Comments
Transcript
ノボサーティーン静注用 2500 2.6.1 緒言 ノボノルディスクファーマ株式会社
1 of 5 ノボサーティーン静注用 2500 2.6.1 緒言 ノボ ノルディスク ファーマ株式会社 2 of 5 2.6.1.1. 内因性血液凝固第 XIII 因子の作用機序 血液凝固第 XIII 因子（以下、FXIII）トランスグルタミナーゼ前駆体であり、血液凝固カスケードの 中で最終段階の酵素である。血管壁の損傷に伴って凝固カスケードが活性化される。その結果、フィ ブリノゲンがフィブリンモノマーに転換され、フィブリンモノマーは重合化により、傷害部位にフィ ブリン塊を形成する1。血管壁傷害部位でトロンビンによって FXIII が活性化されると、活性型 FXIII （以下、FXIIIa）はフィブリンに結合し、隣接するフィブリン分子間の数箇所のアミド結合による架橋 の形成を触媒する2, 3。この架橋はフィブリン塊の機械的強度を高める4, 5。フィブリン分子の架橋結合 に加え、FXIIIa は、線溶の抑制や創傷治癒の促進に関与する多くの血漿蛋白及び細胞外マトリックス 蛋白をフィブリン塊の中に取り込む6, 7。これらの蛋白には、プラスミンによるフィブリン塊の分解に 対する主要なインヒビターである抗線溶蛋白の α2 アンチプラスミンも含まれる。このように FXIII は 凝固塊の機械的強度及び生理的な性質をともに変化させ、正常な止血機構に不可欠の機能を有する 1, 8, 9 。 FXIII は血漿中では、強力に非共有結合した 2 つの FXIII A サブユニット及び 2 つの FXIII B サブユニ ットから構成される非活性型酵素前駆体のヘテロテトラマー（A2B2）として存在する。FXIII A サブユ ニットは FXIII 酵素の触媒部位を有している。一方、FXIII B サブユニットは循環血中で FXIII A サブユ ニットの担体分子として機能することで FXIII A サブユニットの循環血中での半減期を延長させる10, 11。 トロンビンによる蛋白質分解により、FXIII A サブユニットは FXIII B サブユニットから遊離し、FXIII 酵素の活性化部位が露呈する 11。担体である FXIII B サブユニットは、血漿中で過剰に存在しており、 およそ 50%超の FXIII B サブユニットは複合体を形成しない遊離型として循環している12, 13。 3 of 5 2.6.1.2. 遺伝子組換え血液凝固第 XIII 因子 遺伝子組換え血液凝固第 XIII 因子（以下、rFXIII）は 2 つの rFXIII A サブユニットから構成されるホ モダイマーで、ヒト内因性 FXIII A サブユニットホモダイマーと構造的に同一である。rFXIII A サブユ ニットは、N 末端セリンがアセチル化した 731 個のアミノ酸鎖である。rFXIII がトロンビンで活性化さ れる際に、37 個のアミノ酸から成る活性化ペプチドが A サブユニットの N 末端から開裂する。rFXIII A サブユニットのモノマーは約 83.2 kD、ホモダイマーは約 166.4 kDa の分子量を有する。rFXIII は、ヒ トあるいは動物由来の原材料を使用せず、酵母（Saccharomyces cerevisiae）生産菌系で遺伝子組換え技 術を用いて産生される。rFXIII（A サブユニットホモダイマー）の高次構造を図 2.6.1- 1 に示す。rFXIII の国際一般名（INN）は catridecacog である。 図 2.6.1- 1 rFXIII（A2 ホモダイマー）の高次構造 シリンダー：alpha helix、矢印：beta strand、灰色の球：活性化部位。A サブユニット単量体の N-末端及び C-末端及び構造ドメインを表示している。 4 of 5 本剤の目標とする効能又は効果は「先天性血液凝固第 XIII 因子 A サブユニット欠乏患者における出 血傾向の抑制」である。推奨用量は 35 IU/kg（0.21 mg/kg）であり、約 1 ヶ月に 1 回静脈内へボーラス 投与する。 rFXIII は傷害部位でトロンビンにより活性化されることを期待して投与される酵素前駆体である。非 臨床概要では、酵素前駆体すなわち非活性型の分子は rFXIII、活性型 rFXIII を rFXIIIa、トロンビンに より活性化された rFXIII を rFXIIIa*、非蛋白分解的に活性化された rFXIII を rFXIIIa°と表記する。 5 of 5 参考文献 1 Muszbek L, Yee VC, Hevessy Z. Blood Coagulation Factor XIII: Structure and Function. Thromb Res. 1999; 94: 271-305. 2 Mosesson MW. Fibrinogen and Fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 2005; 3: 1894-1904. 3 Weisel JW, Litvinov RI. The biochemical and physical process of fibrinolysis and effects of clot structure and stability on the lysis rate. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem. 2008; 6(3): 161-180. 4 Liu W, Jawerth LM, Sparks EA, Falvo MR, Hantgan RR, Superfine R et al. Fibrin fibers have extraordinary extensibility and elasticity. Science. 4 August 2006; 313: 634. 5 Nielsen VG, Gurley WQ, Burch TM. The impact of factor XIII on coagulation kinetics and clot strength determined by thrombelastography. Anesth Analg. 2004; 99(1): 120-123. 6 Ariëns RA, Lai TS, Weisel JW, Greenberg CS, Grant PJ. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 2002; 100(3): 743-754. 7 Sakata Y, Aoki N. Significance of cross-linking of alpha 2-plasmin inhibitor to fibrin in inhibition of fibrinolysis and in hemostasis. J Clin Invest. 1982; 69(3): 536-542. 8 Greenberg CS, Sane DC, Lai T-S. Factor XIII and Fibrin Stabilization. In: Colman RW, Clowers AW, Goldhaber SZ, Marder VJ, George JN, editors. Haemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. 2006; p.316-334. 9 Muszbek L, Bagoly Z, Bereczky Z, Katona É. The Involvement ofd Blood Coagulation Factor XIII in Fibrinolysis and Thrombosis. Cardiovasc & Hematol Agents in Med Chem. 2008; 6: 190-205. 10 Ichinose A. Physiopathology and Regulation of Factor XIII. Thromb Haemost. 2001; 86: 57-65. 11 Polgár J, Hidasi V, Muszbek L. Non-proteolytic activation of cellular protransglutaminase (placenta macrophage Factor XIII). Biochem. J. 1990; 267: 557-560. 12 Radek JT, Jeong J-M, Wilson J, Lorand L. Association of the A Subunits of Recombinant Placental Factor XIII with the Native Carrier B Subunits from Human Plasma. Biochemistry. 1993; 32(14): 3527-3534. 13 Yorifuji H, Anderson K, Lynch GW, Van De Water L, McDonagh J. B Protein of Factor XIII: Differentiation Between Free B and Complexed B. Blood. 1988; 72(5): 1645-1650. 1 of 51 ノボサーティーン静注用 2500 2.6.2 薬理試験の概要文 ノボ ノルディスク ファーマ株式会社 2 of 51 目次 ページ 目次 .............................................................................................................................................................2 図目次 .............................................................................................................................................................3 表目次 .............................................................................................................................................................3 略語一覧 .............................................................................................................................................................5 2.6.2.1 まとめ ..................................................................................................................................................6 2.6.2.2 薬効薬理 ..............................................................................................................................................9 2.6.2.3 副次的薬理 ........................................................................................................................................31 2.6.2.4 安全性薬理 ........................................................................................................................................36 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用 ....................................................................................................................39 2.6.2.6 考察及び結論 ....................................................................................................................................46 参考文献 ...........................................................................................................................................................50 3 of 51 図目次 ページ 図 2.6.2-1 SDS-PAGE によるマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びヒト由来内因性 FXIII B サブユニットに対する rFXIII の結合...................................................................................11 図 2.6.2-2 ヒト血漿に対する rFXIII 添加時及び非添加時における架橋形成フィブリン及び非 架橋形成フィブリンの SDS-PAGE による分離 .....................................................................13 図 2.6.2-3 サル血漿に対する rFXIII 添加時及び非添加時における架橋形成フィブリン及び非 架橋形成フィブリンの SDS-PAGE による分離 .....................................................................14 図 2.6.2-4 FXIII 欠乏血漿における rFXIII の線溶時間延長作用 ............................................................18 図 2.6.2-5 rFXIII の TAFIa 依存性凝固塊溶解時間延長補強作用...........................................................19 図 2.6.2-6 トロンボエラストグラムの模式図 ..........................................................................................20 図 2.6.2-7 正常ヒト全血における rFXIII 滴定試験 ..................................................................................21 図 2.6.2-8 血小板減少症を模した血液における rFXIII 滴定試験 ..........................................................22 図 2.6.2-9 血小板幹細胞移植 7 日後の患者の全血に対する rFVIIa 及び rFXIII 添加時のトロン ボエラストグラム ......................................................................................................................23 図 2.6.2-10 心臓手術施行患者の全血に対する rFVIIa 及び rFXIII 添加時のトロンボエラストグ ラム..............................................................................................................................................25 図 2.6.2-11 ヘパリン又はプロタミン含有クエン酸処理ヒト血漿における rFXIII の影響 ..................40 表目次 ページ 表 2.6.2-1 rFXIII の in vitro 薬力学的作用の概要 .......................................................................................9 表 2.6.2-2 各種動物における FXIII B サブユニットドメインの N 末端配列 .......................................11 表 2.6.2-3 rFXIIIa⃰ 及び rFXIIIa°のヒト及びサル由来血漿におけるフィブリノゲン架橋形成...........16 表 2.6.2-4 rFXIII のヒト及びサル由来血漿におけるフィブリノゲン架橋形成 ...................................17 表 2.6.2-5 rFXIII で検討した in vivo 薬効薬理パラメータの概要 ..........................................................26 表 2.6.2-6 再出血までの時間（TTL、秒）：測定値及び平均値 ...........................................................28 表 2.6.2-7 総出血時間及び補正出血量 ......................................................................................................30 表 2.6.2-8 副次的薬理試験の実施要綱及び結果 ......................................................................................31 表 2.6.2-9 安全性薬理エンドポイントの概要及び結果 ..........................................................................36 表 2.6.2-10 カニクイザル反復投与毒性試験における心電図の測定時点、誘導及び結果...................37 表 2.6.2-11 ECC 施行後に rFXIII を投与した試験の概要 .........................................................................37 表 2.6.2-12 In vitro 及び in vivo 薬物相互作用試験の概要及び結果 .........................................................39 表 2.6.2-13 試験群、用量、臨床推奨用量比及び動物数（試験番号 NN205070）................................41 4 of 51 表 2.6.2-14 主試験：試験群、用量及び動物数（試験番号 NN205148）................................................42 表 2.6.2-15 トキシコキネティクス：試験群、用量及び動物数（試験番号 NN205148）....................42 表 2.6.2-16 試験デザイン（試験番号 NN206100）：試験群、用量及び動物数....................................44 5 of 51 略語一覧 α2-AP aPTT AUC CPB ELISA FXIII HUVEC PT rFVIIa ： ： ： ： ： ： rFXIII rFXIIIa* rFXIIIa° SD SDS-PAGE ： ： ： ： ： TAFI TAFIa TAT TEG TF TNF-α t-PA ： ： ： ： ： ： ： ： ： α2-antiplasmin（α2-アンチプラスミン） activated partial thromboplastin time（活性化部分トロンボプラスチン時間） area under the concentration-time curve（濃度－時間曲線下面積） cardiopulmonary bypass（人工心肺バイパス術） enzyme-linked immunosorbent assay（酵素免疫吸着測定法） coagulation factor XIII（血液凝固第 XIII 因子） human umbilical vein endothelial cells（ヒト臍帯静脈内皮細胞） prothrombin time（プロトロンビン時間） recombinant activated coagulation factor VII（遺伝子組換え活性型血液凝固第 VII 因 子） recombinant FXIII（遺伝子組換え血液凝固第 XIII 因子） rFXIII activated by thrombin（トロンビン活性型 rFXIII） non-proteolytically activated rFXIII（非蛋白分解性活性型 rFXIII） standard deviation（標準偏差） sodium dodecyl sulfate-polyaclylamidegel electrophoresis（SDS ポリアクリルアミド電気 泳動） thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor（トロンビン活性化線溶阻害因子） activated TAFI（活性型 TAFI） thrombin-antithrombin complex（トロンビン・アンチトロンビン複合体） thromboelastography（トロンボエラストグラフィー） tissue factor（組織因子） tumour necrosis factor-α（腫瘍壊死因子 α） tissue plasminogen activator（組織プラスミノーゲン活性化因子） 6 of 51 2.6.2.1 まとめ 薬効薬理 遺伝子組換え血液凝固第 XIII 因子（以下、rFXIII）の薬効に関する薬力学的特性を示すため、種々の in vitro 及び in vivo 試験を実施した。薬効薬理試験の目的は、血漿中において rFXIII が内因性血液凝固 第 XIII 因子（FXIII）で文献報告1, 2 3されているものと同一の薬力学的特性、すなわち、フィブリンを 架橋結合させ凝固塊強度を増強し、抗線溶蛋白を凝固塊に取り込ませて凝固塊の抗線溶作用を増強し、 凝固塊の接着を促進する接着分子を凝固塊に取り込ませることを示すことである。 内因性 FXIII A サブユニットホモダイマー（A2）の正常血漿中濃度は約 10 μg/mL と文献報告されて いる4。血漿中での内因性 FXIII A2 は強力に非共有結合した 2 つの FXIII A サブユニット及び 2 つの FXIII B サブユニットから構成されるヘテロテトラマー（A2B2）として存在し、およそ 50%超の FXIII B サブユニットは複合体を形成しない遊離型として循環している。rFXIII の臨床推奨用量である 35 IU/kg（0.21 mg/kg）の月 1 回投与時の最大血漿中濃度は 5 μg/mL であり、結合可能な状態にある遊離型 FXIII B サブユニットホモダイマー量を超えることはないと考えられる。 rFXIII はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びヒト由来の内因性 FXIII B サブユニットと結合し ヘテロテトラマー（A2B2）を形成することが示された。トロンビンにより活性化された rFXIII（以下、 rFXIIIa*）はヒト及びカニクイザル血漿において同様にフィブリンを架橋結合させた。rFXIIIa*及び非 蛋白分解的に活性化された rFXIII（以下、rFXIIIa°）は臨床濃度域（2～50 µg/mL）で濃度依存的に同程 度にフィブリノゲンを架橋結合させた。また、非常に高い濃度（400 µg/mL）では rFXIII 単独でもフィ ブリノゲンを架橋結合させることが示された。 FXIII 欠乏血漿を用いた凝固塊溶解試験により rFXIII の凝固塊形成及び線溶における役割を検討した ところ、rFXIII による濃度依存的な凝固塊溶解時間の延長が認められた。また、rFXIII はトロンビン活 性化線溶阻害因子（以下、TAFI）の抗線溶活性を強く亢進したことから、FXIII の付加的な抗線溶作用 が示唆された。トロンボエラストグラフィー（以下、TEG）によりヒト血液における凝固塊形成及び 抗線溶作用を in vitro で検討したところ、rFXIII による濃度依存的で有意な凝固塊の機械的強度及び抗 線溶作用の増強が認められた。 急性毒性試験及び薬物動態試験に用いたカニクイザルの血漿サンプルを用いた検討から、フィブリ ンの架橋結合及びフィブリン塊への抗線溶蛋白の取り込みによる抗線溶作用に rFXIII が関与している ことが示された。血漿蛋白複合体に含まれるものは、フィブリノゲン α 鎖又は γ 鎖のオリゴマー、もし くはこれらと α2-アンチプラスミン（以下、α2-AP）、α2-マクログロブリン及びフィブロネクチンとい った抗線溶作用を示す強固なフィブリン塊の形成に必要な蛋白が混在するものであった。 組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、t-PA）誘発性再出血ウサギモデルにおいて、rFXIII の前処 置により抗線溶作用が増強し凝固塊強度の増強が認められた。これと類似した t-PA 持続注入による線 溶亢進ウサギモデルを用いて、肝部分切除術後の出血に対する遺伝子組換え活性型血液凝固第 VII 因子 （以下、rFVIIa）と rFXIII の in vivo での併用効果を検討した。rFXIII 投与動物では止血栓の出現頻度増 7 of 51 加、血小板の動員及び活性の増強、フィブリノゲン沈着及び TAFI 活性の亢進ならびに α2-AP 及びビト ロネクチンの凝固塊内取り込み亢進が認められた。すなわち、これらのデータから、rFVIIa に加えて rFXIII を投与した動物において、創傷部位に形成された凝固塊の機械的及び生化学的安定性が増強する ことが示唆された。 副次的薬理作用 rFXIII 及び rFXIIIa*の各種細胞に対する結合能を評価した。その結果、rFXIII 及び rFXIIIa*はリンパ 球、顆粒球及び単球と結合しなかった。rFXIIIa*は静止血小板及びトロンビンにより活性化された血小 板のいずれとも結合するが、rFXIII は血小板に結合しないことが確認された。