クルクミン投与がカルディオトキシン誘導性筋損傷

スポーツ科学研究, 9, 29-40, 2012 年
クルクミン投 与 がカルディオトキシン誘 導 性 筋 損 傷 における
炎 症 反 応 、酸 化 ストレスおよび炎 症 細 胞 浸 潤 に及 ぼす影 響
Effects of curcumin administration on inflammatory reactions,
oxidative stress and inflammatory cell infiltration
in cardiotoxin-induced muscle damage
1)
加藤孝基
，川 西 範 明
大塚喜彦
3)
1)
，高 橋 将 記
，今 泉 厚
3)
1)
，椎 葉 大 輔
，鈴 木 克 彦
2)
，
4)
Kouki Kato 1 ) , Noriaki Kawanishi 1 ) , Masaki Takahashi 1 ) , Daisuke Shiva 2) ,
Yoshihiko Otsuka 3 ) , Atsushi Imaizumi 3 ) , Katsuhiko Suzuki 4 )
1)
早 稲 田 大 学 スポーツ科 学 研 究 科
2)
倉敷芸術科学大学生命科学部
3)
4)
1)
2)
株 式 会 社 セラバリューズ
早 稲 田 大 学 スポーツ科 学 学 術 院
Graduate school of Sport Sciences, Waseda University
College of Life Science, Kurashiki University of Science and the Arts
3)
4)
THERAVALUES CORPORATION
Faculty of Sport Sciences, Waseda University
キーワード: 炎 症 反 応 、筋 損 傷 、酸 化 ストレス、マクロファージ、好 中 球
Key words: inflammation, muscle damage, oxidative stress, macrophage, neutrophil
抄 録
【緒 言 】運 動 や外 傷 に伴 う筋 組 織 の損 傷 時 には、炎 症 反 応 および酸 化 ストレスが誘 導 されることが知
られている。近 年 、クルクミンは抗 炎 症 作 用 および抗 酸 化 作 用 を示 すことが知 られている。したがって、
クルクミンの示 すこれらの作 用 が、筋 損 傷 後 の組 織 の炎 症 反 応 および酸 化 ストレスにも影 響 を及 ぼす
可 能 性 が考 えられる。そこで本 研 究 では、カルディオトキシン誘 導 性 の筋 損 傷 モデルを用 いて、クルク
ミン投 与 が炎 症 反 応 および酸 化 ストレスに及 ぼす影 響 を明 らかにすることを目 的 とした。
【方 法 】9 週 齢 の C57BL/6J 雄 マウス (n=14)の片 足 脚 の前 脛 骨 筋 にカルディオトキシン、反 対 脚 の前
脛 骨 筋 に対 照 として PBS を注 入 した。また、クルクミン投 与 群 にはカルディオトキシン投 与 直 後 にクル
クミン 3mg を含 む PBS 溶 液 を経 口 投 与 し、対 照 群 には PBS を同 量 経 口 投 与 した。クルクミン投 与 24
時 間 後 に採 血 および前 脛 骨 筋 を摘 出 した。筋 組 織 中 のサイトカインのタンパク質 濃 度 は ELISA 法 を
用 いて測 定 した。また、遺 伝 子 発 現 量 は real-time PCR 法 を用 いて測 定 した。
【結 果 】骨 格 筋 組 織 内 における炎 症 性 サイトカインタンパク質 濃 度 および遺 伝 子 発 現 量 は、カルディ
オトキシン投 与 脚 において PBS 投 与 脚 と比 較 して有 意 に高 かった。しかしながら、クルクミン投 与 によ
る有 意 な抑 制 はみられなかった。同 様 に hydrogen peroxide および NADPH-oxidase の遺 伝 子 発 現
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は、カルディオトキシン投 与 脚 において PBS 投 与 脚 と比 較 して有 意 に高 かった。しかしながら、クルクミ
ン投 与 による有 意 な抑 制 はみられなかった。
【結 論 】クルクミン投 与 はカルディオトキシン誘 導 性 筋 損 傷 後 の炎 症 反 応 および酸 化 ストレスに影 響 を
及 ぼさない可 能 性 が示 された。
スポーツ科 学 研 究 , 9, 29-40, 2012 年 , 受 付 日 ：2011 年 9 月 1 日 , 受 理 日 ：2012 年 4 月 30 日
