Kobe University Repository: Kernel

Kobe University Repository : Kernel
Title
ラット新生仔一過性低酸素虚血負荷が線条体局所血流と
プリン体代謝に与える効果に関する研究(Effects of
Hypoxica/Isehcmia and Reperfusion on Regional
Cerebral Blood Flow : Extracellular Levels of Adenosine
and Purine Metabolited in Neonatal Rat Striatum)
Author(s)
三宅, 理 / 米谷, 昌彦
Citation
神戸大学医学部紀要=Medical journal of Kobe
University,60(2/3/4):209-217
Issue date
2000-03
Resource Type
Departmental Bulletin Paper / 紀要論文
Resource Version
publisher
DOI
URL
http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/00042547
Create Date: 2017-03-31
8
9
ブツト新生仔一過性低酸素虚血負荷が線条体局所血流と
プリン体代謝に与える効果に関する研究
二宅
理，米谷昌彦
神戸大学医学部小児科学講座
(指導:中村肇教捜)
連絡先:米谷
神戸大学低学部小児科
千6
5
0
0
0
1
7 神岡市中央区楠町 1ι1
内線:6
0
9
0，FAX:0
7
83
8
26
0
9
9
“
崎
(平成 1
2年 2月1
6日受付)
要
約
締
C
a
d
e
n
o
s
i
n
e
) は脳の血流調節物質や神
新生児の治療管理方法が日進月歩していく中で，神
経伝達物質のーっとして歳血後再瀧流による神経細胞
経学的予後の改害事は未だ大きな課題である。出生時に
障害の発症に関与するといわれている。今回の研究で
合併した仮死に発症する低酸素性虚血性脳症
は
， ラット新生仔一過性低酸素虚血モデルを作成して，
C
h
y
p
o
x
i
c
/
i
s
c
h
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ce
n
c
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l
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a
t
h
y:
H
I
E
)は
，
線条体での局所血流の変化と，細胞外液中のアデノシ
古くから多くの研究者遣によってその棲雑な病態が明
ンとその代謝産物であるプリン体の動態について検討
らかにされつつあるが，未だに解明されない点も山積
こは，左総顕動脈のクリッ
した。問一過性低酸紫虚血負荷 i
している。最近の研究では，低酸素虚血のストレスそ
8%酸素の股入を行ったのち 6
0分後にクリッ
のものでなく，その後の再灘流あるいは再酸素化が障
アデノシン
ピングと
ピングと低酸素負荷を共に解除する方法を用いた。線
害の発生に大きく寄与することが指摘されている
条体局所血流量は低酸素虚血負荷により負荷前の 4
8士
蘇生により脳組織が再瀧流されると同時に，白血球の
22%まで減少するが，負荷終了後には速やかに前傾ま
0
分後には 7
6:
t25%まで漸減した。
で回復し，さらに 6
遊走浸潤が起こりへその傷害組織からは活性酸素が
線条体細胞外アデノシン濃度は，負荷により徐々に増
ことが明らかになってきた。
。
1.2)
発生する 4.5) など，再瀧流時に神経傷害の増悪を招く
90%をピ…クとして負荷終了後6
加し，負荷前の平均 7
くから，再濯流に関わる血流調節悶子のーっとし
0
分ではほぼ前値まで彼した。アヂノシンの代謝産物
てアデノシン
であるイノシン，
ヒポキサンチン，キサンチンの濃度
後の冠動脈再瀧流に関与することは古くから知られて
は，負荷開始後，
3
0
分ごろより増加し始め，それぞれ
5
0
.
6
倍
， 3
7
.
2倍まで増加した。
いる九アデノシンはプリンヌクレオシドの代謝産物
C
A
d
e
n
o
s
i
n
e
) が挙げられ，心筋虚印
6
.