rFXIIIa*は内皮細胞、腸 上皮細胞、線維芽細胞及び大動脈平滑筋細胞と結合するが、rFXIII はこれらに結合しないことが確認さ れた。 rFXIII 及び rFXIIIa*による内皮損傷誘導ならびに炎症性反応誘発又はサイトカイン放出誘発を in vitro で検討した。rFXIII 又は rFXIIIa*の臨床濃度域（最大 10 µg/mL）において、内皮損傷、炎症性接着分子 のアップレギュレーション又はサイトカイン放出は認められなかった。 綿糸を挿入し血小板を活性化させたウサギの動静脈シャントモデルを用い、rFXIII の凝固塊形成促進 能を検討した。rFXIII は臨床推奨用量の 2 倍にあたる用量で、凝固塊の増大、血流、血圧又は平均血小 板数に影響を及ぼさなかった。 安全性薬理 中枢神経系及び心血管系の安全性薬理エンドポイントはカニクイザル反復投与毒性の 2 試験におい て評価した。rFXIII 単回又は反復投与（用量範囲は 0～10 mg/kg）による中枢神経系又は心血管系に対 する有害作用は認められなかった。 体外血液循環施術後の rFXIII 静脈内単回ボーラス投与に伴うリスクを、麻酔カニクイザルを用いて 評価した。体外血液循環施術 2 時間後の雄性成熟カニクイザルに対し、2.1 及び 7.1 mg/kg の用量で rFXIII を静脈内へ緩徐に単回ボーラス投与したところ、良好な忍容性が認められ、6 時間の観察期間中 に明らかな有害作用は認められなかった。 総括として、臨床濃度域で rFXIII 又は rFXIIIa*の安全性上の懸念は認められなかった。 薬力学的薬物相互作用 ヘパリン及びプロタミンは心肺バイパスを初めとする多くの手術時に凝固系を調整するために使用 される。In vitro 試験では、rFXIII を 100 µg/mL までの濃度で処理してもヘパリン及びプロタミンの活 性化部分トロンボプラスチン時間（以下、aPTT）に対する作用への影響は認められず、in vitro でヘパ リン及びプロタミンが rFXIII の架橋形成能に影響を及ぼすこともなかった。 8 of 51 rFXIII 及び rFVIIa を数分以内に静脈内投与により併用した場合の相互作用を、カニクイザル単回投 与毒性試験及び安全性薬理の心血管系モデルにおいて検討した。 カニクイザル単回投与毒性試験では、rFXIII と rFVIIa を併用投与した時の無毒性量は、rFXIII 及び rFVIIa をそれぞれ単独で投与した時と同程度であり、併用投与による相乗的な有害作用は認められな かった。 サル心血管系モデルでは、rFXIII 及び rFVIIa をそれぞれ臨床推奨用量の 17 及び 11 倍で併用した時に 12 頭中 1 頭で血栓及び死亡が認められ、相乗的な有害作用の可能性も考えられた。当該心血管系モデ ルは、複数のカテーテルを留置した状態で麻酔を施しており、血液凝固の亢進状態を引き起こしてい た可能性も考えられた。 総括 rFXIII はフィブリンを架橋結合させ抗線溶系蛋白を凝固塊に取り込ませることで、凝固塊の機械的強 度及び抗線溶作用を増強させた。このように、rFXIII の薬効薬理は明らかにされており、rFXIII は内因 性 FXIII で文献報告されているものと同様の薬力学的特性を示した。 安全性薬理試験では、rFXIII の安全性上の懸念は認められなかった。 複数のカテーテルを留置した状態で麻酔を施したサルの心血管系モデルでは、rFXIII 及び rFVIIa の 静脈内投与による併用で相乗的な有害作用の可能性も考えられた。当該モデルは、血液凝固の亢進状 態を引き起こしていた可能性も考えられた。 総括として、rFXIII は内因性 FXIII で文献報告されているものと一致する薬力学的特性を有すること が示された。 9 of 51 2.6.2.2 薬効薬理 薬効薬理試験の総合的な目的は、rFXIII が内因性 FXIII で文献報告されているものと一致する薬力学 的特性を有することを示すことである。すなわち、フィブリンを架橋結合させて凝固塊強度を増強し、 抗線溶蛋白を凝固塊に取り込ませて凝固塊の抗線溶作用を増強し、凝固塊の接着を促進する接着分子 を凝固塊に取り込ませることを示すことである。FXIII の作用機序については Module 4.2.1.1（試験番号 RES-FXIII-0058）の総説に記した。 FXIII の開発期間中に効能又は効果として可能性のあるものが幾つか検討された。すなわち、心臓手 術、がん治療に関する出血、外傷性危機的出血及び炎症性腸疾患である。先天性欠乏症の効能又は効 果と直接的には関係しないが、rFXIII の総合的な作用機序及び効力を示していることから、これらの疾 患に関する試験の一部を本資料に含めた。 一部の例外を除き、in vivo 及び in vitro 試験は正常な凝固系で実施した。したがって、これらの試験 は内因性 FXIII A サブユニット及び FXIII B サブユニットの生理学的レベルに上乗せする形で実施され ている。 In vitro 薬効薬理 rFXIII の FXIII B サブユニットとの相互作用、フィブリン架橋形成能ならびに凝固塊の安定化及び強 度増強を in vitro 試験で検証した。結果の要約を以下に示す。 表 2.6.2-1 rFXIII の in vitro 薬力学的作用の概要 薬力学的パラメータ検討項目 内因性 FXIII B サブユニットへの結 合 rFXIII の血漿蛋白架橋形成活性 活性型 rFXIII の血漿蛋白架橋形成 活性 凝固塊の抗線溶作用に対する影響 凝固塊形成、凝固塊発達ならびに 線溶に対する機械的強度及び安定 性に及ぼす影響の TEG による 評価 結果 rFXIII はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びヒト血 漿由来の内因性 FXIII B サブユニットと結合した。 rFXIII はヒト及びカニクイザル由来血漿中フィブリンを同 程度に架橋形成させた。 rFXIIIa*及び rFXIIIa°は臨床使用時に相当する濃度範囲（2 ～50 µg/mL）において、同様にかつ濃度依存的にフィブリ ノゲンを架橋形成させることが示された。rFXIII 単体で も、高濃度（400 µg/mL）においては、フィブリノゲンを 架橋形成させることが示された。 rFXIII は線溶時間を濃度依存的に延長した。また、rFXIII は TAFI の抗線溶活性を強く亢進した。 rFXIII は凝固塊の機械的強度及び線溶への抵抗性を濃度依 存的に有意に増強した。 試験番号／資料名 RES-FXIII-0025 RES-FXIII-0024 RES-FXIII-0063 LCP051125 EHNO050520 及び Johansson et al5. 10 of 51 rFXIII のマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びヒト由来内因性 FXIII B サブユニットへの結合 （Module 2.6.3.2、試験番号 RES-FXIII-0025） ［目的］ ヒト血漿中において、FXIII はヘテロヘキサマー（A2B2）として循環している。FXIII B サブユニッ トは血漿中に約 50%過剰に存在しており 4、FXIII B サブユニットは FXIII A サブユニットの担体分子と して働いている。本試験の目的は FXIII A サブユニットのホモダイマー（A2）である rFXIII がヒト及び 各種非臨床試験動物種由来の FXIII B サブユニットと複合体を形成できるか否かを評価することである。 ［試験方法］ rFXIII を結合レジン（CNBr 活性化セファロース 4B レジン）上に固定し、ヒト、マウス、ラット、 ウサギ、イヌ及びサル由来の血清とインキュベートした。レジンの懸濁液（rFXIII 約 1.8 nmol/100 µL） を 2 mL の各動物種血清に添加し、4℃で一晩緩やかに振盪した。洗浄後、結合レジンに残った結合 FXIII B サブユニットを SDS ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）を用いて分析した。rFXIII 無 添加とした以外は同一の方法で処理したレジンを陰性対照とした。 同一のプロトコールで別のゲルで電気泳動し、分離したバンドを PVDF 膜に電気的に転写し、クマ シーブルーで染色した。各動物種の FXIII B サブユニットと推定されるバンドを取り出し、N 末端配列 を分析した。 ［結果及び結論］ すべての動物種由来の FXIII B サブユニットは特異的にヒト rFXIII と結合したのに対して、無処置対 照のレジン（陰性対照）に結合した FXIII B サブユニットは認められなかった（図 2.6.2-1）。rFXIII が 結合したマウス、ラット、ウサギ、イヌ及びサル由来 FXIII B サブユニットは、ヒト FXIII B サブユニ ットと同一条件の下で rFXIII の位置に溶出した（図 2.6.2-1）。 既知のヒト FXIII B サブユニット配列と各動物種の N 末端配列の間で相同性が高い（80%以上）こと に基づき（表 2.6.2-2）、N 末端配列を検討した結果、各動物種で同定されたバンドは、FXIII B サブユ ニットのバンドであることが確認された。 結論として、rFXIII の A サブユニットはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びヒト由来内因性 B サブユニットと複合体を形成することが示された。 11 of 51 図 2.6.2-1 SDS-PAGE によるマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル及びヒト由来内因性 FXIII B サブユニットに対する rFXIII の結合 表 2.6.2-2 各種動物における FXIII B サブユニットドメインの N 末端配列 EEKP cGFPH VENGR IAQYY Y ヒト EEKQ cDFPT VENGR IAQYY Y マウス EEKQ cDFPA VENGR IAQYY Y ラット EEEKR cGFPS VENGR IAQYY Y ウサギ EEKT cGLPS VENGR IAQYY Y イヌ EEKP cGFPH VENGr IAQYY Y サル 文字はアミノ酸の種類を示す。小文字は signal-to-noise に基づく蓋然性のあるアミノ酸を示す。 周期的にアミノ酸が示されていない箇所はシステインであることが示唆されている。 12 of 51 カニクイザル及びヒト由来血漿における rFXIII の活性（Module 2.6.3.2、試験番号 RES-FXIII-0024） ［目的］ 本試験の目的は、rFXIII の生体内基質であるフィブリンの架橋形成能を検証することである。rFXIII のフィブリンに対する活性を、内因性 FXIII 欠乏又は内因性 FXIII を枯渇させたヒト及びカニクイザル 由来血漿を用いて検証した。 ［試験方法］ ヒト又はサルより FXIII 欠乏血漿を得た。各種濃度（0～20 µg/mL）の rFXIII と FXIII を枯渇させた ヒト血漿又はサル血漿とを組合せ、トロンビン及び CaCl2 を添加して活性化した。試料を 37℃で 5 分 間インキュベートした後、20 mmol/L EDTA/10 mmol/L ヨウ化アセトアミド（iodoacetamide）溶液を用 いて、rFXIIIa*活性を消失させた。洗浄後、フィブリン鎖を還元条件下 SDS-PAGE で分離した。対照血 漿（生体内レベルの血漿由来 FXIII 含有）試料を電気泳動し、対照とした。さらに、非架橋形成ヒトフ ィブリン又はサルフィブリン及び架橋形成ヒトフィブリノゲン又はサルフィブリノゲンの標準蛋白を 調整し、フィブリンの α 鎖、β 鎖、γ 鎖及び γ 鎖ダイマーの標準蛋白として泳動した。 ［結果及び結論］ 血漿中に 0 ～20 µg/mL の rFXIII を添加し、凝固塊を形成させた。フィブリン塊を洗浄後溶解し、 SDS-PAGE ゲル状で、各種架橋形成フィブリン及び非架橋形成フィブリンを分離した。ヒト及びカニ クイザルの両動物種とも血漿中には架橋形成したフィブリン γ 鎖ダイマーの産生がみられことから、 rFXIII は血漿中でヒトフィブリン及びサルフィブリンに架橋を形成させることが示唆された（図 2.6.2-2 及び図 2.6.2-3）。正常サル及び正常ヒトの血漿中内因性 FXIII 濃度と比較した場合、FXIII 欠乏血漿に rFXIII の 10 μg/mL（血漿中 FXIII A2 濃度にほぼ等しい）を添加した場合、ほぼ同程度の活性が認めら れた。 rFXIII はヒト及びカニクイザル由来血漿中内因性フィブリンを同程度に架橋形成させると結論された。 13 of 51 図 2.6.2-2 ヒト血漿に対する rFXIII 添加時及び非添加時における架橋形成フィブリン及び非架 橋形成フィブリンの SDS-PAGE による分離 a：ZM-rFXIII; ZM118/pD16 株産生 rFXIII b：BJ-rFXIII; BJ2n-5-LA 株産生 rFXIII α：フィブリン α 鎖、β：フィブリン β 鎖、γ：フィブリン γ 鎖、 γ-Dimmer：フィブリン γ 鎖ダイマー 14 of 51 図 2.6.2-3 a サル血漿に対する rFXIII 添加時及び非添加時における架橋形成フィブリン及び非架 橋形成フィブリンの SDS-PAGE による分離 ZM-rFXIII; ZM118/pD16 株産生 rFXIII BJ-rFXIII; BJ2n-5-LA 株産生 rFXIII α フィブリン α 鎖、β：フィブリン β 鎖、γ：フィブリン γ 鎖、γ-Dimmer：フィブリン γ 鎖ダイマー b 15 of 51 血漿における rFXIII 及び rFXIIIa の in vitro 作用（Module 2.6.3.2、試験番号 RES-FXIII-0063） ［目的］ 本試験の目的は、フィブリノゲン架橋形成評価のため、SDS-PAGE を用いて各種 rFXIII 分子の in vitro 活性を検証することである。 ［試験方法］ 実験 1：ヒト及びカニクイザル由来ヘパリン処理血漿中での rFXIIIa*及び rFXIIIa°の活性 rFXIIIa*及び rFXIIIa°をそれぞれ希釈し、最終濃度 50、40、30、20、15、10、5、2 及び 0 μg/mL とし た。各希釈液の 10 µL を血漿 100 µL と組み合わせ、ヒト及びカニクイザル由来ヘパリン処理血漿にお けるフィブリノゲン架橋形成能を評価した。 37℃で 60 分間インキュベートした後、rFXIII 及び血漿中内因性 FXIII の付加的な酵素活性を防止す るために、20 mmol/L EDTA/20 mmol/L ヨウ化アセトアミド混合液を添加し、試料中の FXIII 活性を消 失させた。試料中の総フィブリノゲンは、40 単位/mL のトロンビンを添加して 37℃で 45 分間インキュ ベートし、凝固塊を形成させた。血漿蛋白を除去するために 10 mmol/L EDTA/10 mmol/L ヨウ化アセト アミド混合液でフィブリン塊を洗浄した後、残存したフィブリン塊を、40 mmol/L ジチオトレイトール を含有する 8 mol/L 尿素で溶解し、60℃で 1 時間加温した後、フィブリン鎖を SDS-PAGE を用いて分離 した。 ヒトフィブリン及びカニクイザルフィブリンのフィブリン α 鎖、フィブリン β 鎖、フィブリン γ 鎖及 びフィブリン γ 鎖ダイマーに対する標準蛋白として、各血漿を、20 mmol/L EDTA／20 mmol/L ヨウ化 アセトアミド存在下でトロンビン処理することにより、非架橋のヒトフィブリン又はサルフィブリン を調整した。 ヒト及びカニクイザルのフィブリン β 鎖及びフィブリンγ鎖ダイマーの標準蛋白として、各血漿を 20 mmol/L EDTA／20 mmol/L ヨウ化アセトアミド非存在下でトロンビン処理することにより、架橋形 成したヒトフィブリン又はカニクイザルフィブリンを調整した。 実験 2：ヒト及びカニクイザル由来ヘパリン処理血漿中における rFXIII チモーゲン活性 異なる 2 種類のバッチの rFXIII（バッチ番号：FC93001X 又は 217-01-001）を希釈し、最終濃度 800、 400、200、100、20 及び 0 μg/mL の溶液を得た。各希釈液の 20 µL を血漿 111 µL に添加した。すべての 実験で実験 1 と同一の方法でインキュベートし、得られた凝固塊を SDS-PAGE を用いて分離した。陽 性対照として、トロンビン活性化 rFXIII を実験 1 で述べた方法で調整し、20 μg/mL の濃度でアッセイ に供した。 16 of 51 ［結果及び結論］ 実験 1：ヒト及びカニクイザル由来ヘパリン処理血漿中での rFXIIIa*及び rFXIIIa°の活性 rFXIIIa*及び rFXIIIa°のいずれかをヘパリン処理血漿に添加（2～50 µg/mL）したとき、rFXIIIa*及び rFXIIIa°の双方ともトロンビン非存在下で、濃度依存的にフィブリノゲンを架橋形成（フィブリン γ 鎖 ダイマー）させた。フィブリン架橋の状態と濃度反応性は、rFXIIIa*及び rFXIIIa°で同様であった（表 2.6.2-3）。さらに、ヒト及びカニクイザル由来ヘパリン処理血漿での架橋形成は rFXIIIa*及び rFXIIIa° で同程度であることが示された（表 2.6.2-3）。 実験 2：ヒト及びカニクイザル由来ヘパリン処理血漿中における rFXIII チモーゲン活性 rFXIII（20～800 µg/mL）の架橋形成能を検証したとき、高濃度（400 µg/mL 以上）の rFXIII とともに 4 時間インキュベートした結果、フィブリノゲンの架橋形成を惹起した（表 2.6.2-4）。この時間枠は、 rFXIII の毒性試験（Module 2.6.3.2、RES-FXIII-0058 参照）で採取した in vivo 血漿で同定された架橋形 成分子種と矛盾のないものであった。rFXIII 単体の架橋形成の程度は rFXIII 製造における不純物である rFXIIIa° の量のみに帰することはできなかった。これらのデータから、内因性 FXIII B サブユニットを 超える血漿環境において、rFXIII は活性化されることが示唆された。 結論として、rFXIIIa*及び rFXIIIa°は臨床使用時に相当する濃度範囲（2～50 µg/mL）において、同様 にかつ濃度依存的にフィブリノゲンを架橋形成させることが示された。rFXIII 単体でも、高濃度（400 µg/mL 以上）においては、フィブリノゲンを架橋形成させることが示された。 表 2.6.2-3 rFXIIIa⃰ 及び rFXIIIa°のヒト及びサル由来血漿におけるフィブリノゲン架橋形成 rFXIIIa*添加によるフィブリン架橋形成 rFXIIIa° 添加によるフィブリン架橋形成 ヒト血漿 サル血漿 ヒト血漿 サル血漿 0 2 5 10 15 + + 20 ++ + + + 30 ++ +++ ++ ++ 40 +++ +++ +++ +++ 50 +++ +++ +++ +++ フィブリン架橋：SDS-PAGE における γ ダイマーの発現及び α 鎖及び γ 鎖の減少又は消失として判定 -：架橋形成なし、+：架橋形成及びバンドの密度（+ < ++ < +++） 濃度（g/mL） 17 of 51 表 2.6.2-4 rFXIII のヒト及びサル由来血漿におけるフィブリノゲン架橋形成 rFXIII（バッチ番号 FC93001X） rFXIII（バッチ番号 217-01-001） 添加によるフィブリン架橋形成 添加によるフィブリン架橋形成 ヒト血漿 サル血漿 ヒト血漿 サル血漿 0 20 100 200 400 + + 800 ++ ++ ++ ++ フィブリン架橋：SDS-PAGE における γ ダイマーの発現及び α 鎖及び γ 鎖の減少又は消失として判定 -：架橋形成なし、+：架橋形成及びバンドの密度（+ < ++ ） 濃度（g/mL） rFXIII の in vitro における凝固塊の線溶抵抗性に対する作用（Module 2.6.3.2、試験番号 LCP051125） ［目的］ 本試験の目的はヒト血漿における in vitro の止血栓溶解モデルでの凝固塊の安定性に対する rFXIII の 作用を評価すること及び FXIII 介在性の止血栓保護における TAFI の役割を検討することである。 ［試験方法］ 凝固塊溶解試験は、血漿を使用した試験系であり、リン脂質を凝血原（pro-coagulant）表面とし、組 織因子（TF）及び rFVIIa を添加することで凝固を強力に開始させ、t-PA を添加することで線溶系を誘 発する。 本アッセイの試験方法を以下に述べる。 クエン酸塩処理血漿 75 μL を HEPES バッファー（25 mmol/L HEPES、137 mmol/L NaCl、3.5 mmol/L KCl、3 mmol/L CaCl2、0.1% 仔牛血清アルブミン、pH7.4）混合液〔0.12 pmol/L TF、34 mmol/L CaCl2、 3 nmol/L t-PA 及び 20 μmol/L リン脂質ベシクル（ホスファチジルコリン 50%、ホスファチジルセリン 50%で構成）含有〕75 μL と混合する。 混合物 100 μL を直ちに、濁度測定のために用いる Spectramax photometer（Molecular Devises, Sunnyvale CA, USA）のマイクロタイタープレートのウェルに移した。波長 405 nm で継続的に濁度を測 定し、凝固及び線溶をモニタリングした。ヒト血漿（正常保存血漿又は FXIII 欠乏血漿）に rFVIIa 及び rFXIII を図 2.6.2-4 に表示した通りに添加した。凝固時間〔Clotting time（CT）〕は反応開始時点から最 大濁度の 1/2 に至るまでの時間と定義した。線溶時間〔Clot lysis time（CLT）〕は止血栓を形成してい る間の最大濁度の 1/2 に至った時間から凝固塊溶解の間に同じ濁度（最大濁度の 1/2）に至るまでの時 間と定義した。また TAFI 活性は、25 μg/mL のジャガイモ塊茎由来カルボキシペプチダーゼインヒビタ ー〔potato tuber carboxypeptidase inhibitor（PTCI）〕を添加することにより阻害した。 18 of 51 ［結果及び結論］ 凝固塊形成及び溶解における rFXIII の役割を、FXIII 欠乏血漿に rFXIII 量を添加・漸増して血漿を再 構成することにより検討した。本試験における rFXIII のモル濃度は、A サブユニット（分子量 83000） の濃度に基づいており、したがって正常血漿中 A サブユニット濃度は 120 nmol/L（A2 ダイマーとして は 60 nmol/L）である。図 2.6.2-4 に示す通り、rFXIII は濃度依存的に線溶時間を延長するが、凝固塊形 成時間には影響しなかった。 図 2.6.2-4 FXIII 欠乏血漿における rFXIII の線溶時間延長作用 FXIII 欠乏血漿で実施した線溶測定における rFXIII の作用。強固かつ一貫性のある凝固塊形成をさせるため、TF 及び 25 nmol/L を添加し、凝固を開始し、線溶開始のために t-PA が含有されている。rFXIII のモル濃度は、A サブユニット濃度 （[FXIII A subunit]）として 0～480 nmol/L で記述されている（正常血漿に相当する rFXIII A サブユニット濃度は 120 nmol/L である）。 これらの結果から rFXIII の主要な役割は早期の線溶から凝固塊を保護することであることが示され る。rFXIII は止血栓の安定化ならびにフィブリンモノマーの架橋形成及び α2-AP 及びその他の蛋白とフ ィブリン塊と架橋形成させることによる線溶の阻害であると報告されている（Module 2.6.3.2、試験番 号 RES-FXIII-0024、RES-FXIII-0063 及び RES-FXIII-0058）。トロンビンにより活性化された活性型 TAFI（以下、TAFIa）の凝固塊溶解時間への影響を凝固塊溶解測定中に分析した。その結果、rFXIII 介 在性の TAFI のフィブリン塊への架橋が、TAFIa の活性を亢進し、プラスミノーゲンの活性を消去し、 フィブリン塊の安定性を亢進する酵素の抗線溶系作用を補強することが認められた（図 2.6.2-5）。 要約すると、本試験において、rFXIII は止血栓形成に影響しないのに対して、線溶時間を濃度依存的 に延長したことから、血液凝固における rFXIII の作用は、主として抗線溶作用であることが示された。 19 of 51 線溶に対する止血栓の抵抗性に関する rFXIII の重要性は、rFXIII が TAFI の抗線溶活性を強く増強する という観察結果により、さらに補強された。 図 2.6.2-5 rFXIII の TAFIa 依存性凝固塊溶解時間延長補強作用 FXIII 欠乏血漿において凝固塊溶解を測定した。試験系において高濃度の内因性トロンビン産生による TAFI 活性化を確 実にするために 200 nmol/L の rFVIIa を試験系に添加した。25 μg/mL PTCI 存在下（□）及び非存在下（■）における試験 系に添加する rFXIII 濃度を漸増した。 健康被験者もしくは幹細胞移植又は心臓手術施行患者より採取した全血における rFXIII 及び rFVIIa の in vitro TEG の評価（Module 2.6.3.2、試験番号 EHNO050520） ［目的］ ヒトにおける rFXIII 投与時の薬力学的特性を評価する目的で、TEG を用いて、in vitro でのヒト全血 における凝固塊形成と線溶抵抗性を検討した。フィブリン塊の性質に対する rFXIII 及び rFVIIa の作用 を、正常全血及び正常全血を用いて血小板減少症を模した系で検討した。同様に、血小板幹細胞移植 又は冠動脈バイパス術を施行された心臓病手術患者より採取した全血における rFXIII 及び rFVIIa に関 する in vitro TEG 試験を実施した。 TEG は凝固塊形成、発達、機械的強度及び t-PA のような線溶系酵素の添加による線溶に対する安定 性を評価可能である。図 2.6.2-6 にトロンボエラストグラムの一例を示す。 20 of 51 図 2.6.2-6 トロンボエラストグラムの模式図 凝固を記述するために用いられるパラメータ：凝固開始までの時間；2 mm 幅に至るまでの時間（R）、凝固塊形成速 度；R 値からトロンボエラストグラムとの接点（α 角）、最大機械的強度（MA）及び線溶系に対する抵抗；トロンボエ ストグラムの MA からの曲線下面積（AUC from MA） ［試験方法］ 全血に rFXIII 及び rFVIIa を添加し、TF を凝固のイニシエーターとして使用し、t-PA を線溶誘発のた めに、カルシウムを反応開始のために添加した。rFXIII のモル濃度は A サブユニット（分子量 8300） 濃度として表示した。したがって、正常血漿中濃度は A サブユニット換算で 120 nmol/L（A2 ダイマー 換算では 60 nmol/L）又は約 10 μg/mL である。 TEG は以下の手順で実施した。 A5000 シリーズの TEG アナライザーを分析に用いた。試験試料（rFVIIa、rFXIII、rFVIIa と rFXIII の 混合又は緩衝液）10 μL、t-PA（最終濃度 1.8 nmol/L）混合 TF 溶液〔Innovin 1:50000 に希釈（約 0.15 pmol/L）〕10 μL、CaCl2（15 mmol/L）及び全血 320 μL を混合し、TEG カップに加える。