熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title
マウス胚性幹細胞の神経分化段階における核内制御機構
Author(s)
青戸, 隆博
Citation
Issue date
2007-03-27
Type
Thesis or Dissertation
URL
http://hdl.handle.net/2298/8221
Right
熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title
マウス胚性幹細胞の神経分化段階における核内制御機構
Author(s)
青戸, 隆博
Citation
Issue date
2007-03-27
Type
Thesis or Dissertation
URL
http://hdl.handle.net/2298/8221
Right
学位論文
Doctor'SIhesis
マウス胚性幹細胞の神経分化段階における核内制御機構
(NuclearreorganizationmneuraldiffermtiationofmouseembryonicstemceUs）
青戸隆博
TakahiroAoto
熊本大学大学院医学教育部博士課程生体医科学専攻器官制御学
指導教授
中尾光善教授
熊本大学大学院医学教育部博士課程生体医科学専攻器官制御学
2007年３月
１
学位論文
Doctor'SThesis
●●
論文題名
マウス胚性幹細胞の神経分化段階における核内制御機構
(Nuclearreorganizationinneuraldifferentiationofmouse
embryonicstemceUs）
青戸隆博
●●
著者名
T白kahiroAoto
指導教官名
審査委員名
熊本大学大学院医学教育部博士課程生体医科学専攻器官制御学
中尾光善教授
細胞識別学
担当教授
西中村隆一
脳神経外科学
担当教授
倉津純一
神経発生学
担当教授
大久保博晶
神経分化学
担当教授
田中英明
2007年３月
２
目次
Ｌ要旨
2．参考論文
3．謝辞
4．略語一覧
5．研究の背景と目的
5-1．細胞分化における細胞核の変化
5-2.核構造、クロマチン制御とＤＮＡメチル化によるエピジェエネテイクス
5-3.0ct3/4遺伝子座の特徴
5-4.本研究の目的
6．実験方法
６－１細胞培養および分化系
6-2.細胞の分画法、ウエスタンプロット法および使用した抗体
6-3．半定量的RILPCRおよび使用したプライマー
6-4．クロマチン免疫沈降法、リアルタイムＰＣＲおよび使用したプライマー
6-5.バイサルファイト反応によるＤＮＡメチル化解析および使用したプライマー
6-6．間接免疫染色蛍光
６．７.Immuno･FISH(DNA/RNA）
６－ａイメージ解析
7．実験結果
7-1.ＥＳＣを用いた高効率な神経分化法の確立と評価
７と2.細胞分化におけるクロモセンターの配置転換および細胞核のサイズの変化
７と3.細胞分化におけるクロモセンターの配置転換
7-4.分化時におけるクロモセンター領域のヒストンコード
7-5.HP1の発現量および局在の変化
7-6.ユークロマチン領域のヒストンコード
7-7.転写ファクトリーの分化動態
7-8.マウス１７番染色体上のMHCOcB狸遺伝子領域の特性と進化における保存
７９.RILPCRとGeneSorterpro厚ａｍによる遺伝子発現解析
7-10．クロマチン免疫沈降法によるＯＣＢ/４とＴ℃F19遺伝子プロモーター領域に雨
7-10．クロマチン免疫沈降法によるＯＣＢ/４とＴ℃F19遺伝子プロモーター領域に結合する
t7vms因子の解析
7-11．Immuno-FISH法によるMHC-OcB/４遺伝子領域とへテロクロマチン領域との相互
作用
7L121mmuno-FISH法によるMHC-OcB/4遺伝子領域とＰＭＬボディとの相互作用
7-13.ＥＳＣでのＰＭＬボディの内部コンポーネントおよび転写阻害剤による変化
7と14.Ｃｈｎウオーキング法によるMHC-Oc遇陛遺伝子領域のヒストンアセチル化とリン
酸化の動態
7,5.Chrウオーキング法によるMHC-Oct3鰹遺伝子領域のヒストンH3K4のメチル化動
態
7と16.Ｃｈｎウオーキング法によるMHCOcl3樫遺伝子領域のヒストンＨ３Ｋ９とH3K27の
メチル化動態
界17.バイサルフアイト法によるMHCOc凪/4遺伝子領域のＤＮＡメチノレ化の動態
結語
Ｃ
Ｏ●（卯叩）
（）（）、》シ一句Ⅱ（
考察
参考文献
●
４
1．要旨
【目的】細胞分化は、内在性のプログラムを通して、幹細胞および前駆細胞が特定の系譜に変化
することである。このエピジェネテイックな機構には、ＤＮＡメチル化やクロマチンの修飾およ
び核内櫛造体などが関わることが示唆されている。初期胚に由来する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は
未分化性の維持、自己複製能および全ての胚組織を形成できる全分化能を有している。また神経
幹細胞を含む組織幹細胞は自己複製能と限られた種類の異なる細胞に分化できる多分化能をも
ち、最終分化した細胞群を産出する。細胞の分化過程におけるエピジェネテイックな制御と遺伝
子発現の関連性を明らかにするために、マウスＥＳ細胞の神経分化において、（i）クロモセンタ
ーやＰＭＬ､ボディなどの機能的な核内サプドメインの動態､(ii）選択的に不活性化されるOct3/４
遺伝子を含む主要組織適合抗原遺伝子群（MHC-Oct3/4）領域のクロマチンの修飾変動について
解析し、ＤＮＡメチル化、クロマチンそして核構造の３つの階層的なエピジェネテイック制御と
発生・分化プロセスにおける遺伝子発現調節との関係を検討した。
【方法】マウスPA6フイーダー細胞との共培養を用いて、マウスＥＳ細胞を神経前駆細胞、ニュ
ーロンに均一に分化する系を確立した。ＥＢ３株[Oct3/4+/ires-bsd-pA]はＥＳ細胞マーカーである
Oct3/4遺伝子プロモーター下でプラストシジンＳ(BlaS)耐性を狸得するために､ＵＦおよびＢｌａＳ
添加培地でＥＳ細胞を純化した。４６Ｃ株[Soxl+/gfp-irEs-pac-pA]は神経前駆細胞マーカーである
Soxl遺伝子プロモーター下でビューロマイシン（Puro）耐性を狸得するために、ｂＦＧＦおよび
Puro添加培地で神経前駆細胞を純化した。神経前駆細胞をアスコルピン酸およびＡｒａＣ添加培
地でニューロンに最終分化した。この３つの分化段階を用いて、１細胞レベルの免疫染色法を用
いた核内構造、生化学的手法およびクロマチン免疫沈降法を用いたMHC-Oct3/４週伝子領域の
クロマチン修飾等を解析した。
【結果】核内のへテロクロマチンが集額するクロモセンターは、ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分
化で多数小型に分散し、ニューロンでは核中央部に再集合した大きなドット状構造を呈した。ま
た、へテロクロマチンを構成するヒストンの修飾状態やへテロクロマチンタンパク質ＨＰ１の発
現が分化過程で大きく変化した。ＦＩＳＨ法および核内構造体に対する免疫染色法を組み合わせて
Oct3/4遺伝子座と核内構造との位置関係を鯛ぺると、ＥＳ細胞でOct3/4遺伝子座はＰＭＬボディ
に特異的に近接しているが､神経前駆細胞で離れて位置することが判明し､最終分化したニュー
ロンではＰＭＬボディそのものがほぼ消失した｡MHC-Oct3/4遺伝子領域のクロマチン免疫沈降
法を用いた解析から、可塑性を維持した神経前駆細胞においては、Oct3/４遺伝子は転写不活性
であるが、ＤＮＡメチル化等の不可逆的な修飾は受けずに、ヒストンの脱アセチル化とＨ３の４
番目のリジンの脱メチル化を受けていた。他方、ニューロンでは転写不活性なOCB/４遺伝子は
ＤＮＡのメチル化やヒストンＨ３の27番目のリジンのトリメチル化､そしてユークロマチン領域
に再配置されたＩＴ１による修飾を受けていた。
【考察】マウスＥＳ細胞、神経前駆細胞、ニューロンへの分化過程において、クロモセンターや
ＰＭＬボディ等の核内構造およびMHC-Oct3/4遺伝子領域のヒストン修飾とＤＮＡメチル化が動
的に調節されていた｡クロマチン修飾機構によるエビジェネテイックな制御が遺伝子発現の調節
とともに、ＥＳ細胞および神経前駆細胞の分化能の可塑性と関連する可能性が示唆された。
【結論】マウスＥＳ細胞の神経分化段階における遺伝子発現制御とクロマチン修飾、そして核内
構造で構成されるエピジェネテイクス制御機構が時空間的に協働することが明らかになった。
５
2.参考文献
参考論文
①関連論文１編１冊
LTakahiroAoto,NorikoSaitoh,Takayalchimura,HitoshiNiwa,MitsuyoshiNakao、
NuclearandchromatinreorganizationmtheMHC-Oct3/４１ocusatdevelopmental
phasesofembryonicstemcelldifferentiation・
ＤｅＵ.ＢｊｏＩ､298:354-367,2006.
②その他の論文５編５冊
LTakayalchimura,SugikoWatanabe,YasuoSakamoto,TakahiroAoto,ＮａoyukiFUjita
andMitsuyoshiNakao、
TranscriptionalRepressionandHeterochromatinFormationbyMBD1anｄＭＣＡＦ/AM
FamilyProteins．
〕､ＢｊｏＩ・ＣＩＤ”､280:13928-13935,2005.
2.ShuTBuruzoe,Kolshihara,YasuhiroUchimura,SugikoWatanabe,YOkoSekita,TakahiroAoto，
HisatoSaitoh,YasuhitoYUasa,HitoshiNiwa,MichioKawasUji,HideoBaba,andMitsuyoshi
Nakao
lnhibiUonofDNAbmdingofSox2bytheSUMOconjugation
Biocl8e『仏Biophys・ＲＢＳ・ＣＯ加沈""．（inpress)．
3．青戸隆博，中尾光善
「エピジェネティクスとリプログラミングオーバーピュール
蛋白質核酸酵素増刊号，512024-202Ｚ2006.
4.青戸隆博，市村隆也，坂本快郎，南建，中尾光善
「個体発生におけるメチル化ＤＮＡ結合タンパク質の役割」，
実験医学23:2107-2114,2005.