2倍
，
負荷前の平均 1
の分解過租で生成され，血管拡張因子と
として ATP
キサンチンは負荷終了後には速やかに減少したのに対
しての作用を持っている。
B
e
r
n
eら7)は脳内でもアデ
ヒポキサンチンは終了後6
0
分でも高備が持続して
ノシンは分泌され脳血管に対して血管拡強作用を荷し
いた。細胞外アデノシン濃度は低酸素産血と再瀧流時
ていることを示した。アデノシンアンタゴニストであ
に荷意な増加を認め，アデノシンが再瀧流時の血流維
るテオフィリンを用いた間接的な証明も多数あ
持に関与する可能性が示唆された。一方，再瀧流時に
9
，
1
0，へまた同じく血管拡張作用を持つとされる
り8，
し
，
とボネサンチン濃度の高傭が持続することは，活性酸
酸化窓業とも相作用のあることが報告されている九
こ関わる可能性があ
素の発生源となり再瀧流陣帯発痕 l
最近ではアデノシンはプレシナプスに存在するアデノ
ると考えられた。
シンセブターを介し，神経細胞への過剰なカルシウム
イオンの流入を阻止することにより脳保護に働く可能
性が指摘されているが，その一方で，その代謝過程に
おいて活性酸素の発生が助長されることにより，組織
キーワ…ド:低酸紫性虚雌性脳症，
局所脳血流，アデノシン，
(
2
0
9
)
ヒポキサンチン，キサンチン
9
0
法
傷害を引き起こす可能性も示唆されているヘ
方
活性酸素の発生にはいくつかの代謝経路が知られ
そのひとつがキサンチン酸化還元酵素
Sprague-Dawley ラット 7日齢 (n=7) を対象
(
x
a
n
t
h
i
n
e
o
x
i
d
o
r
e
d
u
c
t
a
s
e
;X
OR) を 介 す る キ サ
として，一過性HIモデルを作成した 14，15，16)。ウレタン
XORが脳内の毛
C
e
t
h
y
lcarbamate; 東京化成，東京)を 1.8g/kgを
細血管内皮細胞に富んでいることを示している ω。ア
皮下投与により麻酔した。麻酔後ラットの左頚部に
デノシンはその代謝経路の上流に位置しており， イノシ
5mmの皮膚切聞を施し，軟部組織を剥離して左総頚
ンCin
o
s
i
n
e
)を経てヒポキサンチン (
h
y
p
o
x
a
n
t
h
i
n
e
)
動脈を同定し，絹糸を懸けた。さらに頭皮を正中にて
ており，
e
t
zらは，
ンチン代謝経路がある。 B
からキサンチン (
x
a
n
t
h
i
n
e
) さらに尿酸へと代謝さ
切開し左頭蓋にドリルで直径 2ミリの穴を開けた後，
が NA
れる。その過程において，平穏状態では XOR
ラットの頭部を固定装置に固定した。左線条体へ向け
Dを 還 元 剤 と す る キ サ ン チ ン ・ ハ イ ド ロ ゲ ナ ー ゼ
て，プレ夕、、マ Cbregma
(xanthine-hydrogenase) を主体とするのに対し，
り，鼻側へ 1.Omm
，外側へ2.5mm，深さ 5.0mmの位
低酸素虚血・再濯流時には，酸素を還元剤とするハ
サンチン・オキシダーゼ C
x
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h
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e
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x
i
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s
e
) が優
ヒトの大泉門に相当)よ
置 に Laser Doppler血 流 計 C
PF319， Perimed，
Stockholm) のマイクロプロープとマイクロダイア
i
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a
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a
l
y
t
i
c
a
lSystems，
リシス・プローブ CCUPll，B
勢となり， この代謝過干呈において活性酸素が発生す
る15 16) (図1)。
東京)を合わせて留置した。マイクロダイアリシス・
今回，我々はラット新生仔を用いて一過性低酸素虚
フ。ローブは人工脳脊髄液にて還流した。処置後，装置
，
血 (
hypoxia/isckemia: HDモデルを作成し，低
と組織の安定を図るために 2時間の安定期を置いた。
酸素虚血開始前から終了後の再濯流に至るまで，経時
体温は，保温マット CCMA150，B
i
o
a
n
a
l
y
t
i
c
a
l Sys
的に線条体における脳血流をモニタリングながら，マ
tems，東京)を用いて 3
7
.