すべての溶液 は 15 mmol/L NaCl 含有 20 mmol/L HEPES バッファー（pH 7.4）で希釈した。もう一組を試験試料 25 μL、 t-PA（最終濃度 1.8 nmol/L）混合 TF 溶液 25 μL、及び 全血 800 μL を混合した後、そのうち 340 μL を直 ちに、あらかじめ CaCl2（15 mmol/L）20 μL を含んだ TEG カップに移すことで調整した。TEG 測定は 最長 120 分間継続的に行った。 ［結果及び結論］ 正常血漿に対する rFXIIa と rFXIII の作用を一連の実験で評価した。その一つの試験では、rFXIII を 60 ～789 nmol/L の範囲で、rFXIII 単体又は 25 nmol/L の rFVIIa と組み合わせて全血に添加した。rFXIII 単体処理では凝固塊形成までの時間（R 値）に影響はみられなかった（図 2.6.2-7 A）のに対して、凝 21 of 51 固塊形成速度（α 角）を有意に亢進した。この作用は rFVIIa 非存在下でのみ濃度依存的にみられた （p<0.001）（図 2.6.2-7 B）。rFXIII は、濃度依存的に、凝固塊の最大機械的強度（以下、MA）と（図 2.6.2-7 C）、線溶に対する抵抗性（MA 以降の AUC）を有意に亢進した（図 2.6.2-7 D）。統計学的解 析の結果、rFXIII と rFVIIa の相互作用が示された。すなわち、R 値を除くすべての TEG パラメータに 対する rFXIII 濃度反応が、25 nmol/L の rFVIIa により影響を受けた。例えば、機械的強度及び線溶に対 する抵抗性に対する rFXIII の濃度反応の勾配は、rFVIIa 存在下よりも rFVIIa 非存在下の方が大きかっ た。 図 2.6.2-7 正常ヒト全血における rFXIII 滴定試験 rFXIII の以下のパラメータに対する作用：A）凝固開始までの時間（R 値）、B）凝固塊形成速度（α 角）、C）最大機械 的強度（MA）及び D）線溶系に対する抵抗；トロンボエストグラムの MA からの曲線下面積（MA 以降の AUC）。 Mean±SD（8 人のドナー血漿の結果をそれぞれの無処理試料で標準化して算出） 同様の rFXIII 及び rFVIIa の滴定試験を、血小板減少症を模した血液（正常血漿と血小板欠乏自己血 漿を用いて、最終血小板濃度 10×109/L まで希釈して調整）を用いて検討した。rFXIII は血小板減少症 を模した血液における最大機械的強度（MA）及び線溶系に対する抵抗（MA 以降の AUC）を濃度依存 的に有意に亢進した（図 2.6.2-8）。rFXIII は、凝固塊形成速度も有意に亢進したが、この作用は濃度依 22 of 51 存性ではなかった。正常全血で観察されたように、この試験系においても、凝固塊形成までの時間（R 値）に影響はみられなかった。rFXIII と rFVIIa の間に有意な相互作用が認められなかった。 rFXIII は正常血における線溶への抵抗性に対して最も強く作用し、それに対して血小板数の低い血液 に対する作用はそれより弱かった。これらの条件の下では、形成した凝固塊は、それによるトロンビ ン産生が最適状態未満であり、また、凝固塊は比較的小さいものであり、rFXIII の最適な有効性はある レベルのトロンビン産生に依存することが示唆された。 図 2.6.2-8 血小板減少症を模した血液における rFXIII 滴定試験 rFXIII の以下のパラメータに対する作用：A）凝固開始までの時間（R 値）、B）凝固塊形成速度（α 角）、C）最大機械 的強度（MA）及び D）線溶に対する抵抗；トロンボエストグラムの MA からの曲線下面積（AUC from MA）。 Mean±SD（8 人のドナー血漿の結果をそれぞれの無処理試料で標準化して算出） rFXIII 及び rFVIIa の in vitro での作用をさらに幹細胞移植患者の血液を用いて検討した（図 2.6.2-9）。 無処置対照試料における凝固塊形成は、血小板数（20 x 109/L 以上）が類似していたにも関わらずかな りのばらつきが認められた。7 人中 3 人の患者では、対照試料の凝固塊形成が認められず、その他の患 者では、小さな凝固塊のみが形成された。これらの試験の大部分では、rFVIIa 及び rFXIII の最高濃度 23 of 51 の添加によっても、すべての TEG パラメータを健康被験者（ドナー）の範囲に至らせるには不十分で あった。統計解析の結果、rFXIII 及び rFVIIa の双方とも凝固時間を濃度依存的に短縮したが、rFXIII の 作用は、rFVIIa の作用よりも弱いものであった。rFXIII 及び rFVIIa の双方とも凝固塊形成速度及び最 大機械的強度を濃度依存的に亢進した。最終的に、rFXIII は線溶に対する抵抗に対して有意に影響した。 2 種の蛋白間に濃度的相互作用は認められなかった。すなわち、これらのパラメータに関して rFXIII の 作用は、 rFVIIa の存在とは独立しており、逆もまた同様であった。概括すると、血小板減少症を模し た血液において rFVIIa 及び rFXIII による血液凝固亢進が確認された。 図 2.6.2-9 血小板幹細胞移植 7 日後の患者の全血に対する rFVIIa 及び rFXIII 添加時のトロンボ エラストグラム 24 of 51 rFXIII 及び rFVIIa の in vitro での作用を、6 例の心臓手術施行患者の血液で検討した。その結果、 rFXIII は凝固時間に影響しなかったのに対し、rFVIIa はこのパラメータを統計学的に有意に短縮させた （図 2.6.2-10）。rFXIII 及び rFVIIa の双方とも凝固塊形成速度、凝固塊の機械的強度及び線溶への抵抗 性を有意に増強した。2 種の蛋白間に濃度的相互作用は認められなかった。すなわち、rFXIII の作用は、 rFVIIa の存在とは独立しており、逆もまた同様であった。 要約すると、rFXIII は、正常血液及び血小板減少症を模した血液ならびに心臓手術又は幹細胞移植を 施行された患者由来の血液において凝固塊の機械的強度及び線溶への抵抗を濃度依存的に有意に亢進 した。患者からの血液試料において rFXIII 及び rFVIIa の薬理学的に適切な用量で分析したとき、rFXIII 及び rFVIIa の作用間に濃度的相互作用はみられなかった。すなわち、各凝固因子の作用は他方の存在 とは独立していた。この試験の結果の一部は公表されている 5。 25 of 51 図 2.6.2-10 心臓手術施行患者の全血に対する rFVIIa 及び rFXIII 添加時のトロンボエラストグラ ム 26 of 51 In vivo 薬効薬理 rFXIII の架橋形成能を in vivo 試験で rFXIII 投与後に採取した血漿サンプルを用いて検討した。また、 rFXIII の抗線溶作用及び損傷誘発性炎症反応調節への関与ならびに内皮バリア機能の変化を複数の動物 モデルを用いて検討した（表 2.6.2-5 参照）。これらの試験について以下に記す。 表 2.6.2-5 rFXIII で検討した in vivo 薬効薬理パラメータの概要 薬物動態パラメータ検討項目 In vivo での血漿蛋白架橋形成 t-PA 誘発性再出血ウサギモデル における線溶抵抗性 t-PA 誘発性肝出血ウサギモデル における rFXIII 及び rFVIIa の併 用効果 結果 rFXIII は in vivo で血漿中の蛋白を架橋結合させることが示された。 血漿蛋白複合体にはフィブリノゲン α 鎖及び γ 鎖のオリゴマー、も しくはこれらと α2-AP、α2-マクログロブリン及びフィブロネクチン といった抗線溶作用を示す強固なフィブリン塊の形成に必要な蛋白 が混在するものであった。 rFXIII で前処理した動物では、t-PA を指標とした凝固塊の機械的強 度の増強すなわち抗線溶作用の増強傾向が認められた。 t-PA 誘発性肝出血ウサギモデルの rFVIIa に加えて rFXIII を投与し た動物では、損傷部位で形成された凝固塊の物理的及び生化学的安 定性が増強されることが本試験結果から示唆された。 試験番号 RES-FXIII-058 RES-10352 DTOR100501 FXIII A サブユニットは FXIII 酵素の触媒部位を有している。一方、FXIII B サブユニットは循環血中 で FXIII A サブユニットの担体分子として機能する。rFXIII は内因性ヒト FXIII A サブユニットと同一 の構造を有する FXIII A サブユニット 2 つから構成されることから、内因性ヒト FXIII と同一の生物活 性を有することが予測された。 ヒト血漿由来 FXIII の in vivo における薬理が FXIII 欠乏症動物モデルで検討されている6, 7。これらの 試験における FXIII の生物活性は種々の哺乳類の動物種間で同程度であり、in vitro で認められた活性と 整合するものであった。 上記の通り、内因性ヒト FXIII と類似した薬力学的作用を示すことが明らかであることから、rFXIII の in vivo 薬理試験は実施していない。 カニクイザルにおける in vivo での rFXIII による血漿中蛋白の架橋形成（Module 2.6.3.2、試験番号 RES-FXIII-0058） ［目的］ カニクイザルを用い非 GLP で実施した予備的な単回投与毒性試験（試験番号 SNBL.002.02、SBi1220-175 及び SBi-1278-175）及び反復投与（週 2 回×4 週間）薬物動態試験（試験番号 SBi-1224-175） で採取した血漿を使用し、in vivo における血漿中蛋白の架橋形成について検討した。 ［試験方法］ サル（n=1／用量／試験）に対し rFXIII を 1～30 mg/kg の用量範囲で投与し、複数時点（投与前及び 投与後 0.25～168 時間、試験により異なる）で血漿サンプルを採取した。還元条件下のドデシル硫酸ナ 27 of 51 トリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動（reducing SDS-PAGE）により各分子種を分離した後、ゲル をクマシー染色し、さらに銀染色して可視化した。分子種は N-末端配列分析により同定もしくはウエ スタンブロット及び文献値との分子量比較により推察した。 ［結果］ 生理学的レベルを超える rFXIII を投与したサルから得られた血漿サンプルには、130 kDa を超えるサ イズの複数の高分子量バンドが認められ、フィブリノゲン α 鎖及び γ 鎖のオリゴマー、もしくはこれら と α2-AP、α2-マクログロブリン及びフィブロネクチンといった抗線溶作用を示す強固なフィブリン塊 の形成に必要な蛋白が混在するものであった。本法は定量的ではなく定性的な分析法ではあるが、高 用量の rFXIII を投与したサルほど視認し易いバンドが認められた。これらの循環複合体は局所の微小 血管系においてさらに大きな複合体を形成する可能性も考えられた。また、これらの架橋蛋白複合体 の形成は血流及び血漿粘度に直接的かつ間接的な影響を及ぼす可能性が考えられた。 本試験では、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）及びヨードアセトアミド存在下及び非存在下でヒト 及びカニクイザルの血漿にトロンビンを添加し得られた凝固塊を再溶解することで得た非架橋形成フ ィブリン及び架橋形成フィブリンを標準溶液として用いた。 ［結論］ rFXIII は in vivo で血漿中の蛋白を架橋結合させることが示された。血漿蛋白複合体にはフィブリノ ゲン α 鎖及び γ 鎖のオリゴマー、もしくはこれらと α2-AP、α2-マクログロブリン及びフィブロネクチン といった抗線溶作用を示す強固なフィブリン塊の形成に必要な蛋白が混在するものであった。 t-PA 誘発性再出血ウサギモデルにおける線溶抵抗性に及ぼす rFXIII の影響の評価（Module 2.6.3.2、試 験番号 RES-10352） ［目的］ 本試験の目的は、t-PA 誘発性再出血ウサギモデルで形成された凝固塊の抗線溶作用に対する rFXIII 前処理の影響を評価することである。 ［試験方法］ 損傷誘発 90 分前、1 群 6 匹の動物に rFXIII（0.4 mg/kg、臨床推奨用量である 35 IU/kg の 2 倍に相当） 又は生理食塩液を静脈内投与した。各動物につき耳部の 3 箇所を切開して出血を誘発、凝固塊の完成 を 15 分間待った。その後 t-PA を処置（1 mg/kg をボーラス投与後 1 mg/kg/h の速度で持続注入）し、凝 固塊に対する線溶作用を活性化した。各切開部位における再出血までの時間（Time to lysis：以下、 TTL）を t-PA 処理後 15 分間測定した。t-PA 誘発性線溶に対する抵抗性を、本モデルにおける凝固塊強 度の代用マーカーとした。 28 of 51 ［結果］ TTL の測定値（3 切開部位／動物）を表 2.6.2-6 に示した。再出血が認められなかった切開部位につ いては 900 秒のデータを入力した。 表 2.6.2-6 再出血までの時間（TTL、秒）：測定値及び平均値 試験群 動物番号 TTL（秒） 生理食塩液 FXIII 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 210 180 215 156 355 154 337 330 298 194 265 152 測定値 2 290 192 270 198 460 164 620 330 392 431 317 176 平均値 3 290 308 390 900 554 300 900 445 417 708 365 900 263 227 292 418 456 206 619 368 369 444 316 409 当初計画した統計解析手法では限界があったことから、両側検定による再解析を実施した。スコア 及び順位（Wilcoxon スコア）に基づく t-検定及び無作為化検定の結果、生理食塩液投与群と rFXIII 投 与群の TTL（3 切開部位／動物の平均値、中央値）に統計学的に有意な差は認められなかった また、投与を固定因子、個体を変動因子として、測定値（自然対数変換）の分散分析（ANOVA）を 行った。さらに、投与効果を Wald 検定により解析し、900 秒としたデータを打ち切り値とした尤度比 検定を実施した。その結果、生理食塩液投与群及び rFXIII 投与群の間に統計学的に有意な差は認めら れなかった。 ［結論］ rFXIII を前処理した動物では、t-PA を指標とした凝固塊の機械的強度の増強すなわち抗線溶作用の 増強傾向が認められたが、統計学的に有意ではなかったことから結論するには至らなかった。 本試験は 2002 年に Zymogenetics 社（米国ワシントン州シアトル）において実施されたもので、本剤 は 2004 年にノボ ノルディスク社へ導入されたものであるが動物数が少ないことと 1 用量でのみ実施さ れているといった試験計画の限界から結論が導けない結果になったものと考える。 29 of 51 t-PA 誘発性肝出血ウサギモデルを用いた rFVIIa 及び rFXIII 併用効果試験における肝生検による組織学 的評価（Module 2.6.3.2、試験番号 DTOR100501） ［目的］ t-PA 持続注入により線溶亢進を模したウサギの肝部分切除後の出血に対する in vivo での rFVIIa 単剤 及び rFVIIa と rFXIII の併用の効果を評価した。本試験では、rFXIII の単剤治療効果は検討されていな い。 ［試験方法］ 試験の in vivo phase については Tranholm らの試験報告書8に別途詳細が記されている。要約すると、 各群 5～6 匹の動物を正常対照の 1 群及び t-PA を 2 mg/kg/h の速度で注入する 5 群の計 6 群に無作為に 割り付け、t-PA 投与群に対してはさらに、溶媒（t-PA 対照）、rFVIIa 単剤（5 mg/kg）の投与又は rFVIIa（5 mg/kg）と rFXIII（0.1、1 又は 3 mg/kg、臨床推奨用量である 35 IU/kg の 0.5、5 又は 15 倍に 相当）との併用投与を行った。肝中葉に標準化した損傷を負わせた 5 分後に rFVIIa 及び rFXIII を投与 し、損傷前後に腹部に設置した綿布の重量を測定することで出血に対する影響を評価した。In vivo phase 終了後（損傷 35 分後）に損傷部位から肝生検サンプルを採取し組織学的検査及び免疫組織化学 的検査に供した。凝固塊が認められた切片の形態学的評価のためにフィブリン及び血小板を Carstairs 染色変法で染色した。 免疫組織化学的検査 切片を脱パラフィンし、マイクロウェーブオーブン内で EGTA 含有 Tris 緩衝液処理により抗原賦活 化を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックのため、H2O2 又は過ヨウ素酸二水和物（HIO4 2H2O）に引き続き水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）で処理した。次に、内因性ビオチン結合部位ブ ロックのため、アビジン・ビオチン溶液とインキュベートした。さらに、切片を当該動物血漿でブロ ックした後、一次抗体と一晩インキュベートし、動物種特異的なビオチン化二次抗体とインキュベー トした。次に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン又はベクタステイン ABC キットのアビジンビオチン複合体であるビオチン化チラミドとインキュベートし、ペルオキシダーゼ標識ストレプトア ビジン／アビジン-ビオチン複合体と共に追加インキュベートした。標準的な手順との相違点は、フィ ブリノゲン及び FXIII の染色に三重免疫組織化学的染色法（一次抗体、ビオチン化ロバ抗ヒツジ抗体及 びベクタステイン ABC キットのアビジン-ビオチン複合体）を施したことと、ビオチン化ロバ抗マウス 抗体添加前にマウス抗 5-HIS タグ抗体を用いて、scFv である His タグ抗体処理ステップを追加したこと である。発色反応にはジアミノべンジジンを使用した。対照は、一次抗体、マウスモノクローナルア イソタイプ特異抗体、ヒツジ IgG 及び scFv HIS タグ抗ラットインスリン抗体の添加を省略することで 得た。切片はマイヤーヘマトキシリン溶液で対比染色し、アルコールで段階的に脱水し、キシレンで 透徹し、Eukitt で封入した。 30 of 51 ［結果］ 他の血液凝固障害誘発試験と同様に、t-PA 処理動物で得られた結果には大きなばらつきが認められ た。本試験において、rFVIIa 単剤投与による総出血時間に対する影響は認められなかったが、rFVIIa （5 mg/kg）と rFXIII（0.1、1 又は 3 mg/kg）の併用投与により、有意ではないが出血の減少傾向が認め られた。総出血時間は、溶媒対照群（中央値：1027 秒）と比較し、これら 3 併用群のいずれにおいて も減少が認められた（中央値：それぞれ 305、646 及び 605 秒）。（表 2.6.2-7 参照） 表 2.6.2-7 総出血時間及び補正出血量 正常対照 溶媒対照 出血時間（秒） 41 (0～545) 1027 (491～ 1666)* 中央値（範囲） 肝切片重量で補正 8.34±5.28 30.93±12.36* した出血量（g） 平均値±SD * p<0.05, *** p<0.001（正常対照との比較） アルテプラーゼ（t-PA）2 mg/kg/h rFVIIa 5 mg/kg rFVIIa 5 + rFVIIa 5 + rFXIII 0.1 mg/kg rFXIII 1 mg/kg 1447 (785～ 305 (170～935) 646 (45～1010) 1759)*** 35.94±19.89* 14.49±8.84 14.57±9.77 rFVIIa 5 + rFXIII 3 mg/kg 605 (290～ 1390) 23.75±10.83 組織学的検査及び免疫組織化学的検査において、rFVIIa と rFXIII（3 mg/kg）併用動物では t-PA 対照 動物及び rFVIIa 単剤投与動物と比較し、1)損傷部位及びその下部に位置する洞様毛細血管の尖端方向 に凝固塊の出現頻度増加、2)血小板の動員及び活性の増強、3)フィブリノゲン沈着の亢進、4)α2-AP 取 り込みの亢進、5)TAFI 活性の亢進及び 6)ビトロネクチンの取り込み亢進が認められた。 ［結論］ rFVIIa に加えて rFXIII を投与した動物では、損傷部位で形成された凝固塊の物理的及び生化学的安 定性が増強されることが本試験結果から示唆された。 31 of 51 2.6.2.3 副次的薬理 各試験の実施要項及び結果を表 2.6.2-8 に示した。 表 2.6.2-8 副次的薬理試験の実施要綱及び結果 検討項目 In vitro 血液細胞との結合 結果 試験番号（GLP 適用） rFXIII 及び rFXIIIa*はいずれもリンパ球、顆粒球及び単球と結合 しないことが示された。また、rFXIIIa*は静止血小板及びトロン ビンにより活性化された血小板のいずれとも結合するが、rFXIII は血小板に結合しないことが確認された。 内皮細胞、腸上皮細胞、線維芽細胞及び大動脈平滑筋細胞と rFXIIIa*は結合したが、rFXIII は結合しなかった。 臨床濃度域 a（10 μg/mL 以下）において rFXIII 及び rFXIIIa*はい ずれも内皮細胞に対し毒性を示さなかった。 臨床濃度域 a（10 μg/mL 以下）において rFXIII 及び rFXIIIa*はい ずれも炎症誘発性細胞接着分子のアップレギュレーションを誘発 しなかった。 RES-FXIII-0018 （GLP 非適用） rFXIII 及び rFXIIIa*は臨床濃度域 a の 10 倍にあたる濃度でも、全 血に対して炎症誘発性サイトカイン放出を惹起しなかった。 RES-FXIII-0016 （GLP 非適用） 綿糸挿入により血小板を活性化させた動静脈シャントウサギモデ ルにおいて、凝固塊形成、血流、血圧及び平均血小板数に対する 影響は認められなった。rFXIII 用量は 0.4 mg/kg であり、67 IU/kg 及び臨床推奨用量の 2 倍に相当する。 a 臨床推奨用量である 35 IU/kg（0.21 mg/kg に相当）投与時の血漿中濃度が 5 µg/mL に相当。 RES-10351 （GLP 非適用） 内皮、線維芽、平滑筋及 び骨髄由来細胞との結合 内皮細胞の細胞毒性 培養内皮細胞における細 胞接着分子活性 Ex vivo Ex vivo での血液細胞から のサイトカイン放出 In vivo 血小板を活性化させたウ サギ動静脈シャントモデ ルにおける凝固塊形成 RES-FXIII-0017 （GLP 非適用） RES-FXIII-0014 （GLP 非適用） RES-FXIII-0015 （GLP 非適用） In vitro 副次的薬理試験 フローサイトメトリーによる rFXIII のヒト血液細胞との結合（Module 2.6.3.3、試験番号 RES-FXIII018） 本試験の目的は in vitro における rFXIII のヒト血液細胞との相互作用を評価することである。新鮮ヒ ト全血を遠心分離により分画し、血液細胞を 1～20 μg/mL（臨床推奨用量である 35 IU/kg 投与時の推定 濃度の 0.2～4 倍に相当）の濃度範囲の rFXIII 及び rFXIIIa*とインキュベートした。FXIII の血液細胞へ の結合はフローサイトメーターで識別した。T 細胞及び B 細胞は抗 CD3 抗体及び抗 CD19 抗体により それぞれ識別した。顆粒球群及び単球群は前方散乱及び側方散乱の比較により識別した。その結果、 rFXIII 及び rFXIIIa*はこれらの細胞と結合しなかった。形質変換骨髄内皮細胞を rFXIII 及び rFXIIIa*の 細胞結合の対照とした。その結果、rFXIII は最大 400 µg/mL までの用量で形質変換骨髄内皮細胞と結合 しなかったが、rFXIIIa*は 10 µg/mL から結合が認められた。 rFXIII の静止血小板及びトロンビンにより活性化された血小板に対する結合を確認するため、血小板 を精製し静止血小板分画をトロンビンで活性化した。さらに、血小板を 5～40 μg/mL の濃度範囲の 32 of 51 rFXIII 又は rFXIIIa*とインキュベートした。その結果、rFXIII は静止血小板及び活性化血小板のいずれ とも結合しなかったが、rFXIIIa*には 5 μg/mL から静止血小板及び活性化血小板との結合が認められた。 要約すると、フローサイトメトリーにより rFXIII 及び rFXIIIa*はいずれもリンパ球、顆粒球及び単球 と結合しないことが示された。また、rFXIIIa*は静止血小板及びトロンビンにより活性化された血小板 のいずれとも結合するが、rFXIII は血小板に結合しないことが確認された。 rFXIII の in vitro における内皮、線維芽、平滑筋及び骨髄由来生細胞との結合の免疫蛍光染色による評 価（Module 2.6.3.3、試験番号 RES-FXIII-017） 本試験の目的は rFXIII の各種ヒト細胞に対する結合を検討することである。ヒトの内皮、腸上皮、 線維芽及び大動脈平滑筋由来の各細胞株を各種濃度段階（0.1～100 μg/mL、臨床推奨用量である 35 IU/kg 投与時の推定濃度の 0.2～20 倍に相当）の rFXIII 又は rFXIIIa*とインキュベートした。rFXIII 及 び rFXIIIa*との結合程度の主観的な判定のために免疫蛍光染色による顕微鏡観察を行った。rFXIII の異 なる複数のバッチを本試験に用いた。rFXIIIa*は培養細胞と結合したが、rFXIII は本試験における最高 濃度でも結合が認められなかった。rFXIII の各バッチの結果はいずれも同様であった。本試験結果から、 rFXIII は in vivo で血管壁の内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞ならびに腸内層の腸上皮細胞とは結 合しないことが示唆された。トロンビンによる活性化で rFXIII の結合が惹起されることから、活性型 の rFXIII が in vivo においても血管壁を構成している内皮細胞、線維芽細胞及び平滑筋細胞ならびに腸 上皮細胞と結合することが示唆された。これらの試験結果は内因性 FXIII について文献報告9, 10されて いることと一致するものであった。 要約すると、トロンビンにより活性化された rFXIII（rFXIIIa*）とは異なり、rFXIII は内皮細胞、腸 上皮細胞、線維芽細胞及び大動脈平滑筋細胞とは結合しなかった。 培養ヒト臍帯静脈内皮細胞に対する rFXIII の細胞毒性（Module 2.6.3.4.1、試験番号 RES-FXIII-014） 本試験の目的は rFXIII の細胞毒性を評価することである。ヒト臍帯静脈内皮細胞（以下、HUVEC） の細胞増殖アッセイにより内皮傷害誘導性を評価した。 rFXIII 及び rFXIIIa*を 0.1～100 μg/mL（臨床推奨用量である 35 IU/kg 投与時の推定曝露量の 0.02～20 倍に相当）の濃度範囲で HUVEC 培養培地に添加し、48 時間後に細胞増殖を評価した。