連 絡 先 : 鈴 木 克 彦 〒359-1192 埼 玉 県 所 沢 市 三 ヶ島 2-579-15 早 稲 田 大 学 スポーツ科 学 学 術 院
Tel ＆ Fax： 04-2947-6898
E-mail： [email protected]
Ⅰ. 緒 言
ファージや好 中 球 が関 与 する可 能 性 が考 えら
運 動 や外 傷 に伴 い骨 格 筋 組 織 の損 傷 が引
れる。
き起 こされる と、炎 症 反 応 および酸 化 ストレスが
天 然 ウコンの主 成 分 であるクルクミンは様 々
誘 導 されることが知 られている。実 際 に、圧 迫 損
な疾 患 モデルにおいて抗 炎 症 作 用 、抗 酸 化 作
傷 および薬 物 投 与 誘 導 性 筋 損 傷 モデルを用 い
用 を示 すことが明 らかにされている (Biswas SK
た動 物 実 験 において、損 傷 後 の前 脛 骨 筋 で炎
et al., 2005; Menon VP and Sudheer AR,
症 性 サ イ ト カ イ ン の 一 種 で あ る TNF- α の 遺 伝
2007) 。 実 際 に 、 ク ル ク ミ ン は 誘 導 性 一 酸 化 窒
子発現が増加することが報告されている
素 合 成 酵 素 (iNOS)の産 生 を抑 制 することが明
(Collins RA and Grounds MD, 2001; Pelosi L
らかにされている (Aggarwal BB et al., 2004)。
et al., 2007)。ヒトを対 象 とした研 究 においても、
iNOS はフリーラジカルの NO 産 生 を誘 導 するこ
筋 損 傷 を誘 発 するダウンヒル運 動 後 には外 側
とにより TNF-αなどの炎 症 反 応 を増 幅 させる。
広 筋 の IL-1βの遺 伝 子 発 現 が増 加 することが
さらに、クルクミンは、腸 での吸 収 によりテトラヒド
報 告 されている (Fielding RA et al., 1993)。ま
ロ ク ル クミ ンと い う 抗 酸 化 物 質 に 変 化 す る こ とが
た、マウスにおいてダウンヒル運 動 後 に腓 腹 筋
知 られており (Osawa T et al., 1995)、テトラヒド
の 過 酸 化 水 素 (hydrogen peroxide: H 2 O 2 ) や
ロクルクミンはマウスの生 体 内 酸 化 を抑 制 するこ
一 酸 化 窒 素 (NO) の 濃 度 が 増 加 す る こ と が 報
と が 報 告 さ れ て い る ( 角 ら 、 2001) 。 興 味 深 い こ
告 さ れ て い る
2010;
とに、近 年 ダウンヒル 運 動 を用 い た動 物 実 験 に
2010) 。 H 2 O 2 は
おいて、クルクミン投 与 によりマウス骨 格 筋 の
NADPH-oxidase を介 して産 生 されることが明 ら
IL-1 β 、 IL-6 、 TNF- α タ ン パ ク 質 濃 度 の 上 昇
かになっているが、NADPH-oxidase は主 にマク
が抑 制 されることが報 告 された (Davis JM et al.,
ロファージや好 中 球 に存 在 することから酸 化 スト
2007)。加 えて、我 々はクルクミン投 与 がダウンヒ
レスの誘 導 にはこれらの炎 症 細 胞 が重 要 と考 え
ル運 動 後 の酸 化 ストレスを減 少 させ、これらの現
られている。興 味 深 いことに、薬 物 投 与 やダウン
象 にマクロファージの浸 潤 抑 制 が関 与 する可 能
ヒル運 動 による筋 損 傷 後 にもマクロファージや
性 について明 らかにしている (未 発 表 データ)。
好 中 球 の活 性 化 や組 織 浸 潤 が亢 進 することも
しかしながら、ダウンヒル運 動 は筋 損 傷 の誘 導
明 らかになっている (Tsivitse SK et al., 2003;
に加 え、様 々な呼 吸 循 環 応 答 や代 謝 性 変 化 な
Martinez CO et al., 2010)。したがって、筋 損 傷
ど の 全 身 的 要 因 を 伴 う こ と が 考 え ら れ る 。 IL-6
後 の炎 症 反 応 や酸 化 ストレスの誘 導 にはマクロ
は運 動 中 の糖 ・脂 質 代 謝 に関 与 し、エネルギー
Lima-Cabello
E
(Liao
et
al.,
P
et
al.,
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供 給 に積 極 的 に働 くことが指摘 されており
片 足 脚 の前 脛 骨 筋 に cardiotoxin (Sigma, St.