5.斉藤典子，青戸隆博，丁秀鎮，中尾光善
「細胞核、クロマチンのダイナミクスル
蛋白質核酸酵素51:302-309,2005
3.謝辞
熊本大学発生医学研究センター器官制御分野の中尾光善教授には、本研究の全体的な御
指導を頂きました。４年間にわたり研究を推進する上での成長を期待して頂き、励ましと
助言を頂いたことを大変感謝しています。同教室の斉藤典子助手には、本研究を行うにあ
たり直接に御指導頂きました。実験、論文発表および学会発表について多数の御指導を下
さいました。エピジェネテイック/核構造研究の第一人者である中尾先生と斉藤先生のご両
名より直接御指導頂いた事は大変に貴重な経験でありここに感鮒いたします。また、同教
室の皆様に深く感謝いたします。優れた教室員の方々と接することで多くのことを学ぶ機
会を得られたことに感謝いたします。理化学研究所発生・再生科学総合研究センターの丹
羽仁史博士、理化学研究所バイオリソースセンター阿部訓也博士、ケンブリッジ大学
AustinSmith博士、熊本大学医学部市村隆也博士にはＥＳ細胞やプラスミド、BAC、抗体な
ど多くの研究材料を供与いただきこの場でお礼を申し上げます。文部科学省２１世紀ＣＯＥ
プログラム「細胞系譜制御研究教育ユニットの構築」には支援を受け、研究に専念するこ
とができ大変感謝致しております。
７
4.略語
ATP;adenosine5'一triphosphate
BAC;bacterialartificialchromosome
BＳＡ;ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｍｅ
ｃＤＮＡ;comp1ementaryDNA
CM-LIF:ConditionMediumderivedLIF
DABCO;1,4-diazabicyclo[2.2.2Ioctane
DAPI;diamidino-2-phenylindole
DIG;digoxigenin
DTEdithiothreitol
Dnmt;DNAmethylatransfeｒａｓｅ
ＥＤＴＡ;ethylenediammetetraaceticacid
EＧＣ;embryonicgermcell
EGTA;ethyleneglycoltetraaceticacid
ECFP;enhancedgreennuorescentprotem
ESC;embryonicstemcell
EST;expressedsequencetag
EtBr;ethidiumbromide
FBS;fetalbovineserum
FITC;fluoresceinisothiocyanate
GFAP:G1ialFibriaryAcidicProtein
HAT;Histoneacetyltransferase
HDACHistonedeacetylase
HEPES;N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicacid
HMT;Histonemethyltransferase
HP1;Heterochromatinproteinl
lPTG;isopropyl-1-thioD-galactopyranoside
KO-ESnmvl;knockoutESMediumMixuture
KO-DMEMknockoutDMEM
KSR;knockoutserumrep1acement
LIF;leukemiainhibitoryfactor
MHCmajorhistocompatibilitycluster
NEAA;non-essentialaminoacid
NPCneuralprecursorcell
PAGE;polyacrylamideelectrophoresis
８
PIPES;piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonicacid）
PBSjphosphatebufferedsalme
PCR;polymerasechainreaction
PIC;Preinitiationcompelx
PML;PromyelocyticLeukemia
PMN;post-mitoticneuron
SDIA;stromalcellderivedinducingactivity
SDS;sodiumdodecylsulfate
Tris;tris(hydroxymethyl)aminomethane
TuJ1:a-typenIbeta-tublin
９
5.研究の背景と目的
5-1．細胞分化における細胞核の変化
われわれヒトやマウスを構成する約２００種類の細胞は全てひとつの受精卵から始まる
一連の発生過程において増殖や分化をへることによって生み出されていく。幹細胞から分
化細胞を作り出す過程とは遺伝子発現を変化させ､その状態を次世代の細胞へと受け継が
せるエビジェネテイックなプログラムとみなすことができる。これらエピジェネティック
なプログラムを特徴づける法則性を解き明かすことは細胞分化の本質を考える上で極め
て重要な情報を与えてくれるはずである(FrancasteletaL,2000)｡ゲノムワイドな遺伝子発
現プロファイリングの解析から､マウスのES細胞(ESqおよびNSC(神経幹細胞Neural
stemceU)などにおいては、ゲノム中にコードされる全遺伝子の総数の40~60%程度つまり
12,000から16,000種類の転写産物ｍＲＮＡが発現していることが報告されている。それに
対して多くの分化細胞などは10~20％、すなわち2,500から5,000種類程度のｍＲＮＡしか
発現していない(AbeytaetaL,2004)。これらのことから考えると幹細胞とは分化細胞に比
ぺて基本的に転写活性が非常に高い細胞であると考えられる。実際に転写活性の高い遺伝
子プロモーターにしばしば認められるヒストンＨ３のアセチル化修飾は細胞内の総量が未
分化な幹細胞ほど高く、分化と共に顕著に減少していくことが報告されている(Kimuraet
aL,2004;LeeetaL,2004)。このような観点から、幹細胞からの分化とは転写活性なクロマ
チン構造を､転写不活性なクロマチン構造へと徐々に変化させるプロセスとも考えられる
（Gassereta1.,2002)。また電子顕微鏡による解析からもニワトリの成熟赤血球ではその前
駆細胞に比べて明らかに電子密度が高く転写不活性なへテロクロマチン領域が増加して
おり、核全体も凝縮のためかサイズが小さくなっているということがわかっている
（FrancasteletaL,2004)。
5-2.核構造、クロマチン制御とＤＮＡメチル化によるエピジエネテイクス
形態学的観察によって古くから知られているように、クロマチン構造は間期において二
つの構造に区分することが可能である｡ひとつは転写活性の高いユークロマチンであり他
方は逆に転写活性の低いヘテロクロマチンであり、これらの構造は細胞分裂を経て娘細胞
に安定に受け継がれていく(図１)。近年、クロマチンの高次構造がＤＮＡやヒストンの翻
訳後修飾様式と密接な関連性があるという「ヒストンコード仮説」が提唱され非常に注目
されている(IenuwemandAms,2001)。ユークロマチン領域ではヒストンＨ３およびＨ４
のＮ末端の複数のリジン残基がHAr(HistoneaceIyltransfErase)と呼ばれる一連の酵素群
によって高頻度でアセチル化(Ac-)されており、逆にヘテロクロマチン領域では
HDAC(HistonedeaceIylase)により低いレベルに保たれている。さらにｍｖＴＴ(Histone
methyltransfbrase)の作用によってヒストンのリジン残基はメチル化(Me-)修飾を受ける
のであるが､この場合はリジン残基の位置によってヒストンコードとしての意味が異なり、
さらに同一のリジンに対してモノ(Ｍｅ１)、ダイ（Me2)、トリ(Me3)という３種類の異なる修
1０
一ンが異なる。またＸ染色体の不活性化などにみられるような多くの遺伝子の不活
性化においては、分化とともに数百ｋｂＰにわたりこれら修飾パターンの変化が起き
る。しかし発生分化でもっとも頻繁に見られるような数ｋｂＰレベルで１遺伝子座の
みが遺伝子発現の変化を受ける場合にどのようなクロマチン構造の変化が起こるか
は不明であった。また細胞核は特定の核内機能に関与する因子が集積する機能サブ
ドメインを構築するが、これらが初期胚のような遺伝子発現が急速に変化する場面
でどのように変化するかも不明である。
1７
、
6．実験方法
6-1.細胞培養および分化系
COS-7細胞およびPA6細胞はＤＭＥＭ/F12Ham培地(Sigma)に10％FBS(Bio-whittaker社）
および抗生物質(ペニシンおよびストレプトマイシン)を加え37度5％CO2培養器にて継代
培養した。マウスＥＳ細胞（ESC)はEB3細胞[OCB/4蛾'窟も衝ulPAIと４６Ｃ細胞[Soxr化gかi'酒…PA]を
用いた。両者共に１２９マウス胚から砿立され、なおかつフイーダー細胞非依存性のクロー
ンであるE14tg2a由来であるため遺伝的背景は基本的に同一である。培養法は、0.1％ゼラ
チン(ICN)でコーティングしたディッシュ上でKO-ESMM培地３７度5％CO2培養器にて継
代培養した｡KO-ESMM培地の組成はKO-DMEM(Gibco)、0.3％FBS(Hydone)、１５％ＫＳＲ
(Gibco)、２mMglutamine(Sigma)、IxNEAA(Gibco)、O1mM2-mercaptoethanol(Wako）
およびＣＭＩⅡ7である。ＣＭＬＩＦはCOS-7細胞にＬ正(Leukemiainhibitoryfactor)を発現さ
せるために､pCAGGSLIFプラスミドをFugene6qRoche)を用いてトランスフェクションし
４日間培養した後、培養上清を回収し遠心し、さらに0.221｣ｍのフィルター処理をしてから
保存した。その後ＣＭ－Ｉ工の力価の検査のため低密度でＥＳ細胞を７日間培養後、アルカリ
フォスファターゼ試験により９５％以上のコロニーでアルカリフォスファターゼ陽性が認め
られるロットのみを使用した。また血清も同様な手法でＥＢ３および46Ｃともにロットチェ
ックしたもののみを用いた。全ての実験においてESCは継代数7回以内のものを使用した。
EB3細胞[Oct3/4……PAIは5ILg/ｍＬのブラストサイジンＳ(Funakoshi)存在下で培菱するこ
とでＬ正存在下でも培養中に散発的に分化してしまう細胞集団を除去した(NicholsetaL，
1998;Niwa.,2002)。ＳDIA法に用いるためにPA6細胞はコンフルエントまで培養した後4％
parafOrmaldehydeを含むＰＢＳで20分間室温で固定し、ＰＢＳで３回洗い、使用するまで４
度にて保存した(Kawasakieta1.,2000)。神経分化させるためにＥＢ３と４６Ｃ細胞はlxlO3
ceU/Cm2の密度で固定したＰＡ６細胞の上にまき、KO-ESMMから0.3%FBSおよびＣＭＬｍ
を除去した分化用培地にて６~１４日ほど培養した。神経系の細胞を均一に入手するために、
SDIＡ開始６日後の46Ｃ細胞をPOly-L-ornithine(Sigma)およびFibrocectin(Sigma)でコーテ
ィングしたディッシュ上にまきなおし、N2B27培地(50％、ＭＥＭ/F12(Gibco)、５０％
NeurObasalmedium(Gibco)、２５ILg/mLinsulin(Sigma)、1001↓g/mLapo-transfbrrm(Sigma)、
6,8/mLprogesterone（Sigma）、１６Ⅱg/mLputrescine(Sigma）、5.2,9/mLSodium
Selemte(Sigma)、IxB27(Gibco)、0.1％BSA(Gibco)、２mMG1utamine(Sigma)）に201JLg/mL
