組み合わせ、ならびに３つサブユニット全てを有するヘテロ 40 三量体Ｇタンパク質を包含する。不活性状態において、Ｇα、ＧβおよびＧγは三量体を 形成する。βおよびγサブユニットは互いに密接に結合し、ベータ−ガンマ複合体と呼ば れる。Ｇαは、リガンドがＧＰＣＲと結合した後にＧβγから分離する。Ｇβγ複合体は 、そのＧＤＰ−ＧＴＰ交換後にＧαサブユニットから放出される。Ｇβγ複合体は他の第 ２のメッセンジャーを活性化することができるか、またはイオンチャンネルをゲートで制 御することができる。Ｇアルファの４つのファミリーには：アデニル酸シクラーゼを活性 化することによりｃＡＭＰ合成を増大させるＧｓ（刺激）；アデニル酸シクラーゼを阻害 するＧｉ（阻害）；種々の細胞運動プロセス（すなわち、細胞骨格、細胞間結合）を調節 する；ならびにカルシウムシグナリングＧ１２／１３ファミリーおよびホスホリパーゼＣ を刺激するＧｑが含まれる。モノマーＧタンパク質はヘテロ三量体Ｇタンパク質のαサブ 50 (248) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ユニットと相同性である。トランスデューシン（例えば、ＧＮＡＴ１、ＧＮＡＴ２、およ びグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｔ））、ガストデューシン（例えば、ＧＮＡ Ｔ３グアニンヌクレオチド結合タンパク質およびαトランスデューシン３）、ヒトＧＮＡ １５（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）α１５（Ｇｑクラス；別名 ＧＮＡ１６）およびマウスＧα１５、ならびにそれらのキメラタンパク質、例えばＧα１ ５−ＧＮＡ１５（Ｇα１５−Ｇα１６とも呼ばれる）を包含するが、これらに限定されな い本発明の細胞または細胞系において、任意のＧタンパク質を発現することができる。好 適な実施形態では、Ｇタンパク質はマウスＧα１５（配列番号１０２）である。別の好適 な実施形態では、Ｇタンパク質はヒトＧＮＡ１５（配列番号５０）であるか、または配列 番号７６を含む核酸によってコードされるヒトＧタンパク質である。Ｇタンパク質は、任 10 意の哺乳動物Ｇタンパク質、例えば表７に記載する任意の哺乳動物Ｇタンパク質であって もよいが、これに限定されるものではない。細胞によって安定して発現されるＧタンパク 質は、細胞に内因性であり得る。あるいは、Ｇタンパク質の安定な発現は、Ｇタンパク質 をコードする核酸の細胞への安定なトランスフェクションの結果であり得る。異種Ｇタン パク質を安定して発現する細胞は、当該技術分野で公知であり、例えば、ＨＥＫ２９３／ Ｇα１５細胞である（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｔ２Ｒｓ ｆｕ ｎｃｔｉｏｎ ａｓ ｂｉｔｔｅｒ ｔａｓｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”， Ｃｅｌｌ １００：７０３−７１１， ２０００；Ｂｕｆｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＴＡＳ２Ｒ１６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｂｉｔｔｅｒｔ ｔａｓｔｅ ｉｎ ｒｓｐｏｎｓｅ ｔｏ β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ”， Ｎａ Ｇ 20 ｅｎｅｔ ３２：３９７−４０１）。他の実施形態では、Ｇタンパク質をコードする核酸 および苦味受容体をコードする核酸を連続して宿主細胞中にトランスフェクトすることが でき、Ｇタンパク質をコードする核酸を最初にトランスフェクトするか、または苦味受容 体をコードする核酸を最初にトランスフェクトするかのいずれかである。他の実施形態で は、Ｇタンパク質をコードする核酸および苦味受容体をコードする核酸を同じかまたは異 なるベクター上で宿主細胞中にコトランスフェクトすることができる。したがって、Ｇタ ンパク質および苦味受容体の両方を安定して発現する細胞の選択を同様に連続してまたは 同時に実施することができる。Ｇタンパク質を安定して発現するために使用することがで きる細胞または細胞系は、前述のように、苦味受容体を安定して発現するために使用する ことができるものと同じである。Ｇタンパク質をトランスフェクトするためのベクターは 30 、前述のように、場合によって抗生物質または非抗生物質選択のための選択可能なマーカ ーをコードする核酸を含む。 【０８９９】 本発明のいくつかの実施形態では、本発明の細胞または細胞系は他のタンパク質を苦味 受容体と同時に発現する。好適な実施形態では、他のタンパク質は、甘味（ＴＡＳ１Ｒ２ ／ＴＡＳ１Ｒ３）受容体または旨味（ＴＡＳ１Ｒ１／ＴＡＳ１Ｒ３）受容体などの少なく とも１つの他の味覚受容体である。苦味受容体と同時に発現されるタンパク質は、これに 限定されるものではないが、宿主細胞において内因的に、またはベクターから不均一に、 など任意の機構によって発現することができる。さらに、本発明の他の実施形態では、２ 種以上の苦味受容体が細胞または細胞系において安定して発現され得る。 40 【０９００】 別の態様では、本発明の細胞および細胞系は、従来法によって産生された細胞および細 胞系と比較すると向上した安定性を有する。安定な発現を特定するために、細胞または細 胞系の苦味受容体の発現を経時的に測定し、発現レベルを比較する。安定な細胞系は、長 時間にわたって苦味受容体を発現し続けるであろう。本発明のいくつかの態様では、時間 経過は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間など、もしくは少 なくとも１ヶ月、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８もしくは９ヶ月、または その間の任意の長さの時間であってよい。単離された細胞および細胞系は、例えば、発現 される苦味受容体の絶対量および相対量を測定するためにｑＲＴ−ＰＣＲおよびシングル エンドポイントＲＴ−ＰＣＲによりさらに特性化することができる。いくつかの実施形態 50 (249) JP 2012-516687 A 2012.7.26 では、安定な発現は、経時的な機能分析の結果を比較することによって測定される。機能 的アッセイに基づく安定性の測定は、対象の遺伝子のｍＲＮＡを安定して発現するだけで なく、適切に機能する対象の遺伝子によりコードされるタンパク質を安定して産生し、適 切に処理（例えば、翻訳後修飾，サブユニットアセンブリ、および細胞内の局在化）する クローンを同定する利点をもたらす。 【０９０１】 本発明の細胞および細胞系は、それらのＺ’因子により証明されるように高い再現性の アッセイを適切に提供するさらなる利点を有する。Ｚｈａｎｇ ＪＨ， Ｃｈｕｎｇ Ｔ Ｄ， Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ＫＲ， “Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐ ａｒａｍｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄ 10 ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａａｓｓａ ｙｓ．” Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎ． １９９９；４（２）：６７−７３を 参照。Ｚ’値は細胞または細胞系の質に関連する。なぜなら、これは細胞または細胞系が モジュレータに対して一貫して反応する程度を反映するからである。Ｚ’は、マルチウェ ルプレート全体にわたる基準化合物に対する機能的反応のシグナル対ノイズ範囲およびシ グナルのバラツキ（すなわち、ウェルごとの）を考慮した統計的計算値である。Ｚ’は、 正の対照を含む複数のウェルおよび負の対照を含む複数のウェルから得られるデータを用 いて計算される。次式にしたがって、それらの標準偏差に３をかけたものの合計のそれら の平均値における差に対する比を１から引いて、Ｚ’因子を得る： Ｚ因子＝１−（（３σ正の対照＋３σ負の対照）／μ正の対照−μ負の対照）） 20 【０９０２】 理論的な最大Ｚ’因子は１．０であり、これはバラツキがなく、ダイナミックレンジが 無限の理想的なアッセイを示す。低いスコア（すなわち、０に近いスコア）は望ましくな い。なぜなら、正の対照と負の対照との間に重複があることを示すからである。産業界で は、簡単な細胞ベースのアッセイに関して、０．３までのＺ’スコアが最低限のスコアと 見なされ、０．３∼０．５のＺ’スコアは許容可能であり、０．５を超えるＺ’スコアは 優れていると見なされる。無細胞または生化学的アッセイはより高いＺ’スコアに近づく が、細胞ベースのシステムのＺ’スコアは低い傾向がある。なぜなら細胞ベースのシステ ムは複雑だからである。 【０９０３】 30 本発明の細胞および細胞系は、アッセイにおいて一貫した結果を有利にもたらすそれら の能力を反映したＺ’値を有する。苦味受容体を発現する本発明の細胞および細胞系は、 ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）適合性アッセイの基礎をもたらした。なぜな ら、これらは一般的に少なくとも０．４５のＺ’因子を有するからである。本発明のいく つかの態様では、細胞および細胞系により、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少な くとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７または少なくとも０．８のＺ’が得 られる。本発明の他の態様では、本発明の細胞および細胞系により、数継代、例えば、５ ∼２０継代の間維持される、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、 少なくとも０．６、少なくとも０．７、または少なくとも０．８のＺ’が得られる。本発 明のいくつかの態様では、細胞および細胞系により、１、２、３、４もしくは５週間また 40 は２、３、４、５、６、７、８もしくは９ヶ月（その間の任意の期間を包含する）の間維 持される、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７ 、または少なくとも０．８のＺ’が得られる。 【０９０４】 さらに本発明によれば、天然に存在する苦味受容体のある形態またはその天然に存在す る対立遺伝子多型を発現する細胞および細胞系、ならびに苦味受容体の突然変異型を発現 する細胞および細胞系は、細胞内遊離カルシウムレベルについて特徴づけることができる 。いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系は、「生理学的に関連した」活性 を有する苦味受容体を発現する。本明細書中で用いる場合、生理学的関連性とは、細胞ま たは細胞系が苦味受容体を発現し、これにより苦味受容体が活性化された場合に同じ種類 50 (250) JP 2012-516687 A 2012.7.26 の天然に存在する苦味受容体として細胞内遊離カルシウムを増大させ、同じ化合物によっ て調節される場合に同じ種類の天然に存在する苦味受容体が反応するのと同じようにモジ ュレータに対して反応する性質を意味する。苦味受容体を発現する本発明の細胞および細 胞系（苦味受容体のいくつかの突然変異型および苦味受容体のいくつかの天然に存在する 対立遺伝子多型を包含する）は、好ましくは、細胞内遊離カルシウムを測定するアッセイ などの好適なアッセイにおいて、通常、天然の苦味受容体を発現する細胞と匹敵する機能 を示す。そのようなアッセイは当業者らに公知である（Ｎａｈｏｒｓｋｉ， “Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈ ｗａｙｓ，” Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． １４７：Ｓ３８−Ｓ４５， ２０００ ））。そのような比較を用いて、細胞または細胞系の生理学的関連性を決定する。訓練さ 10 れた味覚試験者のパネルを用いた「シップ／スピット」味覚試験も、本発明の細胞および 細胞系における苦味受容体生理学的関連性をさらに検証するために使用することができる 。天然もしくは突然変異型の苦味受容体またはその天然に存在する対立遺伝子多型のスク リーニングによって同定されるモジュレータを用いたシップ／スピット味覚試験の結果を 用いて、これらの異なる形態の生理学的関連性を検証することができる。 【０９０５】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系は苦味受容体のモジュレータに対 する増大した感受性を有している。本発明の細胞および細胞系はモジュレータに反応し、 苦味受容体についての生理学的範囲のＥＣ５０またはＩＣ５０値で細胞内遊離カルシウム を増大させる。本明細書中で用いる場合、ＥＣ５０とは、細胞または細胞系において最大 20 半量の活性化反応を誘発するために必要な化合物または物質の濃度を指す。本明細書中で 用いる場合、ＩＣ５０とは、細胞または細胞系において最大半量の抑制反応を誘発するた めに必要な化合物または物質の濃度を指す。ＥＣ５０およびＩＣ５０値は、当該技術分野 で周知の技術、例えば、化合物または物質の濃度を苦味受容体発現細胞系の反応と関連づ ける用量反応曲線を用いて決定することができる。 【０９０６】 苦味受容体の生理学的に関連した機能に由来する本発明の苦味受容体を発現する細胞お よび細胞系のさらなる有利な特性は、初期スクリーニングにおいて同定されるモジュレー タが二次機能アッセイ、例えば、シップ／スピットもしくは他の味覚試験、または味覚調 節化合物に反応した脳活動をスキャンするための機能磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）において 30 機能的であることである。当業者らには理解されるように、初期スクリーニングアッセイ で特定される化合物は、典型的には、コンビナトリアルケミストリー、医薬品化学または 合成化学などによって、それらの誘導体または類似体が二次機能アッセイにおいて機能的 であるように修飾されなければならない。しかし、本発明の苦味受容体を発現する細胞お よび細胞系の高い生理学的関連性のために、これで同定される多くの化合物は修飾しなく ても機能的である。 【０９０７】 いくつかの実施形態では、本発明の細胞および細胞系の特性、例えば安定性、生理学的 関連性、アッセイにおける再現性（Ｚ’）または生理学的ＥＣ５０もしくはＩＣ５０値な どは、特定の培養条件下で達成できる。いくつかの実施形態では、培養条件を標準化し、 40 例えば自動化により、バラツキがないように厳密に維持する。培養条件には、細胞または 細胞系をその条件下で増殖させる任意の好適な条件が含まれ、当該技術分野で公知のもの が含まれる。種々の培養条件の結果、任意の苦味受容体、またはそれらの突然変異体もし くは対立遺伝子多型について有利な生物学的特性が得られる可能性がある。 【０９０８】 他の実施形態では、安定性、生理学的関連性、アッセイにおける再現性（Ｚ’）、また は生理学的ＥＣ５０もしくはＩＣ５０値などの所望の特性を有する本発明の細胞および細 胞系を、１ヶ月以内で得ることができる。例えば、細胞または細胞系を、２、３、４、５ 、もしくは６日以内、または１、２、３または４週間以内、あるいはその間の任意の長さ の時間で得ることができる。 50 (251) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０９０９】 本発明の一態様は、それぞれが同じ苦味受容体、または１以上の苦味受容体の異なる突 然変異型および天然に存在する対立遺伝子多型を含む異なる苦味受容体を発現する、クロ ーン細胞および細胞系のコレクションを提供する。このコレクションは、異なる苦味受容 体の組み合わせ、または苦味受容体の突然変異型、苦味受容体の天然に存在する対立遺伝 子多型、またはそれらの任意の組み合わせを発現する細胞または細胞系を含み得る。コレ クションは、同じ苦味受容体および異なるＧタンパク質、または苦味受容体の任意の可能 な二量体もしくは他の多量体、例えばヘテロ多量体もしくはキメラ二量体もしくは多量体 を発現する細胞または細胞系も含み得る。 【０９１０】 10 細胞または細胞系のコレクションまたはパネルを、例えば薬物スクリーニングのために 産生する場合、コレクションまたはパネル中の細胞または細胞系を、１以上の選択的生理 学的特性に関して同一（実質的に同一を含む）であるように適合させることができる。こ の文脈での「同じ生理学的特性」とは、選択された生理学的特性がコレクションまたはパ ネル中のメンバー間で十分類似しているので、この細胞コレクションまたはパネルは薬物 スクリーニングアッセイにおいて信頼性のある結果をもたらすことができることを意味す る；例えば、薬物スクリーニングアッセイにおける読み出しのバラツキは、例えば、細胞 における固有のバラツキによるのではなく、苦味受容体の種々の天然または突然変異型を 発現する細胞、またはそれらの対立遺伝子多型に対する試験化合物の種々の生物学的活性 による。例えば、細胞または細胞系は、同じ増殖速度、すなわち、細胞コレクションまた 20 はパネルのメンバー間で１、２、３、４、または５時間以下の差を有する増殖速度を有す るように適合させることができる。これは、例えば、細胞をそれらの増殖速度によって５ 、６、７、８、９、または１０群に分け、そして同じビンに分類された群からの細胞を用 いてパネルを作製することによって、達成することができる。細胞増殖速度を測定する方 法は当該技術分野で周知である。パネル中の細胞または細胞系は、同じＺ’因子（例えば 、０．１を超えて異ならないＺ因子）、苦味受容体発現レベル（例えば、５％、１０％、 １５％、２０％、２５％、または３０％を超えて異ならない苦味受容体発現レベル）、組 織培養表面への接着性などを有するように適合させることもできる。適合させた細胞およ び細胞系を、例えば、自動化平行プロセッシングによって達成される同じ条件下で増殖さ せて、選択された生理学的特性を維持することができる。 30 【０９１１】 本発明の適合細胞パネルは、例えば、苦味受容体に関して所定の活性を有するモジュレ ータ（例えば、アゴニストもしくは拮抗物質）を同定するため；様々な苦味受容体または それらの対立遺伝子多型もしくは突然変異型にわたって化合物活性を特性解析するため； １種の苦味受容体、またはその対立遺伝子多型もしくは突然変異型のみに関して活性なモ ジュレータを特定するため；および苦味受容体のサブセットのみに関して活性なモジュレ ータを特定するために使用することができる。本発明の適合細胞パネルはハイスループッ トスクリーニングを可能にする。かつては完遂するために数ヶ月かかっていたスクリーニ ングを数週間以内に完遂することができる。 【０９１２】 40 本発明の細胞および細胞系を作製するために、例えば、米国特許第６，６９２，９６５ 号および国際特許公開第ＷＯ／２００５／０７９４６２号に記載される技術を用いること ができる。これらの文書はどちらも、あらゆる目的に関してそれらの全体として参照する ことによって本明細書に組み込まれる。この技術は、数百万個の細胞のリアルタイム評価 を提供するので、任意の所望の数のクローン（数百から数千個のクローン）を選択するこ とができる。フローサイトメトリー細胞分類（例えば、ＦＡＣＳ機を使用）または磁気細 胞分類（例えば、ＭＡＣＳ機を使用）などの細胞分類技術を用いて、１ウェルあたり１個 の細胞を自動的に高統計的信頼度で培養容器（例えば、９６ウェル培養プレート）中に入 れることができる。技術の速度および自動化は、多重遺伝子細胞系が容易に単離されるの を可能にする。 50 (252) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０９１３】 この技術を使用して、各苦味受容体のＲＮＡ配列を、シグナリングプローブ（分子ビー コンまたは蛍光発生プローブとも称する）を用いて検出することができる。いくつかの実 施形態では、分子ビーコンは、前記のように標的タグ配列を認識する。別の実施形態では 、分子ビーコンは、苦味受容体コーディング配列自体の内の配列を認識する。シグナリン グプローブは、それぞれタグまたは苦味受容体コーディング配列のＲＮＡ配列に対して相 補性である部分を含むように設計することによって、ＲＮＡタグまたは苦味受容体コーデ ィング配列に対するものとすることができる。これらの同じ技術を用いて、もし使用され る場合は、Ｇタンパク質のＲＮＡ配列を検出することができる。 【０９１４】 10 苦味受容体をコードする配列、Ｇタンパク質をコードする配列、タグ配列、またはそれ らの任意の組み合わせを含み、場合によって選択可能なマーカーをコードする核酸をさら に含む核酸を、周知の方法によって選択された宿主細胞中に導入することができる。この 方法としては、これらに限定されるものではないが、トランスフェクション、ウイルス送 達、タンパク質またはペプチド介在性挿入、共沈法、脂質系送達試薬（リポフェクション ）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試薬、エレクトロポレ ーションまたは機械的送達が挙げられる。トランスフェクション試薬の例は、ＧＥＮＥＰ ＯＲＴＥＲ、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ２、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴ ＡＭＩＮＥ２０００、ＦＵＧＥＮＥ６、ＦＵＧＥＮＥ ＨＤ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２ ０、ＴＦＸ−５０、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＲＡＮＳＦ 20 ＥＣＴＡＭ、ＧＥＮＥＳＨＵＴＴＬＥ、ＴＲＯＪＥＮＥ、ＧＥＮＥＳＩＬＥＮＣＥＲ、Ｘ −ＴＲＥＭＥＧＥＮＥ、ＰＥＲＦＥＣＴＩＮ、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ、ＳＩＰＯＲＴ、Ｕ ＮＩＦＥＣＴＯＲ、ＳＩＦＥＣＴＯＲ、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ１、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ ２、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ＩＦＥＣＴ、ＲＮＡＩ ＳＨＵＴＴＬＥ、ＭＥＴ ＡＦＥＣＴＥＮＥ、ＬＹＯＶＥＣ、ＬＩＰＯＴＡＸＩ、ＧＥＮＥＥＲＡＳＥＲ、ＧＥＮＥ ＪＵＩＣＥ、ＣＹＴＯＰＵＲＥ、ＪＥＴＳＩ、ＪＥＴＰＥＩ、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ、Ｐ ＯＬＹＦＥＣＴ、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＡＮＧＥＲ、ＲＮＡｉＦＥＣＴ、ＳＵＰＥＲＦＥＣ Ｔ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ、ＴＦ−ＰＥＩ−ＫＩＴ、ＣＬＯＮＦＥＣＴＩＮ、およびＭＥＴ ＡＦＥＣＴＩＮＥである。 【０９１５】 30 苦味受容体コーディング配列、および場合によってさらにＧタンパク質コーディング配 列を、宿主細胞中に導入し、場合によってその後、薬剤選択した後、分子ビーコン（例え ば、蛍光発生プローブ）を細胞中に導入し、そして細胞分類を用いて、それらのシグナル に関して陽性の細胞を単離する。分子ビーコンを用いて、苦味受容体、Ｇタンパク質、ま たは両者の発現を同定することもできる。両者の発現を同定する場合、それらの同定は、 同時にまたは連続して実施することができる。望ましいならば、数ラウンドの分類を実施 することができる。一実施形態では、フローサイトメトリー細胞分類機はＦＡＣＳ機であ る。ＭＡＣＳ（磁気細胞分類）またはレーザー対応分析を用いた陰性細胞のレーザーアブ レーションおよびプロセッシングも使用することができる。この方法にしたがって、少な くとも１つの苦味受容体を発現する細胞を検出し、回収する。苦味受容体（および、場合 40 によって、Ｇタンパク質）配列を細胞中のゲノムの様々な位置で組み込むことができる。 苦味受容体（および、導入される場合はＧタンパク質）をコードする導入された遺伝子の 発現レベルは、組み込み部位によって変わり得る。熟練者は、任意の所望の発現レベル（ すなわち、バックグラウンドを超えるかまたはバックグラウンドより高い特定のレベル） についてゲートで制御できることを理解するであろう。さらに、安定な細胞系を得ること ができ、この場合、苦味受容体またはＧタンパク質をコードする導入された遺伝子の１以 上はエピソーム性である。 【０９１６】 本発明において有用なシグナリングプローブは、当該技術分野で公知であり、一般的に 、標的配列に対して相補的な配列と、プローブが標的配列と結合していない場合にはシグ 50 (253) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ナルが放出されず、プローブが標的配列と結合する場合にシグナルが放出されるように調 整されたシグナル放出系とを含むオリゴヌクレオチドである。非限定的例として、シグナ リングプローブは、クエンチャーおよびフルオロフォアが一緒になって未結合プローブに なるようなプローブ中の位置にあるフルオロフォアとクエンチャーとを含み得る。プロー ブと標的配列とが結合すると、クエンチャーとフルオロフォアとは分離し、その結果、シ グナルが放出される。例えば、国際公開第ＷＯ／２００５／０７９４６２号は、本発明の 細胞および細胞系の産生において使用され得る多くのシグナリングプローブを記載してい る。タグ配列を用いる場合、苦味受容体のそれぞれのベクター（複数の苦味受容体が１つ の細胞中で発現される場合）、または苦味受容体およびＧタンパク質のベクターは、同一 または異なるタグ配列を含み得る。タグ配列が同じであっても、異なっていても、シグナ 10 リングプローブは、異なるシグナルエミッター、例えば異なる色のフルオロフォアなどを 含むので、それぞれの異なる苦味受容体および、場合によってＧタンパク質の（ＲＮＡ） 発現を別々に検出することができる。例として、１つの苦味受容体ｍＲＮＡを特異的に検 出するシグナリングプローブは、赤色フルオロフォアを含み得、導入されたＧタンパク質 （ＲＮＡ）を検出するプローブは、緑色フルオロフォアを含み得る。さらに例として、１ つの苦味受容体ｍＲＮＡを特異的に検出するシグナリングプローブは赤色フルオロフォア を含み得、別の苦味受容体ｍＲＮＡを特異的に検出するシグナリングプローブは緑色フル オロフォアを含み得、第三の苦味受容体ｍＲＮＡを特異的に検出するシグナリングプロー ブは黄色蛍光フルオロフォアを含み得る。当業者は、複数の苦味受容体または苦味受容体 およびＧタンパク質の発現を、複数の苦味受容体でトランスフェクトされた細胞において 20 シグナリングプローブで差別的に検出するための他の手段を知っているであろう。 【０９１７】 シグナリングプローブをコードする核酸を、選択された宿主細胞中に、これらに限定さ れるものではないが、トランスフェクション、共沈法、脂質ベースの送達試薬（リポフェ クション）、サイトフェクション、リポポリアミン送達、デンドリマー送達試薬、エレク トロポレーションまたは機械的送達をはじめとする任意の多くの当業者に周知の手段によ り導入することができる。トランスフェクション試薬の例は、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ、Ｇ ＥＮＥＰＯＲＴＥＲ２、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０ ００、ＦＵＧＥＮＥ６、ＦＵＧＥＮＥ ＨＤ、ＴＦＸ−１０、ＴＦＸ−２０、ＴＦＸ−５ ０、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ、Ｇ 30 ＥＮＥＳＨＵＴＴＬＥ、ＴＲＯＪＥＮＥ、ＧＥＮＥＳＩＬＥＮＣＥＲ、Ｘ−ＴＲＥＭＥＧ ＥＮＥ、ＰＥＲＦＥＣＴＩＮ、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ、ＳＩＰＯＲＴ、ＵＮＩＦＥＣＴＯ Ｒ、ＳＩＦＥＣＴＯＲ、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ１、ＴＲＡＮＳＩＴ−ＬＴ２、ＴＲＡＮＳ ＩＴ−ＥＸＰＲＥＳＳ、ＩＦＥＣＴ、ＲＮＡＩ ＳＨＵＴＴＬＥ、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮ Ｅ、ＬＹＯＶＥＣ、ＬＩＰＯＴＡＸＩ、ＧＥＮＥＥＲＡＳＥＲ、ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ、Ｃ ＹＴＯＰＵＲＥ、ＪＥＴＳＩ、ＪＥＴＰＥＩ、ＭＥＧＡＦＥＣＴＩＮ、ＰＯＬＹＦＥＣＴ 、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＡＮＧＥＲ、ＲＮＡｉＦＥＣＴ、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、ＥＦＦＥＣ ＴＥＮＥ、ＴＦ−ＰＥＩ−ＫＩＴ、ＣＬＯＮＦＥＣＴＩＮ、およびＭＥＴＡＦＥＣＴＩＮ Ｅである。 【０９１８】 40 一実施形態において、シグナリングプローブを、苦味受容体をコードするＲＮＡの一部 またはそれらの５’もしくは３’非翻訳領域の部分のいずれかに対して相補性であるよう に設計する。対象のメッセンジャーＲＮＡを認識するように設計されたシグナリングプロ ーブが、内因的に存在する擬似標的配列を検出できるならば、トランスフェクトされた細 胞によって産生される対象の配列の割合と比較して、これらの割合は、ソーターが２つの 細胞型を識別できるようなものである。したがって、苦味受容体をコードする核酸を含む 構築物は、蛍光タンパク質をコードする配列を必要とせず、かつ含まない。したがって、 異種蛍光タンパク質は本発明の細胞において発現されない。本発明の細胞または細胞系は 異種天然苦味受容体を安定して発現する。そのようなタンパク質タグ／シャペロンは、細 胞表面への苦味受容体の輸送を促進するために、多くの苦味受容体の発現に使用されるが 50 (254) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、本発明の細胞および細胞系は、有利には苦味受容体のない細胞表面で新規苦味受容体を 機能的に発現する。 【０９１９】 本発明の別の実施形態では、接着細胞を、細胞分類および単細胞単離の前または後に懸 濁液に適合させることができる。他の実施形態では、単離された細胞を個々に増殖させる かまたはプールして、細胞の集団を生じさせることができる。個々のまたは複数の細胞系 も、別々に増殖させるかまたはプールすることができる。細胞系のプールが所望の活性を 生じているかまたは所望の特性を有するならば、この効果を有する細胞系または細胞系の セットが同定されるまで、さらに分画することができる。細胞または細胞系をプールする ことによって、それぞれを別々に維持する必要がなく、多数の細胞系を維持することが容 10 易になる。したがって、細胞または細胞系のプールを陽性細胞について濃縮することがで きる。濃縮されたプールは、所望の特性または活性の少なくとも５０％、少なくとも６０ ％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％のについて 陽性である。 【０９２０】 さらなる態様では、本発明は、本発明の細胞および細胞系を産生する方法を提供する。 一実施形態では、当該方法は、次の工程： ａ）苦味受容体をコードするｍＲＮＡを発現する複数の細胞を提供する工程； ｂ）個々の培養容器中に細胞を個別に分散させ、これにより複数の独立した細胞培養を提 供する工程； 20 ｃ）細胞を、所望のセットの培養条件下で、この条件が独立した細胞培養のそれぞれにつ いて実質的に同じであることを特徴とする自動化細胞培養法を使用して培養する工程であ って、この培養の間、それぞれの独立した細胞培養中の細胞数を正規化し、独立した培養 を同じスケジュールで継代する、工程； ｄ）苦味受容体の少なくとも１つの所望の特性について独立した細胞培養を少なくとも２ 回分析する工程；および ｅ）両アッセイにおいて所望の特性を有する独立した細胞培養を同定する工程 を含む。 【０９２１】 当該方法にしたがって、細胞を所望のセットの培養条件下で培養する。条件は任意の所 30 望の条件であり得る。当業者は、どのパラメータが培養条件のセットに含まれるかを理解 するであろう。例えば、培養条件には：培地（基本培地（ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、 無血清、含血清、完全既知組成、動物由来成分を含まない）、一価および二価イオン（ナ トリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム）濃度、追加されるさらなる成分（アミ ノ酸、抗生物質、グルタミン、グルコースまたは他の炭素源、ＨＥＰＥＳ、チャンネルブ ロッカー、他の標的のモジュレータ、ビタミン、微量元素、重金属、補因子、増殖因子、 抗アポトーシス試薬）、新鮮または馴化培地、ＨＥＰＥＳを含む、ｐＨ、ある栄養素がな いかまたは少ない（アミノ酸、炭素源））、細胞が分裂／継代前に達成することができる 集密度レベル、細胞のフィーダー層、またはガンマ照射細胞、ＣＯ２、三気体系（酸素、 窒素、二酸化炭素）、湿度、温度、静止またはシェーカー上などが挙げられ、これらは当 40 業者には周知であろう。 【０９２２】 細胞培養条件は、簡便のために、または細胞の特定の所望の用途に関して選択すること ができる。有利には、本発明は特定の所望の用途に最適の細胞および細胞系を提供する。 すなわち、細胞を特定の所望の用途のための条件下で培養する本発明の実施形態において 、所望の用途の条件下で所望の特性を有する細胞を選択する。 【０９２３】 例として、細胞が接着性であることが望ましいプレートにおけるアッセイで細胞を使用 する場合、アッセイの条件下で接着性を示す細胞を選択することができる。同様に、細胞 がタンパク質産生に用いられる場合、細胞をタンパク質産生に適切な条件下で培養するこ 50 (255) JP 2012-516687 A 2012.7.26 とができ、この使用に有利な特性について選択することができる。 【０９２４】 いくつかの実施形態では、当該方法は、独立した細胞培養の増殖速度を測定するさらな る工程を含む。増殖速度は、熟練者に周知の種々の技術手段のいずれかを用いて測定する ことができる。そのような技術としては、ＡＴＰ、細胞集密度、光散乱、光学密度（例え ば、ＤＮＡについてＯＤ２６０）の測定が挙げられるが、これらに限定されるものではな い。好ましくは、増殖速度は、培養が選択された培養条件外にある時間の量を最小限に抑 える手段を用いて測定することができる。 【０９２５】 いくつかの実施形態では、細胞集密度を測定し、増殖速度を集密度値から計算する。い 10 くつかの実施形態では、細胞を分散させ、塊を除去した後、改善された精度について細胞 集密度を測定する。細胞を単分散させる手段は周知であり、例えば、分散試薬を測定され る培養物に添加することによって達成することができる。分散剤は周知であり、容易に入 手可能であり、トリプシン、およびＥＤＴＡ系分散剤などの酵素分散剤が含まれるが、こ れらに限定されるものではない。増殖速度は、集密度データから、ＨＡＭＩＬＴＯＮ Ｖ ＥＣＴＯＲなどのその目的のための商業的に入手可能なソフトウェアを用いて計算するこ とができる。自動化顕微鏡的プレートリーダーを用いるなどの自動化集密度測定は特に有 用である。集密度を測定するプレートリーダーは商業的に入手可能であり、ＣＬＯＮＥ ＳＥＬＥＣＴ ＩＭＡＧＥＲ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を包含するが、これに限定されるもので はない。典型的には、細胞集密度の測定を少なくとも２回行った後、増殖速度を計算する 20 。増殖速度を検出するために使用する集密度値の数は、培養に好都合であるかまたは好適 な任意の数であり得る。例えば、集密度は、例えば１週間、２週間、３週間または任意の 長さの時間にわたり、任意の所望の頻度で測定することができる。 【０９２６】 増殖速度が既知である場合、当該方法にしたがって、複数の独立した細胞培養物を増殖 速度の類似性によりグループに分ける。培養物を増殖速度ビンにグループ分けすることに より、グループ中の培養物を一緒に操作することができ、それにより、培養間のバラツキ を減少させる別のレベルの標準化が得られる。例えば、ビン中の培養を同時に継代するこ とができ、所望の試薬で同時に処理することができる。さらに、機能的アッセイ結果は典 型的にはアッセイウェル中の細胞密度に依存する。個々のクローンの真の比較は、これら 30 をプレーティングし、同じ密度で分析することによってのみ達成される。特定の増殖速度 コホートにグループ分けすることによって、ハイスループット形式で機能的にこれらが特 性化されることを可能にする特定の密度でクローンをプレーティングすることが可能にな る。 【０９２７】 各群における増殖速度の範囲は、任意の都合のよい範囲であってよい。細胞を同時に継 代することを可能にし、細胞数の頻繁な繰り込みを回避する増殖速度の範囲を選択するこ とが特に有利である。増殖速度群は、タイトなグループ分けについては非常に狭い範囲を 含み、例えば、互いに１時間以内の平均倍加時間を含み得る。しかし、この方法に従って 、範囲は互いに２時間まで、３時間まで、４時間まで、５時間まで、もしくは１０時間ま 40 でまたはさらにはそれより広い範囲であり得る。ビンにおける増殖速度が同じでなく、し たがっていくつかの培養における細胞の数が他のものより速く増大する場合に、繰り込み の必要性が生じる。ビンにおいて全ての培養について実質的に同じ条件を維持するために 、細胞を定期的に除去して、ビン全体にわたる数を繰り込むする必要がある。増殖速度が 異なるほど、より頻繁な繰り込みが必要である。工程ｄ）において、細胞および細胞系を ：ゲノムによってコードされる細胞プロセスにおける変化；ゲノムによって調節される細 胞プロセスにおける変化；染色体活性のパターンにおける変化；染色体サイレンシングの パターンにおける変化；遺伝子サイレンシングのパターンにおける変化；遺伝子活性化の パターンまたは効率における変化；遺伝子発現のパターンまたは効率における変化；ＲＮ Ａ発現のパターンまたは効率における変化；ＲＮＡｉ発現のパターンまたは効率における 50 (256) JP 2012-516687 A 2012.7.26 変化；ＲＮＡプロセッシングのパターンまたは効率における変化；ＲＮＡ輸送のパターン または効率における変化；タンパク質翻訳のパターンまたは効率における変化；タンパク 質フォールディングのパターンまたは効率における変化；タンパク質アセンブリのパター ンまたは効率における変化；タンパク質修飾のパターンまたは効率における変化；タンパ ク質輸送のパターンまたは効率における変化；膜タンパク質を細胞表面に輸送するパター ンまたは効率における変化；増殖速度における変化；細胞サイズにおける変化；細胞形状 における変化；細胞形態における変化；ＲＮＡ含有量（％）における変化；タンパク質含 有量（％）における変化；含水量（％）における変化；脂質含有量（％）における変化； リボソーム含有量における変化；ミトコンドリア含有量における変化；ＥＲ量における変 化；細胞膜表面積における変化；細胞容積における変化；細胞膜の脂質組成における変化 10 ；核膜の脂質組成における変化；細胞膜のタンパク質組成における変化；核膜のタンパク 質組成における変化；分泌小胞の数における変化；リソソームの数における変化；液胞の 数における変化；細胞の：タンパク質産生、タンパク質分泌、タンパク質フォールディン グ、タンパク質アセンブリ、タンパク質修飾、タンパク質の酵素修飾、タンパク質グリコ シル化、タンパク質リン酸化、タンパク質脱リン酸化、代謝産物生合成、脂質生合成、Ｄ ＮＡ合成、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、栄養の吸収，細胞増殖、有糸分裂、減数分裂， 細胞分裂、脱分化するため、幹細胞へ転換するため、多能性細胞へ変換するため、全能細 胞へ変換するため、任意の臓器（すなわち、肝臓、肺、皮膚、筋肉、膵臓、脳、精巣、卵 巣、血液、免疫系、神経系、骨、心臓血管系、中枢神経系、胃腸管、胃、甲状腺、舌、胆 嚢、腎臓、鼻、眼、爪、毛、味蕾）の幹細胞型へ変換するため、分化した任意の細胞型（ 20 すなわち、筋肉、心筋、ニューロン、皮膚、膵臓、血液、免疫、赤血球、白血球、キラー Ｔ細胞、腸内分泌細胞、味覚、分泌細胞、腎臓、上皮細胞、内皮細胞（核酸配列の導入に 使用できる、すでに記載した動物もしくはヒト細胞型のいずれかも包含する））へ変換す るため、ＤＮＡを取り込むため、小分子を取り込むため、蛍光発生プローブを取り込むた め、ＲＮＡを取り込むため、固体表面へ接着するため、無血清条件へ適合させるため、無 血清懸濁条件へ適合させるため、大規模な細胞培養への適合のため、大規模細胞培養への 使用のため、創薬における使用のため、ハイスループットスクリーニングにおける使用の ため、機能的細胞ベースのアッセイにおける使用のため、カルシウムフラックスアッセイ における使用のため、Ｇタンパク質レポーターアッセイにおける使用のため、レポーター 細胞ベースのアッセイにおける使用のため、ＥＬＩＳＡ研究における使用のため、インビ 30 トロアッセイにおける使用のため、インビボ用途における使用のため、二次試験における 使用のため、化合物試験における使用のため、結合アッセイにおける使用のため、パニン グアッセイにおける使用のため、抗体パニングアッセイにおける使用のため、イメージン グアッセイにおける使用のため、顕微鏡イメージングアッセイにおける使用のため、マル チウェルプレートにおける使用のため、自動化細胞培養への適合のため、小型自動化細胞 培養への適合のため、大規模自動化細胞培養への適合のため、マルチウェルプレート（６ 、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６またはさらに密度）における細胞培養への 適合のため、細胞チップにおける使用のため、スライド上での使用のため、スライドガラ ス上での使用のため、スライドまたはスライドガラス上でのマイクロアレイのため、免疫 蛍光研究のため、タンパク質精製における使用のため、生物学的産生における使用のため 40 、工業用酵素の産生における使用、研究用試薬の産生における使用、細胞療法における使 用、動物またはヒトへの移植における使用のため、細胞によって分泌される因子の単離に おける使用のため、ｃＤＮＡライブラリの調製のため、ＲＮＡの精製のため、ＤＮＡの精 製のため、病原体、ウイルスもしくは他の作用物質による感染のため、病原体、ウイルス または他の作用物質による感染に対する耐性のため、薬物に対する耐性のため、自動化小 型細胞培養条件下で維持されやすさのため、特性化のためのタンパク質の産生における使 用のため（タンパク質結晶学、免疫系の刺激、抗体産生または抗体の生成もしくは試験を 包含する）に関する能力または潜在力における変化を包含するが、これらに限定されない 任意の生理学的特性について試験し、選択することができる。当業者は、前述の特性のい ずれかについて好適な試験を容易に認識するであろう。特定の実施形態では、これらの物 50 (257) JP 2012-516687 A 2012.7.26 理的性質の１以上は、苦味受容体に関連する一定の物理的性質であり得、そして機能的苦 味受容体の発現をモニタリングするために使用することができる。 