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Title イネ転移因子mPing挿入を利用した環境ストレス応答性 の改変
Title Author(s) Citation Issue Date イネ転移因子mPing挿入を利用した環境ストレス応答性 の改変( Dissertation_全文 ) 安田, 加奈子 Kyoto University (京都大学) 2015-03-23 URL https://doi.org/10.14989/doctor.k19030 Right 許諾条件により本文は2016/03/31に公開 Type Thesis or Dissertation Textversion ETD Kyoto University イネ転移因子 mPing 挿入を利用した 環境ストレス応答性の改変 2015 安田 加奈子 目次 第 1 章 緒論 ・・・1 第 2 章 mPing 挿入がストレス応答性遺伝子に及ぼす影響 ・・・4 2.1. はじめに ・・・4 2.2. 材料および方法 ・・・7 2.2.1. 供試材料 ・・・7 2.2.2. DNA および種子プールの作製 ・・・7 2.2.3. mPing::対立遺伝子のスクリーニング ・・・7 2.2.4. 転写調節領域のデータベース解析 ・・・14 2.2.5. 塩および低温ストレス処理 ・・・14 2.2.6. Real-time PCR 解析 ・・・15 2.3. 結果 ・・・17 2.3.1. mPing::対立遺伝子の選抜 ・・・17 2.3.2. 転写調節領域のデータベース解析 ・・・17 2.3.3. mPing::対立遺伝子のストレス応答性 ・・・21 2.4. 考察 ・・・26 第 3 章 次世代シークエンスを利用した mPing::対立遺伝子の検索 ・・・28 3.1. はじめに ・・・28 3.2. 材料および方法 ・・・29 3.2.1. 供試材料 ・・・29 3.2.2. mPing 隣接配列の大規模シークエンス ・・・29 I 3.2.3. Nested-PCR 法による mPing 挿入のスクリーニング ・・・36 3.2.4. 塩ストレス応答性の評価 ・・・40 3.2.5. ABA 応答性の評価 ・・・41 3.3. 結果 ・・・42 3.3.1. mPing 挿入部位の特徴 ・・・42 3.3.2. mPing 挿入データベース作製に向けた課題 ・・・44 3.4. 考察 ・・・53 第 4 章 STAmP (Spontaneous Transposition of an Active transposable element mPing)データベ ースの構築 ・・・58 4.1. はじめに ・・・58 4.2. 材料および方法 ・・・60 4.2.1. 供試材料 ・・・60 4.2.2. DNA および種子プールの作製 ・・・60 4.2.3. シークエンスライブラリー調製法 ・・・60 4.2.4. シークエンスおよびアライメント ・・・69 4.2.5. mPing 挿入の選抜 ・・・69 4.3. 結果 ・・・71 4.3.1. シークエンスライブラリー調製法の評価 ・・・71 4.3.2. STAmP DB を利用した mPing 挿入の選抜効率 ・・・76 4.4. 考察 ・・・77 第 5 章 総合考察 ・・・80 謝辞 ・・・82 II 引用文献 ・・・83 摘要 ・・・93 III 第 1 章 緒論 転移因子は染色体上を動くことができる DNA 断片であり、その大きさは数百から数千 bp と様々である。真核生物のゲノムに占める転移因子の割合は極めて高く（Kazazian 2004）、 ヒトゲノムの 60 %（de Koning et al. 2011）、イネゲノムの 35 %（Turcotte et al. 2001）、トウ モロコシゲノムの 85 %以上（Schnable et al. 2009）は転移因子由来の配列である。ゲノム中 に散在する転移因子由来の配列は、1960 年代から 1990 年代にかけて、機能をもたない「Junk DNA」と考えられてきた。しかし、その後の研究において、転移因子がゲノム進化や遺伝 的多様性の拡大に寄与してきたことが明らかになってきた（Lisch 2013; Levin and Moran 2011）。例えば、転移因子を介した、遺伝子重複やエキソンシャッフリングによる新規遺伝 子の創出が報告されている（Jiang et al. 2004a; Morgante et al. 2005）。また、転移因子は遺伝 的あるいはエピジェネティックに近傍遺伝子の発現制御を改変しており（Butelli et al. 2012; Fujimoto et al. 2008）、遺伝子のプロモーター領域への転移因子の挿入は、DNA 配列レベル でのシス因子の破壊やエピゲネティックなサイレンシングを介して、既存のシス因子とト ランス因子の相互作用を阻害する（Corces and Geyer 1991; Martin et al. 2009）。さらに、転移 因子自身のプロモーター活性による近傍の遺伝子間領域の転写（Bièche et al. 2003; Romanish et al. 2007）、転移因子上のシス因子による近傍遺伝子の組織特異的発現や環境応答性への影 響が報告されている（Butelli et al. 2012; Kloeckener-Gruissem et al. 1992）。このような転移因 子の挿入による遺伝子破壊や発現制御の改変は、宿主の表現型を改変し、有用な農業形質 をもたらしてきた（Liu et al. 2008; Kanazawa et al. 2009; Kobayashi et al. 2004）。例えば、ブラ ッドオレンジにおいて低温で誘導されるアントシアニンの蓄積は生合成関連遺伝子 Ruby の 転写調節領域に挿入している転移因子 Rider に起因する（Butelli et al. 2012）。 Miniature Inverted-repeat Transposable Elements（MITEs）は非自律性の DNA 型転移因子の 1 総称であり、その長さは一般的に 600 bp 以下である。MITEs は他の転移因子に比べ植物ゲ ノムに存在するコピー数が多く、イネゲノムには 90,000 コピーを超える MITEs が存在する （Jiang et al. 2004b）。転移因子は通常、宿主ゲノムによるエピジェネティクな制御により転 移活性が抑制されている（Slotkin and Martienssen 2007）。しかし、系統発生学的観点から、 MITEs は進化のある時点で急速かつ劇的にコピーを増加させたと考えられている（Lu et al. 2012）。さらに、MITEs の多くはユークロマチン領域に分布しており（Feng et al. 2002）、遺 伝子の発現制御に関与してきたことが知られている（Zhang et al. 2000）。 イネの Miniature Ping （mPing）は動植物を通じて初めて発見された活性型 MITE である （Jiang et al. 2003; Kikuchi et al. 2003; Nakazaki et al. 2003）。mPing は全長 430 bp で、両端に 15 bp の末端逆方向反復配列（terminal inverted repeat）、挿入部位に TAA あるいは TTA の標 的部位配列重複（target site duplication）をもつ、典型的な tourist 様 MITE ファミリーの因子 である。mPing の自律性因子である Ping および Pong はそれぞれ 2 つの ORF（ORF1 および 2）を有しており、ORF1 は myb 転写因子の DNA 結合ドメインと類似したタンパク質を、 ORF2 は転移酵素をコードしている（Jiang et al. 2003; Yang et al. 2007）。mPing は Ping の内 部配列欠損により生じたと考えられており、ORF1 のプロモーター領域を含む。 mPing は品種‘銀坊主’において、特異的に転移活性が高く、一世代一個体あたり約 40 コピーの新規挿入が生じると推定されている（Naito et al. 2006）。mPing の新規挿入部位を 解析した結果、遺伝子の転写開始点上流 500 bp 以内への挿入割合が高く、新規挿入全体の 9.4 %を占めた（Naito et al. 2009）。さらに、mPing 配列上のストレス応答性シス因子によっ て、近傍遺伝子の塩および低温に対する応答性を付与する例が報告されている（Naito et al. 2009）。 このような mPing の特徴から、‘銀坊主’集団内には、mPing 挿入によって発現プロフ 2 ァイルが変化した多数の遺伝子が潜在しているはずである。したがって、適切な選抜系を 構築できれば、目的遺伝子の発現改変に効率的に mPing を利用できると期待される。 現在、様々な生物種で挿入突然変異系統が作製され、遺伝学的解析がおこなわれている。 センチュウの Mos1 挿入突然変異系統（Granger et al. 2004）やショウジョウバエの P 因子お よび piggyBac 挿入突然変異系統（Thibault et al. 2004）などがあり、様々な遺伝子が単離さ れてきた。イネでは、内在性のレトロトランスポゾンである Tos17（Miyao et al. 2003）、外 来遺伝子 Ac/Ds（Kolesnik et al. 2004）、En/Spm-dSpm（Kumar et al. 2005）および T-DNA（Jeon et al. 2000）挿入突然変異系統が作出されており、これらの系統は、遺伝子の機能欠損を目 的としている（Miyao et al. 2003; Tsugane et al. 2006; Takagi et al. 2007; Terada et al. 2007）。こ れに対して、mPing を利用すれば遺伝子破壊だけではなく、遺伝子発現の部位や時期を調整 することが可能となる。したがって、mPing を用いた転写レベルの遺伝的多様性の創出は、 イネ育種における従来にはない遺伝資源の開拓に繋がる。 本研究では、mPing に内在するシス因子のストレス耐性育種への応用を検証するために、 まず、mPing 挿入を転写調節領域にもつ対立遺伝子（mPing::対立遺伝子）のストレス応答 性を解析した（第 2 章）。つぎに、mPing 隣接配列（Flanking sequence tags: FSTs）のデータ ベース（DB）を利用した mPing::対立遺伝子の選抜系の効率を評価した（第 3 章）。さらに、 効率的な FSTs DB 構築法を開発して、STAmP（Spontaneous Transposition of Active transposable element mPing）DB 構築を目指した（第 4 章）。最後に、mPing 挿入遺伝子を利用したスト レス耐性育種について考察した（第 5 章）。 3 第 2 章 mPing 挿入がストレス応答性遺伝子に及ぼす影響 2.1. はじめに 自律性転移因子の配列には自身の ORF を転写するためのプロモーター領域が含まれる。 このプロモーター活性により、転移因子の ORF だけでなく、近傍の遺伝子領域あるいは遺 伝子間領域が転写される場合がある（Bièche et al. 2003; Romanish et al. 2007）。ORF をコード しない非自律性因子の挿入であっても、自律性因子由来のプロモーター領域を含めば近傍 の遺伝子領域や遺伝子間領域の転写ならびに、近傍遺伝子への新規シス因子の供給に繋が る（Sun et al. 2013）。 植物シス因子データベース PLACE の検索では、mPing のセンス鎖およびアンチセンス 鎖にはそれぞれ 10 および 12 個のストレス応答性シス因子が認められ（Fig. 2.1.および Table 2.1.）、mPing は挿入方向によらず、シス因子として機能する可能性がある。また、イネ品種 ‘銀坊主’において本来は塩および低温応答性をもたない遺伝子の mPing::対立遺伝子が塩 および低温応答性を示した（Naito et al. 2009）ことから、mPing の内部のシス因子は近傍の 遺伝子に塩および低温応答性を付与すると考えられた。 ‘銀坊主’における mPing の転移活 性は極めて高く、一世代一個体あたり約 40 コピーの挿入が新たに生じ（Naito et al. 2006）、 その約 10 %は遺伝子の転写開始点上流 500 bp 以内に分布する（Naito et al. 2009）。したがっ て、‘銀坊主’集団内には、mPing の新規挿入により新たなシス因子が供給された多数の mPing::対立遺伝子が潜在している。このことから、mPing 挿入により塩および低温応答性 が改変された遺伝子の供給源として‘銀坊主’を利用すれば、全く新しい育種素材の開発 に繋がると期待できる。 植物はストレス環境に曝されても移動による回避ができないため、多数の遺伝子発現を 大きく変化させてストレス環境に対応する。多くのストレス耐性関連遺伝子は、転写調節 4 Fig. 2.1. Stress responsive cis-elements and core promoter elements on mPing sequence. The function of it is indicated in Table 2.1. The numbers correspond to the numbers in Table 2.1. Table 2.1. The list of the stress responsive cis-elements and the core promoter elements on mPing sequence. No. 1 2 3 4 5 6 7 7 8 9 10 11 12 13 14 Element name ACGTATERD1 ARR1AT ASF1MOTIFCAMV CGACGOSAMY3 CURECORECR DPBFCOREDCDC3 EBOXBNNAPA MYCCONSENSUSAT EECCRCAH1 HEXMOTIFTAH3H4 MYB2CONSENSUSAT MYBCORE WBOXATNPR1 WBOXNTERF3 GA element 15 16 TATA box Y Patch Position (nt) (strand) 316 (+), 112(-) 180(+), 253(+), 344(+), 359(+) 110(-), 299(-) 293(-) 262(+), 166(-) 409(+), 24(-) 265(+), 365(+), 61(-), 161(-) 265(+), 365(+), 61(-), 161(-) 107(+), 303(-) 316(+) 256(-) 170(+), 272(-) 109(-) 422(+, -) 93(+) 128(-) 72(+) 53(-), 329(-) 5 Motif ACGT NGATT TGACG CGACG GTAC ACACNNG CANNTG CANNTG GANTTNC ACGTCA YAACKG CNGTTR TTGAC TGACY GAGAGAGA GCAAAGCA TTATTT CTTCTCTCTC Function responsive to dehydration response regulator responsive to auxin, salicylic acid, and light sugar starvation responsive to copper, hypoxic responsive to ABA responsive to ABA responsive to ABA, stress low-CO2 response to cold responsive to ABA, stress responsive to dehydration; responsive to salicylic acid responsive to wounding core promoter element core promoter element core promoter element 領域にストレス応答性のシス因子を有し、ストレス条件に応答して発現が誘導される。こ れらストレス耐性関連遺伝子のストレス応答性を向上させることでストレス耐性が向上し た例（Ito et al. 2006）や、逆にストレス応答性を低下させたことによるストレス耐性が向上 した例（Zhang et al. 2009a）が報告されている。したがって、mPing 挿入によってストレス 耐性関連遺伝子のストレス応答性に多様性を付与することは、ストレス耐性育種に有用な 遺伝資源となり得ると考えられた。本章では、まず mPing::対立遺伝子の選抜系を構築し、 mPing の新規挿入がストレス応答性遺伝子のストレス応答に及ぼす影響を明らかにした。 6 2.2. 材料および方法 2.2.1. 供試材料 Oryza sativa ssp. japonica の品種‘銀坊主’を供試した。2010 年度に京都大学大学院農学 研究科附属農場において 11,520 個体の‘銀坊主’を栽培し、DNA プールおよび種子プール を作製した（Fig. 2.2.）。 2.2.2. DNA および種子プールの作製 幼苗の葉身約 2 cm を 8 個体まとめて（バルク）サンプリングした後、圃場に移植した。 計 1,440 のバルクサンプルに抽出バッファー（100 mM Tris-HCl pH 8.0、1 M KCl および 10 mM EDTA；Yamamoto et al. 2007a）を 400 µl ずつ添加し、マルチビーズショッカー（安井 器械、大阪、日本）で破砕した。遠心後に上清を回収し、等量のイソプロピルアルコール を添加して DNA を析出させた。遠心により沈殿した DNA を 75 %エタノールで洗浄・乾燥 後、RNase 添加 1/10 TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0 および 1 mM EDTA）中で 37 °C で１時間処 理し、RNA を分解した。NanoDrop 2000（Thermo SIENTIFIC、MA、USA）で DNA 濃度を 測定後、1/10 TE で各 25 ng/µl に希釈した。希釈した DNA バルクサンプルを 15 枚の 96 穴 プレートに分注した DNA プールを作製し、PCR 解析に用いた。ただし、全 1,440 個の DNA バルクサンプルのうち DNA の質が低かった 17 個は PCR 解析から除外した。 登熟期に、全個体から 1 穂ずつ収穫し、DNA バルクサンプルと対応した 8 個体分の穂毎 に分けて収納して種子プールとした（Fig. 2.2.）。 2.2.3. mPing::対立遺伝子のスクリーニング Table 2.2.に示したスクリーニング対象遺伝子は全てストレス応答性遺伝子であり、salT および wsi18 以外は、過剰発現によるストレス耐性の向上が報告されている。対象遺伝子の 転写開始点上流 500 bp 以内への mPing 挿入を選抜するため、遺伝子毎に上流領域を増幅す 7 Fig. 2.2. Screening scheme of mPing-inserted alleles. A total of 11,520 Gimbozu plants were cultivated and self-fertilized. A single DNA bulked sample and a single seed bag were compiled from eight plants. A set of DNA bulked samples (DNA pool) was used for the primary screening by PCR. PCR was performed using target-specific primers (see Fig. 2.2.A, B). Progenies of eight plants in a seed bag corresponding to a DNA bulked sample with mPing insertion were cultivated, and DNA was then extracted for the secondary screening with target-specific PCR (see Fig. 2.2C) 8 Table 2.2. Target genes Gene Gene function Acquired abiotic stress tolerance by overexpression Reference OsDREB1A Transcription factor salt-, drought-, and cold-tolerance Ito (2006) DREB1D Transcription factor salt- and cold-tolerance Zhang (2009b) OsDREB1F Transcription factor salt-, drought-, and cold-tolerance Wang (2008) ZFP252 Zinc finger, C2H2-type domain containing protein salt- and drought-tolerance Xu (2008) ZFP182 Zinc finger, C2H2-type domain containing protein salt-tolerance Huang (2007) SNAC1 Transcription factor salt- and drought-tolerance Hu (2006) OsNAC6 Transcription factor salt- and drought-tolerance Nakashima (2007) ONAC045 Transcription factor salt- and drought-tolerance Zheng (2009) OsLEA3-1 Late embryogenesis abundant protein drought-tolerance Xiao (2007) MYBS3 Transcription factor cold-tolerance Su (2010) OsNHX1 Na+/H+ antiporter salt-tolerance Fukuda (2004) OsGS2 Glutamine synthetase salt-tolerance Hoshida (2000) OsCDPK7 Calcium-dependent protein kinase salt-, drought-, and cold-tolerance Saijo (2000) SalT Salt-induced protein no data wsi18 Late embryogenesis abundant protein no data OsWRKY11 Transcription factor drought- and heat-tolerance Wu (2009) OsbZIP Transcription factor salt- and drought-tolerance Xiang (2008) 9 るプライマーを設計した（Table 2.3.）