FGF2(Gibco)を添加しさらに６日間培護した。神経前駆細胞(NPC)を得るために、SDIＡ開
始８日目から１２日目までの間0.5119/ｍＬビューロマイシン(Sigma)を加えてSoxl陽性細胞
を選択した。最終分化したＰＭＮ(posﾄmitoticneuron)を得るために、SDIＡ開始６日目か
ら200IlML-ascorbate(Sigma)を加え続け、さらに９日目から１ＵＭＡｒａＣ(Sigma)を３日間ほ
ど添加した（図13)。
1８
6-2.細胞の分画法、ウエスタンプロット法および使用した抗体
細胞のＴＣＬ（TbtalceUlysabe)を得るために、培養細胞(1~2xlO6ceUs)に直接lxSDS
Laemmlibuffer(2%SDS、１０％Sucrose、ql25MTrsi-HqpH6､8,0.002％Bromophenol
blue)を加えさらに超音波処理した。可溶性の細胞質を分画するためには１x107個の細胞あ
たり3001ＬＬのNB5buffer(０３％ＮＰ４０，５ｍＭＭｇｑ２、６０ｍＭｘロ、l5mMNaCl、l5mM
Tris-HClpH7､４，１ｍＭＤＴｒ、ABSF、PepstatinAおよびTiEichostatinA)を加え５分間氷
上でインキュベートし６００８，３分間遠心し上清を回収した。次に沈殿にchromatin
isolationbuffbr(10mMPIPES-KOHpH6､８，１０mMEDndL、ABSF、PepstatinAおよび
TrichostatinA)を加え氷上で30分間インキュベートし２０００８，１０分間遠心後、上清を回収
し最後に沈殿にlxSDSLaemmlibufferを加え超音波処理しクロマチン結合分画を得た
(Remboutsikaeta1.,1999)。これらのサンプルをそれぞれ1/２７，１/９，１/3に希釈し、さら
に最終濃度ｌ０ｍＭＤＴｒを加え95度で５分間煮沸したものをＳＤＳポリアクリルアミドゲル
にて泳動し、その後ニトロセノレロースメンブレン(ECLAmersham)に150mA、１時間(低分
子量タンパク質)または１．５２時間(高分子堂タンパク質)の条件下で転写した。分離転写後
のメンプレンは10％スキムミノレク/PBSにて室温２時間ブロッキングし、各種１次抗体(抗
体のリストは下記に記す)を1~3%BSA/0.03~０３％TWeen20/PBSにて４度で一晩反応させた。
0.3~1.0％TWen20/PBSにて５分、３回洗浄して、１次抗体に適応するぺルオキシダーゼ標識
２次抗体(Amersham)を0.03~0.3％TWeen20/PBSにて希釈し反応させた。0.3-10％
TWelu20/PBSにて５分３回洗浄してからWestemUghting化学発光検出システム(PErkin
E1mer)にて目的のタンパク質を検出させた。
●使用した抗体、会社、カタログナンバーおよびロット
(2xbranch)Rabbitanti-H3K27Mel（UpstateBiotechCatalogue#07-448,Lot#24439）
(2xbranch)Rabbitanti-H3K27Me2（UPstateBiotech､Catalogue#07凸452Lot#24461）
(2xbranch)Rabbitanti-H3K27Me3（UpstateBiotechCatalogue#07-449,Lot#24440）
(2xbranch)Rabbitanti-H3K9Mel（UpstateBiotechCatalogue#07-450,Lot#24441）
(2xbranch)Rabbitanti-H3K9Me2（UpstateBiotechCatalogue#07割41,Lot#24445）
(2xbranch)Rabbitanti-H3K9Me3（UpstateBiotech､Catalo8nle#07-442,Lot#24446）
(Lineartype)Rabbitanti-H3K9Me2(UpstateBiotechCatalogUe#07-521,Lot#24651）
(Lmeartype)Rabbitanti-H3K9Me3(UpstateBiotech・Catalogue#07-523,Lot#27759）
Goatanti-LaminB1(C-20)(SantaCruz､CatalogUe#Sc-6216,Lot#K2403）
Rabbitanti-HP1u,pandY(J､BioLChem.(2005)280:13928-13935）
Mouseanti-H3S10Phos(cloneRR202)(UpstateBiotech､CatalogUe#05-598,Lot#26436）
Mouseanti-Nestin(cloneRat-401)(HybridomaBankattheUniversilylowa）
Mouseanti-PML(clone36L104)(UpstateBiotech・Catalogue#05-718,Lot#24520）
Mouseanti-RNAポリメラーゼーⅡ（cloneCTD4H8）（UpstateBiotechCatalogUe＃05-623,
Lot#29634）
1９
Mouseanti-SSEA1(cloneMC480)(HybridomaBankattheUniversitylowa）
Mouseamti-TUJ1(cloneSDL3D10)(SigmaCatalogUe#TL8660,Lot#073K4835）
Mouseanti-p-tubulin(cloneTUB2､1)(SigmaCatalogUe#TL4026,Lot#024K4862）
Rabbitanti-CBP(A-22)(SanatCruz､CatalogUe#sG369,Lot#HO904）
Rabbitanti-GFAP(Sigma・Catalogue#G-9269,Lot#113K4808）
Rabbitanti-H3(AbcamCatalogue＃abl791,Lot#69098）
Rabbitanti-H3K4MeI(AbcamCatalogue#ab8895,Lot#66724）
Rabbitanti-H3K4Me2(AbcamCatalogUe#ab7766,Lot#44020）
Rabbitanti-H3K4Me3(AbcamCatalogUe#ab8580,Lot#51545）
Rabbitanti-H3K9/14Ac(UpstateBiotech・Catalogue#06-599,Lot#29505）
Rabbitanti-H4K5/8/12/16Ac(UpstateBiotechCatalogue#06-866,Lot#26393）
Rabbitanti-p300(N-15)(SantaCruz・Catalogue#sc-584Lot#K140）
Rabbitanti-SP1(PEP-2)(SantaCruz・Catalogue#Ｓｃ-59,Lot#K1502）
Rabbit-antiOct3/4(H-138)(SantaCruzCatalogue#Ｓｃ-9081,Lot#G232）
6-3．半定量的RILPCRおよび使用したプライマー
全ＲＮＡを2~3xlO‘の細胞あたりｌｍＬのISOGEN(NipponGene)を加え抽出した｡cDNA
合成は全RNA5ugをDNasel(promega)にて処理することで混在するゲノムＤＮＡを分解し
てからoUg←ｄＴおよびSuperscriptm(Invitrogen)を用いて逆転写させ合成した｡合成した
cDNAを用いて25～35サイクルの間で直線的な増幅範囲内でのみ、サーマルサイクラーに
より増幅させた後、l0xLoadingbuffer(10mMEDnA、５０％G1yceml、0.01％Bromophenol
blue)を1/１０volume加えてから２~3％アガロースゲル/0.5xTBEに流して、100Ｖ１５~30分ほ
ど泳動し、EtBr染色し35511ｍＵＶで可視化することで検出した。
使用したプライマーおよびＰＣＲ産物の大きさ
（ＦはForwardプライマー、ＲはReverseプライマーを表す）
βLACfi〃ＰＣＲ産物=460ｂｐ
ＲＧＧｃｃｃＡＧＡＧｃＡＡＧＡＧＡＧＧｎ８ＫｒＣＣ
Ｒ:ＡＣＧＣＡＣＧＡＩＴ1℃ＣＣＴｃＩＣＡＧＣ
RexZPCR産物=488bp
F:ＧＴ℃ＡＧＡｒｎＡＧｃｃｃＣＧＡＧＡＣＴｃ
Ｒ:ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡｒＧＴＣＧＣＴｒｎＡＧ
E７ｍ２ＰＣＲ産物p399bp
HT亡ＣＡＡＧＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＡＡＧＴ℃
R:T℃ＣＴ亡ＴＧＴＧＣＴＣＴ℃ＣＡＩＴＩｃＩＣ
ENIＰＣＲ産物=563ｂｐ
ＲＴ℃ＡＡＧＡＣＩＣＡＣ1℃ＡＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣ
Ｒ:ＴＣＡ八1℃TCCＡＣ1℃ＧＧＡＧＧＡｒｌＣ
2０
、
ＨｍＢＺＰＣＲ産物=466ｂｐ
ＲＧＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＴＣＩＣＡＣ
Ｒ:ＧＡＡＧＴＩＴ℃ＧＧＡＡＡＧＴｃｒ1℃ＧＡＣ
ＭｙｏＤＰＣＲ産物=121ｂｐ
ＨＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＩＣＡ
Ｒ:ｃＡＧＡＣＣＩＴＣＧＡｒＧｍＡＧｃＧＧＡｒ
Ｔ７ＢｍＰＣＲ産物=835ｂｐ
ＲＡ1℃ＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＧＡＣ
Ｒ:ＡＧＡＧＧＣＴＧＴＡＧＡＡＣＡＩＣＡＩＴ
CUI〕に２ＰＣＲ産物=511bp
F:ＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＡｒＧｎＫ1℃Ｃｎ８ＬＧＣｒ
Ｒ:ＣＨＣＧＣＴ1℃CTハＧＧＧＡＣＩ℃ＣＴ℃
CKI7ＰＣＲ産物毛69ｂｐ
Ｆ８ＣＣＩＣＣＴＣＣＡＧＡｒ1℃ＡＣＡＡＩＣ
Ｒ８ＣＩＴＧＣＴ℃ＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＴ1℃
Ｈ２ＱＺＯＰＣＲ産物=ｇ０ｂｐ
ＲＴ℃ＡＣＡＣＡｒ1℃ＣＩＣＡＩＣ1℃ＣｒＧ
Ｒ８ＴＣＣｃｃ1℃CITTT℃ｍＣｃｒＧＴＧ
OCB煙ＰＣＲ産物ロ500bp
F:ＧＡＧＡｍＫＩＣｃＡＡパ1℃ＧＧＡＧＡｃｃ
ＲＴＤＡＡＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴ亡CＡＣＧＴＴ
７℃F1９ＰＣＲ産物己220bp
F:ＡＣＧＴＣＩＴＣＣＩ℃ＧＴＩＴ1℃ＣＡＩ℃
R:Ｔ℃ＡＧＡＡＧＴＣＣＡｒ1℃ＣＣＴＣＩＣＣ
Ｈと「ＰＣＲ産物=86ｂｐ
ＲＡＧＣＡＧＧＡＡＡｒＣＩ汎ＣＧＧＧＣＡＡＧ
Ｒ８Ｔ℃ＧＴＩ℃ＡＧＣＣＩＣＣＴ亡TITＣＴＣ
6-4．クロマチン免疫沈降法、リアルタイムＰＣＲおよび使用したプライマー
細胞培養液中に最終濃度１％になるようにFormaldehvde溶液を直接加貞
細胞培養液中に最終濃度１％になるようにFormaldehyde溶液を直接加えて25-37度で
10~30分間、クロスリンクし細胞を回収後、ＰＢＳで２回洗浄し、SDS-lysisbuffer(1％SDS、
10,ＭEDTA、５０mMTris-HqpH8.O、ABSF、PEpstatinAおよびＴＳＡ)を加え氷上で１０
分間インキュベー卜してから超音波処理によりゲノムＤＮＡの長さを500~1000ｂｐになるよ
うに調製した。次に細胞破砕液を12,0009で10分間遠心し可溶イヒクロマチンの上清を回収
した｡可溶化クロマチンをDUutionbu碇r(0.01％SDS、1.1％TritonX100、L2mMEDTZA、
