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化場 頁 4 ︱
ふ叩
寸第
道報さ告
海空
北研
サケ・アス魚類の 卵 および精子の 保存に関する 研究― 2
サケ
広 井
((Oncorhynchus
十峯ア
Studies On
ん
安 川
eta)精子の保存にっいて
雅対末
武
敏夫**
the Retention of Gametes
in Salmonid Fishes-2.
0n the Storage of Chum
Osamu
HIROI* Masao
Salmon (Oncorhynchus keta) Sperm
YASUKAWA* and TOshio SUETAKE*
Chum
salmon (Oncorhynchus
keta) sperm
was
obtained
from 23 male fish run up the Chitose
of NOvember,
1972 and stored in the dark ro0m showing the temperatures
of 15.0
t;, 8.0'G, [email protected]
and [email protected]'G.
Milt of one-cc
was
taken in 12-cc open glass vials.
preserved was examined in the Ringer's solution &t every day under a
MOrtility of the spermatozoa
light microscope.
MOreover,
a lot of milt stored @n each
condition for 4 or ? days,
to assess
fertility, was employed to inseminate the eggs preserved for 1 or 4 days
in the Ringer's solution
Of 8. 0t.
The results obtained were &s follows:
1. Spermatozoa
stored &t the temperature
of 15. (TC,
8. 0t and [email protected]! maintained
the
active mortility for 2, 6 and II days, respectively.
N0 mortility, however, was
shown
by the
milt stored at [email protected]'C
even
one day after preservation.
2. Microbes of rod-, globe- or long spindle-shape were observed the milt preserved at 3. 5 @
1.5'C, 8. 0f and 15.01;.
They became visible in earlier time and increased more rapidly as the
milt was exposured at higher temperature.
3. The lot of milt stored for 4 days at 8.0'C could fertilize 89.3%
of the eggs
which were
preserved for 1 day &t 8.0'C in the Ringer's solution.
When the eggs storaged for 1 or 4 days
in the Ringer's solution of 8.0'C was inseminated with the sperm
kept for 4 or ? days at [email protected]
f, fertilization rates of 96.9%
and 53.8%,
respectively, were obtained.
on
24th
・
River,
ま
え
が
き
さけ・ますの
人エふ化事業において
， 悪環境条件での採卵に起因する不受精卵の
発生および過密度
菩技による
親魚の衰弱・乾死は近年・持に回帰親魚が
増加するにつれて・
頻繁にみられる
様になり，これらの
防止対策が強
北海道さけ・ますふ
化 均研究業
筋 第 234 号
，北海道さけ・ますふ
化均千
黄支均(Chitose Br吋
arLnfhOf HOkkkai七 Sal@on Hatchery,Chitose,Japan)
39
北海道さけ・ますふ
化場 : 研究報告 第 27 号
多くは精子および
卵を正常な受精方を
維持したまま長期間保存する
方法が確
く要望されている。
これらの問題の
立できるならば
解?肖 するであろう。
サケ・マス魚類の
精液の保存に関する研究はこれまで
，サケ，
Oncor ん叩 。 Lus Aef0
