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本日の内容 保険収載と 測定検査薬 キット 遺伝情報サービス産業
11.12.20 （2011年12月19日） 個人遺伝情報取扱協議会 勉強会 「遺伝子関連検査の検体取扱いの重要性と 精度保証に向けた取組み」 日本臨床検査標準協議会 ISO/TC212国内委員会 日本臨床検査医学会遺伝子委員会 遺伝子分析科学認定士制度試験委員会 東海大学医学部基盤診療学系臨床検査学 宮地勇人 保険収載と 測定検査薬 キット 「遺伝子関連検査の検体取扱いの重要性と 精度保証に向けた取組み」 本日の内容 • • • • 遺伝子関連検査の動向 精度保証、標準化の現状と課題 測定前プロセスの標準化 今後の展望 遺伝子を指標に薬物治療 （個別化医療） 疾患（肺がん）の診断 ●施設 非小細胞 肺がん縮小 イレッサ 独自の 間質性肺炎 （死亡） 測定法 感染症 ファーマコゲノミクス検査 コンパニオン検査診断 （治療薬物の反応性予測） 非小細胞 EGFR イレッサ 肺がん縮小 がん 遺伝性疾患 遺伝子情報が指標となりうる疾患と治療 標的 治療標的 PML-RARA 薬剤 ATRA BCR-ABL Imatinib 疾患 急性前骨髄性白血病 慢性骨髄性白血病 HER-2受容体 Trastuzumab 乳がん EGFR Iressa, Tarceva 非小細胞肺がん Warfarin Phenytoin 血糖降下剤 プロトンポンプ阻害薬 三環系抗うつ薬 血栓性疾患 痙攣疾患 糖尿病 消化性潰瘍 うつ病 多型（代謝 チトクローム 酵素） P450 NAT2 TPMT Isoniazid 全ての Mercaptopurine 疾患領域 結核 DPYD Fluorouracil 白血病 消化器がん、乳がん UGT1A1 Irinotecan 肺癌 HMG-CoA還元酵素阻害剤 動脈硬化 Tacrine アルツハイマー病 多型（疾患 CETP 関連） APOE-4 遺伝情報サービス産業 有用性 ホームページより：肥満遺伝子 確立していない 予測力低い • 太る原因がわかりやすくなります。 • 体のどこに脂肪がつきやすい体質なのかが分 かります。 • 肥満遺伝子の存在と生活習慣病は関連がある ので生活習慣病の予防につながります。 • 肥満遺伝子は生涯変わることはありません。 よって、中長期的な体重管理・健康管理に役 立ちます。 研究段階 • 自分に適したダイエット方法がわかります。 1 11.12.20 体質検査（遺伝子多型）の意義 基礎研究から一般利用へ 基礎研究 臨床研究 応用研究 厚生研究 技術の 病気発症に関する 臨床的 臨床的 費用対 確立 遺伝子の発見： 分析的 妥当性有用性 効果 再現性の確認 妥当性 遺伝子情報 サービス産業 パイロット 政策 スタディ 測定精度？ 臨床的妥当性？ 一般 利用 ◆ 初期に報告された関連の多くが追試において確 認されない、または弱い関連 ◆ 因果関係は明確でない。 ◆ 検査の陽性結果が生活習慣の改善に結びつくか ◆ 生活習慣改善が検査陽性患者のみ有益なのか ◆ 結果に基づく介入、すなわちリスクを低下する 行為により健康上の有益性が得られるか 保険医療 研究段階 遺伝子関連検査の普及と課題 • 研究から臨床への展開 ‒ ヒトゲノム解読、分子標的療法 →ゲノム医療（予防、個別化医療） ‒ 臨床検査サービス参入 個人遺伝情報を取り扱う事業 患者 一般消費者 医師 取次 DNA 事業 検査機関 研究 受託解析 DNA 製薬 医療機関 検査 保存 (エステ （衛生 機器 情報処理 鑑定 サービス通販 事業 （病院等） 事業 検査所） 事業 事業 事業 事業 健康 サービス) • 研究者、研究機関の参入 ‒ 遺伝情報サービスの社会浸透 （医療→健康産業） • 医療従事者の不慣れ • 医療、ヘルスケアでの枠組み？ 国内どこでも 海外の検査機関 良質な検査 OECD「分子遺伝学的検査における精度保証 に関するガイドライン草案」 （Organization for Economic Cooperation and Development 経済協力開発機構） 趣旨：分子遺伝学的検査の質的保証を確保するため、政府、 専門家機関及び臨床検査機関等における必要な取組事項 国内の を記載し、各国に政策提言を行う。 動向は？ 