本アッセイで は 3 バッチの rFXIII を評価した。細胞毒性と細胞増殖抑制作用を区別するために confluent（密、非細 胞増殖）及び sub-confluent（疎、細胞増殖）な細胞培養により試験を行った。代謝活性は、成長因子を 添加せず 5%仔ウシ血清を添加した培地中で測定した。化学療法剤であるドキソルビシンを細胞毒性の 陽性対照に用い、この処理により一貫して生存率の大幅な減少が認められた。 rFXIII 及び rFXIIIa*の各バッチの confluent 及び sub-confluent な HUVEC 培養のいずれにおいても、臨 床濃度域（10 μg/mL、臨床推奨用量である 35 IU/kg 投与時の推定曝露量の 2 倍に相当）で 48 時間のイ ンキュベーション期間中に毒性作用は認められなかった。rFXIIIa*の最高濃度群（100 μg/mL、臨床推 33 of 51 奨用量である 35 IU/kg 投与時の推定曝露量の 20 倍に相当）でのみ、sub-confluent な増殖細胞の培養に おいて 13～33%の生存率減少が認められた。この作用は confluent な細胞では認められないことから、 細胞毒性ではなく細胞増殖抑制作用であることが示唆された。通常の条件下では、内皮細胞は confluent で静止しており、細胞分裂をしない。rFXIIIa*の 100 μg/mL 処理群では沈澱が認められており、 試験結果に影響を及ぼした可能性が考えられる。 以上の試験結果から、臨床濃度域（10 μg/mL 以下、臨床濃度の 2 倍以下）では rFXIII 及び rFXIIIa* ともに内皮細胞に毒性を示さないと結論された。これより高い濃度（100 μg/mL 以上、臨床濃度の 20 倍以上）では、rFXIIIa*は内皮細胞増殖阻害作用を示す可能性が考えられた。 rFXIII 及び活性化 rFXIII による細胞接着分子のアップレギュレーション（Module 2.6.3.4.1、試験番号 RES-FXIII-0015） rFXIII がトロンビンによる活性化有無の各条件下（rFXIII 及び rFXIIIa*）で炎症システムに影響を及 ぼす可能性を検討するため、培養形質転換骨髄微小血管内皮細胞（TrBMEC）を用いて in vitro 細胞接 着分子活性化試験を実施した。rFXIII 又は rFXIIIa*処置後 24 時間に ELISA により血管細胞接着分子-1、 細胞接着分子-1 及び E-セレクチンの発現を測定した。 rFXIII の 3 バッチを本試験に用いた。内皮細胞をそれぞれ 1～4 種の濃度（0.1、1、10 又は 100 μg/mL：臨床推奨用量である 35 IU/kg 投与時における推定濃度の約 0.02、0.2、2 又は 20 倍に相当）の rFXIII 又は rFXIIIa*存在下でインキュベートし、炎症誘発性細胞接着分子（血管細胞接着分子-1、細胞 接着分子-1 及び E-セレクチン）の発現を測定した。腫瘍壊死因子 α（以下、TNF-α）の 1 ng/mL 処理に よる刺激を炎症誘発性細胞接着分子発現の陽性対照とした。また、バッチ番号 FH92009 及び F249124 を用いた試験では、MG132 の 50 μmol/L を TNF-α による炎症誘発性細胞接着分子発現を抑制する陽性 対照とした。 臨床濃度域（10 µg/mL 以下：臨床推奨用量である 35 IU/kg 投与時における推定濃度の約 2 倍以下に 相当）の rFXIII 又は rFXIIIa*による細胞接着分子のアップレギュレーションは認められなかった。また、 rFXIII 又は rFXIIIa*の 100 μg/mL 処理は、TNF-α で誘発した細胞接着分子発現を阻害しなかった。 試験に供した rFXIIIa*最高濃度（100 μg/mL 以上）では、3 種の細胞接着分子すべての発現増加 （38％）が認められた。しかしながらこの高濃度（100 μg/mL）の rFXIIIa*を添加した培養培地中に沈 澱が相当量認められた。したがって、観察された細胞接着分子の影響は、蛋白の凝集形成によるもの である可能性が考えられた。 結論として、臨床濃度域では、rFXIII 及び rFXIIIa*のいずれも炎症誘発性細胞接着分子を誘導しなか った。 34 of 51 Ex vivo 副次的薬理試験 非トロンビン活性型 rFXIII 及びトロンビン活性型 rFXIII における炎症性サイトカイン放出に関する ex vivo 全血アッセイ（Module 2.6.3.4.1、試験番号 RES-FXIII-0016） rFXIII による炎症反応又は免疫反応に対する影響を決定するために、健康被験者から採取した全血を 用いて、rFXIII 又は rFXIIIa*処理を行い、ex vivo で炎症誘発性サイトカインの産生を測定した。 健康被験者から採取した全血に rFXIII 又は rFXIIIa*を 0.1～100 µg/mL（臨床推奨用量である 35 IU/kg 投与時における推定濃度の約 0.02～20 倍に相当）で処理した。rFXIII 又は rFXIIIa*はそれぞれリポ多糖 （LPS）存在下でも 0.1～100 µg/mL の濃度で処理した。試験ごとに LPS のみの標準曲線を作成し、陽 性対照とした。LPS 存在下及び非存在下で rFXIII 又は rFXIIIa*ともに 4 時間インキュベートした血漿を 収集し、市販 ELISA キットを用いて、TNF-α、インターロイキン（IL）-1β 及び IL-6 を測定した。本試 験では 3 種の異なるバッチの rFXIII を用いた。 rFXIII 又は rFXIIIa*処理した全血には、炎症誘発性サイトカイン産生の有意な亢進は認められなかっ た。また、rFXIII（活性型、非活性型に関係なく）LPS 誘発サイトカイン産生を阻害しなかった。試験 に供した 3 種のバッチ間に有意な差異はなかった。 結論として、rFXIII 又は rFXIIIa*は臨床濃度域の 10 倍にあたる濃度でも、全血に対して炎症誘発性 サイトカイン放出を惹起しなかった。 In vivo 副次的薬理試験 綿糸挿入により血小板を活性化させた動静脈シャントウサギモデルに rFXIII が及ぼす影響（Module 2.6.3.4.2、試験番号 RES-10351） 本試験は、rFXIII が内因性 FXIII の生理学的レベル以上となった場合の凝固塊形成亢進の有無を確認 できるようにデザインされており、動静脈シャント血流中に挿入した綿糸の周囲に形成された凝固塊 重量の測定を行った。血圧、血流量及び血小板数も測定した。綿糸挿入時間は形成された凝固塊によ る閉塞が生じないように設定した。綿糸重量の変化を凝固塊形成の指標とした。 8 匹の雌性 New Zealand 白色種ウサギを試験に供した。動静脈シャントは総頸動脈と外頸静脈の間に 外科的に移植した。形成された止血栓による閉塞は認められなかった。シャント実施中の血液循環を 10 分間モニターした。4 セットの綿糸をそれぞれそれぞれ 10 分間シャント内に吊るした。2 セットは rFXIII 又は溶媒投与前に（凝固塊形成の基準値とした）、残りの 2 セットは投与後にシャント内に挿入 した。試験には 2 群の動物を用い、グループ 1（n=4）の動物に対しては rFXIII の 0.4 mg/kg（臨床推奨 用量の約 2 倍）を、グループ 2（n=4）の動物に対しては溶媒を投与した。平均血小板数、血流量及び 血圧を約 50 分間測定した。 平均血圧及び平均血流量に 2 群間で有意な差は認められなかった。平均血小板数は 2 群間で同程度 であった。rFXIII 投与により凝固塊形成に変化は認められず、綿糸上に形成された凝固塊重量に変化は 35 of 51 認められなかった。本試験の結果は FXIII の既知の主たる機能、すなわち凝固塊の安定化と一致するも のであると考えられた。 36 of 51 2.6.2.4 安全性薬理 中枢神経系及び心血管系に対する rFXIII の安全性薬理は、単回投与毒性試験（試験番号 SBi-1394175）及び重要な反復投与毒性試験（試験番号 NN205225）において in vivo で評価した。 また、体外血液循環施術後に rFXIII を投与した心臓手術モデルにおいて FXIII の安全性を検討した。 実施した試験の概要及び結果を表 2.6.2-9 に要約した。 表 2.6.2-9 安全性薬理エンドポイントの概要及び結果 安全性薬理エンドポイント In vivo サル中枢神経系及び心血管系 サル体外血液循環（ECC）モ デルにおける呼吸、心血管系 パラメータ、体温及び血液凝 固の検討ならびに血液生化学 的検査、血液学的検査及び病 理組織学的検査 結果 試験番号 （GLP 適用） カニクイザルにおいて、中枢神経系、血圧、心拍数及び心電図に対 する影響は認められなかった。rFXIII は 6 mg/kg（1002 IU/kg 及び臨 床推奨用量の 29 倍に相当）の用量で 2 週間反復投与又は 3 mg/kg （501 IU/kg 及び臨床推奨用量の 14 倍に相当）の用量で 2 週間に 1 回の 27 週間投与した。 2 時間の ECC 施行後の 6 時間の観察期間中に明らかな有害作用は認 められなかった。rFXIII 用量は 2.1 及び 7.1 mg/kg であり、それぞれ 351 及び 1186 IU/kg ならびに臨床推奨用量の 10 及び 34 倍に相当す る。 SBi-1394-175、 NN205255 （GLP 適用） ZGI 1112-011、 ZGI 1112-013 （GLP 非適用） In vivo 安全性薬理試験（Module 2.6.3.4.2、試験番号 SBi-1394-175 及び NN205255） ICH S6 ガイドラインを参考とし、中枢神経系及び心血管系に対する安全性薬理の評価（それぞれ 「一般状態及び行動の観察」及び「心電図、血圧及び心拍数」）ならびに体温の測定を、カニクイザ ル反復投与毒性の 2 試験に組み入れて実施した。 カニクイザルに対し rFXIII を 0.3～6 mg/kg の用量（1 日投与量として、臨床推奨用量である 35 IU/kg/ 月の 1.5～30 倍に相当）で単回及び 2 週間反復投与もしくは 1～10 mg/kg の用量（臨床推奨用量である 35 IU/kg/月の 3～48 倍を月 2 回投与に相当）で 2 週間に 1 回 13～27 週間投与した中枢神経系、心血管 系及び体温に及ぼす影響は認められなかった。rFXIII の 10 mg/kg（1670 IU/kg、臨床推奨用量である 35 IU/kg の 48 倍に相当）を単回投与後に 1 頭で死亡が認められたが、死因（血栓症及び虚血性壊死）は rFXIIIa の過剰な薬理作用に関連するものと考えられ（Module 2.6.7.7.E、試験番号 NN205255 に毒性の 詳細を記した）、他の 29 頭では 10 mg/kg を 2 週間に 1 回 13～27 週間投与しても中枢神経系及び心血 管系への影響は認められなかった。 心電図については表 2.6.2-10 に記した。 37 of 51 表 2.6.2-10 カニクイザル反復投与毒性試験における心電図の測定時点、誘導及び結果 試験番号 試験の種類 用量 SBi-1394-175 14 日間反復静脈内投与毒 性試験及び 30 日間回復 性試験 0、0.3、3 及び 6 mg/kg（0、 50、501 及び 1002 IU/kg に 相当）a 0、1、3 及び 10 mg/kg（0、 167、501 及び 1670 IU/kg に 相当）a NN205255 臨床推奨 用量比 0、1.4、 14 及び 29 倍 心電図測定 時点 初回投与 前、投与 2 週、回復最 終週。 2 週間に 1 回の 27 週間静 0、5、14 初回投与 脈内投与毒性試験。13 週 及び 48 前、投与 6、 間中間安楽死処置ならび 倍 12 及び 26 に 溶媒対照群及び高用量 週、回復 3 群における 8 週間の回復 及び 7 週。 試験も実施。 a 投与は mg/kg で行った。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 誘導 結果 I、II、III、 aVR、aVL 及 び aVF rFXIII 投与に よる心電図へ の影響は認め られなかっ た。 rFXIII 投与に よる心拍数及 び心電図への 影響は認めら れなかった。 I、II、III、 aVR、aVL 及 び aVF。心 拍数は II 誘 導で測定。 結論として、rFXIII をカニクイザルへ単回及び反復投与し、肉眼的な中枢神経系機能の評価及び選択 した心血管系パラメータの評価を行ったが、安全性薬理上の懸念は認められなかった。 体外血液循環モデルによる rFXIII の評価11（Module 2.6.3.4.2、試験番号 ZGI1112-010、ZGI1112-011 及び ZGI1112-013） 心肺バイパスを含む大手術後に外因性 FXIII 投与により動員後の不足分を補充することで、出血性合 併症と輸血の必要性を回避できる可能性が考えられた。このことから、rFXIII の非臨床安全性評価のた めに成熟雄性カニクイザルを用いて体外血液循環（ECC）モデルを開発した。先天性欠乏症の補充療 法を目的とした本プロジェクトの効能又は効果とは直接関係しないが、治験薬概要書にこれらの試験 データを記載して各国の規制当局に提出していることと、先天性欠乏症患者の手術時の効能又は効果 を目的としたノボ ノルディスク社による開発着手の判断に必要となる可能性があることから、本概要 にも記載することにした。ECC モデルを評価する予備的な試験から、胸骨切開を伴う ECC モデルより も特に動物の凝固状態に留意した上で ECC の単独モデルを用いる方が好ましいと考えられた。主試験 の概要は表 2.6.2-11 に示した。 表 2.6.2-11 試験群 1 ECC 施行後に rFXIII を投与した試験の概要 試験方法 麻酔下、カテーテル及びカニ ューレ挿入手術、 ヘパリン 化、2 時間心電図、6 時間回復 性観察 プロタミン投与後の処置 a プラセボ投与 性及び動物数 雄6 試験番号 ZGI 1112-011（4 頭） ZGI 1112-013（2 頭） 2 ZGI 1112-011 rFXIII の 2.1 mg/kg を投与 b 雄 3 3 rFXIII の 7.1 mg/kg を投与 b 雄 6 ZGI 1112-011（3 頭） ZGI 1112-013（3 頭） a 被験物質及び対照物質はプロタミン硫酸塩投与後 20 分に緩徐にボーラス投与し、その後 6 時間観察を行った。 b rFXIII は 300 及び 1000 U/kg の用量で投与し、他の非臨床試験と整合性を図るため 1 mg = 140 U 又は 167 IU として mg/kg 換算した。 38 of 51 体温、血圧、心拍数、呼吸数、呼気中二酸化炭素濃度、血液酸素飽和度及び心電図を記録した。ま た、血液学的検査、血液生化学的検査、血液凝固検査及び選択した器官の病理組織学的検査による評 価も行った。 1 頭を除く全動物が 2 時間の ECC 施行後まで生存した。ECC 終了後、プロタミン反転により全動物 の活性化全血凝固時間はベースラインに回復し、被験物質及び対照物質の投与は許容できるものであ った。溶媒対照群動物の 1 頭がプロタミン投与後約 1 時間で死亡した。当該動物を剖検したところ、 右頸動脈に裂傷が認められ、急性失血及び死亡に至ったことから、当該所見が死因であると考えられ た。 成熟雄性カニクイザルに rFXIII を 2.1 及び 7.1 mg/kg（臨床推奨用量の 10 及び 34 倍）の用量で静脈 内へ緩徐に単回ボーラス投与した結果、2 時間の ECC 施行後において良好な忍容性が認められた。呼 吸、心電図、心拍数、血圧、体温、血液生化学的検査、血液学的検査（血小板数を含む）、凝固活性 マーカー〔トロンビン・アンチトロンビン複合体（以下、TAT）及び D-ダイマー〕又は血小板活性化 マーカー（血小板第 4 因子及び β-トロンボグロブリン）といった観察項目及び測定項目に、被験物質 に関連すると考えられる影響は認められなかった。6 時間の観察期間中に、rFXIII 投与による凝固系エ ンドポイント（aPTT、プロトロンビン時間（以下、PT）及びフィブリノゲン）への影響は認められな かった。rFXIII 投与により用量依存的な FXIII 活性の亢進が認められた。脳、心臓、肺、肝臓及び腎臓 の剖検及び病理組織学的検査では、出血及び血栓症も含め rFXIII に関連した変化は認められなかった。 要約すると、成熟雄性カニクイザルに rFXIII を 2.1 及び 7.1 mg/kg の用量で静脈内へ緩徐に単回ボー ラス投与した結果、2 時間の ECC 施行後において良好な忍容性が認められ、6 時間の観察期間中、明ら かな有害作用は認められなかった。 39 of 51 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用 心臓手術やその他の手術を補助する人工心肺バイパス術（以下、CPB）の施行中では、凝固防止のた めにヘパリンが標準的に用いられる。ヘパリンの影響は、手術終了後、プロタミン添加により中和化 されるものの、微小血管系の出血リスクの増大が CPB の一般的副作用である。出血リスクの増大は凝 固塊強度の低下及び FXIII レベルの低下と関連している。したがって、rFXIII とヘパリン及びプロタミ ンとの相互作用を検討する in vitro 試験を rFXIII の手術時に使用を支持する目的で実施した。 FXIII 及び rFVIIa の併用に関連する各種の試験を実施した。本来の目的は、別の IND における rFXIII と rFVIIa の併用療法の臨床開発を支持するためであったが、当該併用療法の臨床開発を中止した。以 下の毒性試験及び安全性試験の要約の通り、毒性がみられた。 rFVIIa 及び rFXIII の併用が科学的に正当な理由は、本併用が凝固塊形成と凝固塊の安定性を向上さ せることである。 In vitro 及び in vivo 薬物相互作用試験の概要及び結果を表 2.6.2-12 に示した。 表 2.6.2-12 In vitro 及び in vivo 薬物相互作用試験の概要及び結果 被験物質 ヘパリン、プロタ ミン及び rFXIII rFXIII 及び rFVIIa 試験の種類及び結果 In vitro 交叉反応性：rFXIII とヘパリン又はプロタミンの間で交叉反応性はない ことが示唆された。 サル単回静脈内投与毒性試験：rFXIII 及び rFVIIa の無毒性量は、併用試験では それぞれ 7 mg/kg 及び 2 mg/kg、単剤投与試験ではそれぞれ 3～8 mg/kg 及び 0.33～1 mg/kg と類似した結果が得られており、併用による相乗的な影響は認 められなかった。 麻酔サル心血管系モデル：血液凝固亢進状態を引き起こす可能性のある複数の カテーテルを留置した状態で麻酔を施した動物では、過剰な薬理作用（12 頭 中 1 頭でみられた止血栓及び死亡）が単回投与毒性試験で rFXIII の 7 mg/kg 及 び rFVIIa の 2 mg/kg を併用した時よりも低い用量である rFXIII の 3.5 mg/kg 及 び rFVIIa の 1 mg/kg 併用により認められた。死亡が認められた用量は、rFXIII は臨床推奨用量である 35 IU/kg の 17 倍、rFVIIa は臨床推奨用量である 90 µg/kg の 11 倍であった。 rFXIII 及び rFVIIa 試験番号 RES-10323 NN205070 （GLP 非適用） NN205148 （GLP 適用） NN206100 （GLP 適用） In vitro 薬力学的薬物相互作用 In vitro での rFXIII とヘパリン又はプロタミンとの間の交叉反応性不存在の検証（Module 2.6.3.5.1、試 験番号 RES-10323） 本試験の目的は FXIII とヘパリン又はプロタミンとの間の交叉反応性を検証することであった。 aPTT を血漿中凝固時間の指標として使用し、ヘパリンとプロタミンの影響を in vitro で検証した。ヘパ リンは aPTT を遅延し、プロタミンはヘパリンの影響を中和した。rFXIII の aPTT に対する影響をヘパ リン処理-プロタミン中和血漿で検討した。rFXIII を最高 100 µg/mL（最大臨床濃度の 20 倍）を添加し ても本アッセイ系では影響を示さなかった（図 2.6.2-11）。さらに、rFXIII の架橋形成能を SDS-PAGE 40 of 51 で検証したが、ヘパリン及びプロタミンは in vitro での rFXIII の架橋形成能に影響を示さなかった。こ れらの結果から、rFXIII とヘパリン又はプロタミンとの間で交叉反応性はないことが示唆された。 図 2.6.2-11 ヘパリン又はプロタミン含有クエン酸処理ヒト血漿における rFXIII の影響 41 of 51 In vivo 薬力学的薬物相互作用 rFVIIa 及び rFXIII 併用試験：サル単回静脈内投与毒性試験及び 3 日間回復試験（Module 2.6.3.5.B、試 験番号 NN205070） 本試験の目的は rFXIII と rFVIIa を数分以内に静脈内へ併用投与した時の毒性評価と、GLP に準拠し て実施する rFXIII と rFVIIa の併用単回投与毒性試験の用量選択である。本試験では雌雄各 4 頭からな る計 8 頭のカニクイザルを使用した。動物は 107～133 週齢で、投与開始時の体重範囲は 2.63～3.70 kg （雄：2.74～3.70 kg、雌：2.62～3.33 kg）であった。試験デザインの概要を表 2.6.2-13 に示した。 表 2.6.2-13 試験群、用量、臨床推奨用量比及び動物数（試験番号 NN205070） rFVIIa rFXIII 臨床推奨用量（90 用量 臨床推奨用量（35 µg/kg）比（倍） （mg/kg) [IU/kg]a） IU/kg）比（倍） 1 0.10 1 0.34 [58] 2 2 0.33 4 1.12 [187] 5 3 1.67 19 5.60 [935] 27 4 5.00 56 16.80 [2806] 80 a 投与は mg/kg で行った。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 試験群 用量（mg/kg） 動物数 （雄／雌） 1/1 1/1 1/1 1/1 第 4 群の雌雄動物に対しては rFXIII を 16.80 mg/kg（臨床推奨用量の 80 倍）及び rFVIIa を 5 mg/kg （臨床推奨用量の 56 倍）の用量で投与したが、投与後 4 時間で瀕死状態であったことから安楽死処置 した。製剤中の rFXIIIa°濃度は 0.64%であった。病理組織学的検査では、雄性動物の腎臓にび慢性尿細 管壊死及び糸球体の止血栓と鬱血、心臓に心筋壊死、肺に止血栓と浮腫、脳及び頭蓋腔に凝固塊及び 出血が、また雌雄動物の注射部位に出血及び蜂巣炎が認められた。これらの所見は、rFVIIa と rFXIII 併用による影響で、播種性血管内凝固症候群（DIC）による死亡の原因と一致するものであった。 第 2 群の雄性動物では投与後 6 時間、第 3 群の雄性動物では投与後 48 及び 72 時間においてそれぞれ、 定量上限以上となる TAT 増加が認められた。TAT の増加と D-ダイマーの相関性は認められなかった。 第 4 群の雄性動物では、安楽死処置直前に採取したサンプル中の D-ダイマー及び TAT が定量上限以上 であった。同群の雌性動物のサンプルは凝固してしまったため、D-ダイマー及び TAT の測定はできな かったが、安楽死処置直前の白血球数は高値を示した。 投与後 72 時間に、第 3 群動物の血漿中クレアチニン濃度が第 1 及び第 2 群動物と比較し約 30%増加 したが、投与前測定値の範囲内であった。第 4 群の雌性動物では、安楽死処置直前にクレアチニン、 無機リン及び尿素が投与前値の 2 倍まで増加した。当該動物では、アスパラギン酸アミノトランスフ ェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼがそれぞれ投与前値の 18 及び 10 倍まで増加した。 第 1～第 3 群動物では、rFXIII 及び rFVIIa による全身性の組織学的変化は認められなかった。 試験に供した全動物で rFXIII 及び rFVIIa の全身曝露が確認された。 死亡した第 4 群動物は各単剤の単回投与時の無毒性量を超える用量が投与されている。第 4 群動物 の死因は DIC であった。 42 of 51 rFXIII 及び rFVIIa を併用投与したところ、それぞれ最大 5.6 mg/kg（臨床推奨用量である 35 IU/kg の 27 倍）及び 1.67 mg/kg（臨床推奨用量である 90 µg/kg の 19 倍）までの用量で良好な忍容性が認められ、 肺、腎臓、心臓及び脳に止血栓形成を示唆する病理組織学的所見は認められなかった。 rFXIII の 5.6 mg/kg 及び rFVIIa の 1.67 mg/kg を 1 分以内に静脈内へ併用投与した時に全身性の毒性は 認められなかったことから、当該用量が無毒性量と推察された。rFXIIIa°は本試験に用いた製剤中に 0.64%含まれており、無毒性量での rFXIIIa°の投与量は臨床推奨用量である 35 IU/kg と有効期限終了時 規格値から算出した臨床における最高臨床用量の 21 倍に相当する。 rFVIIa 及び rFXIII 併用試験：カニクイザル単回静脈内投与毒性試験（GLP 適用）及び 3 日間回復試験 （Module 2.6.3.5.2、試験番号 NN205148） 本試験の目的は rFXIII と rFVIIa を数分以内にカニクイザルの静脈内へ併用投与した時の毒性を評価 することである。投与後 3 日間の観察も行った。また、併用時と単剤投与時のトキシコキネティクス の評価も行った。 試験には 43 頭のカニクイザルを用いた。試験開始時、主試験群動物は 60～100 週齢で体重範囲は 1.84～2.63 kg であり、トキシコキネティクス群動物は 164～251 週齢で体重範囲は 2.55～4.23 kg であっ た。試験デザインの概要を、主試験は表 2.6.2-14 に、トキシコキネティクスは表 2.6.2-15 に示した。主 試験では多くの動物で毒性が顕在化することを避けるため時間差投与を行った。各群雌雄各 1 頭の動 物に対する投与を行い、病理組織学的検査の結果に基づき残りの動物へ予定していた用量を投与する か減量した上で投与するかを決定した。 表 2.6.2-14 主試験：試験群、用量及び動物数（試験番号 NN205148） rFVIIa 臨床推奨用量（90 用量（mg/kg, µg/kg）比（倍） [IU/kg]a） 1 Low/Low 1 11 3.5 [585] 2 Mid/Low 2 22 3.5 [585] 3 Low/Mid 1 11 7 [1169] 4 Mid/Mid 2 22 7 [1169] 5 Low/High (1) 1 11 14 [2338] 5’ Low/High (2) 0.75 8 10.5 [1754] 6 High/low 4 44 3.5 [585] a 投与は mg/kg で行った。