。PCR 解析は、2x GoTaq®Green Master Mix（Promega、 WI、USA）、DNA 25ng、2.5 µM プライマー各 0.5 µl およびジメチルスルホキサイド 0.25 µl を含む 5 µl 中でおこなった。温度条件は、94 °C 3 分の後、94 °C 30 秒、57 °C 45 秒、72 °C 90 秒を 40 サイクル、そして 72 °C 3 分とした。増幅領域に mPing が挿入している DNA バルク サンプルを特定するため、PCR 産物を 0.8 %アガロースゲルで電気泳動により分離した。 mPing が挿入している DNA バルクサンプルでは本来の PCR 産物よりも約 430 bp 長い PCR 産物が検出される（Fig. 2.3.）。DNA プールの PCR により検出できた mPing::対立遺伝子が 含まれる DNA バルクサンプルと対応する種子プール各 8 個体／穂から得られる計 64 個体 の幼苗の葉身 DNA を鋳型に PCR をおこない、mPing::対立遺伝子をもつ個体を特定した。 Table 2.4.のように、mPing::対立遺伝子（mPing::遺伝子名で表記）ホモ個体と mPing 挿入を もたない個体から自殖種子を収穫し、mPing 挿入系統（GP+）および mPing 非挿入系統（GP-） とした。同一個体に由来する mPing 挿入系統および mPing 非挿入系統との比較から、対象 遺伝子への mPing 挿入効果を解析できる。 ‘銀坊主’ゲノムにおいて、mPing の新規挿入は一世代一個体あたり約 40 コピーと推定 されており（Naito et al. 2006）、その約 10 %は遺伝子の転写開始点上流 500 bp 以内への挿入 である（Naito et al. 2009）。イネのタンパク質をコードする遺伝子が 30,000 であること（Itoh et al. 2007）から、 ‘銀坊主’一世代一個体あたり任意の遺伝子が挿入する確率は 4/30,000 で あり、 ‘銀坊主’11,384 個体中、任意の遺伝子の転写開始点上流 500 bp 以内に mPing が挿入 しない確率は、(1 − 4 /30,000)11,384 ≈ 0.22 と推定できる。したがって、11,384 個体の‘銀坊主’ 集団内には、全遺伝子の 78 %が転写開始点上流 500 bp 以内への mPing::対立遺伝子を少な € くとも一つもつと期待される。 10 Table 2.3. Primer pairs for screening of mPing-inserted promoters Gene Name of primer Primer sequence Amplified site* (Product size) (bp) OsDREB1A DRE_2up_F TTCTGCTTGCTCCTGATTCC -674 ~ +46 (Os09t0522200-01) DRE_2up_R ACTTCCAGGCGAAAAATGAC (720) DREB1D DRE_4up_F GTGGCTAGGACTTGAAGATGCTG -895 ~ +154 (Os06t0165600-01) DRE_4up_R GCACCCCACGGAACACTAGGTGC (1049) OsDREB1F DRE_8up_F CACAACTAATGCTCGATGTCCAAA -519 ~ +81 (Os01t0968800-00) DRE_8up_R CTCGGTGTCCATGGTCGAA (600) ZFP252 ZFP_1up_F GGGAAAGAGAAGTGCACAAGAAA -523 ~ +71 (Os12t0583700-00) ZFP_1up_R CAATTAGCTCCTCTACACCAACACA (594) ZFP182 ZFP_2up_F CCGCGATCATAGACACAATCC -462 ~ +95 (Os03t0820300-01) ZFP_2up_R TGCCTCGGGTGCTTCATCT (557) SNAC1 NAC_1up_F TTTCCCCTTTTCGCTCCAC -529 ~ +87 (Os03t0815100-01) NAC_1up_R ATCCCCATCGCTTCTTGCT (616) OsNAC6 NAC_2up_F CGAGCTCGCTACTACTACTGCTCT -440 ~ +72 (Os01t0884300-01) NAC_2up_R CGCATCCTTATCCCACCAC (512) ONAC045 NAC_3up_F GAATAGACAAGCGCCTAGCTGAA -540 ~ +52 (Os11t0127600-01) NAC_3up_R AAGCAACAAAGGTGGAGACGA (592) OsLEA3-1 LEA_1up_F AGCGAAAGGTAGCAGAACACATC -531 ~ +121 (Os05t0542500-01) LEA_1up_R GTCCTGGTGGGAAGCCATT (652) MYBS3 MYB_1up_F TGGAGACGGAGATGGTGGT -485 ~ +64 (Os10t0561400-02) MYB_1up_R GTTCACCCGTGGCACATTAG (549) OsNHX1 NHX_1up_F AAACTGCCTTTGAACCCTAGCA -420 ~ +138 (Os07t0666900-1) NHX_1up_R ACGAACAGATTGAAACGAGGAAC (558) OsGS2 GS_1up_F AGGCATTGCACGGACTCAC -476 ~ +64 (Os04t0659100-01) GS_1up_R ACGTTTCTAAACCGCTAATCTCCTC (540) OsCDPK7 CDPK_1up_F GGGGCAACGAGACGAAA -324 ~ +132 (Os04t0584600-02) CDPK_1up_R CGAGAGGGAACTGAACTGGA (456) SalT1 SalT_1up_F GCAGAGCTAGCTAGAACAACATCAA -390 ~ +114 (Os01t0348900-01) SalT_1up_R GTCCCTAAATCGCCAGAAGATAAG (504) wsi18 wsi_1up_F GAATCACTCACCAACACACGAA -442 ~ +115 (Os01t0705200-01) wsi_1up_R AAGCAAAGAAAGCACAGCACA (557) OsWRKY11 WRKY_1up_F GCATGCTATGCCCAATATATACCA -488 ~ +132 (Os01t0626400-01) WRKY_1up_R TGTACACGTAATCAGCGCCTTC (620) OsbZIP ZIP_1up_F ATGTGGAGCTCTGGCGTTG -507 ~ +67 (Os02t0766700-01) ZIP_1up_R GATTGCCTGGTTGGTGGTG (574) * The position is indicated in relative to the TSS. 11 Fig. 2.3. Detection of mPing-inserted alleles by PCR. A) Schematic view of the positions of designed primer pairs. Arrows position of site-specific primers. B) An example of the primary screening by PCR. mPing insertion was detected in the No. 5 DNA bulked sample. Filled arrowhead, open arrowhead original amplicon and the mPing-inserted amplicon, respectively. C) Example of the secondary screening by PCR. Segregation of the mPing insertion allele in the selfed progeny of the No. 1 panicle of the No. 5 seed bag (5–1 plant). M 100 bp DNA ladder, P Nipponbare, N, standard D.W 12 Table 2.4. Five paired lines originated from a single Gimbozu plant that differ in mPing insertion compared to the upstream region of five targeted genes Line name Allele GP1+ mPing::OsDREB1A-1 GP1- OsDREB1A GP3+ mPing::OsDREB1A-2 GP3- OsDREB1A GP4+ mPing::ZFP252-1 GP4- ZFP252 GP5+ mPing::ONAC045-1 GP5- ONAC045 GP6+ mPing::OsCDPK7-1 GP6- OsCDPK7 Insertion site of mPing Orientation of from TSS (bp) mPing insertion* -224 reverse - - -224 forward - - -446 forward - - -263 reverse - - -17 reverse - - * “Forward” means that the sense strand of Ping’s promoter sequence on mPing is forward relative to the target gene. “Reverse” means that the sense strand of Ping’s promoter sequence on mPing is reverse relative to the target gene. 13 2.2.4. 転写調節領域のデータベース解析 遺伝子の発現に必須なコアプロモーター因子［TATA box、pyrimidine patch（Y Patch）、 GA element および CA element］および発現時期を制御するシス因子［regulatory element group （REG）］を探索するために、Plant Promoter Database（PPDB; Yamamoto and Obokata 2008） で、OsDREB1A、ZFP252、ONAC045 および OsCDPK7 の転写調節領域を解析した。REG の 機能的特徴は、Plant cis-acting Regulatory DNA Elements database（PLACE; Higo et al. 1999） によって検索した。TATA box および Y Patch は方向性をもつ因子であるが、REG は方向性 がなく、TATA box の上流-20 ~ -400 bp に存在する（Yamamoto et al. 2007b）。対象遺伝子の 転写開始点上流 400 bp 以内にストレス応答性の REG が存在しない場合は、転写開始点上流 1 kbp までを解析対象とした。 2.2.5. 塩および低温ストレス処理 供試種子は 1,000 倍希釈した 25 °C の殺菌剤（ベンレート®；住友化学株式会社、東京、 日本）で 24 時間殺菌した。25 °C で 72 時間催芽処理した種子を、木村氏 B 液で温室にて自 然日長で栽培した。3 葉期の幼苗を 25 °C、14 時間明期 10 時間暗期のインキュベーターで 2 日間順化させた後にストレス処理をした。低温ストレス処理は、4 °C 2 時間とした。塩スト レス処理には 250 mM の NaCl を添加した水耕液中で 24 時間生育させた。播種後 56、84 お よび 111 日目におけるストレス応答性の解析には、催芽後、粒状培土で 4~5 葉期まで生育 させた後、水田土壌を充填したポットに 1 個体／ポットで移植し、自然日長の温室内で生 育させた植物体を用いた。低温ストレス処理は、4 °C 2 時間とした。塩ストレス処理には、 250 mM NaCl 溶液で満たした水槽内に植物体のポットを浸し、24 時間生育させた。ストレ ス処理後の植物体を液体窒素で速やかに凍結させ、RNA 抽出まで-80 °C で保存した。 14 2.2.6. Real-time PCR 解析 TriPure Isolation Regent（Roche Diagnostics、IN、USA）を用い、ストレス処理した幼苗 の葉身から total RNA を抽出した。抽出した RNA を Deoxyribonuclease (RT Grade) for Heat Stop（ニッポンジーン、東京、日本）で DNase 処理した後、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche Diagnostics）で逆転写した。Real-time PCR は、LightCycler® FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I（Roche Diagnostics）で反応液を調製し、LightCycler® 1.5 real-time instrument（Roche Diagnostics）を用いた。プライマーは Table 2.5.を用い、温度条件は、95 °C 10 分の後、95 °C 5 秒、60°C 8 秒（RUBQ は 65 °C）、72 °C 12 秒を 55 サイクルとした。内部 標準には RUBQ（GenBank Accession No. AK121590）を用い、生物学的反復は 3 反復とした。 対象遺伝子の mRNA 発現量は、対照区の mPing 非挿入系統を 1 として相対量を求めた。 15 Table 2.5. Primers for real-time PCR Gene Name of primer Primer sequence OsDREB1A DRE_2RT_F GGACCTGTACTACGCGAGCTT DRE_2RT_R GGCAAAATTGTACAGTTGATTGA ZFP_1RT_F TCACCACTCCTCTTCTCCATTTC ZFP_1RT_R CGCCTCCTCCTCACTACTACTTCT NAC_3RT_F TTGCCAATCGGCGAGGT NAC_3RT_R TTGGTGGCTCGGTTGGTT CDPK_1RT_F GGGACCTCAAGCCAGAAAAC CDPK_1RT_R CGTAATATGGGCTTCCGACAA RUBQ RUBQ_F GCTGCTGTTCTTGGGTTCACA (Os06t0681400-01) RUBQ_R CGTTTCAGACACCATCAAACCA ZFP252 ONAC045 OsCDPK7 16 Product size (bp) 80 194 143 136 150 2.3. 結果 2.3.1. mPing::対立遺伝子のスクリーニング mPing::対立遺伝子の効果を解析するために、17 個の環境ストレス応答性遺伝子を解析対 象とした。salT および wsi18 を除き、これらの遺伝子の過剰発現体におけるストレス耐性の 向上が報告されている（Table 2.2.）。DNA プールおよび種子プールを用いたスクリーニング の結果、OsDREB1A、ZFP252、ONAC045 および OsCDPK7（Fig. 2.3.）に mPing::対立遺伝子 をもつ個体を特定できた。OsDREB1A および ZFP252 については、それぞれ、異なる DNA バルクサンプルから独立に、2 個の mPing::対立遺伝子が見出された。mPing::OsDREB1A-1 および-2 は mPing の挿入方向が異なり（Table 2.4.）、独立に生じたものである。したがって、 mPing::OsDREB1A の mPing 挿入部位は mPing 挿入のホットスポットと考えられる。ZFP252 の 2 個 の mPing:: 対 立 遺 伝 子 は 挿 入 部 位 お よ び 挿 入 方 向 が 同 じ で あ っ た 。 2 個 の mPing::ZFP252 は異なる DNA バルクサンプルに由来しているため、両対立遺伝子は独立に 生じた可能性が高く、mPing::ZFP252 の mPing 挿入部位もホットスポットであると考えられ た。また、mPing::ZFP252 については、一方のみを以降の実験に用いた。mPing::OsDREB1A-1、 mPing::OsDREB1A-2、mPing::ZFP252、mPing::ONAC045 および mPing::OsCDPK7 ホモ個体の 後代をそれぞれ GP1+、GP3+、GP4+、GP5+および GP6+系統とし、各非挿入ホモ個体の後 代を GP1-、GP3-、GP4-、GP5-および GP6-系統とした。 2.3.2. 転写調節領域のデータベース解析 シス因子は転写因子と相互作用して遺伝子の発現を制御する重要な DNA 上の配列であ る。mPing 挿入が遺伝子のストレス応答性に与える影響を評価するために、mPing 挿入後の シス配列を挿入前のシス配列と比較した。PPDB（Yamamoto and Obokata 2008）を用い、 OsDREB1A、ZFP252、ONAC045 および OsCDPK7 の転写開始点上流 1 kbp について解析し、 17 コアプロモーター因子である TATA box、Y Patch および GA element、および、シス因子に 相当する REG を抽出した。REG については PLACE（Higo et al. 1999）を用いて、機能を検 索した（Fig. 2.4.および Table 2.6.）。 OsDREB1A の上流域には、TATA box、Y Patch および REG が、それぞれ、転写開始点上 流 38、10 および 486 bp に認められた。REG には、2 個の黄化応答性シス因子（ABRELATERD1 および ACGTATERD1）、カルシウム応答性シス因子（ABRERATCAL）および 3 個の ABA 応答性シス因子（CACGGTGMOTIF、EBOXNNAPA および MYCCONSENSUSAT）が認め られた。GP1+（mPing::OsDREB1A-1）および GP3+（mPing::OsDREB1A-2）では、mPing が TATA box と REG の間に挿入されていた。TATA box および Y Patch と転写開始点の距離は mPing 挿入で変化しないため、GP+および GP-間で、通常の発現量に差はないと考えられる。 しかし、REG と転写開始点の距離は mPing 挿入で増加するため、mPing 上のシス因子が機 能しない場合、REG によって誘導される応答性は低下すると考えられる。 ZFP252 の上流域には、TATA box および REG が転写開始点上流 31 および 701 bp に、 Y Patch が転写開始点上流 17 および 39 bp に認められた。REG には、ジベレリン応答性シス 因子（WRKY71OS）、2 個の黄化応答性シス因子（ABRELATERD1 および ACGTATERD1） および 2 個のオーキシンおよびサリチル酸応答性シス因子（ASD1MOTIFCAMV および HEXMOTIFTAH3H4）が認められた。GP4+（mPing::ZFP252）では、mPing が TATA box と REG の間に挿入されていた。TATA box および Y Patch と転写開始点の距離は mPing 挿入で 変化しないため、GP+および GP-間で、通常の発現量に差はないと考えられる。しかし、REG と転写開始点の距離は mPing 挿入で増加するため、mPing 上のシス因子が機能しない場合、 REG によって誘導される応答性は低下すると考えられる。 ONAC045 の上流域には、TATA box、Y Patch および光合成関連シス因子（SITEIIATCYTC） 18 Fig. 2.4. Distribution of putative core promoters in upstream regions of target genes. Y Patch Pyrimidine patch, REG regulatory element group ABA abscisic acid 19 Table 2.6. Results of database search of promoter region Gene OsDREB1A (AK105599) Core promoter Site from TSS (bp) Name of cis-elements in PLACE Sequence Function TATA box -27 to -38 Y Patch -1 to -10 REG (CCCACGTG) -479 to -485 ABRELATERD1 ACGTG response to etiolation ABRERATCAL MACGYGB response to calcium ACGTATERD1 ACGT response to etiolation CACGTGMOTIF CACGTG G-box EBOXBNNAPA CANNTG E-box MYCCONSENSUSAT CANNTG response to ABA and cold WRKY71OS TGAC response to gibberellic acid ABRELATERD1 ACGTG response to etiolation ASF1MOTIFCAMV TGACG response to auxin and salicylic acid GTGANTG10 GTGA pollen-specific ACGTATERD1 ACGT response to etiolation HEXMOTIFTAH3H4 ACGTCA Rice OBF1-homodimer-binding site TATA box -23 to -31 Y Patch -8 to -17 -32 to -39 ZFP252 (AY219847) ONAC045 (AK067922) OsCDPK7 (AK061881) REG (CACGTCAC) -694 to -701 TATA -25 to -33 Y Patch -7 to -15 REG (TTGTGGGCTTC) -75 to -85 SITEIIATCYTC TGGGCY relative to cytochrome, oxidative phosphorylation GA -10 to -17 REG (CAAGCCCATCA) -212 to -222 CIACADIANLELHC CAANNNNATC relative to circadian and response to light SITEIIATCYTC TGGGCY relative to cytochrome, oxidative phosphorylation REG (CTCGCGCGC) -452 to -460 CGCGBOXAT VCGCGB response to calmodulin 20 を含む REG が、それぞれ、転写開始点上流 33、15 および 85 bp に認められた。