免疫電 戸真微鏡法の実際

免疫電子顕微鏡法の実際 新潟大学電子顕微鏡共同研究室
行田正晃
地味な内容や成功率の低さなどからか、誰もやりたがらな
い免疫電顕法。私が行っている方法や、その経験からわか
ることを簡単にまとめてみた。
ー免疫電子顕微鏡法とは?
免疫電顕法(免疫電子顕微鏡法)とは、電顕法(電子顕微鏡法)と免疫粗描化学を組み合わ
せたものである。もっと簡単に言ってしまえば、組織に存在する抗原の場所を電顕でわかり
やすく見せることが免疫電顕法ということになる。
通常の電顕法では抗原を見ようとしても見えない。そこで電顕で見ることができる標識物を
くっつけて、抗原の場所を明らかにすることが免疫電顕法のねらいだo
■抗J東抗体反応
組織や細胞には様々な抗原がある。そこに抗体をかけると、ある抗原だけに結合するo例え
ば、抗体Aは抗原Aだけに特異的に結合するし、抗体Bは抗原Bだけに特異的に結合する。
この抗原と抗体の特異的な結合を抗原抗体反応と呼んでいる。免疫電顕法はこのことを利用
して行われるo
÷_二=― =二_二三
;= ' ォ な春本
「 「 「 「 「 「
「 「「
∩
組織切片
)良い免疫電顕法
通常の電顕法の場合は、組織の死後変化が少な<構造のわかりやすい像が良いものだと言え
ると思う。そして免疫電顕法の場合ではr電顕法と同等の組織像」とr組織抗原の存在場所
のみに標識物が観察できるもの」が理想だろう。ただし、そのような理想の免疫電顕法はま
だ無い。
通常は固定剤で組織の成分は不動化されるが、その固定剤によって抗原は装飾され抗原と結
合しなくなる。だからといって固定を弱めると組織の構造が崩れてしまう。理想の免疫電顕
法は無理。
抗原の場所を明確に示すことができ.その周囲の組織がある程度保持されていれば、とりあ
えずは良い免疫電顕法だと言えると患う。
37-
租
非特 異 的 反 応
抗体は
目 的の 組 織 抗 原 だ け に 結 合 して く れ れ ば よ い の だ が
､
こ れ を 非特 異 的な 反 応 と い う
抗 原 が 別 な 場 所 に 移 動 して し ま
て しま う こ とが あ る｡
荒 れ 具 合な
の
の か
､
｡
っ
関係の 無 い と こ ろ にく
､
つ い
っ
組織 か ら 切 片 を 切 り 出 し た と き の 表 面
たの か
理 由 は 全 く わ か らな い が こ の
､
非 特 異 反 応 は 多少 起 こ る ｡
い ま ま で の 経 簸 で 必 ず 非 特 異 反 応 が 出る の は
めの 処理 な どを行
とが で き る場合 は
Ji 組 織 の
て も防げな か
っ
ら組 織 を 取 り 出 す 前 に 赤 血 球 を 除 く
で き る だ け 濯流 を 行 う よ う に し て い る
､
輸 液セ
｡
､
トで は な く
ッ
｡
｡
ヒ ドが 個 人 的 な 標 準 と な
て い るが
っ
t P
r e
この
てく る
っ
-
e
m
b
方法 は
e m
｡
e
d di n g
n
凍結 の と き
氷の ダメ
､
ー
ジ は気づ か な い だろ う
､
e
d di n g
U 比r
､
a
C ry
o
の うち
､
ど の 方法 を と るか で 処
､
くる
つ
2 0% シ ョ
た だ し 低 倍率 の 像 で 良 い 場 合 は こ の 処 理 を しな く て も
｡
組織
｡
糖 を 組織
氷の ダ
､
｡
時 点 で 可 視 化 で き る の だが
抗 体) に 対す る 抗 体 ( ニ
ば
b
m
ジ で 微細 構 造 が 壊 さ れ る と い わ れ て い る の で
作 製 した 凍 結 切 片 に 抗 体 を 載 せ
の
トe
そ れ か ら ク リ オ ス タ ッ トで 比 較 的 厚 め の 凍 結 切 片 を
､
ー
に 浸 透 さ せ て か ら 凍結 す る
メ
o s
の 前 に 抗 原 抗 体反 応 を 行 う 技 法 で あ る ｡
固 定 し た 組 織 を 凍結 さ せ
の
P
g
電 顕 包埋
､
､
使用 する抗体
｡
｡
d di
e
b
4 % パ ラ ホル ム ア ル デ
こ の 固 定液 が よ い と い う わ け で は な い ｡
,
な どに よ り い く らで も固定液は換え る
-
ム ラ の な い よう すみ
､
､
r e
般的
一
シ リ ン ジ を使用 して
､
赤血 球 を 除 く だ け な ら ば濫 読 す る だ け で よ い こ の 後 に 固 定 を す る が
や か に 固定 した い と考 えて い る の で
続 け て 麓流 固 定 も 行 う 固 定 液 は
こ こ か らは P
トで 緩 衝 液 の 入
ッ
目 的 の 臓 器 に 応 じた 血 管 の 経 路 を 考 え て 注 入 す る の が
私 は 簡単 に 済 ま せ た い と い う 理 由 か ら輸 液 セ
o
注 入 して い る こ と が 多 い
理 が違
こ
｡
血 管に緩衝液を 淀 して 血 液を流 し出 して しま う こ とだ
､
た 容 器 を 高 い 場所 に 設 置 し
な よ うだ
｡
切 片 上 に非 特 異 反 応 を 軽 減 す る た
｡
摘出
漂流 と は
つ
た
っ
赤血 球牢
,
そ こ で動物か
､
抗原 抗体反 応 を行う
｡
抗 体 自体 に 標 識 物 が つ
い て いれ
ばこ
普通 は 標 識 物 な ど つ い て い な い そ こ で 結 合 し た 抗 体 ( 次
次抗 体) を 反 応 さ せ る 二 次抗 体 に 標 識 物 の つ い た も の を 使 用 すれ
一
､
o
｡
目 的 の 抗 原 の 局在 が 観 察 で き る
｡
抗原抗体反 応を 終え た切片 を 2 5 % グル タ ル と 1 % オ ス ミ ウ ム で 後固 定 し
水 後 に電 顕包 埋 す る こ の ブ ロ ッ ク か ら 電 顕 用 の 切 片 を 作 製 し 観察 す る
.