【０９２８】 本発明の細胞および細胞系および／または適合パネルを特性化するために使用すること ができる試験としては：アミノ酸分析、ＤＮＡシーケンシング、タンパク質シーケンシン グ、ＮＭＲ、タンパク質輸送の試験、核細胞質間輸送の試験、タンパク質の細胞内局在化 の試験、核酸の細胞内局在化の試験、顕微分析、超顕微鏡的分析、蛍光顕微鏡検査法、電 子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、レーザーアブレーション技術、細胞計数および透析が挙げ られるが、これらに限定されるものではない。熟練者は、前記試験のいずれかをどのよう にして使用するかを理解するであろう。 10 【０９２９】 当該方法によれば、増殖速度を測定する工程の前に、細胞または細胞系が各培養物中に 分散されている限り、細胞を任意の細胞培養形式で培養することができる。例えば、簡便 のために、細胞をまず所望の条件下で培養のためにプールし、その後、各細胞をウェルま たは容器１つあたり１個の細胞に分けることができる。 【０９３０】 細胞を、任意の都合のよい数のウェルを有するマルチウェル組織培養プレート中で培養 することができる。そのようなプレートは容易に商業的に入手可能であり、当業者に周知 である。場合によっては、細胞は好ましくはバイアル中または任意の他の都合のよい形式 で培養することができ、種々の形式が当業者に公知であるか、または容易に商業的に入手 20 可能である。 【０９３１】 増殖速度を測定する工程を含む実施形態では、増殖速度を測定する前に、細胞を培養条 件に馴化させるために十分な時間、培養する。当業者には理解されるように、時間の長さ は、細胞型、選択された条件、培養形式などの多くの因子によって変わり、１日から数日 、１週間以上までの任意の長さであってよい。 【０９３２】 好ましくは、複数の独立した細胞培養における個々の培養は、標準化維持スケジュール を包含する、後述するのと実質的に同じ条件下に維持する。当該方法の別の有益な特性は 、多数の各培養を同時に維持することができ、したがって極めてまれであっても、所望の 30 特性のセットを有する細胞を同定できることである。これらや他の理由から、本発明にし たがって、複数の独立した細胞培養物を、自動化細胞培養法を用いて培養し、したがって 、培養は各ウェルについて実質的に同一である。自動化細胞培養は、手動細胞培養に固有 の望ましくないバラツキを防止する。 【０９３３】 任意の自動化細胞培養系を本発明の方法で用いることができる。多数の自動化細胞培養 系が商業的に入手可能であり、当業者には周知であろう。いくつかの実施形態では、自動 化システムはロボットシステムである。好ましくは、システムは、独立して動くチャンネ ル、マルチチャンネルヘッド（例えば、９６チップヘッド）およびグリッパーまたはチェ リーピッキングアームならびに処置の間滅菌を維持するためのＨＥＰＡ濾過装置を含む。 40 ピペッター中のチャンネルの数は、培養形式に適したものでなければならない。便利なピ ペッターは、例えば９６または３８４チャンネルを有する。そのようなシステムは公知で あり、商業的に入手可能である。例えば、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ（商標）装置（Ｈ ａｍｉｌｔｏｎ）を本発明の方法で用いることができる。自動化システムは、種々の所望 の細胞培養作業を実施することができなければならない。そのような作業は、当業者には 公知であろう。これらには：培地の除去、培地の交換、試薬の添加、細胞洗浄、洗浄液の 除去、分散剤の添加、培養容器からの細胞の除去、培養容器への細胞の添加などが含まれ るが、これらに限定されるものではない。 【０９３４】 本発明の細胞または細胞系の産生は、任意の数の独立した細胞培養を含み得る。しかし 50 (258) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、当該方法により得られる利点は、細胞の数が増大するにつれて増大する。当該方法にお いて用いることができる細胞または独立した細胞培養の数に理論的な上限はない。本発明 によれば、独立した細胞培養物の数は、２以上であり得るが、さらに有利には、少なくと も３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の細胞培養物、例えば、少なくとも １２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも ３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも４８、少なくとも ５０、少なくとも７５、少なくとも９６、少なくとも１００、少なくとも２００、少なく とも３００、少なくとも３８４、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０ ００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも５００，０００ 以上である。 10 【０９３５】 本発明の苦味受容体を発現する細胞および細胞系のさらなる有利な特性は、これらは、 薬剤選択圧がない場合に１以上の苦味受容体を安定して発現することである。したがって 、好ましい実施形態では、本発明の細胞および細胞系を、選択的薬物を含まない培養中で 維持する。さらなる実施形態では、細胞および細胞系を、抗生物質を用いないで維持する 。本明細書中で用いる場合、細胞維持とは、細胞を前述のように自身の苦味受容体発現に ついて選択した後に、細胞を培養することを指す。維持は、細胞中に導入された薬剤耐性 マーカーが、混合集団における安定な形質転換体の濃縮を可能にする場合、細胞分類前に 選択的薬物（例えば、抗生物質）において細胞を増殖させる任意の工程を意味しない。 【０９３６】 20 薬物を使わない細胞維持は多くの利点をもたらす。例えば、薬剤耐性細胞は、対象のコ トランスフェクトされたトランス遺伝子を適切なレベルで発現するとは限らない。なぜな ら、選択は、トランス遺伝子の有無に関わらず、薬剤耐性遺伝子を組み込んだ細胞の生存 に依存するからである。さらに、選択的薬物は多くの場合、変異原性であるか、またはそ うでなければ細胞の生理機能を妨害し、細胞ベースのアッセイにおいてゆがんだ結果をも たらす。例えば、選択的薬物は、アポトーシスに対する感受性を減少させ（Ｒｏｂｉｎｓ ｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３６（３７）：１１１６９−１１ １７８（１９９７））、ＤＮＡ修復および薬物代謝を増大させ（Ｄｅｆｆｉｅ ｅｔ ａ ｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８（１３）：３５９５−３６０２（１９８８））、細 胞のｐＨを増大させ（Ｔｈｉｅｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃ 30 ｙｔｏｃｈｅｍ． ３８（５）：６８５−６９０（１９９０）；Ｒｏｅｐｅ ｅｔ ａｌ ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３２（４１）：１１０４２−１１０５６（１９９３ ）；Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９１ （３）：１１２８−１１３２（１９９４））、リソソームおよびエンドソームのｐＨを減 少させ（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３５（９ ）：２８１１−２８１７（１９９６）；Ａｌｔａｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ． １８７（１０）：１５８３−１５９８（１９９８））、細胞膜電位を減少させ（Ｒｏ ｅｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３２（４１）：１１０４２−１ １０５６（１９９３））、塩化物（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ． ７１（１）： ２３−３２（１９９２））およびＡＴＰ（Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎ 40 ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０（１）：３１２−３１６（１９９３））に対す る細胞膜コンダクタンスを増大させ、そして小胞輸送速度を増大させる可能性がある（Ａ ｌｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９６（８ ）：４４３２−４４３７（１９９９））。したがって、本発明の細胞および細胞系により 、選択的薬物が原因の人為的結果がないスクリーニングアッセイが可能になる。いくつか の好ましい実施形態では、本発明の細胞および細胞系を細胞分類の前または後に抗生物質 などの選択的薬物とともに培養せず、したがって、濃縮された細胞集団から始めない場合 でも、所望の特性を有する細胞および細胞系が分類によって単離される。 【０９３７】 苦味受容体の発現レベルは細胞または細胞系ごとに変わる可能性がある。細胞または細 50 (259) JP 2012-516687 A 2012.7.26 胞系における発現レベルも、ＤＮＡメチル化および遺伝子サイレンシングおよびトランス 遺伝子コピーの喪失などのエピジェネティック事象のために、時間とともに減少する可能 性がある。これらの変動は、例えば、細胞により取り込まれるトランス遺伝子のコピー数 、トランス遺伝子のゲノム組込の部位、およびゲノム組込後のトランス遺伝子の完全性な どの種々の因子が原因であり得る。ＦＡＣＳまたは他の細胞分類方法（すなわち、ＭＡＣ Ｓ）を用いて発現レベルを評価することができる。シグナリングプローブを導入するさら なるラウンドを用いて、例えば、細胞がもともと単離された１以上のＲＮＡについて、時 間がたにつれ細胞が陽性のままでいるかどうか、およびその程度を決定することができる 。 【０９３８】 10 具体的な実施形態では、少なくとも１つのシグナリングプローブについて異なる絶対的 または相対的蛍光レベルを有する細胞を、例えばＦＡＣＳにより、全細胞集団に対して好 適な蛍光レベルを有する細胞のサブセットをゲートで規制することにより、単離すること ができる。例えば、特定のシグナリングプローブ（またはシグナリングプローブの組み合 わせ）について最高の蛍光シグナルを有する細胞の上位５％、上位１０％、上位１５％、 上位２０％、上位２５％、上位３０％、上位３５％、上位４０％、上位４５％、上位５０ ％、上位５５％、上位６０％、または上位６５％を、例えば、ＦＡＣＳによりゲートで規 制し、単離することができる。他の実施形態では、特定のシグナリングプローブ（または シグナリングプローブの組み合わせ）について最高の蛍光シグナルを有する細胞の上位２ ％∼３％、上位５％∼１０％、上位５％∼１５％、上位５％∼２０％、上位５％∼３０％ 20 、上位４０％∼５０％、上位１０％∼３０％、上位１０％∼２５％、または上位１０％∼ ５０％を、例えばＦＡＣＳによりゲートで規制し、単離することができる。 【０９３９】 対象のＲＮＡの全てをもはや発現し得ない細胞から所望のＲＮＡの全てを発現する細胞 を再単離しやすいので、薬物が無いかまたは最小濃度の薬物の存在下で細胞系を維持する ことが可能になる。シグナリングプローブは、事前に生成された細胞または細胞系に再適 用して、例えば、それらが当初単離された１以上のＲＮＡについて依然として陽性である かどうかまたはその程度を決定することができる。 【０９４０】 別の態様では、本発明は、本発明の細胞および細胞系の使用法を提供する。本発明の細 30 胞および細胞系は、機能的苦味受容体が必要な任意の用途で使用することができる。細胞 および細胞系は、例えば、これらに限定されるものではないが、インビトロ細胞ベースの アッセイまたは、例えば、苦味受容体モジュレータについてスクリーニングするため；物 質の苦味を評価するため；結晶学および結合研究のためにタンパク質を産生するため；な らびに化合物の選択性および用量、受容体／化合物結合反応速度および安定性、ならびに 細胞生理機能（例えば、電気生理学的機能、タンパク質輸送、タンパク質フォールディン グ、およびタンパク質調整）に対する受容体発現の影響を調査するために細胞が動物（例 えば、非ヒト哺乳動物）に移植されるインビボアッセイにおいて使用することができる。 本発明の細胞および細胞系は、特定の苦味受容体または苦味受容体群の役割を研究するた めのノックダウン研究において用いることもできる。 40 【０９４１】 苦味受容体の種々の組み合わせを発現する細胞および細胞系を別々にまたは一緒に使用 して、特定の苦味受容体または苦味受容体の突然変異型もしくは天然に存在する対立遺伝 子多型に対して特異的なものを含む苦味受容体モジュレータを同定することができ、そし て各形態の活性についての情報を得ることができる。 【０９４２】 モジュレータは、苦味受容体またはそれらの突然変異型もしくは天然に存在する対立遺 伝子多型の活性を改変する任意の物質または化合物を含む。モジュレータは、苦味受容体 アゴニスト（ポテンシエーターもしくはアクチベーター）または拮抗物質（阻害剤もしく はブロッカー）（部分的アゴニストもしくは拮抗物質、選択的アゴニストもしくは拮抗物 50 (260) JP 2012-516687 A 2012.7.26 質および逆アゴニストを包含する）であり得、そしてアロステリックモジュレータであり 得る。物質または化合物は、その調節活性が異なる条件または濃度のもとでも、または苦 味受容体の異なる形態（例えば、突然変異型および天然に存在する対立遺伝子多型）に関 して変化しても、モジュレータである。他の態様では、モジュレータは、別のモジュレー タが苦味受容体の機能に影響を及ぼす能力を変えることができる。例えば、拮抗物質によ って阻害されない苦味受容体のある形態のモジュレータは、その形態の苦味受容体を拮抗 物質により阻害されやすくさせることができる。 【０９４３】 本発明の細胞および細胞系を用いて、苦味受容体のインビボ形態の同一性を種々のモジ ュレータに対するそれらの反応に基づいて苦味受容体の既知形態の同一性と関連づけるこ 10 とによって、様々な苦味受容体病理における様々な形態の苦味受容体の役割を同定するこ とができる。これによって、そのような苦味受容体に関連する病状または他の生理学的状 態の高度に標的化された治療に関する疾患特異的または組織特異的苦味受容体モジュレー タの選択が可能になる。例えば、多くの天然に存在する苦味化合物は有毒であるので、苦 味受容体は、有毒な食品化合物の摂取に対する警告センサーとしての働きをする可能性が ある。胃腸粘膜中で発現された苦味受容体は、内腔中での栄養素および有害物質の機能検 出に関与し、腸にこれらを吸収するか、または防御反応を開始する準備をさせる。苦味受 容体はまた、腸−脳神経経路の活性化による食物摂取の制御にも関与し得る。したがって 、本発明の細胞系および方法を用いて同定される苦味受容体モジュレータは、多くの状況 において栄養素摂取を調節するため、例えば、食欲を制御するため、および／または肥満 20 者の腸における栄養素摂取を減少させるため、または空腹感を制御するため、および／ま たは栄養失調者において食物からの栄養素および／またはエネルギーの摂取を増大させる ために、用いることができる。苦味受容体モジュレータは、苦味化合物の同定、それらの 結合特性に影響を及ぼす苦味受容体の特定の化学的もしくは構造的モチーフまたは重要な 残基のさらなる特性化、リガンド結合についておおまかに、適度に、または選択的に調節 された苦味受容体の同定、それらの結合特性に基づく苦味受容体のグループおよびサブグ ループの規定、オーファン苦味受容体の脱オーファン化、苦味受容体の分子モデリングま たは薬物設計のためのそのようなデータの使用、および種々の苦味受容体がその中で活性 である組織の決定においても有用であり得る。 【０９４４】 30 苦味受容体モジュレータを同定するために、本発明の新規細胞または細胞系を苦味受容 体が機能的であると予想される条件下で試験化合物に暴露し、次いで好適な対照、例えば 、試験化合物に暴露されない細胞と比較して、苦味受容体活性における統計的に有意な変 化（例えば、ｐ＜０．０５）を検出する。既知アゴニストまたは拮抗物質および／または 異なる苦味受容体またはその突然変異型もしくは天然に存在する対立遺伝子多型を発現す る細胞を用いたも正および／または負の対照も用いることができる。いくつかの実施形態 では、検出および／または測定される苦味受容体活性は、細胞内遊離カルシウムレベルに おける変化である。当業者は、種々のアッセイパラメータ、例えば、シグナル対ノイズ比 を最適化できることを理解するであろう。 【０９４５】 40 さらなる関連する態様では、本発明は、他のＧＰＣＲのリガンドを同定する方法を提供 する。哺乳動物またはヒトＧＰＣＲおよびオーファン化または脱オーファン化ＧＰＣＲを 包含するが、これらに限定されない任意のＧＰＣＲをこの方法で用いることができる。脱 オーファン化ＧＰＣＲの例はオピオイド（表９に記載）である。ＧＰＣＲを発現する細胞 または細胞系は、化合物または抽出物ライブラリを用いてスクリーニングして、受容体の 発現特性を生成することができる。類似した特性を有する受容体を一緒のグループに分け 、化合物を用いてスクリーニングして、受容体と結合するリガンドを同定することができ る。 【０９４６】 さらなる態様では、本発明はオーファン苦味受容体のリガンドを同定する方法を提供す 50 (261) JP 2012-516687 A 2012.7.26 る。すなわち、本発明は、苦味受容体を脱オーファン化する方法を提供する。既知モジュ レータがない苦味受容体を発現する細胞または細胞系は、化合物または抽出物ライブラリ を用いてスクリーニングして、受容体の発現特性を生成することができる。場合によって 、類似した特性を有する受容体（もしあれば）を一緒のグループに分け、そして受容体を 結合するリガンドに対して既知苦味化合物を用いてスクリーニングする。リガンドが同定 されたら、味覚試験を用いて結果をさらに検証することができる。有利には、本発明の細 胞および細胞系は、天然の（すなわち、標識されていない）苦味受容体を安定して発現す るので、この方法を用いて同定されるリガンドは正確かつ妥当である。関連する実施形態 では、苦味受容体を脱オーファン化する方法を用いて、表８に記載するものなどの任意の オーファン哺乳動物ＧＰＣＲまたは任意のオーファンヒトＧＰＣＲを包含する任意のオー 10 ファンＧＰＣＲを脱オーファン化することができる。 【０９４７】 いくつかの実施形態では、本発明の、細胞系のコレクションを含む１以上の細胞または 細胞系を、複数の試験化合物、例えば、試験化合物のライブラリに暴露する。試験化合物 のライブラリは、本発明の細胞系を用いてスクリーニングして、１以上のモジュレータを 同定することができる。試験化合物は、小分子、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣 物、抗体またはそれらの抗原結合部分を含む化学的部分であり得る。抗体の場合、抗体は 、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってよい。抗体は、抗 体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂなど）、単鎖 抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、重鎖または軽鎖可変領域の全部または抗原結合部 20 分を含む任意の抗体の重鎖および軽鎖または抗原結合部分の全てを含むインタクト抗体で あってよい。 【０９４８】 本発明の細胞または細胞系は、特定の変数を有するコレクションを作製するために用い ることもできる。例えば、コレクションは：すべてが受容体−Ｇタンパク質相互作用を研 究するために同じ苦味受容体および異なるＧタンパク質を発現する細胞もしくは細胞系； または起こり得る二量化またはヘテロ多量体の形成を研究するために複数の内因性および ／または異種苦味受容体を発現する細胞または細胞系を含み得る。本発明の細胞または細 胞系のコレクションはまた、好適な実施形態では、２５個の苦味受容体全ても含み得る。 そのようなパネルを用いて、化合物の的外れの活性に対する的中活性、または関連する味 30 （すなわち、渋味もしくは金属味）に対する純粋な苦味における受容体の役割を決定する ことができる。 【０９４９】 本発明の細胞および細胞系を用いて、これらが安定して発現する苦味受容体以外のＧＰ ＣＲ経路に関与するものを同定することができる。例えば、異なるＧタンパク質を発現す る核酸を（一時的に、または安定して、のいずれかで）、同じ異種苦味受容体を発現し好 ましくは内因性苦味受容体を発現しない細胞系のコレクション中の各細胞系中に導入する ことができる。細胞系により発現されたこれらのＧタンパク質と苦味受容体との間の相互 作用を、例えば、細胞を苦味受容体の既知アゴニストに暴露した後の細胞内遊離カルシウ ムにおける変化を検出することによって分析することができる。 40 【０９５０】 いくつかの実施形態では、大きな化合物コレクションを、細胞ベースの機能的ハイスル ープットスクリーニング（ＨＴＳ）において、例えば、９６ウェル、３８４ウェル、１５ ３６ウェルまたはさらに高次のプレート形式を用いて苦味受容体調節活性について試験す る。いくつかの実施形態では、試験化合物または試験化合物のライブラリを包含する複数 の試験化合物を、本発明の２以上の細胞または細胞系（細胞系のコレクションを含む）を 用いてスクリーニングすることができる。それぞれが異なる天然に存在する苦味受容体分 子または突然変異体苦味受容体分子を発現する複数の細胞または細胞系を使用する場合、 複数の苦味受容体またはその突然変異型もしくは天然に存在する対立遺伝子多型に対して 有効なモジュレータ、あるいは、特定の苦味受容体またはその突然変異型もしくは天然に 50 (262) JP 2012-516687 A 2012.7.26 存在する対立遺伝子多型に特異的であり、他の苦味受容体または苦味受容体の他の形態を 調節しないモジュレータを同定することができる。ヒト苦味受容体を発現する本発明の細 胞または細胞系の場合、細胞を試験化合物に暴露して、望ましくない苦味受容体活性、ま たは所望の苦味受容体活性の減少もしくは存在しないことにより特徴づけられる疾患もし くは状態の治療において用いられる、苦味受容体活性を調節する（増大させるかまたは減 少させるかのいずれか）化合物を同定することができる。 【０９５１】 いくつかの実施形態では、試験化合物に暴露する前に，本発明の細胞または細胞系を、 哺乳動物または他の動物の酵素、植物酵素、細菌酵素、溶解細胞由来の酵素、タンパク質 修飾酵素、脂質修飾酵素、および口腔、胃腸管、胃または唾液中の酵素をはじめとする酵 10 素で前処理することによって修飾することができる。そのような酵素としては、例えば、 キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、オキシドリダクターゼ、ト ランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げること ができる。あるいは、細胞および細胞系を試験化合物にまず暴露し、続いて処理を行って 当該処理により苦味受容体の修飾を改変する化合物を同定することができる。 【０９５２】 ある態様において、本明細書中で提供されるのは、細胞中に存在する天然に生じる高度 の遺伝的多様性を利用し、そして所望の特性（例えば、機能的苦味受容体の安定および／ または高発現）を付与する所望の遺伝子発現特性を有する細胞を効率的に同定し、選択し 、当該細胞について濃縮する方法である。本発明の方法は、遺伝的に多様な細胞のプール 20 から従来法よりも早くかつ効率的に、改善された特性を有する細胞を同定し、選択し、そ して濃縮することができる。特定の実施形態では、細胞は遺伝的に修飾されていない。他 の特定の実施形態では、本発明の方法により、改善された特性（例えば、機能的苦味受容 体のさらに安定および／または高い発現）を有する新規均一な細胞の集団を生成させるこ とができる。 【０９５３】 ある実施形態では、本明細書中に記載される方法は、１以上の所望の特性（例えば、機 能的苦味受容体の安定および／または高発現）を有する天然に存在する細胞を選択するこ とを含む。具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法は、１以上の苦味受容体 サブユニット遺伝子において天然に存在する変異体または突然変異を有する細胞を選択す 30 ることを含む。 【０９５４】 具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法は、苦味受容体遺伝子のプロモー タ領域または苦味受容体遺伝子の非コーディング領域（例えば、イントロン、５’非翻訳 領域、および／または３’非翻訳領域）において天然に存在する変異体または突然変異を 有する単離された細胞を選択することを含む。苦味受容体遺伝子のプロモータ領域または 苦味受容体遺伝子の非コーディング領域における変異体または突然変異は、遺伝子産物の さらに高い、および／またはさらに安定な発現をもたらし得る。具体的な実施形態では、 苦味受容体遺伝子のプロモータ領域または苦味受容体遺伝子の非コーディング領域が、例 えばＤＮＡのメチル化またはアセチル化により修飾されている。特定の実施形態では、細 40 胞は、苦味受容体遺伝子に関してクロマチン再構築に影響を及ぼすエピジェネティック修 飾を含む。エピジェネティック修飾の非限定例としては、アセチル化、メチル化、ユビキ チン化、リン酸化およびＳＵＭＯ化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 【０９５５】 ある別の実施形態では、本発明の方法は、前処理を受けた細胞を選択することを含む。 そのような前処理は、太陽光または紫外線（ＵＶ）光、突然変異原、例えばエチルメタン スルホン酸（ＥＭＳ）、および化学物質への暴露であり得る。具体的な実施形態では、そ のような前処理には、望ましくない増殖条件、例えば、低酸素もしくは低栄養条件、また は毒性条件への暴露が含まれ得る。 【０９５６】 50 (263) JP 2012-516687 A 2012.7.26 本明細書中に記載される方法は、１以上の対象の遺伝子（例えば、苦味受容体サブユニ ット遺伝子）を発現する細胞（例えば、真核細胞）の同定および／または選択を提供する 。ある実施形態では、対象の遺伝子は、遺伝的変異の結果として他の細胞よりも高いレベ ルで発現される。 【０９５７】 特定の実施形態では、本明細書中で記載される方法は、（ａ）細胞（例えば、真核細胞 ）中に、苦味受容体のＲＮＡを検出できる１以上のシグナリングプローブを導入し；そし て（ｂ）当該細胞（例えば、真核細胞）が苦味受容体のＲＮＡを含むかどうかを決定する ことを含む。そのような方法は、苦味受容体のＲＮＡのレベルを定量化することをさらに 含み得る。具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法は、所望のＲＮＡ発現特 10 性を有する細胞を同定するためのものであって、当該方法は：（ａ）真核細胞（例えば、 真核細胞）中に、それぞれ対象の複数のＲＮＡを検出することができる複数のシグナリン グプローブを導入し；そして（ｂ）複数のシグナリングプローブにより検出されたＲＮＡ レベルを定量化することを含む。所望の遺伝子発現特性は、基準集団との比較により決定 することができる。特定の実施形態では、対象の複数のＲＮＡは、次のＲＮＡの任意の組 み合わせを含み得る：配列番号５０∼１０２のいずれか１つによりコードされるＲＮＡ。 【０９５８】 具体的な実施形態では、そのような方法は、当該細胞の定量化されたＲＮＡレベルを、 基準細胞におけるＲＮＡレベルと、それぞれ比較する工程をさらに含む。特定の実施形態 では、複数のシグナリングプローブは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１ 20 ０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１０ ０、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、５００、６００、７０ ０、８００、９００、または少なくとも１０００のシグナリングプローブを含む。いくつ かの実施形態では、対象のＲＮＡは翻訳される。他の実施形態では、対象のＲＮＡは翻訳 されない。具体的な実施形態では、対象のＲＮＡは、苦味受容体サブユニット遺伝子によ ってコードされる。具体的な実施形態では、単離された細胞は、対象の１以上の組換えＲ ＮＡを発現する。 【０９５９】 具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法によって同定および／または選択 される単離された細胞は、遺伝子操作されていない（例えば、１以上のトランス遺伝子を 30 組換えにより発現しない）。他の実施形態では、本明細書中に記載される方法により同定 および／または選択された、単離された細胞は遺伝子操作されている（例えば、１以上の トランス遺伝子を組換えにより発現する）。具体的な実施形態では、そのような細胞は体 細胞または分化細胞である。 【０９６０】 他の実施形態では、細胞は、所望の遺伝子発現特性を含む。ある実施形態では、所望の 遺伝子発現特性は、遺伝子操作することによるか、または遺伝的変異を増大させることに よって達成される。具体的な実施形態では、所望の遺伝子発現特性は、基準集団との比較 に基づいて決定することができる。 【０９６１】 40 いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、対象のＲＮＡ（例えば、苦 味受容体のＲＮＡ）を、平均異種細胞集団（例えば、分類されていない細胞系集団、例え ば分類されていない２９３Ｔ細胞系集団）よりも高いレベルで発現する細胞を同定および ／または選択するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される 方法は、対象のＲＮＡ（例えば、苦味受容体のＲＮＡ）を、平均異種細胞集団（例えば、 分類されていない細胞系集団、例えば分類されていない２９３Ｔ細胞系集団）よりも少な くとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、ま たは１００％高いレベルで発現する細胞を同定および／または選択するためである。いく つかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、対象のＲＮＡ（例えば、苦味受容 体のＲＮＡ）を、平均異種細胞集団（例えば、分類されていない細胞系集団、例えば分類 50 (264) JP 2012-516687 A 2012.7.26 されていない２９３Ｔ細胞系集団）よりも少なくとも１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍 、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高いレベルで発現する細胞を同定および ／または選択するためである。 【０９６２】 具体的な実施形態では、本明細書中に記載される方法は、対象のＲＮＡ（例えば、苦味 受容体のＲＮＡ）を、平均異種細胞集団よりも低いレベルで発現する細胞を同定および／ または選択するためのものである。異種細胞集団の一例は、異なる起源の混合細胞型の細 胞集団、遺伝的に異質である１つの細胞型の細胞の細胞集団、または本明細書中に記載さ れる方法を用いて単離された細胞が得られる１つの特定の細胞系の細胞集団であり得る。 【０９６３】 10 特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法を用いて単離される細胞は、細胞系 由来の細胞クローンである。ある実施形態では、本明細書中に記載される方法を用いて単 離される細胞は一次細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法 を用いて単離される細胞は形質転換細胞である。 【０９６４】 ある実施形態では、細胞はヒト細胞ではない。特定の実施形態では、細胞は、マウス、 ラット、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、カエル、蠕虫、昆虫 （例えば、ハエ）、魚、甲殻類、またはウシ由来の細胞である。いくつかの実施形態では 、細胞は哺乳動物細胞または真核細胞である。他の実施形態では、細胞はヒト細胞である 。いくつかの実施形態では、細胞は一次細胞である。他の実施形態では、細胞は、形質転 20 換細胞または細胞系の細胞クローンである。 【０９６５】 理論により拘束されるものではないが、苦味としてのそれらの役割において、苦味受容 体はおそらくは多様な潜在的に生理学的活性な化合物を苦味として感知するために進化し た。これらの受容体の一部は、非常に多様な化学構造との結合または相互作用において、 他のＧＰＣＲよりもさらに幅広く調整され得る。したがって、構造的に多様な化合物のラ イブラリを用いた苦味ＧＰＣＲの試験を用いて、苦味受容体と相互作用するかまたは苦味 受容体を調節する化合物を同定することができる。それによって、同定された化合物は、 他のＧＰＣＲの活性を調節することも予想される。 【０９６６】 30 あるさらに具体的な実施形態では、異なる苦味受容体、例えば少なくとも２、５、１０ 、５０、または少なくとも１００の異なる苦味受容体を発現する細胞系のパネルを用いて 、これらの苦味受容体と最も密接に関連する他のＧＰＣＲについて関連する化学的環境を 特定することができる。反対に、苦味受容体と相互作用しないこが判明している化学的環 境は、ＧＰＣＲと相互作用する可能性が低い化合物について濃縮することができる。 【０９６７】 ある実施形態では、これらの方法に準拠したＧＰＣＲおよび非ＧＰＣＲ化学的環境の定 義を用いて、ＧＰＣＲまたは非ＧＰＣＲ標的のどちらを使用するかによってＨＴＳ中の可 能性の高いヒットについて濃縮することができる。同様に、同じ情報を用いて、ＧＰＣＲ との望ましくない相互作用の根底にある可能性がある機能性を排除するために非ＧＰＣＲ 40 標的の開発中の化合物を最適化できる場合、医薬品化学の取り組みを誘導することができ る。 【０９６８】 本発明の方法で用いられる任意のアッセイは、ハイスループット形式で実施することが できる。 【０９６９】 ある実施形態では、タンパク質複合体が苦味受容体である場合、苦味受容体の活性は、 カルシウム動員試験を用いて測定することができる。 【０９７０】 化合物間での構造上の共通点の同定 50 (265) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０９７１】 タンパク質複合体を調節する化合物間での構造上の共通点を同定するシステムおよび方 法が提供される。ある実施形態では、タンパク質複合体は、Ｇタンパク質共役受容体であ る細胞表面受容体であり得る。具体的な実施形態において、タンパク質複合体は苦味受容 体であり得る。タンパク質複合体を調節する化合物は、本明細書中で開示されるシステム および方法のいずれかを用いて同定することができる。これらの化合物は、複数の候補化 合物を、タンパク質複合体を発現するように操作された細胞と別々に接触させ、タンパク 質複合体の活性に対する候補化合物のそれぞれの効果を分析することによって同定するこ とができ、この場合、効果は、タンパク質複合体の生物活性に対する各候補化合物の効果 の種々の定量的手段を用いて解明することができる。具体的な実施形態において、候補化 10 合物のライブラリをタンパク質複合体に対してスクリーニングして、タンパク質複合体を 調節できる化合物を同定することができる。タンパク質複合体に対する対象の化合物の効 果は、活性特性によって表すことができる。そのような定量的手段の非限定例には、本明 細書中に開示するアッセイから誘導されるものが含まれる。それぞれの対象の化合物は、 当該化合物の構造および他の特性を記載する分子表示により表すことができる。具体的な 実施形態において、対象の化合物の分子表示には、当該化合物の構造特性を数学的に記述 する構造記述子が含まれ得る。構造的記述子および他の種類の記述子は以下で考察する。 構造活性相関（ＳＡＲ）モデルを用いて、対象の化合物の１以上の記述子を、当該化合物 の活性特性から観察されるように、当該化合物の生物活性と数学的に相関させることがで きる。 20 【０９７２】 タンパク質複合体を調節する化合物間の構造上の共通点を特定するためのシステムおよ び方法が提供され、これらは、化合物およびその活性特性の分子表示を用いて対象の化合 物の１以上のＳＡＲモデルを構築し、ＳＡＲモデルに基づいて各化合物の活性特性と関連 する化合物のそれぞれの１以上の構造特性を特定し、そして化合物のそれぞれについて特 定された１以上の構造特性から化合物に共通の少なくとも１つの構造特性を特定すること を含み得る。具体的な実施形態において、ＳＡＲモデルは、各化合物および各化合物の活 性特性の分子表示を用いて対象の化合物のそれぞれについて構築することができる。構造 活性相関（ＳＡＲ）モデルを以下で考察する。 【０９７３】 30 ＳＡＲモデルから、各化合物の活性化特性と関連する対象の化合物のそれぞれの１以上 の構造特性を同定することができる。これらの特性のうちから、対象の化合物の全てに共 通である１以上の構造特性（構造上の共通点）を同定することができる。ある実施形態で は、コンピュータモデリング技術を用いて対象の化合物の三次元原子構造を視覚化するこ とができる。具体的な実施形態において、対象の化合物の構造上の共通点は、コンピュー タモデリング技術を用いて視覚化することができる。分子の三次元構造は、選択された分 子のＸ線結晶学的解析またはＮＭＲイメージングから得られるデータに依存し得る。力場 データを用いて、対象の化合物の分子動力学のモデル、および／または構造上の共通点を 得ることができる。分子モデリングプログラムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡ プログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）である。 40 化合物の分子表示 【０９７４】 対象の化合物の分子表示は、化合物の特性および性質を記載する種々の記述子を含み得 る。記述子は、位相型、構造型、物理化学型および／または空間型の記述子であり得る。 所定の化合物は、化合物の部分構造的成分または部分、化学官能基の距離、または空間的 、２Ｄもしくは３Ｄ位相的、電気化学的、電気物理的、およびまたは量子力学的特性をは じめとする種々の記述子によって表すことができる。具体的な実施形態では、対象の化合 物を構造記述子によって表すことができる。化合物の構造記述子の例としては、原子型、 分子量（ＭＷ）、回転可能な結合（Ｒｏｔｌｂｏｎｄ）の数、水素結合ドナー（Ｈｂｏｎ ｄ ｄｏｎｏｒ）の数、水素結合アクセプター（Ｈｂｏｎｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ）の数、 50 (266) JP 2012-516687 A 2012.7.26 化合物におけるキラル中心（ＲまたはＳ）の数、３Ｄ分子モーメント、部分構造的特性、 分子特性、および量子力学的特性を挙げることができるが、これらに限定されるものでは ない。位相的記述子の非限定例としては、バラバン指数（Ｊｘ）、カッパ形状係数、柔軟 性、サブグラフカウント、連結性、ウィーナー指数、ザブレブ指数、連結性指数、ホソヤ 指数およびＥ−ｓａｔｅキーが挙げられる。物理化学的（または熱力学的）記述子の非限 定例としては、分配係数の対数（ＡｌｏｇＰ）、分配係数の対数、原子型値（ＡｌｏｇＰ ９８）、オクタノール／水分配係数（ＬｏｇＰ）、モル屈折率（ＭＲ）およびモル屈折率 （ＭｏｌＲｅｆ）が挙げられる。空間的記述子の非限定例としては、回転半径（ＲａｄＯ ｆＧｙｒａｔｉｏｎ）、Ｊｕｒｓ荷電部分表面積記述子（Ｊｕｒｓ）、表面突起（シャド ー指数）、分子表面積（Ａｒｅａ）、密度、分子容（Ｖｍ）、および主慣性モーメント（ 10 ＰＭＩ）が挙げられる。電子記述子の非限定例としては、電荷、原子分極率の合計（Ａｐ ｏｌ）、最高被占分子軌道エネルギー（ＨＯＭＯ）、最低空分子軌道エネルギー（ＬＵＭ Ｏ）および超局在可能性（Ｓｒ）が挙げられる。種々の記述子の記載は、Ｔｈｅ Ｓｃｒ ｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）から入手 可能な標題ＱＳＡＲ記述子のウェブサイトで見いだすことができる。定義も、Ｃｅｒｉｕ ｓ２ソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）ま たはＡｃｃｅｌｒｙｓ ＱＳＡＲソフトウェア製品（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）の指導用ウェブサイトで見いだすことができる。 【０９７５】 対象の化合物の種々の記述子の値は、分子構造を決定するための計算プログラムを用い 20 て導き出すことができる。例えば、ＧＲＩＤプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｓｃ ｏｖｅｒｙ Ｌｔｄ．， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＵＫ）を用いて、既知構造の化合物上 のエネルギー的に有利な結合部位を決定することができ、これをＱＳＡＲ分析において記 述子入力として用いることができる。さらに、ＱＳＡＲ分析を行う種々のプログラム、例 えばＡｃｃｅｌｒｙｓ ＱＳＡＲソフトウェア製品（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて、対象の化合物の記述子の値を導き出すこともで きる。別の例では、対象の化合物の記述子として用いられる情報を、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｏｒ Ｐｕｒｃｈａｓｅ（ＣＡＰ）データ ベース（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）などの化合物構 造のデータベースから得ることができる。 30 構造および活性関連性モデル 【０９７６】 ＳＡＲモデルを用いて、対象の化合物の記述子を化合物の生物活性と数学的に関連づけ ることができる。対象の化合物の生物活性は、化合物の活性特性により提供することがで きる。ＳＡＲモデルは、記述子およびアルゴリズムの様々な組み合わせを用いて構築して 、他の化合物を分類するために用いることができるモデルを確立することができる。例え ば、タンパク質複合体を調節し、互いに非常に類似しているトレーニング化合物のセット を用いて構築されたある種類の化合物の構造特性を予測するＳＡＲを用いて、トレーニン グセットと類似していると考えられる他の化合物を分類することができる。 【０９７７】 40 ＳＡＲアルゴリズムを用いて、関連する化学的記述子と、観察される生物学的活性の有 効性との間の数学的関係を記述することができる。すなわち、活性Ｙは記述子Ｘの関数で ある［Ｙ＝ｆ（Ｘ）］。データ調査に有用な当該技術分野における任意のアルゴリズムを 用いて、ＳＡＲモデルを構築することができる。