GP5+ （mPing::ONAC045）では、mPing は転写開始点上流 263 bp に挿入されていた。TATA box、 Y Patch および REG と転写開始点の距離は mPing 挿入で変化しないため、GP+および GP間で、通常の発現量および REG によって誘導される応答性に差はないと考えられる。 OsCDPK7 の上流域では、GA element が転写開始点上流 17 bp に、REG が転写開始点上 流 222 bp および 460 bp に認められた。2 個の REG には、それぞれ、光応答性シス因子 （ CIACADIANLELHC お よ び SITEIIATCYTC ） お よ び カ ル モ ジ ュ リ ン 関 連 シ ス 因 子 （CGCGBOXAT）が認められた。GP6+（mPing::OsCDPK7）では、mPing が GA element の 1 bp 下流に挿入されていた。GA element と転写開始点の距離は mPing 挿入で変化しないた め、GP+および GP-間で、通常の発現量に差はないと考えられる。しかし、REG と転写開始 点の距離は mPing 挿入で増加するため、mPing 上のシス因子が機能しない場合、REG によ って誘導される応答性は低下すると考えられる。 2.3.3. mPing::対立遺伝子のストレス応答性 mPing 挿入が遺伝子のストレス応答性におよぼす影響を明らかにするために、塩および 低温ストレス下における対象遺伝子の発現量を GP+系統および GP-系統で比較した（Fig. 2.5.）。 GP1+（mPing::OsDREB1A-1）および GP3+（mPing::OsDREB1A-2）における OsDREB1A の発現量は、無処理区において、挿入方向に関わらず mPing 挿入による影響を受けなかっ た（Fig. 2.5A, B）。塩処理区での OsDREB1A の発現量は通常条件下と同程度であり、挿入に よる変化は認められなかった。低温処理区での OsDREB1A の発現量は通常条件下と比較し て、GP1-（OsDREB1A）で有意に上昇したが、GP1+では発現が上昇せず、mPing 挿入によ って OsDREB1A の塩応答性が抑制された。この結果は、2.3.2.のシス配列のデータベース解 21 Fig. 2.5. Real-time PCR analysis of OsDREB1A (A, B), ZFP252 (C), ONAC045 (D), and OsCDPK7 (E). Total RNA was extracted from mPing-inserted lines and non-inserted lines with no treatment (Control), 4 °C for 2 h (Cold), and 250 mM NaCl for 24 h (Salt). The expression levels of target genes were exhibited as relative values to those of non-inserted lines under the control condition. Data are shown as a mean ± standard error of three replications. Asterisks represent significant differences between the GP- and GP+ (P <0.01, Student’s t test). Different letters in each graph indicate significant differences at 5% probability, by Tukey’s test. 22 析の結果と一致し、mPing 挿入による OsDREB1A の低温応答性シス因子の効果の低下は、 mPing 上のシス因子では十分に回復しなかったと考えられる。一方、GP3-および GP3+では 低温処理による発現上昇が認められなかった。また、mPing 上のシス因子は OsDREB1A に 塩応答性を付与しなかった。 GP4+（mPing::ZFP252）および GP4-（ZFP252）における ZFP252 の発現量は、無処理区 および低温処理区では、ほぼ等しく、mPing 挿入による影響を受けなかった（Fig. 2.5C）。 ZFP252 の発現量は塩処理区において有意に増加し、GP4+では GP4-に比べ応答性がわずか に向上していた。ZFP252 の REG にはオーキシンおよびサリチル酸応答性のシス因子 ASF1MOTIFCAMV が含まれる。オーキシンおよびサリチル酸応答性遺伝子のなかには塩応 答性のものが報告されており、その関連性が示唆されている（Shim et al. 2003; Jain and Khurana 2009）。mPing 挿入により、GP4+における REG の転写開始点からの距離は上流 694 bp から上流 1,124 bp に増大した。しかし、mPing に内在する ASF1MOTIFXAMV が新たな シス因子として供給されることで、GP4+の塩応答性が維持・向上したと考えられる。 GP5-（ONAC045）における ONAC045 の発現量は、無処理区、低温処理区および塩処理 区でほぼ等しかった（Fig. 2.5D）。GP5+（mPing::ONAC045）での ONAC045 の発現量は、無 処理区および塩処理区では GP5-と等しいが、低温処理区では有意に低下していた。Tukey’s test では、低温処理区の GP5-および GP5+における ONAC045 の発現量に有意な差は認めら れなかった。これは、生物学的反復が 3 反復と少なかったためと考えられる。 GP6+（mPing::OsCDPK7）および GP6-（OsCDPK7）における OsCDPK7 の発現は、無処 理区および低温処理区では、ほぼ等しく、mPing 挿入による影響を受けなかった（Fig. 2.5E）。 塩処理区では GP6-では発現上昇する傾向が認められたが、GP6+では発現上昇がみられず、 mPing 挿入により OsCDPK7 の塩応答性が抑制された。GP6+（mPing::OsCDPK7）では、mPing 23 が転写開始点の直前に挿入している。通常条件下での発現量が mPing 挿入の影響を受けな いかったことは、データベース解析の結果と一致する。OsCDPK7 の上流域には塩応答性の シス因子が認められなかったが、未検出のシス因子が存在し、mPing 挿入はその機能を阻害 したと考えられる。また、mPing::OsCDPK7 における mPing 上の低温応答性シス因子の方向 は転写開始点に対して逆方向であったため、低温応答性の付与効果に至らなかったと考え られる。 GP4+で認められた mPing 挿入による塩応答性の増強効果を、生育ステージを通じて確認 するために、播種後 56、84 および 111 日目の mPing::ZFP252 の塩および低温応答性を解析 した（Fig. 2.6.）。生育ステージを通じて、ストレス条件下における ZFP252 の発現量に GP4と GP4+との間に差異はなく、mPing 挿入による塩応答性の向上効果は認められなかった。 24 Fig. 2.6. Real-time PCR analysis of ZFP252. Total RNA was extracted from mPing-inserted lines and non-inserted lines with no treatment (Control), 4 °C for 2 h (Cold), and 250 mM NaCl for 24 h (Salt). The expression levels of target genes were exhibited as relative values to those of non-inserted lines under the control condition. Data are shown as a mean ± standard error of three replications. The same capital letter indicates there is no significant difference at 5% probability, by Tukey’s test. DAS day after seeding 25 2.4. 考察 イネゲノムにおける遺伝子数と‘銀坊主’における mPing の新規挿入数（40 コピー／個 体／世代）から、11,384 個体の‘銀坊主’集団内には、約 78 %の遺伝子に少なくともひと つの mPing::対立遺伝子が新たに生じていると推定された。本研究で対象とした 17 個の遺伝 子座のうち mPing::対立遺伝子が見出されたのは 4 個（23 %）であった。検出できた遺伝子 数が予想の 1/3 以下であったことから、PCR 法による検出では mPing::対立遺伝子を見落と す可能性が高いと考えられた。OsDREB1A および ZFP252 において、同一の部位への独立し た mPing 挿入が認められたことは、mPing 挿入のホットスポットの存在を示唆している。 対象とした遺伝子上流領域がホットスポットとは逆に挿入頻度の極めて低いコールドスポ ットであったため、mPing::対立遺伝子が検出できなかった可能性もある。mPing 挿入のコ ールドスポットの有無を明らかにするためには、更なる研究が必要である。 本研究では、mPing 挿入が近傍のストレス耐性関連遺伝子に塩および低温応答性シス因 子を供給することにより、遺伝子のストレス応答性が向上することを想定していた。しか し mPing::ZFP252 以外はストレス条件下での応答性が mPing 挿入によって向上することは なく、むしろ、本来のストレス応答性が阻害された。このことから、mPing 挿入によるシス 因子の再配置は本来のシスおよびトランス因子の相互作用による転写の促進効果を低下さ せる場合が多いと考えられた。また、mPing::ZFP252 におけるストレス応答性の向上効果は、 分蘖期（56 日目）、幼穂分化期（84 日目）や出穂期（111 日目）の植物体では認められなか った。したがって、mPing 上のストレス応答性シス因子の供給で遺伝子のストレス応答性が 常に向上するわけではないと考えられた。 今回供試した材料の mPing::対立遺伝子には、mPing 挿入がコアプロモーター因子である TATA box、Y Patch や GA element を破壊する例は観察されなかった。一方、Naito et al.（2009） 26 において mPing 挿入によるストレス応答性の付与が観察された遺伝子の転写調節領域をデ ータベース解析したところ、mPing 挿入で TATA box が破壊されている遺伝子が 2 個 （Os01g0178500 および Os02g0582900）認められた。mPing のプラス鎖には TATA box およ び GA element が、マイナス鎖には Y Patch および CA element があることから（Fig. 2.1.）、 mPing が本来の TATA box を破壊しても、mPing 配列自体がコアプロモーターとして機能す ると考えられた。 遺伝子上流への mPing 挿入はストレス応答性遺伝子の応答性を改変する場合が多いこと が明らかになった。GP4+において、mPing 挿入は 3 葉期の幼苗において塩ストレス条件下 での ZFP252 の発現量を増強した。ZFP252 の過剰発現体は野生型に比べ塩耐性が向上する （Xu et al. 2008）ことから、mPing::ZFP252 自体も塩耐性育種における有用な素材と考えら れる。一方、ストレス応答性遺伝子の中には、ストレス耐性を負に制御しているものがあ る（Magnani et al. 2004; Jeon et al. 2010）。したがって、mPing::対立遺伝子の中にはストレス 応答性の阻害によってストレス耐性が向上するものがあると考えられる。ストレス耐性遺 伝子を恒常的に過剰発現させた組換え植物では、ストレス耐性が向上する一方で、通常条 件下での生育は阻害される例が知られている（Kasuga et al. 1999; Hsieh et al. 2002）。このよ うな場合は、耐性遺伝子の発現にストレス誘導性プロモーターが用いられる（Nakashima et al. 2007）。mPing::対立遺伝子は通常条件下における遺伝子発現への影響は小さいので、 mPing::対立遺伝子による発現制御は、通常条件下での生育を大きく変えることなくストレ ス耐性を改変できる。また、 ‘銀坊主’集団から得られる mPing::対立遺伝子は全て自然突然 変異であるから、得られた mPing::対立遺伝子は、直接、育種素材に組み入れられる。mPing 配列上には塩や低温以外のストレス応答性シス因子があることから、mPing::対立遺伝子は 種々の環境ストレスに対応した新規育種素材の開拓に極めて有用と考えられた。 27 第 3 章 次世代シークエンスを利用した mPing::対立遺伝子の検索 3.1. はじめに 転移因子によって機能を喪失した挿入変異遺伝子は、様々な生物において、遺伝子の機 能解析のために利用されてきた（Ivics et al. 2009; Ryder & Russell 2003; Kumar 2008）。イネで は内在性レトロトランスポゾンである Tos17、外来性遺伝子である Ac/Ds、T-DNA、dSpm をもちいた大規模なタギングラインが作製・利用されている（Jeon et al. 2000; Kolesnik et al. 2004; Kumar et al. 2005; Miyao et al. 2003）。タギングラインから目的とする遺伝子の挿入変異 体を特定するため、当初は、転移因子の隣接配列（flanking sequence tags: FSTs）を特異的に 増幅後、増幅産物のシークエンス解析によって挿入部位を決定していた。次世代シークエ ンサー（NGS）の普及により、多数のサンプルを短時間・低コストで解析できるようにな った。2008 年には Petunia の DNA 型トランスポゾン dTph1 挿入変異集団 1000 個体につい て、挿入座の網羅的解析が 454 シークエンサーを用いておこなわれた（Vandenbussche et al. 2008）。その後、さまざまな動植物で NGS による FSTs 解析により、挿入座の情報および種 子が公開されている。イネの挿入変異ラインについても NGS による FSTs 情報が RiceGE （http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE）および OrygenesDB（http://orygenesdb.cirad.fr）で検索 できる。2015 年 1 月現在で RiceGE には 370,179 個、OrygenesDB には 245,508 個の FSTs が 登録されており、データベース上で対象遺伝子の挿入変異体を選び出すことができる。 mPing においても NGS を使用すれば、 ‘銀坊主’集団内に存在する mPing FSTs を網羅的 に解析でき、極めて効率的に環境ストレス耐性関連遺伝子の mPing::対立遺伝子を検索・利 用できる。本章では NGS を利用した mPing 隣接配列のデータベース（FSTs DB）を構築し、 得られた FSTs DB の mPing::対立遺伝子の検出効率および選抜効率を評価した。 28 3.2. 材料および方法 3.2.1. 供試材料 第 2 章で作製した‘銀坊主’11,520 個体を 8 個体ずつバルクにした 1,440 バルクの DNA プールおよび種子プールを供試した。 3.2.2. mPing 隣接配列の大規模シークエンス 11,520 個体の‘銀坊主’集団における mPing 挿入部位のデータベースを作製するため、 Illumina の Genome Analyzer platform で FSTs を解析した。mPing の 3’隣接領域を hemi-specific PCR 法（Ewing et al. 2010）で特異的に増幅し、シークエンス用ライブラリーとした（Fig. 3.1.）。 ライブラリー調製は‘銀坊主’96 個体分に相当する 12 バルクを 1 サンプルとした。使用し たプライマーの配列は Table 3.1.の通りである。 最初に、mPing 特異的プライマーSQ1_mPing Primer を用いて、ゲノム DNA を鋳型とし た伸長反応を 5 サイクルおこない、mPing の 3’隣接領域を一本鎖で増幅した。反応は、1× PCR buffer、DNA 200 ng、プライマー 0.04 pmol、dNTPs 200 pmol、KOD FX Neo（東洋紡株 式会社、大阪、日本）1 unit を含む溶液 46µl 中でおこなった。温度条件は、94 °C 2 分の加 熱の後、98 °C 10 秒、58 °C 30 秒、68 °C 10 秒のサイクルを 5 回繰り返した。その後、反応 を 58 °C で一時停止し、反応液に 5 µM の SQ1_random Primer を 4 µl 加えたて、Hemi-specific PCR をおこなった。反応条件は、98 °C 10 秒、55 °C 30 秒、68 °C 10 秒のサイクルを 15 回 の後、68 °C 3 分とした。SQ1_random Primer は 3’末端に 8 塩基のランダム配列、5’末端にイ ンデックス配列シークエンス用プライマーの結合配列をもつ。得られた PCR 産物を FastGene Gel/PCR Extraction Kit（日本ジェネティクス株式会社、東京、日本）で精製し、25 µl の GP3 buffer で溶出した。精製した hemi-specific PCR 産物を鋳型に nested PCR をおこな い、mPing の 3’隣接配列を特異的に増幅した。反応は、1×PCR buffer、精製産物 8µl、 29 Fig. 3.1. Schematic representation of large-scale identification of mPing insertion sites. The first five cycles of primer extension were carried out with mPing specific primer in order to enrich the 3’ flanking regions of mPing. After enrichment of mPing flanking sequence, a random primer is added that has eight degenerate bases (NNNNNNNN) and target sequences of index sequencing primer. The nested PCR, then, enriches the 3’ flanking sequence with another primer complementary to the 3’ terminal of mPing and adds the necessary adapter sequences for the Illumina sequencing system via primer overhangs. The DNA fragments of sequencing library finally contained 5 bp random bases, 20 bp mPing 3’ terminal, 3’ flanks of mPing and adapter sequences in both terminal. They were mixed and sequenced on the Illumina Genome Analyzer platform. The random bases and mPing region were trimmed from sequenced reads and 45 bp proceeded reads were aligned to the rice reference genome (IRGSP-1.0). The candidates of insertion sites that distributed within 10 bp were integrated in single site. Gray arrows show the primer binding sites. 