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プロトコール型テクニカルノート 1 目次 ページ 4 4 - はじめに ウエスタンブロッティングの流れ 転写 5 ブロッティング方式の比較 ブロッティングメンブレンの比較 実験プロトコール ( セミドライ式ブロッティング・PVDF メンブレン ) トラブルシューティング 5 5 5 7 転写確認 8 実験プロトコール (CBB stain One を用いたメンブレンの染色 ) 実験プロトコール (Rapid Stain CBB Kit を用いたメンブレンの染色 ) 8 9 ブロッキング 10 代表的なブロッキング剤の比較 実験プロトコール（Blocking One） 実施例 例 1）Blocking One 例 2）Blocking One-P Q&A 10 10 10 検出 11 化学発光検出 実験プロトコール（Chemi-Lumi One Super） 実施例 例 1）Chemi-Lumi One Markers Kit を用いた Chemi-Lumi One Super による検出 例 2）Chemi-Lumi One L による HL-60 細胞抽出物中のβ -Actin の検出 例 3）Chemi-Lumi One Markers Kit を用いた Chemi-Lumi One L による検出 トラブルシューティング 11 11 13 13 13 13 14 2 目次 検出 ページ 発色検出 1- ① Peroxidase Stain Kit ＃ 26652-70 15 実験プロトコール 15 実施例 15 HRP 標識抗体を使用し、Peroxidase Stain Kit で発色 発色検出 1- ② Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) #25985-50 16 実験プロトコール 16 実施例 16 HRP 標識抗体を使用し、Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) で発色 16 発色検出 1- ③ Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) #25985-50 と Metal Enhancer for DAB Stain#07388-24 との組合せによる高感度 Gray 染色 17 実験プロトコール 17 感度比較 17 発色検出 2 BCIP-NBT Solution Kit #03937-60 18 実験プロトコール 18 実施例 18 ALP 標識抗体を使用し、BCIP-NBT Solution Kit で発色 18 Streptavidin Biotin Complex Peroxidase Kit #30462-30 を用いた増感検出法 19 実験プロトコール Signal Enhancer HIKARI（抗原抗体反応促進剤）#02267-41 50ml / #02270-81 250ml） 20 実験プロトコール 20 実施例 20 例 1）検出感度や特異性への影響 20 例 2）Chemi-Lumi One Super および Chemi-Lumi One L と HIKARI の組み合わせによる検出感度の向上 20 他社高感度製品との比較 21 実験プロトコール 21 検出反応プロトコール 21 増感反応プロトコール 21 結果 21 条件 21 評価 21 ストリッピング 22 各手法の比較 実験プロトコール 実施例 例 1）HRP 標識抗体を使用し、Chemi-Lumi One L による化学発光にて検出 例 2）WB Strippng Solution 例 3）WB Stripping Solution と WB Stripping Solution Strong の 違い 使用上の注意 3 22 22 23 23 23 24 24 - はじめに ウェスタンブロッティングは複数のタンパク質を含むサンプルを電気泳動によ り分離した後、ニトロセルロースメンブレンや PVDF メンブレンに転写し、メ ンブレンに吸着したタンパク質を、特異的な抗体を使って免疫反応させること により、目的のタンパク質がサンプルに含まれているかどうかを確認する方法 です。 ブロッティングの手法は Edwin Mellor Southern が考案し、その名前に由来す る DNA 検出法のサザンブロッティング（南）に始まり、その後、開発された RNA 検出法のノーザンブロッティング（北）の流れから、タンパク質検出法で ある本手法は、ウェスタン（西）ブロッティングと名づけられています。 ウェスタンブロッティングの流れ ウェスタンブロッティングの操作は、おおまかに以下の実験の流れとなります。 ①ゲルからメンブレンへの転写 ②メンブレンのブロッキング ③抗体反応 ④検出 各操作段階でさまざまな手法が存在し、ベストな結果を得るためには適切な方 法や試薬の選択、注意点などがあります。本冊子では、実験の流れに従い実験 手法の相違点や操作上の注意点などを中心に紹介します。 SDS-PAGE 転写 転写確認 ブロッキング 一次抗体、 二次抗体 検出 : 発光 , 発色 , 蛍光 ストリッピング 発色検出実施後はストリッピング 操作はできません！ ブロッキング 異なる抗体反応 一次抗体、二次抗体 4 転写 転写は下記の 2 つの方法がありますが、転写時間が短い等の利点があるセミド ライ式ブロッティングがよく使用されています。また、メンブレンは PVDF メ ンブレンの方がタンパク質の結合力が強く、そのままアミノ酸シークエンサー にアプライできることから PVDF メンブレンを用いることが多くなっています。 詳細は下記出典をご参照ください。 ブロッティング方式の比較 使用する転写 緩衝液量 タンク式ブロッティング セミドライ式ブロッティング 多い 少ない 発熱 転写緩衝液にて冷却されるので発熱量 は少ない。冷却しながら転写すること が多い。 やや発熱するが、温度調節の必要はな い。 転写時間 長時間かかる（4 時間以上 ） 短時間で済む（2 時間以内） 転写ムラなど 比較的均一な転写が期待できる やや起こりやすい 低電圧で長時間かけて転写するために 高電圧で短時間に転写するために、高 転写効率 高分子量から低分子量タンパク質にか 分子量タンパク質と低分子量タンパク けて効率よく転写される。 質の転写効率に差が生じる。 出典：バイオ実験で失敗しない！検出と定量のコツ 森山達哉 p.41 より改変 ブロッティングメンブレンの比較 性質 強度 タンパク質保持力 値段 PVDF(Polyvinylidene Difluoride） メンブレン ニトロセルロースメンブレン 疎水性 親水性 強い 弱い（ちぎれやすい） 250 μ g/cm2 程度 100 μ g/cm2 程度 高価 安価 ※最近は PVDF メンブレンが主流となってきている。 出典：バイオ実験で失敗しない！検出と定量のコツ 森山達哉 p.41 より改変 実験プロトコール ( セミドライ式ブロッティング・PVDF メンブレン ) 1. 転写膜の準備（トレイ 1） ①清潔なトレイ（ディスポトレイなど）に 100％メタノールを約 50ml 注ぎ込み、 PVDF メンブレンの端から順次液中に浸み込ませる要領で浸し、約 1 分間振 とうします。 ニトロセルロースメンブレンを使用 する場合は 100％メタノールに浸す 必要はありません。 Dispotray (#06563-44) ②約 1 分振とう後メタノールを完全に捨て、セミドライウェスタンブロッティ ング用転写緩衝液約 50ml を注ぎ込み、10 ～ 20 分振とうさせて PVDF メン ブレンを緩衝液で平衡化させます。 2. ポリアクリルアミドゲルの準備（トレイ 2） ①トレイ 1 とは別に、清潔なトレイを準備します。