非限定例として、ＳＡＲモデルを構築す るために使用できるプログラムには、多重回帰（ＯＭＲ）、段階的回帰（ＳＷＲ）、およ び可能なサブセット回帰（ＰＳＲ）、および部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰および遺伝的ア ルゴリズム（ＧＡ）を実施できるプログラムが含まれる。具体的な実施形態において、化 合物のＳＡＲモデルは、一次方程式： Ａ０＋（Ａ１Ｍ１）＋（Ａ２Ｍ２）＋（Ａ３Ｍ３）＋・・・（ＡｎＭｎ） の形態を取ることができる。 50 (267) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【０９７８】 （式中、パラメータＭ１∼Ｍｎは、化合物の分子表示における種々の記述子であり、Ａ ０は定数であり、係数Ａ１∼Ａｎは、パラメータＭ１∼Ｍｎおよび化合物の生物活性、例 えば活性特性によって得られるものにおける変動を適合させることによって計算される。 このＳＡＲモデルは、当該技術分野の任意の回帰法を用いて適合させることができる。例 えば、通常の多重回帰を用いて、従属変数（例えば、活性特性とみなす）に対する独立変 数（例えば、記述子とみなす）の最小二乗適合を計算することができる。定量的構造活性 相関分析（ＱＳＡＲ）を実施することによるなどＳＡＲモデルを提供するために使用でき るソフトウェアの例としては、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＱＳＡＲソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒ ｙｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、およびＱｕａｓａｒ ５、６Ｄ−Ｑ 10 ＳＡＲソフトウェア製品（Ｂｉｏｇｒａｐｈｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ３Ｒ， Ｂ ａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が挙げられるが、これらに限定されるものではな い。他のＳＡＲモデルは、Ｓｅｌａｓｓｉｅ， ＣＤ．， “Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｑ ｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｈｉｐｓ，” Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｈｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｖｏｌ．１：Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（参照することによって本明細書中で援用される）に記載されてい る。 【０９７９】 対象の化合物について構築できるＳＡＲモデルの例としては、受容体依存性自由エネル 20 ギー力場ＱＳＡＲ（ＦＥＦＦ−ＱＳＡＲ）、受容体非依存性三次元ＱＳＡＲ（３Ｄ−ＱＳ ＡＲ）、および受容体依存性または受容体非依存性四次元ＱＳＡＲ（４Ｄ−ＱＳＡＲ）が 挙げられるが、これらに限定されるものではない。 【０９８０】 受容体非依存性３Ｄ−ＱＳＡＲ。ある化合物により示される特定の性質の大きさを、そ の化合物の１以上の構造的性質および／または物理的性質と関連づけるための手段を提供 するために用いることができる方法が、受容体非依存性３Ｄ−ＱＳＡＲ分析である。受容 体形状は、受容体非依存性３Ｄ−ＱＳＡＲ分析の実行においては未知であってよい。受容 体非依存性ＱＳＡＲは、一連の化学的類似体に適用することができ、この類似体の依存的 特性（すなわち、生物活性）は、化合物が共通の作用機序を共有するという仮定に基づい 30 て１組の分子内記述子から誘導される。回帰分析を用いて、受容体非依存性３Ｄ−ＱＳＡ Ｒ分析の活性特性の様々な評価基準に化合物の記述子を適合させることができる。 【０９８１】 受容体依存性３Ｄ−ＱＳＡＲ。別の方法は、受容体依存性３Ｄ−ＱＳＡＲ（自由エネル ギー力場ＱＳＡＲ（ＦＥＦＦ−ＱＳＡＲ）とも呼ばれる）を使用することであり得る。受 容体依存性３Ｄ−ＱＳＡＲ分析に関して、受容体形状は既知である。自由エネルギー力場 リガンド−受容体結合エネルギー項は、ＱＳＡＲスコアリング関数の独立変数として計算 し、使用することができる。例えば、Ｔｏｋａｒｓｋｉ ａｎｄ Ｈｏｐｆｉｎｇｅｒ（ １９９７）， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ． Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｃｉ． ３７：７９ ２−８１１（参照することによって本明細書中で援用される）を参照。 40 【０９８２】 受容体依存性または受容体非依存性４Ｄ−ＱＳＡＲ。４Ｄ−ＱＳＡＲモデルは、トレー ニング化合物のセットに関して分子状態アンサンブル平均を実施することにより３Ｄ−Ｑ ＳＡＲ分析を用いて構造および配列の自由度を組み込むことができる。４Ｄ−ＱＳＡＲ分 析では、化合物の活性における差異は、相互作用ファーマコフォア因子（ＩＰＥ）に関し て分子形状のボルツマン平均空間分布における差異と関連付けることができると考えられ る。単一の「活性」立体配座を、トレーニング化合物のセット中の各化合物について仮定 することができる。４Ｄ−ＱＳＡＲ分析を、受容体独立性３Ｄ−ＱＳＡＲおよびＦＥＦＦ −ＱＳＡＲモデルをはじめとするさらなる分子設計応用に使用できる。４Ｄ−ＱＳＡＲモ デルは、ＤｕｃａおよびＨｏｐｆｉｎｇｅｒ（２００１）， Ｊ Ｃｈｅｍ ｌｎｆ Ｃ 50 (268) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｏｍｐｕｔ Ｓｃｉ ４１（５）：１３６７−８７（参照することによって本明細書中で 援用される）に記載されている。 装置、コンピュータおよびコンピュータプログラム製品の実装 【０９８３】 本発明は、コンピュータ可読ストレージ媒体中に組み込まれたコンピュータプログラム メカニズムを含むコンピュータプログラム製品として実装することができる。さらに、本 発明の方法のいずれかを、１以上のコンピュータまたは他の形態の装置に実装することが できる。装置の例としては、コンピュータ、および測定装置（例えば、アッセイリーダー またはスキャナー）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明 の方法のいずれかを１以上のコンピュータプログラム製品に実装することができる。本発 10 明のいくつかの実施形態は、本出願に開示する方法のいずれかまたは全部をコード化する コンピュータプログラム製品を提供する。そのような方法は、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁 気ディスクストレージ製品、または任意の他のコンピュータ可読データもしくはプログラ ムストレージ製品に記録することができる。そのようなコンピュータ可読ストレージ媒体 は、有形の物理的対象（搬送波と対照的に）であることが意図される。そのような方法は 、永久的ストレージ、例えばＲＯＭ、１以上のプログラム可能なチップ、または１以上の 特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）に組み込むこともできる。そのような永久的ストレー ジ媒体は、サーバー、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１無線ブリッジ／ステ ーション、リピーター、ルーター、携帯電話、または他の電子装置中にローカライズさせ ることができる。コンピュータプログラム製品でコード化されるそのような方法は、イン 20 ターネットまたは他の方法で、コンピュータデータシグナル（ソフトウェアモジュールが 組み込まれているもの）をデジタルまたは搬送波のいずれかで送信することにより、電子 的に配布することもできる（搬送波のそのような使用は、記録のためでなく、配布のため であることは明らかであろう）。 【０９８４】 本発明のいくつかの実施形態は、コンピュータプログラム製品を提供する。これらのプ ログラムモジュールは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスクストレージ製品、または任 意の他のコンピュータ可読データもしくはプログラムストレージ製品に保存することがで きる。プログラムモジュールは、永久的ストレージ媒体、例えばＲＯＭ、１以上のプログ ラム可能なチップ、または１以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）に組み込むことも 30 できる。そのような永久的ストレージ媒体は、サーバー、８０２．１１アクセスポイント 、８０２．１１無線ブリッジ／ステーション、リピーター、ルーター、携帯電話、または 他の電子装置にローカライズさせることができる。コンピュータプログラム製品中のソフ トウェアモジュールは、インターネットまたは他の方法により、コンピュータデータシグ ナル（ソフトウェアモジュールが組み込まれているもの）をデジタルまたは搬送波のいず れかで送信することによって、電子的に配布することもできる。 【０９８５】 具体的な実施形態において、コンピュータプログラムは、ユーザー、ユーザーのインタ ーフェースデバイス、コンピュータ可読ストレージ媒体、モニター、ローカルコンピュー タ、またはネットワークの一部であるコンピュータに対して請求項の方法の結果の出力を 40 提供する。そのようなコンピュータ可読ストレージ媒体は、有形の物理的対象（搬送波と 対象的に）であることが意図される。 【０９８６】 本発明のこれらおよび他の実施形態を、以下の非限定的実施例においてさらに説明する 。 実施例 実施例１ 安定なＧＡＢＡＡ発現細胞系の生成 発現ベクターの生成 【０９８７】 合理化クローニングを可能にするプラスミド発現ベクターをｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ（ 50 (269) JP 2012-516687 A 2012.7.26 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づいて生成させ、これはＣＭＶおよびＳＶ４０真核性プロモ ータ；ＳＶ４０およびＨＳＶ−ＴＫポリアデニル化配列；多重クローニング部位；コザッ ク配列；ならびにネオマイシン／カナマイシン耐性カセットをはじめとする、対象の遺伝 子の転写および翻訳に必要な種々の成分を含んでいた。 工程１：トランスフェクション 【０９８８】 本発明者らは、２９３ＴとＣＨＯ細胞との両方をトランスフェクトした。この実施例は ＣＨＯ細胞に注目し、ＣＨＯ細胞を３つの独立したプラスミド（１つはヒトＧＡＢＡアル ファサブユニット（配列番号１∼４）をコードし、１つはヒトＧＡＢＡベータ３サブユニ ット（配列番号５）をコードし、他のものはヒトＧＡＢＡガンマ２サブユニット（配列番 10 号６）をコードする）を次の組み合わせを、α１β３γ２ｓ（α１）、α２β３γ２ｓ（ α２）、α３β３γ２ｓ（α３）およびα５β３γ２ｓ（α５）の組み合わせでコトラン スフェクトした。当業者には理解されるように、選択された宿主細胞と併用するのに適し た任意の試薬を使用して、核酸、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、標識されたオ リゴヌクレオチドを、適切に最適化した宿主細胞中に導入することができる。核酸を宿主 細胞中に導入するために使用することができる試薬の例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ ｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ 試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、またはＦｅｃ ｔｕｒｉｎが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 【０９８９】 20 薬剤選択は、本発明の方法では任意であるが、プラスミド１個につき１個の薬剤耐性マ ーカーを含めた。配列はＣＭＶプロモータの制御下にあった。シグナリングプローブによ る検出のためのタグをコード化する非翻訳配列も、薬剤耐性マーカーをコード化する配列 とともに存在していた。使用した標的配列は、ＧＡＢＡ標的配列１（配列番号７）、ＧＡ ＢＡ標的配列２（配列番号８）およびＧＡＢＡ標的配列３（配列番号９）であった。これ らの例では、ＧＡＢＡアルファサブユニット遺伝子含有ベクターはＧＡＢＡ標的配列１を 含み、ＧＡＢＡベータサブユニット遺伝子含有ベクターはＧＡＢＡ標的配列２を含み、Ｇ ＡＢＡガンマサブユニット遺伝子含有ベクターはＧＡＢＡ標的配列３を含んでいた。 工程２：選択工程 【０９９０】 30 トランスフェクトされた細胞をＨＡＭＦ１２−ＦＢＳ中で２日間増殖させ、続いて抗生 物質を含有するＨＡＭＦ１２−ＦＢＳ中で１４日間増殖させた。抗生物質含有期間は、次 のように抗生物質を培地に添加した：ピューロマイシン（３．５ｕｇ／ｍｌ）、ハイグロ マイシン（１５０ｕｇ／ｍｌ）、およびＧ４１８／ネオマイシン（３００ｕｇ／ｍｌ）。 工程３：細胞継代 【０９９１】 抗生物質選択後で蛍光発生プローブの導入前に、細胞を抗生物質の非存在下で６∼１８ 回継代して、選択された期間にわたって安定でない発現が沈静化するために時間をとった 。 工程４：蛍光発生プローブへの細胞の暴露 40 【０９９２】 細胞を収穫し、ＧＡＢＡシグナリングプローブ（配列番号１０∼１２）でトランスフェ クトした。当業者には理解されるように、選択された宿主細胞と併用するのに適した任意 の試薬を使用して、核酸、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、標識されたオリゴヌ クレオチドを、適切な最適化をした宿主細胞中に導入することができる。核酸を宿主細胞 中に導入するために使用することができる試薬の例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ試薬 、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、またはＦｅｃｔｕ ｒｉｎが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 【０９９３】 50 (270) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＧＡＢＡシグナリングプローブ１はＧＡＢＡ標的配列１を結合し、ＧＡＢＡシグナリン グプローブ２はＧＡＢＡ標的配列２を結合し、そしてＧＡＢＡシグナリングプローブ３は ＧＡＢＡ標的配列３を結合する。細胞を次いで分析のために集め、蛍光活性化細胞分類（ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）（下記）を用いて分類した。 【０９９４】 シグナリングプローブによって検出される標的配列 ＧＡＢＡ標的１ ５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号７）（ア ルファサブユニット） ＧＡＢＡ標的２ 10 ５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣ−３’（配列番号８）（ベ ータサブユニット） ＧＡＢＡ標的３ ５’−ＧＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号９）（ガ ンマサブユニット） 【０９９５】 シグナリングプローブ １００μＭストックとして供給 【０９９６】 ＧＡＢＡシグナリングプローブ１は（ＧＡＢＡ標的１） 20 ５’−Ｃｙ５ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号１０）を結合する。 【０９９７】 ＧＡＢＡシグナリングプローブ２は（ＧＡＢＡ標的２） ５’−Ｃｙ５．５ ＧＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴ ＣＧＣ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号１１）を結合する。 【０９９８】 Ｃｙ５と類似したスペクトル特性を有するＱｕａｓａｒ Ｄｙｅ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ ）を用いた類似のプローブをある実験で使用した。ＤＮＡプローブではなく５−ＭｅｄＣ および２−アミノｄＡミキシマープローブを数例では使用したことにも注意。ＢＨＱ３は 30 ＢＨＱ２またはプローブ１もしくはプローブ２中の金粒子で置換することができることに 注意。 【０９９９】 ＧＡＢＡシグナリングプローブ３は（ＧＡＢＡ標的３） ５’−Ｆａｍ ＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ１ ｑｕｅｎｃｈ−３”（配列番号１２）を結合する。 【１０００】 ＢＨＱ１はＢＨＱ２またはプローブ３中のＤａｂｃｙｌで置換することができることに 注意。 工程５：陽性細胞の単離 40 【１００１】 蛍光活性化細胞分類（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）を用 いた分析および分類のために、細胞を解離させ、集めた。標準的解析法を使用して、バッ クグラウンドより高い蛍光を発する細胞をゲートで制御し、バーコード化した９６ウェル プレート中でゲート内に含まれる個々の細胞を単離した。ゲート制御階層は次のとおりで あった：ゲート制御階層：コインシデンスゲート＞シングレットゲート＞ライブゲート＞ ソートゲート。このゲート制御法を用いて、三重陽性細胞の上位０．０４∼０．４％をバ ーコード化した９６ウェルプレート中の分類の対象とした。 工程６：工程１∼５および／または３∼５のさらなるサイクル 【１００２】 50 (271) JP 2012-516687 A 2012.7.26 工程１∼５および／または３∼５を繰り返して、多数の細胞を得た。工程１∼５の独立 した２ラウンドを完了し、これらのサイクルのそれぞれについて、独立したラウンドの合 計について、工程３∼５の少なくとも３回の内部サイクルを実施した。 工程７：細胞の集団についての増殖速度の推定 【１００３】 プレートをＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓｔａｒ自動化液体ハンドラーに移し た。細胞を、１００単位のペニシリン／ｍｌ＋０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを 添加した２∼３日馴化させた増殖培地：新鮮な増殖培地の１：１ミックス（増殖培地はＨ ａｍのＦ１２／１０％ＦＢＳである）中で５∼７日間インキュベートし、次いで０．２５ ％トリプシンを用いたトリプシン処理によって分散させて、凝集物を最小限に抑え、新し 10 い９６ウェルプレートに移した。クローンを分散させた後、プレートを撮像して、ウェル （Ｇｅｎｅｔｉｘ）の集密度を測定した。プレート全体に亘って信頼できる画像取得のた めに各プレートに焦点を合わせた。報告された７０％を超える集密度は信頼性がなかった 。集密度測定は、９日（分散後１∼１０日の間）にわたって３日ごとに測定値を得、増殖 速度を計算するために使用した。 工程８：増殖速度推定値による細胞集団のビン化 【１００４】 細胞を、工程７の分散工程後１０∼１１日の間で増殖速度にしたがってビン化した（独 立して分類し、コホートとしてプレーティングした）。ビンを独立して集め、下流の操作 のために各９６ウェルプレート上にプレーティングし、特定のビンにつき２以上の標的プ 20 レートがあり得た。増殖速度の広がりを考慮し、細胞の集団の合計数の高いパーセンテー ジを網羅する範囲をまとめることによって、ビンを計算した。分類の反復によって（工程 ５を参照）、１∼４日の区切りで５∼６の増殖ビンを使用した。したがって、各ビンは、 反復に応じて１２∼１４．４時間の間の増殖速度または集団倍加時間差に相当する。 工程９：パラレルプロセッシングを加速し、ストリンジェントなＱＣを提供するための レプリカプレーティング法 【１００５】 プレートを、標準的および固定条件（加湿３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気）下、抗生 物質を含まないＨａｍのＦ１２培地／１０％ＦＢＳ中でインキュベートした。細胞のプレ ートを分けて、４セットの標的プレートを得た（このセットは全増殖ビンを有する全プレ 30 ートからなり、これらの工程は、初期セットの４つの複製が存在することを保証する）。 ２セットまでの標的プレートを低温保存に付し（下記参照）、残りのセットを継代および 機能的アッセイ実験のために拡大し、さらにレプリカプレーティングした。別個の独立組 織培養試薬、インキュベータ、人員および二酸化炭素源を、それぞれ独立して実施される プレートのセットについて使用した。品質管理工程を行って、全ての組織培養試薬の適切 な産生および品質を保証した：使用するために調製した培地の各ボトルに添加された各成 分を、その試薬のみを含む１つの指定されたフード中で１人の指定された人が添加し、そ の間、もう１人が過誤を回避するために監視した。ウェル全体にわたって相互汚染をなく すために液体取り扱いの条件を設定した。全ての工程で新しいチップを使用するか、また は厳しいチップ洗浄プロトコルを使用した。液体取り扱い条件は、正確な体積移動、有効 40 な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティング速度および位置、細胞分散のためのピペッテ ィングサイクル数、ならびにプレートに対するチップの相対的位置について設定した。 工程１０：細胞の集団の初期継代ストックの凍結 【１００６】 少なくとも２セットのプレートを−７０∼−８０℃で凍結した。各セットのプレートを まず７０∼１００％の集密度にした。培地を吸引し、９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ を添加した。プレートをパラフィルムで密封し、次いで個々に１∼５ｃｍの発泡体で囲ん で、−８０℃の冷凍庫中に入れた。 工程１１：ＶＳＦを産生するための初期変形工程の方法および条件 【１００７】 50 (272) JP 2012-516687 A 2012.7.26 残りのプレートのセットを工程９（前記）で記載したように維持した。全ての細胞分裂 は、培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングなら びに細胞分散工程をはじめとする自動化液体取り扱い工程を用いて実施した。 工程１２：増殖速度の残存するバラツキを補正するための正規化法 【１００８】 細胞および全ての細胞の集団についての培養条件の一貫性および標準化を制御した。増 殖速度の若干の差異が原因のプレート全体にわたる差異は、プレート全体に亘って細胞数 を周期的に正規化することによって制御することができた。 工程１３：細胞集団の特性化 【１００９】 10 細胞を６∼８週間の細胞培養のために維持して、これらの条件下でのそれらのインビト ロで進化させた。この期間中、本発明者らは、サイズ、形態、脆性、トリプシン処理に対 する反応または解離、解離後の丸さ／平均真円度、生存率（％）、マイクロ集密度への傾 向、または培養プレート表面への接着性などの細胞維持の他の態様を観察した。 工程１４：ＶＳＦ条件下の細胞集団の潜在的機能性の評価 【１０１０】 機能基準を用いて細胞の集団を試験した。膜電位アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ／ＭＤＳ）を製造業者の指示に従って使用した。細胞を９６または３８ ４ウェルプレート中で複数の異なる密度で試験し、反応を分析した。例えばプレーティン グ後１２∼４８時間など、プレーティング後の種々の時点を使用した。異なるプレーティ 20 ング密度もアッセイ反応差異について試験した。 工程１５ 【１０１１】 低および高継代数で実施した実験から得られた機能的反応を比較して、３∼９週間の範 囲の所定の期間にわたって最も一貫した反応を有する細胞を特定した。形態、マイクロ集 密度に対する傾向、およびプレーティング後の培養マトリックスへの付着時間をはじめと する、経時的に変化する細胞の他の特性も試験した。 工程１６ 【１０１２】 機能的基準および他の基準を満たす細胞の集団をさらに評価して、生存可能で安定かつ 30 機能的な細胞系を最も産生しやすいものを見いだした。選択された細胞の集団をさらに大 きな組織培養容器中で増殖させ、前述の特性化工程をこれらの条件下で継続し、繰り返し た。この時点で、一貫した信頼性のある継代のために、さらなる標準化工程を導入した。 これらには、種々のプレーティング細胞密度、継代時間、培養皿のサイズ／形式およびコ ーティング、流体工学最適化、細胞解離最適化（種類、使用した体積、時間の長さ）、な らびに洗浄工程が含まれていた。アッセイＺ’スコアは、培養中、４週間にわたって数日 ごとに試験すると、安定であった。 【１０１３】 また、各継代での細胞の生存率を測定した。手作業の介入を増やし、細胞をさらに綿密 に観察し、モニタリングした。所望の特性を有する最終細胞系を同定し、選択するのに役 40 立てるために、この情報を使用して、一貫した増殖、適切な接着性、ならびに機能的反応 を示す最終細胞系およびバックアップ細胞系を選択した。 工程１７：細胞バンクの確立 【１０１４】 最終細胞系およびバックアップ細胞系に対応する低継代凍結プレート（前記参照）を３ ７℃で解凍し、ＨａｍのＦ１２／１０％ＦＢＳで２回洗浄し、加湿３７℃／５％ＣＯ２条 件でインキュベートした。細胞を次いで２∼３週間増殖させた。それぞれ１０００万個の 細胞を有する２５のバイアルからなる各最終およびバックアップ細胞系の細胞バンクを確 立した。 工程１８ 50 (273) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【１０１５】 細胞バンクからの少なくとも１つのバイアルを解凍し、培養で増殖させた。結果として 得られた細胞を試験して、これらがもともと選択されたもととなる同じ特性を満たすこと を確認した。 実施例２ ＧＡＢＡリガンドに対するＧＡＢＡＡ細胞系反応の検証 【１０１６】 ＧＡＢＡＡ（α１β３γ２ｓ（α１）、α２β３γ２ｓ（α２）、α３β３γ２ｓ（α ３）およびα５β３γ２ｓ（α５）のサブユニット組み合わせ）ＧＡＢＡ、内因性ＧＡＢ ＡＡリガンドを発現するＣＨＯ細胞系の反応を評価した。細胞系のＧＡＢＡとの相互作用 を、以下のプロトコルを用いてＧＡＢＡに反応したＧＡＢＡＡの膜電位を測定することに 10 よって評価した。 【１０１７】 ３８４ウェルプレートにおいて増殖培地（ＨａｍのＦ−１２培地＋ＦＢＳおよびグルタ ミン）中、１ウェルあたり１０∼２５，０００細胞でアッセイの２４時間前に細胞をプレ ーティングした。培地を除去した後、ロード緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫ Ｃｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース）中で希 釈した膜電位色素を添加した。インキュベーションは１時間であり、続いてプレートをハ イスループット蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｓｔｕ ＦＤＳＳ）にかけた。ＧＡ ＢＡリガンドをＭＰアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコン酸カリウ ム、１．２５ｍＭのＣａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース）中で、所 20 望の濃度（必要ならば、ＧＡＢＡの連続希釈を生成、使用した濃度：３ｎＭ、１０ｎＭ、 ３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１ｕＭ、３ｕＭ、１０ｕＭ）に希釈し、各ウェルに 添加した。プレートを９０秒間読み取った。 【１０１８】 表６（下記）は、生成した細胞系のそれぞれがＧＡＢＡリガンドに反応することを示す 。これらの結果は、産生されたＧＡＢＡＡ細胞系（予想されるように内因性リガンドに対 して反応する）がハイスループットスクリーニングアッセイでの使用に生理学的に関連す ることを示す。さらに、複製ウェルは、ウェルごとに正確なＥＣ５０値を生みだし、この ことは、ＧＡＢＡＡ細胞系の高い再現性を示す。膜電位アッセイを用いて得られたＺ’値 は、α１β３γ２ｓ ０．５８、α２β３γ２ｓ ０．６７、α３β３γ２ｓ ０．６９ 30 およびα５β３γ２ｓ ０．６２であった。 実施例３ 既知ＧＡＢＡＡモジュレータを用いたＧＡＢＡＡ細胞系のさらなる検証 【１０１９】 ＧＡＢＡＡ細胞系および膜電位アッセイを、ビククリン（公知拮抗物質）のアッセイ緩 衝液中、３０ｕＭ、１０ｕＭ、３ｕＭ、１ｕＭ、３００ｎＭ、１００ｎＭおよび３０ｎＭ での連続希釈を用いて実施例２に記載した方法により検証した。 【１０２０】 ビククリンは、ＥＣ５０濃度のＧＡＢＡの存在下で４つのＧＡＢＡＡ細胞系全てと相互 作用することが判明した。これらの結果は、産生されたＧＡＢＡＡ細胞系（ＧＡＢＡＡの この既知モジュレータに対して予想どおり反応する）がハイスループットスクリーニング 40 アッセイでの使用に生理学的および薬理学的に関連することを示す。 実施例４ 膜電位アッセイを用いた自然のＧＡＢＡＡ機能に関するＧＡＢＡＡ発現細胞系 の特性化 【１０２１】 ＧＡＢＡＡ（α１β３γ２ｓ（α１）、α２β３γ２ｓ（α２）、α３β３γ２ｓ（α ３）およびα５β３γ２ｓ（α５）のサブユニット組み合わせ）を発現するＣＨＯ細胞系 と、ＬＯＰＡＣ１２８０（Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）からの１２８０の化合物との相互作用を評価した（Ｓ ｉｇｍａ−ＲＢＩ Ｐｒｏｄ． Ｎｏ． ＬＯ１２８０）。ＬＯＰＡＣ１２８０ライブラ リは、十分に文書化された薬理学的活性を有する高純度の小有機リガンドを含む。細胞系 50 (274) JP 2012-516687 A 2012.7.26 の試験化合物との相互作用は、以下のプロトコルを用いて、試験化合物に反応するＧＡＢ ＡＡの膜電位を測定することによって評価した。 【１０２２】 ３８４ウェルプレートにおいて増殖培地（ＨａｍのＦ−１２培地＋ＦＢＳおよびグルタ ミン）中、各ウェルにつき１０∼２５，０００個の細胞でアッセイ前２４時間に細胞をプ レーティングした。培地を除去し、続いてロード緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ のＫＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース）中 で希釈した膜電位色素を添加した。インキュベーションは１時間であり、続いてプレート をハイスループット蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｓｔｕ ＦＤＳＳ）にかけた。 試験化合物をＭＰアッセイ緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルコン酸カリウム 10 、１．２５ｍＭのＣａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース）中で所望の 濃度（必要な場合、各試験化合物の連続希釈を生成、使用した濃度：３ｎＭ、１０ｎＭ、 ３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１ｕＭ、３ｕＭ、１０ｕＭ）に希釈し、各ウェルに 添加した。プレートを９０秒間読み取った。 結果 【１０２３】 各化合物の産生されたＧＡＢＡＡ細胞系に対する活性を測定し、ＧＡＢＡ（内因性リガ ンド）と類似した活性またはより高い活性を示す化合物を陽性ヒットとして記録した。ス クリーニングした１２８０個の化合物のうち、３４が少なくとも１つの細胞系（すなわち 、α１、α２、α３およびα５のいずれか）を、ＧＡＢＡより優れてとはいわないまでも 20 同程度に活性化した。これらの化合物のうちの１７の化合物と産生されたＧＡＢＡＡ細胞 系との相互作用は、以下の用量反応研究で確認した。ＧＡＢＡが存在することを必要とす るモジュレータ、部分アゴニストおよび効果の低い化合物はリストに含めなかった。 【１０２４】 スクリーニングアッセイは、ＬＯＰＡＣライブラリにおけるＧＡＢＡＡアゴニスト：Ｇ ＡＢＡ（内因性リガンド）、プロポフォール、イソグバシン塩酸塩、ムシモール臭化水素 酸塩、ピペリジン−４−スルホン酸、３−アルファ，２１−ジヒドロキシ−５−アルファ −プレグナン−２０−オン（神経ステロイド）、５−アルファ−プレグナン−３アルファ −オール−１１，２０−ジオン（神経ステロイド）、５−アルファ−ペグナン−３アルフ ァ−オール−２０−オン（神経ステロイド）、およびトラカゾレートのそれぞれを同定し 30 た。結果は、産生されたＧＡＢＡＡ細胞系が生理学的に関連した方法で反応することを示 す。（例えば、これらは内因性受容体のアゴニストに反応する）。これらの８個のアゴニ ストのＥＣ５０値を測定し、表６（下記）に記載する。 【１０２５】 スクリーニングアッセイは、ＧＡＢＡアゴニストとして記載されていないが、ＧＡＢＡ Ａに付随する他の活性を有することが知られているＬＯＰＡＣライブラリ中の４つの化合 物も同定し、これらは：エタゾレート（ホスホジエステラーゼ阻害剤）、アンドロステロ ン（ステロイドホルモン）、クロルメザノン（筋肉弛緩薬）、およびイベルメクチン（塩 素チャンネルをもたらすことが知られている抗寄生虫薬）である。これらの４つの化合物 のＥＣ５０値を測定し、表６（下記）にまとめる。 【１０２６】 スクリーニングアッセイは、現在までＧＡＢＡＡと相互作用することが知られていなかっ たＬＯＰＡＣライブラリの４つの化合物をさらに同定した。これらの新規化合物には：ジ ピリミドール（ｄｉｐｙｒｉｍｉｄｏｌｅ）（アデノシンデアミナーゼ阻害剤）、ニクロ サミド（抗寄生虫薬）、チルホスチンＡ９（ＰＤＧＦＲ阻害剤）、およびＩ−Ｏｍｅ−チ ルホスチンＡＧ５３８（ＩＧＦ ＲＴＫ阻害剤）が含まれる。これらの４つの化合物のＥ Ｃ５０値を測定し、表６（下記）にまとめる。 【１０２７】 表６にまとめたスクリーニングアッセイの結果： 40 (275) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表６】 10 20 (276) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 実施例５ 電気生理学的アッセイを用いた自然のＧＡＢＡＡ機能についてのＧＡＢＡＡ− 50 (277) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ＣＨＯ細胞特性化 【１０２８】 以下の電位固定プロトコルを使用した：膜電位を−６０ｍＶの保持電位に固定した。Ｇ ＡＢＡの濃度を増大しつつ（０．１０∼１００μＭ）２秒加え、中間で緩衝液で洗浄する ことにより、電流を誘発した。 【１０２９】 １００ｕＭのＧＡＢＡに反応したα２、α３、およびα５ ＧＡＢＡＡ細胞系、ならび に増大する濃度のＧＡＢＡ（ログインクリメントで０．１０∼１００μＭ）に反応したα １ ＧＡＢＡＡ細胞系の全細胞受容体電流のトレースは、ＧＡＢＡＡ細胞系を前述のハイ スループットスクリーニングアッセイに加えて、従来の電気生理学的機能アッセイで使用 10 できることを裏付ける。これらの電気生理学的機能アッセイ結果は、実施例２の膜電位ア ッセイとともに、本発明で得られるＧＡＢＡＡ細胞系の生理学的および薬理学的関連性を 確認する。電気生理学的機能は、ＧＡＢＡＡ受容体のモジュレータを検出する信頼性のあ る方法として認められている。本発明者等のデータは、本発明の細胞系により膜電位アッ セイを用いて同様に信頼性のある結果を得ることができることを示す。従来技術の細胞系 は、電気生理学的機能よりも安価で迅速なこの膜電位アッセイを有効に利用するほど信頼 性および感受性でない。このように、本発明の細胞系により、電気生理学的機能を用いて 得られるよりもはるかに大規模なスクリーニングが可能になる（電気生理学的機能を用い て１日あたり１００未満であるのに対して、膜電位アッセイを用いて１日あたり１０００ ０のアッセイ）。 20 実施例６ ハロゲン化物感受性ｍｅＹＦＰを用いた天然のＧＡＢＡＡ機能に対する細胞内 読み出しアッセイの特性化 【１０３０】 ＧＡＢＡＡ（α１β３γ２ｓ（Ａ１）、α２β３γ２ｓ（Ａ２）、α３β３γ２ｓ（Ａ ３）およびα５β３γ２ｓ（Ａ５）のサブユニット組み合わせ）を発現するＣＨＯ本発明 の細胞の試験化合物に対する反応を、細胞内読み出しアッセイの以下のプロトコルを用い て評価した。 【１０３１】 細胞をアッセイ前２４時間に、３８４ウェルプレートにおいて増殖培地（ＨａｍのＦ− １２培地＋ＦＢＳおよびグルタミン）中、各ウェルあたり１０∼２５，０００細胞でプレ 30 ーティングした。培地を除去し、続いてローディング緩衝液（１３５ｍＭのＮａＣｌ、５ ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ ｍＭのグルコース）を添加し、１時間インキュベートした。アッセイプレートを次いでＦ ＤＳＳ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にかけた。試験化合物（例えば ＧＡＢＡリガンド）をアッセイ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＩ、５ｍＭＫＣｌ、１．２５ｍ ＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース） 中で所望の濃度（必要な場合、各試験化合物の連続希釈を生成、使用した有効濃度：３ｎ Ｍ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１ｕＭ、３ｕＭ、１０ｕＭ）に希釈 し、各ウェルに添加した。プレートを９０秒間読み取った。 【１０３２】 40 ＧＡＢＡリガンドの濃度に対応して、ＧＡＢＡＡ−ｍｅＹＦＰ−ＣＨＯ細胞はｍｅＹＦ Ｐシグナルの増大するクエンチを示す。このクエンチを使用して、ＧＡＢＡ活性化の用量 反応曲線を計算することができる。細胞内読み出しアッセイにより作製されたＧＡＢＡ用 量反応曲線は、実施例３に記載するＭｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｌｕｅア ッセイにより作製された曲線と似ている。これらのデータは、ＧＡＢＡＡのモジュレータ を決定するために、本発明の細胞を細胞内読み出しアッセイで使用できることを示す。 実施例７ 安定なＧＣ−Ｃを発現する細胞系の生成 【１０３３】 標準的技術を用い、ヒトＧＣ−Ｃ遺伝子（配列番号１５）をコードするプラスミドで２ ９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。（核酸を宿主細胞中に導入するために使用すること 50 (278) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ができる試薬の例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡ ＭＩＮＥ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴＦＸ（商標）試 薬、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅまた はＦＥＣＴＵＲＩＮ（商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。） 【１０３４】 本発明の方法では薬剤選択は任意であるが、本発明者らはヒトＧＣ−Ｃ遺伝子をコード するプラスミド中に１つの薬剤耐性マーカーを含めた。ＧＣ−Ｃ配列はＣＭＶプロモータ の制御下にあった。シグナリングプローブにより検出されるタグをコードする非翻訳配列 も薬剤耐性マーカーをコード化する配列とともに存在していた。使用した標的配列はＧＣ −Ｃ標的配列１（配列番号１３）であった。この実施例では、ＧＣ−Ｃ遺伝子含有ベクタ 10 ーはＧＣ−Ｃ標的配列１を含んでいた。 【１０３５】 トランスフェクトされた細胞をＤＭＥＭ−ＦＢＳ中で２日間増殖させ、続いて５００μ ｇ／ｍｌのハイグロマイシン含有ＤＭＥＭ−ＦＢＳ中で１０日間、次いでＤＭＥＭ−ＦＢ Ｓで残りの時間増殖させ。合計４から５週間の間（独立した単離に依存）、ＤＭＥＭ／１ ０％ＦＢＳ中で増殖させた後、シグナリングプローブを添加した。 【１０３６】 抗生物質に関して濃縮した後、細胞を抗生物質選択の非存在下で８∼１０回継代して、 選択された期間にわたって安定でない発現が沈静化するために時間をとった。 【１０３７】 20 細胞を回収し、標準的技術を用いてＧＣ−Ｃシグナリングプローブ１（配列番号１４） でトランスフェクトした。（核酸を宿主細胞中に導入するために使用することができる試 薬の例としては、これらに限定されるものではないが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商 標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ 商標）、ＴＦＸ（商標）試薬、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍ ｅｔａｆｅｃｔｉｎｅまたはＦＥＣＴＵＲＩＮ（商標）が挙げられる。）細胞を次いで解 離させ、分析のために集め、そして蛍光活性化細胞分類（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅ ｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を用いて分類した。 ＧＣ−Ｃシグナリングプローブ１によって検出されたＧＣ−Ｃ標的配列１ ５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１３） 30 ＧＣ−Ｃシグナリングプローブ１ （１００μＭストックとして供給） ５’−Ｃｙ５ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ２−３’（配列番号１４） 【１０３８】 加えて、Ｃｙ５と同様のスペクトル特性を有するＱＵＡＳＡＲ（登録商標）Ｄｙｅ（Ｂ ｉｏＳｅａｒｃｈ）を用いた同様のプローブをある実験で使用した。いくつかの実験では 、ＤＮＡプローブではなく、５−ＭｅｄＣおよび２−アミノｄＡミキシマーを使用した。 【１０３９】 細胞を解離させ、分析および蛍光活性化細胞分類（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， 40 Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）を用いた分類のために集めた。標準的解析法を使用して、バック グラウンドより高い蛍光を発する細胞をゲートにより制御し、バーコード化９６ウェルプ レート中でゲート内に入る個々の細胞を単離した。以下のゲート制御階層を使用した： 【１０４０】 コインシデンスゲート→シングレットゲート→ライブゲート→ソートゲート（プロット ＦＡＭ対Ｃｙ５：０．３％の生細胞において） 【１０４１】 前記工程を繰り返して、さらに多くの細胞を得た。前記工程のすべてを２ラウンド実施 した。加えて、細胞継代、シグナリングプローブへの暴露および工程の蛍光活性化細胞分 類配列による陽性細胞の単離を独立したトランスフェクションラウンドの１ラウンドにつ 50 (279) JP 2012-516687 A 2012.7.26 いて合計２回実施した。 