195L 岡田・伊藤・
(山本， 1949 ，
1955; 岡田外・ 1956; 寺尾，1960) ，べ二マス・
O 偲r血 (FOerSter 1965;WiMer
・
・
BarreLt，
&Humph-
reys.1967)，サクラマ
矢 ， O mmn,sfo"( 中野・野沢，
1925) ．マスノスケ， O tschawytscha ，スチール・へ・ y ド，
SMmo
g0 汁』 n 打ぉ Rぬ rdnerii (Smi 十 5 QuiStorff， 1943) ，ニジマス．
S g0 汁伽erfi irideuS (橋本・ 1961)
および大西洋サケ・
S ． $0Mr
(TruSCott et al。 1967;HOyle も Idler ， 1968) を用いて行なわれている。
そして
・
・
・
これらの実験から
，いくつかの
有効な保存方法が
示されたけれども
，実用に供する
為には尚 検討の必要がある。
著者らはサケ (O ， eM) の精液を容易に
準備できる条件で
保存実験を行なったのでその
結果を次に報告する。
止
稿を進めるに
先だち，木研究について
懇篤なる御指導と御助言を
賜わった北海道大学水産学部．山本喜―郎教
授に厚く御礼申しあ
げます。また，木研究に
用いたサケ卵および精子の
採取に多大の便宜を賜わった北海道きけ
ます増殖事業協会・
三原健夫会長，同西
越捕獲場，布施
智
常民および同捕獲場の
皆様に深甚の謝意を表します。
材料および方法
木研究に用いた
サケ (Oncorhynchus
ke@a) の精液は1972 年HH24
日に石@f 川水系千歳川の
北海道さけ・ます
搾出
増殖事業協会
西越捕獲場で得られた3 年 魚21 尾および4 年魚 2 尾から 搾出した。尿又は血液等の混入精液は
時に注意深く
観察しながら
取除き・可能な
限り純粋な精液のみを
採取した。搾出時の室温はI0.Fiでであった。搾
出した精液は
車で約20 分を要する北海道きけ・ますふ
化場千歳支場ふ化窒まで
水冷運搬した。運搬後すぐに，精
液は洗椴滅菌した広口ガラス
瓶 u2cc)
130 本に駒込ピぺ，トで各々 Icc 毎に小分けした。
精液を入れた瓶は水
． ゴム栓を通気を
妨げない程度に
軽く置いて． すぐに実験条件下に
静置した。この
分，ゴミ等の
混入を防ぐ為に
間のふ化室の
室温は6． oでであった。
精子は次の4 つの実験E に分けて保存した。
実験―1 : 暗室 (消灯) 内にヒーターを
用いて水温を15 0@C に調
・
卸した止水槽を
置き，その中に
精液を入れた瓶を浅漬した。
実験―2 : 暗室 (消灯) 内で8 での流水 (湧水)
に
精液を入れた
瓶を浸潰した。実験―3 :冷蔵庫 (日立) の冷蔵室 (室温3 ． 5 土 1.5q3) に精液を入れた
瓶を静置し
た。 実験―4 : 冷蔵庫 (日立) の冷凍室 (室温―9 ．0 土 9.0て@) に精液を人れた
瓶を静置した。
，
各実験区とも毎日精子の
活方を調べた。
精子の活カは各実験区毎に
小瓶から精液をスライド・グラスにとり
それにサケ用生理食塩水
(山本， 1948)
を加えて精子の
運動能ヵ を光字顕微鏡下で観察する
方法で判定した。
さらに・保存4 日問およびI 週間の精子は
夫々 ．
I 日および4 日間8 でで生理食塩水に
保存した同腹
来受精卵
を用いて，受精率を
調べた。同腹来受精卵は1972 年11M27
加．体重4 ， 800g)
日
同 捕獲場で得た3 年魚 (フ オーク・レングス．
74 2
・
から採取した。
来受精卵の保存方法は
前報 (高野外．
1973)
結
と同様である。
果
採取当日の精子は
生理食塩水で
稀釈することにより
活発な運動を
示した。精子は生理食塩水滴
下後25 秒間は活
発に運動するが・その
後運動は急速に
減衰 し ， 3m秒以降では僅かに動くのみであ
った。この精液で採
卵後2 時間
97 ． 0%
生理食塩水に
保存した来受精卵を
媒精 したところ
実技― @
(来受精卵の66@
粒@中の6.T粒が受精) の受精率を得た。
暗室内でl5 での温度の下で
保存した楕液
実験期間を通じて・
保存瓶を浸潰した止水槽の
水温および室温は
夫々
・
15.0 士 0.5 でおよび7 ．0 士 3.0 での日間
変化を示した。
精子は保存
後 2 日間は採
精当日と変わりなく
生理食塩水で
稀釈することにより
活発な運動を
示した。ところが
保存3 日目では―部の
精子が極めて弱い運動を示すのみであ
り
・
しかも精液中には
桿形・球形および
長紡錘形の
細菌が観察された。
4 日目になると
， これらの細菌はさらに
増え・精子は
殆んど運動しなかった。
この精液で I
日間生理食塩水に
保存した未受精卵を媒精したところ，受精卵は
得られなかった(表― 1U 保存後 5 日目には精
液は採取時の
乳白色から黄白色に変わり
，透明な液状部分が
分離してみられた。
精液は大部分細菌で
占められ
・
40
サケ・マス魚類の
卵および精子の
保存に関する
研究―2
Table.