適用範囲：生殖細胞系列の遺伝学的検査 Japanese Committee of Clinical Laboratory Standards:JCCLS 日本臨床検査標準協議会（NPO法人） 遺伝子検査標準化専門委員会 官 経済産業省 厚生労働省 JCCLS 項目 主な内容 検査の質保証 ・検査機関に対する認定システムの導入 ・認定を受けるインセンティブを付与 ・認定システムの国際的な協調、協力 日本衛生検査所協会 技能試験 ・技能試験を、認定システムの中に含む ・技能試験を受けるインセンティブを付与 ・検査機関に対するモニタリング 診断薬企業 日本バイオインダストリー協会 検査結果の報告 ・検査結果の取扱い ・必要となる報告の内容 ISO/TC212臨床遺伝子検査 原案作成委員会 検査機関の職員教育 ・検査に従事する者の水準や資格 産 個人遺伝情報取扱協議会 学 日本臨床検査医学会 日本臨床検査自動化学会 日本臨床化学会 日本遺伝診療学会 日本人類遺伝学会 日本臨床衛生検査技師会 2 11.12.20 JCCLS日本臨床検査標準協議会 遺伝子検査標準化専門委員会の機能 委員会の目的 ① 国際情報、国内動向の情報収集と集約 （遺伝子関連検査の現状マップ） ② 諸課題の抽出と検討 ③ 国内各方面の意見調整と 国際的な事項への対応 精度保証システム下で分析的妥当性あるデータが蓄積される 体制構築が、臨床的妥当性、臨床的有用性の確立 に重要な課題との認識を共有し、取組みを強化 ①検査の実用化の促進と適切な導入推進 ②機器、試薬、測定者における施設間差解消と 検査標準化、精度の維持向上 ③検査機関や測定者の質的レベルの向上 ④適正な利用の促進と医療環境整備 ⑤医療従事者、患者、一般国民の理解向上と基盤整備 ⑥精度保証管理体制をめぐる国際的環境との調整調和 国内外の活動 OECD� OECD� ISO� ガイドライン� ガイドライン� TC212� 草案� 発行� NWIP� UNESCO� 遺伝情報� 遺伝子関連検査（ヒト由来材料） CDC� ガイドライン� CLSI� ガイドライン� 海外 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 日本 遺伝学的� 個人� 検査� 遺伝情報� ガイドライン�ガイドライン� 遺伝性� 疾患� 保険収載� PGx検査� 保険収載� 関連検査 マップ 2006/2007 検体品質 ベスト 遺伝学的 管理 プラクティス検査診断 マニュアル ガイドラインガイドライン PGx 検査指針 希少疾患 ガイドライン JCCLS: Japanese Committee of Clinical Laboratory Standards (NPO) 日本臨床検査標準協議会 遺伝子関連検査 現状マップ （国内版） 検査前フェース 検 査 依 頼 様々な 工程と役割 検 査 実 施 検査依頼者 検査ネットワーク 個人情報保護 検査適正化 監督指導 測定者 測定方法 測定・機器試薬 標準物質 外部精度管理 検査後フェース 報 告 報告（書） 検査利用 ヒト遺伝子（内在性） ①病原体 遺伝子検査 （核酸検査） ②体細胞 ③生殖細胞系列遺伝子検査 遺伝子検査（遺伝学的検査） 白血病 悪性リンパ腫 固形腫瘍 ウイルス・細菌等 ・肝炎ウイルス ・結核菌群 ・クラミジア ・淋菌 単一遺伝子疾患 疾患 体質診断 薬物 ・遺伝性疾患 応答性 ・家族性腫瘍 易罹患性・アルコール ・肥満 個体識別 確定診断検査 保因者検査 発症前検査 ゲノム 薬理学 ガイドライン 検査機関 検査フェース ヒト以外の 遺伝子(外来性) 遺伝子 関連検査 現状マップ （国内版） 検査依頼者 病原体遺伝子検査遺伝子検査 （病原体核酸） 遺伝学的検査 （ヒト体細胞遺伝子） （生殖細胞系列遺伝子） アルコール、 環境・ 肝炎・結核等 白血病 がん等 食品 等 単一遺 薬物 疾患 肥満 伝子病 代謝 リスク 個人識別等 民間 主治医 一般消費者 臨床遺伝専門医 遺伝カウンセラー 検 検査ネットワーク企業 いでんネット/自動化学会 査 個人情報保護 医療・介護関係者個人情報（遺伝情報）保護ガイドライン 依 検査適正化 個人遺伝情報取扱 検査適正化、精度管理委員会 協議会の自主基準 頼監督指導 検査専門医／検査管理医 個人遺伝情報保護ガイドライン 10医学会ガイドライン 日衛協指針 EBGT/エビデンスに基づく… 指導監督医 精度管理責任者 検査機関 民間 企業 病院検査室（保険医療機関） 衛生検査所 県の立入調査 民間企業 研究機関 ISO,CAP認定／認証 臨床検査技師等 研究者等 検 測定者 遺伝子分析科学認定士 日本自動化学会 染色体検査 査 測定方法 個人遺伝情報取扱 マニュアル ガイドライン 協議会の自主基準 自動化 実 測定・機器試薬 システム＊ ＊JMCoE等 施標準物質 二次的 未整備 臨床細胞遺伝学認定士 認定染色体技師 JBA (メーカー） 外部精度管理 報 報告（書） 告検査利用 日臨技 自動化学会 サーベイ サーベイ CAPサーベイ？ 