30 Table 3.1. Primers for preparation of Illumina sequencing Name of primer Primer sequence SQ1_mPing Primer TATTTTGGGTAGCCGTGCAA SQ1_Random Primer GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCNNNNNNNN SQ2_mPing Primer AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNACTAGCCATTGTGACTGGC*C SQ2_index Primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCA GACGTGTGCTCTTCCGAT*C *: phosphorothioate bond, XXXXXX: index sequence (Table 3.2.) 31 Table 3.2. Index sequence in SQ2_index Primer for preparation of Illumina sequencing Index ID Index sequence 01 CGTGAT 02 GCCTAA 03 TCAAGT 04 CTGATC 05 AAGCTA 06 GTAGCC 07 GGCCAC 08 CGAAAC 09 CGTACG 10 CCACTC 11 ATCAGT 12 AGGAAT 32 SQ2_mPing Primer および SQ2_index Primer 各 300 pM、400µM dNTPs および KOD FX Neo 1unit を含む 50µl 溶液中でおこなった。温度条件は、はじめに 94 °C 2 分、続いて 98 °C 10 秒、62 °C 30 秒、68 °C 10 秒のサイクル 26 回の後に、68 °C 3 分とした。SQ2_mPing Primer は 5’末端から Illumina adapter sequence、Read1 シークエンス用プライマー結合配列、5 塩基 のランダム配列および mPing の 3’末端配列が 20 塩基で構成されている。SQ2_index Primer は 5’末端から Illumina adapter sequence、6 塩基のインデックス配列（Table 3.2.）およびイン デックス配列シークエンス用プライマーの結合配列で構成されている。12 種類のインデッ クス配列を用いることで、11,520 個体の‘銀坊主’集団を 12 グループに分け、それぞれの グループの mPing 挿入部位を区別した。Nested PCR 産物を Midori Green DNA Stain（日本ジ ェネティクス株式会社）で染色した 2 % TAE アガロースゲルで電気泳動し、分離した。サ ンプルと伴に泳動したラダー（Gene Ladder 100 （0.1-2 kbp）、株式会社ニッポンジーン、東 京、日本）のバンドを目安とし、300 から 500 bp の画分を切り出した。FastGene Gel/PCR Extraction Kit を用い、切り出したゲルから DNA を精製した。精製した DNA 濃度を NanoDrop 2000 で測定し、各サンプルから等量の DNA を混合した。混合液を FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、ddH2O 50µl に溶出した。 調製したライブラリーを奈良先端大学院大学の Genome Analyzer IIx（Illumina、CA、USA） で解析した。解析条件は、70 サイクル、シングルエンドとした。得られたリードのインデ ックス配列に基づき、各リードを 12 バルクに分割した。リードは、5’末端からランダム配 列 5 塩基、mPing3’末端配列 20 塩基および mPing の 3’隣接配列 45 塩基で構成されている。 mPing の 3’FSTs を抽出するために、以下の方法でリードから不要な配列をトリミングした （Fig. 3.2.および 3.3.）。はじめに、リードの 5’末端からランダム塩基に相当する 5 塩基を除 いた。Cutadapt v1.2.1（http://www.cutadapt/）を用い、パラメーターを 33 Fig. 3.2. Schematic representation of the read processing. 34 #Trimming random bases (5 bases) from 5ʼ’ ends of reads gunzip -‐‑‒c [input.fastq.gz] | fastx_̲trimmer -‐‑‒f 6 -‐‑‒l 70 -‐‑‒Q 33 | gzip > [output.fastq.gz] #Trimming mPing sequences and removing reads which are shorter than 42 bases or longer than 48 bases after trimming with “cutadapt” cutadapt -‐‑‒g ACTAGCCATTGTGACTGGCC -‐‑‒e 0.1 -‐‑‒m 42 -‐‑‒M 48 -‐‑‒o [output.fastq.gz] [input.fastq.gz] #Trimming low quality bases from 3ʼ’ ends of reads with “FASTX” gunzip -‐‑‒c [input.fastq.gz] | fastq_̲quality_̲trimmer -‐‑‒t 20 -‐‑‒Q 33 -‐‑‒z -‐‑‒o [ouput.fastq.gz] #Removing reads which are shorter than 20 bases with “PRINSEQ” gunzip -‐‑‒dc [input.fastq.gz] | prinseq-‐‑‒lite.pl -‐‑‒fastq stdin -‐‑‒min_̲len 20 -‐‑‒out_̲good [output] ; gzip [output.fastq] #Removing reads which have low quality bases over 80 % of their reads with ”FASTX” gunzip -‐‑‒c [input.fastq.gz] | fastq_̲quality_̲filter -‐‑‒q 20 -‐‑‒p 80 -‐‑‒Q 33 -‐‑‒z -‐‑‒o [ouput].fastq.gz #Alignment of reads with “bowtie” mkfifo file1.fifo gunzip -‐‑‒c $file > file1.fifo & bowtie -‐‑‒n 3 -‐‑‒m 1 -‐‑‒a -‐‑‒-‐‑‒best -‐‑‒-‐‑‒strata -‐‑‒p 1 [reference genome] file1.fifo > [output.txt] Fig. 3.3. Script of the read processing. 35 -g ACTAGCCATTGTGACTGGCC に設定し、mPing 配列を除いた。同時に、パラメーター を-m 42 –M 48 に設定し、mPing を除去後の配列長が 42 塩基以下および 48 塩基以上のリー ドを除去した。ここまでのトリミングで、リードは mPing 隣接配列のみで構成される。続 いて、リードの 3’末端から低品質の塩基（Phred score < 20）をトリミングし、トリミング後 のリード長が 20 塩基以下になったリードを除去した。さらに、fastq quality filter 0.0.13.2 （http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）を用い、Phred score < 20 の塩基がリードの 20 %以 上を占めるリードを除去した。これらのトリミングおよびフィルタリング除去で残ったリ ー ド を 、 bowtie （ http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml ） で イ ネ ゲ ノ ム （Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0）にアライメントし、マップされたリードの 5’末端を mPing 挿入部位とした。検出される隣接配列は、実際の挿入部位から数塩基ずれる可能性が あるため、10 bp 以内に検出された挿入部位のクラスターは同一の挿入部位とした。mPing の挿入部位および該当する DNA・種子バルクの情報を統合した FSTs DB を構築した。 mPing 挿入部位の遺伝子からの距離を解析するために、Rice Annotation Project Database （Sakai et al. 2013）から FL-cDNA、EST およびタンパク質で裏付けされた、2013 年 1 月 19 日現在で最新の遺伝子データセットを取得した。 3.2.3. Nested-PCR 法による mPing 挿入のスクリーニング FSTs DB で得られた挿入部位の情報をもとに、33 個の mPing 挿入を選抜した（Table 3.3.）。 目的とする領域を増幅するプライマーセットを作製し（Table 3.4.）、挿入が検出されたグル ープに関して nested PCR 法により mPing の有無を確認した。1st PCR は 10µl の反応液中に DNA 25 ng、各プライマー0.25 µM、0.5 µl ジメチルスルホキサイド、2× GoTaq® Green Master Mix 5 µl を含んだものを用いた。反応条件は、94 °C 3 分の後に、94 °C 30 秒、63 °C 30 秒（-1 °C ／サイクル）、72 °C 1 分のサイクルを 6 回、94 °C 30 秒、57 °C 30 秒、72 °C 1 分のサイクル 36 Table 3.3. Insertions targeted in screening and results of screening Primer pair for 1st PCR Primer pair for 2nd PCR Gene DNA pool Seed pool Rachis Reads F1/R1 F1/mP1 Stress (Os01g0968800) + - - 18 KG_02_1 F/R F/mR Random + + + 140 02.fa15697226F KG_02_4 F2/R1 F2/mP1 + + + 22 02.fa29800539R KG_02_6 F1/R1 F1/mP3 + - - 4 03.fa10969746R KG_03_2 F1/R1 F1/mP3 + + + 80 03.fa29541085F KG_03_5 F3/R2 F3/mP1 + + + 180 03.fa29541215F KG_03_5 F4/R2 R2/mF + + + 137 03.fa33955261F KG_03_6 F1/R2 F1/mR + + + 55 03.fa20250000R KG_03_7 F2/R1 F2/mF + - - 2 04.fa33640696F KG_04_2 F1/R1 F1/mP1 + + + 1 04.fa33641072F KG_04_2 F2/R2 R2/mP3 + - - 6 04.fa33640782R KG_04_2 F1/R1 F1/mP3 Stress (Os02g0466400) Chlorophyll (Os02g0717900) Chlorophyll (Os03g0308100) Stress (Os03g0726200) Stress (Os03g0726200) Chlorophyll (Os03g0811100) Chlorophyll (Os03g0563300) Stress (Os04g0659300) Stress (Os04g0659300) Stress (Os04g0659300) + - - 11 04.fa28304736F KG_04_3 F1/R1 F1/mP1 Random + + + 1588 04.fa28304736R KG_04_3 F1/R1 F1/mP3 Random + + + 1807 04.fa14865058R KG_04_4 F3/R2 F3/mP3 Random + + + 8 05.fa1062063R KG_05_1 F/R F/mF Random + - - 11 05.fa24063496R KG_05_2 F1/R2 R2/mP1 - - - 1 06.fa5677251R KG_06_3 F1/R1 F1/mF + + + 21 06.fa11689170R KG_06_6 F3/R2 F3/mF Stress (Os05g0489700) Stress (Os06g0211200) Stress (Os06g0308100) + + + 2 07.fa23013045F KG_07_2 F1/R1 F1/mP1 Random + + - 946 08.fa10719480F KG_08_4 F1/R2 F1/mP1 + + + 6 08.fa10719374F KG_08_4 F1/R2 F1/mR + - - 44 08.fa10719385F KG_08_4 F1/R2 F1/mR + - - 12 08.fa21512600F KG_08_5 F1/R1 R1/mR + + + 3571 08.fa26534064R KG_08_6 F1/R1 F1/mF Chlorophyll (Os08g0277200) Chlorophyll (Os08g0277200) Chlorophyll (Os08g0277200) Chlorophyll (Os08g0441500) Chlorophyll (Os08g0532200) + - - 87 10.fa22045462F KG_10_1 F/R2 F/mR Random + - - 1 Insertion ID Primer ID 01.fa42727150F KG_01_5 02.fa11741885F 37 Table 3.3. (Continued) Insertion ID Primer ID Primer pair for 1st PCR Primer pair for 2nd PCR Gene DNA pool Seed pool Rachis Reads 10.fa18900305F KG_10_2 F1/R1 R1/mF + + - 186 10.fa22486910R KG_10_3 F1/R2 F1/mP3 + + + 1 10.fa22486913F KG_10_3 F1/R2 R2/mP3 + + + 9 10.fa22486966F KG_10_3 F1/R2 R2/mP3 + - - 1 10.fa20682005R KG_10_4 F1/R1 F1/mF + + + 1 10.fa20682131F KG_10_4 F1/R1 F1/mP1 Chlorophyll (Os10g0496900) Chlorophyll (Os10g0567400) Chlorophyll (Os10g0567400) Chlorophyll (Os10g0567400) Chlorophyll (Os10g0532100) Chlorophyll (Os10g0532100) + + + 34 12.fa25020062R KG_12_1 F/R F/mF Random + + + 23 32 19 21 Total (33) * “+” means detected and “-“ means undetected. 38 Table 3.4. Primer sequences Name of primer Primer sequence Name of primer Primer sequence KG_01_5_F1 GCGACTTGTGCCTCTTTTGG KG_05_2_F1 GAGGCAAGGGTCGCTGTATG KG_01_5_R1 AGGTGTGGGTGTTGGGTTTG KG_05_2_R2 AAAGCCTGCTGGTGATACTGCT KG_02_1_F GGGGATGATTTGGCCTGT KG_06_3_F1 AACGTATGTAAGAGAGACCCCAAAA KG_02_1_R GCGTGAGTGCTGGAGAAAAC KG_06_3_R1 TCTCCTCTCCCACCTCAAAATC KG_02_4_F2 GTCATTAGTTTGTGCGGTGAAATG KG_06_6_F3 TGTTCAGTTACGGTGCTCGTCT KG_02_4_R1 CTTCGTTTTCTCTCTCGTGTGTGT KG_06_6_R2 TTCTTCAATTCCCACACCACTCT KG_02_6_F1 GGCGAGGGTTTGAGTTTGCT KG_07_2_F1 GCCCGTGTGTTCTCTGGTTT KG_02_6_R1 GTCAAGCCGAAGGCGTAATC KG_07_2_R1 CGAAACCGCTGAAAACAAAG KG_03_2_F1 CAGTTAGGGTAGAGCGAGTGGA KG_08_4_F1 AGGCAACGATCAACTATCACAATC KG_03_2_R1 AACGGGTGTGTGTCTGGTG KG_08_4_R2 GCGTTCTTGGCAGCGTCATC KG_03_5_F3 CCCCTCTGTTTCTATTCACTATTCC KG_08_5_F1 CCAAACTTAATCTCACCATGTCCTT KG_03_5_F4 GCCAACTAATGTTCTTCCATATTCC KG_08_5_R1 TCCAACCACACAACCTCACC KG_03_5_R2 CGATCTCTTGTCCCATGCTCT KG_08_6_F1 CATCTCCACGCAACAAGGAG KG_03_6_F1 CAGTGCCAGACCAGGACAAC KG_08_6_R1 GGCTGAGTACCAATCGTAGC KG_03_6_R2 GCAACACCAATGCAGGAGAA KG_10_1_F GCTAGGCAGCTACTGTGTATTGTGT KG_03_7_F2 GGAAAAGCGGAGAGGGAGAG KG_10_1_R2 CGATTCCTTCCTTTTCTTGCTC KG_03_7_R1 CTTTCGGGACTTGTGCTGTG KG_10_2_F1 GTATAAAACGCCCGCCTAATCTC KG_04_2_F1 GACGGAGGAGAGGGTAGGAAA KG_10_2_R1 GAGCAAACCACAGAGCCACA KG_04_2_F2 CCGTGCGTGGTTCTCTCATT KG_10_3_F1 AACCGAGGGTGGTTTTGTCT KG_04_2_R1 ATCCAGCCAATGAGAGAACCA KG_10_3_R2 GGGAGTACCGCCAAACGTAA KG_04_2_R2 TTGCCGATAACTAAACACACAGTTC KG_10_4_F1 GAAAGTTGGCACCTCCTTGC KG_04_3_F1 CGACGTCAACCTAAATTCTTATCC KG_10_4_R1 CTTGCCATGGGAACAACCTG KG_04_3_R1 GCCACCTCTCGTTTTCTTCCT KG_12_1_F CGGCGAGGGATGCTACTTT KG_04_4_F3 CGATAACGCACCCATCTGGC KG_12_1_R CCACTCACCTACACCGCTTG KG_04_4_R2 AACAGCTTCTGCCAGAAACC mP1 AATGTGCATGACACACCAG KG_05_1_F GTCATTTGAGACCGTTTACCTTTTG mP3 TATTTTGGGTAGCCGTGCAA KG_05_1_R GCCTACACCAACTGCCCAAC mF TCGTCAGCGTCGTTTCCAAGT mR TGGAGGGGTTTCACTTTGACG 39 を 24 回、最後は 72 °C 5 分とした。1st PCR 産物を 1/10 TE buffer で 10 倍希釈し、2nd PCR の鋳型とした。2nd PCR は 10 µl の反応液中に 1st PCR 産物希釈液 1 µl、各プライマー0.25 µM、 0.5 µl ジメチルスルホキサイド、2× GoTaq® Green Master Mix 5 µl を含んだものを用いた。 プライマーは、1st PCR の片方およびそれと対になる mPing 内部プライマーを用いた（Table 3.3.）。反応条件は、1st PCR と同じとした。2nd PCR 産物をエチジウムブロマイドで染色し た 1 % TAE アガロースゲルで電気泳動することにより分離した。mPing 挿入を示すバンド が検出される DNA バルクを選抜し、対応する種子バルクから個体（1 穂）あたり 8 粒の種 子を播種し、計 64 個体の幼苗から、個体別に DNA を抽出して mPing 挿入個体を確認した。 挿入ホモ個体および非挿入ホモ個体を自殖により種子増殖し、SP+および SP-系統とした。 3.2.4. 塩ストレス応答性の評価 2013 年度、FSTs 情報をもとに選抜・収穫した OsRMC (Os04g0659300)の転写開始点上流 602 bp に mPing (04.fa33640696F)が挿入している SP1+（mPing::OsRMC ホモ）および非挿入ホ モの姉妹系統 SP1-を実験に供試した。OsRMC は塩ストレス耐性を負に制御する遺伝子であ ると報告した Zhang ら（2009a）の塩ストレス耐性評価法を参考に、塩ストレス条件下にお ける初期成長を観察した。はじめに、55 °C で 4 日間休眠打破し、登熟不良種子を排除する ため水選した後、200 倍希釈したベンレート®T 水和剤 20（北興産業株式会社、東京、日本） 溶液中で 4 °C、24 時間で種子消毒した。9 cm シャーレに濾紙（No.2）を 2 枚重ねて敷き、 対照区では水道水を、塩処理区では 300 mM NaCl を 8 ml 分注した。濾紙の上に殺菌種子を 置床し、明期 14 時間 30 °C／暗期 10 時間 25 °C のサイクルでインキュベートした。濾紙、 水道水および 300 mM NaCl は毎日新しいものに交換した。鞘葉あるいは第 1 葉が種子長の 半分以上になった個体の割合を成長割合として求めた。 40 3.2.5. ABA 応答性の評価 2013 年度、FSTs DB をもとに選抜・収穫した OsChlD (Os03g0811100)の転写開始点上流 32 bp に mPing (03.fa33955261F)が挿入した SP12+（mPing::OsChlD ホモ）およびその非挿入 ホモの姉妹系統 SP12-を供試した。OsChlD はクロロフィル合成関連遺伝子である（Zhang et al. 2006）。