【１０４２】 プレートをＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ（商標）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃ ｓ）に移した。細胞を１００μｌの新鮮な完全増殖培地と２日馴化増殖培地との１：１ミ ックス（１００Ｕのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加）中 で９日間インキュベートし、凝集物を最小に抑えるために２回トリプシン処理し、新しい ９６ウェルプレートに移した。プレートを撮像して、ウェル（Ｇｅｎｅｔｉｘ）の集密度 を測定した。プレート全体にわたって信頼性のある画像取得のために各プレートに焦点を 合わせた。７０％を超える報告された集密度は信頼性がなかった。３日連続で集密度測定 値を得、これを用いて増殖速度を計算した。 10 【１０４３】 分散工程後３日に、増殖速度によって細胞をビン化した（独立して分類し、コホートと してプレーティングした）。４つの増殖ビンのそれぞれを各９６ウェルプレートに分け； 一部の増殖ビンは２以上の９６ウェルプレートになった。増殖速度の広がりを考慮し、高 率の細胞の集団の合計数におよぶ範囲をまとめることによって、ビンを計算した。ビンを 計算して、増殖速度における１２時間差を得た。 【１０４４】 細胞は、１日未満から２週間を超える倍加時間を有し得る。増殖速度に応じて同時に合 理的にビン化され得る最も多様なクローンを処理するために、１ビンあたり０．２５∼０ ．７日の倍加時間を有する３∼９ビンを使用するのが好ましい。当業者は、ビンのタイト 20 さおよびビンの数を特定の状況について調節することができ、ビンのタイトさおよび数は 、細胞が自身の細胞サイクルについて同期した場合にさらに調節することができることを 理解するであろう。 【１０４５】 プレートを、抗生物質を含まない標準条件および固定条件（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ、３７℃ 、５％ＣＯ２）下でインキュベートした。細胞のプレートを分けて、５組の９６ウェルプ レートを得た（３組は凍結用、１組はアッセイ用、そして１組は継代用）。異なる独立組 織培養試薬、インキュベータ、人員および二酸化炭素源を、プレートのそれぞれの組の作 業の流れの下流で使用した。品質管理工程を取り入れて、全ての組織培養試薬の適切な産 生量および品質を保証した。すなわち、使用するために調製した培地の各ボトルに添加し 30 た各成分は、その試薬のみを有する指定されたフード中で指定された１人が添加し、その 間、もう１人の指定された人が間違いを避けるために監視した。液体取り扱いの条件は、 ウェル全体にわたる相互汚染をなくすように設定した。全工程に関して新しいチップを使 用するか、または厳しいチップ洗浄プロトコルを使用した。液体取り扱い条件は、正確な 体積移動、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティング速度および位置、細胞分散 のためのピペッティングサイクル数、ならびにプレートに対するチップの相対的位置につ いて設定した。 【１０４６】 １組のプレートを−７０∼−８０℃で凍結した。この組のプレートにまず、７０∼１０ ０％の集密度を達成させた。培地を吸引し、９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを添加し 40 た。プレートを個々にパラフィルムで密封し、１∼５ｃｍの発泡体で包囲し、そして冷凍 庫中に入れた。 【１０４７】 残りの２セットのプレートを前述の標準化および固定化条件下で維持した。全ての細胞 分裂は、培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチング ならびに細胞分散工程をはじめとする自動化液体取り扱い工程を用いて実施した。 【１０４８】 細胞の一貫性および標準化ならびに全ての細胞の集団についての培養条件を制御した。 増殖速度の若干の差異が原因のプレート全体にわたる差異を、プレート全体にわたる細胞 数の正規化により制御し、そして再配列後３継代を行った。外れ値である細胞の集団を検 50 (280) JP 2012-516687 A 2012.7.26 出し、除外した。 【１０４９】 細胞を３∼６週間維持して、これらの条件下で自身をインビトロで進化させた。この期 間中、本発明者等は、サイズ、形態、マイクロ集密度への傾向、脆性、トリプシン処理に 対する反応およびトリプシン処理後の平均真円度、または細胞維持の他の態様、例えば培 養プレート表面への接着性および流体添加の際の吹き飛ばしに対する耐性を観察した。 【１０５０】 細胞の集団は、機能基準を用いて試験した。Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ｅ ｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．９００−０１４；ＡｓｓａｙＤ ｅｓｉｇｎｓ、Ｉｎｃ．）を製造業者の指示：（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｓａｙｄｅ 10 ｓｉｇｎｓ．ｃｏｍ／ｏｂｊｅｃｔｓ／ｃａｔａｌｏｇ／／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｅｘｔｒａ ｓ／９００−０１４．ｐｄｆ）にしたがって使用した。細胞を９６ウェルまたは３８４ウ ェルプレート中、４つの異なる密度で試験し、反応を分析した。以下の条件を本発明のＧ Ｃ−Ｃ発現細胞系に関して使用した： 【１０５１】 ・クローンスクリーニング：アッセイ前４８時間にコンフルエント９６ウェルプレート の１：２および１：３分割、３０分のグアニリン処理。 【１０５２】 ・用量反応研究：１ウェルあたり２０，０００、４０，０００、６０，０００、８０， ０００、１２０，０００および１６０，０００の密度、３０分のグアニリン処理（実施例 20 ８を参照）。 【１０５３】 ・Ｚ’研究：各ウェルあたり１６０，０００および２００，０００の密度を使用し、３ ０分グアニリン処理（実施例９を参照）。 【１０５４】 低および高継代数で実施した実験から得られる機能的反応を比較して、４∼１０週の範 囲の所定の範囲の期間にわたって最も一貫した反応を有する細胞を同定した。経時的に変 化した細胞の他の特性も記録した。 【１０５５】 機能的基準および他の基準を満たす細胞の集団ををさらに評価して、生存可能で安定か 30 つ機能的な細胞系を最も産生しやすいものを見いだした。選択された細胞の集団をさらに 大きな組織培養容器中で増殖させ、これらの条件下で、前述の特性化工程を継続するかま たは繰り返した。この時点で、異なる細胞密度；プレーティング時間、細胞培養継代の長 さ；細胞培養皿形式およびコーティング；速度および剪断力を包含する流体工学最適化； 継代時間；ならびに洗浄工程などのさらなる標準化工程を、一貫した信頼性のある継代の ために導入した。さらに、各継代での細胞の生存率を測定した。手動介入を増やし、細胞 をさらに綿密にモニタリングした。この情報を使用して、所望の特性を保有する最終的細 胞系を同定し、選択する助けにした。このプロセスにしたがい、これらの条件下で産生し た場合に、適切な接着性／粘性および増殖速度およびさらにはプレーティング（マイクロ 集密度の欠失）を示した最終的細胞系およびバックアップ細胞系（合計２０クローン）を 40 選択した。 【１０５６】 選択された２０クローンのそれぞれについて３バイアルの初期凍結ストックは、２４ウ ェル、６ウェルおよび１０ｃｍ皿により再配列された９６ウェルプレートからのＤＭＥＭ ／１０％ＦＢＳ／ＨＥＰＥＳ／Ｌ−Ｇｌｕ中で非凍結集団を増殖させることによって生成 させた。最終細胞系およびバックアップ細胞系に対応する低継代凍結ストックを３７℃で 解凍し、ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで２回洗浄し、同様にしてインキュベートした。細胞 を次いで２∼４週間増殖させた。２つの最終クローンを選択した。 【１０５７】 初回凍結の１つのクローンからの１つのバイアルを解凍し、培養で増殖させた。結果と 50 (281) JP 2012-516687 A 2012.7.26 して得られた細胞を試験して、これらが元々選択されたもととなる同じ特性を満たすこと を確認した。２０から１００を超えるバイアルからなる各細胞系の細胞バンクを確立する ことができる。 【１０５８】 以下の工程を実施して、細胞系が生存可能で、安定で、機能的であることを確認し：細 胞バンクからの少なくとも１つのバイアルを解凍し、培養で増殖させ；結果として得られ る細胞を試験して、これらがもともと選択されたもととなる同じ性質を満たすかどうかを 確認する。 実施例８ 自然ＧＣ−Ｃ機能についての細胞の特性化 【１０５９】 10 ｃＧＭＰの検出のための競合的ＥＬＩＳＡを用いて、産生されたＧＣ−Ｃ発現細胞系に おける自然のＧＣ−Ｃ機能を特性化した。ＧＣ−Ｃを発現する細胞を標準的細胞培養条件 下、１０％ウシ胎仔血清、グルタミンおよびＨＥＰＥＳを追加したダルベッコの修飾イー グル培地（ＤＭＥＭ）中で維持し、Ｔ１７５ｃｍフラスコ中で増殖させた。ＥＬＩＳＡの ために、細胞をコーティングされた９６ウェルプレート（ポリ−Ｄ−リシン）中にプレー ティングした。 【１０６０】 細胞処理および細胞溶解プロトコル 【１０６１】 細胞を無血清培地で２回洗浄し、１ｍＭのＩＢＭＸと共に３０分間インキュベートした 20 。所望のアクチベーター（すなわち、グアニリン、０．００１∼４０μＭ）を次いで細胞 に添加し、３０∼４０分間インキュベートした。上清を除去し、そして細胞をＴＢＳ緩衝 液で洗浄した。細胞を０．１ＮのＨＣｌで溶解させた。これに続いて、０．１ＮのＨＣｌ で溶解させ、−２０℃／室温での凍結／解凍サイクルを行った。解凍した溶解物（試料を エッペンドルフ管中、１０，０００ｒｐｍでスピンさせた）を遠心分離して、細胞残屑を ペレット化した。清澄化された上清溶解物をＥＬＩＳＡプレートに移した。 【１０６２】 ＥＬＩＳＡプロトコル 【１０６３】 以下の工程は全て、特に別段の記載がない限り、室温で実施した。ＥＬＩＳＡプレート 30 をコーティング緩衝液（炭酸／重炭酸ナトリウム緩衝液、最終０．１Ｍ、ｐＨ９．６）中 、抗ＩｇＧ抗体で一晩４℃にてコーティングした。プレートを次いで洗浄緩衝液（ＴＢＳ −Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５％）で洗浄し、続いて遮断試薬を添加した。遮断試薬とと もに３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄した。ウサギ抗 ｃＧＭＰポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を次いで添加し、続いて１時間インキ ュベートし、その後洗浄緩衝液で洗浄した。細胞溶解物を次いで添加し、１時間インキュ ベートした後、続いてｃＧＭＰ−ビオチン複合体（１および１０ｎＭの８−ビオチン−Ａ ＥＴ−ｃＧＭＰ（Ｂｉｏｌｏｇ））を添加した。プレートを２時間インキュベートし、次 いで洗浄緩衝液で洗浄した。ストレプトアビジン−アルカリ性リン酸塩を次いで添加し、 １時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で洗浄した。プレートを少なくとも１時間（ 40 好ましくは２∼５時間）、ＰＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。吸 光度は、ＳＡＦＩＲＥ２（登録商標）プレートリーダーで読み取った。 【１０６４】 最大吸光度は細胞溶解物をＥＬＩＳＡで使用しない場合（対照）に見られた。吸光度の 減少（ｃＧＭＰレベルの増加に対応）が、１００ｎＭのグアニリン（クローン）で処理し た産生されたＧＣ−Ｃ発現細胞系からの細胞溶解物で観察された。 【１０６５】 １００ｎＭのグアニリンで処理した産生されたＧＣ−Ｃ発現細胞系におけるｃＧＭＰレ ベルを、Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｔ． ９００−０１４；ＡｓｓａｙＤｅｓｉｇｎｓ， Ｉｎｃ．）を用い 50 (282) JP 2012-516687 A 2012.7.26 てＧＣ−Ｃを発現しない親細胞系対照試料（不掲載）とも比較した。ＧＣ−Ｃ発現細胞系 は、グアニリンで処理した親細胞および未処理の親細胞よりも、吸光度において大きな減 少（ｃＧＭＰレベルの増加に対応）を示した。 【１０６６】 グアニリン用量反応実験のために、９６ウェルプレート中、２０，０００、４０，００ ０、６０，０００、８０，０００、１２０，０００および１６０，０００細胞／ウェルの 密度でプレーティングした、産生されたＧＣ−Ｃ発現細胞系の細胞を、グアニリンの濃度 を増加させつつ３０分間攻撃した。ｃＧＭＰレベル（Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭ Ｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｔ． ９００−０１４；Ａｓ ｓａｙＤｅｓｉｇｎｓ， Ｉｎｃ．）を用いて測定）の変化の関数としての細胞反応（す 10 なわち、吸光度）を、ＳＡＦＩＲＥ２（商標）プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて 検出した。データを次いでグアニリン濃度の関数としてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを使用した非線形回帰分析を用いて分析し、その結果、 １．１ｎＭのＥＣ５０値を得た。産生されたＧＣ−Ｃ発現細胞系は、低濃度のグアニリン で処理した場合、他の細胞系で以前に報告されているもの（３．５ｐｍｏｌ／ｍｌ）（Ｆ ｏｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒ． １４０（４）：１８００−１８０６（１９ ９９））と比較して、高レベルのｃＧＭＰ（６ｐｍｏｌ／ｍｌ）を示し、このことは、ク ローンの有効性を示す。 実施例９ ＧＣ−Ｃ発現細胞系Ｚ’値の生成 【１０６７】 20 産生されたＧＣ−Ｃ発現細胞系のＺ’値を、直接競合的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて計 算した。Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｙｃｌｉｃ ＧＭＰ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｔ． ９００−０１４；ＡｓｓａｙＤｅｓｉｇｎｓ， Ｉｎｃ．）を用い てＥＬＩＳＡを実施した。具体的には、Ｚ’アッセイに関して、９６ウェルアッセイプレ ート（１６０，０００または２００，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする） 中２４の正の対照ウェルを、ＤＭＥＭ培地中４０μＭのグアニリンおよびＩＢＭＸのＧＣ −Ｃ活性化カクテルで３０分間攻撃した。９６ウェルアッセイプレートの容積および表面 積を考慮して、この量のグアニリンにより、Ｆｏｒｔｅら（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒ． １４０（４）， １８００−１８０６が使用した１０μＭに匹敵する濃度が得られた。Ｄ ＭＥＭ／ＩＭＢＸ中クローン細胞を含む等しい数のウェルを、ビヒクル単独（アクチベー 30 ターの非存在下）で攻撃した。２種の条件での吸光度（ｃＧＭＰレベルに対応）を、ＳＡ ＦＩＲＥ２（商標）プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いてモニタリングした。２種の 条件での平均および標準偏差を計算し、Ｚｈａｎｇら（Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ ， ４（２）：６７−７３（１９９９））の方法を用いてＺ’を計算した。産生されたＧ Ｃ−Ｃ発現細胞系のＺ’値は０．７２と測定された 実施例１０ 短絡回路電流測定 【１０６８】 培養インサート（Ｓｎａｐｗｅｌｌ， Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ）上にＧＣ−Ｃ発現細胞（一次もしくは不死化上皮細胞、例えば、肺、腸、乳房、子宮、 または腎臓）をプレーティングした７∼１４日後にユージングチャンバー実験を実施した 40 。培養インサート上の細胞をリンスし、ユージング型装置（ＥａｓｙＭｏｕｎｔ Ｃｈａ ｍｂｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にかけ 、３７℃に維持し１２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、３．３ｍＭのＫＨ２ ＰＯ４、０．８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２ 、および１０ｍＭのグルコースを含む、連続して気体を供給したリンガー液（５％ＣＯ２ ／Ｏ２、ｐＨ７．４）に浸した。ヘミチャンバーをマルチチャンネル電圧および電流クラ ンプ（ＶＣＣ−ＭＣ８、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続する 。電極［寒天橋付（１ＭのＫＣｌ中４％）Ａｇ−ＡｇＣｌ］を使用し、インサートを０ｍ Ｖに電圧固定する。経上皮電流、電圧および抵抗を実験の期間中１０秒ごとに測定する。 ＜２００ｍＯｈｍの抵抗を有する膜を廃棄する。この二次アッセイにより、適切な細胞型 50 (283) JP 2012-516687 A 2012.7.26 （すなわち、密着結合を形成する細胞）において、導入されたＧＣ−ＣがＣＦＴＲ活性を 改変し、経上皮電流を調節することの確証を得ることができる。 実施例１１ 安定なＣＦＴＲ発現細胞系の生成 発現構築物の生成 【１０６９】 合理化クローニングを可能にするプラスミド発現ベクターを、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づいて生成させ、これは、ＣＭＶおよびＳＶ４０真核性プ ロモータ；ＳＶ４０およびＨＳＶ−ＴＫポリアデニル化配列；多重クローニング部位；コ ザック配列；ならびに薬剤耐性カセット（すなわち、ピューロマイシン）をはじめとする 対象の遺伝子の転写および翻訳のための種々の必須成分を含んでいた。アンピシリンまた 10 はネオマイシン耐性カセットもピューロマイシンと置換して使用することができる。標的 配列２（配列番号１３８）を含むタグ配列を次いでプラスミドの多重クローニング部位中 に挿入した。ヒトＣＦＴＲをコードするｃＤＮＡカセットを次いで、Ａｓｃ１およびＰａ ｄ制限エンドヌクレアーゼを用いて、タグ配列の上流の多重クローニング部位中にサブク ローニングした。 細胞系の生成 工程１：トランスフェクション 【１０７０】 ＣＨＯ細胞を、標準的技術を用いてヒトＣＦＴＲ（配列番号１６）をコードするプラス ミドでトランスフェクトした。（核酸を宿主細胞中に導入するために使用することができ 20 る試薬の例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ Ｅ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴＦＸ（商標）試薬、Ｆ ＵＧＥＮＥ（登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、ＭｅｔａｆｅｃｔｉｎｅまたはＦＥ ＣＴＵＲＩＮ（商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。） 【１０７１】 薬剤選択は本発明の細胞または細胞系を製造するためには任意であるが、本発明者らは 、プラスミド（すなわち、ピューロマイシン）中に１つの薬剤耐性マーカーを含めた。Ｃ ＦＴＲ配列はＣＭＶプロモータの制御下にあった。シグナリングプローブによる検出のた めに標的配列をコードする非翻訳配列も、薬剤耐性マーカーをコード化する配列とともに 存在していた。使用した標的配列は標的配列２（配列番号１３８）であり、この実施例で 30 は、ＣＦＴＲ遺伝子含有ベクターは標的配列２（配列番号１３８）を含んでいた。 工程２：選択 【１０７２】 トランスフェクトされた細胞を、抗生物質を含まないＨａｍのＦ１２−ＦＢＳ培地（Ｓ ｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中で２日間増殖させ、続い て１２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＨａｍのＦ１２−ＦＢＳ培地中で１ ０日間増殖させた。細胞を次いで残りの時間、抗生物質を含まないＨａｍのＦ１２−ＦＢ Ｓ培地に移した後、シグナリングプローブを添加した。 工程３：細胞継代 【１０７３】 40 抗生物質に関して濃縮した後、細胞を抗生物質選択の非存在下で５∼１４回継代して、 選択された期間にわたって安定でない発現が弱まるために時間をおいた。 工程４：蛍光発生プローブへの細胞の暴露 【１０７４】 細胞を収穫し、標準的技術を用いてシグナリングプローブ２（配列番号１３９）でトラ ンスフェクトした。（核酸を宿主細胞中に導入するために使用することができる試薬の例 としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標） ２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴＦＸ（商標）試薬、ＦＵＧＥＮＥ （登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、ＭｅｔａｆｅｃｔｉｎｅまたはＦＥＣＴＵＲＩ Ｎ（商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。）ＣＦＴＲシグナリング 50 (284) JP 2012-516687 A 2012.7.26 プローブ２（配列番号１３９）は標的配列２（配列番号１３８）を結合した。細胞を次い で分析のために集め、蛍光活性化細胞分類を用いて分類した。 シグナリングプローブにより検出される標的配列 ＣＦＴＲ標的配列１ ５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１７） ＣＦＴＲ標的配列２ ５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣ−３’（配列番号１３８） シグナリングプローブ ＣＦＴＲシグナリングプローブ１（１００μＭストックとして供給） ５’−Ｃｙ５ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧ 10 Ｃ ＢＨＱ２−３’（配列番号１８） ＣＦＴＲシグナリングプローブ２（１００μＭストックとして供給） ５’−ＣＹ５．５ ＧＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴ ＣＧＣ ＢＨＱ２−３’（配列番号１３９） 【１０７５】 シグナリングプローブ２中のＢＨＱ２をＢＨＱ３または金粒子で置換することができる 。標的配列２およびシグナリングプローブ２を、それぞれ標的配列１（配列番号１７）お よびシグナリングプローブ１（配列番号１８）により置換することができる。シグナリン グプローブ１中のＢＨＱ２をＢＨＱ３または金粒子で置換することができる。 【１０７６】 20 加えて、Ｃｙ５と類似したスペクトル特性を有するＱｕａｓａｒ（登録商標）色素（Ｂ ｉｏＳｅａｒｃｈ）を用いた類似のプローブを、標的配列１（配列番号１７）に対するあ る実験で使用する。いくつかの実験では、ＤＮＡプローブではなく、５−ＭｅｄＣおよび ２−アミノｄＡミキシマーを使用した。非標的化ＦＡＭ標識プローブをローディング対照 としても使用する。 工程５：陽性細胞の単離 【１０７７】 蛍光活性化細胞分類（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）を用 いた分析および分類のために細胞を解離させ、そして集めた。標準的解析法を使用して、 前記バックグラウンドよりも高い蛍光を発する細胞をゲートで制御し、バックグラウンド 30 より高い蛍光を発する細胞をゲートで規制し、ゲート内に入るバーコード化された９６ウ ェルプレート中にある個々の細胞を単離した。次のゲート制御階層を使用した：コインシ デンスゲート→シングレットゲート→ライブゲート→ソートゲート（当該技術分野で標準 的な手順にしたがいプロットＦＡＭ対Ｃｙ５．５：０．１∼０．４％の細胞において）。 工程６：工程ｐ１∼５および／または３∼５のさらなるサイクル 【１０７８】 工程１∼５および／または３∼５を繰り返して、多数の細胞を得た。工程１∼５を２ラ ウンド実施し、これらのラウンドのそれぞれについて、工程３∼５の２回の中間サイクル を実施した。 工程７：細胞の集団の増殖速度の推定 40 【１０７９】 プレートをＭｉｃｒｏｌａｂ Ｓｔａｒ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ）に移し た。細胞を、１００μｌの新鮮な完全増殖培地と２∼３日馴化増殖培地との１：１ミック ス（１００単位／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加 ）中でインキュベートした。次いで、細胞を１回または２回トリプシン処理することによ って分散させて凝集塊を最小限に抑え、その後、新しい９６ウェルプレートに移した。プ レートを撮像して、ウェル（Ｇｅｎｅｔｉｘ）の集密度を測定した。各プレートをプレー ト全体にわたる信頼性のある画像取得のために集中させた。報告された７０％を超える集 密度は信頼性がなかった。集密度測定値を、分散後１日∼１０日間連続で得、これを用い て増殖速度を計算した。 50 (285) JP 2012-516687 A 2012.7.26 工程８：増殖速度推定値にしたがった細胞集団のビン化 【１０８０】 細胞は、工程７における分散工程後２週間未満で、増殖速度にしたがってビン化した（ 独立して分類し、コホートとしてプレーティングした）。３つの増殖ビンのそれぞれを各 ９６ウェルプレートに分け；一部の増殖ビンは２以上の９６ウェルプレートとなった。増 殖速度の広がりを考慮し、高率の細胞集団の合計数をまとめることによって、ビンを計算 した。ビンを計算して、増殖速度において１２∼１６時間の差異を得た。 【１０８１】 細胞は、１日未満から２週間を超える倍加時間を有し得る。同時に増殖速度に従って合 理的にビン化され得る最も多様なクローンを処理するために、１ビンあたり０．２５∼０ 10 ．７日の倍加時間の３∼９ビンを使用することが可能である。当業者は、ビンのタイトさ および数を特定の状況について調節することができ、細胞がそれらの細胞サイクルについ て同期するならば、ビンのタイトさおよび数をさらに調節できることを理解するであろう 。 工程９：パラレルプロセッシングを加速し、ストリンジェントな品質管理を提供するため のレプリカプレーティング法 【１０８２】 プレートを、抗生物質を含まない標準および固定条件（すなわち、ＨａｍのＦ１２−Ｆ ＢＳ培地、３７℃／５％ＣＯ２）下でインキュベートした。細胞のプレートを分けて、４ セットの９６ウェルプレート（３セットは凍結用、１セットはアッセイおよび継代用）を 20 得た。異なる独立組織培養試薬、インキュベータ、人員、および二酸化炭素源をプレート のセットのそれぞれについて使用した。品質管理工程は、全ての組織培養試薬の適切な産 生量および品質を保証するために行った：使用するために調製した培地の各ボトルに添加 する各成分を、１人の指定された人が、その試薬のみを含む１つの指定されたフード中で 添加し、その間、もう１人の指定された人が間違いを避けるために監視した。液体取り扱 いの条件は、ウェル全体にわたる相互汚染をなくすように設定した。全工程で新しいチッ プを使用するか、または厳密なチップ洗浄プロトコルを使用した。液体取り扱い条件を、 正確な体積移動、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティング速度および位置、細 胞分散のためのピペッティングサイクルの数、およびプレートに対するチップの相対的な 位置について設定した。 30 工程１０：細胞集団の初期継代ストックの凍結 【１０８３】 ３セットのプレートを−７０∼−８０℃で凍結した。セット中のプレートをまず７０∼ １００％の集密度に到達させた。培地を吸引し、９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを添 加した。プレートを個々にパラフィルムで密封し、個々に１∼５ｃｍの発泡体で包囲し、 次いで−８０℃の冷凍庫中に入れた。 工程１１：生存可能で安定な機能的（ＶＳＦ）細胞系を産生するための初期変形工程の方 法および条件 【１０８４】 プレートの残りのセットを工程９に記載されているようにして維持した。全ての細胞分 40 裂は、培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングな らびに細胞分散工程をはじめとする自動化液体取り扱い工程を用いて実施した。 工程１２：増殖速度の残存するバラツキを補正するための正規化法 【１０８５】 細胞の一貫性および標準化ならびに全ての細胞の集団についての培養条件を制御した。 増殖速度の若干の差異に起因するプレート全体にわたる差異を、プレート全体にわたる細 胞数の正規化により制御し、再配列後の８継代ごとに行った。外れ値である細胞の集団を 検出し、除去した。 工程１３：細胞集団の特性化 【１０８６】 50 (286) JP 2012-516687 A 2012.7.26 細胞を培養中、再配列後６∼１０週間維持した。この期間中、本発明者らはサイズ、形 態、マイクロ集密度への傾向、脆性、トリプシン処理に対する反応およびトリプシン処理 後の平均真円度、または培養プレート表面への接着性などの細胞維持の他の態様ならびに 通例の内部品質管理の一部としての液体添加に際して吹き飛ばし耐性を観察して、健常細 胞を特定した。そのような基準化細胞を次いで機能評価に付した。 工程１４：ＶＳＦ条件下での細胞集団の潜在的機能性の評価 【１０８７】 機能基準を用いて細胞の集団を試験した。膜電位色素キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄ ｅｖｉｃｅｓ， ＭＤＳ）を製造業者の指示にしたがって使用した。 【１０８８】 10 細胞を３８４ウェルプレート中種々の密度（すなわち、１２．５×１０３∼２０×１０ ３ 細胞／ウェル）で試験し、反応を分析した。細胞プレーティングと分析読み取りとの間 の時間を試験した。色素濃度も試験した。用量反応曲線およびＺスコアをどちらも潜在的 機能性の評価の一部として計算した。 【１０８９】 次の工程（すなわち、工程１５∼１８）も、最終およびバックアップの製造可能で安定 な機能的細胞系を選択するために実施することができる。 工程１５： 【１０９０】 低および高継代数で実施した実験から得られた機能的反応を比較して、所定の期間（例 20 えば、３∼９週間）にわたって最も一貫した反応を有する細胞を特定する。経時的に変化 する細胞の他の特性も記録する。 工程１６： 【１０９１】 機能的基準および他の基準を満たす細胞の集団をさらに評価して、生存可能で、安定な 機能的細胞系の産生に最も適しているものを決定する。選択された細胞の集団をさらに大 きな組織培養容器中で増殖させ、これらの条件下で前述の特性化工程を継続するか、また は繰り返す。この時点で、さらなる標準化工程、例えば異なる細胞密度；プレーティング 時間、細胞培養継代の長さ；細胞培養皿形式およびコーティング；流体工学最適化、例え ば速度および剪断力；継代時間；ならびに洗浄工程を、一貫した信頼性のある継代のため 30 に導入する。 【１０９２】 加えて、各継代での細胞の生存率を測定する。手動介入を増やし、細胞をさらに綿密に 観察し、モニタリングする。この情報を用いて、所望の特性を保有する最終的細胞系を同 定し、選択するのに役立てる。この方法に従ってこれらの条件下で産生された場合、適切 な接着性／粘性、増殖速度、および均一なプレーティング（マイクロ集密度がない）を示 す最終的細胞系およびバックアップ細胞系を選択する。 工程１７：細胞バンクの確立 【１０９３】 最終細胞系およびバックアップ細胞系に対応する低継代凍結ストックを３７℃で解凍し 40 、ＨａｍのＦ１２−ＦＢＳで２回洗浄し、次いでＨａｍのＦ１２−ＦＢＳ中でインキュベ ートする。細胞を次いで２∼４週間の期間で増殖させる。各最終およびバックアップ細胞 系のクローンの細胞バンクを確立し、各クローン細胞について２５バイアルを冷凍保存す る。 工程１８： 【１０９４】 細胞バンクからの少なくとも１つのバイアルを解凍し、培養で増殖させた。結果として 得られる細胞を試験して、これらがもともと選択されたもととなる同じ特性を満たすかど うかを確認する。 実施例１２ 天然のＣＦＴＲ機能に関する安定な細胞系の特性化 50 (287) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【１０９５】 本発明者らはハイスループット適合性蛍光膜電位アッセイを用いて、産生された安定な ＣＦＴＲ発現細胞系における天然のＣＦＴＲ機能を特性化した。 【１０９６】 ＣＦＴＲを安定して発現するＣＨＯ細胞系を、１０％ウシ胎仔血清およびグルタミンを 追加したＨａｍのＦ１２培地中で維持した。アッセイ前日に、細胞をストックプレートか ら収穫し、黒色透明底の３８４ウェルアッセイプレート中にプレーティングした。アッセ イプレートを３７℃の細胞培養インキュベータ中、５％のＣＯ２下で２２∼２４時間維持 した。培地を次いでアッセイプレートから除去し、ローディング緩衝液（１３７ｍＭのＮ ａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ 10 のグルコース）中で希釈した青色膜電位色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉ ｎｃ．）を添加して、１時間３７℃でインキュベートした。アッセイプレートを次いで蛍 光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）にかけ、化合物緩衝液（１３７ｍ Ｍのグルコン酸ナトリウム、５ｍＭのグルコン酸カリウム、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、 ２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース）中に溶解させたホルスコリンおよびＩＢ ＭＸのカクテルを添加した。 【１０９７】 蛍光膜電位アッセイから得られる代表的データは、安定なＣＦＴＲ発現ＣＨＯ細胞系（ 細胞系１、Ｍ１１、Ｊ５、Ｅ１５、および０１５）における機能的ＣＦＴＲに起因するイ オン束がすべて、アッセイ反応により示されるようにＣＦＴＲのない対照細胞よりも高い 20 ことを示す。 【１０９８】 安定なＣＦＴＲ発現ＣＨＯ細胞系（細胞系１、Ｍ１１、Ｊ５、Ｅ１５、および０１５） における機能的ＣＦＴＲに起因するイオン束はまた、全て一時的ＣＦＴＲトランスフェク トＣＨＯ細胞よりも高い。一時的ＣＦＴＲトランスフェクト細胞は、ＣＨＯ細胞を１０ｃ ｍの組織培養皿あたり５００万∼１６００万でプレーティングし、そしてこれらをトラン スフェクション前に１８∼２０時間インキュベートすることにより生成させた。脂質トラ ンスフェクション試薬と、プラスミドコード化ＣＦＴＲとからなるトランスフェクション 複合体を直接各皿に添加した。細胞を次いで３７℃でＣＯ２インキュベータ中、６∼１２ 時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を持ちあげ、黒色透明底の３８４ 30 ウェルアッセイプレート中にプレーティングし、前記蛍光膜電位アッセイを用いて機能に ついて分析した。 【１０９９】 ホルスコリン用量反応実験について、３８４ウェルプレート中、１５，０００細胞／ウ ェルの密度でプレーティングされた、産生された安定なＣＦＴＲ発現細胞系の細胞を、既 知のＣＦＴＲアゴニストであるホルスコリンの濃度を増大させて攻撃した。細胞蛍光にお ける変化の関数としての細胞反応を経時的に蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）によってモニタリングした。データを次いでホルスコリン濃度の関数として プロットし、ＧｒａｐＨＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを使用した非線形回帰 分析を用いて分析し、その結果、２５６ｎＭのＥＣ５０を得た。産生されたＣＦＴＲ発現 40 細胞系は、ホルスコリンが以前に他の細胞系において報告されている場合のＥＣ５０（２ ５０∼５００ｎＭ）（Ｇａｌｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２８１（５）：Ｃ１７３４−１７４２（２００１））の範 囲内のホルスコリンのＥＣ５０値を示し、このことは、クローンの有効性を示す。 実施例１３ ＣＦＴＲ細胞ベースのアッセイに関するＺ’値の測定 【１１００】 産生された安定なＣＦＴＲ発現細胞系のＺ値を、ハイスループット適合性蛍光膜電位ア ッセイを用いて計算した。蛍光膜電位アッセイプロトコルを実施例１２のプロトコルに実 質的にしたがって実施した。Ｚアッセイについて具体的には、３８４ウェルアッセイプレ ート（１５，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングする）中２４の正の対照ウェル 50 (288) JP 2012-516687 A 2012.7.26 を、ホルスコリンおよびＩＢＭＸのＣＦＴＲ活性化カクテルで攻撃した。等しい数のウェ ルを、ビヒクル単独およびＤＭＳＯを含むもの（アクチベーターの非存在下）で攻撃した 。２種の条件での細胞反応を、蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ） を用いてモニタリングした。２種の条件での平均および標準偏差を計算し、Ｚｈａｎｇら 、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ， ４（２）：６７−７３，（１９９９）で開示され た方法を用いてＺを計算した。産生された安定なＣＦＴＲ発現細胞系のＺ値は０．８２以 上であると決定された。 実施例１４ ハイスループットスクリーニングおよびＣＦＴＲモジュレータの同定 【１１０１】 ハイスループット適合性蛍光膜電位アッセイを使用して、ＣＦＴＲモジュレータをスク 10 リーニングし、同定する。アッセイ前日に、細胞をストックプレートから抗生物質を含ま ない増殖培地中へ集め、黒色透明底の３８４ウェルアッセイプレート中にプレーティング した。アッセイプレートを３７℃の細胞培養インキュベータ中、５％のＣＯ２下で１９∼ ２４時間維持する。培地を次いでアッセイプレートから除去し、ロード緩衝液（１３７ｍ ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ ０ｍＭのグルコース）中で希釈した青色膜電位色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ｓ Ｉｎｃ．）を添加し、細胞を１時間３７℃でインキュベートする。試験化合物をジメ チルスルホキシド中に溶解させ、アッセイ緩衝液（１３７ｍＭのグルコン酸ナトリウム、 ５ｍＭのグルコン酸カリウム、１．２５ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ ｍＭのグルコース）中で希釈し、次いで３８４ウェルのポリプロピレンマイクロタイター 20 プレート中にロードする。細胞および化合物プレートを蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａ ｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）中にロードし、３分間実行して、試験化合物活性を同定する。装 置は次いでホルスコリン溶液を３００ｎＭ∼１μＭの濃度で細胞に添加して、事前に添加 された化合物のモジュレータまたはブロッカー活性のいずれかを観察できるようにする。 化合物の活性をは、試験化合物を細胞に添加した後および／またはその後のアゴニスト添 加後に生じる蛍光における変化を測定することによって決定する。 実施例１５ 短絡回路電流測定値を用いた天然のＣＦＴＦ機能についての安定なＣＦＴＲ 発現細胞系の特性化 【１１０２】 培養インサート（Ｓｎａｐｗｅｌｌ， Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 30 ）上にＣＦＴＲ発現細胞（これらに限定されないが、肺および腸を包含する一次または不 死化上皮細胞）をプレーティング後７∼１４日にユージングチャンバー実験を実施する。 培養インサート上の細胞をリンスし、ユージング型装置（ＥａｓｙＭｏｕｎｔ Ｃｈａｍ ｂｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にかけ、 ３７℃に維持され、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、３．３ｍＭのＫＨ ２ＰＯ４、０．８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ ２、および１０ｍＭのグルコースを含む連続的に通気したリンガー液（５％のＯ２中ＣＯ ２、ｐＨ７．４）に浸す。ヘミチャンバーをマルチチャンネル電圧および電流クランプ（ ＶＣＣ−ＭＣ８ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続する。電極 ［寒天橋付（１ＭのＫＣｌ中４％）Ａｇ−ＡｇＣｌ］を使用し、インサートは０ｍＶに電 40 圧固定する。経上皮電流、電圧および抵抗を、実験の期間中、１０秒ごとに測定する。＜ ２００ｍΩの抵抗を有する膜を廃棄する。 実施例１６ 電気生理学的アッセイを用いた天然のＣＦＴＦ機能に関する安定なＣＦＴＲ 発現細胞系の特性化 【１１０３】 手動および自動化電気生理学的機能アッセイはどちらも開発されており、どちらもこの システムを分析するために適用することができるが、以下では、手動パッチクランプ実験 のプロトコルを記載する。 【１１０４】 細胞を低密度で播種し、プレーティング後２∼４日に使用する。ホウケイ酸塩ガラスピ 50 (289) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ペットを先端熱加工して、２∼４メガΩの先端抵抗を得る。電流をサンプリングし、ロー パスフィルターに付す。細胞外（浴）溶液は以下のものを含む：１５０ｍＭのＮａＣｌ、 １ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのマンニト ール、および１０ｍＭのＴＥＳ、ｐＨ７．４。ピペット溶液は次のものを含む：１２０ｍ ＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＴＥＡ−Ｃｌ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、 １ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）。−８０ｍＶから− １００ｍＶの間で膜電位を交互に切替ることによって、膜コンダクタンスをモニタリング する。２０ｍＶ刻みで−１００ｍＶ∼＋１００ｍＶの電圧パルスを加えることによって、 電流−電圧関係が得られる。 