(Pedersen BK et al., 2003) 、 1 時 間 以 上 の
Louis, MO, USA)を PBS で希 釈 し、10μmol/l
60%Vo 2 max の持 久 性 運 動 時 には、IL-6 および
濃 度 で 100μl 注 入 した。また、対 照 として反 対
TNF-α の血 漿 濃 度 が増 加 することが報 告 され
脚 の前 脛 骨 筋 に PBS を 100μl 注 入 した。
ている (Pedersen BK et al., 2003: Nieman DC
et al., 2003)。したがって、クルクミン投 与 による
3. クルクミン投 与
筋 損 傷 後 の炎 症 反 応 を検 討 するために、これら
クルクミン投 与 群 には前 脛 骨 筋 にカ ルディオ
の全 身 的 要 因 を排 除 した純 粋 な筋 損 傷 モデル
トキシンおよび PBS を注 入 した直 後 にイソフルラ
を用 いる必 要 がある。マウスの骨 格 筋 に筋 損 傷
ン吸 入 麻 酔 下 にてマウス１匹 あたりクルクミン
を惹 起 する薬 物 であるカルディオトキシンは、筋
(細 粒 化 クルクミン: 株 式 会 社 セラバリューズ,
損 傷 を引 き起 こすだけでなく炎 症 反 応 および酸
Tokyo, Japan)成 分 3mg を含 む PBS を 200μl
化 ストレスを誘 導 することが明 らかになっており、
経 口 投 与 した。クルクミン非 投 与 群 には PBS を
骨 格 筋 の損 傷 と修 復 の機 序 を解 明 するために
200μl 経 口 投 与 した。なお、経 口 投 与 にはマウ
多 くの研 究 で用 いられている。
ス用 ゾンデ (夏 目 製 作 所 , Tokyo, Japan)を使
そこで本 研 究 では、クルクミンを経 口 で単 回
用 した。
投 与 し、マウスのカルディオトキシン誘 導 性 筋 損
傷 後 の骨 格 筋 組 織 の炎 症 反 応 、酸 化 ストレス
4. 筋 組 織 採 取
および炎 症 細 胞 浸 潤 に及 ぼす影 響 を明 らかに
クルクミン投 与 24 時 間 後 に麻 酔 下 で安 楽 死
することを目 的 とした。
後 に解 剖 を行 い、両 脚 から前 脛 骨 筋 を摘 出 し
た。摘 出 した前 脛 骨 筋 は、RNA later (Applied
Ⅱ. 方 法
Biosystems, Carlsbad, California, USA)に浸 し
1. 実 験 動 物 と飼 育 条 件
て液 体 窒 素 で凍 結 させた後 、-80℃の冷 凍 庫 に
て保 存 した。
本 実 験 では 9 週 齢 の C57BL/6J 雄 マウス
( 紀 和 実 験 動 物 研 究 所 , Wakayama, Japan) を
用 いた。室 温 21℃、湿 度 35％、21:00-9:00 を
5. Real-time quantitative PCR
暗 期 に 9:00-21:00 を明 期 に設 定 した飼 育 室 に
前 脛 骨 筋 の Total RNA は、RNeasy Mini Kit
おいて、ゲージ内 で飼 育 した。MF (オリエンタル
(QIAGEN, Vakencia, California, USA)および
酵 母 , Tokyo, Japan)の飼 料 を使 用 し、飲 水 は
RNase-Free DNase Set (QIAGEN, Valencia,
水 道 水 を用 い、ともに自 由 摂 取 とした。マウス
California, USA) を 用 い て 抽 出 し た 。 そ の 後
(n=14) の 片 足 脚 に カ ル デ ィ オ ト キ シ ン (CTX) 、
Nano Drop system (Nano Drop Technologies,
反 対 脚 にリン酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 (PBS)を投 与
Wilmingston, Delaware, USA)を用 いて RNA 濃
し、無 作 為 にクルクミン非 投 与 群 (n=7)、クルク
度 を測 定 した。Total mRNA は、High Capacity
ミン投 与 群 (n=7)に群 分 けした。
cDNA Reverse Transcription kit with RNase
inhibitor
なお、本 実 験 は早 稲 田 大 学 動 物 実 験 委 員
(Applied
Biosystems,
Carlsbad,
California, USA) を 用 い て 、 逆 転 写 反 応 に よ り
会 の承 認 を得 て行 った (10K001)。
cDNA を 作 製 し た 。 cDNA は 、 Power SYBR
Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,
2. カルディオトキシン (cardiotoxin) 投 与
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Carlsbad, California, USA) を 用 い て Fast
構 成 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 と し て 、
real-time
glyceraldehyde-3-phosphate
PCR
7500
装 置
(Applied
dehydrogenase
Biosystems, Carlsbad, California, USA)により
(GAPDH) を 使 用 し た 。 標 的 遺 伝 子 お よ び 内 因
定 量 した。PCR 条 件 は、95℃で 10 分 間 cDNA
性 遺 伝 子 として使 用 したプライマーを表 1 に示
を変 性 させた後 に、1 サイクル 95℃で 15 秒 間 、
した。
60℃で 1 分 間 の条 件 で、40 サイクル繰 り返 した。
表 1.