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 試験群 用量（mg/kg） 表 2.6.2-15 rFXIII 臨床推奨用量（35 IU/kg）比（倍） 17 17 33 33 67 50 17 動物数 （雄／雌） 3/3 3/3 3/3 3/3 1/1 3/3 3/3 トキシコキネティクス：試験群、用量及び動物数（試験番号 NN205148） 試験群 rFVIIa 用量（mg/kg） rFXIII 用量（mg/kg, [IU/kg]a） 7 10.5 [1754] rFXIII 単剤 8 4 rFVIIa 単剤 a 投与は mg/kg で行った。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 動物数（雄／雌） 2/2 2/2 43 of 51 一般状態の観察、体重測定、血液学的検査、血液生化学的検査、トキシコキネティクス評価、バイ オマーカー検査、尿検査、器官重量測定、剖検及び病理組織学的検査による評価を行った。 一般状態における有害所見ならびに体重及び器官重量に対する影響は認められなかった。 rFVIIa を投与した全群、すなわち rFXIII との併用群及び単剤投与群（第 8 群）で、PT 及び aPTT の 急激な（投与後 30 分以内）短縮が認められたが、投与後 26 時間までには投与前値に回復した。rFXIII 単剤投与群（第 7 群）ではこれらのパラメータへの影響は認められなかった。ヘモグロビン濃度、赤 血球数、ヘマトクリット値、平均赤血球容積は投与後 72 時間まで全試験群で全体的に減少した。投与 後 8 時間に血小板数の一過性の減少が認められたが、第 5 群〔Low/High (1)〕の雄性動物を除き、概し て投与後 72 時間までに投与前値に回復した。第 5 群〔Low/High (1)〕の雄性動物では、進行性の血小 板数減少ならびにフィブリノゲン、D-ダイマー及び TAT の増加、また、これらの所見と対応する病理 組織学的検査における肺の止血栓といった過剰な薬理作用に起因する所見が認められた。当該動物で 認められた所見に基づき、引き続き投与を行う他の動物（第 5'群）では忍容性を確保するため減量し て投与を行った。rFXIII 単剤（10.5 mg/kg）投与群の雌性動物 2 頭ではフィブリノゲンの増加が、 rFVIIa 単剤（4 mg/kg）投与群の雄性動物では D-ダイマー又は TAT の増加が認められた。肝酵素及び ビリルビンの増加が殆どの試験群で認められたが、併用時の組み合わせとの明確な相関性は認められ なかった。 被験物質の影響による病理組織学的所見は認められなかった。 主試験群（第 1～6 群）の病理組織学的検査： rFXIII の 14 mg/kg と rFVIIa の 1 mg/kg 併用群の雄性動物 1 頭及び rFXIII の 3.5 mg/kg と rFVIIa の 4 mg/kg 併用群の雌性動物 1 頭では肺に止血栓が認められた。rFXIII の 14 mg/kg と rFVIIa の 1 mg/kg 併用 群の雄性動物 1 頭では腎臓に尿細管壊死、心臓に心筋細胞壊死が認められた。rFXIII の 3.5 mg/kg と rFVIIa の 2 mg/kg 併用群、rFXIII の 7 mg/kg と rFVIIa の 2 mg/kg 併用群及び rFXIII の 3.5 mg/kg と rFVIIa の 4 mg/kg 併用群では注射部位に止血栓が認められた。 トキシコキネティクス群（第 7 及び 8 群）の病理組織学的検査： rFVIIa の 4 mg/kg 投与群では心臓に心筋症が認められた。rFVIIa の 4 mg/kg 投与群の 1 頭では 1 肺葉 に動脈炎及び止血栓が認められた。当該動物では脳の脈絡叢に動脈炎が認められた。rFXIII の 10.5 mg/kg 投与群の雌性動物 1 頭では肺に初期段階の止血栓が認められた。 rFXIII と rFVIIa を数分以内に静脈内へ投与したが、それぞれの血漿中曝露量及び PK プロファイルに 対する影響は認められなかった。rFVIIa 曝露量及び総 FXIII A2 には、それぞれほぼ用量依存的な増大が 認められた。性差は認められなかった。 rFXIII と rFVIIa を静脈内への単回投与により併用した本試験では、両剤を 14:1～0.88:1 の範囲で 5 段 階の用量比で組み合わせて投与したが、良好な忍容性が認められ、死亡及び有害作用は認められなか った。 44 of 51 両剤いずれかの最高用量を投与した群の動物では病理組織学的変化が認められたが、両剤の組み合 わせによる相加的又は相乗的な影響を明らかに示すものはみられなかった。 病理組織学的検査では全身性の毒性は認められなかったことから、本試験における無毒性量は rFXIII の 7 mg/kg と rFVIIa の 2 mg/kg であると推察された。rFXIIIa°は本試験に用いた製剤中に 0.82%含まれ ており、無毒性量での rFXIIIa°の投与量は臨床推奨用量である 35 IU/kg と有効期限終了時規格値（0.8%） から算出した最高臨床用量の 34 倍に相当する。 rFXIII 及び rFVIIa 併用試験：麻酔下でのカニクイザルの血行動態全般に対する影響（Module 2.6.3.5.2、 試験番号 NN206100） 本試験の目的は、麻酔下における雄性カニクイザルの心血管系の血行動態全般に対し rFXIII と rFVIIa を数分間隔で併用した時の影響を評価することである。 試験には、各群 4 頭からなる計 16 頭の雄性カニクイザルを用いた。投与開始時の動物は 20～32 ヵ月 齢で、体重は 2.07～4.55 kg であった。試験群及び用量は表 2.6.2-16 に示した。 表 2.6.2-16 試験デザイン（試験番号 NN206100）：試験群、用量及び動物数 試験群 用量（mg/kg） 1 2 3 4 0 1 2 0.5 rFVIIa 臨床推奨用量（90 µg/kg）比（倍） 0 11 22 6 用量（mg/kg） 0 3.5 7 1.75 rFXIII 臨床推奨用量（35 IU/kg）比（倍） 0 17 33 8 性及び動物数 雄4 雄4 雄4 雄4 動物はペンタバルビトンナトリウムで麻酔され、外科的処置を受けた。 低用量群（rFXIII の 1.75 mg 及び rFVIIa の 0.5 mg）では、カテーテルを留置した麻酔サルの心血管系 パラメータに影響は認められなかった。 中間用量群（rFXIII の 3.5 mg 及び rFVIIa の 1 mg）では、試験終了前（4 時間の試験手順が終わる 2 分前）に 1 頭が死亡した。当該動物では、死亡するまで動脈圧及び心室圧の変動及び減少が認められ た。血圧及び心室圧の変動は中間用量群の他の動物でも認められた。高用量群では、投与後に血圧及 び左心室圧の変動が 2 頭で認められた。 死亡動物の病理組織学的検査では肺、胸腺及び心臓の血管に早期止血栓形成及び器質化ならびに赤 血球凝集が認められた。病理組織学的ピアレビューの結果、止血栓内に炎症性細胞が無く、凝固塊内 にフィブリンが認められなかったことから、止血栓は死亡時に炎症性反応が惹起される前に形成され たことが示唆された。しかしながら、rFXIII 及び rFVIIa の併用による過剰な薬理作用、ならびに本モ デルすなわち血液凝固亢進状態を引き起こす可能性のある複数のカテーテルを留置した状態と麻酔の 組み合わせが死因となった可能性は否定できないと考えられた。 45 of 51 rFXIII の 1.75 mg 及び rFVIIa の 0.5 mg を併用投与したサルに対する影響は認められず、この用量が 無毒性量であると推察された。rFXIIIa°は本試験に用いた製剤中に 0.26%含まれており無毒性量での rFXIIIa°の投与量は臨床推奨用量である 35 IU/kg と有効期限終了時規格値（0.8%）から算出した最高臨 床用量の 3 倍に相当する。 46 of 51 2.6.2.6 考察及び結論 薬効薬理（Module 2.6.2.2） FXIII は凝固カスケードの中で最終段階の酵素である。血管壁創傷部位でトロンビンにより活性型ト ランスグルタミナーゼに転換され、フィブリン及びフィブリン塊中のその他の蛋白を架橋結合させる ことで止血機構に影響を与える。 In vitro 及び in vivo での薬効薬理試験により、rFXIII の生化学的活性及び生物活性は哺乳類動物種間 で同程度であり、FXIII の役割として文献報告されていること12, 13と一致することが示された。rFXIII A サブユニットホモダイマー（A2）は各種動物の FXIII B サブユニットと結合する。FXIII A サブユニッ トは FXIII B サブユニットを介してフィブリノゲンと結合し、フィブリノゲンとの結合は FXIII A サブ ユニットの創傷部位局在を補助することになるため、FXIII B サブユニットとの複合体形成は FXIII A サブユニットの機能上有益である14。トロンビンはフィブリノゲンをフィブリンに転換させ、ポリマー 化されたフィブリンはトロンビンによる FXIII 活性化のプロモーターとして機能する 13。FXIII B サブ ユニットは FXIII A をフィブリノゲン上に局在化させることの他に、FXIII A の非蛋白分解的な活性化 を防止する15。rFXIII の臨床推奨用量（35 IU/kg、血漿中濃度は 5 μg/mL に相当）投与時においては、 血漿中の過剰な FXIII B サブユニットが非蛋白分解的な活性化から rFXIII を保護していることが予測さ れる。しかしながら、rFXIII の高用量（血漿中濃度が 10 μg/mL を超える場合、すなわち>70 IU/kg に相 当）では、血漿中の遊離型 FXIII B サブユニットが不足し、不足分については FXIII B サブユニットに よる保護作用がなくなる。 また、他の in vitro 試験では、rFXIII がトロンビンにより活性化され内因性 FXIII と同様にフィブリ ンの架橋形成させることが示された。文献報告されている幾つかの試験では FXIII による活性化メカニ ズムの特性が解明されており、フィブリンの架橋形成について rFXIII を用いた検討も行われている16, 17, 18, 19 。また、rFXIII は FXIII 欠乏症患者の血漿中及び FXIII を枯渇させた血漿中のいずれにおいても凝 固塊の機械的強度及び抗線溶作用を濃度依存的に高めた。 rFXIII は凝固塊に血小板を動員し、線溶阻害因子である α2-AP 及び TAFI や細胞接着分子であるビト ロネクチンなどの止血栓内取り込みを亢進した。t-PA 誘発線溶亢進 in vivo 動物モデルでは、rFXIII 投 与で凝固塊溶解抵抗性の増強及び出血傾向の減少が認められた。 止血における役割以外に、FXIII は炎症のような損傷誘発性の合併症及び内皮バリア機能の変化を調 整することが示唆されている。腸管虚血再潅流損傷及び外傷性出血性ショックの in vivo ラットモデル ではそれぞれ、rFXIII 投与により多臓器不全の早期マーカーに改善が認められたとの報告がある。両モ デルとも、rFXIII 投与群動物の肺透過性の変化ならびに肺及び腸管における好中球分画の変化は溶媒投 与群動物よりも軽度であった。同様に、rFXIII 投与動物における好中球呼吸バースト活性は低く、回腸 粘膜損傷は軽度であった。以上の通り、rFXIII 投与によりラットでは多臓器不全の早期マーカーに改善 が認められ、おそらく内皮細胞を安定化させることにより肺及び腸管のバリア機能が保たれたことと、 好中球の活性化及び好中球分画の変動を制限することによるものと考えられた20, 21。 47 of 51 以上を要約すると、in vitro 及び in vivo での薬効薬理試験により、rFXIII は各種動物の FXIII B サブユ ニットと速やかに結合し、トロンビンにより活性化され内因性 FXIII と同様にフィブリンの架橋形成を 触媒することなどが確認され、rFXIII の生化学的活性及び生物活性は、フィブリンを架橋結合させ、止 血栓形成過程において他の蛋白を取り込み、止血栓の抗線溶作用を増強させることで創傷治癒を促進 するという損傷時の止血機構の維持における重要な酵素である内因性 FXIII で文献報告されているもの と整合性を有することが示された。rFXIII は凝固塊に血小板を動員し、線溶阻害因子である α2-AP 及び TAFI や細胞接着分子であるビトロネクチンなどの止血栓内取り込みを亢進した。rFXIII は FXIII 欠乏 症患者の血漿中及び FXIII を枯渇させた血漿中のいずれにおいても凝固塊の機械的強度及び抗線溶作用 を濃度依存的に増強した。 結論として、rFXIII の血漿中における薬効薬理特性は内因性 FXIII で文献報告されていること一致す るものであった。 副次的薬理（Module 2.6.2.3） rFXIII 及び rFXIIIa*はリンパ球、顆粒球及び単球と結合しなかった。rFXIIIa*は静止血小板及びトロ ンビンにより活性化された血小板のいずれとも結合するが、rFXIII は血小板に結合しないことが確認さ れた。rFXIIIa*は内皮細胞、腸上皮細胞、線維芽細胞及び大動脈平滑筋細胞と結合するが、rFXIII はこ れらに結合しないことが確認された。以上の結合特性は、培養ブタ大動脈内皮細胞の細胞間結合部位 及びトロンビンにより活性化された血小板への FXIIIa*の沈着が認められたとの文献報告 9, 22と整合性 を示すものであった。rFXIIIa*の血小板及び各種細胞に対する結合は、血小板及び止血栓の傷害組織へ の接着増強により組織の機械的強度獲得及び内皮バリア機能維持に関与するメカニズムの一つである 可能性が考えられ23、rFXIIIa*の薬効薬理作用であると考えられた。rFXIII はひとたび活性化されると、 rFXIIIa の曝露を特異的に測定するなどのために血漿中でアクセスすることは不可能となる。 rFXIII 及び rFXIIIa*は臨床濃度域において内皮細胞に対し毒性作用を示さず、炎症性接着分子のアッ プレギュレーションや全血からのサイトカイン放出刺激も認められなかった。 rFXIIIa*の高濃度（100 μg/mL、臨床推奨用量投与時の推定曝露量の 20 倍に相当）処置により、subconfluent な HUVEC 培養において細胞毒性様の所見が認められたが rFXIII 処置では認められず、高濃 度の rFXIIIa*により細胞増殖が阻害された可能性が示唆された。rFXIIIa*の 100 μg/mL 処理群では培地 に沈澱が認められており、認められた影響は蛋白の凝集に起因する可能性が考えられた。 綿糸を挿入し血小板を活性化させたウサギの動静脈シャントモデルにおいて、rFXIII（0.4 mg/kg、約 67 IU/kg、臨床推奨用量である 35 IU/kg の 2 倍に相当）は、凝固塊の増大、血流、血圧又は平均血小板 数に影響を及ぼさなかった。FXIII の主な機能は凝固塊安定化であり凝固塊形成ではないことから、本 試験結果は予測できるものであった。 48 of 51 安全性薬理（Module 2.6.2.4） 生命維持に必要な器官である中枢神経系及び心血管系に対する影響を、カニクイザルへの単回投与 及び 27 週間までの反復投与により評価した。6 mg/kg（約 1002 IU/kg、臨床推奨用量である 35 IU/kg の 29 倍に相当）を 2 週間連日反復投与又は 3 mg/kg（約 501 IU/kg、臨床推奨用量である 35 IU/kg の 14 倍 に相当）を 2 週間に 1 回の 27 週間投与により、中枢神経系及び心血管系に対する影響は認められなか った。 ECC 後の rFXIII 単回静脈内ボーラス投与に伴うリスクを評価するため麻酔カニクイザルを用いて ECC モデルを開発したが、呼吸、心血管系パラメータ、体温、血液生化学的検査、血液学的検査、血 液凝固検査及び病理組織学的検査に投与の影響は認められなかった。本モデルの成熟雄性カニクイザ ルに rFXIII を 2.1 及び 7.1 mg/kg の用量で静脈内へ緩徐に単回ボーラス投与した結果、2 時間の ECC 施 行後において良好な忍容性を示した。また、6 時間の観察期間中、明らかな有害作用は認められなかっ た。 ECC モデルでは 3 頭の死亡が認められた。うち 2 頭は胸骨切開を伴う ECC モデルの開発中の死亡で あり、もう 1 頭は ECC のみを施した溶媒投与群動物であったことから、本モデルに麻酔や手術などの 処置を伴う場合のリスクが示唆された。 薬力学的薬物相互作用（Module 2.6.2.5） rFXIII 及び rFVIIa をカニクイザルの静脈内へ数分以内にそれぞれ単回投与し併用した結果、rFXIII 及 び rFVIIa をそれぞれ単独で投与した時の無毒性量と同程度の用量で良好な忍容性が示され、相乗的な 影響は認められなかった。本試験における無毒性量は、rFXIII の 7 mg/kg（1169 IU/kg、臨床推奨用量 である 35 IU/kg の 33 倍に相当）及び rFVIIa の 2 mg/kg（臨床推奨用量である 90 μg/kg の 22 倍に相当） と推察された。 麻酔下における血行動態全般及び心電図を評価するためのカニクイザル心血管系安全性薬理モデル では、単回投与毒性試験では良好な忍容性が認められた rFXIII の 3.5 mg/kg（臨床推奨用量である 35 IU/kg の 17 倍に相当）及び rFVIIa の 1 mg/kg（臨床推奨用量である 90 μg/kg の 11 倍に相当）併用によ り 12 頭中 1 頭で死亡が認められた。死亡動物の病理組織学的検査では肺、胸腺及び心臓の血管に早期 止血栓形成及び器質化ならびに赤血球凝集が認められ、rFXIII 及び rFVIIa 併用による影響の可能性は 否定できないと考えられた。しかしながら、病理組織学的ピアレビューの結果、止血栓内に炎症性細 胞がなく、凝固塊内にフィブリンが認められなかったことから、止血栓は死亡時に炎症性反応が惹起 する前に形成されたことが示唆された。本試験の結論として、rFXIII 及び rFVIIa の併用による過剰な 薬理作用、ならびに本モデルすなわち血液凝固亢進状態を引き起こす可能性のある複数のカテーテル を留置した状態の麻酔が組み合わさって死因となった可能性は否定できないと考えられた。無毒性量 は rFXIII の 1.75 mg/kg（約 292 IU/kg）及び rFVIIa の 0.5 mg/kg であると推察された。 49 of 51 総括 rFXIII の薬効薬理は十分に特性解析がなされ明らかとなっている。rFXIII は内因性 FXIII で文献的に 報告されているものと類似した薬力学的特性を血漿中で示した。すなわち rFXIII はフィブリンの架橋 形成及び抗線溶蛋白の凝固塊内取り込みを通じて凝固塊の機械的強度及び抗線溶作用を増強させた。 rFXIII は各種細胞と結合しなかったが、rFXIIIa*は結合性を示した。rFXIIIa*の各種細胞に対する結 合は、血小板及び止血栓の傷害組織への接着増強による組織の機械的強度獲得及び内皮バリア機能維 持に関与するメカニズムの一つである可能性が考えられた。 安全性薬理試験では、臨床濃度域において rFXIII の安全性上の懸念は認められなかった。 複数のカテーテルを留置した状態で麻酔を施したサル心血管モデルでは、rFXIII 及び rFVIIa を静脈 内へ併用投与したときに血栓形成及び死亡が認められ、相乗的な有害作用の可能性も考えられた。当 該モデルは、血液凝固の亢進状態を引き起こす可能性のあるものであった。この結果から、臨床での rFXIII と rFVIIa の併用は推奨しない。 50 of 51 参考文献 1 Greenberg CS, Miraglia CC. The effect of Fibrin Polymers on Thrombin-Catalyzed plasma Factor XIII formation. Blood. 1985; 66(2): 466–469. 2 Muszbek L, Haramura G, Polgár J. Transformation of cellular factor XIII into an active zymogen transglutaminase in thrombin-stimulated platelets. Thromb Haemost. 1995; 73(4): 702-705. 3 . Muszbek L, Ádány R, Szegedi G, Polgar J, Kávai M. Factor XIII of Blood Coagulation in Human Monocytes. Thromb Res. 1985; 37(3): 401-410. 4 Yorifuji H, Anderson K, Lynch GW, Van De Water L, McDonagh J. B Protein of Factor XIII: Differentiation between Free B and Complexed B. Blood. 1988; 72(5): 1645-1650. 5 Johansson PI, Jacobsen N, Viuff D, Olsen EHN, Rojkjaer R, Andersen S, et al. Differential clot stabilising effects of rFVIIa and rFXIII-A2 in whole blood from thrombocytopenic patients and healthy volunteers. Brit J Haemat. 2008; 143: 559-569. 6 Lauer P, Metzner HJ, Zettlmeißl G, Li M, Smith AG, Lathe R, Dickneite G. Targeted Inactivation of the Mouse Locus Encoding Coagulation Factor XIII-A: Hemostatic Abnormalities in Mutant Mice and Characterization of the Coagulation Deficit. Thromb Haemost. 2002; 88: 967–974. 7 Lee SY, Chang SK, Lee IH, Kim YM, Chung SI. Depletion of Plasma Factor XIII Prevents Disseminated Intravascular Coagulation-induced Organ Damage. Thromb Haemost. 2001; 85(3): 464-469. 8 社内試験報告書：Tranholm M. Liver bleeding model in rabbits: t-PA induced bleeding. Effect of rFVIIa and rFVIIa + rFXIII in combination. 9 Noll T, Wozniak G, McCarson K, Hajimohammad A, Metzner HJ, Inserte J, et al. Effect of Factor XIII on Endothelial barrier function. J Exp Med. 1999; 189(9): 1373-1382. 10 D'Argenio G, Grossman A, Cosenza V, Valle ND, Mazzacca G, Bishop PD. Recombinant factor XIII improves established experimental colitis in rats. Digestive diseases and sciences. 2000; 45(5): 987-997. 11 Ponce R, Armstrong K, Andrews K, Hensler J, Waggie K, Heffernan J, Reynolds T, Rogge M. Safety of Recombinant Human Factor XIII in a Cynomolgus Monkey Model of Extracoporeal Blood Circulation. Toxicol Pathol. 2005, 33(6): 702-710. 12 Francis CW, Marder VJ. Rapid formation of large molecular weight alpha-polymers in cross-linked fibrin induced by high factor XIII concentrations. Role of platelet factor XIII. J Clin Invest. 1987; 80: 1459-1465 13 Muszbek L, Yee VC, Hevessy Z. Blood Coagulation Factor XIII: Structure and Function. Thromb Res. 1999; 94: 271-305. 14 Greenberg CS, Achyuthan KE, Fenton JW. Factor XIIIa formation promoted by complexing of -thrombin, fibrin and plasma factor XIII. Blood. 1987; 69(3): 867–871. 15 Polgár J, Hidasi V, Muszbek L. Non-proteolytic activation of cellular protransglutaminase (placenta macrophage Factor XIII). Biochem. J. 1990; 267: 557-560. 16 Bishop PD, Teller DC, Smith RA, Lasser GW, Gilbert T, Seale RL. Expression, purification and characterization of human factor XIII in Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 1990; 29: 1861–1869. 17 Procyk R, Bishop PD, Kudryk B. Fibrin Recombinant Human Factor XIII A-Subunit Association. Thrombosis Res. 1993; 71(2): 127-138. 18 Yee VC, Pedersen LC, Bishop PD, Stenkamp RE, Teller DC. Structural evidence that the activation peptide is not released upon thrombin cleavage of factor XIII. Thromb Res. 1995; 78(5): 389–397. 19 Lewis KB, Teller DC, Fry J, Lasser GW, Bishop PD. Crosslinking kinetics of the Human Transglutaminase, Factor XIII[A2], Acting on Fibrin Gels and gamma-chain Peptides. Biochemistry. 1997; 36(5): 995-1002. 20 Zaets SB, Xu D-Z, Lu Q, Feketova E, Berezina TL, Gruda M. et al. Recombinant Factor XIII Diminishes Multiple Organ Dysfunction in Rats Caused by Gut Ischemia-Reperfusion Injury. Shock. 