はじめに、200 倍希釈したベンレート®T 水和剤 20 で 24 時間処理した。その後、 1×Hoagland 水耕液を用い、明期 14 時間 30 °C／暗期 10 時間 25 °C のサイクルの人工気象 器内で栽培した。播種後 14 日目の第 4 葉期の幼苗を 100 µM ABA を含む水耕液に移し、5 日間栽培した。その後、ABA を含まない水耕液に戻し、6 日間栽培した。処理前および回 復処理後の幼苗の第 4 葉を約 2 cm サンプリングしてクロロフィル含量を測定した。 クロロフィル含量の測定は、ジメチルホルムアミド抽出法を用いた。サンプリングした 植物体の生体重を測定し、ジメチルホルムアミド 3 ml に浸した。4 °C で一晩静置した。ク ロロフィルが溶出されたジメチルホルムアミドの 646.8 nm および 663.8 nm における吸光度 を測定した後、吸光度からクロロフィル a および b の含量を算出し（以下の式）、生体重当 たりのクロロフィル a および b の含量を求めた。 Chlorophyll a (µM) = 13.43 A663.8 – 3.47 A646.8 Chlorophyll b (µM) = 22.9 A646.8 – 5.38 A663.8 41 3.3. 結果 3.3.1. mPing 挿入部位の特徴 第 2 章で作製した‘銀坊主’11,384 個体の集団内に存在する mPing の挿入座を NGS で 網羅的に検出し、mPing の FSTs DB を作製した。まず、hemi-specific nested PCR 法（Ewing and Kazazian 2010 を改良）によりシークエンス用ライブラリーを作製した（Fig. 3.1.）。全 1,423 個の DNA バルクサンプルを 12 グループに分け、それぞれのグループに特異的な 6 塩基の index 配列を含むプライマーを用い、各グループを区別した。作製したライブラリーは mPing の 3’隣接領域、index 配列および Illumina adapter 配列を含み、本ライブラリーを Illumina Genome Analyzer IIx でシングルエンド 76 塩基シークエンスした。demultiplex したのち、リ ードを mPing の 3’隣接領域のみにトリミングし、イネゲノムにアライメントした。 アライメントの結果、222,086,314 リード（全リードの 96 %）がイネゲノムのユニーク なサイトにマップされ、60,080 個の挿入部位が検出された（Table 3.5.）。アライメントソフ トの性質上 FSTs の末端が実際の挿入部位から数塩基ずれてマップされ得るため、10 bp 以 内に検出された挿入は同一の挿入部位とみなした。この結果、51,666 個の mPing 挿入部位 を特定できた。挿入部位あたりのリード数の中央値は 11 であった。得られた全ての挿入部 位について検出されたバルクを対応させ、Gbrowser で可視化できる BED フォーマットにま とめた FSTs DB を構築した。第 2 章で特定した 5 個の mPing 挿入部位のうち、FSTs DB 上 で確認できたのは 1 個であり、4 個は確認できなかった。また、第 2 章のスクリーニングで mPing::対立遺伝子が確認されなかった 13 個の遺伝子について転写開始点上流 500 bp 以内へ の挿入を FSTs DB で検索した結果、8 個の遺伝子座について 13 個の mPing::対立遺伝子が検 出された。 検出された全ての mPing 挿入部位は、ゲノム全体に分布していること、mPing の挿入数 42 Table 3.5. Classification of reads and flanking sequence tags (FSTs) Category Number of reads FSTs Total reads 230,537,026 - Mapped 222,086,314 51,666 Multi-hit 3,703,409 - Unmapped 4,747,303 - Shared - 1,737 De novo - 35,814 Identified within gene - 9,095* Exon - 4,822* CDS - 1,074* 5’UTR - 1,566* 3’UTR - 1,967* Intron - 4,273* Promoter (-1 to -500) - 9,309* * includes the insertions into the same gene. 43 が多い領域や少ない領域が存在し、とりわけ第 4 および第 9 染色体の短腕への挿入頻度が 低い傾向が認められた（Fig. 3.4.）。各挿入部位について、最近傍の挿入部位までの距離を調 べたところ、1 kbp 以内に隣接して存在するものが最も多く、5 割以上の挿入が 200 bp 以内 に近接して分布していた（Fig.3.5.）。 51,666 個の挿入部位は、タイプ I：12 グループのうち 1 グループのみで検出されたもの、 タイプ II：2 ~ 3 グループで検出されたもの、およびタイプ III：12 グループ全てで検出され たものに分類できた。タイプ I の挿入は特定の個体だけがもつ新規挿入、タイプ II の挿入 は集団内で固定していない比較的新しい挿入、およびタイプ III の挿入は集団内で既に固定 した古い時期の挿入と考えられる。タイプ I、II および III に分類された挿入部位はそれぞ れ 35,814、9,786 および 1,737 個あった（Table 3.5.）。タイプ I の挿入部位と最近傍の mPing との距離を調べた結果、5 割以上が既存挿入の 3 kbp 以内に分布し（Fig. 3.6A）、新規挿入は 既存の挿入部位の近くに集中する傾向が認められた。mPing 挿入部位を詳細に確認すると、 タイプ I の挿入がタイプ II および III の挿入部位の周辺にクラスターを形成していた（Fig. 3.6B）。 全挿入部位を転写調節領域（遺伝子の転写開始点上流 500 bp）、5’UTR、CDS、イントロ ン、3’UTR および遺伝子間領域の 6 群に分類した（Table 3.5.）。mPing は転写調節領域に最 も多く存在し、9,309 個（全挿入部位の 18 %）であった。また、遺伝子内への挿入部位は 9,095 個であった。ひとつの遺伝子に対し複数の挿入部位が認められたケースもあり、重複 をはぶくと、転写調節領域および遺伝子内部に挿入をもつ遺伝子は、5,826 および 5,288 個 であった。 3.3.2. mPing 挿入データベース作製に向けた課題 作製した FSTs DB の実用性を評価するために、mPing::対立遺伝子を含む 33 個の mPing 44 Fig. 3.4. (Continued) 45 Fig. 3.4. Distribution of mPing insertions in all chromosomes. The x axis indicates the distance along the chromosome and the y axes indicate the number of mPing insertions per 500 kbp. 46 Fig. 3.5. Histogram of interval length between neighboring insertions. An enlarged graph represents data in which the interval length was shorter than 1,000 bp. The average and median of the interval length are indicated with arrows. 47 Fig. 3.6. Distribution of new mPing insertions in STAmP database. A) Closer look of insertions. Arrows show the mPing insertion sites. B) Histogram of distance of new insertions from the nearest shared insertions. Right-pointing arrows indicates the forward insertions and Left-pointing arrows indicates the reverse insertions. The darker color indicates the older insertions considering from shared level among 12 groups. 48 を選抜した。mPing::対立遺伝子の選抜対象は、mPing 挿入によるストレス耐性の向上が期 待できるストレス耐性を負に制御する遺伝子、ならびに、mPing がもつシス因子の効果を葉 色で簡便に評価できるクロロフィル合成関連遺伝子である。FSTs DB を用いた in silico 解析 の結果、ストレス耐性遺伝子およびクロロフィル合成関連遺伝子についてそれぞれ 10 およ び 15 個の mPing 挿入が確認でき、それぞれ 5 および 4 個の mPing::対立遺伝子が確認でき た。これら 25 個の挿入に加えて、無作為に選んだ 8 個の挿入部位について DNA プールか ら nested PCR 法で該当箇所を増幅した結果、33 個の挿入部位のうち 32 個を確認できた。 mPing 挿入が確認された DNA バルクサンプルに対応する種子プールから 8 個体／穂で育成 した計 64 個体を調査した結果、32 個中 21 個について挿入をもつ個体を特定できた（Table 3.3.）。新規挿入に関してヘテロの個体から採種した 8 個体中、挿入をもつ個体が 1 個体も 含まれない確率は、0.0015 %と非常に低い。つまり、DNA バルクサンプルで検出された mPing 挿入が種子のサンプリングエラーで認められない可能性は低い。DNA プール作製には各個 体の葉身から抽出した DNA を用いている。したがって、DNA プールのみで検出された挿 入は葉身特異的な挿入であったと考えられる。種子プールとして保存している穂の穂軸か ら抽出した DNA サンプルでは、種子プールで確認された mPing 挿入の全てが検出されたが、 種子プールで確認できなかった 13 個のうち 11 個は検出されなかったかったことからも、 FSTs DB には葉身特異的な挿入が多く含まれると考えられた。 FSTs DB をもとに選んだストレス耐性を負に制御する遺伝子座の mPing::対立遺伝子の ストレス応答性を観察した。OsRMC の転写開始点上流（-602 bp）に mPing 挿入をもつ SP1+ および非挿入姉妹系統 SP1-の塩ストレス応答性を比較した（Fig.3.7.）。SP1+は SP1-に比べ、 塩条件下における初期成長が速くなった。また、クロロフィル合成関連遺伝子である OsChlD の転写開始点上流（-32 bp）に mPing 挿入をもつ SP12+およびその非挿入姉妹系統 SP12-の 49 Fig. 3.7. mPing insertions found in salt tolerance related gene (OsRMC). A) The mPing insertion site in STAmP database. The size of the insertion is not proportional to the size of the gene. Numbers indicate the distance from transcription start site. Boxes represent exons. B) Seed germination of mPing insertion line with OsRMC under 300 mM NaCl condition. 50 ABA 応答性を比較した（Fig. 3.8.）。通常条件下において SP12+は SP12-に比べ薄い緑色を呈 し（Fig. 3.8B）、SP12+のクロロフィル a および b の含量は、どちらも SP12-の約半分であっ た（Fig. 3.8C）。これに対して、5 日間の ABA 処理後、6 日間の回復処理をした植物体では クロロフィル含量に関して、両系統に差異がなく、SP12+の緑色程度は SP12-と同程度であ った（Fig. 3.8C）。 51 Fig. 3.8. mPing insertions found in chlorophyll synthesis related gene (OsChlD). A) The mPing insertion site in STAmP database. The size of the insertion is not proportional to the size of the gene. Numbers indicate the distance from transcription start site. Boxes represent exons. B) The segregation of leaf color in the next generation. The leaves were peal green with mPing insertion allele. Minus means the no mPing insertion and plus means the mPing inserted allele in OsChlD. C) The chlorophyll contain under control and ABA treatment (treated with 100μM ABA for 5 days following normal condition for 6 days). 52 3.4. 考察 NGS を用いて検出された‘銀坊主’集団内に存在する mPnig 挿入部位 51,666 個の挿入 部位情報（FSTs DB）を検出効率および選抜効率から評価した。第 2 章においてスクリーニ ングした 17 個の遺伝子の mPing::対立遺伝子を FSTs DB を用いて再検索した結果、PCR に よる検索では検出できなかった 13 個の mPing::対立遺伝子を検出できた。したがって、PCR 法による mPing 挿入の検出感度は低く、多くの mPing 挿入が見落とされていることが明ら かになった。解析に用いた‘銀坊主’は 11,384 個体であり、新規挿入数が 1 個体 1 世代あた り約 40 コピー（Naito et al. 2006）であれば、集団内には約 46 万の新規挿入が存在すること になる。新規挿入と考えられる挿入は 35,814 個しか検出されておらず、推定される新規挿 入の数と大きく異なった。NGS によって得られたリード数自体は十分であり、集団内に 46 万の新規挿入が存在する場合、各新規挿入に割当てられるリード数は平均 10 リードである。 しかし、リード数が最も多かった挿入部位（第 3 染色体 31,364,757 bp）だけで全リード数 の 11 %を占め、上位 10 ヶ所の累計リード数は全リード数の 25 %を超えていた（Table 3.6.）。 特定の挿入部位にリードが集中したことから、調製したシークエンスライブラリーに大き な偏りがあると考えられる。偏りの原因のひとつとして SQ1_mPing Primer による特異的な PCR 増幅が考えられる。挿入方向が異なる mPing が近接している場合、SQ1_mPing Primer を用いた mPing3’隣接領域の一本鎖増幅の際に、mPing 間領域が増幅されることになる。こ の点に関しては、ゲノム DNA を鋳型とした SQ1_mPing Primer による PCR 反応でバンドが 検出され、mPing 間領域の増幅が確認できた（Fig. 3.9.）。また、ランダムプライマーのラン ダ ム 塩 基 数 が 10 塩 基 以 下 に な る と ゲ ノ ム の ラ ン ダ ム 増 幅 が 偏 る と 報 告 さ れ て い る （Kawasaki and Inagaki, 2001）。したがって、ランダム塩基が 8 塩基であったことが、 hemi-specific PCR によるランダム増幅時に偏りが生じた原因である可能性が高い。mPing 新 53 Table. 3.6. The top ten FSTs about read number Chromosome Position (bp) Reads (Rate) chr. 3 31,364,757 25,483,359 (11%) chr. 1 4,076,464 5,320,262 (2%) chr. 6 27,840,591 5,143,220 (2%) chr. 1 8,080,399 4,960,049 (2%) chr. 4 20,249,932 4,049,242 (2%) chr. 3 26,028,786 3,337,571 (2%) chr. 4 21,673,101 3,303,636 (1%) chr. 3 9,014,023 3,122,343 (1%) chr. 5 15,488,460 3,014,031 (1%) chr. 8 20,628,372 2,820,575 (1%) 54 Fig. 3.9. PCR amplification with SQ1_mPing Primer. Left lane is 100 bp DNA ladder and right lane is PCR product amplified with genomic DNA and SQ1_mPing Primer. 55 規挿入の検出率が高く、シークエンスライブラリーの偏りを小さくすることが実用的な FSTs DB 作製には不可欠と考えられた。 mPing 挿入の分布は、特に第 4 および第 9 染色体の短腕で少なく、ユークロマチン領域 に多くなる傾向が認められた。ヘテロクロマチン領域は反復配列やサテライト配列が多く 分布するため、ヘテロクロマチン領域の mPing 挿入は 3’隣接配列が複数の部位にマップさ れ、挿入部位を特定できないので FSTs DB には含まれない。しかし、複数の部位にマップ されたリードは全リードの 5 %以下と非常少なく、これらが全てヘテロクロマチン領域に分 布したとしてもヘテロクロマチン領域の挿入が大きく増えることはない。挿入頻度が特異 的に高いホットスポットの存在は、他の転移因子において報告されている（Urbański et al. 2012、Minaya et al. 2013）。特に、DNA 型転移因子では、本来の挿入部位の周辺への再挿入 が生じ易い（Parinov and Sundaresan 2000）。mPing 新規挿入が既存挿入の周辺にクラスター を形成していたことから、mPing でも既存の挿入部位の周辺に再挿入される割合が高いと考 えられた。 FSTs DB の情報をもとに 33 個の mPing について DNA プールを用いた nested PCR をお こなった結果、32 個の挿入を検出できた。検出できなかった 1 個の挿入は FSTs DB の擬陽 性と考えられる。検出できた 32 個の挿入のうち 13 個は種子プールで認められず、このう ち、11 個については穂軸から抽出した DNA でも検出されなかった。イネの地上部は茎長分 裂組織から分化し形成される。穂は茎長分裂組織に由来する花序分裂組織から分化する。 茎長分裂組織で生じた新規挿入は、切り出されない限り分化した細胞においても存在する。 活性型転移因子の場合、穂に分化する直前の細胞にある mPing 挿入が次世代の種子に伝達 される。種子が分化する直前の組織である穂軸において検出できた mPing 挿入の 90 %はそ の穂に着生した種子で確認できた。 ‘銀坊主’において mPing が最も活発に転移するのは受 56 精後 3~5 日であるが葉身特異的な挿入も少なからず存在し、葉身特異的な挿入は後代に遺 伝しない（Teramoto et al. 2013）。このことから、葉身特異的な挿入を含まない FSTs DB を 作製するには、穂軸から抽出した DNA を用いるべきであると考えられた。 SP1+（mPing::OsRMC）および SP1-における塩ストレス応答性を解析した結果、SP1+で は SP1-に比べ塩ストレス条件下における初期成長速度が上昇していた。OsRMC は塩応答性 の遺伝子であり、ノックダウン体では塩条件下の初期成長速度が上昇すると報告されてい る（Zhang et al. 2009a）。mPing::対立遺伝子では、本来のストレス応答性が阻害される傾向 があるため、mPing::OsRMC では mPing 挿入による塩応答性の低下によって、塩ストレス下 における初期成長が改善された可能性が高い。したがって、mPing::OsRMC は塩ストレス耐 性育種に有用な遺伝資源となり得る。 SP12+（mPing::OsChlD）は、通常条件下においてクロロフィル a および b の含量が低下 していた。OsChlD のノックアウト体でクロロフィル含量が低下していることから（Zhang et al. 2006）、SP12+におけるクロロフィル含量の低下は OsChlD の発現量の低下を示している と考えられる。mPing 上には ABA 応答性シス因子が存在することから、mPing 上の ABA 応 答性シス因子が ABA 処理に応答して OsChlD の発現量を促進し、SP12+のクロロフィル含 量が回復したと考えられる。このことから、mPing::対立遺伝子には ABA 応答性が付与され る可能性も認められた。また、SP12+を用いれば、mPing::対立遺伝子が応答する環境因子の スクリーニングにも利用できると考えられた。 57 第 4 章 STAmP (Spontaneous Transposition of an Active transposable element mPing) DB の構築 4.1. はじめに 植物遺伝子の多くは転写調節領域に転移因子由来の配列を含み、転移因子の種類や挿入 部位によって遺伝子の発現様式が異なる（White et al. 1994）。数百万年におよぶ進化の過程 で、転移因子の増殖と淘汰が繰り返され、挿入された転移因子の多くが遺伝子の発現改変 を介して宿主の適応性向上に関わったと考えられる。しかし、転移因子の新規挿入が宿主 の適応性に及ぼす影響が正負どちらになるかは偶然に支配されている。