16.7mMTris-HClpH80、l67mMNaC1、ABSF、PepstatmAおよびTrichostatinA)にて
1/１０に希釈しSDS濃度を薄めてから、１/10volumeのサンプルを、putとして保存した。非
特異的結合を抑えるためにProtemAbeads/BSA/SalmonspermDNAを加え４度で２時間イ
ンキュベートしてから12,0009で１分間遠心しpre-clearされたサンプルにコントロール
２１
IgGを含む各種一次抗体を加え４度で一晩反応させた。翌日proteinAbeads/BSA/Salmon
spermDNAを加え４度で２時間反応させてからbeadsを１１頂番にLow-saltbuffcr(0.1％
SDS、１％IritonX100、２，ＭEDTA、２０mMTris-HC1pH8.O、150ｍＭＮａｑ)にて１
回、High-saltbuffbr(0.1％ＳＤＳ、１％TritonX100、２，ＭEDTA、２０mMTris-HC1
pH80、500ｍＭＮａＣ１)にて1巡回、Liqwashbuffer(1％NP40、１％DOC、１mMEDTyk、
l0mMTris-HC1pH8､0,250mMLiCl)にて１回、ＴＥ(10mMTrisHClpH8.O、lmMEDTA）
にて３回ずつ洗浄した。E1utionbuffer(l00mMNaHCO3、１％SDS、l0mMDTr)にて
beadsからタンパク質ＤＮＡ複合体を分離し､最終濃度250,ＭになるようNaC1を加え６５
度６時間インキュベートしてクロスリンクを外してからprotemaseK処理しタンパク質を
分解し、さらにRNaseを加えＲＮＡも分解した。最終的に得られたＤＮＡをフェノール抽
出およびエタノール沈殿により精製してからＰＣＲのテンプレートとした。定量的に解析す
るためABIprism7700(ABI)およびPremixEXTb1q(Takara)を用いてSYBRGrCen法による
リアルタイムＰＣＲを行った。検量線は1/1000~1/１０に希釈したinputＤＮＡを用いて作成し
た。
使用したプライマーおよびＰＣＲ産物の大きさ
ＬＨ２Ｑ１０プライマーＰＣＲ産物=ｌ５６ｂｐ
ＲＧＡＡＧＡＣＣＴＣＧＡｒＧＧＧＡｒＧＴＧ
Ｒ;CTGGGn4AAGGCA1℃T℃CTG
2.-30ｋｂｐＰＣＲ産物=248ｂｐ
ＵＰ８０:Ｆ:ＣＴＧＡＣＣＡＩＣＧＡＴＧＧＨＩ℃CITI亡
UP-30:Ｒ:ＣＣＡＧＣ1℃ＣＣｎｏｈＣＡＣＡＡＣＴＴＧＴＩＣ
a-15kbpPCR産物=28元ｐ
Ｆ:ＧＴ℃ＣＡＣＡＧＴＡＣＣｎＡＡＧＧＡＡＧＴ℃
Ｒ:ＣＣＣＡＣＩＴＣＣＩＣＴｈＡｎＡＡＧＡＧＴ℃
4.-10ｋｂｐＰＣＲ産物=163ｂｐ
ＨＣ1℃ＣＧＴ亡ＩＴＧＡＣＴｃＡＧＡＩＣｒＩＣ
Ｒ:ＧＧＧＴＩＣＡＣＡＣＣｎＫ1℃ＣＴＧＧＡＧ
5.-5.6ｋｂｐＰＣＲ産物=ｌ５８ｂｐ
ＲＧＣＴＩｃＧＧＡＴＧＣＴＣＴ1℃T℃ＡＣＡ
Ｒ:ＡＡＧＣＴＣＧＣＡＡＧＧＴｃ1℃ＣＴ℃T℃
6.-3.6ｋｂｐＰＣＲ産物=200bp
F2CT℃ＴＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＩＣＡＡＣ
Ｒ:ＧＧＴ℃八1℃TＧＣＡＧＴｎＡＣＡｒＣＧＡＣ
7.-3.2ｋｂｐＰＣＲ産物=194bp
F:ｍＫｒｃＡｃＩＴｃｃＡＡｃＧＣＣＣＡＡＧ
Ｒ:ＡＡＣＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣ1℃
8.2.7ｋｂｐＰＣＲ産物=179bｐ
ＲＧＧＧＡｒｎ２ＬＡＡＧＣＣＡｒＧＡＧＴＴＧＧ
2２
R:ＧＧＧＴｒＣｃｃＴＡｃＡｎﾍＧｃｃＴｎＡＧＡｒＧ
9.2ｋｂｐＰＣＲ産物=170bp
F:ＧＧＡＡＣＩＣＧＧＴＣＴＧＧＧＧＡＧＧＴｒＣｍヘ
R:ＡＧＣＡＧＡｒｎﾍＡＧＧＡＡＧＧＧＣｍＡＧＧＡＣＧＡＧＡＧ
10.-1.5ｋｂｐＰＣＲ産物=l94bp
F:ＴＣＴＣＣｎＫ1℃T℃ＴｈＧＣＴＧＴＧＴＧｍＡＧＧ
Ｒ:ＧＧＧＴＧＴ℃TCT1℃ＡＴＧＧｎＡＧＴ亡r1℃Ａ
11.-1.OkbpPCR産物=200ｂｐ
ＲＧｎＡＡＩｃＧＧＡ1℃ＣＩＣＡＧＡＣＴｃＧ
ＲＣＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣ1℃ＡＧＡTＧＧ
12.-0.5ｋｂｐＰＣＲ産物=l44bp
F:ＡＣＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣｒｌｃ1℃
Ｒ:ＣＣＡＧＴ窓rlT℃ＡＧＣＣＣＡ1℃T℃Ｃ
13．プロモーターＰＣＲ産物=g5bp
F:ＧＧＡｒｌＣＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＴ
Ｒ:Ｔ℃ＧＡＡＧＣＴｎＡＧＣＣＡＧＧＴ1℃ＧＡＧＧＡ1℃ＣＡＣ
14.+1.5ｋｂｐＰＣＲ産物=200bp
F:Ｃ1℃ＡＣＡ1℃ＴｎｄＬＡＡＴＧＧＣｃＣＴｎＡＡ1℃
Ｒ:ＡＣＡＣＣＩＣＡＡｒＧＣＣＡＩＴＴＣＡＡ1℃
15.OcWI1cfl9intergemcreglonPCR産物=l71bp
F:ＡＣＴｒＣＧＧＡＧＣＡＧＣＣｊＫＩＣｎ８ＬＧ
Ｒ:ＧＣＡＧＣＧＡ1℃ＧＡＩｈ８ＬＧＡＣＴＧＧＡ
16.T℃F1，プロモーターＰＣＲ産物=144ｂｐ
ＲＣＴＣＴ℃ＣＧＣＣＡＣＩＴＣＴ℃ＡＩＴＣ
Ｒ:ＡＧＣＩＣｃＡＩＴＴ℃TＣＣＣｎＡＣＣＧ
6-5.バイサルフアイト反応によるＤＮＡメチル化解析および使用したプライマー
ケノムＤＮＡの抽出にはDNAextractionbuHbr(l00mMThds･ＨＣ１ｐＨ８､８，５ｍＭＥＤＩＹｋ、
ゲノムＤＮＡの抽出にはDNAextractionbu錐r(l00mMThds･HC1pH8､８，５ｍ
0.2％SDS、200ｍＭＮａＣ１、１００１１８/mLprotemaselO中で0.5x106個の細胞を３７度で一
晩インキュベー卜してからフェノール抽出、フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム
抽出の順番で行い、さらにエタノール沈殿を行い精製した。２ｕｇのＤＮＡをＢａｍＨ１で３７
度一晩切断してから再び精製し、５OILの水に溶かし、１/１０量の３ＭＮａＯＨを添加し４２度
で３０分間アルカリ処理を行った。次にl0mMHydroqumone(Sigma)を添加しさらに尿素
/バイサルフアイト溶液00H5.0)を加え５５度、遮光しながら一晩バイサルファイト反応を行
った。WizardBpincolomn(Promega)を用いて脱塩したサンプルに、ＮａＯＨを加えること
で脱スルホン化し、フェノール抽出およびエタノール沈殿法でＤＮＡを精製しＰＣＲのテン
プレートに用いた。ＰＣＲ反応はAmplinLqGold(PEbioBystems)を用いて行い、増幅効率
の低いサンプル(､０．４，６，１３のプライマーセットを用いた場合)についてはさらに一次増幅
産物のｌ/５０量を用いてnested-PCRを行った。これらにより得られたＰＣＲ産物はゲルか
2３
ら精製しpGEM-easyvector(Promega)に、クローニングし、n.coliDH5cLにtransfbrm
させた。それぞれのサンプルについて最低１５個ずつコロニーを選出しプラスミドを抽出し
てABI310シーケンサー(ABIPriBm)によりシーケンスを解析した。99.5％以上の非ＣｐＧ
配列部位のＣ(シトシン)がＵ(ウラシル)に正しくバイサルファイト反応により変換されてい
るサンプルのみを、本解析でのＣｐＧメチル化の解析に使用した。
使用したプライマー、ＰＣＲ産物の大きさ、およびＰＣＲ産物中に含まれるＣｐＧの数
（括弧内はバイサルファイト処理前の配列）
LH2Q10products-283bpCpG=1９
ＨＴＴｎＡＧＧＧＴｒＧＡＧＧ
Ｒ８ＣＡＣＴ℃ＡＣＣｎ４ＣＣＴＡＡＡＴＣＴｈＡＡ1℃
（CCCAGGGCTGAGGACICCCCAICT℃ｃｃ）
(CAC1℃ACCT℃CCT℃GGT℃T℃GGT℃）
2.Oct480kbpPCR産物=202bpCpG-3
Ｆ：
RnkTnoLA1℃、ＡＣ
ＧＴｈＡＧＡ1℃ＴＩＡＧ
、ＡＣ（T℃TTT1℃AAAAAndLCArlCCAAGA1℃CcAG）
ＡｒＣＡ（T℃T1℃GTm℃CTGGTC1℃AGGAAGTCArcA）
3.Oct420kbpPCR産物=215bPCpG=４
F:TITGTrlmGT℃T℃GAArnKITITT（CTI℃TTI℃AGTCTcGAA1℃ACTTCC）
R:AC1℃TcAccAAArCcAcTrlmT℃T八Ａ（GCT℃T℃AccAGGT℃cAcTrl℃TTcTGG）
4.Oct4-10kbp(nested）
一次ＰＣＲ産物=307bｐ
1/2F:TAArAmAAAG
(cAACAnAAAAGCAAAAC
1Ｒ：
）
ＣｎＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣｎＡＡＡ
(CmmGGGAAGGCTAAAGGCAAAAGCmAA）
二次ＰＣＲ産物=299bpCpG=２
２Ｒ:AAAACTyLAAAACAAAAACTyAAAAAA
(AAGGCT晩AAGGCAAAAGCTYkAAGGGG）
5.Oct4-55kbpPCR産物=256bpCpG=４
F:八ｍﾍGThKIT℃AAAG八nAAAGAnAAAnKr（AcmGTﾊcT℃AAAGACAAAGACAAACAC）
R:CmCCCTT℃T℃AC1℃CACAmAA1℃（CTCCCCTTC1℃ACTCCACAICGGTC）
6.Oct4-4kbp(nested）
一次ＰＣＲ産物=289bp
1F:AAGGAAITnKrGTnoLGTIAGAGAAArMIT（AAGGAArCImCCCAGccAGAGAAACn8LCC）
1R:AACmAAmAICAArndLAAmAAcTcAc（GAcT℃GGTcA1℃AGTmAA1℃GAC1℃AC）
２次ＰＣＲ産物=224ｂｐＣｐＧ=４
２F:TrrlTmGAAIynTICGArlT℃GGA（CcITCCAGAACArCTGGArlTGGGA）
2R:AAAACACmAAACTﾊAAACAAAAAA（AGGACACmGACIAGAGCAGGGAA）
7.Oct48kbpPCR産物=268bpCpG-4
F:TTITTTnK1℃TT℃GTGGArmKrlTIT（CCTTTT℃ＡＩＣＴ1℃ArGC1℃GTcGACCA1℃TCT）
R:AICACccTCTIcTAAIWrcmAAAndLcTm（GTCACcCTCT1℃T℃GTCT℃TGAAGndLCrlA）
8.Oct4-Z5kbpPCR産物=l75bpCpG=２
F:T℃AGmdLAIAGGTITGTrGTITnKrrlTIA（TCAGCcAAcAGGTcTGCICTCCCATcTCCA）
R:AACTrnAcAACCAAATmACCCmAAc（GGCITrGCAACCAGGTnAGCCCTAAGC）
2４
9.Ｏｃｔ４ＤＥＰＣＲ産物=28gbpCpG=５
F:TCTrlAGGTrmACAGGT1℃GTTTT（TGTCT八GGCCrmGAGGC1℃GcccT）
R:CAT1℃ArndmoLAAACAAmcQmkArlﾊAｒ（CAT1℃AITCTGGAACAGTCCCAndLGTndLGT）
10.Oct4-L5kbpPCR産物=289bpCpC=４
F:AGGAGGGGAITITnKImm℃T℃TI、（AGGAGGGGACIT℃CACACﾊﾟ1℃TcCnkr）
R:ACAAAArlCTAAAccnAAACCCAAC（ACAGAGTT℃TCAGCCTCGCCCCAG）
11.Ｏｃｔ４ＰＥＰＣＲ産物=l97bpCpG=４
F:GGAITITnﾍGATICGGTrnﾍGAAAArnKr（GGArcc1℃AGACT℃GGCCCAGAAAACCAC）
R:CCI℃AAAAACAAAACCTCAAAmAAにCTCAAAGACAGAGCCTCAGATGGA〉
12.Oct4-O5kbp
PCR産物=295bpCpG=４