臨床遺伝専門医 遺伝カウンセラー 食品 産業等 一般診療（保険診療） 個別化 個人遺伝情報取扱 協議会の自主基準 遺伝診療予防医療 健康(産業) 3 11.12.20 現状の課題のまとめ（JCCLS, 2006年） １）単一遺伝子病、薬物代謝、疾患リスク、アルコール、肥満、個人識 別等について、標準化の取組みがなされていない。 有用性、適応、精度管理の手法、方法、報告、解釈についてマニュア ルが整備されていない。 ２）一般消費者（一般医師）が適正に利用するしくみがない。 ３）指導監督、測定者の資質を評価するしくみがない。 ４）検査機関の登録、認可、立入り調査のしくみがない。 ５）外部精度評価の実施項目が限られている。 ６）実態調査と情報蓄積によるフィードバックのしくみがない。 利用者レポート、消費者レポート、エビデンス作成、保険収載の資料 作成 ７）保険収載が限られている。 ８）希少な疾患の検査体制の維持が困難である。 検査室の新たな役割 適正利用に向けて • 急速な進歩、研究から臨床応用への展開 • 項目の多さ、検査の複雑さ、多彩な検体種、 多様な測定法 • 膨大な情報（生涯不変） • 病型診断の体系化（悪性腫瘍） • 治療の展開（分子標的療法） 作業計画 （JCCLS,2007） 作業項目 作業内容 Ⅰ)包括的ガイドラ イン／ベストプラク ティスの作成 1)検査機関の指導監督、測定者の教育・訓練・資格要 件、検査機関の登録、認可、立入り調査等 2)技能試験 3)適正利用・実施・報告 4)実態のフィードバック 検体品質評価、検査の自動化/キット化、標準物質の 検討 WG-1 WG-2 Ⅱ)標準化技術の開 発の進め方 Ⅲ)外部精度評価、 技能試験 Ⅳ)適正利用・実 施・報告に関するマ ニュアル作成 Ⅴ)実態のフィード バックに関するマ ニュアル作成 各学会・CAPサーベイの調整、新規サーベイの検討 Ⅵ)一般消費者／一 般医師の啓発 方法の検討、資料作成 有用性、適応、ラベリング、 精度管理の手法、方法、報告、 利用者・消費者レポート、エビデンス作成、保険収載 検討の資料作成等の手順作成 臨床検査の精度保証→医療の質保証 検査結果 患者モニタリング の説明 適切な結果解釈 適切な検査選択 測定 後 標的 サンプリング 核酸抽出 増幅 検出 結果 報告 主要な要素 標的量 核酸塩基配列（多様性) 検体の種類(適合性と安定性) 阻害因子 採取、搬送、保存 サンプル処理、試薬 核酸劣化 汚染, 内部コントロール 方法 臨床的妥当性 解釈 採取 保存 運搬 前処理 測定前プロセス 正確な検査実施 5.000 抗HCV抗体と RNA検出 （5,395検体） 4.000 3.000 HCV-RNA(OD) プロセス 適切な検体確保 測定 結果の確認と報告 検査全プロセスの精度保証 （検査選択 サンプリング 測定 報告 解釈） 核酸増幅検査における精度保証 測定 前 2.000 高い抗体価で RNA陰性 1.000 0.000 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 Anti-HCV antibody titers 4 11.12.20 遺伝子検査の市場の展開 PGx検査における標準化プロセスの比較 UGT1A1 Molecular Assay (Sekisui Med): Invader 治療 AmpliChip CYP (Affymetrix/Roche):Array Verigene System (Nanophere): PCR 薬理ゲノミクス モニタ リング OSNA（Sysmex） eSencor XT-8 System (Osmetcch): Array 疾 患 症状 予後MammaPrint(Agilent/Agendia):Array 症 状 診断 管 理 0ncotype DX (Genomic Health):RT-PCR 2005年 7000件 2006年 14,500件 スクリー ニング 基礎研究 厚生研究 技術の 病気発症に関する 臨床的 臨床的 費用対 確立 遺伝子の発見： 分析 妥当性有用性 効果 再現性の確認 妥当性 2010年 総数175,000件効果判定 潜在 臨床研究 応用研究 MAQC: FDA MAQCII: FDA MammaPrint(Agilent/Agendia) ゲノムプロファイル 疾患リスク 23andMe deCODE genetics Navigenics 健康 疾患の 管理全体 治癒 Oncotype DX Development Step 1. Optimization of methods for quantifying gene expression in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue Biochip ASCO 核酸品質 の重要性 JMAC 悪性腫瘍におけるCompanionDiagnostics CD function