セミドライウェスタンブロッ ティング用転写緩衝液約 50ml を注ぎ込み、電気泳動したポリアクリルアミ ドゲルを浸して、10 ～ 20 分振とうさせてゲルを緩衝液で平衡化させます。 Semi-dry Blotting Buffer Solution for Western Blotting ( ＃ 30650-31) PVDF メンブレン・ろ紙を切るとき は、手のタンパク質がつかないよう に、手袋を着用して行います。 5 転写 3. 電極板へのセット ① PVDF メンブレンよりも一回り大きく切ったろ紙 12 枚を準備します。 ろ紙は Whatman 3MM Chr がよ く使用されています。 ②トレイ 1、2 とは別に、清潔なトレイを準備します（トレイ 3）。 セミドライウェスタンブロッティ ング用転写緩衝液約 50 ml を注ぎ込みます。 ③ろ紙を一枚ずつトレイ 3 の転写用緩衝液に浸し、トレイ壁で余分な液を拭って 電極版（陽極）上にろ紙端から順次密着させる要領で置いていきます。 あとの 5 枚も同様の操作を繰り返します（合計 6 枚のろ紙を重ねます）。 ④ PVDF メンブレンをろ紙同様の要領でろ紙上におきます。 ⑤ゲルを転写膜の上に重ねて、ゲルの裏表および端がわかるようにボールペンで 印をつけます。残りのろ紙も、同じ要領でゲルの上に重ねていきます。 ⑥電極板（陰極）を取り付け（この時、PVDF メンブレン、ゲルは下図のようにセッ トされています）、電源とブロッティング装置を結線し、定電流 0.8 ～ 1mA/ cm2 で 1 ～ 1.5 時間通電します。（ミニゲルで（10cm x10cm）1 枚を転写する 場合） 転写膜を重ねる時、気泡が入ら ないように注意してゆっくり重 ねてください。気泡が入った部 分は転写されなくなります。 （P7 トラブルシューティング参 照） メンブレンの表裏がわかるよう にボールペンで印を付けてくだ さい。 最適な通電時間は、装置の種類、 使用するろ紙の種類・枚数によ り異なります。あらかじめ、予 備実験により最適条件の設定を 行ってください。 電極でろ紙・転写膜・ゲルをサ ンドイッチし、その後、電線を つなぐタイプの装置の場合、ゲ ルから転写膜にタンパク質が移 るように、プラスマイナスを間 違えないようにします。逆につ ないでしまうと、ゲルからろ紙 にタンパク質が転写されます。 一度に 2 枚セットする場合は、 電流値を 2 倍にします。 ⑦電源とブロッティング装置の結線を取り除き、電極板（陰極）側から順次剥が す要領でろ紙を取り除きます。転写が終了したメンブレンを t-PBS、t-TBS 等に浸し、次の工程に進みます。（作業を中断する場合は、メンブレンが乾か ないように t-TBS に浸します。） 6 りん酸化抗体を用いる場合は、 t-TBS を使用してください。 転写 4.PVDF メンブレンの洗浄 ①転写された PVDF メンブレンをディスポーサブルのトレイにのせ、そこに t-TBS をそそぎ、シェイカーで 5 分間振とうします。これをもう一度繰り 返します。 転写の確認には、SDS-PAG を行う 際に、Protein Ladder One,Triplecolor(#09547-74) 等の、Prestained Marker を使用すると便利 です。 その他にも、サンプルの転写の確 認はメンブレンを CBB 染色で行う こともできます。詳細は p9 を参 照ください。 Protein Ladder One,Triple-color (Broad Range)(#09547-74) トラブルシューティング 気泡が入った例 Protein Ladder One,Multi-color (Broad Range)(#09549-25) Pre-stained Protein Markers(Broad Range） (#02525-35) ①矢印（ピンク）で示しますように、ゲルと PVDF メンブレンの間に気泡が入ると、 そこだけ転写されません。 問題点 ① バンド中に未転写部分が入る ② 低分子量タンパク質の転写効率 が悪い ③ 高分子量タンパク質の転写効率 が悪い 原因 解決策 ゲルと PVDF メンブレ 転写膜を重ねるとき、気泡が入 ンの間に気泡が入りそ らないように注意してゆっくり の部分が転写されてい 重ねる ない 高電圧で短時間に転写 するために高分子量タ ンパク質と低分子量タ ンパク質の転写効率に 差が生じている ・目的タンパク質付近の転写効率 が良くなるよう転写時間を増 減する ・すべての分子量領域で転写効率 を均一にしたい場合は、タン ク式ブロッティングを行う 7 転写確認 SDS-PAGE などの電気泳動後のゲルをニトロセルロースメンブレンや PVDF メン ブレンに転写したのち、そのメンブレン上で転写された全てのバンドを検出した い場合がある。例えば、目的タンパク質の発現量を比較したい場合などは、レー ンごとに転写ムラがあっては困る。このようなときにはゲルからメンブレンへの タンパク質の転写後に、転写ムラがないかどうか確認した方が安心できる。また、 転写されたタンパク質バンドの N 末端シークエンスを行う場合は、目的のタンパ ク質バンドの位置を確認するためにポンソー S によって染色する。さらにウェス タンブロッティングのシグナル検出後に、対応する位置のタンパク質バンドを確 認したい場合なども多い。 CBB Stain One(Ready To Use) (#04543-51) 出典：バイオ実験で失敗しない！検出と定量のコツ 森山達哉 p.88 より改変 メンブレンの CBB 染色には、染色液や脱色液に酢酸やメタノール、エタノール などの有機溶媒を含むものと含まない染色方法があり、弊社では以下の 2 製品を 用意しています。また、染色後のメンブレンの脱色には、Rapid CBB Destain Kit を用意しています。 CBB Stain One を用いた染色法では、脱色の操作が抗原抗体反応を行うために必 要な染色像の完全脱色 1 ステップのみで完了し、簡便です。 製品名 染色液 CBB Stain One Rapid Stain CBB kit 有機溶媒不含 有機溶媒含有 染色時間 25 分間（水洗時間 5 分 x2 を含む） 脱色操作 -1 不要（染色液の性質から、バックグラウン （バックグラウンドの脱色） ドが低く、脱色不要で染色像が確認可能） 脱色操作 -2 5 分間 （染色像の完全脱色） Rapid CBB Destain Kit (#30046-74) 1 分間 15 分間 5-10 分間 実験プロトコール (CBB Stain One を用いたメンブレンの染色 ) 1. メンブレンの染色と染色像の確認 Protein Markers(M.W. 6,500~200,000) (10x)(#29458-24) 1 2 3 Albumin → （66kDa） ← 65 ← 45 ①清潔なトレイに CBB Stain One を注ぎタンパク質 を転写したメンブレンを浸して、約 15 分間浸します。 ②染色したメンブレンは水で約 5 分間 x2 洗浄します。 ＜実験条件＞ ：12％ゲル サンプル ： 1; Protein Markers(#29458-24) 2; ヒト血清 3;Pre-stained Protein Markers(Broad Range） (#02525-35) メンブレン ：PVDF メンブレン SDS-PAGE 2. メンブレンの完全脱色 1 2 3 ① Dispotray に Rapid CBB Destain Kit の A 液 20 容量、 B 液 10 容量、およびイオン交換水 30 容量を注ぎ 込んで混合します。 約 10cm x 10cm のメンブレンに適用する場合、 CBB 脱色液 50ml 程度が適量です。 ② CBB 染色したメンブレンをトレイの脱色液に浸して 振とうします。