1.
MOrtility and fertility 0f the preserved
sperms
in various conditions
The
mark, ++,
+ and -, represents the grade of sperm
mortility; ++, most of spermatozoa
actively,
+, a part oF spermatozoa
show activity and -, none 0t spermatozoa
show activity
in the Ringer's
solution.
Fertility o[ spermatozoa
was determined by the test which
inseminated
the eggs preserved in the Ringer's solution.
move
表― @
保存桔子の活ヵと受精ヵ
++; 全ての 楕 子が駒方を 侍っ
+ ; ―部分の格子が 辺劫ヵ を持っ
- ; 箱 子は 闘力を示さない
完全な形の精子は
殆んどみられず，
僅かに変形した
球形小型の精子の
頭部がみられるのみであ
った。
実技―2
暗室内で8 での温度の下に
保存した箱液
る。
保存瓶を浸潰した流水水温は
実験期間を通して8 ． on であった。室温は実験―1 の場合と同様であ
精子は保存後 6 日間まで活発な
運動方を示した。
精液は保存期間が
長くなるにつれて
粘性が高くなった。
4
日
間保存の精液を
用いて8L の生理食塩水にI 日間保存した
未受精卵を媒精したところ，
89 3% の受精率を得た(表
・
精子は生理食塩水を
滴下しても同ら反応を示さず
，精液中には
細菌が繁殖していた。
― 10 しかし 7 日間保存した
この精液で 4 日間保存した
未受精卵を媒精した結果，受精卵は
得られなかった(表― 1U 保存8 日以降の精液は
黄自色に変わり・
完全な形の精子は
認められなかった。
実験―3
冷蔵庫で3． 5土 l.5f の下に保存した
精液
冷蔵庫の冷蔵室の室温ば実験期間を
通して，3 ． 5 士 1.5 でを示していた。
精子は保存後1l 日間活発な運動を
示したが・精液は
保存期間が長くなるにつれて
粘性を増した。4 日間および
7 日間保存した
精液で8@C の生理食塩水に
大々 1 日および4 日間保存した
未受精卵を媒精したところ．
夫々9f 9
・
% および53.8% の受精率を得た(表 ― 1)n この受精華は
同様に保存した
来受精卵を新鮮な
精液で媒精した場合と
あ
まり変わりない
成績であった (1 日間保存，
97.2%0; 4 日間保存．
47.8%:
高野外，19730 ―方．保存後12
日
から 18 日になると―部の
精子のみが生理食塩水に
対し反応を示す
様になり．さらに保存日数が
増すに従い ．運動
する精子の数は減少した。さらにこの期間に
精液中に細菌の
繁殖がみられ．保存期間が
長くなるにつれて
増加し
・
た。 保存後19 日以降では精子の
活動は認められなくなり．それに
代って細菌は
急速に増加した。
保存??日目以降
では精液の
殆んどが
湘@菌で占められ
，正常な形の
精子がみられなくなると
同時に精子は
乳白色から黄白色に変わ
だ
実験―4
冷蔵庫で― 9 士 9 でに凍結保存した
精液
冷蔵庫の冷凍室の
室温は実験期間を
通して ― 9 ．0土 9.0@C であった。
・
精子は18 日間保存したが
，いずれの日にも
活動カ がみられなかった。
もちろん4 日および7 日の受精の際も
受
室温で溶解させた後では
精液は凝縮した
精子の部分と液状の剖
精卵は得られなかった(表 ― 1o 凍結した精液を