Therapeutic Cancer type Diag. target Efficacy Herceptin Breast cancer Her2/neu Tamoxifen, Aromasin Breast cancer E/P receptor Erlotinib/Tarceva NSC lung cancer EGFR Erbitux Colorectal cancer EGFR Erbitux Colorectal cancer KRAS Gleevec CML BCR-ABL Gleevec GIST CKIT Rituxan NHL CD20 Tamoxifen Breast cancer CYP450 Gemzar NSCLC, Breast, Ovarian, Pancreatic RRMI Cisplatin NSCLC, Colorectal cancer ERCC1 Cisplatin NSCLC, Colorectal cancer TS Camptosar Colorectal cancer UGT1A1 Purinethol Leukemia TPMT Colorectal cancer DHPD Leukemia, Lymphoma G6PD Step 2. Selection of 250 candidate genes from the human genome 検体品質 の重要性 Step 4. Prospective clinical validation of the 21-gene panel and Recurrence Score calculation 50 45 検体数 30 25 EGFR 増幅検体数 検体品質が 検査結果、治療 選択を左右 増幅不良検体数 依頼施設の 検体品質の違い？ 20 15 10 5 0 B C D E F G H I 依頼施設 J K L M 生殖細胞系列 5-FU 遺伝子検査 Elitek 遺伝子検査の測定前プロセス ホルマリン固定パラフィン包埋組織から抽出した DNAのPCR増幅有無の施設間差 （10検体以上の16施設） 35 体細胞 遺伝子検査 Safety Step 3. Testing of candidate genes to identify an optimal gene panel for clinical validation 40 FDA 0ncotype DX (Genomic Health) 経過 A 精度保証 パイロット 一般 検体品質管理 政策 スタディ 利用 に依存 N O P 手術材料のFFPEよりQIAquick DNA Mini Kit（QIAGEN）を用いて 回収したDNAでPCR（190bp）増幅不良検体が出現（ 検体） サンプ リング ↓ 保存 ↓ 搬送 ↓ 前処理 ↓ 核酸抽出 採取部位、検体の種類、性状は多様 物理的・化学的・生物的性状、増幅阻害因子 検体採取とその後の管理は用手法、" 施設や作業担当者によって異なる方法 検体性状に応じた個別の方法： 施設や測定者（検査者）によって異なる 方法、技術差 重要な課題：作業工程の標準化による" 検査の品質保証体制の確立 5 11.12.20 １． 遺伝子関連検査における 検体保存と運搬 1.1 病原体遺伝子検査（病原体核酸検査） 1.1.1 血清・血漿等 1.1.2 尿 1.1.3 喀痰 1.2体細胞遺伝子検査 1.2.1 組織・組織切片 1.2.2 血液・血球 1.2.3 尿・糞便 1.3遺伝学的検査（生殖細胞系列遺伝子検査） 1.3.1外部委託による遺伝学的検査の実施 ２．遺伝子関連検査における 検体取扱い 2.1病原体遺伝子検査（病原体核酸検査） 2.1.1 血清 2.1.2 血漿 2.1.3 喀痰 2.1.4 糞便 2.1.5 尿 2.1.6 血液（白血球）、骨髄 2.1.7 胸水、腹水、心嚢液、膵液、気管支肺胞洗浄液等 2.1.8 リンパ節、固形組織（生検、手術材料） 2.2 体細胞遺伝子検査 2.3遺伝学的検査（生殖細胞系列遺伝子検査） 2.3.1 血液（白血球） 2.3.2 口腔粘膜 2.3.3 毛髪 2.3.4 爪 2.3.5 血痕 2.3.6 臍帯（へその緒） ３．