通常約 5 分程度で完全に脱色できま す。 3. 影響の検証 2 3 M.W. （kDa） ← 65 Globulin → ← 45 脱色後のメンブレンを使用し、一次抗体とペルオキ シダーゼ標識抗体を反応させた後、目的とするタン パク質を高感度に検出できます。左図の結果から、 CBB Stain One および Rapid CBB Destain Kit の使用に より、抗原抗体反応に影響を与えずに目的のタンパ ク質を検出できました。 8 Pre-stained Protein Markers (Broad Range）(#02525-35) Dispotray (#06563-44) 転写確認 実験プロトコール (Rapid Stain CBB Kit を用いたメンブレンの染色 ) 1. メンブレンの CBB 染色 1 2 3 4 5 6 ①精製水（脱イオン水または蒸留水）3 容量に A 液１容 量を混ぜ合わせた後、B 液１容量を混ぜ合わせ、CBB 染 色液を調製します。約 10cm x10cm メンブレンに適用 する場合、CBB 染色液 50ml 程度が適量です。染色液 は用時調製してください。 ②清潔なトレイ（Dispotray など）に CBB 染色液を注ぎ、 タンパク質を転写したメンブレンを浸して正確に 1 分 間振とうします。 ③ CBB 染色したメンブレンは、t-PBS で十分洗浄します。 Rapid Stain CBB Kit (#30035-14) 2.CBB 染色像の確認 CBB 染色したメンブレン上のタンパク質泳動像を確認できる程度に残し、メン ブレン自体に吸着した CBB 色素を除去します。 1 2 3 4 5 6 116,250 → 66,200 → 45,000 → 31,000 → ①清潔なトレイ（Dispotray など）に Rapid CBB Destain Kit の A 液 20 容量、B 液 10 容量、およびイオン交換水 30 容量を注ぎ込んで混合します。 約 10cm x10cm メンブレ ンに適用する場合、CBB 脱色液 50ml 程度が適量です。 ② CBB 染色したメンブレンをトレイの脱色液に浸して振と うします。 適当な泳動像が得られるまで脱色します。 通常は 3 ～ 5 分間が適当です。 ③ CBB 染色したメンブレンは、t-PBS で十分洗浄します。 ④必要に応じてデータの取り込みや、写真撮影を実施し ます。 Rapid CBB Destain Kit (#30046-74) Dispotray (#06563-44) 3.CBB 染色像の完全脱色 CBB 染色されたタンパク質泳動像を観察した後、抗原抗体反応による検出を妨 害しないように、CBB 染色像を完全に脱色します。 1 2 3 4 5 6 ①約 10cm x10cm メンブレンに適用する場合、清潔なトレ イ（Dispotray など）に Rapid CBB Destain Kit の A 液 25 容量と B 液 25 容量を注ぎ込んで混合します。 ②メンブレンをトレイの脱色液に浸して振とうします。 通常 5 ～ 10 分 間程度で完全に脱色できます。 ③トレイの脱色液を捨て、t-PBS を注いで振とうします。 4. 影響の検証 メンブレン上に固定した抗原に、ペルオキシダーゼ標識抗体を反応させた後、 目的とするタンパク質を検出します。 1 2 3 4 5 6 左 図 の 結 果 か ら、Rapid Stain CBB Kit お よ び Rapid CBB Destain Kit の使用により、抗原抗体反応に影響 を与えずに目的のタンパク質を検出できました。 Albumin → 9 ブロッキング タンパク質をメンブレンに転写した後、抗体が非特異的に結合しないように、 タンパク質が存在しない部分をあらかじめマスクする必要があり、この操作を ブロッキングといいます。不十分なブロッキングは、高いバックグラウンドの 原因となります。 ブロッキング剤には BSA ベースのものや、ミルク（カゼイン）ベースのもの、 魚由来のもの、タンパク質以外の高分子由来のものなどがあり、サンプルの由 来や価格などを考慮して検討します。以下に主なブロッキング剤を記載します。 代表的なブロッキング剤の比較 名称 ブロッキング 時間 説明 合成高分子化合物ベースのブロッキング試薬で、迅速か つ効果的なブロッキングが可能。 Blocking One 上記ブロッキングワンのりん酸化タンパク質検出用の製 品で、カゼインフリー、内因性ホスファターゼが含まれ ていないことを保証。 チロシンのりん酸化の検出の場合は、1 ～ 5% の濃度で使 用される。 Blocking One-P BSA 最もよく使用されているブロッキング剤で、5% スキム ミルク /t-TBS の組成で良く使用される。 スキムミルク 30 分程度 Blocking One （#03953-95) 30 分程度 1 時間程度 1 時間程度 実験プロトコール（Blocking One） 1. 清潔なトレイに Blocking One（原液）を PVDF メンブレンが浸る程度に 注ぎます。 2. 室温、30 分間シェイカーで振とうします。 3.t-TBS でメンブレンを洗浄します。（5 分間 x2 回） 実施例 例 1）Blocking One 例 2）Blocking One-P Mouse 血清からの IgG の検出 Hela 細胞ライセートからのりん酸化タンパク質の検出 1 2 M 1 2 3 ＜実験条件＞ サンプル ＜実験条件＞ サンプル： タンパク質マーカー (Biotin 標識 ) 100 倍希釈 5 μ l Mouse 血清 1000 倍希釈 1; 2.5 μ l 2; 5 μ l 3; 10 μ l ：HeLa 細胞 1.0x107 個 ＋ RIPA Buffer(#08714-04(1ml) 1; 5 μ l、2; 10 μ l 検出に用いた抗体 一次抗体 ：Anti-p-Tyr(PY20)(Mouse), Monoclonal (SantaCruz #sc-508)2,000 倍希釈 二次抗体 ：Anti-Mouse IgG-HRP （SantaCruz #sc-2005）10,000 倍希釈 転写膜の染色 ：CBB Stain One(#04543-51) 化学発光検出 ：Chemi-Lumi One L(#07880-70) Q&A 質問 対応策 抗体希釈液にブロッキング溶液を加えなくても問題はあり ません。しかし、バックグラウンドや非特異的バンドを抑 一 次 抗 体 お よ び 二 次 抗 体 反 応 時 に えるだけでなく、サンプルチューブやブロッティング中の も Blocking One も し く は Blocking トレイなどへの非特異吸着を減らし抗体を無駄なく使用す One-P を用いて希釈した方がよいの る意味でも、本製品の 20 倍希釈をお薦めします。なお本製 ですか？ 品を希釈せずに抗体希釈に用いた場合、実験例はありませ んが過剰量のブロッキング剤により本来の抗体反応が妨害 される可能性があります。 10 Blocking One-P （#05999-84) 検出 化学発光検出 弊社では化学発光検出キットとして、高感度かつ迅速なタンパク質の検出に適 した Chemi-Lumi One Super、測定レンジが広くサンプル中の目的タンパク質 の量が不明な際の検出に適した Chemi-Lumi One L を用意しています。 製品名 感度 測定レンジ Chemi-Lumi One Super 0.04pg 0.04pg-2.5pg Chemi-Lumi One L 0.63pg 0.63pg-10pg Chemi-Lumi One Super (#02230-30) * 感度や測定レンジの値は、 サンプルにビオチン標識タ ンパク質マーカー、ラベリン グに HRP 標識ストレプトア ビジンを用いて、LAS-3000、 露光時間：2 分、検出感度： High の条件で算出していま す。 