実施例１７ 安定なＮａＶ１．７ヘテロ三量体を発現する細胞系の生成 10 発現構築物の生成 【１１０５】 合理化クローニングを可能にするプラスミド発現ベクターをｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づいて生成させ、これらは、ＣＭＶおよびＳＶ４０真核性プ ロモータ；ＳＶ４０およびＨＳＶ−ＴＫポリアデニル化配列；多重クローニング部位；コ ザック配列；およびネオマイシン／カナマイシン耐性カセット（またはアンピシリン、ハ イグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン耐性カセット）をはじめとする、対象の遺 伝子の転写および翻訳に必要な種々の成分を含んでいた。 細胞系の生成 工程１：トランスフェクション 20 【１１０６】 ２９３Ｔ細胞を、標準的技術を用いて３つの独立したプラスミド（１つはヒトＮａＶ１ ．７αサブユニット（配列番号１９）をコードし、１つはヒトＮａＶ１．７β１サブユニ ット（配列番号２０）をコードし、１つはヒトＮａＶ１．７β２サブユニット（配列番号 ２１）をコードする）とともにコトランスフェクトした。（核酸を宿主細胞中に導入する ために使用することができる試薬の例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、 ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標） 、ＴＦＸ（商標）試薬、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａ ｆｅｃｔｉｎｅまたはＦＥＣＴＵＲＩＮ（商標）が挙げられるが、これらに限定されるも のではない。） 30 【１１０７】 薬剤選択は、本発明の細胞または細胞系を産生するためには任意であるが、本発明者ら は、プラスミド１個につき１個の薬剤耐性マーカーを含めた。配列は、ＣＭＶプロモータ の制御下であった。シグナリングプローブによる検出のためのＮａＶ標的配列をコードす る非翻訳配列も薬剤耐性マーカーをコード化する配列とともに存在していた。使用したＮ ａＶ標的配列は、ＮａＶ標的配列１（配列番号２２）、ＮａＶ標的配列２（配列番号２３ ）およびＮａＶ標的配列３（配列番号２４）であった。この実施例において、ＮａＶ１． ７αサブユニット遺伝子含有ベクターはＮａＶ標的配列１（配列番号２２）を含み；Ｎａ Ｖ１．７β１サブユニット遺伝子含有ベクターはＮａＶ標的配列２（配列番号２３）を含 み；そしてＮａＶ１．７β２サブユニット遺伝子含有ベクターはＮａＶ標的配列３（配列 40 番号２４）を含んでいた。 工程２：選択 【１１０８】 トランスフェクトされた細胞をＤＭＥＭ−ＦＢＳ培地中で２日間増殖させ、続いて抗生 物質含有ＤＭＥＭ−ＦＢＳ培地中で１０日間増殖させた。抗生物質含有期間中、抗生物質 を次のように添加した：ピューロマイシン（０．１μｇ／ｍｌ）、ハイグロマイシン（１ ００μｇ／ｍｌ）、およびゼオシン（２００μｇ／ｍｌ）。 工程３：細胞継代 【１１０９】 抗生物質に関して濃縮した後、細胞を、抗生物質選択の非存在下で６∼１８回継代し、 50 (290) JP 2012-516687 A 2012.7.26 選択された期間にわたって安定でない発現が沈静化するために時間をとった。 工程４：蛍光発生プローブへの細胞の暴露 【１１１０】 細胞を収穫し、標準的技術を用いてシグナリングプローブ（配列番号２５、２６、２７ ）でトランスフェクトした。（核酸を宿主細胞中に導入するために使用することができる 試薬の例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ （商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴＦＸ（商標）試薬、ＦＵ ＧＥＮＥ（登録商標）６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、ＭｅｔａｆｅｃｔｉｎｅまたはＦＥＣ ＴＵＲＩＮ（商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。） 【１１１１】 10 ＮａＶシグナリングプローブ１（配列番号２５）はＮａＶ標的配列１（配列番号２２） を結合し；ＮａＶシグナリングプローブ２（配列番号２６）はＮａＶ標的配列２（配列番 号２３）を結合し；そしてＮａＶシグナリングプローブ３（配列番号２７）はＮａＶ標的 配列３（配列番号２４）を結合した。細胞を次いで解離させ、分析のために集め、蛍光活 性化細胞分類（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）を用いて分類 した。 シグナリングプローブによって検出される標的配列 【１１１２】 以下の標的配列をＮａＶ１．７サブユニットトランス遺伝子に使用した。 ＮａＶ標的配列１ 20 ５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号２２）（ ＮａＶ１．７αサブユニット） ＮａＶ標的配列２ ５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣ−３’（配列番号２３）（ ＮａＶ１．７β１サブユニット） ＮａＶ標的配列３ ５’−ＧＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号２４）（ ＮａＶ１．７β２サブユニット） シグナリングプローブ １００μＭストックとして供給。 30 ＮａＶシグナリングプローブ１−このプローブは標的配列１と結合する。 ５’−Ｃｙ５ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号２５） ＮａＶシグナリングプローブ２−このプローブは標的配列２と結合する。 ５’−Ｃｙ５．５ ＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＣ ＧＣ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号２６） ＮａＶシグナリングプローブ３−このプローブは標的配列３と結合する。 ５’−Ｆａｍ ＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＣ ＢＨＱ１ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号２７） 【１１１３】 40 ＮａＶシグナリングプローブ１および２中のＢＨＱ３は、ＢＨＱ２または金粒子により 置換することができる。ＮａＶシグナリングプローブ３中のＢＨＱ１は、ＢＨＱ２、金粒 子、またはＤＡＢＣＹＬにより置換することができる。 【１１１４】 加えて、Ｃｙ５と類似したスペクトル特性を有するＱｕａｓａｒ（登録商標）色素（Ｂ ｉｏＳｅａｒｃｈ）を用いて類似プローブをある実験では使用した。いくつかの実験では 、ＤＮＡプローブではなく、５−ＭｅｄＣおよび２−アミノｄＡミキシマープローブを使 用した。 工程５：陽性細胞の単離 【１１１５】 50 (291) JP 2012-516687 A 2012.7.26 標準的解析法を使用して、バックグラウンドよりも高い蛍光を発する細胞をゲートで制 御し、所定のゲート内に入る細胞を直接９６ウェルプレート中に単離した。フローサイト メトリー細胞分類は、１つの細胞が各ウェルごとに入るように操作した。選択後、薬物を 含まない培地中で細胞を増殖させた。 【１１１６】 以下のゲート制御階層を使用した：コインシデンスゲート→シングレットゲート→ライ ブゲート→ソートゲート（ＦＡＭ対Ｃｙ５プロットにおいて：０．１−１．０％の生細胞 ）。 工程６：工程１∼５および／または３∼５のさらなるサイクル 【１１１７】 10 工程１∼５および／または３∼５を繰り返して、さらに多数の細胞を得た。工程１∼５ を独立して少なくとも４ラウンド完了し、これらのサイクルのそれぞれについて、それぞ れの独立したラウンドについて工程３∼５の少なくとも２回内部サイクルを実施した。 工程７：細胞集団の増殖速度の評価 【１１１８】 プレートをＭｉｃｒｏｌａｂｓｔａｒ自動化液体ハンドラー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏ ｂｏｔｉｃｓ）に移した。細胞を５∼７日間、新鮮な完全増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％の ＦＢＳ）および２∼３日馴化増殖培地の１：１ミックス（１００単位／ｍｌのペニシリン および０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加）中でインキュベートした。次いで 、細胞をトリプシン処理によって分散させて、凝塊を最小限に抑え、新しい９６ウェルプ 20 レートに移した。クローンを分散させた後、プレートを撮像して、ウェル（Ｇｅｎｅｔｉ ｘ）の集密度を測定した。プレート全体にわたる信頼性のある画像取得のために、各プレ ートに焦点を合わせた。７０％を超える報告された集密度は信頼性がなかった。９日間（ すなわち、分散後１∼１０日間）にわたって３日ごとに集密度測定値を得、これを使用し て増殖速度を計算した。 工程８：増殖速度推定値にしたがった細胞集団のビン化 【１１１９】 工程７における分散工程後１０∼１１日に増殖速度にしたがって、細胞をビン化した（ 独立して分類し、コホートとしてプレーティングした）。ビンを独立して集め、下流の操 作のために各９６ウェルプレート上にプレーティングし；一部の増殖ビンは２以上の９６ 30 ウェルプレートとなった。増殖速度の広がりを考慮し、高率の細胞集団の合計数をまとめ ることによって、ビンを計算した。工程５に記載した分類の反復によって、５∼９の増殖 ビンを１∼４日に区切って使用した。したがって、各ビンは、反復に応じて、８∼１４． ４時間の増殖速度または集団倍加時間に相当した。 【１１２０】 細胞は１日未満から２週間超の倍加時間を有し得る。同時に増殖速度にしたがって合理 的にビン化され得る最も多様なクローンを処理するために、ビンあたり０．２５∼０．７ 日の倍加時間を有する３∼９ビンを使用することが好ましい。当業者は、ビンのタイトさ および数を特定の状況について調節することができ、細胞がそれらの細胞サイクルについ て同期するならば、ビンのタイトさおよび数をさらに調節できることを理解するであろう 40 。 工程９：パラレルプロセッシングを加速し、ストリンジェントな品質管理を提供するた めのレプリカプレーティング法 【１１２１】 プレートを無抗生物質ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培地中、標準および固定条件（加湿３７ ℃、５％ＣＯ２）でインキュベートした。細胞のプレートを分割して４組の標的プレート を得た。これらの４組のプレートは、当初のセットの４つの複製があることを保証するた めに、全増殖ビンを有する全てのプレートを含んでいた。３組までの標的プレートを低温 保存（工程１０で記載）に付し、残りのセットを拡大し、継代および機能的アッセイ実験 のためにさらにレプリカプレーティングした。異なる独立組織培養試薬、インキュベータ 50 (292) JP 2012-516687 A 2012.7.26 、人員、および二酸化炭素源を、下流のレプリカプレーティングに使用した。品質管理工 程を採り入れて、全ての組織培養試薬の適切な産生量および品質を保証した。すなわち、 使用するために調製した培地の各ボトルに添加された各成分を、指定された１人の人がそ の試薬のみを含む指定されたフード中で添加し、その間、もう１人の指定された人が間違 いを避けるために監視した。ウェル全体にわたる相互汚染をなくすように、液体取り扱い の条件を設定した。全工程について新しいチップを使用したか、または厳密なチップ洗浄 プロトコルを使用した。液体取り扱い条件を、正確な体積移動、効率的な細胞操作、洗浄 サイクル、ピペッティング速度および位置、細胞分散のためのピペッティングサイクルの 数、およびプレートに対するチップの相対的な位置について設定した。 工程１０：細胞の集団の初期継代ストックの凍結 10 【１１２２】 ３セットのプレートを−７０∼−８０℃で凍結させた。各セットのプレートをまず７０ ∼８０％の集密度にした。培地を吸引し、９０％のＦＢＳおよび５％∼１０％のＤＭＳＯ を添加した。プレートをパラフィルムで密封し、個々に１∼５ｃｍの発泡体で包囲し、次 いで−８０℃の冷凍庫中に入れた。 工程１１：生存可能で安定な機能的（ＶＳＦ）細胞系を産生するための初期変形工程のた めの方法および条件 【１１２３】 残りのプレートセットを工程９に記載したように維持した。全ての細胞分裂は、培地除 去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングならびに細胞分 20 散工程をはじめとする自動化液体取り扱い工程を用いて実施した。いくつかのアッセイプ レーティング工程について、細胞をトリプシンではなく細胞解離緩衝液（例えば、ＣＤＢ ， ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＣｅｌｌｔｒｉｐｐｅｒ，ＣｅｌｌＧｒｏ）で解離させ た。 工程１２：増殖速度の残存するバラツキを補正するための正規化法 【１１２４】 細胞および全ての細胞の集団についての培養条件の一貫性および標準化を制御した。増 殖速度の若干の差異によるプレート全体にわたる差異を、２∼８継代ごとにプレート全体 にわたる細胞数の周期的正規化により制御した。外れ値の細胞の集団を検出し、除去した 。 30 工程１３：細胞集団の特性化 【１１２５】 細胞を３∼８週間維持して、これらの条件下でそれらをインビトロで進化させた。この 期間中、本発明者らは、サイズ、形態、脆性、トリプシン処理に対する反応もしくは解離 、解離後の丸さ／平均真円度、生存率（％）、マイクロ集密度への傾向、または培養プレ ート表面への接着性などの細胞維持の他の態様を観察した。 工程１４：細胞の集団ＶＳＦ条件下の潜在的機能性の評価 【１１２６】 機能基準を用いて細胞の集団を試験した。膜電位アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ／ＭＤＳ）を製造業者の指示に従って使用した。細胞を、９６ウェルプ 40 レートまたは３８４ウェルプレート中で複数の様々な密度にて試験し、反応を分析した。 種々のプレーティング後の時点、例えばプレーティング後１２∼４８時間を使用した。様 々なプレーティング密度も、アッセイ反応差異について試験した。 工程１５： 【１１２７】 低継代数および高継代数で実施した実験から得られる機能的反応を比較して、３∼９週 間の範囲の所定の期間にわたって最も一貫した反応を有する細胞を同定した。経時的に変 化した細胞の他の特性も記録した。 工程１６： 【１１２８】 50 (293) JP 2012-516687 A 2012.7.26 機能的基準および他の基準を満たす細胞の集団をさらに評価して、生存可能で安定かつ 機能的な細胞系を最も産生しやすいものを見いだした。選択された細胞の集団をさらに大 きな組織培養容器中で増殖させ、前述の特性化工程をこれらの条件下で継続し、繰り返し た。この時点で、さらなる標準化工程、例えば異なるプレーティング細胞密度；継代時間 ；培養皿サイズ／形式およびコーティング）；流体工学最適化；細胞解離最適化（例えば 、種類、使用する容積、および時間の長さ）；ならびに洗浄工程を、一貫した信頼性のあ る継代のために導入した。温度差も標準化のために使用した（すなわち、３０℃対３７℃ ）。加えて、各継代での細胞の生存率を測定した。手動介入を増やし、細胞をさらに綿密 に観察し、モニタリングした。この情報を使用して、所望の特性を保有する最終細胞系の 同定および選択に役立てた。一貫した増殖、適切な接着性、および機能的反応を示す最終 10 細胞系およびバックアップ細胞系を選択した。 工程１７：細胞バンクの確立 【１１２９】 最終細胞系およびバックアップ細胞系に対応する前述の低継代凍結プレートを３７℃で 解凍し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳで２回洗浄し、加湿３７℃／５％ＣＯ２条件でインキュ ベートした。細胞を次いで２∼３週間、増殖させた。１５∼２０のバイアルからなるそれ ぞれの最終およびバックアップ細胞系の細胞バンクを確立した。 工程１８： 【１１３０】 次の工程も、細胞系が生存可能で、安定で、機能的であることを確認するために実施す 20 ることができる。細胞バンクからの少なくとも１つのバイアルを解凍し、培養で増殖させ た。結果として得られる細胞を試験して、それらがもともと選択されたもととなる同じ特 性を満たすかどうかを確認した。 実施例１８ 安定なＮａＶ１．７発現細胞系における異種ＮａＶ１．７サブユニットの相 対的発現の特性化 【１１３１】 定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、産生された安定なＮａＶ１．７発現 細胞系における異種ヒトＮａＶ１．７α、β１、およびβ２サブユニットの相対的発現を 測定した。全ＲＮＡを、１∼３×１０６哺乳動物細胞から、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａ ｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＤＮａｓｅ処理は、厳密 30 なＤＮａｓｅ処理プロトコル（ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ， Ａｍｂｉｏｎ ）にしたがって実施した。逆転写酵素キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ， Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２０μＬの反応体積中、ＤＮＡを含まない全ＲＮＡおよび２５０ｎ ｇのＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに使用して、第１鎖 ｃＤＮＡ合成を実施した。逆転写酵素含まない試料およびＲＮＡを含まない試料をこの反 応の負の対照として使用した。合成は、サーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中、次の条件で実施した：２５℃で５分、５０℃で６０分；反 応停止は、７０℃で１５分間実施した。 【１１３２】 遺伝子発現の分析のために、ｑＲＴ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブ（ＭＧＢ Ｔ 40 ａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅｓ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を標的配列（配 列番号２２、２３、２４）に特異的にアニールするように設計した。試料正規化のために 、対照（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ））Ｐｒｅ−Ｄｅ ｖｅｌｏｐｅｄ Ａｓｓａｙ試薬（ＴａｑＭａＮ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ）を使用した。負の対照および正の対照（プラスミドＤＮＡ）を含む反応は、５０μ Ｌの反応体積中４０ｎｇのｃＤＮＡを用いて三連で設定した。発現させる３つのＮａＶ１ ．７サブユニットのそれぞれの相対量を測定した。３つのサブユニットは全て産生された 安定なＮａＶ１．７発現細胞系における発現に成功した。 実施例１９ 電気生理学的アッセイを用いた天然のＮａＶ機能に関する安定なＮａＶ１． ７発現細胞系の特性化 50 (294) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【１１３３】 自動化パッチ−クランプシステムを使用して、ＮａＶ１．７α、β１、およびβ２サブ ユニットを発現する産生された安定なＨＥＫ２９３Ｔ細胞系からのナトリウム電流を記録 した。以下に示したプロトコルはＱＰａｔｃｈ、ＳｏｐｈｉｏｎまたはＰａｔｃｈｌｉｎ ｅｒ、Ｎａｎｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍにも使用することができる。細胞外リンガー液は室温 で１４０ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、２．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１１ｍＭのグ ルコースおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を含んでいた。細胞内リンガー液は、１ ２０ｍＭのＣｓＦ、２０ｍＭのＣｓ−ＥＧＴＡ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ ２、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を含んでいた。実験を室温で実施した。 【１１３４】 10 ＮａＶ１．７α、β１、およびβ２サブユニットを安定して発現する細胞を、実施例１ ７で記載するような標準的培養プロトコルのもとで増殖させた。細胞を収穫し、連続して 撹拌しながら４時間まで懸濁液中に保持し、品質または付着能力において有意な変化はな かった。標準的パッチプレートを用いて電気生理学的実験（全細胞）を実施した。パッチ −クランプホール（チップにマイクロエッチ処理）は直径約１μｍであり、∼２ＭΩの抵 抗を有する。膜電位を−１００ｍＶの保持電位に固定した。 【１１３５】 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において安定して発現された、電圧ゲート制御されたヒトＮａＶ１ ．７ナトリウムチャンネルの電流−電圧関係および不活性化特性を特性化した。−１００ ｍＶの保持電位で、−８０ｍＶから＋５０ｍＶまでの脱分極パルスに反応するナトリウム 20 電流を測定した。結果として得られるピークナトリウムチャンネル電流の電流−電圧（Ｉ −Ｖ）関係を特性化した。活性化閾値は−３５ｍＶ（活性化の中点、Ｖａ＝−２４．９ｍ Ｖ＋／−３．７ｍＶ）であり、最大電流振幅は−１０ｍＶで得られた。ナトリウムチャン ネルの不活性化グラフをプロットした。膜電位を−１００ｍＶの保持電位に固定し、続い て１０００ｍｓ間、マイナス１１０ｍＶから＋１０ｍＶの範囲の条件付け電位にシフトさ せ、そして最終的に電流は１工程で０ｍＶまでと測定された。結果として得られる電流振 幅は、不活性化状態におけるナトリウムチャンネルのフラクションを示す。−８５ｍＶよ りもさらにマイナスの電位で、チャンネルは主に閉鎖状態であり、一方、−５０ｍＶより 高い電位では、主に不活性化状態にあった。曲線はボルツマンフィットを表し、これから 定常状態不活性化が−７４ｍＶであると推定された。産生された安定なＮａＶ１．７発現 30 細胞系の電流−電圧特性は、以前に報告されている電流−電圧特性と一致する（Ｖａ＝− ２８．０ｍＶ±１．１ｍＶ；Ｖ１／２＝−７１．３ｍＶ±０．８ｍＶ）（Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５８１（Ｐｔ ３）：１０１９−１０３１．（ ２００７））。 実施例２０ 膜電位アッセイを用いた天然のＮａＶ機能についての安定なＮａＶ１．７発 現細胞系の特性化 【１１３６】 産生された、ＮａＶ１．７α、β１、およびβ２サブユニットを発現する安定な細胞を 、標準的細胞培養条件下、１０％ウシ胎仔血清、グルタミンおよびＨＥＰＥＳを添加した ダルベッコの修飾イーグル培地中で維持した。アッセイ前日に、細胞解離緩衝液、例えば 40 、ＣＤＢ（ＧＩＢＣＯ）または細胞ストリッパー（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を用いてストッ クプレートから細胞を収穫し、３８４ウェルプレート中、増殖培地中で１ウェルあたり１ ０，０００∼２５，０００細胞でプレーティングした。アッセイプレートを、３７℃の細 胞培養インキュベータ中、５％ＣＯ２下で２２∼２４時間維持した。培地をアッセイプレ ートから取り出し、ロード緩衝液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍ ＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース）中で希釈した青色蛍光 膜電位色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を添加した。細胞を青色 膜電位色素とともに１時間、３７℃でインキュベートした。アッセイプレートを次いでハ イスループット蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｓｔｕ ＦＤＳＳ）にかけた。蛍光 プレートリーダーは、細胞プレートを１秒につき１回撮影した画像における細胞蛍光を測 50 (295) JP 2012-516687 A 2012.7.26 定し、データを相対蛍光単位として表示する。 【１１３７】 安定なＮａＶ１．７発現細胞および対照細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３Ｔ親細胞）の、 緩衝液およびチャンネルアクチベーター（すなわち、ベラトリジンおよびサソリ毒（ＳＶ ））の添加に対するアッセイ反応を測定した。第一添加工程（すなわち、添加１）では、 緩衝液のみを添加し、試験化合物は添加しなかった。所望により、試験化合物をこの工程 で添加することができる。第二添加工程では、ナトリウムチャンネルアクチベーターであ るベラトリジンおよびサソリ毒をアッセイ緩衝液中で所望の濃度（すなわち、２５μＭの ベラトリジンおよび５∼２５μｇ／ｍｌのサソリ毒）に希釈し、そして３８４ウェルポリ プロピレンマイクロタイタープレート中に添加した。結合すると、ベラトリジンおよびサ 10 ソリ毒タンパク質は、活性化および不活性化速度の改変をはじめとするメカニズムの組み 合わせによって電位ゲート制御されたナトリウムチャンネルの活性を調節する。安定なＮ ａＶ１．７発現細胞におけるナトリウムチャンネルの結果としての活性化は、細胞膜電位 を変化させ、蛍光シグナルが増大する。前記機能的アッセイは、ＮａＶ１．７イオンチャ ンネルでの試験化合物の相対的有効性を特性化するためにも使用できる。 実施例２１ ベータサブユニットによるＮａＶ１．７アルファサブユニットの調整の特性 化 βサブユニットによるアルファサブユニット遺伝子発現の調整 【１１３８】 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプールは、独立性プラスミドＤＮＡまたはαおよび対照プラスミ 20 ドの比を操作することによって、様々な比のαおよびβサブユニットを発現するように操 作した（例えば、α：β１：β２＝１：１：１）。薬剤選択後、６つの異なる細胞プール におけるサブユニット発現を、実施例１８に記載するようにしてｑＲＴ−ＰＣＲで評価し た。比較ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、薬剤選択細胞 検出におけるαサブユニット発現は、３つのヒトＮａＶ１．７サブユニット（すなわち、 α、β１、およびβ２）全てがコトランスフェクトされた場合、αサブユニットおよび対 照のみをトランスフェクトした場合と比較して、増加したことを示した。βサブユニット 転写産物の存在は、αサブユニット遺伝子発現に影響を及ぼし、このことは、生理学的に 関連した機能アッセイに関して３つのＮａＶ１．７サブユニット全てを同時発現する重要 性を示す。 30 ベータサブユニットによる薬理学的特性の調整 【１１３９】 膜電位細胞ベースのアッセイを使用して、３つのＮａＶ１．７サブユニット（すなわち 、α、β１、およびβ２）全てを安定して同時発現する細胞ならびにＮａＶ１．７αサブ ユニットのみを安定して発現する対照細胞の試験化合物に対する反応を測定した。２つの 化合物（すなわち、Ｃ１８およびＫ２１）を、実施例２０におけるプロトコルに実質的に したがって実施した膜電位アッセイで試験した。この実施例について特に、試験化合物を 最初の添加工程で添加した。 【１１４０】 Ｃ１８およびＫ２１は、クローンＣ４４（ＮａＶ１．７α、β１、およびβ２サブユニ 40 ットを発現する）の反応を増強し、クローンＣ６０（ＮａＶ１．７αサブユニットのみを 発現する）の反応をブロックした。２つの試験化合物のアッセイ反応を、２つのクローン のそれぞれについて緩衝液単独の反応に対して正規化した。 実施例２２ ＮａＶ１．７の異なるサブユニット組み合わせの特性化 【１１４１】 膜電位細胞ベースのアッセイを使用して、３つのＮａＶ１．７サブユニット（すなわち 、α、β１、およびβ２）全てを安定して同時発現する異なる細胞系の試験化合物に対す る反応を測定した。ＮａＶ１．７アルファ、ベータ１およびベータ２サブユニットの発現 について陽性である細胞から生成された４つの細胞系に関して試験した化合物のセットに ついての用量反応分析（ＤＲＣ）の結果、別個の機能特性（図４）が得られた。複数の細 50 (296) JP 2012-516687 A 2012.7.26 胞系が、図４に示す４つの特性のそれぞれと類似した特性を含むことが判明した。 【１１４２】 ３つのＮａＶ１．７サブユニット（すなわち、α、β１、およびβ２）全てを同時発現 する∼９０のＮａＶ１．７細胞系を、同じ化合物を用いて各クローン細胞系を試験する細 胞ベースのアッセイにおけるそれらの機能的薬理学的特性に基づいて分類した（図５）。 図５中のクラスター（ビン１∼５）は、類似した活性を有するクローンのサブセットを表 す。活性は、図５において各クローン細胞系について示すように、最大シグナル阻害のパ ーセンテージとして計算した。図５中の負の数は、増強のパーセンテージを表す。 表７ 哺乳動物Ｇタンパク質、それらのファミリーおよび説明 【表７】 10 20 (297) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (298) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (299) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (300) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (301) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (302) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (303) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (304) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 注：細胞は、これらのタンパク質のいずれかの種々の組み合わせを発現することができる 。 表８ ヒトオーファンＧＰＣＲ（それらの遺伝子記号およびＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号を含 む） 50 (305) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表８】 10 20 30 40 (306) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (307) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 表９ ヒトオピオイド受容体のリスト 50 (308) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表９】 10 表１０ ヒト嗅覚受容体のリスト 【表１０】 20 30 40 (309) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (310) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (311) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (312) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (313) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (314) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (315) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (316) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (317) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (318) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (319) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 表１１ イヌの嗅覚受容体（それらの遺伝子名）のリスト 【表１１】 30 40 (320) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (321) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (322) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (323) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (324) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (325) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (326) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (327) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (328) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 表１２ ハマダラカ嗅覚受容体 【表１２】 40 (329) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 注：ＧＰＲｏｒ７／ＩＯＲ５５は、他のＯＲのそれぞれとともに同時発現させることがで きる。 表１３ ヒト受容体のリスト 【表１３】 (330) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (331) JP 2012-516687 A 2012.7.26 注：細胞は、他の種からの対応する配列で作製することもでき；これは、受容体のクラス の例示的リストであり、全てのファミリーまたはファミリーメンバーを列挙しているわけ 10 ではなく、他のものも本発明者らの方法を用いて細胞中で発現することができる。 表１４ 様々な種由来のＧＡＢＡサブユニット 【表１４】 20 30 40 (332) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (333) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (334) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (335) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 表１５ ヒト苦味受容体のリスト (336) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表１５】 【１１４３】 10 苦味受容体細胞系の調製において好適なＧタンパク質としては、マウスＧα１５および ヒトＧＮＡ１５が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 表１６ 甘味および旨味受容体 【表１６】 20 表１７ 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子 【表１７】 30 表１８． グアニリルシクラーゼ 【表１８】 40 (337) JP 2012-516687 A 2012.7.26 表１９ マウス嗅覚受容体のリスト 【表１９】 10 20 30 40 (338) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (339) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (340) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (341) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (342) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (343) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (344) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (345) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (346) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (347) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (348) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (349) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (350) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (351) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (352) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (353) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (354) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (355) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (356) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (357) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (358) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (359) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (360) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (361) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (362) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (363) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (364) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (365) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (366) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (367) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (368) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (369) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (370) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (371) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (372) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (373) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (374) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (375) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 表２０ ヒト苦味受容体遺伝子に関連する多型 （表２０は、ヒトＴＡＳ２Ｒ遺伝子の独自の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のそれぞれ についての参照配列番号、参照配列中のＳＮＰの位置、およびＳＮＰの説明を含む） 【表２０】 (376) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (377) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (378) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (379) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (380) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (381) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (382) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (383) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (384) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (385) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (386) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (387) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (388) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (389) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (390) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (391) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (392) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 表２１ ヒト苦味受容体のコーディング配列における対立遺伝子変異 【表２１】 40 (393) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (394) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (395) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 注：表２１中の全ての位置情報は、ヒトＴＡＳ２Ｒタンパク質のカノニカル配列を指す。 