分に分離した。
精液中には細菌の
発現はなかった。
41
北海道さけ・ますふ
化 場 : 研究報告 第 77 号
察
考
岡田・伊藤u955)
カ
は サケ
(Oncorhynchus
ke@a) 精液をいくつかの
温度条件で保存し
，淡水中の精子の
運動
と新鮮な
来受精卵に媒精した場合の受精
カ (受精率)
を上
ヒ
較した。その結果・
or,
55でおよびnr で保存し
た精液は活カ 喪失の殆んど直前まで
受精方を保有することを
確めた。この事実がそのまま
我々の実験にあてはめ
得るならば・
6 日間・
生理食塩水賦活により
，精子の殆んどが活発に
運動した期間，
即わち・
15 ． 0@C で2 日間． 8 ． of で
3 ． 5士 1.5 でで11 日間精子は受精方を
保有したと考えられる。
我々の結果は低温
程精子の受精カ が長期間
保持されることを
示している。
同様の事実は
比較的短期間の
試験ではあるが，同じくサケで
山本 け 949) ¥@ よっ
て述べられている。
山本 u949)
は 3-6@C
に保存した精液中の
精子は8 時間まで活動カ も受精カも搾出直後と
殆んど変わらず
， 16 時間後でも大部分のものが
活発に運動するが・
13-16 での温度では3 時間後で既¥- 不 活性な
精子が認められ
， 5 時間後ではすべての
精子が活動ヵ を示さなくなると
報告している。
保存温度と精子の
活ヵ保
有期間に関連して
，岡田・伊藤u955)
は 5 でから3syc までの8 段階の温度でサケ
精液を保存した
結果から，保
活ヵ保有期間 (y ) の問にx
存温度 (x ) と精子の
の 場合の保存温度は
岡田・伊藤u955)
Barrett
(1951)
は 2 ． 5-5
(y +1.1)
-45 の曲線的相関があ
ることをみっけた。
我々
のそれと異なるが
，得られた結果は
彼等の相関式を
支持した。
． 8@C の 温度でサケ精液を
保存した場合，受精
カ (90% 以上の受精率) は 36時間後ま
でしか保持きれないと
報告している。
我々の結果では類似の
温度 (3.5+1 ． 5@C) で保存し24 日後でも96.9%0の受
精率を得ており
， Barrett
の結果よりはるかに
良い成績を得た。
この相違は保存容器の
通気効果の差によって
生
じたものと推定される。
べ二マス (0.nerka)
― 9 でではU 時間 (Withler
&
に 2 ． 士 C入れて密栓して．
8-9
がみられている(WiWer
HumphreyS
でで保存したカラフトマス
(O ． goHu5cA
も HumphreyS
するとスチール・
へッド (SMmo
の精子は5 て@で密栓して保存すると
26 時間 (FOerster,1965)
め
精子では33時間後で受精率の降下
． 1967) 。 同様に保存容器―杯に
精液を入れて密栓 し ， 6H-7
goirdne
，
H
goi ， d庇
． 0でで保存
H りでは2 ． 5時間後で，マスノ スケ (O ． L 。 hWyt5cA
は 5 時間後で受精カ が減衰する(Smith
R QuLto
CC の容器に入れて
密閉し．6 ． 0-13.0@C
で保存すると4
いる
， 8
， 1967) 以降で顕著な
受精カの減衰がみられている。
精液を25cC の瓶
日
。) で
佃 s0 めの 精・液を 70
(97 時間) 後でも受精カ (受精率95.2%) を保持して
。 rf， 1943L
ところが湖水産サクラマス
(0 ．
(中野・野沢．
1925)o この場合では
保存容器の容積が
大きい鳥，精子は
長時間空気の
供給を得たものと
推察
される。