実験プロトコール（Chemi-Lumi One Super） 1. 前準備 Chemi-Lumi One L (#07880-70) 一次抗体反応 ①一次抗体を t-TBS で希釈し、シェイカーで振とうしながら室温で 1 時間反応 させます。 ② t-TBS でメンブレンを洗浄します。（5 分間 x2 回） 二次抗体反応 ① 二次抗体を t-TBS で希釈し、シェイカーで振とうしながら室温で 1 時間反応 させます。 ② t-TBS でメンブレンを洗浄します。（5 分間 x2 回） 2. Chemi-Lumi One Super の Solution A と Solution B を 1：1 の割合で混合し、 検出液とします。 抗体の希釈倍率は、抗体に添付 されている Data Sheet を参考に、 適宜検討を行ってください。 混合液はブロッティングしたメ ンブレンに対し約 0.125ml /cm になる量を使用します。 2 Solution A Solution B 抗 体 希 釈 を、Signal Enhancer 3. プラスチック製ラップフィルムを机上に敷きます。メンブレンをピンセット HIKARI を 用 い て 行 う と 検 出 感 でつまみ、メンブレンの角をキムワイプ ® などに当て、緩衝液を取り除きます。 度、特異性が向上します。詳細 は P19 を参照ください。 4. 敷いておいたプラスチック製ラップフィルムの上に、メンブレンをタンパク 質吸着面が上側になるように置きます。その後、検出液を上からかけ、1 分 間反応させます。 5. メンブレンをピンセットでつまみ、メンブレンの角をキムワイプ ® などに当て、 余分な検出液を取り除きます。 11 気泡が入らないように、プラス チック製ラップフィルムの上に メンブレンを置いてください。 検出 6. メンブレンを充分に包める程度の大きさの新しいプラスチック製ラップフィル ムを敷きます。その上にタンパク質吸着面が下側になるようにメンブレンを置 き、プラスチック製ラップフィルムでメンブレンを包んでください。 タンパク質吸着面 気泡が入らないように、プラス チック製ラップフィルムの上に メンブレンを置いてください。 また、プラスチック製ラップ フィルムでメンブレンを包むと きは、プラスチック製ラップ フィルムの折れやシワに気をつ けてください。 7. タンパク質吸着面を上にしてメンブレンをフィルムカセットに入れます。 （以後の作業は暗室内で行ってください） 8. 暗室内で、プラスチック製ラップフィルムで包んだメンブレンの上に X 線フィ ルムを置き、フィルムカセットを閉め、感光させます。 感光時間は実験条件により異な ります。適した感光時間の検討 を行ってください。 現像液および定着液として GBX Developer and Fixer（コダック： 製品番号 6610091）などが販売 されています。また、現像液お よび定着液の処理能力には限界 があり、その限界はパッケージ などに記載されています。 タンパク質吸着面 9. Ｘ線フィルムを現像液につけ、像が確認できるまで現像します。 10. Ｘ線フィルムを停止液（0.3％酢酸水溶液）につけます。 11. Ｘ線フィルムを定着液につけます。 12. Ｘ線フィルムを流水で注ぎ、定着液を落とします。その後、Ｘ線フィルム が重なり合わないように乾かします。 12 停止液には 0.3％酢酸水溶液を 使用してください。停止液は何 度か繰り返し使用することがで きますが劣化していきますので、 用時調製することをお薦めしま す。 検出 実施例 例 1）Chemi-Lumi One Markers Kit を用いた Chemi-Lumi One Super による検出 ＜実験条件＞ サンプル 電気泳動 転写 ブロッキング ラベリング 検出 ：Chemi-Lumi One Markers 2.5 μ l / well ：8% アクリルアミドゲルで SDS-PAGE、35 mA で 55 分泳動 ：セミドライ式ウェスタンブロッティング ：Blocking One 30 分 室温 ：Streptavidin (HRP conjugate)、t-TBS で 7500 倍に希釈、 室温で 120 分反応 ：LAS-3000、露光時間：2 分、検出感度：High Chemi-Lumi One Markers Kit(#06456-70) Chemi-Lumi One Markers Kit (#06456-70) のキット構成 ・Chemi-Lumi One Markers ・Streptavidin (HRP conjugate) Chemi-Lumi One Super (#02230-30) 例 2）Chemi-Lumi One L による HL-60 細胞抽出物中のβ -Actin の検出 ←β -Actin ＜実験条件＞ サンプル ：HL-60 細胞タンパク質抽出液 (1.6 μｇ / レーン ) メンブレン ：PVDF メンブレン ブロッキング ：Blocking One 30 分 室温 一次抗体 ：Anti- β -Actin 1 時間 室温 (1：10,000 Santa Cruz) 二次抗体 検出試薬 撮影 ：Anti-Mouse IgG HRP conjugated 1 時間 室温 （1：10,000 Santa Cruz） ：Chemi-Lumi One L ：LAS-3000 Chemi-Lumi One L (#07880-70) 例 3）Chemi-Lumi One Markers Kit を用いた Chemi-Lumi One L による検出 1 2 ＜実験条件＞ サンプル メンブレン ブロッキング 一次抗体 二次抗体 検出試薬 ：1；Chemi-Lumi One Markers 2；HL-60 細胞タンパク質抽出液 (1.6 μ g/ レーン ) ：PVDF メンブレン ：Blocking One 30 分 室温 ：Anti- β -Actin 1 時間 室温 (1：10,000 Santa Cruz) ：Anti-Mouse IgG HRP conjugated 1 時間 室温 （1：400 Santa Cruz） ：Chemi-Lumi One L 通常の Protein Ladder One,(Triple-color #09547-74 /Multi-color #09549-25) は 化学発光法では検出できませんが、Chemi-Lumi One Markers Kit(#06456-70) を 使用すると、サンプルと同じフィルム上での検出が可能になります。 ※ただし、マーカータンパク質にはビオチンが標識されているため、未修飾の マーカータンパク質と多少泳動状況が異なる場合があります。正確な分子量を 測定する場合は Protein Markers(M.W. 6,500~200,000)(10x)(#29458-24) を使用 してください。 13 Blocking One (#03953-95) 検出 トラブルシューティング ③ ① ←β -Actin ＜実験条件＞ サンプル メンブレン ブロッキング 一次抗体 二次抗体 検出試薬 撮影 ：HL-60 細胞タンパク質抽出液 (6.4 μｇ / レーン ) ：PVDF メンブレン ：Blocking One (#03953-95) 15 分 室温 ：Anti- β -Actin 1 時間 室温 (1：1,000 Santa Cruz) ：Anti-Mouse IgG HRP conjugated 1 時間 室温 （1：2,000 Santa Cruz） ：Chemi-Lumi One L (#07880-70) ：LAS-3000 ② 問題点 原因 解決策 ① バ ン ド が 白 抜 け ・SDS-PAGE 時、泳動するサンプ 泳動するサンプル量を減らす、一次抗 している ル 量が多い 体、二次抗体の濃度を下げてみるなど ・一次抗体の濃度が高い 実験条件を再検討してください。 ・二次抗体の濃度が高い ② 非 特 異 的 バ ン ド ・SDS-PAGE 時、泳動するサンプ が多い ル 量が多い ・一次抗体の濃度が高い 泳動するサンプル量を減らす、一次抗 体の濃度を下げてみるなど実験条件を 再検討してください。 ③ バ ッ ク グ ラ ン ド ・ブロッキングが不十分である が高い 十分なブロッキングがされているか、 適当なブロッキング剤が使用されてい るか確認してください。特にりん酸化 部位を認識する抗体を使用する際は、 カゼインフリーのブロッキング剤（カ ゼインは高度にりん酸化されています） を使用する必要があります。りん酸化 検出実験にはりん酸基不含を保証した、 Blocking One-P(#05999-84) をお試しく ださい。 ・二次抗体の濃度が高い ・洗浄過程がきちんと行われてい ない ④ 全くバンドが でない 二次抗体の濃度を下げるなど実験条件 を再検討してください。 洗浄（特に二次抗体反応終了時）を十 分な量の t-TBS で行うなど適切に洗浄 を行ってみてください。 一次抗体と二次抗体の組み合わせが間 違っていないか確認してください。 ・一次抗体と二次抗体の組み合わ せが違っている （例：一次抗体にマウスモノク ローナル抗体を使用し、二次抗 体に抗ウサギ抗体を使用するな ど） ・現像液が古くなっている 現像液が濃い黄色に変色している場合 は、液が酸化し劣化してしまっていま す。また、変色していない場合でも現 像液の処理能力が限界を超えている可 能性があります。現像液を新しく作製 しなおしてください。 ・一次抗体および二次抗体の濃度 泳動時のサンプル量を増やす、一次抗 が 低い、泳動したサンプル量 体、二次抗体の濃度を上げてみるなど が極端に少ない 実験条件を再検討してください。 14 検出 発色検出 1- ① Peroxidase Stain Kit ＃ 26652-70 実験プロトコール 1. 試薬の調製 試薬の調製は使用直前に行い、調製後 10 分間以内に発色反応を開始してくだ さい。試薬の調製後 30 分間以上経過すると、良好な染色性能が得られない可 能性があります。 【発色液の調製（10 cm x10 cm メンブレン用）】 ①まず、緩衝液を十分に転倒攪拌してください。 ② 清潔な 50 ～ 100 ml 用メスシリンダーに緩衝液 50ml を分取し、マイクロ ピペットで発色原液 2.5 ml を加えて十分に混和してください。 Peroxidase Stain Kit (#26652-70) 上記以外のスケールで発色液を調製する場合は、緩衝液 20 容量と発色原液 1 容量の割合で 混和してください。 2. 操作手順 ①メンブレン上に固定した抗原に一次抗体を反応させた後、t-TBS で十分に洗 浄します。（二次抗体を使用しない場合は一次抗体としてペルオキシダーゼ 標識抗体を使用し③に進む） ②二次抗体となるペルオキシダーゼ標識抗体を反応させた後、t-TBS で 十分に洗浄します。 ③調製した発色液を清潔なプラスチック製トレイに入れ、洗浄したメンブレ ンを浸して室温で静置又は振とうします。 ④メンブレン上に泳動像の適当な染色が得られたら、メンブレンを発色液か ら取り出して流水で１０分間以上洗浄して反応を停止します。 実施例 HRP 標識抗体を使用し、Peroxidase Stain Kit で発色 CBB 染色 マーカー M.W タンパク質の分離 1 2 3 4 5 メンブレンへの転写 120,000 → 97,000 → ← Albumin ← IgG,H 鎖 50,000 → 36,000 → ← IgG,L 鎖 27,500 → ブロッキング 一次抗体インキュベーション 洗浄 20,000 → 泳動先端→ マーカー 発色反応 マーカー 1 2 3 4 5 M.W 120,000 → 97,000 → 50,000 → ← IgG,H 鎖 36,000 → 27,500 → 20,000 → 泳動先端→ マーカー ← IgG,L 鎖 ＜実験条件＞ サンプル ：ヒト血清 サンプル量 ：1; 5 μ g、2; 1.7 μ g、3; 0.55 μ g、 4; 0.2 μ g、5; 60ng 一次抗体 ：POD 標識ヤギ抗ヒト IgG 電気泳動 ：12.5％ SDS-PAGE(35 mA,40 分間） メンブレン ：PVDF メンブレン 発色時間 ：60 分間 15 ・発色液を入れるトレイは、 プラスチック製を推奨します。 ステンレス製トレイを用いた 場合、トレイに色素が析出す る場合があります。 Dispotray (#06563-44) 検出 発色検出 1- ② Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) #25985-50 実験プロトコール 1. 試薬の調製 試薬の調製は使用直前に行い、調製後 10 分間以内に発色反応を開始します。試 薬の調製後 30 分間以上経過すると、良好な染色性能が得られない可能性があり ます。 Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) (# 25985-50) 【発色液の調製 （10 cm x10 cm のメンブレン用）】 清潔な 50 ～ 100 ml 用メスシリンダーにイオン交換水 40 ml を分取します。 点眼容器のキャップおよび中栓を取り、緩衝液 900 μｌ、発色原液 900 μｌ、 基質試薬 900 μｌを加えて十分に混和します。 2. 操作手順 ①メンブレン上に固定した抗原にペルオキシダーゼ標識抗体を反応させた後、 t-PBS または t-TBS で十分に洗浄します。 ②調製した発色液を清潔なプラスチック製トレイ（Dispotray など）に入れ、 洗浄したメンブレンを浸して 10 ～ 60 分間室温で振とうします。 ③メンブレン上に泳動像の適当な染色が得られたら、メンブレンを発色液から 取り出して流水で 10 分間以上洗浄して反応を停止します。 実施例 HRP 標識抗体を使用し、Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) で発色 ＜実験条件＞ サンプル ：HL-60 細胞タンパク質抽出液（1.6 μｇ / レーン） メンブレン ：PVDF メンブレン ブロッキング ：Blocking One 30 分 室温 一次抗体 ：Anti- β -Actin 1 時間 室温（1：5,000 Santa Cruz） 二次抗体 ：Anti-Mouse IgG HRP conjugated 1 時間 室温 （1：10,000 Santa Cruz） 検出試薬 ：Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) 16 上記製品について ・ 変異原性物質を含んでいます ので、取り扱いにはゴム手袋 および保護メガネなどを着用 してください。 ・ 発色液を入れるトレイは、 プラスチック製を推奨します。 ステンレス製トレイを用いた 場合、トレイに色素が析出す る場合があります。 Dispotray (#06563-44) 検出 発色検出 1- ③ Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) #25985-50 と Metal Enhancer for DAB Stain#07388-24 との組合せによる高感度 Gray 染色 Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) #25985-50 と Metal Enhancer for DAB Stain#07388-24 を 併 用 す る こ と で グ レ イ に 染 色 で き ま す。 