表２２ 昆虫遺伝子のリスト 【表２２】 30 【１１４４】 表２２に記載した受容体のヒト嗅覚受容体ホモログを、本発明の方法および組成物とと もに用いることもできる。 実施例２３ 安定な旨味受容体発現細胞系の生成 トランスフェクション 【１１４５】 ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）を３個の独立したプラスミドとコト 40 ランスフェクトした（１つはＴ１Ｒ１（配列番号４１）をコードし、もう１つはＴ１Ｒ３ （配列番号３２）をコードし、他のものはシグナリング分子（マウスＧα１５、配列番号 ３３）をコードする）。本発明の方法では薬剤選択は任意であるが、本発明者らは、プラ スミド１個につき１個の薬剤耐性マーカーを含めた。配列は、ＣＭＶプロモータの制御下 であった。シグナリングプローブによる検出のためのタグをコード化する非翻訳配列も、 薬剤耐性マーカーをコード化する配列とともに存在していた。用いられる標的配列は、標 的配列１（配列番号２８）、標的配列２（配列番号２９）および標的配列３（配列番号３ ０）であった。これらの例では、Ｔ１Ｒ１遺伝子ベクターは標的配列３を含み、Ｔ１Ｒ３ 遺伝子ベクターは標的配列１を含み、Ｇα１５遺伝子ベクターは標的配列２を含んでいた 。細胞を、薬物を含む培地中で１０∼１４日間従来どおりに選択した。 50 (396) JP 2012-516687 A 2012.7.26 蛍光発生プローブへの細胞の暴露 【１１４６】 選択された細胞を収穫し、シグナリングプローブ（配列番号３８∼４０）でトランスフ ェクトした。シグナリングプローブ１はタグ配列１（配列番号１２６）を結合し、シグナ リングプローブ２はタグ配列２（配列番号１２７）を結合し、シグナリングプローブ３は タグ配列３（配列番号１２８）を結合する。細胞を次いで解離させ、分析のために集め、 そして蛍光活性化細胞分類（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ） を用いて分類した。当業者には理解されるように、選択された宿主細胞と併用するのに適 した任意の試薬を使用して、核酸、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、標識された オリゴヌクレオチドを、適切な最適化をした宿主細胞中に導入することができる。核酸を 10 宿主細胞中に導入するために使用することができる試薬の例としては：Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｔ ＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、またはＦ ｅｃｔｕｒｉｎが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 シグナリングプローブ１ ５’−Ｃｙ５ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’ （配列番号３８） シグナリングプローブ２ ５’−Ｃｙ５．５ ＧＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴ 20 ＣＧＣ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’ （配列番号３９） シグナリングプローブ３ ５’−Ｆａｍ ＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ１ ｑｕｅｎｃｈ−３’ （配列番号４０） タグ配列１（標的配列を太字で標示）（旨味） ＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴ ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＧ ＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴ ＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴ ＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＣ 30 ＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１２ ６） タグ配列２（標的配列を太字で標示）（旨味） ＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴ ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣ ＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴ ＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴ ＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧ ＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣ Ｔ ＧＣ（配列番号１２７） タグ配列３（標的配列を太字で標示）（旨味） ＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣ 40 ＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡ ＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＴＣＴＧ ＧＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧ （配列番号１２８） 【１１４７】 他の標的配列およびシグナリングプローブを使用することができた（例えば、２００６ 年９月１日付で公開された国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０７９４６２（出願第ＰＣ Ｔ／ＵＳ０５／００５０８０号）に記載されているとおり））。例えば、ＢＨＱ３をプロ ーブ１またはプローブ２中のＢＨＱ１または金粒子と置換することができた。ＢＨＱ１は 、プローブ３に中のＢＨＱ２またはＤａｂｃｙｌで置換することができたことに注意。Ｃ 50 (397) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｙ５と類似したスペクトル特性を有するＱｕａｓａｒ Ｄｙｅ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）を 用いる類似のプローブをある実験では使用することができた。ＤＮＡプローブではなくｍ ５−ＭｅｄＣおよび２−アミノｄＡミキシマープローブを場合によっては使用することが できたことにも注意。 陽性細胞の単離 【１１４８】 標準的解析法を使用して、バックグラウンドより高い蛍光を発する細胞をゲートで制御 し、所定のゲート内の細胞を直接９６ウェルプレート中に単離した。細胞分類は、各ウェ ルごとに１つの細胞が入るように操作した。選択後、薬物を含まない培地中で細胞を増殖 させた。 10 機能的変換 【１１４９】 本発明者らは、例えば、低グルコースＤＭＥＭ培地または無グルコースＬｅｉｂｏｖｉ ｔｚ Ｌ−１５培地（１０％血清を含むかもしくは無血清）中を包含する種々の増殖条件 で、同じ細胞および異なる細胞の両アリコートを用いて、旨味受容体細胞（前述のように して選択し、増殖させたもの）を維持した。一部の細胞を、種々の濃度のガラクトースな どの他の糖を含む培地中で維持した。本発明者らは、次いで旨味リガンドに適切に反応し 、他の刺激（すなわち糖）には反応しないそれらの能力について複数の条件下で特性化し た。 【１１５０】 20 種々の培養条件での増殖は、理論に束縛されることを望まないが、例えば遺伝子発現レ ベル、ゲノム構成および細胞表面での受容体の機能的発現の変化などにより、細胞を機能 的に変換することができる。評価して、細胞の機能的アッセイ反応に影響を及ぼすことが 示された種々の培地におけるパラメータとしては、血清濃度（すなわち、低血清濃度およ び血清枯渇）、糖枯渇およびアッセイプレートコーティング（例えば、ポリＤリシンおよ びラミニン）が挙げられる。これらの結果は、細胞が異なる培地条件で維持される場合、 旨味受容体細胞系の細胞の特徴が異なる場合があることを証明した。これらの結果は、蛍 光発生プローブによって選択される異なる細胞は異なる特徴を有する可能性があることも 示す。蛍光発生プローブによって選択される細胞の本発明者等の特徴化の一例を、図６中 に示す。図６で示すように、異なる条件（１、２および最終）で増殖させた同じ細胞のア 30 リコートは、旨味（ＭＳＧ）と甘味（フルクトース）リガンドに対して有意に異なって反 応した。条件１で増殖させた細胞を、血清枯渇低グルコース培地中にプレーティングした 。条件２で増殖させた細胞を、１０％の血清を含む低グルコース培地中に一晩プレーティ ングし、次いでアッセイ前に血清枯渇培地に切り替えた。条件１または２で増殖させた細 胞を、コーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６６５）上にプレーティングし た。「最終」条件は、コーティングされたプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３３００）上およ び血清を除去した低グルコース培地中での高密度増殖を含む。条件１で増殖させた細胞は 、旨味アゴニストよりも甘味アゴニストに反応する。条件２で増殖させた細胞は、両方の リガンドに対して等しく反応する。対照的に、「最終」増殖条件で増殖させた細胞は、Ｍ ＳＧに対して強く反応し、フルクトースには反応しない。このように、これらの細胞は、 40 生理学的かつ薬理学的に関連した旨味受容体を生成させた。 実施例２４ 生まれつきの旨味受容体機能１に関する細胞系の特性化。 １．遺伝子発現の立証および定量化 【１１５１】 ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者らは、前記細胞（「最終」）において発現される 旨味受容体サブユニットのそれぞれの相対量（ＲＮＡ）を測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲを使 用して、本発明者等は、発現される旨味受容体サブユニットのそれぞれの相対量を測定し た。全ＲＮＡは、商業的に入手可能なＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉ ｔ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１∼３ｘ１０６個の哺乳動物細胞から精製した。ＲＮＡ抽 出物を次いで、厳密なＤＮａｓｅ処理プロトコル（ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉ 50 (398) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｔ； Ａｍｂｉｏｎ）を使用して処理した。第１の鎖ＤＮＡ合成は、２０ｕＬの反応体積 のＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｉ ＩＩ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１ｕＧのＤＮＡを含まない全ＲＮＡおよび２５０ｎ ＧのＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに使用して実施した 。この反応の負の対照は、逆転写酵素またはＲＮＡがｃＤＮＡ合成工程中で省略された試 料を含んでいた。ｃＤＮＡとＰＣＲ産物合成は、以下の条件で熱サイクラー（Ｍａｓｔｅ ｒｃｙｃｌｅｒ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中にて実施した：２５０℃で５分、５０℃で６０ 分；反応終結は、７００℃で１５分間実施した。 【１１５２】 遺伝子発現（ＲＮＡ）の分析のために、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３およびマウスＧα１５ｃＤ 10 ＮＡに対するプローブ（ＭＧＢ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅｓ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。試料正規化対照として、ＧＡＰＤＨ（Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅ ｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａＮ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ）を利用した。負の対照と正の対照（プラスミドＤＮＡ）を含む反応を、５ ０ｕＬの反応体積中、４０ｎＧのｃＤＮＡを用いて３連で開始した。発現される旨味受容 体サブユニット（ＲＮＡ）のそれぞれの相対量を測定した。図７は、３つの核酸全てが旨 味受容体細胞系で発現さられた（ＲＮＡ）ことをグラフで表す。Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３およ びＧα１５の発現レベルは、対照細胞で観察されるレベルよりもそれぞれ約１０，０００ ×、１００×および１００，０００×高かった。 【１１５３】 20 標準的シングルエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ手順を使用して、前記のプロトコルに従っ て生成させた旨味受容体細胞系（「最終」）の１ヶ月培養物および９ヵ月培養物において Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３およびＧα１５遺伝子発現（ＲＮＡ）を評価した。細胞を８０％の集 密度まで２４ウェルプレート・フォーマット中で増殖させ、収集し、そして商業的に入手 可能なのＲＮＡ調製キット（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ｋｉｔ， Ａｍｂｉｏｎ）を使用して ＲＮＡを単離した。ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２，１８プライマーを含む市販の第１鎖ｃＤＮ Ａ合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｋｉｔ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の プロトコルに従って、５ｐｇ∼５ｕｇの範囲の精製された全ＲＮＡを使用して、逆転写を 実施した。第１鎖の合成後、旨味受容体核酸のサブユニット（Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ３）なら びにマウスＧα１５核酸に特異的なｏｌｉｇｏセットを、独立してＰＣＲ反応混合物（Ｈ 30 ｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ）にした。４５サイクルのＰＣＲの後、アンプリコン試料を、ア ガロースゲル電気泳動法によって更に分析した。 【１１５４】 これらのシングルエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ実験から得られる結果を図８に示す。図 ８は、ＲＴ−ＰＣＲ実験で使用したアガロースゲルの代表的な写真を示す。核酸をコード 化するすべての旨味受容体の強い発現（ＲＮＡ）は、１ヵ月培養物およびさらに時間がた った９ヵ月培養物において検出され、「最終」条件で増殖させた本発明の細胞系には例外 的なレベルの安定性を示した。 ２．細胞ベースのアッセイまたはモジュレータ 【１１５５】 40 本発明の細胞を、増殖培地（低グルコースＤＭＥＭまたはＬ１５培地、この培地に血清 および標準的増殖添加剤を追加）中、９６ウェルプレートにおいて分析する２４時間前に 、ウェル当たり（７５−１２５Ｋ）で播種する。インキュベーション後、増殖培地を除去 し、細胞を増殖無血清培地中に入れる。細胞を２∼３時間インキュベートする。培地を次 いで除去し、そして旨味アッセイ緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、１．１ｍＭのＫＨ２Ｐ Ｏ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび３ｍＭＮａＨＰＯ４＊７Ｈ２ Ｏ）中で希釈されたカルシウム感受性蛍光色素（Ｃａｌｃｉｕｍ−３， Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を細胞にロードする。細胞を１時間この培地中でイ ンキュベートする。プレートを、ハイスループット蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａ ｔｓｕ ＦＤＳＳ）にロードする。試験化合物を所望の濃度まで旨味分析緩衝液中で希釈 50 (399) JP 2012-516687 A 2012.7.26 し、そしてそれぞれのウェルに添加する。カルシウムフラックスを９０秒間検出する。上 述のように緩衝液で希釈したアクチベーター（すなわちＭＳＧ）を、１０ｕＭ∼１００ｍ Ｍの範囲の最終濃度で各ウェルに添加し、そして相対的な蛍光の変化をさらに９０秒間記 録する。 ３．旨味細胞ベースのアッセイのＺ’およびＥＣ５０値の測定 【１１５６】 これらの旨味受容体を発現する細胞系における旨味受容体反応の有効性を試験するため に、確立された旨味受容体アゴニストであるグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）を前述 のアッセイにおいて試験化合物として使用する。ＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ， Ｇ５８８９）、 ３３ｍＭの濃度で試験ウェルに添加し、対照ウェルには緩衝液だけを添加する。最終アッ 10 セイ条件では、蛍光プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ３ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅ ｍ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定されるカルシウムフラックス 測定により報告されるように。数回繰り返された１つのアッセイでは、細胞系は０．８の Ｚ値を有していた。図９（アッセイの一例）を参照。このＺ値は、発生した旨味受容体を 発現する細胞が、細胞ベースの分析法においてＭＳＧを認識し、そしてこれらの細胞を使 用して確実かつ強固にこれらのアッセイを実施できることを示す。 【１１５７】 本発明の旨味受容体発現細胞系において旨味受容体反応の感受性を試験するために、前 述のように増加量のＭＳＧを細胞に添加し、そして反応を測定することによって用量反応 実験を実施する。１つのアッセイ（図１０）において、この細胞系におけるＭＳＧに対す 20 るＥＣ５０値は２２ｍＭであることが判明した。これらの結果から、本発明の細胞系で産 生された旨味受容体が、本発明の旨味受容体発現細胞系において既知旨味受容体リガンド に対して強い感受性を示すことがわかる。 実施例２５ 既知ポテンシエーターＩＭＰおよびシクラミン酸ナトリウムによるＭＳＧに 対する旨味細胞系反応の増強 【１１５８】 前述のように、ＭＳＧは旨味受容体の公知リガンドである。ＭＳＧと共に提示される場 合、ヌクレオチドイノシン一リン酸（ＩＭＰ、Ｓｉｇｍａ）は、旨味受容体シグナリング のポテンシエーターとして用いられることができることも証明されている。上記のアッセ イプロトコルを使用して、増加するＭＳＧおよび増加するＩＭＰ濃度のマトリックスを細 30 胞系に適用し、反応を生じさせる。図１１は、そのようなアッセイに関して、ＩＭＰ濃度 が増加するにつれて、試験されるＭＳＧの各濃度でより強い反応が検出されることを示す 。 【１１５９】 ＭＳＧと同様に、人工甘味料であるシクラミン酸ナトリウムは、甘味受容体と旨味受容 体との両方に共通のサブユニットと相互作用するので、旨味受容体のアクチベーターとし ての働きをすることができる。上記のアッセイプロトコルを使用して、シクラミン酸塩（ Ｓｉｇｍａ）濃度を上昇させるマトリックスを適用し、反応が起こる。図１２は、１つの アッセイについて、シクラミン酸塩濃度が増加するにつれて、より有意な応答が検出され ることを示す。これは、ＭＳＧが存在しない状態でシクラミン酸塩を検出しない、従来技 40 術で記載されたいくつかの他の細胞系と対照的である。 実施例２６ 安定な苦味受容体発現細胞系の生成 工程１−トランスフェクション 【１１６０】 ２９３Ｔ細胞を、２つの独立したプラスミド（一方はヒトＴＡＳ２Ｒ苦味受容体（配列 番号７７−１０１のうちの１つ）をコードし、もう一方はマウスＧα１５シグナリングタ ンパク質（配列番号１０２）をコードする）とコトランスフェクトした。当業者には理解 されるように、選択された宿主細胞と併用するのに適した任意の試薬を用いて、核酸、例 えば、プラスミド、オリゴヌクレオチドまたは標識されたオリゴヌクレオチドを適切に最 適化された宿主細胞に導入することができる。核酸を宿主細胞中に導入するために使用す 50 (400) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ることができる。核酸を宿主細胞に導入するために用いることができる試薬の例としては 、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅ ｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃ ｔｉｎｅとＦｅｃｔｕｒｉｎが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明 の方法では薬剤選択は任意であるが、本発明者等は、プラスミド当たり１つの哺乳動物薬 剤耐性マーカーを含めた。プラスミドは、苦味受容体遺伝子またはＧα１５遺伝子の発現 のためにＣＭＶプロモータを使用した。シグナリングプローブによる検出のためのタグを コード化する非翻訳配列も、薬剤耐性マーカーをコード化する配列とともに存在し、した がって、タグは発現されたベクター中のタンパク質、すなわち、苦味受容体またはＧα１ ５とともに転写された。利用される標的配列は、標的配列１（配列番号４６）および標的 10 配列２（配列番号４７）であった。これらの例では、ＴＡＳ２Ｒ遺伝子を含むベクターは 標的配列１を含み、Ｇα１５遺伝子含有ベクターは標的配列２を含んでいた。 工程２−選択工程 【１１６１】 トランスフェクトした細胞を、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコの修飾イーグ ル培地（ＤＭＥＭ）中で２日間増殖させ、続いて抗生物質含有ＤＭＥＭ−ＦＢＳ中で２週 間増殖させた。抗生物質を含む期間では、抗生物質を以下のように培地に加えた：ピュー ロマイシン（０．１５ｕｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）。 工程３−細胞継代 【１１６２】 20 抗生物質に関して濃縮した後で蛍光発生シグナリング・プローブの導入の前に、細胞を さらに８回（ｐ５∼ｐ１３）抗生物質選択の非存在下で継代して、選択された期間にわた って安定でない発現が鎮静化する時間をとる。 工程４−蛍光発生シグナリングプローブへの細胞の暴露 【１１６３】 細胞を収穫し、シグナリングプローブ（配列番号４８および４９）でトランスフェクト した。当業者には理解されるように、選択された宿主細胞と併用するのに適した任意の試 薬を使用して、核酸、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、標識されたオリゴヌクレ オチドを、適切な最適化をした宿主細胞中に導入することができる。核酸を宿主細胞中に 導入するために使用することができる試薬の例としては：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、 30 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ試薬、Ｆ ｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、またはＦｅｃｔｕｒｉ ｎが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 シグナリングプローブによって検出される標的配列 標的１ 【１１６４】 ５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号４６） 標的２ 【１１６５】 ５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣ−３’（配列番号４７） 40 【１１６６】 Ｃｙ５と類似のスペクトル特性を有するＱｕａｓａｒ Ｄｙｅ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ） を使用する類似のプローブを、ある実験で使用した。ＤＮＡプローブではなく５−Ｍｅｄ Ｃおよび２−アミノｄＡミキシマープローブを数例では使用した点にも注意する。 【１１６７】 スクランブル化非ターゲッティングｆａｍプローブを、送達対照（不図示）として使用 した。 シグナリングプローブ 【１１６８】 シグナリング・プローブを、１００μＭストックとして供給した。 50 (401) JP 2012-516687 A 2012.7.26 シグナリングプローブ１は標的１を結合する 【１１６９】 ５’−Ｃｙ５ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣ ＧＣ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号４８） シグナリングプローブ２は標的２を結合する 【１１７０】 ５’−Ｃｙ５．５ ＧＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣ ＴＣＧＣ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号４９） 【１１７１】 ＢＨＱ３をプローブ１またはプローブ２中のＢＨＱ１または金粒子で置換できたことに 10 注意する。 【１１７２】 ＢＨＱ３を、プローブ１またはプローブ２においてＢＨＱ２または金粒子で置換するこ とができた。 工程５−陽性細胞の単離 【１１７３】 細胞を解離させ、蛍光標示式細胞分取器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａ ｍｉ， ＦＬ）を使用する分析および分類のために集めた。標準分析法を使用して、バッ クグラウンドより高い蛍光を発する細胞をゲートで制御し、ゲート内に入る個々の細胞を バーコード化された９６ウェルプレート中に単離した。ゲート制御階層は以下のとおりで 20 あった：コインシデンスゲート＞シングレットゲート＞ライブゲート＞ソートゲート。こ のゲート制御戦略を用いて、ダブルポジティブな細胞の上位０．１∼１．３％を、バーコ ード化９６ウェルプレート中に分類するために標識した。 工程６−工程１∼５および／または３∼５のさらなるサイクル 【１１７４】 実験は、非常に厳重に時間が決められたロジスティックスで段階に分けた。この作戦の 一部として、余分なソートを完了してさらなるクローンを得るために、工程３∼５の完全 なサイクルを２回実施した。 工程７−細胞の集団のための増殖速度の評価 【１１７５】 30 プレートを、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓｔａｒ自動化液体ハンドラーに移 した。２∼３日馴化増殖培養液：１００単位ペニシリン／ｍｌ＋０．１ｍｇ／ｍｌのスト レプトマイシンを追加した新しい増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ）の１：１のミッ クス中で最高２０日間、細胞をインキュベートした。プレートを、分類後７∼２０日間で 画像化して、ウェル（Ｇｅｎｅｔｉｘ）の集密度を決定した。プレート全体にわたって信 頼できる画像を取得するために、各プレートに焦点を合わせた。７０％を超える報告され た集密度は信頼性がなかった。集密度測定値は先に指定した時間にわたって３回得、これ を用いて増殖速度を計算した 工程８−増殖速度にしたがった細胞集団のビン化 【１１７６】 40 細胞を、分類後約２０日の増殖速度にしたがってビン化した（独立して分類し、コホー トとしてプレーティングした）。ビンを独立して集め、下流の処理のために各９６ウェル プレート上にプレーティングし、特定のビンにつき２以上の標的プレートがあり得る。増 殖速度の広がりを考慮し、かつ高いパーセンテージ、つまり細胞の集団の総数の最低約９ ０％（推定値として）を網羅する範囲をまとめることによって、ビンを計算した。５つの 増殖ビンを、異なる苦味受容体細胞系全体にわたって、ビンに対して１．２∼３．５日の 平均的分割で使用した。従って、各ビンは、約１１時間の増殖速度または集団倍加時間差 に対応した。 【１１７７】 細胞は１日未満∼２週超までの倍加時間を有し得−同時に増殖速度にしたがって合理的 50 (402) JP 2012-516687 A 2012.7.26 に分化することができる最も多様なクローンを処理するために、典型的にはビン当たり０ ．２５∼０．７日の倍加時間で３∼９のビンを実施するのが好ましい。当業者は、特定の 状況にしたがってビンのタイトさとビンの数を調整する方法を理解し、細胞がそれらの細 胞周期の間同期する場合、ビンのタイトさと数を更に調整することができた。 工程９−パラレルプロセッシングを加速し、ストリンジェントな品質管理を提供するた めのレプリカプレーティング法 【１１７８】 プレートを、標準および固定条件（加湿された３７．５％のＣＯ２／９５％の空気）で 、抗生物質を含まないＤＭＥＭ培地／１０％のＦＢＳ中でインキュベートした。細胞のプ レートを分割して、４セットの標的プレート（このセットはすべての増殖ビンを有する全 10 プレートからなり、これらの工程により、当初のセットの４つの複製が存在することを保 証した）を得た。３セットまでの標的プレートを凍結保存（下記参照）に付し、残りのセ ットを拡大し、そして継代のためおよび機能的アッセイ実験のためにレプリカプレーティ ング培養した。異なった独立組織培養試薬、インキュベータ、人員および二酸化炭素源を 、プレートのセットごとに使用した。品質管理工程は、全ての組織培養試薬の適切な産生 量および品質を保証するために行った：使用するために調製した培地の各ボトルに添加す る各成分を、１人の指定された人が、その試薬のみを含む１つの指定されたフード中で添 加し、その間、もう１人の指定された人が間違いを避けるために監視した。液体取り扱い の条件は、ウェル全体にわたる相互汚染をなくすように設定した。全工程で新しいチップ を使用するか、または厳密なチップ洗浄プロトコルを使用した。液体取り扱い条件を、正 20 確な体積移動、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティング速度および位置、細胞 分散のためのピペッティングサイクルの数、およびプレートに対するチップの相対的な位 置について設定した。 工程１０−細胞集団の初期継代ストックの凍結 【１１７９】 ３セットのプレートを−７０∼−８０℃で凍結した。各セットのプレートをまず７０∼ １００％の集密度にした。培地を吸引し、９０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯを添加 した。プレートをパラフィルムで密封し、次いで個々に１∼５ｃｍの発泡体で包囲し、− ８０℃の冷凍庫中に入れた。 工程１１−安定な細胞系を生産する初期形質転換工程のための方法および条件 30 【１１８０】 プレートの残りのセットを、工程９で前述したように維持した。すべての細胞分裂は、 培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加ならびにインキュベーション、クエンチングおよび 細胞分散工程を含む液体取り扱い工程を用いて実施した。 工程１２−再配列されたプレートの細胞の機能の試験 【１１８１】 受容体細胞パネルのスケールのために正規化を使用しなかった−その代わりに、増殖再 配列プレートを最優先事項として機能について迅速に試験し（再配列後３∼５継代）、２ ５の苦味受容体のそれぞれの反応物のサブセット集団を特定した。 工程１３−細胞集団の特性化 40 【１１８２】 クローンを分類後３．５∼６週間でスクリーニングし、上位クローンを機能的に再試験 し、分類後５∼６週間で同定した。細胞は、これらの条件下で最高６週の間維持して、そ れらをインビトロで進化させた。この間に、本発明者らは、サイズ、形態、脆性、トリプ シン処理に対する反応または解離、解離後の丸み／平均真円度、生存率（％）、マイクロ 集密度に対する傾向、または培養プレート表面への接着性など細胞維持の他の態様を観察 した。 工程１４−細胞の集団の潜在的機能の評価 【１１８３】 機能的規準を用いて細胞集団を試験した。カルシウム動員色素キット（Ｃａｌｃｉｕｍ 50 (403) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ３， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ／ＭＤＳ）を、製造業者の指示にしたがっ て使用した。細胞を９６または３８４−ウェルプレート中、複数の異なる密度で試験し、 反応を分析した。プレーティング後の種々の時点、例えばプレーティング後１２∼４８時 間を使用した。アッセイ反応差を得るために異なるプレーティング密度も試験した。 【１１８４】 低および高継代数で実施した実験から得られる機能的な反応を比較して、分類後６∼１ １週間の範囲の所定の期間にわたって最も一貫した反応を示す細胞を特定した。時間とと もに変化した細胞の他の特性、例えば、細胞が解離後に再付着するための時間も記録した 。 工程１６−細胞のさらなる評価 10 【１１８５】 機能的基準および他の基準を満たす細胞の集団をさらに評価して、生存可能で安定かつ 機能的な細胞系を最も産生しやすいものを確定した。選択された細胞の集団をさらに大き な組織培養容器中で増殖させ、前述の特性化工程をこれらの条件下で続けるかまたは繰り 返した。この時点で、一貫した信頼性のある継代のために、さらなる標準化工程を導入し た。これらは、異なる表面プレーティング細胞密度、プレーティングコーティング、継代 時間、培養皿のサイズ／形式およびコーティング、流体工学最適化、細胞解離最適化（例 えば、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロゲン）対トリプ シンの存在下での解離）、使用する解離試薬の体積と解離の時間）、ならびに洗浄工程を 含んでいた。グルタミン濃度は、培地によって変動する量であった。さらに、各継代での 20 細胞の生存率を測定した。手動介入を増やして、細胞をより細かく観察し、モニタリング した。この情報を使用して、望ましい特性を保有する最終細胞系を特定し、選択するのに 役立てた。一貫した増殖、一貫した（すなわち形態が変わらない）適切な接着性、ならび に機能的反応を示す最終細胞系およびバックアップ細胞系を選択した。 工程１７−細胞バンクの確立 【１１８６】 最終的な細胞系とバックアップ細胞系に対応している低継代凍結プレート（上記参照） を、３７℃で解凍して、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳで２回洗浄し、加湿３７℃／５％のＣ Ｏ２条件でインキュベートした。細胞を次いで２∼３週間の期間、増殖させた。２５∼５ ０のバイアルからなる最終的およびバックアップ細胞系それぞれの細胞バンクを確立した 30 。さらなる最適化実験から得られた細胞を、５０％のＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ、４０％ のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯ中で低温保存した。 工程１８−細胞バンクの試験 【１１８７】 増殖させ、そして再凍結した、解凍した細胞系の凍結貯蔵物を含む細胞バンクからの少 なくとも１つのバイアルを、解凍し、培養で増殖させた。結果として生じる細胞を試験し て、それらがもともと選択されたもととなる同じ特性を満たすことを確認した。 実施例２７ 天然の苦味受容体機能についての細胞系の特性化 【１１８８】 苦味受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞の、リガンドによって誘発される反応性を確認 40 し、測定するために、細胞内カルシウムレベルで受容体により引き起こされる改変を測定 することによって受容体活性化をモニタリングした。細胞を、標準的増殖培地中、黒色透 明底プレートにおいて一夜増殖させるか、またはアッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ 、１３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ ２、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）中懸濁液として黒色透明底プレートに添加する かのいずれかをおこなった。細胞を、緩衝液中、非洗浄カルシウム感受性蛍光色素Ｃａｌ ｃｉｕｍ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）とともに室温で１時 間インキュベートした。細胞プレートおよび試験化合物（０．０１μＭ∼１００ｍＭ）を 、装置が試験化合物を細胞に添加する前、添加中および添加後にプレート蛍光の画像を集 めるハイスループット蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）に入れた 50 (404) JP 2012-516687 A 2012.7.26 。画像のソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）分析により、細胞プレート中の 各ウェルについて相対的な蛍光の変化が報告された。 【１１８９】 その多くが苦いと報告されている種々の化合物および抽出物を、２５の苦味受容体細胞 系全体にわたり、対照細胞と同様に分析して、活性を測定し、脱オーファン化した。 実施例２８ 一時的にトランスフェクションされた天然受容体と標識された受容体との間 の機能的差異 【１１９０】 天然および標識された受容体の一時的トランスフェクションとそれに続くアッセイによ って、天然受容体と標識された受容体との間の機能的な差異を分析した。一例として、機 10 能的アッセイは、マウスＧα１５タンパク質および天然のＴ２Ｒ１６苦味受容体またはマ ウスロドプシン遺伝子由来のＮ末端タグを有する同じ受容体のいずれかの一時的トランス フェクションの４８時間後に、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞で実施した。細胞を、 緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭの ＫＣＬ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４）中、非洗浄カル シウム感受性蛍光色素Ｃａｌｃｉｕｍ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏ ｒｐ．）とともに室温にて１時間インキュベートした。苦味受容体活性のアッセイ反応は 、装置がある範囲の濃度（０．０１ｕＭ∼１００ｕＭ）の苦味抽出物を添加する前、添加 中および添加後にプレート蛍光のイメージを集めるＨａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ蛍光プ レートリーダーで測定した。ＦＤＤＳソフトウェアは画像を分析して、細胞プレート中の 20 各ウェルの相対的な蛍光の変化を報告した。 【１１９１】 結果を、図１３中でプロットした。図１３で示すように、苦味抽出物は、ロドプシンタ グ含有受容体より大きく天然の苦味受容体を選択的に活性化した。この結果から、天然お よび標識されたヒト苦味受容体が異なった機能的な活性を示すことが示され、適切な受容 体帰属のために天然のタンパク質を発現するタンパク質および生理学的に関連した細胞ベ ースの分析および脱オーファン化の重要性が強調された。 実施例２９ 苦味受容体の機能的クローン生成の高い成功率 【１１９２】 成功率（単離されたすべてのクローンに対する機能的に活性な受容体を発現するクロー 30 ンの数）は、安定な細胞系を生成する効率を測定する際の重要なパラメータである。本発 明者等は、実施例２６で記載する方法を使用して単離したクローンの機能的アッセイを行 って、単離されたクローンの８０％超が機能的に活性であることを見いだした。 【１１９３】 一例として、特定のヒト苦味受容体Ｔ２Ｒ４１の発現のために単離された個々のクロー ン細胞系を９６ウェルプレートの個々のウェルで培養し、各ウェルの生菌の存在を、初期 カルシウム感受性色素負荷測定によって確証した。色素を添加していないかまたは色素添 加量が少ないウェルをブランクと見なし、図１４中、黒色で示した。細胞を次いで、苦味 抽出物の添加に対する機能的苦味受容体反応について試験し、受容体が関与するカルシウ ム動員をよみとり、色素蛍光の変化によってモニタリングした。細胞を含むが、初期蛍光 40 より高いシグナルで２倍未満の増加を示すウェルを陰性とみなし、図１４中、白色で示し 、一方、２倍超の増加のシグナルを灰色で示す。このプレートにおいて、この苦味受容体 遺伝子の発現について単離された６４クローンのうち５７のクローン（８９％）が、有意 な機能的苦味受容体応答を示した。 実施例３０ 苦味受容体反応の機能的なリアルタイム画像診断 【１１９４】 均一性は、安定な細胞系を生成する際のもう一つの重要なパラメータである。