0Cに設定した。
0
イクロダイアリシス法を用いて経時的に採取した濯流
一過性の HI
負荷は，予め絹糸を懸けておいた左総
液よりアデノシンとその代謝産物であるプリン体の濃
頚動脈を脳外科用動脈癌クリップ C
S
u
g
i
t
a Mini
度を測定することにより，それらの動態を明らかにす
Aneurysm C
l
i
p
; Mizuho，東京)でクリッピング
した後，ラットを設置したチャンパー内を直ちに 8
ることを目的とした。
Adenosine三一一 AMP守 一 ADP三一-ATP
Xanthine
dehydrogenase
Xanthine
U
r
i
ca
c
i
d
図1.プリン体の代謝および活性酸素の発生経路
(
2
1
0
)
Xanthine
oxidase
9
1
%酸素で満たし， 6
0
分後にクリッピングも解除すると
ほぽ負荷前値にまで復帰した(図 3)。
0
分前より負荷終
同時に低酸素負荷も中止した。負荷3
イノシン，
ヒポキサンチン，キサンチンの濃度は，
了後 6
0分までの 1
5
0分間にわたり， LaserDoppler血
負荷開始後 3
0分頃より増加し始め，それぞれ，最高，
流計による線条体局血流量のモニタリングを行い，同
6
.
2倍
， 5
0
.
6倍
， 3
7
.
2倍 ま で 増 加 し た
負荷前の平均 1
0
分毎に採取された
時にマイクロダイアリシスにより 1
(
図4
，5
，6
)。キサンチンは負荷終了後には速やかに減
濯流液から。アデノシンとプリン体代謝産物，すなわ
少したのに対し，
ちイノシン，
0分後でも高値を持続していた。
し続け， 6
ヒボキサンチン，キサンチンの各々の濃
ヒポキサンチンは負荷終了後も増加
度を， HPLCと蛍光検出器 (CMA，B
i
o
a
n
a
l
y
t
i
c
a
l
Systems，東京)を用いて測定した的。なお，データ
考
察
nstruments，
の処理解析には MacLab/4e (AD I
名古屋)を用いた。統計学的検定には one-way AN
アデノシンは心臓 18， ぺ 腎 臓 20)等 の 組 織 濯 流 の 維 持
OVAとFisher-PLSD法を用いて， p<O，
0
5を有意差
に関与することが指摘され，新生児遷延性肺高血圧症
ありと判定とした。
に対しアデノシンの全身投与で有効であった刊という
報告も見られる。アデノシンは暗乳動物の中枢神経系
結
果
において神経伝達物質としても重要な因子である 22)な
ど，古くからその潜在的な役割は注目されていたが，
虚血の程度を評価するために， L
aser Doppler血
全身的に普遍的に存在するためその動態を追うことが
流計による線条体局所血流量のモニタリングを行った。
困難であった。近年， HPLCを 用 い た 分 析 な ど で 評
8:
t2
2
低酸素虚血負荷により線条体血流量は負荷前の 4
価が可能となり，また，マイクロダイアリシス法の応
%まで減少し，負荷終了後は速やかにほぼ前値まで
用により，経時的の脳局所での変化を追跡することが
6土 25%に漸減した
回復したが，さらに 1時間後には 7
可能となった。
(
図 2)。この結果より，我々の用いた HIモデルでは
今回，我々はラット新生仔を用いて一過性の脳 HI
約 50%の虚血がなされていることが示された。
モデルを作成し，アデノシンとその代謝産物であるプ
次にラット線条体間質における各プリン体濃度の変
リン体の，虚血低酸素負荷と再濯流時の細胞外濃度の
化を示す。アデノシンの濃度は，負荷により徐々に増
動態について明らかにした。ラット新生仔を用いた
0分にてピークを迎えた。負荷前
加し，再瀧流開始後 1
HIモデルは，片側頚動脈の結主主離断と 8 %酸 素 を 負
の 7
.
9倍をピークとして漸減し，負荷終了 6
0分後には
iceら23)の方法が，それ以降の多くの研究者ら
荷する R
eE4E4E
nununu
a守 司
4nu
Reperfusion
一
-
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・
・
・
・
・
柿
・
・
“
*
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室
田 gShoav}言。E B。一国首﹄昔話ω
HypoxiaIlschemia
ー
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ー
・
車
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*
*
*
80
材料材料一******
*
*
60
40
20
0
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2
0 -10
o
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120
Time(min)
図2
. 一過性低酸素虚血負荷に対するラット脳線条体血流量の変化
数値は平均値±標準偏差にて示した口負荷前の基準値を 1
00%として比較した。
<
0
.