ま た、Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) 単独での使用よりも感度が 2 倍上昇します。 Peroxidase Stain DAB Kit(Brown Stain) (# 25985-50) 実験プロトコール 1. 試薬の調製 試薬の調製は使用直前に行い、調製後 10 分間以内に発色反応を開始してくださ い。 【メンブレン発色用溶液の調製 （10 cm x10 cm のメンブレン用）】 50 ～ 100 ml 用メスシリンダーに Metal Enhancer for DAB Stain 40 ml を分取し、 ペルオキシダーゼ染色 DAB キット（Brown Stain）の緩衝液 900 μｌ、発色原液 900 μｌ、基質試薬 900 μｌを加えて十分に混和してください。 2. 操作手順 ①ウエスタンブロッティングやドットブロッティングでメンブレン上に固定した 抗原にペルオキシダーゼ標識抗体を反応させた後、界面活性剤を含むりん酸 緩衝生理食塩水（PBS）またはトリス緩衝生理食塩水（TBS）で十分に洗浄します。 ②調製した発色液を Dispotray（＃ 06563-44）に入れ、洗浄したメンブレンを 浸して 5 ～ 60 分間室温で振とうします。 ③メンブレン上に泳動像の適当な染色が得られたら、メンブレンを発色液から 取り出して流水で 10 分間以上洗浄して反応を停止します。 上記製品について ・ 変異原性物質を含んでいます ので、取り扱いにはゴム手袋 および保護メガネなどを着用 してください。 ・ 発色液を入れるトレイは、 プラスチック製を推奨します。 ステンレス製トレイを用いた 場合、トレイに色素が析出す る場合があります。 Metal Enhancer for DAB Stain (#07388-24) 感度比較 ドットブロットによる DAB 染色液の性能比較 HRP conjugated antibody (pg) 400 200 100 50 25 （ナカライテスク）Brown キット + エンハンサー （ナカライテスク）Brown キット Dispotray (#06563-44) （A 社）汎用品（Ni+） （A 社）汎用品（Ni-） （A 社）高感度品 （B 社）高感度品 （C 社）1 液タイプ品 （D 社）錠剤タイプ品 エンハンサーを併用することにより、未使用に比べて感度が 2 倍程度上昇します。 もちろん Brown 単独でも、他社製品よりも感度よく検出できます。 17 検出 発色検出 2 BCIP-NBT Solution Kit #03937-60 実験プロトコール 1. 試薬の調製 試薬の調製は使用直前に行い、調製後 10 分間以内に発色反応を開始します。 試薬の調製後 30 分間以上経過すると、良好な染色性能が得られない可能性が あります。 BCIP-NBT Solution Kit (# 03937-60) 2. 発色液の調製（10 cm x10 cm のメンブレン用） ① まず、緩衝液を十分に転倒攪拌します。 ② 清潔な 50 ∼ 100 ml 用メスシリンダーに緩衝液 50 ml を分取し、マイクロ ピペットで発色原液 0.5 ml を加えて十分に混和します。 上記以外のスケールで発色液を調製する場合は、緩衝液 100 容量と発色原液 1 容量の割合で 混和します。 3. 操作手順 ①メンブレン上に固定した抗原に一次抗体を反応させた後、t-TBS で十分に洗 浄します。 （二次抗体を使用しない場合は一次抗体としてアルカリホスファ ターゼ標識抗体を使用し③に進む） ②二次抗体となるアルカリホスファターゼ標識抗体を反応させた後、t-TBS で 十分に洗浄します。 ③調製した発色液を清潔なプラスチック製トレイに入れ、洗浄したメンブレ ンを浸して室温で静置又は振とうします。 ④メンブレン上に泳動像の適当な染色が得られたら、メンブレンを発色液か ら取り出して流水で 10 分間以上洗浄して反応を停止します。 実施例 Dispotray (#06563-44) ALP 標識抗体を使用し、BCIP-NBT Solution Kit で発色 CBB 染色 M.W タンパク質の分離 マーカー 1 2 3 4 5 6 7 メンブレンへの転写 120,000 → ← Albumin ← IgG,H 鎖 50,000 → ブロッキング 36,000 → ← IgG,L 鎖 27,500 → 一次抗体インキュベーション 20,000 → 洗浄 泳動先端→ マーカー 二次抗体インキュベーション 発色反応 M.W マーカー 1 2 3 4 5 6 7 ＜実験条件＞ 120,000 → サンプル ：ヒト血清 50,000 → ← IgG,H 鎖 27,500 → ← IgG,L 鎖 20,000 → 泳動先端→ マーカー サンプル量 ：1; プレステインドマーカー 2;5 μ g、 3;1.7 μ g、4;0.55 μ g、5;0.2 μ g、 6;60ng、7;20ng メンブレン ：PVDF メンブレン 一次抗体 ：ヤギ抗ヒト IgG 二次抗体 ：ALP 標識ウサギ抗ヤギ IgG 発色時間 ：30 分 電気泳動 ：12.5％ SDS-PAGE(35 mA,40 分間 ) 18 ・アルカリホスファターゼ標識 抗体を反応させた後のメンブ レン洗浄に、t-PBS を使用する ことはできません。 アルカリホスファターゼが りん酸と反応することによ り酵素活性を失います。 メンブレンの洗浄は、t-TBS で 行ってください。 検出 Streptavidin Biotin Complex Peroxidase Kit #30462-30 を用いた増感検出法 実験プロトコール Streptavidin Biotin Complex Peroxidase Kit 1. 試薬の調製 【ストレプト ABC Working 溶液の調製】（Working 溶液は、冷蔵保存で数日間安定） ①キットに含まれる A 液、B 液の混合用容器 C に t-PBS を 5 ml 分取する。 ② A 液 2 滴および B 液 2 滴を加え、キットに含まれる A 液、B 液の混合用容器 C のフタをして転倒混和により混合し、30 分間放置後使用する。 (#30462-30) （Working 溶液は、使用直前に調製してください。） 【Chemi-Lumi One L Working 溶液の調製】 Solution A と Solution B を 1：1 の割合で混合します。 （Working 溶液量はブロッティングしたメンブレンに対して約 0.125ml/cm2 に相 当する量を使用します。） 2. 前準備 一次抗体反応 ① 一次抗体を t-TBS で希釈し、シェイカーで振とうしながら室温で 1 時間反応 させます。 ② t-TBS でメンブレンを洗浄します。 （5 分間 x2 回） Chemi-Lumi One L (#07880-70) 二次抗体反応 ① ビオチン標識抗体を反応させます。 （室温１時間） ② t-TBS でメンブレンを洗浄します。 （5 分間 x2 回） 3. 操作手順 ① Streptavidin Biotin Complex Peroxidase Kit(#30462-30) の Working 溶液を、 t-TBS で 10 倍希釈し、メンブレン上のビオチン標識抗体と反応させます。 ② t-TBS を用いてメンブレンを洗浄します。（5 分間 x4 回） ③ Chemi-Lumi One L の Working 溶液を調製します。 ④ブロッティングメンブレンの端をキムワイプ ® などに接触させて、洗浄後の残 存液を十分に除去します。 ⑤プラスチック製ラップフィルムを机上に敷き、その上にタンパク質吸着側が上 側になるようにブロッティングメンブレンを置きます。 ⑥上から Working 溶液をゆっくりと注いでメンブレンを浸し、１分間反応させ ます。 ⑦メンブレンの端をキムワイプ ® などに接触させて、余分な液を取り除き、メン ブレンを十分に包める程度の大きさの新しいプラスチック製ラップフィルムに タンパク質吸着側の面が下側になるようにブロッティングメンブレンを置きま す。 ⑧プラスチック製ラップフィルムでブロッティングメンブレンを包み、タンパク 質吸着側の面を上にしてフィルムカセットにいれます。 ⑨暗室内で、プラスチック製ラップフィルムで包んだブロッティングメンブレン の上にＸ線フィルムを置き、フィルムカセットを閉め、3 分間感光させます。 ⑩Ｘ線フィルムを現像液につけ、像が確認できるまで現像します。 ⑪Ｘ線フィルムを停止液（0.3% 酢酸水溶液）につけ、現像を停止します。 ⑫Ｘ線フィルムを定着液につけ、像を定着させます。 ⑬Ｘ線フィルムを暗室から出し、結果を確認します。 ブロッキングに Blocking One を使用された場合のご注意 アビジン・ビオチン反応を利用した検出系では、Blocking One に含まれるウシ由来タン パク質とアビジンが交差反応する可能性があります。使用に先立って、交差反応の有無を ご確認ください。 19 メンブレンとプラスチック製ラ ップフィルムの間に気泡が入ら ないよう、またプラスチック製 ラップフィルムの折れやシワが 表面にできないように注意して ください。 検出 Signal Enhancer HIKARI（抗原抗体反応促進剤）（#02267-41 50ml / #02270-81 250ml） 実験プロトコール 1. 操作手順 ①転写後、ブロッキングまでが終了した転写膜を準備します。 ②一次抗体を A 液で希釈します。（二次抗体を使用しない場合は B 液を用いて 希釈します）抗体の希釈倍率は抗体メーカーの推奨する希釈倍率を参照し最 適化してください。 ③一次抗体を反応させます。（室温、1 時間） ④ t-TBS を用いてメンブレンを洗浄します。（10 分間 x3 回 )( 二次抗体を使用 しない場合は⑧に進んでください。) ⑤二次抗体をＢ液で希釈します。抗体の希釈倍率は抗体メーカーの推奨する希 釈倍率を参照し最適化してください。 ⑥二次抗体を反応させます。（室温１時間） ⑦ t-TBS を用いてメンブレンを洗浄します。（10 分間 x3 回 ) ⑧検出操作に入ります。 Signal Enhancer HIKARI （#02267-41 50ml） （#02270-81 250ml） （#02267-41 50ml） （#02270-81 250ml） Chemi-Lumi One Super (#02230-30) 実施例 例 1）検出感度や特異性への影響 本製品を従来の t-TBS や t-PBS などの一次抗体および二次抗体の反応液 ( 希釈 液 ) の代わりに使用するだけで、ウェスタンブロッティングにおける感度・ 特異性が向上します。 ■特異性と検出感度の向上 HIKARI ■検出感度の向上 3% BSA / t-TBS TBS-T HIKARI Total protein: 1μg 2μg 3μg Skim Milk / t-PBS PBS-T 1μg 2μg 3μg 38 28 - pJNK - 17 14 - Non-specific - band 一次抗体：Anti-pJNK(1：1000) 二次抗体：Anti-Rabbit IgG-HRP （1：5000） サンプル：マウス胎児線維芽細胞 検出試薬：SuperSignal R West Pico （Thermo Fisher Scientific(Pierce)) 一次抗体：Anti-Rac1(1：1000) 二次抗体：Anti-Mouse IgG-HRP（1：2500） サンプル：ラット初代皮質ニューロン 検出試薬：ECL（GE Healthcare) データご提供：Dr.K.Ishizuka, Department of Psychiatry, Johns Hopkins University School of Medicine データご提供：Dr.S.Matsuzawa, Signal Transduction, NCI Cancer Center, Burnham Institute for Medical Research 例 2）Chemi-Lumi One Super および Chemi-Lumi One L と HIKARI の組み合わせによる検出感度の向上 Chemi-Lumi One Super および Chemi-Lumi One L を Signal Enhancer HIKARI for Western Blotting and ELISA と併用することで、高感度かつ低バックグラウ ンドに検出できることが示されています。 ＜実験条件＞ サンプル ：HeLa 細胞抽出物 一次抗体 ：Anti- β -Actin(C4)(mouse)(SantaCruz 社 #SC-4778) サンプル量 ：1;1667ng/well、2;333ng/well、 3;67ng/well、4;13ng/well、 5;3ng/well メンブレン ：PVDF メンブレン 転写 ：15V、50 分間 二次抗体 ：Anti-Mouse IgG(Goat), HRP conjugate (Santa Cruz 社 #SC-2005) 検出 ：LAS-3000、露光時間 3 分 20 Chemi-Lumi One L (#07880-70) 検出 他社高感度製品との比較 実験プロトコール 検出反応プロトコール A（結果データ中）は P11 の Chemi-Lumi One Super をご参照ください。 Signal Enhancer HIKARI （#02267-41 50ml） （#02270-81 250ml） 増感反応プロトコール B（結果データ中）は P19 の Signal Enhancer HIKARI（抗原抗体反応促進剤） をご参照ください。 結果 低バックグラウンドで高感度検出が可能 （#02267-41 50ml） （#02270-81 250ml） Chemi-Lumi One Super (#02230-30) A B 条件 サンプル ：HL-60 細胞抽出タンパク質（1：0.5μg、2：0.25μg、3：0.125μg） ブロッキング試薬：各検出試薬推奨ブロッキング剤を使用 （ブロッキング時間は各ブロッキング剤推奨処置時間で処置） 一次抗体 ：マウス抗βアクチン抗体（Santa Cruz：sc-47778）1,000 倍希釈 二次抗体 ：HRP 標識抗マウス IgG（Santa Cruz：sc-2005）10,000 倍希釈 検出試薬 ：Chemi-Lumi One L（1 分間反応）、Chemi-Lumi One Super（1 分間反応）、 A 社新規高感度検出試薬（5 分間反応）、A 社高感度検出試薬（5 分間反応） 検出 ：LAS-3000、検出感度 High、露光時間 1 分および 10 分（反応終了より 2 分後に測定） 評価 Chemi-Lumi One Super は Chemi-Lumi One L および A 社高感度検出試薬よりも感 度が高く、A 社新規高感度検出試薬と同等の感度を示しています。また、感度を 上げるため露光時間の延長もしくはシグナルエンハンサー HIKARI を使用すると、 A 社新規高感度検出試薬と A 社高感度検出用ブロッキング剤の組み合わせでは顕 著なバックグラウンドの上昇が見られますが、Chemi-Lumi One Super と Blocking One の組み合わせの場合、より低バックグラウンドで検出できます。 21 ストリッピング ストリッピング法は、ウェスタンブロッティングで目的タンパク質を複数の異な る抗体で検出することや、複数の異なるタンパク質を検出することを可能にし、 貴重・微量なタンパク質を扱う研究者にとって、重要な実験プロセスです。 