2009; 31(6): 621-626. 21 Zaets SB, Xu D-Z, Lu Q, Feketova E, Berezina TL, Malinina IV. Et al. Recombinant Factor XIII eliminates experimental trauma-hemorrhagic shock-induced multiple organ dysfunction. Submitted for publication in Shock, April-2010. 22 Dardik R, Loscalzo J, Inbal A. Factor XIII (FXIII) and angiogenesis. J Thromb Haemost. 2006b; 4: 19–25. 51 of 51 23 Bakker ENTP, Pistea A, VanBavel E. Transglutaminases in Vascular Biology: Relevance for Vascular Remodeling and Atherosclerosis. J Vasc Res. 2008; 45: 271–278. 1 of 18 ノボサーティーン静注用 2500 2.6.3 薬理試験の概要表 ノボ ノルディスク ファーマ株式会社 2 of 18 目次 ページ 目次 2.6.3.1 .............................................................................................................................................................2 薬理試験 ..............................................................................................................................................3 2.6.3.1.A 薬理試験：一覧表 .........................................................................................................................3 2.6.3.1.B 薬理試験に用いた rFXIII バッチの概要 .....................................................................................5 2.6.3.2 薬効薬理試験 ......................................................................................................................................7 2.6.3.3 副次的薬理試験 ................................................................................................................................12 2.6.3.4 安全性薬理試験 ................................................................................................................................14 2.6.3.5 薬力学的薬物相互作用試験 ............................................................................................................16 2.6.3.5.A In vitro 薬力学的薬物相互作用試験 ..........................................................................................16 2.6.3.5.B In vivo 薬力学的薬物相互作用試験 ...........................................................................................16 3 of 18 2.6.3.1 薬理試験 2.6.3.1.A Test Article: rFXIII 薬理試験：一覧表 Type of Study Test System Method of Administration Testing Facility Study Number/reference Location in CTD Binding to endogenous FXIII-B subunit Human, cynomolgus monkey, mouse, rat, rabbit and dog serum In vitro Zymogenetics RES-FXIII-0025 4.2.1.1 Plasma protein cross-linking activity of rFXIII Human and cynomolgus monkey plasma In vitro Zymogenetics RES-FXIII-0024 4.2.1.1 Plasma protein cross-linking activity of activated rFXIII Human plasma In vitro Zymogenetics RES-FXIII-0063 4.2.1.1 Effect on clot resistance to fibrinolysis Human plasma In vitro Novo Nordisk - DK LCP051125 4.2.1.1 Thromboelastography Human whole blood In vitro Novo Nordisk - DK EHNO050520 4.2.1.1 Plasma protein cross-linking Cynomolgus monkey Intravenous Zymogenetics RES-FXIII-0058 4.2.1.1 Resistance to fibrinolysis in a tPA-induced rebleeding Model New Zealand white rabbit Intravenous Zymogenetics RES-10352 4.2.1.1 Combined effect of rFXIII and rFVIIa in a rabbit model of tPA enhanced liver bleeding Rabbit Intravenous Novo Nordisk - DK DTOR100501 4.2.1.1 1.1 Primary Pharmacodynamics In vitro In vivo 1.2 Secondary Pharmacodynamics In vitro Binding to whole blood cells Human lymphocytes, granulocytes, In vitro monocytes and platelets Zymogenetics RES-FXIII-0018 4.2.1.2 Binding to endothelial-, intestinal epithelial-, fibroblast- and smooth muscle cells Human endothelial-, intestinal epithelial-, fibroblast- and smooth muscle cells Zymogenetics RES-FXIII-0017 4.2.1.2 In vitro 4 of 18 Type of Study Test System Method of Administration Testing Facility Study Number/reference Location in CTD Cytotoxicity HUVEC cells In vitro Zymogenetics RES-FXIII-0014 4.2.1.2 Adhesion molecule up-regulation Endothelial cells In vitro Zymogenetics RES-FXIII-0015 4.2.1.2 Whole blood In vitro Zymogenetics RES-FXIII-0016 4.2.1.2 Rabbit Intravenous Zymogenetics RES-10351 4.2.1.2 CNS and Cardiovascular system (Part of Toxicology study) Cynomolgus ,monkey Intravenous Sierra Biomedical (SBi) US SBi-1394-175a 4.2.3.2 CNS and Cardiovascular system (Part of Toxicology study) Cynomolgus monkey Intravenous Covance Laboratories - UK NN205255a 4.2.3.2 Cardiovascular and respiratory system after Extracorporal circulation Cynomolgus monkey Intravenous Covance Laboratories - US ZGI 1112-010 4.2.1.3 Cardiovascular and respiratory system after Extracorporal circulation Cynomolgus monkey Intravenous Covance Laboratories - US ZGI 1112-011 4.2.1.3 Cardiovascular and respiratory system after Extracorporal circulation Cynomolgus Monkey Intravenous Covance Laboratories - US ZGI 1112-013 4.2.1.3 Interaction with Heparin and Protamine Human plasma In vitro Zymogenetics RES-10323 4.2.1.4 Single dose toxicity study rFXIII and rFVIIa Cynomolgus monkey Intravenous Covance Laboratories - UK NN205070 4.2.1.4 Single dose toxicity study rFXIII and rFVIIa Cynomolgus monkey Intravenous Covance Laboratories - UK NN205148a 4.2.1.4 a 4.2.1.4 Ex vivo Cytokine release In vivo Clot formation and cardiovascular system in an ateriovenous-shunt model with activated platelets 1.3 Safety Pharmacology In vivo 1.4 Pharmacodynamic Drug Interactions In vitro Cardiovascular system rFXIII and rFVIIa a The study was under GLP. Cynomolgus monkey Intravenous Aptuit Ltd. - UK NN206100 5 of 18 2.6.3.1.B 薬理試験に用いた rFXIII バッチの概要 Batch No. Yeast Strain Study Number Type of Study F249124 ZM146 RES-FXIII-0014 Safety pharmacology: Cytotoxicity on HUVEC cells RES-FXIII-0015 Safety pharmacology: Up-regulation of adhesion molecules RES-FXIII-0016 Safety pharmacology: ex vivo cytokine release in whole blood RES-FXIII-0017 Secondary pharmacodynamic: Binding to endothelial-, intestinal epithelial-, fibroblast- and smooth muscle cells RES-FXIII-0063 Primary pharmacodynamic: in vitro fibrinogen cross-linking of activated rFXIII RES-FXIII-0058 Primary pharmacodynamic: in vivo plasma protein cross-linking in cynomolgus monkey ZM146 RES-FXIII-0014 Safety pharmacology: Cytotoxicity on HUVEC cells ZM146 RES-FXIII-0015 Safety pharmacology: Up-regulation of adhesion molecules RES-FXIII-0016 Safety pharmacology: ex vivo cytokine release in whole blood RES-FXIII-0018 Secondary pharmacodynamic: Binding to whole blood cells RES-FXIII-0017 Secondary pharmacodynamic: Binding to endothelial-, intestinal epithelial-, fibroblast- and smooth muscle cells RES-FXIII-0025 Primary pharmacodynamic: in vitro binding to FXIII-B from multiple species RES-FXIII-0024 Primary pharmacodynamic: in vitro cross-linking activity in human and cynomolgus monkey plasma RES-FXIII-0014 Safety pharmacology: Cytotoxicity on HUVEC cells RES-FXIII-0015 Safety Pharmacology: Up-regulation of adhesion molecules RES-FXIII-0016 Safety pharmacology: ex vivo cytokine release in whole blood RES-FXIII-0017 Secondary pharmacodynamic: Binding to endothelial-, intestinal epithelial-, fibroblast- and smooth muscle cells FC93001X FE9007X a FE92007X FH92009X ZM146 ZM146 A687F BJ2n-5-LA RES-FXIII-0063 Primary pharmacodynamic: in vitro fibrinogen cross-linking of activated rFXIII A674F BJ2n-5-LA RES-FXIII-0063 Primary pharmacodynamic: in vitro fibrinogen cross-linking of activated rFXIII BPR-PURFXIIIExp-0099 BJ2n-5-LA RES-FXIII-0024 Primary pharmacodynamic: in vitro cross-linking activity in human and cynomolgus monkey plasma 6 of 18 Batch No. Yeast Strain Study Number Type of Study A724F BJ2n-5-LA RES-FXIII-0025 Secondary pharmacodynamic: Binding to FXIII-B from multiple species A683F BJ2n-5-LA RES-FXIII-0058 Primary pharmacodynamic: in vivo plasma protein cross-linking in cynomolgus monkey A657F BJ2n-5-LA RES-FXIII-0058 Primary pharmacodynamic: in vivo plasma protein cross-linking in cynomolgus monkey 217-01-001 BJ2n-5-LA RES-FXIII-0063 Primary pharmacodynamic: in vitro fibrinogen cross-linking of activated rFXIII RES-FXIII-0018 Secondary pharmacodynamic: Binding to whole blood cells RES-FXIII-0017 Secondary pharmacodynamic: Binding to endothelial-, intestinal epithelial-, fibroblast- and smooth muscle cells RES-10351 Safety pharmacology: Clot formation and cardiovascular system in an ateriovenous-shunt model with activated platelets RES-10323 Pharmacodynamic drug interaction: Interaction with heparin and protamine SBi-1394-175 Safety pharmacology: CNS and Cardiovascular system ZGI 1112-011 Safety pharmacology: Cardiovascular and respiratory system after extracorporal circulation ZGI 1112-013 Safety pharmacology: Cardiovascular and respiratory system after extracorporal circulation EHNO050520 Primary pharmacodynamic: Thromboelastography on human whole blood LCP051125 Primary pharmacodynamic: Thromboelastography on human whole blood 217-04-001 LH030803A BJ2n-5-LA BJ2n-5-LA LH 030622B BJ2n-5-LA EHNO050520 Primary pharmacodynamic: Effect on clot resistance to fibrinolysis LH021023A BJ2n-5-LA DTOR100501 Primary pharmacodynamic: Effect of rFXIII and rFVIIa in an rabbit model of tPA enhanced liver bleeding RDLS002 BJ2n-5-LA NN205148 Pharmacodynamic drug interaction: Single dose toxicity study rFXIII and rFVIIa NN205255 Safety pharmacology: CNS and cardiovascular system ZBC401N BJ2n-5-LA NN205070 Pharmacodynamic drug interaction: Single dose toxicity study rFXIII and rFVIIa in cynomolgus monkey SLDF010 BJ2n-5-LA NN206100 Pharmacodynamic drug interaction: Cardiovascular system rFXIII and rFVIIa a Batch number noted in the study report is FE9007X, this is considered likely to be a type error and the batch number should have been FE92007X. 7 of 18 2.6.3.2 薬効薬理試験 Type of Study Model Concentration/Dose Noteworthy findings Study Number rFXIII binds specifically to endogenous FXIII-B subunit from human, mouse, rat, rabbit, dog and cynomolgus monkey. RES-FXIII-0025 In vitro Pharmacology The Binding of rFXIII to endogenous FXIII-B of Mouse, Rat, Rabbit, Dog, Monkey and Human Binding endogenous FXIII-B subunit from human, mouse, rat, rabbit, dog and cynomolgua monkey serum to immobilised rFXIII [A2] affinity resin. Specifically bound proteins were analysed by SDS-PAGE gels and conclusively identified by N-terminal sequencing. Activity of rFXIII in Cynomolgus Monkey and Human Plasma rFXIII was added to FXIII deficient or depleted human and cynomolgus plasma. The resulting fibrin clot was washed and dissolved and the different fibrin forms were separated on SDSPAGE gels. 0, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 μg/mL rFXIII is able to crosslink both human and RES-FXIII-0024 cynomolgus fibrin. This cross-linking readily occurs in a plasma environment. 10 μg/mL rFXIII (one plasma equivalent) in FXIIIdeficient- or depleted- plasma gives a crosslinking activity approximately equivalent to that observed by normal endogenous levels of plasma FXIII in cynomolgus monkey or human plasma. In vitro effects of rFXIII and rFXIIIa on Plasma Fibrinogen/fibrin clots were solubilised with urea/DTT and analyzed by SDSPAGE. The crosslinking ability of plasma FXIII (pFXIII), thrombin activated rFXIII (rFXIIIa*), non-proteolytically activated rFXIII (rFXIIIaº) and zymogen rFXIII was examined. Dilution series of normal human plasma prepared in FXIII-A-deficient plasma (100, 50, 20, 5, 1, 0.5, 0.15, 0% normal FXIII levels). rFXIIIa* or rFXIIIa (0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 μg/mL) rFXIII (0, 20, 100, 200, 400, 800 μg/mL) Both rFXIIIa* and rFXIIIaº crosslinked fibrinogen RES-FXIII-0063 in the absence of thrombin in a dose dependent manner. The crosslinking profiles and concentration-responses were similar between rFXIIIa* and rFXIIIaº. Human and cynomolgus plasma have equivalent crosslinking profiles with rFXIIIa* and rFXIIIaº. High concentrations ( 400 µg/mL) of zymogen rFXIII produced crosslinked fibrinogen species after 4 hours. In vitro effect of rFXIII on clot resistance to fibrinolysis. Clot-lysis analysis in normal and FXIII-A deficient plasma. The effects of FXIII on TAFIa activity was examined in clot-lysis assays in The concentrations of rFXIII used are based on the concentration of Asubunit (Mr 83000), thus rFXIII (0-480 nmol/L) prolonged the clot lysis time (CLT) in FXIII deficient plasma in a concentration dependent manner. The importance of FXIII for clot resistance to LCP051125 8 of 18 Type of Study In vitro thromboelastography evaluation of rFXIII and rFVIIa in whole blood from normal donors and patients undergoing stem cell transplantation and cardiac surgery Model Concentration/Dose Noteworthy findings normal and FXIII deficient plasma. normal plasma concentration of the Asubunit is 120 nmol/L (versus 60 nmol/L for A2). rFXIII (0, 30, 60, 120, 240, 480 nmol/L) fibrinolysis was further strengthened by the observation that rFXIII strongly enhances the antifibrinolytic activity of TAFI. Thromboelastography (TEG) was used to evaluate the in vitro effects of rFXIII and rFVIIa on clot properties in normal whole blood, a model system that mimic thrombocytopenia based on normal blood as well as an evaluation of rFVIIa and rFXIII spiked in whole blood from cardiac surgery (CS) patients and stem cell-transplantation (SCT) patients. Whole blood was spiked with small volumes of test protein (rFXIII and/or rFVIIa), coagulation was initiated with TF and tPA was added to induce fibrinolysis Normal blood: The effect of rFXIII and rFVIIa was evaluated in two experimental titration series. 