Saccharomyces cerevisiae のレトロトランスポゾン Ty1 挿入変異集団で適応性を評価した実験では、一部の 挿入は宿主の適応性向上に関与したが、多くの挿入はむしろ宿主の適応性を低下させた （Wilke and Adams 1992）。このように、少数の新規挿入の中から宿主の適応性向上に関わ る挿入を見つけるのは困難である。このため、転移因子による発現制御の変異を植物改良 に利用できるとしても、少数の挿入変異から有用変異を見出すのは実用的ではないと考え られる。 ‘銀坊主’集団内には毎世代極めて多くの mPing::対立遺伝子が創出されており、そ の中には mPing::OsRMC のようにイネのストレス耐性を向上させる変異も含まれている。し たがって、 ‘銀坊主’集団内に蓄積される膨大な mPing 挿入部位を効率的に特定することは、 mPing 新規挿入を育種素材として利用する上で極めて重要である。 第 3 章で作製した mPing FSTs DB の検出・選抜効率を検証した結果、シークエンスライ ブラリー作製時の偏りおよび葉身特異的な挿入の存在が問題となった。シークエンスライ ブラリーの偏りの原因として、1）mPing 内部に設計したプライマーで mPing 隣接領域を増 幅する際に、近接するふたつの mPing 間領域の選択的な増幅および 2）random primer の選 択的なアニーリングが挙げられた。 本研究では、新たな DNA プールを種子プールに用いる穂の穂軸から抽出した DNA で作 58 製することにより、葉身特異的挿入の混入を避けることとした。また、個体間で共通する 新規挿入を減らしてリードが重複することを避けるため、個体別採種を 2 世代繰り返した 後に混合採種して育成した‘銀坊主’集団を新たに育成して用いた。シークエンスライブ ラリーの偏りについては、1）mPing 特異的なプライマーの塩基長を長くすることにより、 mPing 間領域が増幅された場合に両端の mPing 配列同士の自己会合により PCR 増幅が抑制 される suppression PCR 法を適用した。また、2）random primer のランダム塩基を長くする （Kawasaki and Inagaki, 2001）と同時にアニーリング温度を低温にすることで、ランダムな 伸長反応を促進した（Miura et al. 2012）。これらの点を考慮して、新たに作製した DNA プ ールに対して 6 種類の調製法でシークエンスライブラリーを作製し、ライブラリーの偏り、 再現性および新規挿入検出数を比較した。 59 4.2. 材料および方法 4.2.1. 供試材料 2009 年に収穫した‘銀坊主’ （G0）1 個体から得られた自殖種子を用いて、2011 年に 120 個体（G1）を栽培し自殖種子を採種した。2012 年に個体別系統法により 120 系統（G2）を 栽培した（Fig. 4.1.）。G0〜G2 までの 3 回の自殖により G2 各個体には G0 個体にはない約 80 コピーの mPing 挿入を互いに独立にもつことが期待される。 4.2.2 DNA および種子プールの作製 2013 年、120 系統（G2）の各１個体から 1 穂ずつ採種した種子を混合して、10,560 個体 を栽培した（Fig. 4.1.）。全個体から 1 穂ずつ、8 個体 1 バルクで収穫し、全ての穂の軸を約 1 cm ずつ 2 ml チューブにサンプリングし、液体窒素で凍結させた。その後、マルチビーズ ショッカーで破砕し、2.2.2.と同様の手順で DNA を抽出し、DNA プールを作製した。また、 収穫した種子は 1 バルクずつ袋詰めし、種子プールとした。 4.2.3. シークエンスライブラリー調製法 ライブラリー調製方法を検討するため、A〜F の調製法を比較した（Fig. 4.2.）。suppression PCR による mPing 間領域の増幅の抑制には SQ1_mPing Primer を 5’側に 20 塩基追加して 40 塩基にした SQ1_mPing Primer_2 を用い（Fig. 4.3.）、また、ランダムプライミング時の偏り をなくすため、ランダム塩基数を 8 塩基から 15 塩基に増やした（調製法 A および B）。こ の他に、mPing の 3’隣接配列の濃縮過程の省略（調製法 C）、mPing 隣接配列の増幅前にラ ンダムプライミングの実施（調製法 D および E）および制限酵素による断片化（調製法 F） を試みた。プライマーおよびインデックス配列は Table 4.1.および 4.2.に示した。 調製法 A 1）3’隣接領域の濃縮：mPing 特異的プライマーSQ1_mPing Primer_2 を用いて、ゲノム DNA 60 Fig. 4.1. Outline of new Gimbozu population. 61 Fig. 4.2. Schematics of new NGS library for identification of mPing insertion sites. 62 Fig. 4.3. The effect of suppression PCR. PCR were done with genomic DNA using the mPing specific primer. M 100 bp DNA ladder, 20 base PCR product amplified by 20 base mPing specific primer, 40 base PCR product amplified by 40 base mPing specific primer 63 Table 4.1. Primers for preparation of Illumina sequencing Name of primer Primer sequence SQ1_mPing Primer TATTTTGGGTAGCCGTGCAA SQ1_mPing Primer_2 TTTGAGAGAAGATGGTATAATATTTTGGGTAGCCGTGCAA SQ1_Random Primer_2 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCNNNNNNNNNNNN NNN SQ2_mPing Primer_2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCTNNNNNATGACACTAGCCATTGTGAC SQ2_index Primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCA GACGTGTGCTCTTCCGATC Adapter A GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGGTGCTTGATGCTTGA AAA Adapter B TATTTTCAAGCATCAA SQ1_TD_MseI Primer GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCGTGCTTGATGCTT GAAAATAA XXXXXX: index sequence (Table 4.2.). 64 Table 4.2. Index sequence in SQ2_index Primer for preparation of Illumina sequencing Index ID Index sequence 01 CGTGAT 02 GCCTAA 03 TCAAGT 04 CTGATC 05 AAGCTA 06 GTAGCC 07 GGCCAC 08 CGAAAC 09 CGTACG 10 CCACTC 11 ATCAGT 12 AGGAAT 13 CACGTT 14 ACCACT 15 TTGATG 16 CTACAG 17 AACTGG 18 CTTCGG 65 を鋳型とした伸長反応を 5 サイクルおこない、mPing の 3’隣接領域を一本鎖で増幅し た。反応は、1×PCR buffer、DNA サンプル 1 µl、プライマー 0.04 pmol、dNTPs 200 pmol、 KOD FX Neo 1 unit を含む溶液 46µl 中でおこなった。温度条件は、94 °C 2 分の加熱の 後、98 °C 10 秒、58 °C 30 秒、68 °C 10 秒を 5 回繰り返した。 2）ランダムプライミング：58 ℃で一時停止し、5 µM の SQ1_random Primer_2 を 2 µl 加え、 98 °C 10 秒、55 °C 30 秒、68 °C 10 秒を 15 回繰り返した後、68 °C 3 分とした。反応産 物は FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、25 µl の GP3 buffer に溶出した。 3）3’隣接領域の増幅：精製した PCR 産物を鋳型に nested PCR をおこなった。反応は、1× PCR buffer、精製産物 8µl、SQ2_mPing Primer_2 および SQ2_index Primer 各 300 pM、 400µM dNTPs および KOD FX Neo 1unit を含む 50µl 溶液中でおこなった。温度条件は、 はじめに 94 °C 2 分、続いて 98 °C 10 秒、アニーリング 30 秒（68 ℃から 1 サイクル毎 に−1 ℃）、68 °C 10 秒を 10 回繰り返し、98 °C 10 秒、58 °C 30 秒、68 °C 10 秒を 20 回 繰り返した。 調製法 B 1）3’隣接領域の濃縮：調製法 A と同じ反応液組成で温度条件を変えて PCR をおこなった。 はじめに 94 °C 2 分、続いて 98 °C 10 秒、58 °C 30 秒、68 °C 10 秒を 5 回繰り返した。 2）ランダムプライミング：58 ℃で一時停止し、5 µM の SQ1_random Primer_2 を 2 µl 加え、 98 °C 10 秒、40 °C 5 分、68 °C 10 秒を 15 回繰り返した後、68 °C 3 分とした。反応産物 は FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、25 µl の GP3 buffer で溶出した。3）3’隣接 領域の増幅：精製産物を鋳型とし、調製法 A と同様の条件で Nested PCR をおこなった。 調製法 C 1）ランダムプライミング：PCR は、1×PCR buffer、DNA 4 µl、SQ1_mPing Primer_2 および 66 SQ1_random Primer_2 各 250 pM、dNTPs 400µM、KOD FX Neo 0.5 unit を含む 25 µl 中で おこなった。温度条件は、94 °C 2 分の加熱の後、続いて 98 °C 10 秒、40 °C 5 分、68 °C 10 秒を 30 回繰り返した。反応産物は FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、25 µl の GP3 buffer で溶出した。2）3’隣接領域の増幅：精製産物を鋳型とし、調製法 A と同 様の条件で Nested PCR をおこなった。 調製法 D 1）ランダムプライミング：PCR は、1×PCR buffer、DNA 2 µl、SQ1_random Primer_2 4 µM、 dNTPs 400µM、KOD FX Neo 0.5 unit を含む 25 µl 中でおこなった。温度条件は、94 °C 2 分の加熱の後、続いて 98 °C 10 秒、40 °C 5 分、68 °C 10 秒を 2 回繰り返した。反応産 物は FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、25 µl の GP3 buffer で溶出した。 2）3’隣接領域の濃縮：精製産物 2 µl を鋳型とし、1×PCR buffer、SQ1_mPing Primer_2 およ び SQ1_random_withoutN Primer 各 250 pM、dNTPs 400µM、KOD FX Neo 0.5 unit を含む 25 µl 中で hemi-specific PCR をおこなった。温度条件は調製法 A の Nested PCR と同じ とした。反応産物は FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、25 µl の GP3 buffer で溶 出した。 3）3’隣接領域の増幅：精製産物を鋳型とし、調製法 A と同様の条件で Nested PCR をおこ なった。 調製法 E 1）ランダムプライミング：PCR は 1×NEB buffer 2、DNA 4 µl、SQ1_random Primer_2 8 µM 、 dNTPs 250 µM を含む 50 µl 中でおこなった。94 ℃5 分の加熱後、4 ℃で 20 分処理し、 50 U /µl DNA Polymerase I Klenow Fragment（New England BioLabs, MA, USA）を 1.5 µl 加えた。＋1 ℃／分で 4 ℃から 37 ℃でアニーリングさせ、37 ℃で 1.5 時間伸長反応 67 をおこない、70 ℃10 分で Klenow Fragment を失活させた。反応産物は FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、25 µl の GP3 buffer で溶出した。 2）3’隣接領域の濃縮：精製産物 2 µl を鋳型とし、1×PCR buffer、SQ1_mPing Primer_2 およ び SQ1_random_withoutN Primer 各 250 pM、dNTPs 400µM、KOD FX Neo 0.5 unit 含む 25 µl 中で hemi-specific PCR をおこなった。温度条件は調製法 A の Nested PCR と同じ とした。反応産物は FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、25 µl の GP3 buffer で溶 出した。 3）3’隣接領域の増幅：精製産物を鋳型とし、調製法 A と同様の条件で Nested PCR をおこ なった。 調製法 F 1）制限酵素処理およびアダプターライゲーション：DNA 100 ng、1×CutSmartTM buffer およ び MseI 0.5 unit（NEB）を含む 10 µl 中で 37 ℃16 時間反応させゲノム DNA を断片化し た。Adapter A および B をアニーリングさせ、アダプターとした。MseI 切断産物 10 µl、 1×buffer、T4 DNA Ligase、アダプター2 µM を含む 12.5 µl を、16 ℃ 1 時間でアダプタ ーを結合させ、70 ℃ 10 分で Ligase を失活させた。反応産物に 1/10 TE buffer を加え 5 倍希釈した。 2）3’隣接領域の濃縮：希釈産物 1 µl、1× PCR buffer、dNTPs 2mM、DMSO 0.5 ul、Takara Ex Taq® 0.25 unit、SQ1_mPing Primer 30 µM、SQ1_TD_MseI Primer 3 µM を含む 10 µl 中で PCR 反応をおこなった。温度条件は、94 °C 3 分の加熱後、続いて 94 °C 30 秒、アニー リング 30 秒（67 ℃から 1 サイクル毎に−1 ℃）、72 °C 45 秒を 10 回繰り返し、94 °C 30 秒、58 °C 30 秒、72 °C 45 秒を 20 回繰り返した。反応産物を 1/10 TE buffer で 10 倍希 釈した。 68 3）3’隣接領域の増幅：希釈産物を鋳型に、調製法 A と同様の条件で Nested PCR をおこな った。 調製法 A〜F で得られた 3’隣接領域の増幅産物を Midori Green DNA Stain で染色した 2 % TAE アガロースゲルで電気泳動・分離した。サンプルと伴に泳動したラダー（Gene Ladder 100（0.1-2kbp））のバンドを目安とし、300 から 500 bp の画分を切り出した。FastGene Gel/PCR Extraction Kit を用い、切り出したゲルから DNA を精製した。精製した DNA 濃度を Qubit® dsDNA BR Assay Kit（Life Technologies、California、USA）で測定し、各サンプルから等量 の DNA を混合した。混合液を FastGene Gel/PCR Extraction Kit で精製し、ddH2O 50µl に溶出 した。 4.2.4. シークエンスおよびアライメント 各調製法で 8 個体バルクの DNA バルクサンプル×3 サンプル（Sample1、2 および 3）の シークエンスライブラリーを作製し、シークエンス解析（Illumina Hiseq 2000、シングルエ ンド、150 塩基）を北海道システムサイエンス株式会社に委託した。得られたリードを 3.2.3. と同様の方法でトリミング・フィルタリングし、イネゲノムにアライメントした。 4.2.5. mPing 挿入の選抜 調製法 F で検出された挿入部位を無作為に 14 個選び、各挿入部位を含む領域を増幅す るプライマーを設計した（Table 4.3.）。3.2.3.と同様の nested PCR 法で DNA プールおよび種 子プールで mPing 挿入の有無を確認した。 69 Table 4.3. Insertions targeted in screening and results of screening Insertion ID Forward primer DNA Seed pool pool Reverse primer 02.fa2882479F TTCGGTGATGGGTCCCGACT TCCAACCCTAGATCCACCGCA + + 02.fa30922964F TAGAGGGAATCCGCGGCGAT ACCAACCAACCGAGCCCCAT + + 03.fa2295186R TCGTCCGTTAGCCTTTCCGC TGATTGATGCAATGCGCCAA + + 03.fa23792925R GCTGCCACAACCGACCCATT TCATGTCCATGAAACGCCGC + + 03.fa28363057F ATTGGTGGCGGGTCGGATCT TGGGGACGGAAGAATGGCAA + + 03.fa31938253F TTGCATGTGTACGCAACCCG TTCCTCTCCCAAAGCGTTTGC + + 03.fa8687662F CGAGACGGGGTTTGGCTTTG TGCCACGCCATTGACCAAAA + + 05.fa21321180R CCGGTTTGAATTTCAACCGGG TCACATCGCACACAGATCAA + + 06.fa2734690R ACGCAGACCACTTTGGCCGT TGGGAGTATTGATTCTGGCGCA + + 07.fa22606340R TCCGTTTGTCACGCTCGCAC CCGATCGATGGCAGGATTGG + + 10.fa159735R ACGGCGAGACTGCATGCATG GCTGCGCTGCCACATTAGCA + + 10.fa19638086R GCATGGACTGCGTGCATTGTT TGTTCAGCGCCATTTGCACA + + 10.fa22071018F GAAATGAGAACCGGCGCTGG TGGGGCCTGATGGAGTTCGT + - 11.fa3444162F CTTTGCTTGGTCGCCATCGC TTTCTAACCACCCGGACCCA + + * “+” means detected and “-“ means undetected. 70 4.3. 結果 4.3.1. シークエンスライブラリー調製法の評価 各調製法で作製したライブラリーにおいて 2〜55 万のリードが得られた（Table 4.4.）。 アライメントの結果、全ライブラリーにおいて約 9 割のリードをイネゲノムにマップでき た。検出された mPing 挿入部位は、同一調製法の 3 サンプル間で大きな差異はなく、調製 法 A、B、C、D、E および F での平均値は、それぞれ 803、1092、1082、565、1366 および 1113 個であった。調製法 E で最も多く、調製法 D で最も少なかった。 シークエンスライブラリーの偏りを評価するために、マップされたリード数の上位 10 ヶ所の累計値が全リード数に占める割合を算出した（Fig. 4.4.）。第 3 章の FSTs DB と比較 して、上位 10 ヶ所の累積リード数の占有割合が減少したのは、調製法 E および F であった。 したがって、調製法 E および F では偏りを小さくできたと考えられた。 調製法 A〜F のいずれかの方法で検出された挿入部位は、Sample1、2 および 3 でそれぞ れ 1,591、1,487 および 1,389 個であった。このうち、3 サンプルで共通して検出された挿入 部位は 619 個であった。調製法の再現性を評価するために、619 個の共通挿入について各調 製法の検出数を調査した（Fig. 4.5.）。調製法 A〜F について 3 サンプル全てで検出された共 通挿入の数はそれぞれ 441、493、499、218、506 および 369 個であり、調製法 E の再現性 が最も良かった。 新規挿入の検出感度について評価するために、Sample1、2 および 3 のうち、ひとつのサ ンプルのみで検出された挿入を新規挿入とみなし、各調製法の新規挿入数を調査した（Table 4.5.）。3 サンプルで検出された新規挿入の合計は、調製法 A〜F それぞれで 418、1,028、949、 98、1,541 および 803 個であった。調製法 E で検出された新規挿入数が最も多かった。