遺伝子関連検査における 検体採取 3.1 病原体遺伝子検査（病原体核酸検査） 3.1.1 主なウイルス感染症 (1) 肝炎ウイルス (2) 急性呼吸器感染症原因ウイルス ・ ・ 3.2 体細胞遺伝子検査 3.3 遺伝学的検査（生殖細胞系列遺伝子検査） 3.3.1遺伝病学的検査 1.1 病原体遺伝子検査における検体保存と運搬 （1.1.1血漿、1.1.2尿、1.1.3喀痰） 検体 病原体 分離 短期間保存: 冷蔵（2-8℃） 血液 HIV 6h HCV 6h HBV 24h 尿 STD（クラミジア、 淋菌） 喀痰 結核菌、MAC 分離後血漿 5日間 長期間保存 （冷凍） -70℃ -70℃ -20℃ ４日間 -70℃ ７日間 -70℃ 2.1 病原体遺伝子検査における検体取扱い 2.1.2血漿 不適切な性状 原因 対処法 回避法 ① フィブリン析 不十分な転 均一化、 出、粘性 倒混和 ホモジナイズ 十分な転 倒混和 ② 混濁、沈渣 適正な遠 心条件 不十分な遠 再遠心 心条件 ③ ヘパリン混入 ヘパリン採 内部標準、核酸 血管やシリ ンジ採血、 カテーテル 採血、透析 EDTA採血 抽出試薬（フィ 管、カ ルター/メンブレ テーテル ンや磁性粒子等)、から採血 heparinase 法 2.2 体細胞遺伝子検査における検体取扱い 2.2.3 血液（白血球）、骨髄 検査目的 室温保存 代替法 ① RNA定量 2h以内 変性処理で室温１W （グアニジンイソチオシアン酸） ② DNA変異 3日以内 全血凍結保存 ③ 高分子DNA解析 (サザンブロット) 24h以内 細胞分画後、超低温(-70℃) 6 11.12.20 遺伝学的検査（生殖細胞系列） • 単一遺伝子疾患の遺伝学的検査等、一生変化し ない遺伝学的情報を明らかにする検査で （1）患者（発症者）を対象にした確定診断のための検 査、保因者検査、発症前検査、易罹患性検査（疾 患感受性検査）、薬理遺伝学的検査、出生前検査、 新生児スクリーニング等の遺伝学的検査 （2）移植目的に患者および供給者のHLAタイプを明 らかにする遺伝子型検査 （3）親子鑑定、個人識別等のDNA鑑定。 2.3 遺伝学的検査における検体取扱い 推奨 不適切な性状 原因 対処法 回避法 血 白血球数 フィブリン析 液 3日以内の室 出、粘性、ヘ パリン混入 温保存 第三者立会い 不十分な転 倒混和、ヘ パリン採血 管 均一化、 DTT でフィ ブリン分解 促進 十分な転倒混和、 フィルター／メン ブレン／磁性粒 子法、ヘパリン分 解酵素、白血球 洗浄 口 腔 粘 膜 飲食物や母 乳 が残存 DNA型個人 識別検査 30分程度経過し て採取 水で口腔内すす ぎ 採取後に直ち に風乾、室温 保存、第三者 立会い 飲食や授乳の 直後に採取 JCCLS検体品質管理マニユアル（暫定文書） 採取 病原体遺伝 子／核酸検 査 病巣を反映 する検体 ヘパリン混入 回避 体細胞遺伝子 病変を反映す 検査 る検体 ヘパリン混入 回避 保存（運搬） 処理（取扱い） 検体種別の保存温 汚染防止 度・時間 洗浄 凍結融解の回避 核酸劣化の防止 検体種別の保存温 汚染の防止 度・時間 洗浄（阻害的影響除去） 凍結融解の回避 腫瘍細胞の分画化 核酸劣化の防止 正常細胞混入の評価 緩衝ホルマリン固定 生殖細胞系列 対面（第三者立情報管理 遺伝子検査 ち会い）で採取 口腔粘膜採取後の （遺伝学的検 綿棒（スワブ）の乾 査） 燥 遺伝学的検査の対象検体 • • • • 血液 口腔粘膜 毛髪（毛根細胞）、爪等 血痕、臍帯（DNA鑑定） 2.3 遺伝学的検査における検体取扱い 対処法 回避法 毛 毛根付き、脱 整髪剤や毛染 髪 落毛 、専用 め剤、メラニン 毛抜き、第三 残存 者立会い 推奨 不適切な性状 原因 PCR反応を 阻害、DNA 断片化 エタノールで 洗浄 抽出効率高める ため検体量↓ NaI法 でDNA抽 出 爪 専用爪切り 大きな爪片 第三者立会い ケラチンに よるDNA抽 出効率↓ 蛋白質分解 酵素処理 1ミリ四方片 先進医療専門家会議 （2009年2月３日） 当該技術の医療機関の要件 I．実施責任医師の要件 診療科、資格、当該診療科の経験年数、当該技術の 経験年数、当該技術の経験症例数 II.医療機関の要件 実施診療科の医師数、院内検査（24時間実施体制）、 倫理委員会による審査体制、 その他「遺伝子関連検査の検体品質管理マニュア ル」（日本臨床検査標準協議会）に準拠した検体 品質管理を行うこと。 7 11.12.20 白血病検体の細胞分画法おけるRNA品質への影響 RIN(RNA Integrity Number)による RNAの品質チェック Agilent 2100 バイオアナライザーによる Chip上の電気泳動像 • Agilent 2100 バイオアナライザーによるRIN 値を用いた。 • Chip上で電気泳動を行い、泳動像をデジタ ルデータ解析 →RNAの分解度を数値化するソフトウェア・ア ルゴリズムでRIN値を算出 BCR-ABL RNA品質とABL発現定量 A260/ A280 骨髄液 検体１ 溶血法 フィコー ル バフィ コート デジタルデータ解析 検体２ 溶血法 1.95 2.01 1.79 フィコー ル バフィ コート RIN 2.3、 2.3 9.2、 9.2 8.0、 8.2 N/A、 1.1 9.1、 8.9 7.6、 7.3 1.95 1.99 1.96 RNA量 ABL １µg 2.83E+03 １µg 4.31E+04 １µg 4.74E+04 100n g 100n g 100n g 7.22E+02 8.37E+03 1.35E+04 28S / 18S rRNA ホルマリン固定パラフィン包埋組織から抽出した DNAのOD260/280比とPCR増幅（n=521）EGFR ホルマリン固定パラフィン包埋組織からの DNA回収量とPCR増幅（n=521） 250 40 35 200 増幅不良検体数 30 25 EGFR 20 検体数 検体数 増幅検体数 増幅検体数 15 10 増幅不良検体数 150 100 50 DNA濃度（ng/μL） ・手術材料のFFPEよりQIAquick DNA Mini Kit（QIAGEN）を用いて回収したDNAで 16ng/μL以下でPCR（190bp）増幅不良検体が出現（ 検体）。 ホルマリン処理細胞からの RNA抽出法の⽐比較 良好な結果が得られたカラム法とは対照的に、改良AGPC（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform）法による抽出では吸光度スペクトラムは異常な波 形を⽰示し、RNA収量もごく少量でRIN値算出が不可となった。 （北海道⼤大学医学部附属病院病理部 松野、畑中） 3.0- 2.9-3.0 2.8-2.9 2.7-2.8 2.6-2.7 2.5-2.6 2.4-2.5 2.3-2.4 OD260/280 2.2-2.3 2.0-2.1 2.1-2.2 1.9-2.0 1.8-1.9 1.7-1.8 1.6-1.7 1.5-1.6 1.4-1.5 1.3-1.4 -1.2 25- 24-25 23-24 22-23 21-22 20-21 19-20 18-19 17-18 16-17 15-16 14-15 13-14 12-13 11-12 8-9 10-11 7-8 9-10 6-7 5-6 4-5 3-4 -1 2-3 0 1-2 0 1.2-1.3 5 手術材料のFFPEよりQIAquick DNA Mini Kit（QIAGEN）を用いて回収したDNA で1.6-2.2の範囲を対象とすると、OD260/280値が小さいほどPCR増幅不良の割合は大きくなる傾向あり。 JCCLS検体品質管理マニユアル（承認文書） 採取 病原体遺 伝子／核 酸検査 病巣を反映す る検体 ヘパリン混入 回避 体細胞遺伝 病変を反映す 子検査 る検体 ヘパリン混入 回避 保存（運搬） 検体種別の保存温度・ 時間 凍結融解の回避 核酸劣化の防止 処理（取扱い） 汚染防止 洗浄 検体種別の保存温度・時 汚染の防止 間 洗浄（阻害的影響除去） 凍結融解の回避 腫瘍細胞の分画化 核酸劣化の防止 正常細胞混入の評価 10%緩衝ホルマリン固定 ホルマリン固定組織 核酸抽出：カラム法 DNA純度（OD260/280>2.0) DNA収量（>16ng/μL） 白血病細胞：分画化に過度な溶 血法注意 生殖細胞系 対面（第三者立情報管理 列（遺伝学的 ち会い）で採取 口腔粘膜採取後の綿棒 検査） （スワブ）の乾燥 8 11.12.20 FFPE人工組織による AcroMetrix® KRAS FFPE プロセスコントロール KRAS コントロールの比較 • 初のホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) KRAS プロセスのコントロール試薬 • KRAS変異をもつ細胞とコポリマーを混合して 合成組織を作り、ホルマリン固定、パラフィン 包埋を行ったFFPE人工組織. • 標本の変異は、G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13Dおよび野生型(WT) • 各10 µm切片に、200ng以上のゲノムDNA CAP外部精度管理調査2012年導入 脱パラフィン 培養細胞 AcroMetrix® KRAS FFPE Process Controls CAP外部精度管理調査(分子腫瘍学） 核酸 抽出 解析 精製核酸 HER2(乳癌), FOXO1, MDM2(固形腫瘍), BCL6, BCL2 (リンパ腫) PCR EGFR(NSCLC), KIT(GIST), KRAS(Colon) （固形腫瘍） BRAF(HNPCC) PCR IGH/BCL2 major/ minor, IGH/CCND1, （造血器腫瘍） IGK,NPM1/ALK,TRB,TRG, CBFB/MYH11, FLT3-ITD, FLT3-TKD, , JAK2, V617F, NPM1, PML/RARA, RUNX1/RUNX1T1 BCR-ABL, PML-RARA MRD: BCR-ABL, PML-RARA 細胞ペレット IGH/BCL2 