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Corning® HepatoCellsスフェロイド：
Corning® HepatoCells スフェロイド： 肝毒性試験の新規３次元ハイスループットモデル 技術資料 Feng Li, Ph.D. and Rongjun Zuo, Ph.D. Corning Incorporated, Life Sciences Bedford, MA USA 材料と方法 はじめに （Corning w Corning 384 ウェルスフェロイドプレート（超低接着表面）、 in vitro での単一細胞株ないしは混合細胞型の肝細胞3次元（3D）培養系 は2次元（2D）培養系に比べ in vivo 挙動をより反映していることが示さ れている。3D 培養によって細胞にはより適切な極性、細胞間接着、肝細胞 機能が生ずる1。このような肝細胞3D 培養システムは産業界とアカデミア の両方で創薬と薬剤開発に向けた検討が行われている2。 本 研 究 で は 二 つ の 新 し い 技 術 を 組 み 合 わ せ て い る。Corning HepatoCells と Corning スフェロイドマイクロプレートを用いて細胞毒 性評価用ハイスループット3D モデルを構築した。Corning HepatoCells はヒト初代肝細胞由来の再生可能肝細胞で、チトクローム P450と薬物ト ランスポーター活性に関して一定の表現形質を持ち、CYP 誘導、代謝、細 胞毒性等の用途に使用可能である。 Corning スフェロイドマイクロプレートは超低接着表面（Ultra-Low Attachment）の丸底ウェルにより各ウェル内にシングルスフェロイド形 成を促進する。本プレートウェル内に形成された HepatoCells シングル スフェロイドは一定の大きさと形状をしている。播種細胞数が少ない時は １スフェロイドあたりの ATP レベルは最初に蒔いた細胞数と高い相関関 係にある。 この新規3D 肝細胞培養システムの評価のために、主要な薬物代謝酵素で ある CYP3A4活性を測定した。我々のデータは2D 培養に比べ3D 培養で CYP3A4活性が大きく亢進していることを示した。さらにスフェロイドの CYP3A4活性は代表的な CYP3A4誘導剤であるリファンピシンによって3 倍に誘導された。 肝毒性試験においては、HepatoCells スフェロイドをアフラトキシン B1、 アセトアミノフェンのような既知の肝毒性物質で処理し、エンドポイント w Corning 96 ウェルスフェロイドプレート（超低接着表面）、（Corning カタログ番号 4515） カタログ番号 4516） 、 （Corning カタログ番号 354881） w Corning HepatoCells（凍結細胞） w Corning HepatoCells 培養培地、（Corning カタログ番号 354882） w ウシ血清（FBS）、（Corning カタログ番号 35016-CV） w Pen/Strep 溶液（100x）、（GIBCO カタログ番号 15140） w 0.4％トリパンブルー、（Sigma カタログ番号 T8154） 培地調製 スフェロイドプレーティング培地 Corning HepatoCells 培養培地 100 mL FBS 10 mL Pen/Strep 溶液 1 mL スフェロイドカルチャー培地 Corning HepatoCells 培養培地 Pen/Strep 溶液 100 mL 1 mL 手順 HepatoCells の解凍 w 50mL コニカルチューブ内に温めたスフェロイドプレーティング培地 15 mL を入れて準備しておく。 生存率評価として bioluminescent-ATP アッセイを行った。3D スフェ w HepatoCells 入りバイアルを液体窒素から出して 37℃温浴で迅速に解 フェロイド培養では2D 培養に比べてアフラトキシン B1誘導性細胞死―こ w バイアル表面に 70％エタノールを噴霧してクリーンベンチ内に持ち込 ロイド培養における CYP3A4活性の亢進と整合性ある結果として、3D ス れは CYP 代謝依存的なプロセスである―の感受性が高くなった。重要な こととして、既知のいくつかの肝毒性物質に対する HepatoCells スフェ ロイド反応の用量依存性 EC50値は既存の in vitro 肝毒性モデルと同等で あった。以上のことから、我々のモデルはハイスループット3D 肝毒性評 価モデルとして有望なものであると考えられる。 凍する。 む。 w バイアル内の細胞を準備してある温プレーティング培地に入れる。 w バイアル内に残った細胞も 50 mL チューブ内プレーティング培地 1-2 mL で洗いこむ。 w ピペッティングにより細胞塊をほぐす。 w プレーティング培地を追加して 50 mL とする。 w 150×g で 10 分遠心する。 w 上清を吸引して除く。 細胞サスペンジョンの準備 スフェロイドカルチャーの維持管理 w 細胞ペレットを 10mL のプレーティング培地に懸濁する。 3日目にスフェロイドカルチャー培地を入れる。 w ピペッティングにより細胞の凝集を解離させシングルセルサスペンジョ 96ウェルプレートの場合 ンとする。 w ここから適量をとってトリパンブルーと混合して血球計数盤で細胞を数 え、細胞数と生存率を算出する。 HepatoCells スフェロイドカルチャーの開始 96ウェルマイクロプレートの場合 w セルサスペンジョンをプレーティング培地で 15×103 細胞 /mL に希釈 する。 w このサスペンジョンを 100µL（1.5K 細胞） / ウェルで分注する。 