Real-time PCR に用 いたプライマーの塩 基 配 列
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, TNF-α : tumor necrosis factor-alpha
IL: interleukin, NADPH-oxidase: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase,
iNOS: inducible nitric oxide synthase, MCP-1: monocyte chemotactic protein-1
6. タンパク質 濃 度 測 定
7.
前 脛 骨 筋 は Tissue Protein Extraction
Reagent
(T-PER)
with
Protease
H2O2 濃 度 測 定
H 2 O 2 濃 度 は SensoLyte ADHP hydrogen
inhibitor
peroxide assay kit (Fremount, California,
(Thermo, Rockford, Illinois, USA)溶 液 でホモ
USA) を 用 い て 測 定 し た 。 な お 、 蛍 光 強 度 の 測
ジナイズした後 、10,000xG、10 分 間 の条 件 で遠
定 には FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH,
心 操 作 を 行 い 上 清 の タ ン パ ク 質 を分 離 し た 。 タ
Offenburg, Germany)を使 用 した。
ン パ ク 濃 度 は BCA Protein Assay (Thermo,
Rockford, Illinois, USA)を用 いて測 定 した。
8. 血 漿 中 および前 脛 骨 筋 中 のクルクミン濃 度
前 脛 骨 筋 内 の TNF-α タ ン パ ク 質 濃 度 は
マウス (n=4)にクルクミンを投 与 し、0, 1, 3, 6
Mouse TNF-α ELISA kit (R&D systems,
および 24 時 間 後 にイソフルラン吸 入 麻 酔 下 で
Mckinley, Minnesota, USA)、MCP-1 タンパク
開 腹 し、腹 部 大 動 脈 から血 液 をヘパリン処 理 真
質 濃 度 は Mouse MCP-1 ELISA kit (R&D
空 採 血 管 （TERUMO, Tokyo, Japan）に採 取 し
systems, Mckinley, Minnesota, USA)を用 いて
た。採 取 した血 液 は、2,600xG、10 分 間 の条 件
測 定 した。MPO タンパク質 濃 度 は、Mouse MPO
で遠 心 し、上 清 の血 漿 を分 離 し-80℃にて凍 結
ELISA kit (Hycult Biotech, Uden, Netherland)
保 存 した。また、両 脚 から前 脛 骨 筋 を摘 出 した。
を用 いて測 定 した。なお、吸 光 度 の測 定 には
摘 出 した前 脛 骨 筋 は液 体 窒 素 で凍 結 させた後 、
VERSA Max microplate reader (Molecular
-80 ℃に て 凍 結 保 存 し た。 摘 出 し た血 漿 お よ び
Devices, California, USA)を使 用 した。
前 脛 骨 筋 は、HPLC-MS/MS システム法 にて解
析 定 量 を行 った (Sasaki et al., 2011)。
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9.