本発明者 等は、苦味受容体反応の機能的リアルタイム画像診断を使用して、薬剤選択のみによって 見いだされるものと比較して、実施例２６で記載される方法を使用して単離される細胞の 均一性を決定した。苦味受容体およびＧタンパク質を発現する細胞を、アッセイの２４時 50 (405) JP 2012-516687 A 2012.7.26 間前に、９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた黒色透明プレート（Ｂｅｃ ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上にプレーティングした。細胞に、アッセイ緩衝液（１３ ０のＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭグ ルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中で希釈したカルシウム感受性蛍光色 素をロードした。細胞を１時間インキュベートし、次いで苦味受容体の既知のアクチベー ターを適切な濃度で使用した。細胞のカルシウムフラックス反応は、適切なフィルターを 有するＡｘｉｏＶｅｒｔ ２００ＥＰＩ−蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して３分間記 録した。データは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ６．３ｒ７ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。 【１１９５】 10 苦味受容体活性化により起こる細胞内遊離カルシウムの増加によって示されるように、 均一な苦味受容体反応は単離されたクローン細胞系において検出された（図１５、上の写 真）。薬剤選択された細胞の同様に処理された培養では、アッセイ反応において大きな異 質性が、同じアクチベーターの使用後に観察された（図１５、下の写真）。この結果は、 本発明（すなわち実施例２６）の苦味受容体発現細胞系を生成する方法が、遺伝的かつ機 能的に一貫した細胞集団を選択することができることを示した。 実施例３１ 苦味受容体発現細胞系における機能的反応の均一性 【１１９６】 苦味受容体がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であるので、さまざまな化合物の存 在下で異なる苦味受容体間で苦味反応の重要な比較をするために、Ｇタンパク質カップリ 20 ングが異なる細胞系で一様に機能することを確認することは重要である。Ｇタンパク質共 役アゴニストのある範囲の濃度全体にわたって異なる細胞系の相対的反応は均一でなけれ ばならない。このことを確認するために、本発明者等は、細胞で内因的に発現されるβ− アドレナリン受容体のアゴニストであるイソプロテレノールの濃度を変えた用量反応曲線 実験で、異なるヒト苦味受容体を発現する２５の細胞系全ておよびマウスＧα１５タンパ ク質のＧα１５が関与する受容体反応において均一性を試験した。この内因性の受容体は 、刺激されると、発現されたＧα１５にカップリングすることができ、細胞内遊離カルシ ウムの変化を引き起こすことができる。反応（％）をイソプロテレノール濃度の関数とし てプロットし、結果を曲線にあてはめて、ＥＣ５０値（最大半量の受容体活性化濃度）を 計算した（図１６を参照）。２５の別個のクローン苦味細胞系全てにわたって比較して、 30 このＥＣ５０値は４．９±０．４１ｎＭであることが判明し、これは公開された文献値と ほぼ一致し、細胞系間での偏りは非常に小さい。 実施例３２ 機能的に反応性の、広く調整された受容体、中等度に調整された受容体およ び選択的受容体の同定 【１１９７】 本発明（すなわち実施例２６）の方法を用いて生成させた、天然ヒト苦味受容体遺伝子 を安定して発現する細胞系を、機能的細胞ベースの受容体研究で試験して、化学的に多様 な化合物のコレクションによるそれらの活性化を検出した。対応するヒト苦味受容体の用 量依存的活性化を誘発する物質１∼１２を、それらが活性化することが判明した受容体と ともに図１７に記載する。これにより、広く調整された受容体、それほど広くはなく調整 40 された受容体、および狭く調整された受容体の特定が可能になった。 実施例３３ 化合物のライブラリによって活性化される受容体の同定 【１１９８】 ２５のヒトの苦味受容体細胞系のそれぞれに対する化合物のライブラリの活性を試験し た。データは、化合物の添加に関する受容体活性の機能的細胞ベースのアッセイで得られ 、受容体の基礎活性（すなわち、緩衝液単独の添加による受容体活性）より高い活性（％ ）として表した。各受容体での各化合物の活性を次に、各受容体で低い活性（基礎活性よ り＜１００％高い；白色）、中程度の活性（基礎活性より１０１∼５００％高い；淡灰色 ）、高い活性（基礎活性より５０１∼１０００％の上記の；ダークグレイ）または非常に 高い活性（基礎活性より＞１００１％高い；黒色）を有する化合物を強調するために符号 50 (406) JP 2012-516687 A 2012.7.26 化した（図１８）。結果として得られるパターンは、選択的または苦味受容体全体にわた って広範囲のいずれかで活性である化合物、および化学的に多様な化合物のセットに対す る広範囲または選択的反応（列）を示す受容体のグラフを提供する。 実施例３４ アゴニスト誘導性苦味受容体活性の拮抗物質と類似した機能活性を有する化 合物の類似体の同定 【１１９９】 苦味受容体発現細胞ベースの分析法の、類似した機能活性を有する化合物の類似体を同 定する能力を試験するために、既知の苦味遮断化合物の２１の構造類似体を、苦味受容体 のアゴニスト誘発性受容体活性を阻害するそれらの能力について試験する。アゴニストに よって誘発される苦味受容体の活性を阻害する類似体の構造を比較する。このように、苦 10 味受容体発現細胞系は、強力な苦味受容体アンタゴニストの発見に役立つ可能性がある。 実施例３５ 天然の細胞系と標識された細胞系を使用する異なる受容体帰属 【１２００】 実施例２８で記載する一時的トランスフェクション後の機能的アッセイは、天然および 標識されたヒト苦味受容体が異なる機能的活性を有することを示した。このことはさらに 、標識された苦味受容体を発現する細胞系と比較して、天然の苦味受容体を発現する細胞 系を使用して確認された。手短に言うと、サッカリンの苦味受容体帰属は、天然の苦味受 容体を発現する安定な細胞系を用いてカルシウム動員を測定する機能細胞ベースの受容体 アッセイを使用して行った。サッカリンの苦味受容体帰属はまた、Ｐｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ Ｔｗｏ 20 Ｈｕｍａｎ Ｂｉｔｔｅｒ Ｔ２Ｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，” Ｃｈｅｍ． Ｓｅｎｓｅ ｓ， ２９：５８３−５９３ （２００４）で記載されているようにして、Ｎ末端マウス ロドプシンタグ配列を有する昆虫によって産生された組換え受容体タンパク質を使用して 、ＧＴＰ加水分解の膜画分ベースの無細胞アッセイで実施した。異なる帰属を図１９に示 す。同じ苦味化合物の苦味受容体帰属間の相違は、生理学的に関連した機能的な帰属のた めの天然の苦味受容体の必須要件を明らかにした。 実施例３６ 安定な甘味受容体を発現する細胞系の生成 トランスフェクション 【１２０１】 ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）を、３つの独立したプラスミド（１ 30 つはＴ１Ｒ２（配列番号３１）をコードし、１つはＴ１Ｒ３（配列番号３２）をコードし 、残りはシグナリング分子（マウスＧα１５、配列番号３３）をコードする）とコトラン スフェクトした。本発明の方法では薬剤選択は任意であるが、本発明者らは、プラスミド １個につき１個の薬剤耐性マーカーを含めた。配列は、ＣＭＶプロモータの制御下であっ た。シグナリングプローブによる検出のためのタグをコード化する非翻訳配列も、薬剤耐 性マーカーをコード化する配列とともに存在していた。用いられる標的配列は、標的配列 １（配列番号２８；配列番号１２３のタグ配列を使用）、標的配列２（配列番号２９；配 列番号１２４のタグ配列を使用）および標的配列３（配列番号３０；配列番号１２５のタ グ配列を使用）であった。これらの例では、Ｔ１Ｒ２遺伝子ベクターは標的配列３を含み 、Ｔ１Ｒ３遺伝子ベクターは標的配列１を含み、Ｇα１５遺伝子ベクターは標的配列２を 40 含んていた。細胞は、１０∼１４日間、薬剤を含む培地中で従来どおりに選択した。 蛍光発生プローブへの細胞の暴露 【１２０２】 選択された細胞を収穫し、そしてシグナリングプローブ（配列番号３８∼４０）でトラ ンスフェクトした。シグナリングプローブ１は標的配列１を結合し、シグナリングプロー ブ２は標的配列２を結合し、そしてシグナリングプローブ３は標的配列３を結合する。細 胞を次いで解離させ、分析のために集め、次いで、細胞を解離させ、分析のために集め、 蛍光標示式細胞分取器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）を用 いて分類した。 【１２０３】 50 (407) JP 2012-516687 A 2012.7.26 当業者には理解されるように、選択された宿主細胞と併用するのに適した任意の試薬を 使用して、核酸、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、標識されたオリゴヌクレオチ ドを、適切な最適化をした宿主細胞中に導入することができる。核酸を宿主細胞中に導入 するために使用することができる試薬の例としては：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉ ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇ ｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、またはＦｅｃｔｕｒｉｎが 挙げられるが、これらに限定されるものではない。 シグナリングプローブ１ ５’−Ｃｙ５ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’ 10 （配列番号３８） シグナリングプローブ２ ５’−Ｃｙ５．５ ＧＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴ ＣＧＣ ＢＨＱ３ ｑｕｅｎｃｈ−３’ （配列番号３９） シグナリングプローブ３ ５’−Ｆａｍ ＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧ Ｃ ＢＨＱ１ ｑｕｅｎｃｈ−３’ （配列番号４０） タグ配列１（標的配列を太字で標示）（甘味） 20 ＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴ ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＣ ＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴ ＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１２３） タグ配列２（標的配列を太字で標示）（甘味） ＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴ ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧ ＧＴＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧ ＣＣＣＧＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧ Ｃ（配列番号１２４） 30 タグ配列（標的配列を太字で標示）（甘味） ＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣ ＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＣＴＡＴＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴ ＧＴＣＧＣＴＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧ（配列番号１２５） 【１２０４】 他の標的配列およびシグナリングプローブを使用することができる（例えば、２００５ 年９月１日に公開された、国際特許出願公開第ＷＯ２００５／０７９４６２号（出願第Ｐ ＣＴ／ＵＳ０５／００５０８０号）に記載のとおり）。例えば、ＢＨＱ３をＢＨＱ１また はプローブ１もしくはプローブ２中の金粒子と置換することができる。ＢＨＱ１をプロー ブ３中のＢＨＱ２またはＤａｂｃｙｌで置換できることに注意。Ｃｙ５と類似したスペク 40 トル特性を有するＱｕａｓａｒ Ｄｙｅ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）を用いた類似のプローブ をある実験で用いることができる。ＤＮＡプローブではなく、５−ＭｅｄＣおよび２−ア ミノｄＡミキシマープローブを数例で使用できることに注意。 陽性細胞の単離 【１２０５】 標準分析法を使用して、背景より高い蛍光を発する細胞をゲートで制御し、その所定の ゲート内の細胞を９６ウェルプレート中に直接単離した。細胞分類は、各ウェルごとに１ つの細胞が入るように操作した。選択後、薬物を含まない培地中で細胞を増殖させた。 機能的変換 【１２０６】 50 (408) JP 2012-516687 A 2012.7.26 本発明者等は、例えば、低グルコースＤＭＥＭ培地を含むさまざまな増殖条件で、また は、１０％の血清を含むかまたは無血清の、グルコースを含まないリーボビッツＬ−１５ 培地中で同じ細胞および異なる細胞の両アリコートを使用して、甘味受容体細胞（上記の ように選択し、増殖させたもの）を維持した。一部の細胞を、さまざまな濃度のガラクト ースなどの他の糖を含む培地中で維持した。次いで、本発明者らは、甘味リガンドに適切 に反応し、他の刺激（ＭＳＧ）には反応しないそれらの能力について複数の条件の下で維 持された甘味受容体細胞系の細胞を特性化した。 【１２０７】 種々の培地条件での増殖は、理論に束縛されることを望まないが、例えば遺伝子発現レ ベル、ゲノム構成および細胞表面での受容体の機能的発現における変化など、細胞を機能 10 的に変換することができる。評価し、細胞の機能的アッセイ反応に影響を及ぼすことが示 された種々の培地におけるパラメータとしては、血清濃度（すなわち低い血清濃度および 血清枯渇）、砂糖枯渇とアッセイプレートコーティング（例えば、ポリＤリジンおよびラ ミニン）が挙げられる。これらの結果は、細胞が異なる培地条件で維持される場合、甘味 受容体細胞系の細胞の特性が異なる場合があることを証明した。それらは、蛍光発生プロ ーブにより選択される異なる細胞は、同じ増殖条件下で異なる特性を有し得ることも示す 。蛍光発生プローブにより選択される細胞の本発明者らによる特徴化の一例を図２０に示 す。図２０で示すように、異なる条件（１、２、および最終）で増殖させた同じ細胞のア リコートは、旨味（ＭＳＧ）および甘味（フルクトース）リガンドに対して有意に異なっ て反応した。条件１で増殖させた細胞を、血清枯渇低グルコース培地中にプレーティング 20 した。条件２で増殖させた細胞を、１０％の血清を含む低グルコース培地中に一晩プレー ティングし、次いでアッセイ前に血清枯渇培地に切り替えた。条件１または２で増殖させ た細胞を、被覆プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６６５）上にプレーティングした。「最終 」条件は、被覆プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３３００）上および血清枯渇グルコース培地 中での高密度増殖を含む。条件１および条件２で増殖させた細胞は、甘味アゴニストより も旨味アゴニストに反応する。対照的に、「最終」増殖条件で増殖させた細胞は、フルク トースに強く反応し、ＭＳＧには反応しない。このように、これらの細胞は、生理学的お よび薬理学的に関連した甘味受容体を生産した。 実施例３７ 天然の甘味受容体機能１についての細胞系の特性化 １．遺伝子発現の確認と定量化 30 【１２０８】 ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者等は、前記細胞（「最終」）において発現された 甘味受容体サブユニットのそれぞれの相対的な量（ＲＮＡ）を測定した。全ＲＮＡは、市 販のＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用する１ ∼３×１０６哺乳動物細胞から精製した。ＲＮＡ抽出物を次いで、厳密なＤＮａｓｅ処理 プロトコル（ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ； Ａｍｂｉｏｎ）を使用して処理 した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は、１ｕＧのＤＮＡを含まない全ＲＮＡおよび２５０ｎＧのＲ ａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２０ｕＬの反応体積で、Ｒ ｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。この反応の負の対照は、逆転写酵素ま 40 たはＲＮＡをｃＤＮＡ合成工程の間除外した試料を含んでいた。ｃＤＮＡとＰＣＲ産物の 合成は、熱サイクラー（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中、以下の条 件で実施した：２５０Ｃで５分、５０℃で６０分；反応終結は、７０℃で実施した。 【１２０９】 遺伝子発現（ＲＮＡ）の分析のために、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３およびマウスＧα１５ ｃ ＤＮＡに対するプローブ（ＭＧＢ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅｓ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓは）を使用した。例えば、試料正規化対照のために、ＧＡＰＤＨ（Ｐ ｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａＮ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。負の対照と陽性対照（プラスミドＤＮＡ）を 含む反応は、５０ｕＬの反応体積で４０ｎＧのｃＤＮＡを用いて３連で設定した。発現さ 50 (409) JP 2012-516687 A 2012.7.26 れた（ＲＮＡ）甘味受容体サブユニットのそれぞれの相対的な量を測定した。図２１は、 視覚的に結果を表して、３つの核酸全てが甘味受容体細胞において発現された（ＲＮＡ） ことを示す。Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３およびＧα１５の発現レベルは、対照細胞で観察される レベルよりそれぞれ約１００，０００×、１０×および１００，０００×高かった。 【１２１０】 標準的シングルエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ処置は、前記の（「最終」）プロトコルに 従って生成させた甘味受容体細胞の１ヶ月と９ヵ月の培養におけるＴ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３お よびＧα１５遺伝子発現（ＲＮＡ）を評価するために使用した。細胞を２４ウェルプレー トフォーマット中で８０％の集密度まで増殖させ、収穫し、市販のＲＮＡ製剤キット（Ｒ ＮＡｑｕｅｏｕｓ ｋｉｔ， Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＲＮＡを単離した。５ｐｇ∼５ 10 ｕｇの範囲の精製された全ＲＮＡを使用して、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２，１８プライマー を用いて、市販第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｋｉｔ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って逆転写を実施した。第１の鎖合成の後、 甘味受容体核酸（Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３）のサブユニットに特異的なｏｌｉｇｏセット、な らびにマウスＧα１５核酸に特異的なｏｌｉｇｏセットを独立して、ＰＣＲ反応混合物（ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ）にした。４５サイクルのＰＣＲの後、アンプリコン試料を、 アガロースゲル電気泳動法によって更に分析した。 【１２１１】 これらのシングルエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ実験から得られた結果を図２２に示す。 図２２は、ＲＴ−ＰＣＲ実験で使用したアガロースゲルの代表的な写真を示す。全ての甘 20 味受容体をコードする核酸の強固な発現（ＲＮＡ）は、１ヶ月培養と、さらに時間のたっ た９ヶ月培養との両方で検出され、これは、「最終」条件下で増殖させた本発明の細胞系 について例外的な安定性レベルを示す。 ２．モジュレータについての細胞ベースのアッセイ 【１２１２】 アッセイの４８時間前に、本発明の細胞を、１０ｃｍ皿中で高密度にて増殖培地（低グ ルコースＤＭＥＭまたはＬ１５培地、この培地に血清および標準的増殖添加剤を追加する ）中に播種する。細胞を培養マトリックスから解離させ、９６ウェルプレート中にアッセ イの２４時間前に播種する。培地を除去した後、続いて甘味アッセイ緩衝液（１３０ｍＭ のＮａＣｌ、１．１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ 30 ＊ および３ｍＭのＮａＨＰＯ４ ７Ｈ２Ｏ）中で希釈したカルシウム感受性蛍光色素（カル シウム−３， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を添加する。細胞を この培地中で１時間インキュベートする。プレートを次いでハイスループットプレートリ ーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）にかける。試験化合物（すなわち、フルクトー ス（Ｓｉｇｍａ）、スクロース（Ｓｉｇｍａ）、グルコース（Ｓｉｇｍａ）、アセスルフ ァムカリウム（Ｆｌｕｋａ）、サッカリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、シクラミン酸ナト リウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ステビバ（Ｓｔｅｖｉｖａ Ｂｒａｎｄｓ Ｉｎｃ．）、モ グロシド（Ｓｌｉｍ Ｓｗｅｅｔ， Ｔｒｉｍｅｄｉｃａ）、およびソルビトール（Ｓｉ ｇｍａ））を甘味アッセイ緩衝液中で希釈し、各ウェルに添加する。カルシウムフラック スを９０秒間検出する。アクチベーターを前述のように緩衝液中で希釈し、１０ｕＭ∼１ 40 ００ｍＭの範囲の最終濃度で各ウェルに添加し、そして相対的蛍光における変化をさらに ９０秒間記録する。 ３．甘味細胞ベースのアッセイについてのＺ’およびＥＣＲＯ値の測定 【１２１３】 これらの甘味受容体を発現する細胞における甘味受容体反応の有効性を試験するために 、確立された甘味受容体アゴニストフルクトースを、前記アッセイの試験化合物として利 用する。フルクトースを７５ｍＭの濃度で試験ウェル（奇数列）に添加し、対照ウェル（ 偶数列）には緩衝液単独を添加する。最終アッセイ条件では、蛍光プレートリーダー（Ｆ ＬＩＰＲ３ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ｓ）によって測定されるカルシウムフラックス測定値により報告されるように。数回繰り 50 (410) JP 2012-516687 A 2012.7.26 返された１つのアッセイでは、細胞は０．８のＺ’値を有していた。図２３（アッセイの 一例）を参照。このＺ’値は、生成する甘味受容体発現細胞が細胞ベースの分析法でフル クトースを認識すること、そしてこれらの分析はこれらの細胞を使用して確実かつ強固に 実施できることを示す。 【１２１４】 本発明の甘味受容体発現細胞系における甘味受容体反応の感受性を試験するために、一 連の用量反応実験は、前述の様にさまざまな甘味受容体アゴニストの用量を増加させて細 胞に添加し、反応を測定することによって実施した。１つのアッセイ（図２４）では、こ れらの試験された化合物のＥＣ５０値は以下のとおりであることが判明した：サッカリン については１．５ｍＭ未満、スクロースについては３．５ｍＭ未満、フルクトースについ 10 ては４．３ｍＭ未満、そしてグルコースについては３４．１ｍＭ未満。これらの結果から 、本発明の細胞系で産生される甘味受容体が、本発明の甘味受容体発現細胞系において多 くの確立された甘味受容体リガンドに対して強い感受性を示すことがわかる。 【１２１５】 このアッセイでは、甘味受容体発現細胞が異なる甘味料にさらされた場合に、カルシウ ムフラックス反応曲線が異なることも判明した。図２５に図示されるように、異なるリガ ンドに対する細胞による反応の長さと強度は変化した。例えば、ステビバは、試験した他 の多くの甘味料よりも長く、かつより強力な反応を示した。これらの結果は、本発明の細 胞および細胞系がステビバなどの特定の高強度甘味料で見られる、甘い後味（甘味の望ま しくない持続）について分析するために有用であることを示唆する。 20 実施例３８ 少なくとも１つの甘味受容体サブユニットを内因的に発現する安定な細胞系 の生成および単離 シグナリングプローブの設計 【１２１６】 Ｔ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３ゲノム遺伝子座に対応する配列に対するシグナリングプローブ を設計した。シグナリングプローブは、表２３に記載するようにコーディングエクソン、 非コーディングイントロンまたは非コーディング非翻訳配列に対するものであった。 【１２１７】 シグナリングプローブＳ２１、Ｓ２２、Ｓ２３、Ｒ２−３Ｕ１およびＲ２−１１は、５ ’末端でＣｙ５．５蛍光ラベルを含み、３’末端でＢＨＱ２クエンチャーを含む。シグナ リングプローブＳ３１、Ｓ３２、Ｓ３３、Ｒ３−３Ｕ１およびＲ３−Ｉ３１は、５’末端 に６−ＦＡＭフルオロフォアを含み、３’末端にＢＨＱ１を含む。シグナリングプローブ は、他のフルオロフォアまたはクエンチャーも含み得る。シグナリングプローブを合成し 、それらのそれぞれの標識と結合させ、Ｇｅｎｅｌｉｎｋ（Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ， ＮＹ ）で精製した。 30 (411) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【表２３】 10 20 30 40 (412) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 【１２１８】 40 図２６および２７は、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３ゲノム遺伝子座ならびにイントロン−エ クソンコーディング構造を図示する。他の標的配列およびシグナリングプローブを使用す ることができる（例えば、２００５年９月１日付で公開された国際特許出願公開第ＷＯ２ ００５／０７９４６２号（出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／００５０８０に記載されているもの を参照））。例えば、ＢＨＱ１をプローブ３中のＢＨＱ２またはＤａｂｃｙｌで置換する ことができる。ＤＮＡプローブではなく５−ＭｅｄＣおよび２−アミノｄＡミキシマープ ローブを数例では使用できることにも注意。 蛍光発生プローブへの細胞の暴露 【１２１９】 ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）、ＨｕＴｕ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−４ 50 (413) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ０）またはＨ７１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２５１）細胞のいずれかを、別個の実験におい てシグナリングプローブの以下の組み合わせのうちの１つでトランスフェクトした：ａ） Ｓ２１およびＳ３１、ｂ）Ｓ２１およびＳ３２、ｃ）Ｓ２１およびＳ３３、ｄ）Ｓ２２お よびＳ３１、ｅ）Ｓ２２およびＳ３２、ｆ）Ｓ２２およびＳ３３、ｇ）Ｓ２３およびＳ３ １、ｈ）Ｓ２３およびＳ３２、ｉ）Ｓ２３およびＳ３３、ｊ）Ｒ２−３Ｕ１およびＲ３− ３Ｕ１、ｋ）Ｒ２−３Ｕ１およびＲ３−Ｉ３１、Ｉ）Ｒ２−Ｉ１およびＲ３−３Ｕ１、な らびにｍ）Ｒ２−Ｉ１およびＲ３−Ｉ３１。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清 （ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ ＃ＳＡＣ１２０３Ｃ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｇ７５１３）および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｈ０８８７）を含むダルベッ コの修飾イーグル培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５７９６）中に維持し、ＨｕＴｕ細胞は、１０％ 10 ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃２４４２）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７５１３） および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ８６３６）を含むイーグルの最小 必須培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５６５０）中に維持し、Ｈ７１６細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｓｉ ｇｍａ＃Ｆ２４４２）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉ ｔｕｔｅ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ＃１１８７５−０９３）中で維持した。当業者には理 解されるように、選択された宿主細胞と併用するのに適した任意の試薬を用いて、核酸（ 例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、標識されたオリゴヌクレオチド）を適切に最適 化した宿主細胞中に導入することができる。核酸を宿主細胞中に導入するために使用する ことができる試薬の例としては：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ ｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡ 20 Ｐ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、またはＦｅｃｔｕｒｉｎが挙げられるが、これ らに限定されるものではない。 【１２２０】 異なる実験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｕＴｕ細胞およびＨ７１６細胞を変異原性処 理（例えば、ＵＶ光）で処理するかまたは処理しないかのいずれかで、ランダム突然変異 生成または遺伝子活性化を誘発した後、後述のように蛍光発生プローブを導入した。細胞 を無血清培地中に１．２５×１０６細胞／ミリリットルで再懸濁させ、ＵＶ線に暴露して 、１５分間、主に２５４ｎｍ波長を放射する殺菌電球（Ｓｙｌｖａｎｉａ）から１ジュー ル／ｍ２／ｓを供給した。他の変異原性処理も使用できる（例えば、エチルメタンスルホ ン酸（ＥＭＳ）などの突然変異原に暴露することによる化学的突然変異生成）。細胞を、 30 最終濃度（例えば、２００ｕｇ／ｍｌ）のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ；Ｓｉｇｍａ ）とともにインキュベートした後、ＥＭＳを含まない培地に移すことができる。 【１２２１】 細胞を次いでシグナリングプローブに暴露し、解離させ、蛍光活性化細胞分類（Ｂｅｃ ｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， ＦＬ）を用いた試験のために集めた。 陽性細胞の単離 【１２２２】 フローサイトメトリーの分野における標準的実施にしたがった、そして当業者によく知 られた標準的解析法を使用して、陽性蛍光細胞をゲートで制御するか、または選択した。 蛍光活性化細胞分類を使用して、所望のゲート内にあるか、または所望の蛍光を有する陽 40 性蛍光細胞を、９６ウェルプレート中に直接単離した。細胞分類パラメータは、１ウェル あたり細胞１個だけを単離するために設定した。少なくとも１つのシグナリングプローブ の異なる絶対的または相対的蛍光レベルと関連するトランスフェクトされた細胞を、全集 団に対して最高のシグナル強度を有する細胞の上位１％をゲートで制御することによって 単離した。 【１２２３】 別の実験では、少なくとも１つのシグナリングプローブの異なる絶対的または相対的蛍 光レベルと関連するトランスフェクトされた細胞を、全集団に対して最高のシグナル強度 を有する細胞の上位０．１％をゲートで制御することによって単離した。 【１２２４】 50 (414) JP 2012-516687 A 2012.7.26 個々の細胞を単離し、下記のような細胞中で維持した。各細胞型に関して、均等な割合 のそのそれぞれの馴化および新鮮培地を使用するために合した。各細胞型をそれぞれの新 鮮培地中で２日間培養し、収穫し、次いで培地を濾過することによって、馴化培地を調製 した。個々の単離されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を単離し、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃ＳＡ Ｃ１２０３Ｃ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｇ７５１３）、１０ｍＭのＨＥ ＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｈ０８８７）および１∼５０希釈度のペニシリン／ストレプトマイ シン溶液（最終濃度１００単位のペニシリン／１００μＧのストレプトマイシン／ｍＬ） （Ｓｉｇｍａ＃Ｐ４４５８）を含むダルベッコの修飾イーグル培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５７ ９６）中に維持した。個々に単離されたＨｕＴｕ細胞を単離し、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇ ｍａ＃２４４２）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７５１３）、１ｍＭのピル 10 ビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ８６３６）および１∼５０希釈度のペニシリン／スト レプトマイシン溶液（最終濃度１００単位のペニシリン／１００μＧのストレプトマイシ ン／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ４４５８）を含むイーグルの最小必須培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ ５６５０）中で維持した。個々に単離されたＨ７１６細胞を単離し、１０％のＦＢＳ（Ｓ ｉｇｍａ＃Ｆ２４４２）および１∼５０希釈度のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ 最終濃度１００単位のペニシリン／１００μＧのストレプトマイシン／ｍＬ）（Ｓｉｇｍ ａ＃Ｐ４４５８）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ ｔｅ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃１１８７５−０９３）中で維持した。 【１２２５】 ロボットによる細胞培養法を使用して、単離された細胞を継代し、９６ウェル組織培養 20 プレート中で維持した。特に、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ＳＴＡＲ（商標）装置を使用して、様 々な自動化細胞培養作業（例えば、培地の除去、培地の交換、試薬の添加、細胞洗浄、洗 浄液の除去、分散剤の添加、培養容器からの細胞の除去、細胞を培養容器へ添加すること など）を実施した。手動法を含む他の細胞培養法も使用することができる。細胞を次いで １０ｃｍの組織培養皿中に増殖させ、標準的手動組織培養技術（例えば、培地の除去、細 胞の洗浄、培地の添加）を用いて培養した。 【１２２６】 単離された細胞を培養で増殖させて、個々の単離された細胞に由来する細胞の集団を生 成させた。個別に単離された細胞を、それらの各培地中で培養することによって増殖させ た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ ＃ＳＡＣ１２０３Ｃ）、２ｍＭ 30 Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｇ７５１３）および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｈ０８８７）を含むダルベッコの修飾イーグル培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５７９６）中で維 持するために移し、ＨｕＴｕ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃２４４２）、２ｍＭの Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ７５１３）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉ ｇｍａ＃Ｓ８６３６）を含むイーグルの最小必須培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５６５０）中で維 持するために移した。Ｈ７１６細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ｆ２４４２）を含む Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０培地（Ｇ ｉｂｃｏ＃１１８７５−０９３）中で維持するために移した。 機能試験 【１２２７】 40 それぞれ単一の単離された細胞の増殖から得られる細胞の集団を次いで、機能的細胞ベ ースのアッセイを用いて甘味リガンドに対して反応するそれらの能力について特性化した 。１５ｍＭのフルクトースをこれらの実験で使用した。細胞型に応じて、後述のような様 々な条件を使用した。 【１２２８】 アッセイの４８時間前に、細胞を、１０％血清（Ｓｉｇｍａ＃ＳＡＣ１２０３Ｃ）、４ ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｇ７５１３）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ Ｈ０８８７）、および１∼５０希釈度のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（最終濃 度１ｍＬあたり１００単位のペニシリン／１００μＧのストレプトマイシン）（Ｓｉｇｍ ａ＃Ｐ４４５８）を添加した増殖培地（Ｌ１５培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｌ５５２０）中、１０ 50 (415) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｃｍ皿中、１２００万∼２０００万細胞の高密度で播種した。細胞を培養マトリックスか ら解離させ、３８４ウェルプレート中、アッセイの２４時間前に、ウェルあたり３５，０ ００細胞で播種した。培地を１８∼２４時間後に除去した。甘味アッセイ緩衝液（１３０ ｍＭのＮａＣｌ、１．１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰ ＥＳおよび３ｍＭのＮａＨＰＯ４＊７Ｈ２Ｏ）中で希釈したカルシウム感受性蛍光色素（ Ｆｌｕｏ−４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を次いで各ウェルに添加した。細胞をこの培地中 で１時間インキュベートした。プレートを次いでハイスループットプレートリーダー（Ｈ ａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）にかけた。ＤＭＳＯを含む甘味アッセイ緩衝液を各ウェル に０．２％ＤＭＳＯの最終濃度になるように添加した。カルシウムフラックスまたはアッ セイ反応を、フルクトースを含む甘味アッセイ緩衝液を１５ｍＭのフルクトースの最終濃 10 度にするために各ウェルに添加する前、添加中および添加後に検出した。アッセイは、場 合によってカルシウム感受性蛍光色素のクエンチャーを用いて実施することができる。そ のようなクエンチャーは当該技術分野で周知であり、例えば、ジピクリルアミン（ＤＰＡ ）、アシッドバイオレット１７（ＡＶ１７）、ジアジンブラック（ＤＢ）、ＨＬＢ３０８ １８、トリパンブルー、ブロモフェノールブルー、ＨＬＢ３０７０１、ＨＬＢ３０７０２ 、ＨＬＢ３０７０３、ニトラジンイエロー、ニトロレッド、ＤＡＢＣＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＱＳＹ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、金属イオンク エンチャー（例えば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋）、およびヨウ化物イオンが挙げら れる。 【１２２９】 20 あるいは、細胞を培養マトリックスから解離させ、３８４ウェルプレートにおいて、ウ ェルあたり２，５００∼２０，０００の細胞密度で、アッセイの２４または４８時間前に 、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃２４４２）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ ７５１３）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ８６３６）を含むイー グルの最小必須培地（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５６５０）中、またはこの培地とＬ−１５培地（Ｓ ｉｇｍａ，Ｌ５５２０）との等量混合物中に播種した。