major/ minor, IGH/CCND1, IGK,NPM1/ALK,TRB,TRG, CBFB/MYH11, PML/RARA, RUNX1/RUNX1T1 FLT3-ITD, FLT3-TKD, JAK2, V617F, NPM1 FFPE 切片組織スライド EGFR(NSCLC), KIT(GIST), KRAS(Colon) BRAF(HNPCC) JCCLS WG-2 測定前プロセスの質保証 検体品質管理 マニュアルの策定 (2009年) ↓ 保存 病変部位 時期 増幅 遺伝子項目 FISH 採取 解析 プラスミドDNA 脱パラフィン 白血病MRD 増幅 精製gDNA （日本臨床検査医学会精度管理委員会） カテゴリー 核酸 抽出 運搬 温度、期間、固定 前処理 エビデンス ↓ 承認版（2011年） 細胞分画化 補完 検体品質管理マニュアル 脱パラフィン 核酸 抽出 JCCLS WG-1 増幅 解析 AcroMetrix® FFPE プロセス・コントロール CAP外部精度管理調査 日本版 ベストプラクティス ガイドライン の策定 (2011年) 対策と期待効果 ISO/TC212 WG1 検体品質評価 の検討 検証 反映 管理・評価 の基準 臨床検査および 体外診断用検査 提案 システム 応用 標準化技術 規格化 測定の標準化 分析的妥当性 測定システム の品質保証 測定機器の robust性能、評価 開発 臨床的妥当性 臨床的有用性 医療の良質化 9 11.12.20 日本版ベストプラクティス・ガイドラインの 項目と主な内容（ JCCLS WG-1, 2011） 項目 主な内容 検査機関の質保証シ ・施設認定の取得 ステム ・質保証の定期的評価と改善 ・ 標準物質と対照の利用 ・ 検査の分析妥当性、臨床的妥当性と有用性 技能試験：検査施設 ・施設技能試験制度と実施機関 の質のモニタリング ・施設技能試験制度と代替方法 ・検査機関に対するモニタリング 結果の報告の質 ・検査結果の取扱い ・必要となる報告の内容 検査施設要員の教育 ・検査に従事する者（責任者、担当者）の水準や と訓練の基準 資格 JCCLS WG-1とJSLM遺伝子委員会の活動展開 様々な領域、人材 日本遺伝子診療学会 技術委員会 日本臨床化学会 日本臨床検査医学会（JSLM） 遺伝子検査技術委員会 倫理委員会 日本臨床衛生検査技師会 遺伝子委員会 臨床検査点数委員会 遺伝子・染色体研究班 精度管理委員会 CAPサーベイ 日本臨床検査自動化学会 遺伝子検査・プロテオミクス委員会 遺伝子分析科学認定士 制度委員会の設立 遺伝子分析・検査技術の 専門的人材の育成は早急な課題 試料供給、試験方法の難しさ 検査前プロセスの重要性 測定者の 教育、資質評価 OECD 遺伝子分析認定科学士? 文部科学省 遺伝子分析科学認定士 IS0/TC212 • 第41類：資格取得 講座における教授 • 第42類：医薬品、 化粧品又は食品の 試験、検査 . 遺伝学的検査標準化委員会 の困難さ 普及、利用拡大 商標登録 日本人類遺伝学会 急速な進歩 項目の多さ 外部精度評価 検査の複雑さ 様々な技術レベル 国際化 日本適合性認定協会 1)検査機関の指導監督 測定者の教育・訓練・資格要件、 検査機関の登録、認可、立入り調査等 2)技能試験 3)適正利用・実施・報告 4)実態のフィードバック 日本臨床検査同学院 遺伝子分析科学認定士 精度確保に専門技術者の必要性 背景 ISO/TC212委員会 日本版ベストプラクティス策定 標準化委員会 検査の精度保証 日本バイオインダストリー協会 JCCLS遺伝子専門委員会 WG-1 WG-2 商標登録 初級認定試験の受験者 様々な 職種 第1回、2007年 • 技師 • 医師、歯科医、獣医 • 薬剤師 • 理工学部出身者 • 警察官、学生 研究開発 実用化 測定実施 第２回、2008年 • 登録衛生検査所 • 検査受託会社 • 検査診断製造企業 • 研究開発者 • 健康食品管理士 10 11.12.20 受験者と合否 80.5% 140 120 69.2% 76.5% 65.4% 68.8% 25 37 100 24 29 80 60 上級資格試験と更新制度 103 83 40 64 遺伝子分析 科学認定士 （初級） 27 78 70 4 2010 5 2011 2007年 一級 遺伝子分析 科学認定士 更新試験 更新試験 更新試験 2012年 eラーニング 20 0 1 2007 2 2008 3 2009 ５年 １０年 計398名 一級遺伝子分析科学認定士カリキュラム 遺伝学的検査の課題 大項目 中項目 小項目 遺伝子検査の基礎知識 遺伝子分析科学認定士制度,遺伝子検査総論、遺伝子の基礎、染色体の 基礎 遺伝子検査前の基礎技術 検体の取扱い、検査試薬・検査機器の取扱い、品質保証 