調製 法 E は、シークセンスライブラリーの均一性、再現性および新規挿入の検出の全てにおい 71 3 1 2 3 1 2 3 E E E F F F 2 C D 1 C 2 3 B D 2 B 1 1 B D 3 A 3 2 A C 1 A 72 398,135 419,899 280,494 201,354 284,288 223,456 286,197 303,539 293,732 217,677 227,686 233,549 241,196 249,284 265,708 24,575 556,123 31,496 296,407 324,903 225,751 153,132 197,755 172,374 241,292 263,419 256,999 191,149 210,098 211,373 207,150 208,704 231,395 22,166 462,101 27,787 268,173 294,365 205,167 134,606 171,750 152,706 230,088 247,737 243,505 181,859 199,365 200,982 198,712 199,583 222,196 21,362 440,495 26,710 (90) (91) (91) (88) (87) (89) (95) (94) (95) (95) (95) (95) (96) (96) (96) (96) (95) (96) Method Sample Total reads Used for mapping Uniquely mapped (%) 15,240 15,850 10,591 4,542 6,240 4,969 2,839 4,688 4,086 2,954 2,870 3,038 2,788 2,826 3,008 274 7,640 334 (5) (5) (5) (3) (3) (3) (1) (2) (2) (2) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (2) (1) Multiply mapped (%) 12,994 14,688 9,993 13,984 19,765 14,699 8,365 10,994 9,408 6,336 7,863 7,353 5,650 6,295 6,191 530 13,966 743 (4) (5) (4) (9) (10) (9) (3) (4) (4) (3) (4) (3) (3) (3) (3) (2) (3) (3) 1,094 1,165 1,081 1,298 1,348 1,453 492 449 753 1,039 1,077 1,131 1,071 1,067 1,137 697 913 800 Unmapped (%) Number of mPing sites Table 4.4. Classification of reads and flanking sequence tags (FSTs) Fig. 4.4. The bias of libraries 73 Fig. 4.5. The detection rate of shared mPing sites in each method. Total number of position is 619 sites. 74 Table 4.5. The number of de novo mPing insertion detected in each method Total A B C D E F Sample 1 708 147 384 376 56 619 276 Sample 2 567 183 344 290 13 487 270 Sample 3 531 88 300 283 29 435 257 75 て最も優れていた。したがって、調製法 E 全ての DNA バルクサンプルから得られる mPing の挿入部位の情報を STAmP （Spontaneous Transposition of an Active transposable element mPing）DB と呼ぶこととした。 4.3.2. STAmP DB の mPing 挿入の選抜効率 STAmP DB で検出された Sample1 特異的な新規挿入 14 個について、nested PCR 法で DNA プールおよび種子プールにおける mPing 挿入の有無を調査した（Table 4.3.）。DNA プール で検出された 14 個の挿入のうち、13 個は種子プールにおいても確認できた。 76 4.4. 考察 調製法 E および F においてライブラリーの偏りを低減できた。調製法 E は、調製法 D と同様に、SQ1_Random Primer_2 で全ゲノムを無作為にタグ付けし、その後 SQ1_Random Primer_2 特異的プライマーおよび mPing 特異的プライマーで mPing 隣接配列を増幅した。 mPing 隣接配列の増幅過程は調製法 D および E で同一であるので、調製法 E の SQ1_Random Primer_2 を用いたタグ付け時の条件がランダム塩基の非選択的アニーリングに適していた と考えられる。調製法 E では、ポリメラーゼ活性の至適温度が 37 °C である Klenow Fragment を用い、アニーリング温度も 4〜37 °C と低温に設定した。アニーリング温度を低温にした 調製法 B では調製法 A よりも均一性が低下していた。KOD polymerase の活性は、75 °C に おける活性を 100 %とした時、温度の低下とともに直線的に低下していき、55 °C で 30 %以 下となる（Takagi et al. 1997）。40 °C でアニーリングしたランダムプライマーに対してポリ メラーゼによる伸長はほとんどなく、伸長反応温度の 68 °C へ上昇する間に解離する。した がって、ランダム塩基の非選択的なアニーリングの抑制には低温でのアニーリングに加え て、低温でのポリメラーゼ伸長が必要と考えられた。調製法 F では、制限酵素処理後に付 加したアダプター配列特異的プライマーで mPing 隣接配列を増幅するため、ランダム塩基 のアニーリング部位の選択性の問題を回避でき、均一性の高いライブラリーの作製に繋が ったと考えられる。 共通挿入の再現性に関して、調製法 D 以外は、6〜8 割の挿入部位が 3 サンプルで検出 されていた。調製法 D および E ではライブラリーの均一性に関連するアニーリング温度お よび伸長反応温度の他、ポリメラーゼ濃度が大きく異なり、調製法 D のポリメラーゼ濃度 は調製法 E の 1%程度であった。ライブラリーの偏りが調製法 D と同程度の調製法 B にお いても再現性は高く、ライブラリーの均一性と再現性との関連は低いと考えられる。した 77 がって、調製法 D では、ゲノムワイドにタグ付けするにはポリメラーゼ濃度が不十分で、 タグ付けされていない挿入部位が増加したと考えられた。 新規挿入数は、均一なライブラリーが作製できた調製法 E で最も多かった。調製法 F で は均一なライブラリーが作製できたが、検出できた新規挿入数は中程度であった。調製法 F では、挿入部位と制限酵素の切断部位間の塩基長に応じてライブラリーに含まれる mPing 隣接配列の塩基長が決まり、隣接配列長が短い挿入部位についてはアライメントできない ため、切断部位に近接する挿入部位が検出できなかったと考えられる。調製法 D では、共 通挿入の検出感度と同様に、ポリメラーゼ量の不足が原因で検出できない新規挿入部位が 多数生じたと考えられる。調製法 B および C では、調製法 A の倍以上の新規挿入部位が検 出できており、低温でのアニーリングはライブラリーの偏りを解消するには不十分であっ たが、ランダム塩基の非選択的アニーリングは一定の効果が認められた。 以上のことから、調製法 E がシークエンスライブラリーの均一性、共通挿入の再現性お よび新規挿入数において優れていると結論した。これは、低温でのアニーリングおよび低 温かつ高濃度のポリメラーゼ反応の効果と考えられる。 本実験に供試した‘銀坊主’集団は、2 回の個体別採種と 1 回の混合採種を経ているた め、1 世代 1 個体あたりの新規挿入数が 40 個であれば、1 個体あたり G0 植物にはない 120 個の新規挿入が期待できる。つまり 8 個体バルク（１個の Sample）あたり約 960 個の新規 挿入である。１個の Sample に検出された挿入部位は調製法 E で平均 514 個であり、STAmP DB には集団中の 5 割以上の挿入部位が含まれると推定された。Sample1 のみで検出された 挿入を、種子プールで確認したところ、複数の個体で検出された挿入も含まれた。このよ うな挿入部位をもつ個体は、DNA および種子プールの作製に供試した同一の G1 個体もし くは G1 個体別 G2 系統のに由来すると考えられる。同一 G2 系統に由来する個体では 1 あ 78 るいは 2 世代分の新規挿入は共通している。同一バルク内に共通祖先をもつ個体が含まれ る場合、実際のバルク特異的な挿入部位は推定値よりも少なくなるため、STAmP DB の新 規挿入検出効率がやや過小評価された可能性もある。また、STAmP DB は DNA プールと種 子プールにおける mPing 挿入部位の相違が少なく、in silico で選んだ mPing::対立遺伝子を もつ個体を確実に得ることができる。今後は、残りの 129 バルクについても NGS 解析をお こない、STAmP DB を完成させる。同一個体別系統に由来する挿入を考慮すると、集団内 に含まれる推定新規挿入部位は、系統特異的挿入 80 個 120 系統分（9,600 個）および個体 特異的挿入 40 個 10,560 個体分（422,400 個）の計 432,000 個と推定される。集団全体の FSTs を解析すれば、この内の 5 割、22 万個以上の挿入部位が STAmP DB に含まれることになり、 RiceGE および OrygenesDB に登録されている FSTs に匹敵する数となる。 79 第 5 章 総合考察 本研究の目的は‘銀坊主’集団に生じた新規の mPing::対立遺伝子を、環境ストレス耐性 育種に利用することにある。mPing::ZFP252 で認められた幼苗における塩ストレス応答性の 増強効果や、mPing::OsRMC で認められた塩ストレス耐性の向上は、ストレス耐性育種に有 用な mPing::対立遺伝子が‘銀坊主’集団に潜在していることを明らかにした。転移因子挿 入変異は、機能欠損型もしくは機能獲得型に分類される。Tos17、Ac/Ds や T-DNA などの転 移因子は機能欠損型であり、遺伝子内部への挿入による遺伝子の機能破壊が表現型に及ぼ す効果を遺伝子の機能解析に利用している。35S プロモーターを内部に配した T-DNA を利 用したアクチベーションタギングでは、転移因子の挿入により発現量が増加した遺伝子が 表現型に及ぼす効果を遺伝子の機能解析に利用している。これに対して、 ‘銀坊主’集団か ら得られる mPing::対立遺伝子は、機能喪失型にも機能獲得型にも該当しない。mPing 挿入 によって新たな環境応答性を獲得した対立遺伝子を効率的に獲得できる。 植物はストレスに曝されると、ストレス耐性関連遺伝子の発現が促進されストレス条件 下で生存するための多様な対応をする。発現上昇によってストレス耐性が向上する遺伝子 が多数報告されており、これらの遺伝子を同定することがストレス耐性育種を進める上で 重要であった。一方で、低温条件下で花粉の発育が良好な低温耐性品種では、低温条件下 で花粉の発育不良が認められる品種に比べ、低温条件下でのゲノム全体の遺伝子発現が非 ストレス条件と類似しており、耐性品種は低温ストレスに対し鈍感であることが示された （Ishiguro et al. 2013）。mPing::対立遺伝子はストレス応答性遺伝子のストレス応答性を低下 させることから、ストレス耐性遺伝子の mPing::対立遺伝子を集積させることで、低温スト レスに鈍感な育種素材に繋げることも可能である。 シス因子をもつ転移因子が転移・増殖すると、同じシス因子を共有する遺伝子群が形成 80 されることになる。したがって、異なる発現プロファイルをもつ複数の遺伝子の転写調節 領域に転移因子が挿入すると、転移因子を介して複数の遺伝子の発現が同じタイミングで 制御され、発現ネットワークが形成される（Feschotte 2008）。ストレス応答性をもたない遺 伝子の mPing::対立遺伝子を人為的に集積することで、複数の遺伝子のストレス応答性を、 mPing を介して制御することも可能である。STAmP DB を利用して得られる数千個の mPing::対立遺伝子情報を利用すれば、単独の遺伝子の発現改変だけでなく、多数の遺伝子 が関与する遺伝子発現ネットワークを特定の個体に導入できると考えられる。 以上のように mPing::対立遺伝子に認められるストレス応答性の改変はストレス耐性育 種において全く新しい素材になり得る。STAmP DB は‘銀坊主’集団に生じた mPing::対立 遺伝子を利用するうえで非常に有用なツールであり、 ‘銀坊主’はイネの遺伝的多様性を生 み出す重要な遺伝資源であるといえる。 81 謝辞 本研究を遂行し学位論文を取りまとめるにあたって、ご指導ならびにご閲覧頂きました、 京都大学大学院農学研究科育種学研究室教授 奥本裕博士に深く感謝しております。本研究 を遂行するに当たり、日々の研究において多くのご指導を頂いた京都大学大学院農学研究 科育種学研究室助教 築山拓司博士に感謝申し上げます。 京都大学大学院農学研究科農学専攻植物生産管理学研究室助教 齊藤大樹博士ならび に農業生物資源研究所遺伝資源センター多様性活用研究ユニット 内藤健博士には、数多 くの貴重なご助言と激励を賜り、研究をすすめるうえでの原動力となりました。心より感 謝申し上げます。 次世代シークエンス解析において多大なるご助力を頂いた奈良先端科学技術大学院大 学バイオサイエンス研究科植物機能解析学研究室倉田哲也准教授ならびに坂本智昭博士に 深く感謝申し上げます。 大学学部生時代から現在にわたり温かく見守って頂くとともに、多くのご支援ご指導を 賜りました、京都大学名誉教授で現吉備国際大学地域創成農学部教授 谷坂隆俊博士に深 く感謝いたします。また、育種学研究室のスタッフ、卒業生ならびに在学生の方々には、 研究生活の様々な面でご助力頂き、大きな励みとなったことを記すとともに、心より感謝 申し上げます。 最後に、時に厳しく時に温かく、これまで支援し続けてくださった両親、家族に対し深 い感謝の意を示し謝辞と致します。 82 引用文献 Bièche I, Laurent A, Laurendeau I, Duret L, Giovangrandi Y, Frendo JL, Olivi M, Fausser JL, Evain-Brion D, Vidaud M (2003) Placenta-specific INSL4 expression is mediated by a human endogenous retrovirus element. Biol Reprod 68: 1422-1429 Butelli E, Licciardello C, Zhang Y, Liu J, Mackay S, Bailey P, Reforgiato-Recupero G, Martin C (2012) Retrotransposons control fruit-specific, cold-dependent accumulation of anthocyanins in blood oranges. Plant Cell 24: 1242-1255 Corces V, Geyer P (1991) Interactions of retrotransposons with the host genome: the case of the gypsy element of Drosophila. Trends in Genetics 7: 86-90 de Koning AP, Gu W, Castoe TA, Batzer MA, Pollock DD (2011) Repetitive elements may comprise over two-thirds of the human genome. PLoS Genet 7: e1002384 Ewing AD, Kazazian HH (2010) High-throughput sequencing reveals extensive variation in human-specific L1 content in individual human genomes. Genome Res 20: 1262-1270 Feng Q et al. (2002) Sequence and analysis of rice chromosome 4. Nature 420: 316-320 Feschotte C (2008) Transposable elements and the evolution of regulatory networks. Nat Rev Genet 9: 397-405 Fujimoto R, Kinoshita Y, Kawabe A, Kinoshita T, Takashima K, Nordborg M, Nasrallah ME, Shimizu KK, Kudoh H, Kakutani T (2008) Evolution and control of imprinted FWA genes in the genus Arabidopsis. PLoS Genet 4: e1000048 Fukuda A, Nakamura A, Tagiri A, Tanaka H, Miyao A, Hirochika H, Tanaka Y (2004) Function, intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na(+)/H(+) antiporter from rice. Plant Cell Physiol 45: 146-159 83 Granger L, Martin E, Ségalat L (2004) Mos as a tool for genome-wide insertional mutagenesis in Caenorhabditis elegans: results of a pilot study. Nucleic Acids Res 32: e117 Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, Korenaga T (1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999. Nucleic Acids Res 27: 297-300 Hoshida H, Tanaka Y, Hibino T, Hayashi Y, Tanaka A, Takabe T (2000) Enhanced tolerance to salt stress in transgenic rice that overexpresses chloroplast glutamine synthetase. Plant Mol Biol 43: 103-111 Hsieh TH, Lee JT, Yang PT, Chiu LH, Charng YY, Wang YC, Chan MT (2002) Heterology expression of the Arabidopsis C-repeat/dehydration response element binding factor 1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato. Plant Physiol 129: 1086-1094 Hu H, Dai M, Yao J, Xiao B, Li X, Zhang Q, Xiong L (2006) Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 12987-12992 Huang J, Yang X, Wang M, Tang H, Ding L, Shen Y, Zhang H (2007) A novel rice C2H2-type zinc finger protein lacking DLN-box/EAR-motif plays a role in salt tolerance. Biochim Biophys Acta 1769: 220-227 Ishiguro S, Ogasawara K, Fujino K, Sato Y, Kishima Y (2014) Low temperature-responsive changes in the anther transcriptome's repeat sequences are indicative of stress sensitivity and pollen sterility in rice strains. Plant Physiol 164: 671-682 Ito Y, Katsura K, Maruyama K, Taji T, Kobayashi M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2006) Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice. Plant Cell Physiol 47: 141-153 84 Itoh T et al. (2007) Curated genome annotation of Oryza sativa ssp. japonica and comparative genome analysis with Arabidopsis thaliana. Genome Res 17: 175-183 Ivics Z, Li MA, Mátés L, Boeke JD, Nagy A, Bradley A, Izsvák Z (2009) Transposon-mediated genome manipulation in vertebrates. Nat Methods 6: 415-422 Jain M, Khurana JP (2009) Transcript profiling reveals diverse roles of auxin-responsive genes during reproductive development and abiotic stress in rice. FEBS J 276: 3148-3162 Jeon J, Kim NY, Kim S, Kang NY, Novák O, Ku SJ, Cho C, Lee DJ, Lee EJ, Strnad M, Kim J (2010) A subset of cytokinin two-component signaling system plays a role in cold temperature stress response in Arabidopsis. J Biol Chem 285: 23371-23386 Jeon JS, Lee S, Jung