F:TmrnﾍAITICGAnAAnKIﾊAGAICGAAnMT℃mcCAACCTCGACAACACAAGATGGAAnA）
R:crcnAAAAAACCmAAACArCCArmAAnA(CTCICGAGAGCCn4AAACAICcAITCAArG）
１３.Oct4PP(nested）
一次ＰＣＲ産物=309bp
lF:Trl八AGGmGGGGTCAGAGGAIT（CCCAAGGCAGGGGTCAGAGGACC）
1R:AAICTAAAACCAAAnKrcCAACCAndkA（AGT℃T℃AAGCCAGCTCT℃CAGCCArGG）
２次ＰＣＲ産物=265bpCpG=10
2F:AAAIcAAGGTTTTTTCGGGTIT（AAA1℃AAGGCCTCCIcGGGT℃q
2R:CCAAAIm℃CAACC八nAAAAAA（CCAGGTCT亡CAGCQdKICGGGAA）
14.Oct4intronPCR産物=221bpCpG=８
F:mGTnAGmKrlTICGAGndLAGT℃mAGndLA（CAGCCAGCAcTcTGGAGcAAGTCndLA）
RmoLCIT℃ＡＴＩＡＡＡＡＡＣＣ
(TGcTT℃ATndLAGGGCCAITIﾊAGArGT℃AG）
15.ＯＣＷ1℃F1gmtergenicregionPCR産物=mlbpCpG=４
F:AAAITTIAGGT℃AITITmAAAmGG（AAAccccAGGTGA1℃rlCAAAACAGG）
Ｒ:ＡＡＡＡＣ1℃ｃｃ
(AGAACTCCCAGAGTcACAAGAGG）
16.TCF１９プロモーターreglonPCR産物=210bpCpG=１３
F:GGTTGTITIm八GTTTTmTTTITIT（GGCTCCTcIACAGCTCCArlTC1℃CC）
R:ArnAcACCCAITnoLCT℃nKrnoLACC（GTI℃CAcCCAITTGCT℃TmT℃GCC）
6-6．間接免疫染色蛍光
培養細胞をゼラチンコートしたカバーグラス上にr3xlO5の密度でまき一晩培養してか
らＰＢＳで一回洗い、４％pamfbrmaldehydeを含むＰＢＳにて室温で１０分間固定した。
0.2~０５％IYitonX100を含むＰＢＳを用いて氷上で５分間処理して細胞膜と核膜を透過処理
した。ＰＢＳで３回洗浄後０５~3.0％ＢＳＡを含むＰＢＳで15分間室温でブロッキングした。
一次抗体を０２％BSAを含むＰＢＳにて希釈して室温で１時間、もしくは４度で一晩反応さ
せた。0.2％BSAを含むＰＢＳで洗浄後、１次抗体に適応する蛍光色素⑱ITC、Alexa488、
Cy3など)で標識された２次抗体で反応させた。0.1Ⅱg/ｍＬＤＡＰＩでＤＮＡを染色しながら
PBSで３回洗浄後、カバーグラスを、DABＣＯを用いてマウントした。
２５
6-7.Immuno･FISH(DNA/RNA）
カバーグラス上に培養した細胞をCSKbuffer(l00mMNaCL300mMSucrose、
3mMMgC12、１０mMPIPES-KOHpH68)で一回洗浄し、0.5％IritonX100を加えた
CSKbuf化rで４度、２~５分間反応させることで細胞質ＲＮＡを含む可溶性成分を除去した。
4％parafbrmaldehydeを含むＰＢＳにて室温で10分間、細胞を固定した。Ｉｍｍｕｎｏ･FISH
の際は免疫染色を行ってから４％parafbrmaldehydeを含むＰＢＳにて室温で蛍光色素を固
定してＦＩＳＨを行った。プロープは､DNA･FISHにはjdHU-Oc2a1`領域を含むＢＡＣを用
い、RNA-FISHにはＥＳＣから抽出したgenomicDNAをテンプレートにOcda'４３遺伝子の
Exonl-intronl領域を増幅し、pB1ueScriptllのEcoRIHincllサイトにサブクローニング
したプラスミドをプローブとして使用した。
プライマーは以下の通り
F:CGGAATTCTGGGCCIYkGTCCCCOAAGTrG(下線部はEcoRIsite）
R:GACGTCGAOCAAmGAACGGOAGGGGCAC(下線部はHincllsite）
プローブの作成はＢＡＣまたはプラスミドそれぞれ１１４９ずつNicklranslationkit(Roche）
を使用し200~500ｂｐの長さに切断しbiotinもしくはＤＩＧを付加したプロープとした。
DNA-FISHの場合のみ2xSSQ70％fOrmamide、７５~85度で30秒~10分間細胞を熱処理する
ことでゲノムＤＮＡを１本鎖にしてからハイブリダイゼーシヨンさせた。細胞を７０~995％
エタノールで徐々に脱水し、プローブ100,9を含むハイプリダイゼーシヨンbuHer(50％
formamide/2xSSC/10％dextransulfate/Oﾕ％BSA/yeastIRNA/CotmDNA)を用いてプロー
ブと１本鎖のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを３７度で１晩ハイプリダイゼーシヨンさせ、
2xSSC/50％fOrmamide、２xSSC1xSSCの順で５分ずつ洗浄してから、蛍光色素を付加し
たAvidinもしくは抗ＤＩＧ抗体をdetectionbuffbr(4xSSC/O/､1％BSA/0.1％TWeen20)で反応
させ検出した。
6-8.イメージ解析
全ての画像の取得と編集はO1ympus社の蛍光顕微鏡ＩＸ７１で観察し､得られた蛍光像は
LummaviBionsoftwareven221qOIitanico.)を用いて行われた。１細胞での細胞核の像は、
Ｚ軸上に沿って0.5~1.Ｏ１Ｌｍの間隔で３０~６０枚ほどから構成されるスタックを
Nearest･neighborアルゴリズム(cutoH=０９、、=2)を用いてデコンボリューション処理を
行ってから解析に用いた。
2６
泡.細胞分化におけるグローバルなヒストンコードの変化
近年のゲノムワイドな遺伝子発現解析より、幹細胞からの分化とは転写抑制な環境とし
てのヘテロクロマチン構造を増大させていく過程ではないか､ということが指摘され始め
ている(Gassen2002;AbeytaetaL,2004)。最近の研究により、さまざまなヒストンの修飾
の中で、主に転写活性と相関するのがヒストンＨ３の９番目および１４番目の、ジン残基
のアセチル化(H3K9/14Ac)や、ヒストンＨ３の４番目のリジン残基のメチル化(H3K4Me）
などであり逆に、転写不活性と相関するのがヒストンＨ３の９番目や27番目のリジン残
基のメチル化(H3K9MeorH3K27Me)など、ヒストンの修飾パターンと転写との関係性が
判明しつつある(JenuwemandAms,2001;Peterseta1.,2003)。まずはじめに、グローバル
なクロマチン構造のＥＳＣ分化時における動態を見るために複数のヒストン修飾特異的な
抗体を用いてウエスタンプロットを行った。なおヒストンのリジン残基のメチル(Ｍｅ）
化には、モノ(Mel)、ダイOVIe2)、トリOⅦe3)の３種類のパターンが存在するためこれらを
区別できる抗体を用い、さらに半定量的に検出するために希釈系列を作成して比較した。
まずESC、NPC、ＰＭＮのそれぞれの細胞をSDSで細胞ごと可溶化し(TbtalceUlysates)、
SDSポリアクリルアミドゲルに供した。結果、Ｈ３のアセチル化およびメチル化につい
ては調べた中の、どの修飾パターン(H3Ac、H3K9Me3、H3K4Mel-3、H3K9Me1-3、
H3K27Mel-3)についてもほとんど変化は認められなかった。しかし、ヒストンは必ずしも
クロマチンに取り込まれているとは限らず細胞質や核質中に存在しクロマチンに弱く結
合している画分も存在するため､上記の結果は必ずしも分化時のクマチンの動態を必ずし
も反映していないことが予想した。そこで細胞を分画調製し、クロマチンに比較的強固に
結合している画分(chromatinboundfraction)のみで同様にヒストンの修飾パターンを解
析すると異なる結果が得られた（図１４および図１５)。転写不活性なへテロクロマチン領
域を示すマークであるH3K9およびH3K27のトリメチル化が、ＥＳＣからの分化過程にお
いて劇的に増加することが判明した｡この結果は分化の過程においてヒストンの各修飾の
量的調節は行われていないが､へテロクロマチン領域における修飾特異的なヒストンの取
り込みなどは積極的に変化していることを示している。
3３
ノレ。
マウスＭＨＣ領域は、マウスゲノム中でもっとも遺伝子密度が高い領域であるため、
MHC-OcB姪領域とＰＭＬボディとの位置関係をPMLの特異的抗体を用いてimmuno-FISH
法で調べたところ、おおよそ４６％の細胞で有意にＰＭＬボディの近傍にMHC-Ocf3姪遺伝
子領域は存在した(10％が共局在し36％が211ｍ以内の距離)（図28A)。同時にＺ軸に沿って
集めた画像群を３次元に再構築させてから平面上に投影させると２つのMHC-Oct3姪アレ
ルの両方がＥＳＣの核内でそれぞれＰＭＬボディ近傍に存在しているが、ＮＰＣでは離れてい
た（図２８B)。MHC-OcB煙遺伝子領域がＰＭＬボディ近傍に存在するものの、この割合が
必ずしも100％ではないことは、確率論的に核内での局在は決定しているものにすぎず転写
とは必ずしも関係がない可能性も考えられうる。そこでOcf3煙のexonl-mtronl部分をプ
ローブにimmuno-FISH(RNA)法を行ったところ、両アレノレ上の転写産物由来の二つのシグ
ナルは共にＰＭＬボディ近傍に存在し、この割合はすべての細胞のうちで約35~40%程度で
ありDNA-FISHの結果とほぼ近い割合であった。ゆえにOct3狸遺伝子はＰＭＬボディ近傍
に局在化している際に活発に転写されていることを示唆し､さらに興味深いことにＰＭＬボ
ディ内部にはＲＮＡのシグナルは全く検出されなかったことから、ＰＭＬボディ内部では転
写は起きておらず、ＰＭＬボディ近傍の領域が転写の場であることが示唆された。
重要なことに遺伝子座とＰＭＬボディの距離はＮＰＣにおいて明らかに離れる傾向にあ
る｡ＰＭＬボディとMHC-Oct3煙遺伝子座の間の距離が2ｌｌｍ以内の細胞数はＥＳＣでは36％
だがＮＰＣでは12％と約1/３に減少していた。さらにＰＭＮではＰＭＬボディそのものが消
失している。また他の核内の構造体であるCajalボディ、核小体、Ｓａｍ68ボディ、傍核
小体ボディなとMHC-O6B/4遺伝子領域との相互作用をimmuno-FISH法にて解析したが有
意な会合などは認められなかったことからＰＭＬボディはこれらの核内構造体の中で特異
的にMHC-Ocl3煙領域近傍に存在していることが明らかとなった。
4８
Ｈ３およびＨ４のアセチル化は転写活性と相関するが、それ以外の遺伝子間の領域やコー
ド領域についてはほとんどよくわかっていない。ヒストンＨ３とヒストンＨ４のアセチル
化状態をＤＮＡ鎖に沿って調べたところＥＳＣでのＯＣＢ狸遺伝子のプロモーター付近はＨ３
とＨ４の両方が高アセチル化状態にあったがそのコード領域はＨ３のみが高アセチル化状
態でありＨ４は逆に低アセチル化状態であった（図３０)。Ｔ℃F19とHb7の間にはきわめて
GC-richである典型的なCpGislandが存在し、この領域はＨ３のみが高アセチル化であ
ったが、ｍＲＮＡの検出できないH2Q10遺伝子の近傍はＨ３およびＨ４ともに低アセチル
化であった。また、ＲやSINE/B2反復配列付近はＨ３およびＨ４ともに低アセチル化に
保たれていた。ＥＳＣを分化させるとNPC、ＰＭＮともにOCB/4のプロモーター領域のみ
が著しくＨ３の脱アセチル化を受け、Oct3樫のコード領域やT℃P19とHbrの間のCpG
island、あるいトランスポゾン周辺の領域などはほとんど変化が認められなかった。これ
らの結果は分化時において､それぞれの遺伝子発現の変化に応じてプロモーター領域の数