統計処理
時 間 後 の血 漿 中 および前 脛 骨 筋 のクルクミン
結 果 は、平 均 値 ±標 準 誤 差 で表 した。カル
濃 度 を測 定 したところ、いずれも投 与 1 時 間 後
ディオトキシン投 与 およびクルクミン投 与 を要 因
にピークを示 した (図 1A および B)。血 漿 中 のク
とした 測 定 項 目 の 変 化 につ いては 二 元 配 置 分
ルクミン濃 度 は、投 与 前 ：0、投 与 1 時 間 後 ：
散 分 析 を行 い、有 意 水 準 は 5％未 満 とした。多
2692.5 (2310.0 ～ 3170.0) 、 3 時 間 後 ： 2325.0
重 比 較 検 定 は Turkey’s test を行 い、有 意 水
(1800.0～2770.0)、6 時 間 後 ：1087.5 (740.0～
準 は 5％未 満 とした。
1410.0)、24 時 間 後 ：97.3 (29.5～152.0){平 均
値 ng/mg (最 小 値 ～最 大 値 )}であった。また、
Ⅲ. 結 果
前 脛 骨 筋 のクルクミン濃 度 は、投 与 前 ：0、投 与
クルクミン投 与 による血 中 および骨 格 筋 組 織 に
1 時 間 後 ：18.1 (10.9～32.4)、3 時 間 後 ：15.6
おけるクルクミン濃 度 の変 化
(12.1～20.3)、6 時 間 後 ：5.0 (3.4～6.3)、24 時
血 中 および骨 格 筋 組 織 のクルクミン動 態 を検
間 後 ：0.6 (0.5～0.8) {平 均 値 ng/mg (最 小 値 ～
討 するために、投 与 前 、投 与 1、3、6 および 24
最 大 値 )}であった。
A
B
図 1. クルクミン投 与 ０，１，３，６，２４時 間 後 のマウスの血 漿 クルクミン濃 度 (A)
および前 脛 骨 筋 のクルクミン濃 度 (B) (平 均 値 ±標 準 誤 差 )
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ク ルクミ ン 投 与 に よ る カル デ ィオ ト キシ ン 誘 導 性
ルクミン投 与 による有 意 な変 化 はみられなかっ
の炎 症 反 応 の変 化
た (8.75±0.64 vs 9.31±0.918 pg/mg) (図 2)。
骨 格 筋 組 織 の炎 症 反 応 を検 討 す るために、
また、炎 症 性 サイトカインである TNF-α、IL-6、
炎 症 性 サイトカインのタンパク質 濃 度 および遺
IL-1βおよび IL-12 の遺 伝 子 発 現 は PBS 投
伝 子 発 現 を 測 定 し た 。 TNF- α タ ン パ ク 質 濃 度
与 脚 と比 べて CTX 投 与 脚 において有 意 な高 値
は
PBS 投 与 脚 に お い て は 検 出 感 度
を示 した。しかしながら、PBS 投 与 脚 および CTX
(7.8pg/mg)未 満 であったが、カルディオトキシン
投 与 脚 ともにクルクミン投 与 による有 意 な変 化
(CTX)投 与 脚 においては検 出 感 度 以 上 の濃 度
はみられなかった (図 3A-D)。
を示 した。しかしながら、CTX 投 与 脚 においてク
図 2. クルクミン投 与 および PBS 投 与 による PBS 投 与 脚 およびカルディオトキシン
(CTX) 投 与 脚 の TNF-αのタンパク質 濃 度 の変 化 (平 均 値 ±標 準 誤 差 )
図 3. クルクミン投 与 および PBS 投 与 による PBS 投 与 脚 およびカルディオトキシン
(CTX)投 与 脚 の TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C), IL-12 (D)の遺 伝 子 発 現 の変 化
(平 均 値 ±標 準 誤 差 、 ※ ※ p＜0.01)
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ク ルクミ ン 投 与 に よ る カル デ ィオ ト キシ ン 誘 導 性
したが、PBS 投 与 脚 および CTX 投 与 脚 ともにク
の酸 化 ストレスの変 化
ルクミン投 与 による有 意 な変 化 はみられなかっ
骨 格 筋 組 織 の酸 化 ストレスを検 討 するために、
た (図 5A)。加 えて、NO を産 生 する iNOS の遺
(H 2 O 2 ) 濃 度 お よ び
伝 子 発 現 は PBS 投 与 脚 と比 べて CTX 投 与 脚
NADPH-oxidase, iNOS の遺 伝 子 発 現 を測 定 し
において有 意 な高 値 を示 したが、PBS 投 与 脚 お
た。H 2 O 2 濃 度 は PBS 投 与 脚 と比 べて CTX 投
よび CTX 投 与 脚 ともにクルクミン投 与 による有