Truscott
et
al u967)
・
は大西洋サケ(S ．，alar)
の精液を
20cc の瓶にIcc 入れ・通気して2 ． O@C で保
存すると5 日間新鮮な精子と
殆んど変わらない
受精率を示すが
，同じ条件で
密栓して保存すると
I 日後で既に受
精率は60% 以下に降下すると
報告している。
彼等は密封した場合は
精子の代謝によって
生じる二酸化炭素ガスの
毒性，ガスによる
精液のpH の降下，又 は酸素不足によって
精子が害されると
考えている。この様な空気の
遮断
の 影半は通気して保存したサケ
精液の場合でも
精液の空気と
接触しない内層 部に認められ・
内層部の精子の活カ
19550 同じく，
保有期間は空気に
接している表層部に
比して著しく
差があることが知られている(岡田・伊藤，
岡田・伊藤u955)
はサケ精液をicc アンプルに
―杯に詰めて密封し・
空気を遮断して
保存したところ・
精子は
0@C では約3 時間，n でおよび20f では約I 時間で活方を喪失するが，その
後空気に接触させておくと
，次第に
活方を回復し
． しかも低温
程より短時間で
活方を取戻すことを
観察した。この結果について・
彼等は空気遮断に
よって炭酸ガスの
蓄積が高まり
精子を麻樺させていたものが
，通気によって
炭酸ガスの拡散と
酸素の供給がなさ
麻 庫状態から解放されることを
意味すると述べている。
又，酸素消費量で
観察した精子の
基礎代謝
れて．精子は
は温度が高い
程大きくなることがサケ
精液で報きされている(岡田外．1956L 即わち，精液Icc は 10 ． 8@C で I 時
間に21mm3 の酸素量を消費するが．
18.7 でではその量は約4 ． 5倍の94mm ，にも達する。
これらの事実および
我々の結果は精子の
保存に際して・1) 精液が空気に接する表面積を
充分大きくとれる
容
重要であることを示している。
器を用いること．2) 充分な通気を行なうこと． および 3) より低温に置くことが
我々 は実験期間を
通して細心の
旺意をはらったにもかかわらず
，常温で保存した
精液のいずれにも
細菌の繁殖
がみられた。
細菌の出現および
繁殖の速度は高温程早かった。いずれの場合も
，保存精子の
活カが喪失する以前
に細菌が出現し
，細菌が増加する
時点で精子の
活カの低下がみられ・
精子の死後急激に
繁殖する。このことは細
思われる。
サケ精液保存中の
細菌の出現については
菌が精子の活カ保有に対して
大きな影牛を与えているように
42
サケ・マス魚類の
卵 および精子の
保存に関する研究―2
寺尾 u960)
が 2-4
での保存実験で
報告し，末薔の精液保存等で
用いられている
抗生物質の必要性を
強調して
いる。細菌は精液自体から・
又 空気から由来すると
考えられ． これを排除することは
極めて困難である。 何故な
先に述べたように
常温下での精液の
保存には通気が
絶対条件となるからであ
る。 このことから．精液を
長
らぱ・
期間保存する為には細菌の
繁殖を阻止しうる
凍結保存法を考える必要があ
ろう。
我々はサケ精液を二9.0土 9.0でで凍結保存したところ
，実験期間 (22日間) を通して，細菌の
出現はみられな
かったが・精子の
活カも又，完全に喪失することを
確認した。これは明らかにサケ
精子の保存の
場合にも適当な
保存稀釈液が必要であ
ることを示している。
色類精子のO で以下の保存に
関して，いくつかの
報告がみられる。
B@axter (1953) は二シン (Clupea harengus} の 精液を% 海水の12 5% グリセリン溶液で稀釈し，ドライ・ア