w 既存培地（100µL/ ウェル）に培地を 100µL 加える 384ウェルプレートの場合 w 既存培地（50µL/ ウェル）に培地を 50µL 加える このあとは毎日、ウェル内培地の半分を除いて（96ウェルは100µL、384 ウェルは50µL）同量のカルチャー培地を入れる操作を行う。 注：もし FBS 使用量を最小限にする場合は3日目の培地交換の時に半量交 換を5-6回行う。 w プレートを 5％ CO2、37℃インキュベーターに入れる。 結果 w 最初の 2 日間は培地交換を行わない。 Corning HepatoCells スフェロイドの特性解析 384ウェルマイクロプレートの場合 Figure 1に示すように、384ウェルプレート使用時の最適細胞数を決定す る目的で一連の希釈系列で細胞数を振って検討した。1ウェル5K 未満の播 種密度ではシングルスフェロイドを形成するのに2∼3日必要であった。 w セルサスペンジョンをプレーティング培地で 30×103 細胞 /mL に希釈 する。 w このサスペンジョンを 50µL（1.5K 細胞） / ウェルで分注する。 w プレートを 5％ CO2、37℃インキュベーター内に入れる。 w 最初の 2 日間は培地交換を行わない。 / ウェルでは細胞は最初にルー 注：播種細胞数が少ない状態（＜5K 細胞） ズな塊となり、そのあと48∼72時間で円滑な外部輪郭形状の単一ス フェロイドとなっていく。 細胞数が多い条件ではスフェロイド形成にはさらに日数が必要であった。 スフェロイドはほぼ円形の輪郭をもったものが形成され、そのサイズも播 種した細胞数と相関した（Figure 1、2）。 構造と形態を評価するために、7日目の HepatoCells スフェロイドを 10％ホルマリン固定しパラフィン包埋後、切片を Hematoxylin-Eosin （H&E）染色して顕微鏡観察した。その結果、中心部まで壊死細胞の兆候 を示す細胞は見られず健常な細胞の集団であった（Figure 2）。播種した Figure 1. 播種密度とスフェロイドサイズの関係。HepatoCells を Corning 384ウェルスフェロイドプレート（カタログ番号4516）に播種して7日間培養した。最初の2日間は培地交換 は行わず、それ以降は培地の半分を交換した。バーは100µm を示す。 細胞数が同一であればウェル間でスフェロイドのサイズと形状はほぼ同等 であった。7日目におけるスフェロイド直径は極めてよい一貫性を示し、 最初にウェルに入れた細胞数との間に明瞭な相関性を示した。7日目スフェ ロイドに関して ATP-bioluminescent assay を行い、スフェロイドが産 であり、それに比べると低いが、これはスフェロイドにおいて CYP3A4 basal 活性が上昇したことに由来すると考えられる。 古典的肝毒性物質の効果 生する ATP レベルと播種細胞数との間にも良好な相関性が見られた。定量 薬物誘導性肝障害（drug-induced liver injury, DILI）は医薬品が市販後 ATP レベルの間に非常に高い相関性が見られた。以上の結果から、播種細 胞数としては1.5K/ ウェルを推奨することとした。 in vivo 状態に近く、in vitro 肝毒性評価系として有望であることが示され ている。Corning HepatoCells 2D 培養でのアフラトキシン B1による肝 毒性は CYP 活性依存性である。このことは CYP 阻害剤のケトコナゾール による前処理によりアフラトキシン B1の毒性作用が抑制されたことで示 された（Figure 4の▼印）。一方、3D 培養系の場合はアフラトキシン B1 誘導性肝細胞死の感受性が亢進していた。培養4日目のアフラトキシン B1 に 対 す る EC50は2D で78.4µ M、3D で20.7µ M で あ っ た。 こ れ は HepatoCells 3D 培養では同じ細胞の2D 培養に比べ CYP 活性が亢進して 的な評価を行った結果、細胞数が少ない（＜5K/ ウェル）段階では細胞数と HepatoCells スフェロイドの CYP3A4活性 HepatoCells スフェロイド（3D）培養における CYP3A4活性を luciferinIPA プローブを用いた特異的 bioluminescent アッセイ（Promega）によ り 測 定 し、2D 培 養 と 比 較 し た。Figure 3に 示 す よ う に2D と3D の CYP3A4活性を測定した。両方の培養系で同時に ATP レベルを測定し、 CYP3A4活 性 を 補 正 し た。 補 正 し た CYP3A4活 性 は3D に お い て2D の 538％であった（Figure 3C）。文献報告においては他の肝細胞株でもス フェロイド化により同様の知見が得られている3。またHepatoCellsスフェ ロイドにおける CYP3A4活性の誘導性についても検討を行った。Table 1 に示すようにスフェロイドをリファンピシン（10µ M）で3日間処理した 時、約3倍の活性上昇がみられた。2D 系では CYP3A4活性誘導は19.6倍 Hematoxylin & Eosin 染色 Corning HepatoCells スフェロイドは健康なコア構造を示す に市場から撤退する理由として最も多い4, 5。ヒト肝細胞3D 培養系はより いたことと整合性のとれた結果である。 Figure 5は7日目の HepatoCells スフェロイド（1.5K/ ウェル）に、肝毒 性物質（アフラトキシン B1とアセトアミノフェン）、非毒性物質（メントー ル）を一連の希釈系列で24時間作用させた後の生存率を示した。