与 脚 におい て有 意 に 高 値 を示 した 。し か し なが
意 な変 化 はみられなかった (図 5B)。また、ミエ
ら、PBS 投 与 脚 および CTX 投 与 脚 ともにクルク
ロペルオキシターゼ (MPO)のタンパク質 濃 度 は
ミン投 与 による有 意 な変 化 はみられなかった
PBS 投 与 脚 と比 べて CTX 投 与 脚 において有 意
( 図 4) 。 同 様 に 、 H 2 O 2 の 発 生 を 誘 導 す る
に高 値 を示 したが、PBS 投 与 脚 および CTX 投
NADPH-oxidase の遺 伝 子 発 現 は PBS 投 与 脚
与 脚 ともにクルクミン投 与 による有 意 な変 化 は
と比 べて CTX 投 与 脚 において有 意 に高 値 を示
みられなかった (図 6)。
過 酸 化 水 素
図 4. クルクミン投 与 および PBS 投 与 による PBS 投 与 脚 およびカルディオトキシン
(CTX)投 与 脚 の H 2 O 2 濃 度 の変 化 (平 均 値 ±標 準 誤 差 、 ※ ※ p＜0.01)
図 5. クルクミン投 与 および PBS 投 与 による PBS 投 与 脚 およびカルディオトキシン
(CTX)投 与 脚 の NADPH-oxidase (A), iNOS (B) 遺 伝 子 発 現 の変 化
(平 均 値 ±標 準 誤 差 、 ※ ※ p＜0.01)
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図 6. クルクミン投 与 および PBS 投 与 による PBS 投 与 脚 およびカルディオトキシン
(CTX)投 与 脚 の MPO タンパク質 濃 度 の変 化 (平 均 値 ±標 準 誤 差 、 ※ ※ p＜0.01)
ク ルクミ ン 投 与 に よ る カル デ ィオ ト キシ ン 誘 導 性
に特 異 的 に発 現 するタンパク質 を認 識 する抗
のマクロファージ浸 潤 の変 化
体 F4/80 の遺 伝 子 発 現 は PBS 投 与 脚 と比 べて
骨 格 筋 組 織 のマクロファージ浸 潤 を検 討 する
CTX 投 与 脚 に おい て 有 意 に 高 値 を示 した。 し
ために、F4/80 および MCP-1 の遺 伝 子 発 現 を
かしながら、PBS 投 与 脚 および CTX 投 与 脚 とも
測 定 した。マクロファージの組 織 浸 潤 を特 異 的
にクルクミン投 与 による有 意 な変 化 はみられなか
に誘 導 する MCP-1 のタンパク質 濃 度 は PBS 投
った (図 8A)。加 えて、MCP-1 の遺 伝 子 発 現 は
与 脚 と比 べて CTX 投 与 脚 において有 意 に高 値
PBS 投 与 脚 と比 べて CTX 投 与 脚 において有 意
を示 した。しかしながら、PBS 投 与 脚 および CTX
な高 値 を示 した。しかしながら、PBS 投 与 脚 およ
投 与 脚 ともにクルクミン投 与 による有 意 な変 化
び CTX 投 与 脚 ともにクルクミン投 与 による有 意
は みられなかった (図 7)。また、マクロファージ
な変 化 はみられなかった (図 8B)。
図 7. クルクミン投 与 および PBS 投 与 による PBS 投 与 脚 およびカルディオトキシン
(CTX)投 与 脚 の MCP-1 タンパク質 濃 度 の変 化 (平 均 値 ±標 準 誤 差 、 ※ ※ p＜0.01)
図 8. クルクミン投 与 および PBS 投 与 による PBS 投 与 脚 およびカルディオトキシン
(CTX)投 与 脚 の MCP-1 (A), F4/80 (B) 遺 伝 子 発 現 の変 化 (平 均 値 ±標 準 誤 差 、 ※ ※ p＜0.01)
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Ⅳ. 考 察
られる。本 研 究 ではこれらの影 響 を除 した筋 損
骨 格 筋 の損 傷 に伴 い炎 症 反 応 や酸 化 ストレ
傷 時 のクルクミン投 与 による影 響 を検 討 したが、
スが誘 導 されることが明 らかにされている。本 研
クルクミン投 与 はカルディオトキシン投 与 24 時
究 では、マウス骨 格 筋 の筋 損 傷 を誘 導 する薬
間 後 の炎 症 性 サイトカインの遺 伝 子 発 現 、
剤 であるカルディオトキシン投 与 によ り、前 脛 骨
NADPH-oxidase 遺 伝 子 発 現 および H 2 O 2 濃 度
筋 における種 々の炎 症 性 サイトカインの遺 伝 子
などの酸 化 ストレス指 標 に影 響 を及 ぼさなかっ
発 現 やタンパク質 濃 度 が増 加 することに加 え、
た。また、MCP-1 および F4/80 の遺 伝 子 発 現