0
5を **はp
<
O
.
0
1を示す。
*はp
(
2
11
)
9
2
。
唱
雪6525霊gS喜ag奪還
Reperfusion
8642
HypoxlaIlschemia
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-20
唱
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10
20
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40 50 60
T
1m e(min)
70
80
90
唱00
o
唱
唱20
図3
. 低酸素虚血負荷に対する線条体細胞外アデノシン濃度の変化
数値は平均値±標準偏差にて示した。負荷開始時を基準値として
比較した。
<
O
.
0
5を示す。
*はp
40
HypoxlaIlschemla
o
-20
・
唱
o
0
o
唱
20
30 40 50
Tlme(min)
Reperfuslon
60
70
80
90
唱00 唱10 唱20
図4
. 低酸素虚血負荷に対する線条体細胞外イノシン濃度の変化
数値は平均値±標準偏差にて示した。負荷開始時を基準値として
比較した。
<
O
.
0
5を，川 p
<
O
.
O
lを示す。
*はp
30
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HypoxlaIlschen
Reperfuslon
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30
40 50
Time(min)
60
70
80
90
唱00 官官
o 120
図5
. 低酸素虚血負荷に対する線条体細胞外ヒポキサンチン濃度の変化
数値は平均値±標準偏差にて示した。負荷開始時を基準値として
比較した。
*はp
<
O
.
0
5を
， *
*
p
<
O
.
0
1を示す。
(
2
1
2
)
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Edwa
nunwnwnwnu
ra0505援護側 Mg援者出
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暗唱咽内届噌，
o
制
20 ・10
0
10
20
30 40
50
60
70
80 90 100 110 120
前m
e(min)
図6
. 低酸素虚血負荷に対する線条体細胞外キサンチン濃度の変化
数備は平均値士標準偏まにで示した。負荷開始時を慕準備として
比較した。
本はpく0
.
0
5を.pく0
.
0
1を示す。
ラット新生仔を
酸紫 E
盤血時に徐々に増加を示し，負荷後半での血流量
低酸撲に嘆すのみではその後の神経傷害を引き組こす
増加に関与していることをうかがわせ，再灘流がなさ
ことはできないことが病理学的に示されており 26) 我々
れてから徐々に減少に転じており，アデノシンが再瀧
の以前の検討でも，低酸素だけではむしろうット脳血
流へ向けての血流維持に関与している可能性が示唆さ
流は増加することを報告している 2九 低 酸 素 に 虚 血 を
れた。アデノシンは血流調節悶子としてだ、けではなく，
によって用いられている仇ヘ一方，
iceら
加えることが重要であるものの，虚血方法が R
棄物質のーっとして虚血低酸素負荷に対して神
神経伝i
のような恒久的結殺では，再瀧流させることができな
経保護的に働くのか，それとも傷害増悪に働くのか，
いため，我々は，今回，頚動脈の一過性クリッピング
議論のあるところである。アデノシンには興奮性神経
という新しい方法を開発した。ラットは左右大脳半球
伝達物質であるグルタミン酸の神経終末からの放出を
聞の血管短絡路が存在し，左頚動脈の片側クリッピン
抑制する作用があり，内因性のアデノシンは脳保護に
グのみでは有意な慮血にはならなし仰。しかし，我々
働くとの報告があるヘ
Iモデルでは，そこに低酸素負荷を加えることで，
のH
一方，アデノシンの代謝産物であるプリン体類の虚
負荷側において約 50%まで脳血流量を減少させること
血負荷における動態についての報告は，心筋や大脳皮
aserDoppler1
血流計により確認
ができることが. L
質では既にみられている 17.34)。両者とも，我々の結果
された。また，再謹流により速やかに負荷前のレベル
同様に，成血によりアデノシン，イノシン，
0分以内に再度漸減することが観
まで回復し，その後 6
ンチン，キサンチン全ての増加を認めている。ヒポキ
察された。重度の嘩血後には障害組織において，血管
サンチン，キサンチンは，虚血を伴わない低酸業負荷
内皮細胞の傷害や腫脹，血管内凝固，遊走した頼粒球
刷
。 しか
のみでも増加が見られるという報告もある 35，
の微細塞栓などが起こるため.再濯流の防げが起こ
し，我々のモデルのように. h
盤血低酸諜さらにその後
る 1)。麻酔及び使襲による影響も考慮すべきことで
の肖瀧流時まで含めて，幼弱な脳内での動き長追跡
ヒボキサ
あるが，我々のモデルに見られる再灘流時の血流盤の
0我々の検討では，
した報告は未だみられていなし '
低下にもこれらの因子が反映されているのかもしれな
瀧流時には線条体において，アデノシン，イノシン，
い。虚血を伴わない低酸素下では，新生豚の脳でアデ
ヒポキサンチンは壊やか ι減少したのに対し，
ノシンが低酸素下の血流維持に関与すると報告されて
0
分後でも高傾告維持し続けてい
サンチンのみはその 6
3
0
)。低血糖時に脳血流が増加する機序にもアデ
いる 29，