8 normal donors were included in each series. Mimic of thrombocytopenia: Normal whole blood was diluted with autologous platelet poor plasma to a platelet density of 10 x 109/L. The effect of rFXIII and rFVIIa was evaluated in two experimental titration series. Modified blood from 8 normal donors was included in each experimental series. In Vitro effect of rFXIII and rFVIIa on The concentrations of rFXIII used in this study are concentration of Asubunit (Mr 83000). Thus normal plasma concentration of the Asubunit is 120 nmol/L (versus 60 nmol/L for A2). Study Number EHNO050520 In normal whole blood rFXIII (60-789 nmol/L) significantly enhanced the mechanical strength of the clot and the resistance against fibrinolysis over the entire concentration range both in the presence and absence of rFVIIa. The dose-response of rFXIII on mechanical strength and resistance against fibrinolysis appeared steeper in the absence of rFVIIa. In a mimic of thrombocytopenia with platelet counts of 10 x 109/L rFXIII significantly enhanced the mechanical strength and the resistance against Normal whole blood fibrinolysis in a concentration-dependent manner. and thrombocytopenia rFXIII appears to have the largest effect on the mimic: rFXIII titration: resistance against fibrinolysis in normal blood, and rFXIII (0, 60, 120, 240, a more modest effect at low platelet count. At low 480, and 789 nmol/L) platelet count the clots formed are relatively small and consequently only support suboptimal 25 nM rFVIIa (25 nmol/L corresponding to thrombin generation. The data thus indicate, that optimal efficacy of rFXIII is dependent on a the maximal plasma certain level of thrombin generation. concentration obtained In vitro experiments with whole blood from SCT after dosing 100 µg/kg patients showed that rFXIII either alone or in the rFVIIa to humans) presence of rFVIIa significantly enhanced the rFVIIa titration: maximal strength of the clot in a concentrationrFVIIa (0, 5, 25, 100, 200, and 1667 nmol/L) dependent manner. rFXIII significantly enhanced resistance against fibrinolysis. 120 nM rFXIII (120 nmol/L corresponding to In vitro experiments with blood from CS patients one plasma equivalent) showed that rFXIII alone or in the presence of rFVIIa enhance the maximal mechanical clot 9 of 18 Type of Study Model Concentration/Dose Noteworthy findings blood from SCT patients: Thrombocytopenic blood from 7 SCT patients with platelet counts below 20 x 109/L was spiked with rFXIII and rFVIIa. In vitro effect of rFXIII and rFVIIa on blood from patients undergoing CS with cardiopulmonary bypass: Blood from 6 non-bleeding CS patients was spiked with rFXIII and rFVIIa. Patients treated with antifibrinolytica such as Cyclocapron and Aprotinin were excluded, as these drugs mask the fibrinolytic phase in the thromboelastograms. SCT Patients: 0, 60, 120 and 240 nmol/L rFXIII combined with 0, 25 and 100 nmol/L rFVIIa. strength and resistance against fibrinolysis in a concentration-dependent manner. No concentration interaction was observed between rFVIIa and rFXIII. In summary, in normal blood both at normal and low platelet densities as well as in blood from CS or SCT patients, rFXIII significantly enhanced the mechanical strength of the clot and the resistance against fibrinolysis in a concentration-dependent manner. No interaction between the effects of rFXIII and rFVIIa was found when pharmacological relevant concentrations of rFXIII and rFVIIa was analyzed in patient samples, i.e. the effect of each haemostatic protein was independent on the presence of the other. CS Patients: 0, 60, 120 and 240 nmol/L rFXIII combined with 0, 12.5 and 100 nmol/L rFVIIa. Study Number In vivo Pharmacology In vivo Plasma protein cross-linking by rFXIII in Cynomolgus monkey Plasma samples from cynomolgus rFXIII 1-30 mg/kg monkey dosed with supra-physiological amounts of rFXIII were analysed by reduced SDS-PAGE, western blot analysis, and N-terminal sequencing. Plasma samples from monkeys dosed with RES-FXIII-0058 supraphysiologic levels of rFXIII showed the presence of multiple high molecular weight protein complexes which appeared to contain various oligomers of fibrinogen α- and γ-chain either, alone or in combination with α-2-antiplasmin, α-2macroglobulin and fibronectin all of which are important proteins for the formation of strong fibrin clots resistant to fibrinolysis. The method used was qualitative rather than quantitative, but generally monkeys dosed with higher amounts of rFXIII had more easily visualized bands. These circulating complexes may form even larger complexes in the local microvasculature. The formation of these cross-linked protein complexes can be expected to have both direct and indirect effects on blood flow and plasma viscosity. 10 of 18 Type of Study Model Concentration/Dose Noteworthy findings Study Number Evaluation of the influence of rFXIII on Fibrinolytic Resistance in a tPA-induced Re-Bleed Model in the Rabbit Rabbit model of tPA-induced rebleeding. 12 female New Zealand white rabbits were treated with rFXIII (n=6) or saline (n=6) 90 minutes prior to injury. 3 incisions were made in the ear to induce bleeding and the clot was allowed to age for 15 minutes (18 injuries/group). Hyper fibrinolysis was induced with tPA. Time to re-bleeding from each incision was measured (15-minute observation period). Intravenous rFXIII (0.4 mg/kg) Rabbits pre-treated with rFXIII showed a nonsignificantly increase in resistance to clot lysis by tPA indicating increased clot strength in these animals. RES-10352 Histological analysis of liver biopsies from a study of the combined effect of rFVIIa and rFXIII in a rabbit model of t-PA enhanced liver bleeding. 36 female New Zealand white rabbits were randomised into 6 groups: one normal control group and five groups dosed with 2 mg/kg/hour t-PA followed by either: vehicle (t-PA control), or rFVIIa rFXIII. (n=6 per group) Liver biopsies were collected from the site of injury. A modified Carstairs staining was used to hisologically identify the haemostatic clots. Clot appearance was evaluated using a semi-quantitative scoring system. Recruitment and activation of platelets were identified by immunohistochemistry using antibodies against CD9 and the active conformation of the fibrinogen receptor rFVIIa/rFXIII (mg/kg): 0 / 0 (normal control) 0 / 0 (t-PA control) 5/0 5 / 0.1 5/1 5/3 Histological evaluation of liver biopsies from a study of the combined effect of rFVIIa and rFXIII in a rabbit model of t-PA enhanced liver bleeding tPA intravenous bolus 1 mg/kg, followed by continuous infusion of 1 mg/kg/h Immunohistochemical analysis of clots formed DTOR100501 under hyperfibrinolytic pressure revealed that animals co-treated with both rFVIIa and rFXIII showed several improvements of their haemostatic clots compared to t-PA control animals or animals treated with rFVIIa mono-therapy. The benefits of combined rFVIIa/rFXIII treatment include: Increased appearance of clots apically at the site of injury and in the underlying sinusoids. Increased recruitment and activation of platelets. Increased fibrinogen deposition. Increased incorporation of 2-antiplasmin. Increased activation of TAFI. Increased incorporation of vitronectin. The data indicate an enhanced mechanical and biochemical stability of the clots formed at sites of injury in the animals which received rFVIIa and rFXIII co-treatment, which suggests that rFVIIa/rFXIIIa combination therapy is advantageous compared to rFVIIa mono-therapy in a surgical bleeding with a significant fibrinolytic 11 of 18 Type of Study Model GPIIb/IIIa, respectively. 2-antiplasmin, vitronectin, fibrinogen, TAFI and the activated form of TAFI (TAFIa) were detected using specific monoclonal antibodies. Concentration/Dose Noteworthy findings element. Study Number 12 of 18 2.6.3.3 副次的薬理試験 Noteworthy Findings Study Number Interaction of rFXIII and rFXIIIa* with human whole blood cells, detected by flow cytometry. Blood cells were isolated by differential centrifugation and rFXIII or rFXIIIa* were incubated with the relevant cell type for 1 hour at 4C. rFXIII does not bind to any of the examined human blood cell types: lymphocytes, granulocytes, monocytes or platelets. rFXIIIa* does not bind to lymphocytes, granulocytes or monocytes. rFXIIIa* binds to both un-activated platelets and thrombin activated platelets at concentrations as low as 5 μg/mL. RES-FXIII-0018 In vitro, live cell binding of rFXIII to endothelial-, fibroblast-, smooth muscle- and intestinal ephithelial derived cell lines with immunofluorescence detection Detection of rFXIII and rFXIIIa* rFXIII or rFXIIIa* binding to various human cell lines (0, 0.1, 1, 10 and by immunofluoresence microscopy 100 μg/mL). using a rabbit anti-human rFXIII primary antibody, and an antirabbit FITC conjugated secondary antibody. Cell lines: HUVEC, microvascular endothelial cells, dermal fibroblast cells, intestinal epithelial enterocyte cells and human aortic smooth muscle cells. Several different batches of rFXIII were analyzed. Only rFXIIIa* bound to the cultured cells whereas rFXIII showed no cell binding even at the highest concentrations analyzed. Results were similar for all rFXIII batches tested. The results suggest that in vivo, rFXIII will not bind to endothelial-, smooth muscle-, or fibroblast cells of the vessel wall, nor will it bind to the enterocytes of the intestinal lining whereas rFXIIIa is likely to bind to all of these cell types. RES-FXIII-0017 rFXIII toxicity on cultured HUVEC cells 48 hours incubation of HUVEC with rFXIII or rFXIIIa* to assess cytotoxicity by the MTT toxicity No endothelial cell toxicity was detected with either rFXIII or RES-FXIII-0014 rFXIIIa* at concentrations up to 100 μg/mL. At the highest concentration tested (100 μg/mL) the viability of Title Model rFXIII binding to human blood cells evaluated by Flow Cytometry Concentration rFXIII or rFXIIIa*: 10-400 μg/mL Control cells: Transformed bone marrow endothelial (TRBME) cells 1-20 μg/mL Blood mononuclear cells: leukocytes, granulocytes, monocytes 5-40 μg/mL Platelets (resting and thrombin activated): rFXIII: 0.1-100 µg/mL rFXIIIa*: 0.1-100 13 of 18 Title Model Concentration µg/mL test. The cells were tested at Doxirubicin:0.1 confluent (dense cells, nonand 10 µg/mL proliferating) and sub-confluent (sparse cells, proliferating) densities to evaluate cytotoxic and cytostatic effects. Doxorubicin was used as positive control. Three batches of rFXIII were tested. Noteworthy Findings Study Number sub-confluent proliferating HUVEC cultures was reduced by 13-33%. This effect was not seen with confluent nonproliferating cells, suggesting it is a cytostatic effect and not a measure of toxicity. In conclusion, at clinical relevant concentrations, 10 μg/mL or less, neither rFXIII nor rFXIIIa* are toxic to endothelial cells. At elevated concentrations (≥ 100 μg/rnL), rFXIIIa* may