日本語マニュアル

本品は研究用試薬です。In vitroでのみご使用下さい。
mRNA Capture Kit
total RNAや細胞ライセート、組織破砕物からPCRチューブ中でポリ[A]RNAをキャプチャーします。
製品番号 1787896 192回反応
2004年10月
保存温度：2∼8℃
キット構成
1. Lysis Buffer
Ready-To-Use 溶液
2%以下のドデシルサルコシルを含む
2. Oligo[dT] 20
ビオチン標識
20 倍濃縮
5 nmol オリゴヌクレオチドを含む
3. Nuclease-free redist. water
4. Washing Buffer
Ready-To-Use 溶液
5. Streptavidin-coated PCR Tubes (strips)
6. Cap for the PCR Tubes (strips)
1×50 ml
半透明ボトル
1×50μl
半透明カップ
赤色キャップ
1×1 ml
半透明カップ
半透明キャップ
半透明ボトル
5×100 ml
24×8
24×8
保存と安定性
2∼8℃に保存した場合、キットラベルに記載の使用期限まで安定です。ワーキングソリュ
ーションの安定性は、セクション 4.2.1 をご覧下さい。
ストレプトアビジンコート PCR チューブの特徴
ストレプトアビジンコート範囲：200μl
総ビオチン結合能：15 ng/チューブ（200μl）
個々のチューブ間のコート偏差：SD＜5％
ノート： 仕様書での結合能力は、結合部位の数に相当します。
mRNA Capture Kit の特長
・簡単で迅速：ワンチューブリアクションです。
・多様的：少数から多数サンプル、半自動処理にも対応します。
・効率的：mRNA をロスしません。
・経済的：低コストな操作ステップです。
1. イントロダクション
通常の RT-PCR では、細胞ライセートや組織破砕物はポリメラーゼ阻害物を多く含むた
め、精製トータル RNA や mRNA を出発材料とします。経済的で簡便にサンプル抽出と
RT-PCR を組み合わせるために、mRNA Capture Kit を開発しました。細胞、組織、ト
ータル RNA を出発材料とします。3’末端にポリ[A]を持つ RNA は、ライシスステップで
細胞から遊離されます。mRNA のポリ[A]は、ビオチン標識[dT] 20 タグとハイブリダイズ
します。オリゴ[dT] は 2 つの機能を持ちます。
1. ストレプトアビジンコート PCR チューブ内でポリ[A]RNA をキャプチャーします。
2. ライセート上清を洗浄した後に、逆転写反応のプライマーとなります。
mRNA の固定後、逆転写反応ミックスを追加して、そのまま逆転写出来 ます。次のステ
ップで、逆転写反応ミックスを PCR ミックスに置換します。標識ヌクレオチド（DIG 標
識、フルオレセイン標識） の有無に関わらず 、PCR 反応が可能で、一般的 なゲル電気泳
動や ELISA などで検出出来ます。
逆転写酵素と耐熱性 DNA ポリメラーゼを用いた 2 ステップ RT-PCR に変わり、TthDNA
ポリメラーゼや適当な酵素の組み合わせによる 1 ステップ RT-PCR を行うことが出来ま
す（3）。
2. アプリケーション
トータル RNA、溶解後の細胞や組織からのポリ[A]RNA のキャプチャーと、ストレプト
アビジンコート PCR チューブ内での固層化が行われます。固層化された mRNA は定性
RT-PCR や定量 RT-PCR に使用出来ます。
3. テスト方法
トータル RNA、細胞、組織
細胞や組織の破砕および溶解
ビオチン標識オリゴ[dT] 20 プローブとのハイブリダイゼーション
ストレプトアビジンコート PCR チューブでの固層化
洗浄
RT-PCR
4.装置と溶液
4.1 追加で必要となる装置
PCR サーマルサイクラー ； ミネラルオイル （特 殊な サーマルサイクラーの 場 合に 限
る）；ピペット；滅菌エアフィルターつきチップ；希釈バッファーを準備するための滅菌
カップ；21 ゲージ針；乳鉢と乳棒（組織を出発材料として用いる場合）；DNA 電気泳動
装置、もしくは PCR ELISA などの PCR 検出装置
ノート： RNA を抽出する材料が RNase を混入していない事を確認して下さい。デコンタ
ミネーションの操作方法は文献（1、2）で紹介されています。
4.2 キット 構成物の準備と安定性
4.2.1 ワーキングソリューション
溶液 1：Lysis Buffer（ボトル 1）
Ready-To-Use 溶液です。2∼8℃ で保存した場 合、キットラベルに記載されている使用
期限まで安定です。
溶液 2a：Oligo[dT] 20, biotin-labeled（ボトル 2）