kbpのみが限局的に制御されていることを意味する。そしてヒストンH3S10のリン酸化
は一般的には分裂期における染色体凝縮と関連することが知られているが間期において
も一部の遺伝子のプロモーターにおいて転写活性化と相関することが知られている｡その
ためＣｈｎウオーキング法で解析したところアセチル化とよく似たパターンでＯＣＢ/４の
プロモーター付近にピークが認められた。しかし転写活性の高いT℃P19やHbrのプロモ
ーター領域には認められないことからこの領域においてはＯＣＢ/４プロモーターに特異的
に修飾を受けていると考えられる。さらにOct3煙プロモーターでのH3S10リン酸化は
分化すると失われることから､分化における転写抑制と共に脱リン酸化も起きていること
を意味する。
５１
図34:ＥＳＣ分化時における核構造全体の変化およびZlnlCOct3/4遺伝子領域における局
所的なエビジェネテイックなマークの変化のモデル
（上段）グローバルな核構造の変化：クロモセンター(●)とＰＭＬボディ（○）のどちらの
核構造もＥＳＣからＮＰＣに分化する過程でサイズが小さくなり数が増大し､同時に細胞核は
肥大化する。しかしＰＭＮへの最終分化時にはクロモセンターは集積し１，２個程度の巨大
な点状の構造物へと変化する。一方ＰＭＬボディはＰＭＮではほとんど認められなくなる。
このときＰＭＮの細胞核のサイズは小さくなる。ＥＳＣ特異的にMHC-Oct3姪遺伝子領域(★）
がＰＭＬボディ周辺に局在化しており、このとき周辺部位にはHATであるｐ３００などのよ
うなクロマチン修飾に関与する因子が転写活性依存的に集積している。
（下段）MHCOc凪陛遺伝子領域におけるローカルなエピジェネテイックなマークの変化：
OCB煙遺伝子近傍のヌクレオソームをESC(オレンジ)、NPC(ピンク)、ＰＭＮ（黄）で表し
ている。ＥＳＣからＮＰＣヘのの過程でＯＣＢ/4遺伝子の周辺数ｋｂｐ特異的に転写活性化に関
与するヒストンのアセチル化やＨ３Ｋ４のメチル化などが消去される。ただしH3K4Me2のみ
はＮＰＣでもＥＳＣとほとんど変わらない。ＰＭＮへの最終分化の過程で転写抑制に関与する
H3K27のメチル化やＤＮＡのメチル化およびIｍｙの結合が起きる。
最近のいくつかの報告によればヘテロクロマチンの形成はES細胞から分化した細胞を作
り出す上で必須であることが報告されている(LeeetaL,2004)。また体細胞との細胞融合時
にＥＳ細胞が内在性に有しているその初期化能は、体細胞のグローバルなユークロマチン化
を促進する(Kimuraeta1.,2004)｡つまりユークロマチンとへテロクロマチンという両方のク
ロマチン構造の制御は共に幹細胞の維持と分化において重要な役割を果たしている。転写
不活性なクロモセンターが最終分化したＰＭＮで巨大なfOciへと統合されるのに類似した現
象が1Vb/oblastからMyotubeへの最終分化の段階でも起こることが最近報告された(Breroet
aL,2005)。これらは組織の違いによらず､細胞が分化する上で共通の仕組みが核内には存在
していることを強く示唆するものである。それに加えて今回ＥＳＣからＮＰＣへの分化過程
においては、クロモセンターが分散しサイズの小さな多くのfbciへとなることはヘテロク
ロマチンの形成は複数の制御機構が分化段階ごとに存在し機能していることを意味する。
Hsiehらの最近の報告では成体海馬由来の神経幹細胞をi7zUifmで分化させると、グリ
ア系列の細胞(アストロサイトとオリゴデンドロサイト）ではグローバルなヒストンの脱ア
セチル化が起こる一方で､ニューロンへ分化させたときはアセチル化のレベルは維持された
ままであり、さらにIrichostatinAやValproicacidなどの脱アセチル化阻害剤を添加すると
ニューロンへの分化が著しく促進されることがわかっている(HsiehetaL,2004)。今回の研
究でもＥＳＣからＮＰＣＰＭＮへと分化させたときにヒストンのアセチル化が維持されてい
たことから、初期胚および成体において､幹細胞からニューロンへ分化させた時の共通した
機構のようである。しかし核を分画したところクロマチンに強く結合している画分では
5７
H3K9Me3とH3K27Me3の著しい増大を認めたことから、分化におけるグローバルなレベル
でのクロマチンの変化はニューロンへの分化でもやはり起きていることを意味する。クロ
モセンターはＥＳＣとＮＰＣにおいH3K9Me3、H3K27Mel、HP1などが豊富に存在していた
がＰＭＮではH3K27MelとIr1は欠いていた。これらは細胞の種類によって同じヒストン
の修飾様式であっても転写などにたいして異なる意味を持つか､あるいは細胞分裂を繰り返
す幹細胞や前駆細胞に対して非分裂細胞であるニューロンなどではヘテロクロマチン/クロ
モセンターの維持機構がＨＰ1非依存性に行われている複数の可能性が考えられうる。興味
深い点としてニワトリでは成体でも有核型の赤血球を有し､血液前駆細胞からの分化成熟と
共にHP1の発現は消失してしまう一方で、ＭＥＮＴと呼ばれる別のクロマチン結合因子が最
終分化時に特異的に発現するようになり､へテロクロマチンの凝縮に関わっていることが報
告されている(GrigoryevetaL,1993;Gilberteta1.,2003)。ＰＭＮではHP1がユークロマチ
ン領域に分散していたという本研究の結果はＯＣＢ姪プロモーター部分にHP1Yが結合して
いた事実と共に考えた場合、分化した細胞では1ｍはヘテロクロマチンでなく、むしろユ
ークロマチン領域内での局所的な転写抑制に積極的に機能している可能性を強く示唆する。
MHC-OcB姪遺伝子領域がＥＳＣ特異的にＰＭＬボディ近傍に局在化する一方で、OCB/４
が転写不活性化なＮＰＣとＰＭＮではＰＭＬボディから明らかに離れていた。さらにＨＡｒ
とＨＤＡＣの両者がＥＳＣではＰＭＬボディ周辺部位に集積しており、転写阻害剤を用いた実
験からわかるように、これらクロマチンの修飾酵素はＲＮＡポリメラーゼⅡ依存性の転写
活性と相関してＰＭＬボディ近傍に存在する。これらの事実はＰＭＬボディの周辺部分にお
いてのOCB煙の転写状態は活性化と不活性化の両者が常に動的に均衡した状態であること
が考えられる。丹羽らの実験から人工的にＯＣＢ狸の発現レベルを調節した場合において、
わずか50％の転写量の増減でさえＥＳＣの未分化状態は維持できなくなってしまうことがわ
かっている(Niwaeta1.,2000)。このような狭い範囲内での転写量の調節には転写活性化だ
けでなく､活性化と抑制化の両者のバランスを常に流動的に調節することによってのみ保た
れうるものと考えられる。さらにＥＳＣから神経分化の過程でＰＭＬボディの数の減少、サ
イズの縮小が見られることはこの構造体が分化時における転写調節機構の変化に関与して
いることを示唆する。
過去に考えられていたような遺伝子がその領域近傍のクロマチンが大規模に凝縮させ、
ヘテロクロマチン様の構造を作ることで不活性化状態を長期にわたり安定に維持するとい
う概念は、最近のゲノムワイドな解析で明らかにされたようにクロマチンの凝縮度はその
クロマチン領域での転写活性とは相関せず､むしろ遺伝子密度の高さと強く相関するという
知見から修正を求められつつある（GUbertetaL,2004)。本研究で明らかになったように遺
伝子密度の高い領域に存在するOCB/4遺伝子座において、H3K27Me3のような不活性化の
マークがプロモーター領域1kbp以内、すなわちヌクレオソーム数個分でのみ起こる事実は
凝縮されたクロマチン構造を経ないでユークロマチン領域での長期の不活性化は行われう
る可能性を示すものであり前述のゲノムワイドの解析とも矛盾しないＤＯＣ田陛遺伝子の転
5８
写制御およびそれに関与するクロマチン関連の分子機構が生物学的にいかに重要であるか
については既に多くの報告例が存在する。核移植による体細胞クローンの成功率はOCB狸
の再活性化率に依存し、さらにOCB/4の再発現時にはＤＮＡの脱メチル化がおきており、
これらにはクロマチンリモデリング因子であるＳＷＩ/SNF複合体の活性が必要とされている
ことなどである（BoianietaL,2002;Hansiseta1.,2004;SimonssonandGurdon,2004)。
ＮＰＣにおいてＯｃｆ３狸は発現していないにもかかわらずH3K4Me2という転写活性な領域
特有のマークがＥＳＣと同レベルで維持されており、ＰＭＮへ分化してはじめてＤＮＡのメチ
ル化やH3K27Me3およびHP1Yの結合などが引き起こされる。このことはH3K4Me2が転写
不活性なOCB蛭遺伝子座においてさらなる抑制性のクロマチン構造形成を防いでいる可能
性を示唆している。転写不活性な領域におけるH3K4Me2の存在は赤芽球でのβLgI0bi"遺伝
子座においても報告されている(SclmeideretaL,2004)。ＤＮＡのメチル化は現在まで脱メチ
ル化酵素が発見されていないことからも明らかなように、もっとも長期にわたり安定な抑
制機構であると考えられる。Oct3煙遺伝子座におけるＤＮＡメチル化が多能性を有する幹
細胞であるＮＰＣでは認められず､最終分化したＰＭＮでのみ､認められることはOCB/4遺
伝子座が細胞の分化のステージを経て可塑性を徐々に失うごとに、エピジェネテイックな
修飾機構もまた徐々に不可逆的なものへと変化していく性質を有していることになる。興
味深いことに成体由来の神経幹細胞(NeuralstemceU)は培養条件によってOCB狸陽性の
ESC様の細胞へとmUiZjoで戻れることが示されている一方で、最終分化したＰＭＮは核移
植の成功率が生体内のあらゆる細胞の中で最も低いことが知られており、本研究における
ＯＣＢ樫遺伝子座の結果はこのような細胞の持つ可塑性の分子基盤としてのエピジェネティ
ックな修飾機構の重要性を反映しているものと思われる(qarkeetaL,2001;YamazakietaL，
2001)。
分化時における遺伝子座の核内動態を解析した例は、イムノグロブリンクラスターや
Th2サイトカインクラスターなどの遺伝子クラスターとよばれる領域を主な対象としてお
り、これらの領域では数個～数十個の遺伝子が協調的な制御を受け、転写不活性な状態な
ときにはクロモセンターや核膜などのようなヘテロクロマチン領域の近傍に遺伝子座が局
在化していることが過去に報告されている(BrownetaL,l99ZFrancasteletaL,2000;Kosak
etaL,2002)。しかしながら遺伝子密度の高い領域に存在するOCB/4遺伝子座では転写不活
性な状態のときでもクロモセンターや核膜などの近傍にはいなかった。最終分化時におい
てＯＣＢ/4遺伝子座に起きた変化はＤＮＡメチル化、ポリコーム遺伝子群によって修飾、認
識されるH3K27Me3の両方共にプロモーターのきわめて狭い領域にのみ見られた。同様に
ハエのUbX遺伝子座でもH3K27Me3およびボリコーム遺伝子群の結合領域はプロモーター
のきわめて限局された領域でのみ認められている(CaoetaL,2002)。これらのことからポリ
コーム遺伝子群は、周辺部位のクロマチン構造に影響せずに標的遺伝子のみを安定な抑制
状態にすることができる能力を有していることになる。さらにHP1サブフアミリーの中で
も、ＩｍＹは基本転写因子であるTyAFn130と相互作用しその活性を阻害することが報告され
5９
ている(VassalloandTmese,2002)｡FRAP(FluorescnecerecoveIyafterphotObleaching）によ
り分子の細胞内での移動速度を解析するとHP1およびポリコーム遺伝子群の両方共にm
DiDoではきわめて早い速度でクロマチンヘの結合と乖離を繰り返していることが明らかに
されており安定したクロマチン構造という古典的概念とは大きく隔たりがある(Cheutinet