核酸抽出 検体の前処理、DNA・RNA抽出(動物・植物・ヒト）、検査の利用 遺伝子増幅 意義と原理、PCR法、その他の遺伝子増幅技術 検出技術 DNA・RNA解析、その他の検出技術 先端技術 ゲノミクス、プロテオミクス、再生医療、バイオインフォマティクス その他の遺伝子検査の技 術 動物の遺伝子解析、植物の遺伝子解析、ヒトの染色体地図 遺伝子検査に基づく診療の 実践 遺伝子異常と疾患、遺伝子診断、遺伝子治療、遺伝カウンセリング、遺伝 情報、倫理 遺伝子検査結果の評価 感染症、血液疾患、固形腫瘍、遺伝性疾患、生活習慣病、個人識別、 ファーマコゲノミクス 染色体検査の実践 細胞培養法、標本作製、分染法、核型分析、蛍光in situハイブリダイゼー ション 染色体検査結果の評価 染色体異常の種類、腫瘍と染色体異常、環境変異原と染色体異常、倫理 遺伝子・染色体検査業務 業務管理、コンサルテーション、教育とトレーニング、マネジメント、安全管 理、精度管理、遺伝子検査ビジネス、臨床治験、検査診断薬の開発、ガイ ドライン • 遺伝学的検査15疾患の問題点 – 一部機関、価格、疾患項目、標準化測定法なし • 保険点数の問題 – 検査実施料・判断料、ドクターフィー要素？ • 遺伝医療→一般医療：全ての医療機関での利用 • 病院検査室、登録衛生検査所での実施困難 • 予防、未発症は対象外→自費診療 適正に実施、提供するしくみは？ 遺伝学的検査の基本的評価基準 遺伝子関連検査の展望：質保証と提供体制 基礎研究 （ACCEモデル：Analytic Validity, Clinical Validity, Clinical Utility, ELSI) 臨床研究 評価対象 内容 技術の 病気発症に関する 臨床的 臨床的 一般 確立 遺伝子の発見： 分析 妥当性有用性 利用 再現性の確認 妥当性 検査サービス 提供の枠組み 遺伝子情報 先進医療 保険診療 サービス産業検査薬の 研究検査 サービス 薬事承認 あり／なし 検査が如何に正確かつ信 検出感度・特異度、再現性（施設内、施設間）、 頼性をもって目的の遺伝子 検体種レンジ、内部精度管理プログラム、外部 型を測定できるか 精度評価等 臨床的 妥当性 検査が如何に正確に目的 （臨床的）感度・特異度、罹患率、偽陽性回避法、 の病態や成績を検出できる 陽性・陰性予測値、遺伝型・表現型関係、遺伝 か 的・環境的修飾因子等 臨床的 有用性 検査実施によって患者の臨 介入（疾患の自然経過、患者ケアへのインパク 床成績を有為に改善する ト、効果的療法の有無）、精度保証手段、パイ か ロット試験結果、健康リスク、経済性（経済的ベ ネフィット）、利用可能な設備・人材、教育・教材、 長期モニタリング手段 倫理的、 法的、 社会的な 課題 検査実施にともない発生し 、倫理的・社会的弊害（差別、機密保持、個人・ うる倫理的、法的、社会的 家族の社会的課題）、法的課題（説明と同意、 問題 データと検体の所有権、特許、ライセンス、製造 販売独占の検査、開示義務、報告要求）、安全 予防策等がある。 検査薬の薬事承認あり／なし 検査サービス ネットワーク 精度の保証 施設基準：検体検査管理加算 常勤の検査専任医師 検体品質管理 外部精度評価 マニュアル、 精度管理委員会 遺伝カウンセリング 臨床検査適正化委員会 施設基準： 施設基準 施設基準 の方向性？ 協議会 自主基準 日本版ベストプラクティスガイドライン ①質保証システム②施設技能試験 ③結果の報告の質④検査施設要員 指標 分析的 妥当性 OECDガイドライン 11 11.12.20 遺伝子関連検査の将来展望 社会 リーダーシップと政策監視: 規制、インセンティブ、予算 国民 政府 利用者の教育 ガイダンス メディア、学校 School 医療従事者 訓練、資質評価 産業 専門家 標準とエビデンス作成： 開発、実用化、臨床利用 良質な医療 ヘルスケア 大物女優の全ゲノム解読の発表 (2010年３月１１日) • グレン・クローズ （「危険な情事」主演、アカデミー賞５回ノミネート） • コメント「精神疾患の遺伝学的な側面を科学者 が解明し、より効果的な治療につながることを望 む。」 • 全ゲノムシークエンス費用： ４万８千ドル→１０００ドル （DNAシークエンサー販売 イルミナ社） まとめ • 遺伝子関連検査の利用拡大と社会浸透が見られる。 • 検査の精度保証、標準化の取組みが進められてい る。 • 利用・実施において、検査の精度や臨床的妥当 性・有用性、測定前 測定 測定後プロセスが適 正に行われる必要がある。 • JCCLS は検体品質評価•管理手法の開発に取り組 んでいる。 • 標準化の体制整備、教育、ガイドライン等のソフ トとの連携が期待される。 • 検査施設の質、検査利用者の啓発の取組みが必要 である。 12