have an inhibitory effect on endothelial cell proliferation. Adhesion molecule upregulation with rFXIII and activated rFXIII 24 hours incubation of microvascular endothelial cells with rFXIII or rFXIIIa* and effect on pro-inflammatory adhesion molecules: VCAM-1, ICAM-1, and E-selectin were tested. TNFα was used as a positive control. Three batches of rFXIII were tested. rFXIII: 0.1, 1, 10 or 100 µg/mL rFXIIIa*: 0.1, 1, 10 or 100 µg/mL TNFα: 1 ng/mL At clinically relevant concentrations (10 µg/mL) neither rFXIII RES-FXIII-0015 nor rFXIIIa* were pro-inflammatory. At the highest concentration of rFXIIIa* tested (100 μg/mL), 38% increase in expression of all three adhesion molecules was observed. At 100 μg/mL rFXIIIa* some precipitation was seen in the culture media and thus the observed effect on adhesion molecules may be due to formation of protein aggregates. No inhibition of TNFα-induced expression of adhesion molecules with rFXIIIa* was detected. Inflammatory cytokine release in the ex vivo whole blood assay with rFXIII: thrombin activated and nonactivated rFXIII Whole blood from healthy donors was treated with rFXIII or rFXIIIa*, and then assayed for ex vivo production of pro-inflammatory cytokines (TNFα, IL-1β, and IL-6) in the presence or absence of LPS. Three batches of rFXIII were tested. rFXIII: 0.1-100 µg/mL rFXIIIa*: 0.1-100 µg/mL LPS: 0.1-100 ng/mL Whole blood treated with either rFXIII or rFXIIIa* showed no RES-FXIII-0016 significant increase in pro-inflammatory cytokine production. rFXIII or rFXIIIa* did not augment or inhibit LPS-induced production of cytokines. In conclusion, rFXIII or rFXIIIa* do not elicit a proinflammatory cytokine release in whole blood at concentrations up to 10 fold greater the clinical relevant concentrations. Clot formation and cardiovascular system in an ateriovenous shunt model with activated platelets Effect on clot growth, blood flow, blood pressure or mean platelet levels in an ateriovenous shunt model with cotton tread activated platelets in rabbit was examined. rFXIII: 0, 0.4 mg/kg Mean blood pressure and mean blood flow rates of both groups RES-10351 were not significantly different between the two groups. Mean platelet levels were similar between groups. Treatment with rFXIII did not cause change in clot formation, there was no difference in the weight of the clots formed on the threads. In conclusion, this study did not find an effect of rFXIII on clot growth. 14 of 18 2.6.3.4 安全性薬理試験 Dosesa (mg/kg) Gender and No. Noteworthy Findings per Group (No recovery) Intravenous bolus injection [1.6] 0 0.3 3 6 (14 daily repeat doses) M 3(2), F 3(2) M 3, F 3 M 3(2), F 3(2) M 3, F 3 No effect on CNS (general appearance and behaviour) or Yes cardiovascular system (blood pressure, heart rate and ECG) or on body temperature of single and repeat daily dosing of 0.3–6 mg/kg. (for toxicology details see table 2.6.7.7 C, SBi-1394-175) NOAEL 6 mg/kg/day SBi-1394-175 Cynomolgus monkey (Macaca Fascicularis) Intravenous bolus injection [0.83] 0 1 3 10 (repeat doses with 2 weeks interval for 13 or 27 weeks) M 3(2), F 3(2) M 3, F 3 M 3, F 3 M 9(6), F 9(6) No effect of rFXIII on CNS (general appearance and behaviour), the cardiovascular system (ECG, heart rate and blood pressure) after single and repeat fortnightly dosing of 1-10 mg/kg for 13-27 weeks. One monkey died after a single dose of 10 mg/kg rFXIII (1670 IU/kg), the cause of death was considered related to exaggerated pharmacology of rFXIII/rFXIIIa (for toxicology details see table 2.6.7.7 E, NN205255). There were no effect on CNS or the cardiovascular system of the remaining 29 monkeys admin istered 10 mg/kg fortnightly for 13 or 27 weeks. NOAEL: 3 mg/kg/2 weeks rFXIII NN205255 Cynomolgus monkey (Macaca Fascicularis) Intravenous [not known] 0 (sham) A: M 2 B: M 3 Animals underwent anaesthesia, catheterisation, No heparinisation and extracorporeal circulation with (B) or without (A) sternotomy. Both animals of group A survived through the recovery period. In group B one animal died from acute blood loss at the end of the ECC period, one animal died after 9 hours recovery and one animal survived through the 10 hours recovery with no apparent complication. The results suggest that the use of ECC alone with particular attention to the coagulation status of the animals may be a preferred model compared to the Type of study or organ Systems Evaluated Species/Strain Method of Administration [% rFIIIao in test article] A 14-Day Toxicity study with daily repeat dosing, including 30Day recovery Cynomolgus monkey (Macaca Fascicularis) 13 and 27 weeks Repeat dose toxicity study with fortnightly dosing Pilot cardiopulmona ry bypass model to evaluate the model Study Number GLP Compliance (Y/N) Yes ZGI 1112-010 15 of 18 Type of study or organ Systems Evaluated Species/Strain Method of Administration [% rFIIIao in test article] Dosesa (mg/kg) Gender and No. Noteworthy Findings per Group (No recovery) Study Number GLP Compliance (Y/N) model involving ECC and sternotomy. Cardiopulmon Cynomolgus monkey ary bypass (Macaca model Fascicularis) Intravenous bolus injection [not known] 0 2.1b 7.1c M4 M3 M3 Cardiopulmon Cynomolgus monkey ary bypass (Macaca model Fascicularis) Intravenous bolus injection [not known] 0 7.1c M2 M4 a There were no treatment related effect observed or No measured parameters, including respiration, ECG, heart rate, blood pressure, body temperature, clinical chemistry, haematology (including platelet counts) or specialty evaluation of indicators of thrombosis (thrombin-anti-thrombin complex TAT and D-dimer) or No platelet activation (platelet factor 4 and betathromboglobulin). No effect of rFXIII administration on coagulation endpoints (aPTT, PT, fibrinogen) during the 6-hour observation period. Specific examination of brain, heart, lung, liver and kidneys provided no evidence of rFXIII related gross or microscopic alterations, including haemorrhage or thrombosis. In conclusion, a single dose intravenous slow bolus injection of 2.1 or 7.1 mg/kg rFXIII to adult male cynomolgus monkey after 2 hours of ECC was well tolerated, with no apparent adverse effects through 6 hours of observation. ZGI 1112-011 ZGI 1112-013 Ponce R. et al 2005 Single dose unless specified otherwise. The animals were administered 300b or 1000c U/kg, respectively the dose has been converted to mg/kg to be consistent with the other nonclinical studies, 1 mg corresponds to 140 U or 167 IU. rFXIIIa°: non-proteolytic activated rFXIII present in test article at time of dosing. b, c 16 of 18 2.6.3.5 薬力学的薬物相互作用試験 2.6.3.5.A In vitro 薬力学的薬物相互作用試験 Title In vitro verification on non-crossreactivity of rFXIII with Heparin and Protamine 2.6.3.5.B Model aPTT (activated partial thromboplastin time) was used as a measurement of coagulation time in plasma, to determine the effects of rFXIII on heparin (0.75 units/mL) and protamine (2.7 µg/mL). The effects of heparin (0.75, 3, 10 units/mL) and protamine (3.75, 16.5, 56.3 µg/mL) on the crosslinking ability of rFXIII were examined on fibrin clots solubilised with urea/DTT and analyzed by SDS-PAGE. Clots were formed in FXIII deficient plasma. Concentration 0, 1, 3, 10, 30, 100 µg/mL 0.05 µg/mL Noteworthy findings Heparin was shown to delay the aPTT, while protamine was shown to neutralize the effect of heparin as expected. rFXIII (up to 100 µg/mL) had no effect on aPTT in heparin-treated, protamine-neutralized plasma. Neither heparin nor protamine had an effect on the in vitro crosslinking activity of rFXIII. These results indicate that there is no crossreactivity between rFXIII and heparin/protamine. Study Number RES-10323 In vivo 薬力学的薬物相互作用試験 Dosesa (mg/kg) Type of study Species/ Strain Method description and/or method of Administration Single dose toxicity study Cynomolgus monkey (Macaca Fascicularis) Intravenous injection rFVIIa 0.1 0.33 1.67 5.00 rFXIII 0.34 1.12 5.60 16.80 Gender and No. per Group M 1, F 1 M 1, F 1 M 1, F 1 M 1, F 1 Noteworthy Findings GLP Compliance (Y/N) Both the female and the male administered 5.00 No mg/kg rFVIIa and 16.80 mg/kg rFXIII animals were killed in a moribund condition 4 hours after dosing. Microscopically there was diffuse tubular necrosis and glomerular thrombi/congestion in the kidney; myocardial necrosis in the heart, thrombi and oedema in the lungs, thrombi and haemorrhage in the brain and cranial cavity of the male and haemorrhage and cellulitis at the injection site. These findings were consistent with a cause of demise of disseminated intravascular coagulation (DIC) due to the effects of rFVIIa and rFXIII. NOAEL:1.67 mg/kg rFVIIa and 5.6 mg/kg rFXIII. Study Number NN205070 17 of 18 Dosesa (mg/kg) Type of study Species/ Strain Method description and/or method of Administration Single dose toxicity study Cynomolgus monkey (Macaca Fascicularis) Intravenous injection rFVIIa 1 2 1 2 1 0.75 4 4 rFXIII 3.5 3.5 7 7 14 10.5 3.5 10.5 - Gender and No. per Group M 3, F 3 M 3, F 3 M 3, F 3 M 3, F 3 M 1, F 1 M 3, F 3 M 3, F 3 M 2, F 2 M 2, F 2 Noteworthy Findings GLP Compliance (Y/N) Dosing of rFVIIa and rFXIII within minutes of Yes each other did not appear to influence plasma exposure or pharmacokinetics of either compound. There was an approximately dose-proportional increase in exposure to rFVIIa and to total A2, respectively. No gender differences were observed. Microscopic findings: In the lungs, thrombi were present in one male treated with 1 mg/kg rFVIIa / 14 mg/kg rFXIII and one female treated with 4 mg/kg rFVIIa / 3.5 mg/kg rFXIII. Tubular necrosis in the kidney and myocardial necrosis in the heart were present in a single male animal treated with 1 mg/kg rFVIIa / 14 mg/kg rFXIII. At the injection site, thrombi were present in animals treated with 2 mg/kg rFVIIa / 3.5 mg/kg rFXIII, 2 mg/kg rFVIIa / 7 mg/kg rXIII and 4 mg/kg rFVIIa / 3.5 mg/kg rFXIII. In the heart cardiomyopathy was present in animals dosed with 4 mg/kg rFVIIa alone. In the lung, arteritis and thrombi were present in one lobe of an animal treated with 4 mg/kg rFVIIa alone. This animal also had minimal arteritis in the choroid plexus in the brain. Early thrombi were present in the lung of one female treated with 10.5 mg/kg rFXIII alone. Microscopic evidence of pathological changes were found in animals dosed with the highest levels of either of the two compounds but without any clear evidence of an additive or synergistic effect of the two test articles in combination. NOAEL: 2 mg/kg rFVIIa and 7 mg/kg rFXIII (Based on a lack of systemic histopathological findings). Study Number NN205148 18 of 18 Dosesa (mg/kg) Type of study Species/ Strain Method description and/or method of Administration Cardiova scular Safety Pharmacology assessing general haemadynamics under anaesthesia Cynomolgus monkey (Macaca Fascicularis) Intravenous injection rFVIIa 0 0.5 1 2 a Single dose unless specified otherwise. rFXIII 0 1.75 3.5 7 Gender and No. per Group M4 M4 M4 M4 Noteworthy Findings GLP Compliance (Y/N) After the administration of the mid dose Yes combination (1 mg/kg rFVIIa and 3.5 mg/kg rFXIII), one animal died prior to the completion of the experiment (2 minutes prior to the end of the experimental procedure). Arterial blood pressure and ventricular pressure were fluctuating and decreasing in this animal until death. The results of the pathology of the dead animal indicated early thrombus formation with organisation and red cell margination in the vessels in the lungs, thymus and heart which could not exclude a possible effect of the combination treatment. However, a peer review pathologist found lack of inflammatory cells in thrombi and no evidence of fibrin in the clot, suggesting that the thrombi all occurred at the point of death before any inflammatory response could be initiated. Fluctuating blood pressure and ventricular pressure were also noted in another animal in the mid dose group (1 mg/kg rFVIIa and 3.5 mg/kg rFXIII). In the high dose group (2 mg/kg rFVIIa and 7 mg/kg rFXIII), two animals had fluctuating blood pressure and left ventricular pressure after dosing. NOAEL: 0.5 mg/kg rFVIIa and 1.75 mg/kg rFXIII Study Number NN206100