aL,2003;FiczetaL,2005)。これらはユークロマチン領域でのHP1やボリコーム遺伝子によ
るクロマチン構造の変化はきわめて動的なものであり、その転写抑制は必ずしも凝縮され
た安定なクロマチン構造の形成に依存するものではないことを意味している｡またＰＭＬボ
ディとMHC-Oct3催との間の関連性は転写活性化もまた動的なバランスによって成立して
いることを示唆している。遺伝子密度の高いMHCOcl3煙領域での限局された領域での
ＤＮＡのメチル化やヒストンの修飾などは､OCB/4遺伝子ひとつのみを発生を通して安定か
つ動的な抑制状態を作り出すメカニズムの本質的な分子基盤であるものと考えられる。
９.結語：
本研究では、エピジェネテイックな分子メカニズムが遺伝子発現そのものよりも、
むしろ細胞の可塑性と深く関与する可能性をＯＣＢ樫遺伝子座をモデルとして示した。具体
的には可塑性が失われた分化度の高いニューロンではES細胞特異的な遺伝子でメチル化や
ヒストンのメチル化の消失などより高次的かつ複合的な抑制制御を受けるのに対し、ある
程度の分化の可塑性を維持した神経幹細胞ではより簡素なシステムにより抑制がなされる
点である。このように、細胞は抑制された遺伝子のエピジェネテイックな状態に差異を作
り出すことで再活性の頻度を調節しているのかもしれない。実際、神経幹細胞はニューロ
ンよりもはるかに核移植によるクローンマウス作出の成功率が高いことが知られており、
今回の知見は再生医学の分子基盤の理解に結びつく可能性を秘めている。興味深いことに
最近、クロモセンターの配置転換は血液系や筋肉系の細胞でも同様のパターン変化を示す
ことが国外のグループから相次いで報告されており、細胞系譜あるいは胚葉を超えた、普
遍的な分化の共通則を見出せる可能性が今後期待される(BaxteretaL,2004;BreroetaL，
2005)。本研究ではこれまで初期胚における細胞の確保などの技術的な問題からアプローチ
が難しかった発生学やエビジェネテイクスの研究分野と、本来これとは独立して展開され
てきた核構造に関する研究分野とを、融合させたことにも大きな意義がある。核内構造が
発生・分化の側面においても重要な役割を果たしており、その再編成機構がエピジェネテ
ィクス制御と高次に結びつくという新規概念を提示した。
6０
10.参考文献：
Abeyta,ＭＪ.,qark,Ａ皿,Rodriguez,Ｒ皿,Bodnaｴ>Ｍ､S､,Pera,Ｒ､Ａ､,andFirpo,Ｍ皿
UniquegeneexpressionsignaturesofmdependenUy-derivedhumanembryonicstemceU
lines・HDJ".MOI.Ｇ師et､１３:601-608,2004.
AubertJ.,Stavridis,Ｍ､E,TWeedie,Ｓ､,O0ReiU】ＤＭ.,Ⅵerlinger》Ｋ､,Ｌｉ,Ｍ,Ghazal,Ｒ,Pratt，
Ｔ,Mason,J0.,Ｒｏヌ，.,andSmith,Ａ・
ScreeningfOrmanⅡnalianneuralgenesviafluorescence-activatedceUsorterpurificationof
neuralprecursorsfromSoxl-gfPknockmmice・Proc､MEtJ・AcowJ・Sci､ＵＳＡ100:SuppL1，
11836-11841,2003.
Bannistel>ＡＪ.,Zegerman,Ｅ,Partridge,J､F､,Miska,Ｅ､Ａ､,Thomas,J､0.,AUshire,Ｒ､Ｃ,and
Kouzarides,T
Selectiverecognitionofmethylaｔｅｄｌｙｓｍｅ９ｏｎｈｉｓｔｏｎｅＨ３ｂｙｔｈｅＨＰ１chromodomain、
IWtw花410:120-124,2001.
Barberi,Ｔ,K1ivenyi,Ｒ,Calmgasan,Ｎ・Yb,Lee,Ｈ､,Kawamata,Ｈ,Loonam,Ｋ､,Perrie口Ａ､L,，
Bruses,Ｊ,Rubio,Ｍ､Ｅ,Tbpf,Ｎ､,ｎbar)Ｖ,Harrison,Ｎ､L､,Bea1,ＭF.,Moore,Ｍ､Ａ,and
StudePL、
NeuralsUbtypespecificationoffertilizationandnucleartransferembryonicstemcellsand
appUcationinparkinsomanmice､Mut6BiotBchm1.21:1200-12oz2003.
BaxteqJ.,Sauer>Ｓ､,Peters,Ａ､,John,Ｒ`,WnUams,Ｒ､,CaparroS,ＭＬ.,Arne】6Ｋ.,Otte,Ａ､，
Jenuwein,工,Merkenschlagel)Ｍ､,andFishe巧Ａ・G
Histonehypomethylationisanmdicatorofepigeneticp1asticitymquiescentlymphocytes・
EMBOJ23:4462-4472,2004.
Boiani,Ｍ､,EckardLS.,Scholer)Ｈ､R､,andMcLaughlinKJ・
Oct4distributionandlevelmmouseclones:consequencesfOrp1uripotencybGey9eSDeD.１６：
1209-1219,2002.
Bregman,ＤＢ.,Ｄｕ,Ｌ､,vanderZee,Ｓ､,andWarren,Ｓ,L、
Transcription-dependentredistributionofthelargesubunitofRNApolymeraseⅡto
discretenucleardomainsJ5CcJＪＢｉｏ1.129:287-298,1995.
Brero,Ａ､,Easwaran,Ｈ､E,Nowak,，.,Grunewald,Ｌ,Creme叫工,Leonhardt,Ｈ､,and
6１
CardosqMC、
MetllylCpG~bmdingproteinsmducelarge-scalechromatinreorganizationduringteIminal
differentiationﾉ､α〃ＢｉｏＪ.169:733-743,2005.
Brown,Ｋ,Ｅ,Guest,Ｓ､S､,Smale,Ｓ・正,Ｈａｈｍ,Ｋ,,MerkenschlageZ,Ｍ､,andFishe町Ａ・Ｇ，
AssociationoftranscriptionaUysUentgeneswilhlkaroscompIexesatcentromenc
heteroChromatinCeJJ91:845-854,1997
CaO,Ｒ､,Wang,Ｌ､,Wang,Ｈ,,Xia,Ｌ､,ErdjumentBromage,Ｈ､,TbmpsbE,Jones,Ｒ､S､,and
Zhang,Yb
RoleofhistoneH31ysme27methylationmPolycomb-groupsnencing.ＳCie"CB298：
1039-1043,2002.
Cheutin,正,MCNairn,Ａ加Jenuwein,、,Gilbert,Ｄ・皿,Singh,ＥＢ.,andMisteli,T
MaintenanceofstableheterochromatmdomainsbydynamicHP1bmding.ＳCie"“299：
721-725,2003.
Chin3R.Ｗ,DeUaire,Ｇ,ＥｓｋｉＷＣＨ.,andBazettJones,、ｎ．
PMLbodies:ameetmgp1acefbrgenomicloci?ＪＣＣＩＪＳｃｉ､11ａ847854,2005.
C1arkeD.L､,Johansson,ＣＢ.,WUbertz,』.,Veress,Ｂ､,NUsson,Ｅ､,Karlstrom,Ｈ､,LendahLU，
andFrisenJ
Generalizedpotentialofadultneuralstemcells､ScieP8“288:1660-1663.2000.
CookしER
Theorganizationofreplicationandtranscription
Scie12cB284:1790-1795,1999.
Deb-Rinke易Ｅ,IDG、,Jezierski,Ａ､,SikorskaM.,andWalke町ＥＲ・
SequentialDNAmethylationoftlleNanogandOcﾄ４upstreamregionsinhumanNmceUs
duringneuronaldifferentiationJBBjoJ､Ｃｈａ".280:6257と6260,2004.
Ficz,Ｇ,Hemtzmann,Ｒ､,andAmdtJovin,ＤＪ・
Polycombgroupproteincomp1exesexchangerapidlymUvmgDrosophila､DewJo伽師t
l32:3963-3976,2005.
6２
Francastel,Ｃ､,SchubelenD.,Martin,Ｄ､1.,andGroudine,Ｍ・
NuclearcomparbnentanzationandgeneactivitybMUtbReD､MOI.α"・BioJ・I:137-143,2000.
FUjita,Ｎ､,mkebayashi,S､,Okumura,Ｋ,Kudo,S､,Chiba,Ⅱ,Saya,Ｈ､,andNakao,Ｍ・
Methylation-mediatedtranscriptionalsUendngmeuchromatmbymethyl-CpGbindmg
proteinMBD1isofOrms・MDI.CBI【・BjoM9:6415-6426,1999.
Gassel>Ｓ､Ｍ・
VisualizingChromatindynamicsmmterphasenudeiScie10ce296:1412-1416,2002．
Gilbert,Ｎ,,Boyle,Ｓ､,Fiegler>Ｈ､,WOodfine,Ｋ､,CarteDN.Ｒ,andBickmore,ＷＡ・
Chromatinarchitectureofthehumangenome:gene-richdomamsareenrichedmopen
chromatinfibers,CbII118:555-566,2004．
GUbert,Ｎ､,Boyle,Ｓ､,Sutherland,Ｈ,,deLasHeras小AUan,J､,Ienuwein,Ⅲ,andBickmore，
ＷｂＡ，
FormationoffacultativeheterochromatinmtheabsenceofHP1・
EMBOJ22:5540-5550,2003.
GilberbN.,Boyle,ｓ､,FiegleDH.,WOodfine,Ｋ､,Cartel>Ｎ､PL,andBickmore,ＷＡ・
Chromatinarchitectureofthehumangenome:gene-richdomamsareenrichedinopen
chromatinfibers,CeII118:555-566,2004.
GrigoryelGS.Ａ､,andWOodcock,ＣＬ・
Stage-specificexpressionandlocalizationofMENZanudearprotemassociatedwith
ChromatincondensationinterminaUydifferentiatingavianerythroidcells．
E”.αJIRes､206:335-343,1993.
Hansis,Ｃ,Barreto,Ｇ,MaltryN.,andNiehrs,C
NuclearreprogrammingofhumansomaticcellsbyxenopuseggextractrequiresBrgL
C8dmBio1.14:1475-1480,2004.