H 2 O 2 濃 度 および NADPH-oxidase の遺 伝 子 発
にも影 響 がみられなかったことから、本 研 究 で用
現 が増 加 す ることが示 さ れた。近 年 、骨 格 筋 損
いた筋 損 傷 モデルにおいては、少 なくとも筋 損
傷 時 の炎 症 反 応 や酸 化 ストレスはマクロファー
傷 後 のクルクミン投 与 はマクロファージの浸 潤 を
ジや好 中 球 などの炎 症 細 胞 によって調 節 されて
抑 制 することなく、炎 症 反 応 や酸 化 ストレスにも
いることが報 告 されているが、本 研 究 ではカルデ
変 化 が認 め られな かっ た可 能 性 が 考 えら れる 。
ィオトキシン投 与 によってマクロファージの浸 潤
有 酸 素 運 動 時 には、ミトコンドリア電 子 伝 達 系
を 特 異 的 に 誘 導 す る MCP-1 遺 伝 子 発 現 や
のアデノシン三 リン酸 (ATP)産 生 過 程 で H 2 O 2
F4/80 遺 伝 子 発 現 が増 加 することが示 された。
などの活 性 酸 素 が産 生 されることが知 られてい
さらに、MPO 濃 度 がカルディオトキシン投 与 によ
る (Powers SK et al., 2008)。一 方 で、筋 損 傷
り増 加 する ことも示 さ れ た。NADPH-oxidase は
時 にはマクロファージなどの炎 症 細 胞 が組 織 に
主 にマクロファージや好 中 球 の細 胞 膜 に存 在 し、
浸 潤 し、貪 食 を行 った際 に細 胞 膜 に存 在 する
H2O2 の 産 生 を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る
酸 化 酵 素 である NADPH-oxidase が活 性 化 され、
(Powers SK and Jackson MJ. 2008)。また、MPO
H 2 O 2 などの活 性 酸 素 が生 成 されることが知 られ
は H 2 O 2 から次 亜 塩 素 酸 (HOCl)産 生 を誘 導 す
ている (Halliwell B et al. 2007)。さらにこれらの
ることが知 られている。したがって、カルディオト
活 性 酸 素 は、NF-κB などのシグナル伝 達 経 路
キシン投 与 によって炎 症 反 応 や酸 化 ストレスが
を 活 性 化 し 、 IL ‐6 な どの 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を
誘 導 されるが、これらの現 象 はマクロファージや
誘 導 し て い る こ と が 知 られ て い る (Gloire G et
好 中 球 の浸 潤 亢 進 によ って生 じた可 能 性 が考
al., 2006: Baeuerle PA, 1998)。本 研 究 より、カ
えられる。
ルディオトキシン投 与 による炎 症 性 サイトカイン
一 方 で、抗 炎 症 作 用 、抗 酸 化 作 用 を示 すク
および活 性 酸 素 の増 加 は炎 症 細 胞 の組 織 浸
ルクミンは筋 損 傷 後 の炎 症 反 応 を抑 制 すること
潤 によるものであり、局 所 的 な筋 組 織 損 傷 後 の
が明 らかにされている。実 際 に、ダウンヒル運 動
炎 症 反 応 と 酸 化 ス ト レ スは 、 クル クミン 投 与 に よ
を用 いた筋 損 傷 モデルにおいて、損 傷 4 日 前
り抑 制 さ れ ないことが示 唆 された 。今 後 は、ク ル
からのクルクミン投 与 により、損 傷 24 時 間 後 の
クミンの示 す運 動 時 の炎 症 反 応 への影 響 につ
TNF- αや IL-1βなど の 炎 症 性 サ イ トカ イ ン濃
いて、筋 損 傷 を伴 わない低 強 度 の持 久 性 運 動
度 が減 少 することが報 告 されている (Davis JM
モデルを用 いて検 討 する必 要 があると思 われ
et al., 2007)。しかしながら、150 分 のダウンヒル
る。
運 動 には 物 理 的 な 筋 損 傷 の みで な く 様 々 な全
また、クルクミンの影 響 が認 められなかった要
身 的 要 因 の影 響 を伴 うことから、純 粋 な筋 損 傷
因 として、ダウンヒル運 動 誘 導 性 筋 損 傷 に比 べ、
誘 導 モデルによる反 応 とは異 なる可 能 性 が考 え
カルディオトキシン誘 導 性 筋 損 傷 時 には炎 症 の
37
スポーツ科学研究, 9, 29-40, 2012 年
程 度 が大 きいことが挙 げられる。これまでに、
本 研 究 では、過 度 の筋 損 傷 モデルを用 いて
150 分 のダウンヒル運 動 (22m/min, -14%) 24
クルクミン投 与 の影 響 を検 討 したが、今 後 はより
時 間 後 には、筋 損 傷 マーカーであるクレアチン