イス (solidcarbon dioxide) を用いて． ― 79.0@C.@-@
凍結保存したところ
，約6 ケ月 保存後で80% および85% の 受
精率を得ている。
TruSCottet al． u96n は大西洋サケ (S ． SOlM) の精液を5% DMS (dlme 小 yl Su@phoxide)
で稀秋し ― 4． 5C で保存28 日後に81%0 の受精率を，又5% EG (ethylene g@ycoD で稀釈し， ― 3 0でで38 日後
に 70% の受精卵を確認した。
サケ精液では
寺尾 u960) が―40--50 でで生理食塩水に
稀釈した場合2 日間． 5
% 又は10% グリセリン
液で3 日間， 15% グリセリン
液で4 日間． 卵ク液 (3% クェン酸ソーダに等量の
鶏卵黄を
・
・
混合) で I 日間精子は活方を
保有することを報告している。
これらの結果を
参考として．サケ・マス
魚類精液の
関する基礎研究を
進める必要があ
ろう。
より有効な より簡便な凍結保存法に
・
きて， 我々は常温の
3 ． 5士 1.5f で7 日間，
市販の冷蔵庫の冷蔵室保存であり，
8． Of
8 O でで4 日間サケ精液を
確実に保存しえた。
しかも 3.5 士 1 5では
・
・
はふ化用水に
浸しただけの極めて簡単な方法であることはきけ・ます
人 エふ化事業の中に
手軽に応用しうる
利点をもっている。
実際にこの研究の
中で示したように
冷蔵庫 (3.5 bl 5
二
@C)
に 4 日間保存したサケ
精液を同じく生理食塩水に
入れて8
常な採卵に劣らない
96.9%
・
・
O@C で I 日保存した来受精卵に
媒精 したところ正
の受精率を得た。これらの結果が
今後ふ化事業の中で，作業能率の
向上．過密度蓄養
の解消又 は悪条件下での
採卵から生じる不受精卵の解消等に
応用きれうるならば
，この上ない
幸いである。
要
糸勺
ぁ3守 Jll水系千歳f1@で捕獲したサケの
雄完熟魚23 尾から 搾出した精液の
保存実験を行なった。
場合，精子は2 日間， 8 ． Of で暗室 (消灯) 内に保存の精子は
6
I ．精液を15.0 でで暗室 (消灯) 内に保存した
日間・冷蔵
庫の冷蔵室 (3.5
士
1.5 で ) に保存の精子は
n 日間， 夫々新鮮な精子と
同じ活方を保持した。しかし
ながら，冷蔵
庫の冷蔵室 (― 9 ． 0+9.0@C}
t@@凍結保存した精子はI 日後で既に活方を
喪失していた。
2 ．常温保存の
精液にばいずれにも
， 桿状・球状又 は長紡錐状の細菌の
繁殖がみられ， しかも細菌の
出現および
繁殖速度は高温
程速かった。細菌は精子の活カ喪失以前に出現し．精子の
活カ喪失時まで除々 に増加し．精子
の死後・急激に
繁殖した。
精子を8 ． or@ で I 日間生理食塩水に
保存した来受精卵に
媒精したところ．
89.3% の 受
3 ． 8 ． OV で 4 日間保存した
精卵を得た。3 ． 5+1.5c@:4
日間および7 日間保存した
精子を8 OV で生理食塩水に
去々 I 日間および4 日間
・
保存した未受精卵に
媒精 したところ・
96.9% および53.S% の 受精率を得た。
文
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22 ， 1503-1521
8 での湧水に於ける
サケ(OncoHwc-
北海道さけ・モす ふ化場 :研究報告第 27
HOy@e
．
R ． J． & D ． R ．
AtlantlC Salmon
中野宗治・野沢
鑑
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