2∼8℃で保存した場合、キットラベルに記載されている使用期限まで安定です。
溶液 2b：Oligo[dT] 20, biotin-labeled; working solution
2a の 適 切 な 量を 、滅菌蒸留水 （ボトル 3）で 希釈 します（ 1： 20）。 1 反 応 あたり
Oligo[dT] 20 の 4μl が必要です。ワーキングソリューションは出来るだけ用時調製して下
さい。-20℃で保存しますが、凍結融解の反復は避けて下さい。
溶液 3：ヌクレアーゼフリー滅菌蒸留水（ボトル 3）
ヌ ク レ ア ー ゼ フ リ ー滅 菌 蒸 留 水 は 、溶 液 2b： Oligo[dT] 20, biotin-labeled; working
solution（溶液 2b）を準備するために必要です。ヌクレアーゼや 微生物のコンタミネー
ションを避けて下さい。
溶液 4：Washing Buffer （ボトル 4）
Ready-To-Use 溶液です。2∼8℃ で保存した場 合、キットラベルに記載されている使用
期限まで安定です。
4.2.2 RT-PCR に必要な溶液
逆転写反応ミックス；本キットでは提供されません
mRNA の逆転写に 適当な 酵素 （AMV や M-MuLV ）が使用出来ま す。もちろん、RTPCR ステップを 1 反応ミックスに組み込むために、逆転写酵素と耐熱性ポリメラーゼ酵
素（Tth など）も使用出来ます。大部分の供給元は酵素と共に適当なバッファーを供給し
ています。お客様が独自にミックスを調整される場合は、Sambrook et al.（2）で解説さ
れる組成を推奨します。
1 ml の準備
204.1μl 10 mM Tris-HCl, pH 7.4
51.0μl 1 M Tris-HCl, pH 8.3 (42℃)
142.9μl 1 M KCl
40.8μl 250 mM MgCl2
102.0μl dNTPs, 各10 mM
40.8μl 100 mM DTE
20.0μl RNaseインヒビター(40 U/μl)*
398.4μl redist.water
32.0μl AMV reverse transcriptase (25 U/μl)*
このミックスは用時調整して下さい。
PCR ミックス；本キットでは供給されません
cDNA の増幅には、 様々な 酵素 や酵素 ミックス（Taq DNA Polymerase や Expand1）
Long Template PCR System など）が使用出来ます。大部分の供給元は酵素と共に適当
な バ ッ フ ァ ー を 供 給 し て い ま す 。 お 客 様 が 独 自 に ミ ッ ク ス を調 整 さ れ る 場 合 は 、
Sambrook et al.（ 2）で解説される組成を推奨します。
5. 操作
5.1 一般的条件
ノート： 出来る限り、RNA と扱う溶液や装置を RNase フリーに保ちます。実験用ガラス
器具は 180℃で 8 時間感熱滅菌処理をします。プラスチック器具は DMDC（ジメチルジ
カーボネイト）で処理しなければなりません。シールされた プラスチック器具 は RNase
フリーのものを使用します。キットに含まれない RNA と接する全ての溶液類は、可能な
限り RNase を除去するために DMDC で処理しなければなりません。
Tris バッファーは DMDC 処理出来ません。Tris バッファーは DMDC 処理水を使用して
調製し、オートクレーブします。DMDC や DEPC 処理は 0.1％（ v/v）溶液を用い、 15∼
25℃で 30 分間インキュベートします。溶液中の余剰な DMDC や DEPC はオートクレー
ブにより破壊されます。
装置や溶液のコンタミネーションを避けるために、使い捨て手袋を装着します。
非常に低コピー数の DNA でも、PCR は超高感度な DNA 増幅方法です。PCR チューブ
でキャプチャーされた mRNA はごく僅かな DNA のコンタミネーションの可能性があり、
その場合、特異的な cDNA が存在しなくても陽性シグナルを示します 。このような偽陽
性を避けるために、PCR にはイントロン領域を跨ぐプライマーの使用を推 奨します。コ
ントロール反 応は、逆転写反応ミックスから 逆転写酵素を除去している事 により、 PCR
産物の結果ではありません。
5.2 出発材料の準備
トータル RNA：40μg のトータル RNA を 200μl のライシスバッファーで希釈します。
培養細胞：細胞（最高 5×105 個）を氷冷した PBS バッファーで 2 回洗浄します。細胞 ペ
レットに 200μl のライシスバッファーを加えます。21 ゲージ針を 6 回通すことにより、
DNA を機械的に剪断します。