軽 度 な筋 損 傷 モデルを用 いることや、組 織 学 的
キナーゼ活 性 がおよそ 220U/L まで上 昇 するこ
手 法 による免 疫 細 胞 の浸 潤 について検 討 する
とが報 告 されている (Davis et al., 2007)。一 方
ことが必 要 である。また、本 研 究 ではカルディオ
で、カルディオトキシン投 与 24 時 間 後 にはおよ
トキシン投 与 直 後 にクルクミン摂 取 を行 ったが、
そ 600U/L まで上 昇 する (Shi H et al., 2010)。
損 傷 前 から 摂 取 さ せ 、 筋 損 傷 抑 制 効 果 に つ い
さらに、Davis らによる研 究 (2007)では、炎 症 性
てさらなる検 討 を行 う必 要 があると考 えられる。
サイトカインである TNF-α のタンパク質 濃 度 が、
ダ ウ ン ヒ ル 運 動 24 時 間 後 に 20pg/100μg
Ⅴ. 結 論
protein ま で 上 昇 し た の に 対 し 、 我 々 の 研 究 で
カルディオトキシンによる筋 損 傷 誘 導 により過
はカルディ オトキ シン 投 与 24 時 間 後 にお よ そ
剰 な炎 症 反 応 および酸 化 ストレスが生 じるもの
85pg/100μg protein まで上 昇 した。したがって、
の、少 なくとも筋 損 傷 後 のクルクミン投 与 はこれ
カルディオトキシン誘 導 性 筋 損 傷 はダウンヒル
らの現 象 には影 響 を及 ぼさない可 能 性 が示 さ
誘 導 性 筋 損 傷 に比 べ過 度 の炎 症 を伴 うために、
れた。
クルクミンの効 果 が認 められなかったと考 えられ
る。さらに、クルクミンの投 与 タイミングも影 響 を
Ⅵ. 参 考 文 献
及 ぼす要 因 と考 えられる。Davis らの研 究 では、
1)
Aggarwal BB, Shishodia S. Suppression of
運 動 72 時 間 前 よりクルクミン粉 末 を含 む餌 を摂
the
取 させていたのに対 し、我 々はカルディオトキシ
pathway
ン投 与 直 後 にクルクミンを経 口 投 与 した。本 研
phytochemicals: reasoning for seasoning.
究 では、通 常 のクルクミンの約 30 倍 もの吸 収 性
Ann N Y Acad Sci. 1030: 434-441. 2004.
が認 められている細 粒 化 された高 吸 収 クルクミ
2)
ンを用 いた。したがって、先 行 研 究 同 様 のプロト
nuclear
factor-kappaB
by
Baeuerle
PA.
at
structures:
コルを 用 い るとクル クミ ンの 吸 収 が 過 剰 と な る お
inflammation
それがあるために本 投 与 タイミングとした。Davis
activation
spice-derived
IkappaB-NF-kappaB
the
interface
control.
Cell.
of
95(6):
729-731. 1998
らの先 行 研 究 では血 中 および筋 組 織 中 のクル
3)
クミン濃 度 が検 討 されていないため、我 々の研
Biswas SK, McClure D, Jimenez LA,
究 とクルクミン吸 収 動 態 を比 較 することは困 難 で
Megson IL, Rahman I. Curcumin induces
あるが、これらのプロトコルの違 いが及 ぼす影 響
glutathione
も検 討 する必 要 がある。さらに Davis らの研 究 で
NF-kappaB activation and interleukin-8
はヒラメ筋 が用 いられている。本 研 究 では、カル
release
ディオトキシン投 与 筋 損 傷 モデルで一 般 的 に用
in
biosynthesis
alveolar
and
epithelial
inhibits
cells:
mechanism of free radical scavenging
いられている前 脛 骨 筋 を対 象 とし たが、前 脛 骨
activity. Antioxid Redox Signal. 7(1-2):
筋 はヒラメ筋 に比 べ速 筋 繊 維 が多 く含 まれてい
32-41.7: 32–41, 2005.
るため、これらの筋 繊 維 タイプの違 いが及 ぼす
4)
影 響 も考 慮 して今 後 実 験 を行 う必 要 がある。
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スポーツ科学研究, 9, 29-40, 2012 年
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