｡
タノ
エ
ー
.
､
ー
ル脱
｡
､
電顕切片作製
切片作製
/ 〟
⊂⊃
凍結 し た 組 耗
∠
勤
⊂⊃
抗原抗捧反応
剥 が して 細 切
切 片 包埋
メ
試料台 に接着
成功 し た 場 合
わ か りや すい
｡
､
細胞な どの 膜 に存在する抗原 は
ごく わ ず か な 部 位 の 場 合や
-
､
ッ
シ
ュ
に採 リ
観察
標識物 が高密度 に連続 して 確認 され る の で
高倍 率 で の 観 察 の 場 合 は よ ほ ど 組 織 保 持 が よ く
38
､
-
な い とわ か り づ ら い
どちらか とい うと低倍 率 広範 囲の 抗原 局在 に向 い て い る 方法だと思
う 凍 結 切 片 の ほ ん の 少 し の キ ズ や め く れ な ど で も非 特 異 的 反 応 が お き や す い よ う だ
｡
､
｡
｡
海P
卜
o s
e
m
b
e
d di
n
固定後 の 組 織 を 脱水
g
樹脂包埋す る
､
｡
こ の
ブロ
ッ
ク か ら電顕 用 切片 を作製 す る
この電顕用
｡
切片上 で 抗 原 抗 体反
こ の 方法 は
芸人
度 ブロ
て し ま え ば あ る 程度 の 期 間 は 保 存 が で き る し 切 片 を 伴 っ て
し ま え ば後 の 操 作 は 特 に 技 術 を 必要 と しな い の で 簡単 だ 欠点 は 高 密度 の 抗 原 抗 体 反 応 が
一
ッ
ク を作
っ
､
｡
難 しい
こ
とだ
する時間 の
大 き な 理 由 は 抗 原 が 固定 か ら包 埋 ま で の 操 作 で 流 出 した り そ の 操 作 に 要
問 題 か ら も 失 わ れ や す く そ して どん な に 切片 を 厚 く し て も 抗 原 抗 体 反 応 が 有 効
｡
､
､
､
な の は表面 だ け と い う こ とだ ろ う
J U lt
r a
C
r e
-
e m
b
e
d di n g
と P
水 晶 防 止 処 理 を した 後
､
｡
(y o
こ の 方法 は P
組織 は
､
o s
トe
b
m
d di
e
凍結 され る
n
を 組み 合 わ せ た よ う な 方 法 だ
g
こ の 凍 結ブロ ッ クか ら
｡
作製 し こ の 切 片 上 で 抗 原 抗 体 反 応 を お こ な う
する
､
｡
固 定後 の
｡
T/
≠如
こ の 方法 は P o
て い る｡
1 00
■
c
の 超 薄切片を
抗 原 抗 体 反 応 を 終 え た ら切 片 を 包 埋 し て 観 察
抗原 抗
の
電顕 用
､
n m
ト
s
e m
b
e
d di n g
に近 い 手 順 で
､
P
r e
そ の た め 高密度 な抗 原 抗体反 応が 可 能だが
-
切 片包 埋
に近 い 抗 原 抗 体 反 応 性 を も っ
に
的
技術
難易 度 の 高 い 手 法 で あ る
e m
､
以 下 の 厚 さ の 電顕 用凍結切片を 作製す るの は
切片を 包埋 ま で
J
反応
b
e
d di n g
｡
､
通常の電 顕用 切片よ り 困難 だ
｡
またそ
の 操 作 で 崩 して し ま い や す い ｡
簡単 に は 成 功 し な い
免疫 電 顕 法 は 組 織 や 目 的 の 抗 原 や 使 用 す る 抗 体 な ど に 合 わ せ て 各 操 作 の 条 件 を 検 討 し 何
度 も試 行 錯 誤 し な け れ ば満 足 の で き る 結 果 は 得 ら れ な い 私 の 場 合 も 数 ヶ 月 で 満 足 の で き
る 写真が 取 れ た もの もあ る し 1 年以上取 り組ん で もう まく い かず に結局あ き らめ た もの も
､
､
､
｡
,
ある
｡
免 疫 電 顕 法 は 普 通 は 失敗 か ら 始 ま る も の と 考 え て 間違 い 無 い
-
39
-
｡