１８∼５２時間後、培地を除去し た。甘味アッセイ緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、１．１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍ ＭのＣａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび３ｍＭのＮａＨＰＯ４＊７Ｈ２Ｏ）中で希釈 したカルシウム感受性蛍光色素（Ｆｌｕｏ−４， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を次いで各ウ ェルに添加した。細胞をこの培地中で１時間インキュベートした。プレートを次いでハイ 30 スループットプレートリーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）にかけた。ＤＭＳＯを 含む甘味アッセイ緩衝液を各ウェルに０．２％ＤＭＳＯの最終濃度になるように添加した 。カルシウムフラックスまたはアッセイ反応を、フルクトースを含む甘味アッセイ緩衝液 を各ウェルに１５ｍＭフルクトースの最終濃度になるように添加する前、添加中および添 加後に検出した。 【１２３０】 あるいは、細胞をペレット化し、甘味アッセイ緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、１．１ ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび３ｍＭのＮａ ＨＰＯ４＊７Ｈ２Ｏ）中で希釈したカルシウム感受性蛍光色素（Ｆｌｕｏ−４， Ｉｎｖ ｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた。細胞を３８４ウェルプレート中にプレーティングし 40 、この培地中で１時間インキュベートした。プレートを次いでハイスループットプレート リーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）にかけた。ＤＭＳＯを含む甘味アッセイ緩衝 液を各ウェルに０．２％ＤＭＳＯの最終濃度になるように添加した。カルシウムフラック スまたはアッセイ反応を、フルクトースを含む甘味アッセイ緩衝液を各ウェルに１５ｍＭ フルクトースの最終濃度になるように添加する前、添加中および添加後に検出した。 【１２３１】 高強度の天然および人工甘味料ならびに天然および人工甘味料をはじめとする他の甘味 リガンド、例えば、スクロース（Ｓｉｇｍａ）、グルコース（Ｓｉｇｍａ）、アセスルフ ァムカリウム（Ｆｌｕｋａ）、サッカリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、シクラミン酸ナト リウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ステビバ（Ｓｔｅｖｉｖａ Ｂｒａｎｄｓ Ｉｎｃ．）、モ 50 (416) JP 2012-516687 A 2012.7.26 グロシド（Ｓｌｉｍ Ｓｗｅｅｔ、Ｔｒｉｍｅｄｉｃａ）、およびソルビトール（Ｓｉｇ ｍａ）も使用できる。加えて、苦味、旨味、脂肪味、清涼味、辛味および酸味リガンドを はじめとする他の味覚リガンドまたは味物質、ならびに既知の味または固有の味がない化 合物を用いて、甘味反応に対する選択性および特異性を決定することができる。加えて、 任意の味物質またはリガンドを、例えば甘味増強剤Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ−ＣＲＰ４ ４（ＲｅｄＰｏｉｎｔ Ｂｉｏ）およびスクラロース増強剤Ｓ２３８３（Ｓｅｎｏｍｙｘ ）、およびＳｕｃｒｏｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓ５７４２（Ｓｅｎｏｍｙｘ）などの増 強剤またはブロッカーを包含するさらなる化合物の存在下で試験することができる。 【１２３２】 加えて、他の培地およびインキュベーション工程を用いることができ、他のプレート形 10 式、例えば９６ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートを用いることができる。 【１２３３】 個々に単離された細胞から培養され、甘味受容体の少なくとも１つのサブユニットを自 然に、および／または遺伝子活性化により発現することが判明した多くの細胞集団は、機 能的蛍光カルシウムフラックスレポーターアッセイにおいて細胞の反応または活性化速度 をモニタリングすることによって、フルクトースに対する反応性を有すると確認された。 図２８を参照。図２８Ａは、フルクトースに反応するＨｕＴｕ細胞を示す。図２８Ｂは、 フルクトースに反応するＨ７１６細胞を示す。図２８Ｃは、フルクトースに反応する２９ ３Ｔ細胞を示す。 ハイスループットスクリーニング 20 【１２３４】 甘味アゴニストおよび／またはモジュレータは、前記方法にしたがってプレーティング された細胞に対する化合物の影響を試験するためにハイスループットスクリーニング（Ｈ ＴＳ）を使用することによって特定することができる。甘味アッセイ緩衝液を、天然もし くは合成化合物ライブラリの１以上の成分もしくは化合物、または抽出物もしくは抽出物 フラクションの存在下または非存在下で各ウェルに添加する。ＤＭＳＯまたは他の有機溶 媒、例えばエタノールも含めて、５％未満（例えば、０．２％）のＤＭＳＯの最終濃度に するために化合物または抽出物を可溶化するのを助ける。カルシウムフラックスをある期 間（例えば、９０秒間）検出する。甘味アッセイ緩衝液中で希釈した、フルクトース、ま たは別の甘味リガンドを次いで各ウェルに添加して、最終活性化濃度（例えば、１５ｍＭ 30 ）にする。相対的蛍光の変化をさらなる期間（例えば、９０秒）記録する。多数の対照化 合物も試験する。 【１２３５】 この試験は、化合物ライブラリの一部または全部がスクリーニングされるまで繰り返す 。データを分析して、活性化合物を同定する。ブロッカー、ポテンシエーター、増強剤ま たはアロステリックモジュレータを包含するアゴニストおよびモジュレータは、このアッ セイプロトコルまたは他のアッセイプロトコルを用いて同定する。異なる甘味リガンドを 用いた化合物の試験を用いて、甘味リガンド、例えば選択的または汎活性化合物の１つだ け、全てまたはサブセットに対する甘味受容体の反応を調節する化合物を特定する。これ は、同じ化合物または化合物ライブラリの独立したハイスループットスクリーニングによ 40 るが、各スクリーンにおいて１以上の異なる甘味リガンドを用いて行う。 【１２３６】 反応曲線（例えば、減衰速度または大きさまたは反応）の一時的速度を調べることによ って、他の定性的および定量的効果を有する化合物の調節を確認する。 甘味試験 【１２３７】 甘味細胞ベースのアッセイを用いて特定した化合物を、当該技術分野における標準的技 法に準拠した当業者に周知のヒト官能検査で試験した。化合物をそれらの固有の味特性（ 例えば甘味、苦味、旨味、塩味、酸味、清涼味もしくは辛味および味落ち）ならびに食感 、しびれ、痛み、刺激および刺痛などの知覚され得る他の性質または特性について試験す 50 (417) JP 2012-516687 A 2012.7.26 る。試験は、液体、半固体、固体、粉末、錠剤、ゲル、ガム、スプレー、可溶性ストリッ プ、食品もしくは飲料品を含む１以上の異なる形式またはマトリックスで実施する。化合 物を含む試料および化合物を含まない試料を評価して、当該化合物の知覚特性を検出する 。様々な用量の化合物を試験することができる。ある実験では、化合物を、味のある他の 化合物または成分をさらに含む試料において試験し、そのような味の変化、改変、向上、 増強、または阻害を評価する。化合物は、エタノールなどのアルコール、ＤＭＳＯまたは 他の溶媒をはじめとする、溶解させるために設計された薬剤の存在下で提供することがで きる。試料を、加熱するか、冷却するか、または室温で試験することができる。化合物を 、甘味または他の味を向上またはブロックするそれらの能力についても試験する。官能検 査は、臭いに関連する効果を識別するために、ノーズクリップを場合によっては使用して 10 実施する。味覚試験は、「シップ／スピット」モードを用いて実施し、この場合、低濃度 の化合物を用いて、人体暴露を制限する。化合物を試験して、１以上の甘味リガンドおよ び甘味料の知覚に対するそれらの影響を決定する。当該化合物に暴露されるか、または当 該化合物を評価するヒトまたは動物対象は、インビボ活性のパターンを化合物と関連づけ るために、機能的脳イメージングまたは他のイメージング試験（例えば、磁気共鳴イメー ジング）を用いて研究することができる。 実施例３９ 安定な嗅覚受容体発現細胞系の生成 工程１−トランスフェクション 【１２３８】 ２９３Ｔ細胞を２つの独立したプラスミド（１つはヒト嗅覚受容体（配列番号１３４∼ 20 １３５の１つ）をコードし、もう１つはヒトＧα１５シグナリングタンパク質（配列番号 １３３）をコードする）とともにコトランスフェクトした。当業者には理解されるように 、選択された宿主細胞と併用するのに適した任意の試薬を用いて、核酸、例えば、プラス ミド、オリゴヌクレオチド、または標識されたオリゴヌクレオチドを、適切に最適化した 宿主細胞中に導入することができる。核酸を宿主細胞中に導入するために使用することが できる試薬の例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２ ０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６、ＤＯＴＡＰ／Ｄ ＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、およびＦｅｃｔｕｒｉｎが挙げられるが、これらに限 定されるものではない。薬剤選択は、本明細書中に記載される方法では任意であるが、本 発明者らはプラスミド１個あたり１個の哺乳動物薬剤耐性マーカーを含めた。ここで使用 30 するプラスミドは、嗅覚受容体遺伝子またはＧα１５遺伝子の発現のためのＣＭＶプロモ ータを含む。シグナリングプローブによる検出のための、標的配列を含むタグをコード化 する非翻訳配列も各プラスミド中に存在するので、タグは嗅覚受容体またはＧα１５転写 産物と同時転写され、融合した。タグは、シグナリングプローブとハイブリダイズできる 標的配列を含む。使用した標的配列は、標的配列１（配列番号１２９）、および標的配列 ２（配列番号１３０）であり、使用したタグ配列は、タグ配列１（配列番号１３６）およ びタグ配列２（配列番号１３７）であった。これらの例では、着臭剤遺伝子をコードする プラスミドは標的配列１を含み、Ｇα１５遺伝子をコードするプラスミドは標的配列２を 含む。 工程２−選択工程 40 【１２３９】 トランスフェクトされた細胞を１∼４日間、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ の修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、続いて抗生物質含有ＤＭＥＭ−ＦＢＳ中 で増殖させた。抗生物質含有期間に次のように培地に抗生物質を添加した：ピューロマイ シン（０．３ｕｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（１１０ｕｇ／ｍｌ）、ピューロマイ シン（０．１５ｕｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（７５ｕｇ／ｍｌ）、およびピュー ロマイシン（０．０５ｕｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（１８ｕｇ／ｍｌ）。 工程３−細胞継代 【１２４０】 抗生物質選択によって濃縮した後、そして蛍光発生シグナリングプローブの導入前に、 50 (418) JP 2012-516687 A 2012.7.26 細胞を抗生物質選択の非存在下でさらに３∼１５回（ｐ３∼ｐ１５）継代して、選択され た期間にわたって安定でない発現が沈静化するために時間をとった。 工程４−蛍光発生シグナリングプローブへの細胞の暴露 【１２４１】 細胞を収穫し、シグナリングプローブ（配列番号１３１および１３２）でトランスフェ クトした。当業者には理解されるように、選択された宿主細胞との併用に適した任意の試 薬を用いて、核酸、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、標識されたオリゴヌクレオ チドを、適切に最適化された宿主細胞中に導入することができる。核酸を宿主細胞中に導 入するために使用できる試薬の例としては：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅ ｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴＦＸ試薬、Ｆｕｇｅｎｅ６ 10 、ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｉｎｅ、またはＦｅｃｔｕｒｉｎが挙げられ るが、これらに限定されるものではない。 シグナリングプローブにより検出される標的配列 標的配列１ 【１２４２】 ５’−ＧＴＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１２９ ） タグ配列１（標的配列は太字） （着臭剤）５’− ＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴ ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＣ 20 ＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＣＣＴ ＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１ ３６） 標的配列２ 【１２４３】 ５’−ＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣ−３’（配列番号１３０ ） タグ配列２（標的配列は太字で標示）（着臭剤） ５’− ＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴ 30 ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣ ＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＴ ＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＧＴＴ ＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧ ＧＡＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣＴ ＧＣ−３’（配列番号１３７） シグナリングプローブ 【１２４４】 シグナリングプローブを１００μＭストックとして供給した。 シグナリングプローブ１は標的１を結合する 40 【１２４５】 ５’−Ｑｕａｓａｒ６７０ ＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＡＧ ＡＡＣＣＴＣＧＣ ＢＨＱ２ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号１３１） シグナリングプローブ２は標的２を結合する 【１２４６】 ５’−Ｃｙ５．５ ＧＣＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣ ＴＣＧＣ ＢＨＱ２ ｑｕｅｎｃｈ−３’（配列番号１３２） 【１２４７】 ＤＮＡプローブではなく５−ＭｅｄＣおよび２−アミノｄＡミキシマープローブを数例 では使用したことにも注意。 50 (419) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【１２４８】 スクランブル化非標的６−Ｆａｍプローブを送達対照（不掲載）としていくつかの実験 において使用した。 工程５−陽性細胞の単離 【１２４９】 細胞を解離させ、蛍光活性化細胞分類（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍ ｉ， ＦＬ）を用いた分析および分類のために集めた。標準的解析法を使用して、バック グラウンドより高い蛍光を発する細胞をゲートで制御し、バーコード化した９６ウェルプ レート中へのゲート内にある個々の細胞を単離した。ゲート制御階層は次のとおりであっ た：コインシデンスゲート＞シングレットゲート＞ライブゲート＞ソートゲート。このゲ 10 ート法を用いて、ダブルポジティブな細胞の上位０．１∼２％を、バーコード化９６ウェ ルプレート中に分類するために標識した。 工程６−工程２∼５および／または３∼５のさらなるサイクル 【１２５０】 実験を、非常に厳密に時間が決められたロジスティックで段階に分けた。このプロトコ ルの一部として、重複した分類を完了し、さらなるクローンを得るために工程２∼５また は３∼５のフルサイクルを２回実施した。 工程７−細胞の集団についての増殖速度の推定 【１２５１】 プレートをＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓｔａｒ自動化液体ハンドラーに移し 20 た。２∼３日馴化増殖培地：１００単位のペニシリン／ｍｌ＋０．１ｍｇ／ｍｌのストレ プトマイシンを追加した新鮮な増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）の１：１ミックス中 、２０日まで、細胞をインキュベートした。プレートを分類後７∼３０日に撮像して、ウ ェル（Ｇｅｎｅｔｉｘ）の集密度を測定した。プレート全体にわたって信頼できる画像を 取得するために、各プレートに焦点を合わせた。７０％を超える報告された集密度は信頼 性がなかった。前記で特定された時間にわたって３回集密度測定値を得、増殖速度を計算 するために使用した。 工程８−増殖速度推定値にしたがった細胞集団のビン化 【１２５２】 細胞を、分類後約２０∼３０日に増殖速度にしたがってビン化した（独立して分類し、 30 コホートとしてプレーティングした）。ビンを独立して集め、下流の処理のために個々の ９６ウェルプレート上にプレーティングし、特定のビンにつき２以上の標的プレートが存 在し得る。増殖速度の広がりを考慮し、細胞集団の合計数の少なくとも約３０∼９０％（ 推定値として）の高いパーセンテージを対象とする範囲を含めることによって、ビンを計 算した。９の増殖ビンを使用し、異なる嗅覚受容体細胞系にわたるビン全体について平均 区分は約１５∼４０時間であった。したがって、各ビンは、約１∼５時間の増殖速度また は集団倍加時間の差に相当した。 【１２５３】 同時に増殖速度にしたがって合理的にビン化され得る最も多様なクローンを処理するた めに、細胞は１日未満から２週間超までの倍加時間を有し得；本発明者等によると、典型 40 的には１つのビンあたり３∼９ビンを０．２５∼０．７日の倍加時間で行うのが好ましい 。当業者は、特定の状況にしたがってビンのタイトさおよびビンの数を調節する方法、な らびに細胞がそれらの細胞サイクルに関して同期する場合に、ビンのタイトさおよび数を さらに調節できることを理解するであろう。この実施例では、１５∼４０時間の倍加時間 を有する細胞を、ビンのタイトさを増大させるためにビン化に関して選択する。 工程９−パラレルプロセッシングを加速し、ストリンジェントな品質管理を提供するた めのレプリカプレーティング法 【１２５４】 プレートを標準的および固定条件（加湿３７．５％ＣＯ２／９５％空気）的条件下、Ｄ ＭＥＭ培地／抗生物質（１００単位のペニシリン／ｍｌ＋０．１ｍｇ／ｍｌのストレプト 50 (420) JP 2012-516687 A 2012.7.26 マイシン）を含む１０％ＦＢＳ中でインキュベートした。細胞のプレートを分割して、４ セットの標的プレート（このセットはすべての増殖ビンを有する全プレートからなり、こ れらの工程により、当初のセットの４つの複製が存在することを保証した）を得た。３セ ットまでの標的プレートを低温保存（下記参照）に付し、残りのセットを拡大し、継代お よび機能的アッセイ実験のためにさらにレプリカプレーティングした。別個の独立組織培 養試薬、インキュベータ、人員および二酸化炭素源を各セットのプレートに使用した。品 質管理工程は、全ての組織培養試薬の適切な産生量および品質を保証するために採用した ：使用するために準備する培地の各ボトルに添加する各成分は、１人の指定された人がそ の試薬のみを含む指定された１つのフード中で添加し、その間、もう１人の指定された人 が間違いを避けるために監視した。液体取り扱いの条件は、ウェル全体にわたる相互汚染 10 をなくすように設定した。全工程で新しいチップを使用するか、または厳密なチップ洗浄 プロトコルを使用した。液体取り扱い条件を、正確な体積移動、効率的な細胞操作、洗浄 サイクル、ピペッティング速度および位置、細胞分散のためのピペッティングサイクルの 数、およびプレートに対するチップの相対的な位置について設定した。 工程１０−細胞の集団の初期継代ストックを凍結する 【１２５５】 ２組のプレートを−７０∼−８０℃で凍結させた。各組のプレートをまず７０∼１００ ％の細胞集密度に到達させた。培地を吸引し、培養培地または９０％ＦＢＳおよび１０％ ＤＭＳＯを添加した。プレートをパラフィルム（登録商標）で密封し、次いで個々に１∼ ５ｃｍの発泡体で包囲し、−８０℃の冷凍庫中に入れた。 20 工程１１−安定な細胞系を産生するための方法および初期変形工程の条件 【１２５６】 残りの２セットのプレートを工程９で前述したように維持した。全ての細胞分裂は、培 地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングおよび細胞 分散工程を含む液体取り扱い工程を用いて実施した。 工程１２−再配列されたプレート中の細胞の機能性の試験 細胞および全ての細胞の集団についての培養条件の一貫性および標準化を制御した。増 殖速度の若干の差異が原因のプレート全体にわたる差異を、プレート全体にわたる細胞数 の正規化によって制御し、再配列後２∼８継代ごとに生じた。外れ値の細胞の集団を検出 し、除外した。 30 工程１３−細胞集団の特性化 【１２５７】 クローンを分類後３．５∼６週間の間にスクリーニングし、上位のクローンを機能的に 再試験し、分類後５∼６週間で同定した。細胞を６週間まで維持して、これらの条件下で インビトロで進化させた。この期間中、本発明者等は、サイズ、形態、脆性、トリプシン 処理に対する反応もしくは解離、解離後の丸さ／平均的真円度、生存率（％）、マイクロ 集密度への傾向、または培養プレート表面への接着性などの細胞維持の他の態様を観察し た。 工程１４−細胞の集団の潜在的機能性の評価 【１２５８】 40 機能基準を用いて細胞の集団を試験した。カルシウム動員色素Ｆｌｕｏ−４（Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用した。ｈ−ＯＲを安定して発現するＨＥＫ ２９３Ｔ細胞系を、標準的細胞培養条件下、１０％ウシ胎仔血清およびグルタミンを添加 したＤＭＥＭ培地中で維持した。アッセイ前日に、細胞をストックプレートから収穫し、 黒色透明底の３８４ウェルアッセイプレート中にプレーティングした。アッセイプレート を、３７℃の細胞培養インキュベータ中、５％ＣＯ２下で２２∼４８時間維持した。培地 を次いでアッセイプレートから除去し、緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ 、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグ ルコース、ｐＨ７．０）中で希釈したカルシウム動員色素（Ｆｌｕｏ−４， Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を添加し、クエンチャーとしてのＴｒｙｐａ 50 (421) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ｎ Ｕｌｔｒａ Ｂｌｕｅ（ＡＢＤ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ， ＣＡ）とともに３７℃で１時 間インキュベートし、そして前記緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍ ＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコー ス、ｐＨ７．０）中で希釈した。前記クエンチャーを、当該技術分野で周知のクエンチャ ー、例えば、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）、アシッドバイオレット１７（ＡＶ１７）、ジ アジンブラック（ＤＢ）、ＨＬＢ３０８１８、ブロモフェノールブルー、ＨＬＢ３０７０ １、ＨＬＢ３０７０２、ＨＬＢ３０７０３、ニトラジンイエロー、ニトロレッド、ＤＡＢ ＣＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＱＳＹ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ ｅｓ）、金属イオンクエンチャー（例えば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋）、およびヨ ウ化物イオンと置換してもよい。アッセイプレートを次いで蛍光プレートリーダー（Ｈａ 10 ｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）にかけ、前記緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣ ｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭの グルコース、ｐＨ７．０）中に溶解させたアゴニスト（ＯＲ３Ａ１について４．５ｍＭの ＨｅｌｉｏｎａｌおよびＯＲ１Ｄ２について０．３ｍＭのＢｏｕｒｇｅｏｎａｌ−図２９ Ａ、２９Ｂ）を添加した。細胞を３８４ウェルプレート中、複数の異なる密度で試験し、 反応を分析した。プレーティング後の様々な時点、例えばプレーティング後１２∼４８時 間を使用した。様々なプレーティング密度をアッセイ反応差異について試験した。 【１２５９】 図２９Ａは、対照としてのＤＭＳＯビヒクルバックグラウンドシグナルと比較して、ヒ ト嗅覚受容体ＯＲ３Ａ１を発現する細胞のＨｅｌｉｏｎａｌ（４．５ｍＭの最終濃度まで 20 ）に対する機能的細胞ベースの反応の代表的な曲線を示す。試験曲線および対照曲線を重 ね合わせる。蛍光カルシウムシグナリング色素を用いてカルシウムフラックスを報告する ために設計された細胞ベースのアッセイの図２９に提示した結果から、細胞がＨｅｌｉｏ ｎａｌに対してバックグラウンドよりも高い反応を示すことがわかる。 【１２６０】 図２９Ｂは、対照としてのＤＭＳＯビヒクルバックグラウンドシグナルと比較して、Ｂ ｏｕｒｇｅｏｎａｌ（０．３ｍＭの最終密度まで）に対してヒト嗅覚受容体ＯＲ１Ｄ２を 発現する細胞の機能的細胞ベースの反応の代表的な曲線を示す。試験および対照曲線を重 ね合わせる。蛍光カルシウムシグナリング色素を用いてカルシウムフラックスを報告する ために設計された細胞ベースのアッセイの図２９Ｂに示した結果から、細胞がバックグラ 30 ウンドよりも高いＢｏｕｒｇｅｏｎａｌに対する反応を示したことが分かる。 【１２６１】 低および高継代数で実施した実験から得られる機能的反応を比較して、分類後６から４ ０週間の範囲の所定の期間にわたって最も一貫した反応を有する細胞を特定する。経時的 に変化する細胞の他の特性、例えば、細胞が解離後に再付着する時間も記録する。 工程１６−細胞のさらなる評価 【１２６２】 機能的基準および他の基準を満たす細胞の集団をさらに評価して、生存可能な安定で機 能的な細胞系の産生に最も適したものを決定する。選択された細胞の集団をさらに大きな 組織培養容器中で増殖させ、前述の特性化工程をこれらの条件下で継続するかまたは繰り 40 返す。この時点で、一貫した信頼性のある継代のために、さらなる標準化工程を導入する 。これらには、異なるプレーティング細胞密度、プレートコーティング、継代時間、培養 皿サイズ／形式およびコーティング、流体工学最適化、細胞解離最適化（例えば、細胞解 離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）対トリプシンの存在下での解離）、使用する解離試薬 の体積、および解離時間の長さ）、ならびに洗浄工程が含まれる。グルタミン濃度は培地 によって変わる量である。さらに、各継代での細胞の生存率も測定する。手動介入を増や し、細胞をさらに綿密に観察し、モニタリングする。この情報を用いて、所望の特性を保 有する最終的細胞系を特定し、選択するのに役立てる。一貫した増殖、一貫した（すなわ ち形態が変わらない）適切な接着性、ならびに機能的反応を示す最終的細胞系およびバッ クアップ細胞系を選択する。 50 (422) JP 2012-516687 A 2012.7.26 工程１７−細胞バンクの確立 【１２６３】 最終細胞系およびバックアップ細胞系に対応する低継代凍結プレート（前記参照）を３７ ℃で解凍し、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳで２回洗浄し、加湿３７℃／５％ＣＯ２条件中で インキュベートする。細胞を次いで２∼３週間増殖させる。２５∼５０バイアルからなる 、それぞれ最終およびバックアップ細胞系の細胞バンクを確立する。さらなる最適化実験 から得られる細胞を５０％ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、４０％ＦＢＳ、および１０％ＤＭＳ Ｏ中で冷凍保存する。 工程１８−細胞バンクの試験 【１２６４】 10 解凍した細胞系（増殖させ、再凍結したもの）の凍結ストックを含む細胞バンクからの 少なくとも１つのバイアルを解凍し、培養で増殖させる。結果として得られる細胞を試験 して、これらがもともと選択されたもととなる同じ特性を満たすことを確認する。 実施例４０ 天然の嗅覚受容体機能に関する細胞系の特性化 【１２６５】 嗅覚受容体を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のリガンド誘発性反応性を同定し、測定する ために、細胞内カルシウムレベルの受容体により誘発された改変を測定することによって 、受容体活性化をモニタリングする。細胞を、黒色透明底のプレート中、標準的増殖培地 中で一夜増殖させるか、またはアッセイ緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ 、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグ 20 ルコース、ｐＨ７．０）中懸濁液として黒色透明底のプレートに添加する。細胞を、１時 間室温で、クエンチャーとしてＴｒｙｐａｎ Ｕｌｔｒａ Ｂｌｕｅ（ＡＢＤ Ｂｉｏｑ ｕｅｓｔ、ＣＡ）を含む緩衝液中、前記緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ 、２ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグ ルコース、ｐＨ７．０）中で希釈した、無洗浄カルシウム感受性蛍光色素Ｆｌｕｏ−４（ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートする。前記同定されたクエンチャーを当 該技術分野で周知のクエンチャー、例えば、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）、アシッドバイ オレット１７（ＡＶ１７）、ジアジンブラック（ＤＢ）、ＨＬＢ３０８１８、トリパンブ ルー、ブロモフェノールブルー、ＨＬＢ３０７０１、ＨＬＢ３０７０２、ＨＬＢ３０７０ ３、ニトラジンイエロー、ニトロレッド、ＤＡＢＣＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ 30 ｅｓ）、ＱＳＹ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、金属イオンクエンチャー（例え ば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋）、およびヨウ化物イオンにより置換することができ る。細胞プレートおよび試験化合物（０．０１μＭ∼１００ｍＭ）を、装置が試験化合物 を細胞に添加する前、添加中、および添加後のプレート蛍光の画像を集めるハイスループ ット蛍光プレートリーダー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）中に入れる。画像のソフト ウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＦＤＳＳ）分析は、細胞プレート中の各ウェルについての 相対的蛍光における変化を報告する。 【１２６６】 その多くが着臭剤として報告された種々の化合物および抽出物を、嗅覚受容体細胞系な らびに対照細胞全体に亘って分析して、活性を測定し、脱オーファン化する。 40 実施例４１ 嗅覚受容体発現細胞系における機能的反応の均一性 【１２６７】 嗅覚受容体はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であるので、種々の化合物の存在下 で異なる嗅覚受容体間の反応の有意な比較を行うためには、Ｇタンパク質共役受容体が異 なる細胞系において一様に機能することを見いだすことが重要である。Ｇタンパク質共役 アゴニストの濃度範囲全体にわたる種々の細胞系の相対的反応は均一でなければならない 。このことを確かめるために、様々な嗅覚受容体およびマウスＧα１５タンパク質を発現 する全ての細胞系のＧα１５介在性受容体反応を、イソプロテレノール（細胞において内 因的に発現されるβ−アドレナリン受容体のアゴニスト）の濃度を変えて、用量反応曲線 実験で試験する。この内因性受容体は、刺激された場合、発現されたＧα１５とカップリ 50 (423) JP 2012-516687 A 2012.7.26 ングし、細胞内遊離カルシウムの変化を誘発し得る。反応（％）をイソプロテレノール濃 度の関数としてプロットし、結果を曲線に適合させて、ＥＣ５０値（最大半量の受容体活 性化の濃度）を計算する。 実施例４２ 機能的に反応する広く調整された受容体、中程度に調整された受容体、およ び選択的受容体の同定 【１２６８】 本明細書中（すなわち、実施例３９）に記載される方法を用いて生成させた、天然のヒ ト嗅覚受容体遺伝子を安定して発現する細胞系を、機能的細胞ベースの受容体研究におい て試験して、化学的に多様な化合物のコレクションによるそれらの活性化を検出する。こ れにより、広く調整された受容体、それほど幅広くないが、狭い範囲で調整された受容体 10 の同定が可能になる。 実施例４３ 化合物のライブラリにより活性化された受容体の同定 【１２６９】 嗅覚受容体細胞系のそれぞれに対する化合物のライブラリの活性を試験する。化合物を 添加した際の受容体活性についての機能的細胞ベースのアッセイにおいてデータを得、受 容体の定常活性（すなわち、緩衝液単独を添加した際の受容体活性）を上回る活性のパー セントとして表す。各受容体での各化合物の活性を次いで記号化して、各受容体で低い活 性（例えば、定常活性よりも＜１００％高い；白色）、中程度の活性（例えば、定常活性 よりも１０１∼５００％高い；薄灰色）、高（例えば、定常活性よりも５０１∼１０００ ％高い；暗灰色）または極めて高い活性（例えば、定常活性よりも＞１００１％高い、黒 20 色）を有する化合物を強調する。結果として得られるパターンを用いて、選択的に、また は嗅覚受容体全体にわたって広範囲のいずれかで活性である化合物、および化合物の化学 的に多様なセットに対して広範囲または選択的反応のいずれかを示す受容体をグラフで表 示する。データの分析を用いて、対象の化合物で特定の嗅覚受容体または嗅覚受容体活性 のパターンを帰属または同定し、ブロッカーおよびポテンシエーターをはじめとするモジ ュレータを同定する。このデータの分析を用いて、嗅覚受容体活性のパターンを、試験し た対応する着臭剤の生理学的効果と関連づけることもできる。 実施例４４ アゴニスト誘導性嗅覚受容体活性の拮抗物質と同様の機能活性を有する化合 物の類似体の同定 【１２７０】 30 嗅覚受容体発現細胞ベースのアッセイが類似した機能活性を有する化合物の類似体を同 定する能力を試験するために、既知モジュレータまたは調節化合物の構造類似体を、それ らの嗅覚受容体のアゴニスト誘導性受容体活性を阻害する能力について試験する。アゴニ ストにより誘発される嗅覚受容体の活性を阻害する類似体の構造を比較する。したがって 、嗅覚受容体発現細胞系は、有力な嗅覚受容体拮抗物質を見いだすのに役立つ可能性があ る。異なる活性（例えば、増強、作動、遮断など）を有するモジュレータは、当業者に公 知のように、アッセイおよび試験を行い、結果分析を実施することによっても同定される 。 【１２７１】 前述の本発明の実施形態は、単に例示的であることが意図され、当業者らは、本明細書 40 中に記載する具体的な手順の多くの同等物を理解するか、または慣例の実験のみを用いて 確かめることができるであろう。そのような同等物は全て本発明の範囲内に含まれると見 なされ、以下の請求項の対象である。さらに、当業者らは、説明および請求のためにある 特定の順序で記載しなければならないが、本発明はそのような特定の順序以外の種々の変 更を想定することを理解するであろう。 【１２７２】 本明細書中で記載する全ての参考文献は、それらの全体として参照することによって本 明細書中に組み込まれ、それぞれの刊行物または特許または特許出願が具体的かつ個別に 記載されているのと同程度に全ての目的に関してその全体において参照により組み込まれ る。 50 (424) 【図１】 【図２】 【図３】 【図４Ａ】 【図４Ｂ】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (425) 【図４Ｃ】 【図５Ａ】 【図４Ｄ】 【図５Ｂ】 【図５Ｃ】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (426) 【図５Ｄ】 【図５Ｅ】 【図６】 【図８】 【図７】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (427) 【図９】 【図１１】 【図１２】 【図１０】 【図１３】 【図１５】 【図１４】 【図１６】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (428) 【図１７】 【図１８Ａ】 【図１８Ｂ】 【図１８Ｃ】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (429) 【図１８Ｄ】 【図１９】 【図２０】 【図２２】 【図２１】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (430) 【図２３】 【図２４】 【図２５】 【図２６Ａ】 【図２６Ｂ】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (431) 【図２７Ａ】 【図２８Ａ】 【図２７Ｂ】 【図２８Ｂ】 【図２８Ｃ】 【図２９Ａ】 JP 2012-516687 A 2012.7.26 (432) 【図２９Ｂ】 【配列表】 2012516687000001.app JP 2012-516687 A 2012.7.26 (433) JP 2012-516687 A 2012.7.26 【国際調査報告】 10 20 30 40 (434) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (435) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (436) JP 2012-516687 A 2012.7.26 10 20 30 40 (437) JP 2012-516687 A 2012.7.26 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/00 (2006.01) Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｎ (2010.01) Ｃ１２Ｎ 5/00 ２０２Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/48 (2006.01) Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/68 (2006.01) Ｇ０１Ｎ 33/68 5/0735 (31)優先権主張番号 61/230,536 10 (32)優先日 平成21年7月31日(2009.7.31) (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 61/235,181 (32)優先日 平成21年8月19日(2009.8.19) (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 61/149,324 (32)優先日 平成21年2月2日(2009.2.2) (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM), 20 EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,S K,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR, BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,I S,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE ,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW (72)発明者 ソーチャック，デニス アメリカ合衆国，ニュージャージー州 ０７０２３，ファンウッド，１８３ エヌ．マーチン ア ベニュー (72)発明者 スハー，パーヴィ，マノジュ アメリカ合衆国，ニュージャージー州 ０８９０２，ノース ブランスウィック，１１３５ アレ ックス ドライブ Ｆターム(参考) 2G045 AA24 BB20 BB50 BB51 CB01 FA11 FB12 4B024 AA11 CA04 DA02 DA11 DA12 EA04 FA01 GA11 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ07 QQ08 QQ13 QQ16 QQ19 QR33 QR60 QR76 QR77 QR80 QS05 QS36 QX02 4B065 AA57X AA90X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA46 4H045 AA30 DA50 EA50 FA74 30