本評価系 における EC50値はヒト初代肝細胞や HepG2での2D 培養で報告されてい 7日目スフェロイドの播種細胞数と ATP レベルの関係 播種細胞数と3日目以降スフェロイド直径との関係 播種密度が低い領域では 細胞数と ATP レベルの間に 高い相関関係がある Figure 2. 均質な HepatoCells スフェロイドの形成。384ウェルスフェロイドプレートにグラフに表示した細胞数で播種した。細胞数1.5K の培養7日目スフェロイドを取り出し10％ホ ルマリン含有 PBS で24時間以上固定しパラフィン包埋し10µm 厚切片とした。スフェロイドサイズを測定したグラフでは、表示した各日時で画像を撮影し寸法を測定した。ATP レベル（生 存率）は Promega 社 CellTiter-Glo 3D kit により測定した。 Figure 3. HepatoCells のスフェロイドでは２D 培養に比べ CYP3A4活性（ATP レベルで補正した）が上昇していた。HepatoCells を96ウェルスフェロイドプレートに1.5K/ ウェル播種 培養した。 （A） CYP3A4活性は培養7日目に（スフェロイドは6個をプール（細 した。併行して HepatoCells を Corning BioCoat Collagen I 96ウェルプレートに播種して平板接着（2D） （B） 3D・2D 培養系に関してそれぞれ（A）と同じ細胞数で測定した ATP レベル。（C） ： （A） 胞数9K）して、2D は細胞数100K/ ウェル）Promega 社 Luciferin-IPA キットで測定した。 を（B）で除して補正した CYP3A4活性。エラーバーは n ＝3の標準偏差。 る値と同等かより優れたものであった（Figure 5、Table 2）。初代肝細胞 を用いた in vitro モデルではバラつきが大きいとされていることは、留意 すべき点である。また他方 HepG2では薬物代謝活性が低下しているため、 同細胞を用いた肝毒性物質スクリーニングで CYP- 依存性肝毒性が見逃さ れる可能性がある。 Table 1. HepatoCells スフェロイドでの CYP3A4活性の誘導．リファンピシン（RIF, 10µ M）で3日間の誘導を行った。単一スフェロイドで、又は5スフェロイドを1ウェルに 集めて、培養4、5、6日目に10µ M RIF 含有培地に曝露した。非曝露コントロールとして は0.1％ DMSO 含有培地を使用した。曝露を行った。7日目に Luciferin-IPA プローブで CYP3A4活性測定を行った。 Single Spheroid 結論 Corning HepatoCells スフェロイドを用いてハイスループット3D 培養 系を構築することが可能であった。スフェロイドにおける CYP3A4活性は 2D に比べ高値であった。3D 系における CYP3A4活性は2D 系に比べかな り亢進しており、さらに fold-induction は2D に比べ低下したもののその 誘導能も保持されていた。古典的な肝毒性物質であるアフラトキシン B1, アセトアミノフェンを用いた検討より、本3D 培養系は肝毒性 HTS 評価系 CYP3A4 Activity Fold Change 5 Spheroids DMSO RIF DMSO RIF 167.1 (n = 5) 535.7 (n = 4) 983.9 3,483.8 3.2 3.5 として有用なものであることを示すことができた。 Figure 4. 4日目スフェロイド系と2D 系でアフラトキシン B1（AFB1）に対する反応を検 討した。HepatoCells を96ウェルスフェロイドプレートに1.5K/ ウェル播種した。2D 培 養は Corning BioCoat コラーゲン I 96ウェルプレートに100K/ ウェル播種して接着状態 で培養した。AFB1のグラフ横軸に示す各濃度溶液を調製し、それで各細胞を24時間曝露 した。一部の2D 培養ではケトコナゾール（20µM）で2時間予備培養して CYP 活性を阻害 してから AFB1含有培地を加えた。24時間後に Promega CellTiter-Glo 3D kit で ATP レ ベルを測定し生存率の指標とした。非処理群で生存率を補正し、Graphpad software で 非線形回帰分析と EC50値算出を行った。エラーバーは n = 3の標準偏差。 Figure 5. 7日目の HepatoCells スフェロイドを毒性試験で使用される古典的な肝毒性物質に暴露した EC50 値 96ウェルプレートで培養した7日目 HepatoCells スフェロイド（1.5K/ ウェル）を古典的な肝毒性物質及び非毒性コントロールに24時間曝露した。曝露後に生存率として ATP レベルを測定した。非線形回帰分析と EC50値算出を行った。エラーバーは n ＝3の 標準偏差。 Table 2. Corning HepatoCells 3D 培養系の毒性試験における EC50値と文献値の比較 Toxin EC50 (µM) Corning HepatoCells 3D culture アフラトキシン B1 5.34 Reported EC50 (µM) (2D Culture) References 10 (HH) >100 (HepG2) 78.4 (Corning HepatoCells) Avior Y, et al. (2015)6 In-house data アセトアミノフェン 14,610 28,200 (HH) 29,755 (HepG2) Jemnitz K, et al. (2008)7 Wang K, et al. (2002)8 メントール Nontoxic Nontoxic Avior Y, et al. (2015)6 HH = human hepatocytes. 