従来は毒物である 2 - メルカプトエタノール (2ME) を含む試薬を用いて、高温処 理が必要でしたが、弊社では加温が不要な WB Stripping Solution 、WB Stripping Solution Strong を用意しています。 WB Stripping Solution (#05364-55) 各手法の比較 手法 従来法 WB Stripping Solution & WB Stripping Solution Strong 不含（不快な匂いがしない） 2ME( 毒物 ) 含有 加温 50℃ 不要 処理時間 30 分 15 分程度 ( 場合により適宜増減してください ) 使用可能な メンブレン PVDF メンブレン 実験プロトコール WB Stripping Solution WB Stripping Solution Strong トレイやピンセット等は金属・ 樹脂製品ともに使用できます。 使 用 量 ブロッティングメンブレン（ミニゲルサイズ）には本製品 20ml を使用してください。 化学発光法の検出に使用したブロッティ 化学発光法の検出に使用したブロッティ ングメンブレンは、0.05% (V/V) t-PBS ングメンブレンは、イオン交換水により 洗 浄 または t-TBS により洗浄（5 分間程度）し 洗浄（1 分間程度）してください。 てください。 処 理 WB Stripping Solution Strong (#05677-65) 室温に戻した本製品はブロッティングメンブレンが浸る程度の液量を樹脂製トレイ 等の容器へ注いでください。 ブロッティングメンブレンを浸して室温で緩やかに振とう (5 ∼ 15 分間 ) します。 洗 浄 本製品を廃液した後、0.05% (V/V)t-PBS または t-TBS により洗浄（5 分間程度）して ください。 反 応 洗浄したブロッティングメンブレンは新たな抗体反応を行うことができます。 下記の何れの場合もブロッティングメンブレンに抗体が残存していると、以前の検 出像が検出されます。 残存抗体の 標識抗体の残存は、本製品で処理した後のブロッティングメンブレンをそのまま化 確認方法 学発光法で検出することにより確認することができます。 未標識抗体の残存は、本製品で処理した後のブロッティングメンブレンを二次抗体 （標識抗体）と反応させた後、化学発光法で検出することにより確認できます。 22 トレイやピンセット等は樹脂 製品を使用してください。 ストリッピング 例 1）HRP 標識抗体を使用し、Chemi-Lumi One L による化学発光にて検出 β -Actin β -Tubulin ＜実験条件＞ サンプル ：HL-60 細胞タンパク質抽出液（3.2 μｇ / レーン） メンブレン ：PVDF メンブレン ブロッキング ：Blocking One 30 分 室温 一次抗体 ：Anti- β -Actin 1 時間 室温 （1：10,000 Santa Cruz） 二次抗体 ：Anti-Mouse IgG HRP conjugated 1 時間 室温 （1：10,000 Santa Cruz） 検出試薬 ：Chemi-Lumi One L 撮影 ：LAS-3000･･･ 左図 ↓ ストリッピング WB Stripping Solution Strong 60 分 ↓ ブロッキング ：Blocking One 30 分 室温 一次抗体 ：Anti- β -Tubulin 1 時間 室温 (1：200 Santa Cruz) 二次抗体 ：Anti-Mouse IgG HRP conjugated 1 時間 室温 （1：10,000 Santa Cruz） 検出試薬 ：Chemi-Lumi One L 撮影 ：LAS-3000･･･ 右図 Blocking One (#03953-95) Chemi-Lumi One L (#07880-70) 例 2）WB Strippng Solution（データご提供：東京工業大学生命理工学部 赤池研究室） 1 回目 2 回目 ＜実験条件＞ ブロッキング ：Blocking One 30 分 洗浄 ：t-TBS 一次抗体 ：Anti-paxillin (mouse IgG) 二次抗体 ：Anti-mouse IgG-POD 検出 ：光学発光検出キット ↓ ストリッピング WB Stripping Solution 室温 15 分処理 ↓ ブロッキング ：Blocking One 30 分 洗浄 ：t-TBS 一次抗体 ：Anti-vinculin (mouse IgG) Anti-actin (mouse IgG) ：Anti-mouse IgG-POD ：Chemi-Lumi One (#05027-20) 二次抗体 検出試薬 23 WB Stripping Solution Strong (#05677-65) WB Stripping Solution (#05364-55) ストリッピング 例 3）WB Stripping Solution と WB Stripping Solution Strong の 違い 5000ng, 500ng, 50ng, 5ng の抗原 (c-Myc-GST) を結合させた PVDF メンブレン を HRP 標識抗 GST 抗体で反応させて下記の各溶液を用いて室温で 緩やかに振 とう (10 分間 ) 処理した。 WB Stripping Solution (#05364-55) a. 0.05%(V/V)、t- PBS b. 2%(W/V) SDS, 100mM 2 -Mercaptoethanol, 62.5mM Tris-HCl(pH 6.7) c. WB Stripping Solution d. WB Stripping Solution Strong その後、PVDF メンブレンに残存した HRP 標識抗 GST 抗体を検出するため、t- PBS で 1 分間洗浄後、 化学発光検出した。 e. は、d. を HRP 標識抗 c-Myc 抗体で再検出した 結果 a. とほぼ同様の結果が得られた。 WB Stripping Solution Strong (#05677-65) 使用上の注意 WB Stripping Solution WB Stripping Solution Strong 容器等 本製品を分注するトレイやピンセット 等は金属・樹脂製品ともに使用できま す。 組 成 本製品は酸性（pH2 ～ 3）の水溶液です。 本製品は還元性を有しています。 保 護 使用時は、保護着、保護メガネ、保護手袋等の保護具を着用してご使用ください。 身体等に付着した場合は大量の水で洗い流して必要に応じて医師の診察を受け てください。 使用時 本製品は室温に戻してからご使用ください。本製品は冷蔵保存ですが、保存環境 によっては界面活性剤が析出する場合があります。析出物が存在すると組成濃度 が変化しますので、析出物を溶解させてから使用してください。 適 応 本製品は、TMB、DAB、4 -Chloro-1 -naphtol 等の発色検出法で染色されたブロッ ティングメンブレンの再利用には適していません。また、発色検出法の染色像は 消えません。 混合使用 両製品を混合すると反応して白い沈殿を生じます。両製品を交互に使用される場 合は、剥離したブロッティングメンブレンを適当な緩衝液、あるいは精製水で充 分に洗浄（3 ～ 5 回程度）して試液を完全に取り除いてから次の製品を使用して ください。なお、使用されるトレイ等はそれぞれ別のものを用いてください。 本製品を分注するトレイやピンセット 等は樹脂製品を使用してください。金 属製品は本製品の性能を劣化させます。 ご注意 試験・研究用以外には使用しないでください。 ※記載の内容は、'11 年 9 月現在の情報に基づいております。 ※価格に消費税は含まれておりません。 1109