組織：瞬間凍結（液体窒素など）させた組織 20 mg を、あらかじめ冷却したモーターで
均質なパウダーにします。材料が融解 しないようにして下さい。 200μl のライシスバッ
ファー（予め塩化ナトリウムで 0∼-4℃冷却）に凍結粉末を加えます。21 ゲージ針を 4 回
通して均質にし、その後 11000× g で 30 秒間スピンダウンします。次のステップのため
に上清を除去します。ハイブリダイゼーション、固層化、洗浄ステップ は 0∼ 4℃で行い
ます。
5.3 mRNA とビオチン標識オリゴ[dT] 20 のハイブリダイゼーション
サンプルに Oligo[dT] 20, biotin-labeled; working solution を 4μl 加え、組織サンプルは 2
∼8℃で、トータル RNA や培養細胞の場合は 37℃で 5 分間インキュベートします。
5.4 ストレプトアビジンコート PCR チューブへのポリ[A]RNA の固定
5.3 のミックスの 50μl をストレプトアビジンコート PCR チューブに加え、組織サンプ
ルの場合は 2∼8℃で、培養細胞やトータル RNA の場合は 37℃で 3 分間インキュベート
します。
5.5 洗浄
チューブからミックスを除去し、250μl の洗浄バッファー（ボトル 4）を用いて 3 回洗浄
します。
各ステップで洗浄バッファーが確実に除去されているか確認して下 さい。mRNA のロス
を避けるため、過激な洗浄は行わないで下さい。
キャプチャーした mRNA は直接逆転写反応と増幅反応に使用出来ます。
10.2 操作方法フローシート
1
6 ダウンストリームアプリケーション
6.1 ファーストストランド cDNA の合成
50μl の逆転写反応ミックスをチューブに加え、適当な温度 と時間（逆転写酵素に依存し
ます）でインキュベートします（供給元のプロトコールに従って操作して下さい）。逆転
写反応に逆転写反応ミックス （本説明書 で説明するもの）を使用 する場合、 42℃で 120
分インキュベートします。
ステップ
出発材料の準備
a） ト ー タ ル
RNA
b）培養細胞
c）組織
6.2 洗浄
逆転写反応ミックスを除去し、250μl の洗浄バッファー（ボトル 4）を用いて洗浄します。
6.3 PCR
チューブに PCR ミックスを加え、PCR を開始します。個々のプライマー毎に最適なスタ
ンダードなプロトコールは、第一サイクルとして、92℃5 分間、 50℃ 2 分間、72℃3 分間、
続くサイクルは、94℃ 1 分間、50℃ 2 分間、 72℃ 3 分間（これを 40 サイクルまで）、最
後のサイクルとして、 94℃1 分間、 50℃ 2 分間、 72℃ 10 分間を 行います。PCR 産物を
ELISA などで検出する場合は、PCR 過程で PCR-ELISA（DIG-Labeling）の使用を推奨
致します。
6.4 PCR 産物の検出
6.4.1 電気泳動とエチジウムブロマイド染色
確立されたプロトコール（2）に従って操作して下さい。
6.4.2 ELISA
PCR 産物が DIG 標識されていた場合、PCR ELISA（DIG-Detection）を用いて検出出来
ます。詳細な操作方法は、製品説明書をご覧下さい。
図 1：K562 細胞発現したβアクチンの検出
全ての細 胞ライセート は、 セクション 5 に記 載された希釈 および ビオチン標識 オリゴ
[dT] 20 とのハイブリダイズの方法で準備されました。RT-PCR は逆転写酵素 AMV と Taq
DNA Polymerase を用いて、2 ステップで行われました。
上流プライマー：CCA AGG CCA ACC GC GAGA AGA TGA C
下流プライマー：AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C
-RT：逆転写反応ステップで逆転写酵素を使用しない
7. 結果解説
RT-PCR 後の PCR 産物の存在は、サンプル中に相当する mRNA が含まれていることを
示します。定量 RT-PCR に適当なプロトコール をお持ちであれば、サンプル中の特異的
mRNA の定量ももちろん可能です。
8. 追加情報
出発材料
培養細胞
脳組織（マウス）
肝組織（マウス）
肺組織（マウス）
107 個細胞もしくは 100mg
組織当りのトータル RNA
30∼500
200
700
130
107 個細胞もしくは 100mg 組織
当りの mRNA
0.3∼ 25
7
14
10
9.リファレンス
1 Farrell, R. E.(1993) RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and
Characterization.
Academic Press, New York.