文献 1. Lecluyse EL, et al. Organotypic liver culture models: Meeting current challenges in toxicity testing. Crit Rev Toxicol. 2012 Jul; 42(6):501-48. 2. Godoy P, et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Arch Toxicol. 2013 Aug; 87(8):1315-530. 3. Elkayam T, et al. Enhancing the drug metabolism activities of C3A–a human hepatocyte cell line̶by tissue engineering within alginate scaffolds. Tissue Eng. 2006 May; 12(5):1357-68. 4. Soldatow VY, et al. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol Res (Camb). 2013 Jan 1; 2(1):23-39. 5. Kostadinova R, et al. A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2013 Apr 1; 268(1):1-16. 6. Avior Y, et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 2015 Jul; 62(1):265-78. 7. Jemnitz K, et al. Interspecies differences in acetaminophen sensitivity of human, rat, and mouse primary hepatocytes. Toxicol In Vitro. 2008 Jun; 22(4):961-7. 8. Wang K, et al. Advantages of in vitro cytotoxicity testing by using primary rat hepatocytes in comparison with established cell lines. J Toxicol Sci. 2002 Aug; 27(3):229-37. For more specific information on claims, visit the Certificates page at www.corning.com/lifesciences. 保証・免責事項：特に記載がない限り、記載中の製品は研究用機材および試薬です。 診断、または治療用途には使用しないでください。また人体には使用しないでください。 コーニングライフサイエンスは本製品の臨床又は診断用途でのいかなるパフォーマンスについても保証しません。 Beginning-to-end Solutions for Cell Culture At Corning, cells are in our culture. In our continuous efforts to improve efficiencies and develop new tools and technologies for life science researchers, we have scientists working in Corning R&D labs across the globe, doing what you do every day. From seeding starter cultures to expanding cells for assays, our technical experts understand your challenges and your increased need for more reliable cells and cellular material. It is this expertise, plus a 160-year history of Corning innovation and manufacturing excellence, that puts us in a unique position to offer a beginning-to-end portfolio of highquality, reliable cell culture consumables. www.corning.com/lifesciences/solutions For a listing of trademarks, visit us at www.corning.com/clstrademarks. All other trademarks are the property of their respective owners. 総販売元 コーニングインターナショナル株式会社 ライフサイエンス事業部 〒107-0052 東京都港区赤坂 1-11-44 赤坂インターシティ7階 Tel : 03-3586-1996 Fax : 03-3586-1291 www.corning.com/lifesciences [email protected] 技術サポートへのお問い合わせは Tel : 03-3586-1268 [email protected] CLS-112-00 R0-1606-000 -T ©2016 Corning Incorporated. All rights reserved. 価格は2016年6月現在のものです。価格は税抜き価格で記載しております。 商品の外観・仕様は予告無しに変更することがあります。予めご了承下さい。