Heard,Ｅ,RougeuUe,Ｃ,Amaud,，.,AvneI>Ｒ,A1Us,Ｃ､，.,andSpectoIPL、
MethylationofhistoneH3atlys-9iｓａｎｅａｒｌｙｍａｒｋｏｎｔｈｅＸｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｄｕringX
mactivation.α〃107:727と738,2001.
Hochedlingel》Ｋ､,Yamada,Ｙｂ,Beard,Ｃ,andJaemsch,Ｒ、
6３
EctOpicexpressionofOct-4bloCksprogenito形ceUdifferentiationandcausesdysplasiain
epitheUaltissues・CEJI121:465-47Ｚ2005.
Horton,Ｒ､,Wilming,Ｌ､,Rand,Ｖｂ,Lovering,Ｒ､ｃ,BrufOrd,ＥＡ.,Khodiyal》Ｖ【Ｋ､,Lush,ＭＪ.，
Povey》Ｓ､,mlbot,ｃｃ､JrB,Wright,Ｍ・WWVain,Ｈ､Ｍ,,Trowsdale,Ｊ,ZieglenA.,andBeck,Ｓ、
Genemapoftheextendedhumann征ＩＣ,MutbReD.Ｇ“et65:889-899,2004.
HsiehJ.,Nakashima,Ｋ､,Kuwabara,Ⅲ,Mejia,Ｅ､,andGage,EH
HistonedeacetylaseinhibitioLmediatedneuronaldifferentiationofmultipotentadult
neuralprogemtorceUs､Ｐｍｃ･IWtJ･ＡＣＭ・Ｓα･ＵＳＡ101:16659-16664,2004.
Ichimura,、,Watanabe,S､,Sakamoto,Yb,AotOm,FUjita,Ｎ､,andNakao,M
TranscriptionalrepressionandheterochromatinfOnnationbyMBD1aｎｄＭＣＡＦ/AM
familyproteins・JBBioJ.ｑｉ”､280:13928-13935,2005.
Irvme,Ｒ､Ａ､,Lin,I.Ｇ,andHsieh,CL
DNAmelhylationhasalocaleffectontranscriptionandhistoneacetylation
MDJ・ＣｅＪｌＢｊｏ1.22:6689-6696,2002.
Jenuweinm,AUis,ＣＤ、
Translatmgthehistonecode.Ｓ箆醜Ce2g3:1074-1080,2001.
Kawasaki,Ｈ,,Mizuseki,Ｋ､,Nishikawa,Ｓ､,KanekO,ｓ,,Kuwana,Ｙ,Nakanishi,ｓ､，
Nishikawa,Ｓ・I.,andSasai,Ｙｂ
InductionofmidbraindopaminergncneuronsfromEScellsbystromalcell-derived
mducingactivitWW1um"28:31-40,2001.
Kent,ＷＪ.,Hsu,Ｅ,Karolchik,，.,Kuhn,Ｒ､Ｍ,qawson,Ｈ､,Trumbowm,Ｈ､,andHaussleP
D，
Exploringr巴lationshipsandminingdatawiththeUCSCGeneSorteLGeｿ、抗eReS､１５：
737と741,2005.
Kimura,Ｈ,mda,Ｍ､,NakatsUji,Ｎ､,andmdam
HistonecodemodificationsonpluripotentialnucleiofreprogrammedsomaticceUs・MOI．
αILBjoJ､２４:5710-5720,2004.
６４
Kosak,Ｓエ,Skok,J､Ａ､,Medma,Ｋ､L､,Riblet,Ｒ､,LeBeau,Ｍ､Ｍ､,ＦｉｓｈｅｚＡＧ,andSmgh,Ｈ，
SubnudearcompartmentalizationofimmunoglObulinlociduringlymphocyte
development､Scie"Ce296:158-162,2002.
Kremensko】ＧＭ.,Kremenska,Ｙｂ,Ohgane,J､,Ｈａ廿ori,Ｎ､,mnaka,Ｓ､,HashizumeK.,and
Shiota,Ｋ､、
Genome-wideanalysisofDNAmethylationstatusofCpGislandsinembryoidbodies，
teratomas,andfetuses､BioChe"Z･BjOPhyS・ＲＣＳ・ＣＯ"91"""､311:884-890,2003
Ladurne口Ａ､Ｇ,Inouye,Ｃ,Jain,Ｒ,andTiian,Ｒ，
Bromodomainsmediateanacetyl-histoneencodedantisilencingfUnctionat
heterochromatinboundaries､MOI､ＣＣＩＪ１１:365-376,2003.
Lee,ＪＨ.,Hart,Ｓ､R,,andSkalnik,Ｄ・G
Histonedeacetylaseactivityisrequiredforembryonicstemcelldifferentiation・Ｇｅ鯉siS38：
32-38,2004.
Lee,ＳＨ.,Lumelsk)6Ｎ.,StudepL.,Auerbach,J､Ｍ､,andMcKa】ＧＲ.Ｄ、
EfficientgenerationofmidbrainandhindbrainneuronsfrommouseembryonicstemceUs・
NUufBjo蛇ＣＩＩ"０J､１８:675-679,2000.
Li,Ｅ､,Bestor>ｍＨ.,andJaenisch,R
nrgetedmutationoftheDNAmethyltransferasegeneresultsinembryomcleIhality;α〃
69:915926,1992.
Ｌund,Ａ､Ｈ､,andvanLohuizen,M
Epigeneticsandcancer.Ｇ“esDeD.１８:2315-2335,2004.
Nichols,J､,Zevnik'Ｂ､,AnastassiadiS,Ｋ,Ｎｉｗａ,Ｈ､,Klewe-Nebenius,Ｄ,Chambers,I.，
ScholepH.,Smith,Ａ､，
Fonnationofp1uripotentstemceUsinthemammalianembryodependsonthePOU
transcriptionfactorOct4・CBII95:379-391,1998.
Ｎｉｗａ,Ｈ､,Masui,Ｓ,Chambers,Ｌ,Smith,Ａ・Ｇ.,Miyazaki,J､，
Phenotypiccomp1ementationestEdiishesrequlrementsforspecificPOUdomainand
generictransactivationfunctionofOctB/4membryonicstemceUs､MOJ.Ｃｅ"､Ｂｉ01.22：
6５
1526-1536,2002.
Niwa,Ｈ､,Miyazaki,Ｊ,andSmith,Ａ・Ｇ・
QuantitativeexpressionofOct-3/4definesdifferentiation,dedifferentiationorselfLrenewal
ofEScells,MUt・GeT8ef24:372-376,2000.
Nordhoff,Ｖ,Hubne】ﾛ,Ｋ､,Bauel》Ａ､,Orlova,Ｌ,Malapetsa,Ａ､,andScholer>ＨＲ・
Comparativeanalysisofhuman,bovine,andmurineOct-4upstreampromotersequences・
MUI沈沈.GeTzo擁12:309-317,2001.
Okano,Ｍ,,BeU,、.Ｗ８，Habez,，.Ａ､,ａｎｄＬｉ,E
DNAmethyltransfErasesDnmt3aandDnmt3bareessentialfbrdenovomelhylationand
mammaliandevelopment､CeJJ99:247-257,1999.
Peters,Ａ､Ｈ,Kubicek,S､,MechUepK.,OSumvan,ＲＪ.,Derijck,Ａ､A､,Perez-Burgos,Ｌ､，
Kohhnaie口Ａ,,OpraviLS.,mchibana,Ｍ､,Shinkai,Ｙｂ,Martens,〕.Ｈ､,andJenuweinm
Partitioningandp1asticilyofrepressivehistonemethylationstatesmmammalian
chromatin・ＭＤＬＣｅｌＩ１２:1577-1589,2003.
Ramos-Mejia,V:,Escalante-A1calde,，.,Kunathm,Ramirez,Ｌ､,Gertsenstein,Ｍ､,Ｎａg〕5Ａ.，
andLomeu,Ｈ，
PhenotypicanalysesofmouseembryCswithubiquitousexpressionofOct4:effcctson
mid-hindbrainpatterningandgeneexpression・ＤＢＵ.Ｄｙ"､232:180-190,2005.
Remboutsika,Ｅ,Lutz,Ｙ,GansmuUepA.,VOnesch,J､L､,Losson,Ｒ,andChambon,R
TheputativenuclearreceptormediatorTImalphaistightlyassociatedwitheuchromatin，
JCeJIScj､112:1671-1683,1999
ＲＯＳＳ,S､Ａ､,McCaffer】GRJ.,ＤｒａｇｅｚＵＣ,andDeLuca,Ｌ・M
Retinoidsinembryonaldevelopment､Physiol･Reu､８０:1021-1054,2000.
Schneide喝Ｒ,Bannistel》ＡＪ.,Myers,F､Ａ,,Thorne,ＡＷ,Crane-RObmson,Ｃ,and
Kouzarides,m
HistoneH31ysme4methylationpatternsmhighereukaryoticgenes・NbUfCelIBio1.6：
73-77>2004.
6６
Simonsson,Ｓ､,andGurdonJ
DNAdemethylationisnecessaryfortheepigeneticreprogrammingofsomaticceUmudei・
IWt､CeJJBjo1.6:984-990,2004.
Spada,Ｅ,ⅥncenbM.,ａｎｄThompson,Ｅ､Ｍ．
ＰlasticityofhistonemodificationsacrossthemvertebratetovertebratetransiIion:histone
H31ysine4trimethylationinheterochromatin.Ｃh扣加ＣＳＯ”eRes､１３:５Ｚ72,2005.
Stavridis,ＭＥ,ａｎｄSmith,Ａ,Ｇ、
Neuraldifferentiationofmouseembryonicstemcells､BiochelDD･SocblimzS､３１:45-49,2003.
Tachibana,Ｍ,Sugimoto,Ｋ､,Nozaki,Ｍ､,Ueda,J,Ohta,王,Ohki,Ｍ,,Fukuda,Ｍ,Tthkeda，
Ｎ､,Niida,Ｈ､,Kato,Ｈ､,andShinkaLYb
G9ahistonemethyltransferasep1aysadominantroleineuchromatichistoneH31ysine9
methylationandisessentialforearlyembryogenesis.Ｇ…ｓＤｅｕ､１６:1779-1791,2002.
VassaUo,Ｍ､F､,andmnese,Ｎ・
IsofOrm-specificinteractionofＨＰ１ｗｉｔｈｈｕｍａｎＴＡＦｎ１３０､Ｐ７ｏｃ･MEtl･ＡｍｃＪ・Sci・ＵＳＡ９９：
5919-5924,2002.
Ｗan9,Ｊ,Shiels,Ｃ,Sasieni,PWVu,ｎJ.,Islam,Ｓ､Ａ､,Freemont,ＥＳ,andSheerD・
PromyeloCyticleukemianuclearbodiesassociatewithtranscriptionallyactivegenonuc
regionsJbCeIIBioI,164:515-526,2004.
Yamazaki,Yb,MakinqH.,Hamaguchi-Hamada,Ｋ､,Hamada,S,,Su駒o,Ｈ､,KawaseE，
Miyata,Ⅲ,ＯｇａｗａＭ.,Yanagimachi,Ｒ､,andYagi,m
AssessmentofthedevelopmentaltotipotencyofneuralceUsmthecerebralcortexofmouse
embryobynucleartransfeLPmc・IVbu〃､ACUWJ､SCi､ＵＳＡ９８:14022-14026,2001.
Ymg,ＱＬ.,andSmilh,Ａ・Ｇ
DefinedconditionsfOrneuralcommitmentanddifferentiationMb鋤oolS動zy"、J､365：
327-341,2003.
6７