2 Sambrook, J., Fritsch, E, F., & Maniatis, T. (1989): Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
3 PCR Applications Manual, available from Roche Molecular Biochemicals.
ISBN 3-88630-195-8
10. クイックリファレンスプロトコール
10.1 必要な溶液
溶液
組成
1
2a
Lysis Buffer（ボトル 1）Ready-To-Use
Oligo[dT] 20, biotin-labeled （ ボ ト ル 2 ）
stock solution
Oligo[dT] 20,
biotin-labeled;
working
solution
ヌクレアーゼフリー滅菌蒸留水（ボトル 3）
Washing Buffer（ボトル 4）Ready-To-Use
逆転写反応ミックス（本キットでは提供して
いません）
PCR ミックス（本キットでは 提供していま
せん）
2b
3
4
5
6
2
ビオチン標識オ
リゴ[dT] 20 との
ハイブリダイゼ
ーション
3
固層化
4
洗浄
5
6
ファーストスト
ラ ン ド cDNA
の合成
洗浄
7
PCR 反応
8
検出
操作
トータル RNA の 40μg
を溶解バッファーで 希釈
します。
PBS で細胞を洗浄： 5×
105 個細胞のペレットに
ライシスバッファー を加
え、21 ゲージ針を 6 回
通します。
液体窒素で凍結させた組
織 20 mg を乳鉢で 均一
な 粉 末に し、 21 ゲ ー ジ
針を 4 回通します。
11000×g で 30 秒スピン
ダウンします。上清 を除
去します。
ビオチン標識オリゴ
[dT] 20 ワーキングソリュ
ーション （溶 液 2b） を
加えて、インキュベート
します。
ハイブリダイゼーション
ミックスをストレプトア
ビジンコート PCR チュ
ーブに移し、インキュベ
ートします。
チューブからミックスを
除去し、洗浄バッファー
（溶液 4）で 3 回洗浄し
ます。
逆転写反応ミックス を加
えてインキュベート しま
す。
チューブからミックスを
除去し、洗浄バッファー
（溶液 4）で 3 回洗浄し
ます。
PCR ミ ッ ク ス を 加 え
PCR プログラム 1 を開始
します。
容量
200μl
時間/温度
2∼8℃
200μl
2∼8℃
200μl
0∼-4℃
4μl
250μl
37℃ （ 培 養 細 胞 ・
トータル RNA）で
5分
2∼ 8℃で 5 分 （組
織）
37℃ （ 培 養 細 胞 ・
トータル RNA）で
5分
2∼ 8℃で 5 分 （組
織）
15∼25℃
50μl
42℃で 120 分
250μl
15∼25℃
50μl
確立された方法に従 って
電気泳動と染色（レファ
レ ン ス 2） 、 あ る い は
PCR ELISA 2 を 行 い ま
す。
1 ここで説明したプログラムは単に第一選択肢としてのプロトコールです。しかし、最適
な結果のためのサイクルパラメーターはアプリケーション毎に調節しなければなりません。
サーマルサイクラーのタイプによっては、ミネラルオイルの重層が必要になります。
2 PCR ELISA によるアンプリコンの検出は、DIG 標識が必要です。これは PCR ELISA
（DIG-Labeling）で容易に行えます。
11. 関連製品
製品名
Oligo[dT] 20 probe, biotin-labeled
Streptavidin-coated PCR tubes
PCR Master
PCR Nucleotide Mix
PCR Core Mix
PCR ELISA ( DIG-Labeling )
PCR ELISA ( DIG-Detection )
Reverse Transcriptase AMV
Reverse Transcriptase M -MuLV
Taq DNA Polymerase
Tth DNA Polymerase
Expand Long Template PCR System
包装単位
2 nmol
192 チューブ
100 反応
100 反応
100 反応
50 反応
192 反応
500 ユニット
500 ユニット
100 ユニット
100 ユニット
100 ユニット
2×250 ユニット
25μg の RNA 用
30 反応
反応当りの
容量
200μl
0.2μl
使用ステップ
/溶液
ステップ 1
溶液 2b
cDNA Synthesis Kit
First Strand cDNA Synthesis Kit
for RT-PCR
Transcriptor First Strand cDNA
50 反応
Synthesis Kit
1）Expand はロシュグループのメンバーのトレードマークです。
4.0μl
3.8μl
1.0ml
ステップ 2
溶液 2b
ステップ 4、6
r
ステップ 5
ステップ 7
サイクル1
94℃5分間
50℃2分間
72℃3分間
サイクル2
（ 40 サ イ ク ル ま
で）
94℃1分間
50℃2分間
72℃3分間
最終サイクル
94℃1分間
50℃2分間
72℃10分間
ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
〒105-0014 東京都港区芝 2 丁目 6 番 1 号
www.roche-applied-science.com
TEL. No.：03-5443-5287
FAX. No.：03-5443-7098
E-Mail：[email protected]
本製品能書（英語版）は下記 URL よりご覧頂けます。
http://www.roche-applied-science.com/pack-nsert/1787896a.pdf
製品番号
1741764
1741772
1636103
1581295
1578553
1636120
1636111
1495062
0162603
1146165
1480014
1681834
1681842
1117831
1483188
4379012