た。再瀧流時にヒポキサンチンの濃度の高値が持続す
ヒポキ
ノシンが関与する 3，1 32)ことが示されており，様々な状
ることは，傷害組織内の血管内皮におけるキサンチン・
況下で，アデノシンは血管拡張という役割を果たとて
オキシダーゼの活性化に伴い，ハイドロキシルラジカ
いると考えられている。我々の H
Iモデルで見たラッ
ルやスーパーオキサイドなど活性酸素の発生源となる
ト新生仔線条体細胞外のアデノシン濃度の変化は，低
可能性が十分に考えられる。 Lubecら川ま，酸素投与
(
2
1
3
)
9
4
6) Berne，R.M.，B1ackmon， J
.
R
.， Gardner，
T
.
H
.
: Hypoxiaand coronary blood f
l
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.
J
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e
st
.3
6:1
1
0
1
1
1
0
6，1
9
5
7
.
7) Berne，R.M.，Rubio，R.，Curnish，R
.
R
.
:
R
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l
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fadenosinefromi
s
c
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cb
r
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i
n
.
を受けた新生児ではよく多くの活性酸素の発生が見ら
れると報告している。再瀧流後 l
こヒポキサンチン濃度
の高備が線条体にて遷延することは，再び酸素が供給
されることと相まって，活性酸素による神経障害の発
るのかもしれない。
外でのアデノシン濃度の上昇は，問所血流維持や神経
E
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tonc
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l a
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興奮抑制を通じて傷害発生に保護的に作用することが
n
u
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5:2
6
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2
7
1，1
9
7
4
.
期待できるが，その代謝過程で産生されるプリン体の
.日
， J
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.， Raymond， R.M.:
8) 日merson， T
濃度が再瀧流時に高値を保っていたことは，活性酸素
l
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による傷害の惹起につながるおそれがある。キサンチ
hypoxic hyperemia i
nt
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. Am. J
.
Physiol
.2
4
1:H134-H138，1
9
81
.
虚血低酸業負荷に対する新生仔ラットの線条体細胞
ンオキシダーゼ阻害剤などによるプリン体の産生抑制
.，Ngai，A.L.，Ko，K.R.，Winn，
9) Morii，S
H.R.: Roleo
f adenosine i
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. Am. J
.
.2
5
3:H165H175，1
9
8
7
.
Physiol
が，成血低酸素による脳障害の抑制に有効かどうか，
今後， このモデルを用いて，さらに検討したいと考え
ている。
謝
静
ゅ
1
0
) Pinard，E
.
， P
uiroud，S
.，S
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ぉ J.:Roleof
adenosine i
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1 hypoxic hyperemia
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. BrainR
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8
1:1
2
41
3
0，1
9
8
9
.
今回の研究に対して，御指導，御助言いただき，本
論文の御校閲をいただいた中村議教授に深謝いたしま
す
。
削
1
1
)H
a
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e
r， C
.， Kuschinsky， W
.
: Moderate
文 献
hypoxia
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1
) Fellman，V.，R
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