KH, Jun SH, Jeong DH, Lee J, Kim C, Jang S, Yang K, Nam J, An K, Han MJ, Sung RJ, Choi HS, Yu JH, Choi JH, Cho SY, Cha SS, Kim SI, An G (2000) T-DNA insertional mutagenesis for functional genomics in rice. Plant J 22: 561-570 Jiang N, Bao Z, Zhang X, Eddy SR, Wessler SR (2004a) Pack-MULE transposable elements mediate gene evolution in plants. Nature 431: 569-573 Jiang N, Bao Z, Zhang X, Hirochika H, Eddy SR, McCouch SR, Wessler SR (2003) An active DNA transposon family in rice. Nature 421: 163-167 Jiang N, Feschotte C, Zhang X, Wessler SR (2004b) Using rice to understand the origin and amplification of miniature inverted repeat transposable elements (MITEs). Curr Opin Plant Biol 7: 115-119 Kanazawa A, Liu B, Kong F, Arase S, Abe J (2009) Adaptive evolution involving gene duplication and insertion of a novel Ty1/copia-like retrotransposon in soybean. J Mol Evol 69: 164-175 85 Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (1999) Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat Biotechnol 17: 287-291 Kawasaki M, Inagaki F (2001) Random PCR-based screening for soluble domains using green fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun 280: 842-844 Kazazian HH (2004) Mobile elements: drivers of genome evolution. Science 303: 1626-1632 Kikuchi K, Terauchi K, Wada M, Hirano HY (2003) The plant MITE mPing is mobilized in anther culture. Nature 421: 167-170 Kobayashi S, Goto-Yamamoto N, Hirochika H (2004) Retrotransposon-induced mutations in grape skin color. Science 304: 982 Kolesnik T, Szeverenyi I, Bachmann D, Kumar CS, Jiang S, Ramamoorthy R, Cai M, Ma ZG, Sundaresan V, Ramachandran S (2004) Establishing an efficient Ac/Ds tagging system in rice: large-scale analysis of Ds flanking sequences. Plant J 37: 301-314 Kumar A (2008) Multipurpose transposon insertion libraries for large-scale analysis of gene function in yeast. Methods Mol Biol 416: 117-129 Kumar CS, Wing RA, Sundaresan V (2005) Efficient insertional mutagenesis in rice using the maize En/Spm elements. Plant J 44: 879-892 Levin HL, Moran JV (2011) Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet 12: 615-627 Lisch D (2013) How important are transposons for plant evolution? Nat Rev Genet 14: 49-61 86 Liu B, Kanazawa A, Matsumura H, Takahashi R, Harada K, Abe J (2008) Genetic redundancy in soybean photoresponses associated with duplication of the phytochrome A gene. Genetics 180: 995-1007 Lu C, Chen J, Zhang Y, Hu Q, Su W, Kuang H (2012) Miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs) have been accumulated through amplification bursts and play important roles in gene expression and species diversity in Oryza sativa. Mol Biol Evol 29: 1005-1017 Magnani E, Sjölander K, Hake S (2004) From endonucleases to transcription factors: evolution of the AP2 DNA binding domain in plants. Plant Cell 16: 2265-2277 Martin A, Troadec C, Boualem A, Rajab M, Fernandez R, Morin H, Pitrat M, Dogimont C, Bendahmane A (2009) A transposon-induced epigenetic change leads to sex determination in melon. Nature 461: 1135-1138 Minaya M, Pimentel M, Mason-Gamer R, Catalan P (2013) Distribution and evolutionary dynamics of Stowaway Miniature Inverted repeat Transposable Elements (MITEs) in grasses. Mol Phylogenet Evol 68: 106-118 Miura F, Enomoto Y, Dairiki R, Ito T (2012) Amplification-free whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. Nucleic Acids Res 40: e136 Miyao A, Tanaka K, Murata K, Sawaki H, Takeda S, Abe K, Shinozuka Y, Onosato K, Hirochika H (2003) Target site specificity of the Tos17 retrotransposon shows a preference for insertion within genes and against insertion in retrotransposon-rich regions of the genome. Plant Cell 15: 1771-1780 Morgante M, Brunner S, Pea G, Fengler K, Zuccolo A, Rafalski A (2005) Gene duplication and exon shuffling by helitron-like transposons generate intraspecies diversity in maize. Nat Genet 37: 997-1002 87 Naito K, Cho E, Yang G, Campbell MA, Yano K, Okumoto Y, Tanisaka T, Wessler SR (2006) Dramatic amplification of a rice transposable element during recent domestication. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 17620-17625 Naito K, Zhang F, Tsukiyama T, Saito H, Hancock CN, Richardson AO, Okumoto Y, Tanisaka T, Wessler SR (2009) Unexpected consequences of a sudden and massive transposon amplification on rice gene expression. Nature 461: 1130-1134 Nakashima K, Tran L, Van Nguyen D, Fujita M, Maruyama K, Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2007) Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice. Plant J 51: 617-630 Nakazaki T, Okumoto Y, Horibata A, Yamahira S, Teraishi M, Nishida H, Inoue H, Tanisaka T (2003) Mobilization of a transposon in the rice genome. Nature 421: 170-172 Parinov S, Sundaresan V (2000) Functional genomics in Arabidopsis: large-scale insertional mutagenesis complements the genome sequencing project. Curr Opin Biotechnol 11: 157-161 Romanish MT, Lock WM, van de Lagemaat LN, Dunn CA, Mager DL (2007) Repeated recruitment of LTR retrotransposons as promoters by the anti-apoptotic locus NAIP during mammalian evolution. PLoS Genet 3: e10 Ryder E, Russell S (2003) Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila. Brief Funct Genomic Proteomic 2: 57-71 Saijo Y, Hata S, Kyozuka J, Shimamoto K, Izui K (2000) Over-expression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants. Plant J 23: 319-327 88 Sakai H, Lee SS, Tanaka T, Numa H, Kim J, Kawahara Y, Wakimoto H, Yang CC, Iwamoto M, Abe T, Yamada Y, Muto A, Inokuchi H, Ikemura T, Matsumoto T, Sasaki T, Itoh T (2013) Rice Annotation Project Database (RAP-DB): an integrative and interactive database for rice genomics. Plant Cell Physiol 54: e6 Schnable P et al. (2009) The B73 Maize Genome: Complexity, Diversity, and Dynamics. Science 326: 1112-1115 Shim I, Momose Y, Yamamoto A, Kim D, Usui K (2003) Inhibition of catalase activity by oxidative stress and its relationship to salicylic acid accumulation in plants. Plant Growth Regulation 39: 285-292 Slotkin RK, Martienssen R (2007) Transposable elements and the epigenetic regulation of the genome. Nat Rev Genet 8: 272-285 Su C, Wang Y, Hsieh T, Lu C, Tseng T, Yu S (2010) A novel MYBS3-dependent pathway confers cold tolerance in rice. Plant Physiol 153: 145-158 Sun X, Xu Q, Ruan R, Zhang T, Zhu C, Li H (2013) PdMLE1, a specific and active transposon acts as a promoter and confers Penicillium digitatum with DMI resistance. Environ Microbiol Rep 5: 135-142 Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, Imanaka T (1997) Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. Appl Environ Microbiol 63: 4504-4510 Teramoto S, Tsukiyama T, Okumoto Y, Tanisaka T (2014) Early embryogenesis-specific expression of the rice transposon Ping enhances amplification of the MITE mPing. PLoS Genet 10: e1004396 Thibault ST et al. (2004) A complementary transposon tool kit for Drosophila melanogaster using P and piggyBac. Nat Genet 36: 283-287 89 Turcotte K, Srinivasan S, Bureau T (2001) Survey of transposable elements from rice genomic sequences. Plant Journal 25: 169-179 Urbański DF, Małolepszy A, Stougaard J, Andersen SU (2012) Genome-wide LORE1 retrotransposon mutagenesis and high-throughput insertion detection in Lotus japonicus. Plant J 69: 731-741 Van den Broeck D, Maes T, Sauer M, Zethof J, De Keukeleire P, D'hauw M, Van Montagu M, Gerats T (1998) Transposon Display identifies individual transposable elements in high copy number lines. Plant J 13: 121-129 Vandenbussche M, Janssen A, Zethof J, van Orsouw N, Peters J, van Eijk MJ, Rijpkema AS, Schneiders H, Santhanam P, de Been M, van Tunen A, Gerats T (2008) Generation of a 3D indexed Petunia insertion database for reverse genetics. Plant J 54: 1105-1114 Wang Q, Guan Y, Wu Y, Chen H, Chen F, Chu C (2008) Overexpression of a rice OsDREB1F gene increases salt, drought, and low temperature tolerance in both Arabidopsis and rice. Plant Mol Biol 67: 589-602 White SE, Habera LF, Wessler SR (1994) Retrotransposons in the flanking regions of normal plant genes: a role for copia-like elements in the evolution of gene structure and expression. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 11792-11796 Wilke CM, Adams J (1992) Fitness effects of Ty transposition in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 131: 31-42 Wu X, Shiroto Y, Kishitani S, Ito Y, Toriyama K (2009) Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter. Plant Cell Rep 28: 21-30 90 Xiang Y, Tang N, Du H, Ye H, Xiong L (2008) Characterization of OsbZIP23 as a key player of the basic leucine zipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity and salinity and drought tolerance in rice. Plant Physiol 148: 1938-1952 Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L (2007) Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions. Theor Appl Genet 115: 35-46 Xu D, Huang J, Guo S, Yang X, Bao Y, Tang H, Zhang H (2008) Overexpression of a TFIIIA-type zinc finger protein gene ZFP252 enhances drought and salt tolerance in rice (Oryza sativa L.). FEBS Lett 582: 1037-1043 Yamamoto E, Takashi T, Morinaka Y, Lin S, Kitano H, Matsuoka M, Ashikari M (2007a) Interaction of two recessive genes, hbd2 and hbd3, induces hybrid breakdown in rice. Theor Appl Genet 115: 187-194 Yamamoto YY, Ichida H, Matsui M, Obokata J, Sakurai T, Satou M, Seki M, Shinozaki K, Abe T (2007b) Identification of plant promoter constituents by analysis of local distribution of short sequences. BMC Genomics 8: 67 Yamamoto YY, Obokata J (2008) ppdb: a plant promoter database. Nucleic Acids Res 36: D977-981 Yang G, Zhang F, Hancock CN, Wessler SR (2007) Transposition of the rice miniature inverted repeat transposable element mPing in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 10962-10967 Zhang H, Li J, Yoo JH, Yoo SC, Cho SH, Koh HJ, Seo HS, Paek NC (2006) Rice Chlorina-1 and Chlorina-9 encode ChlD and ChlI subunits of Mg-chelatase, a key enzyme for chlorophyll synthesis and chloroplast development. Plant Mol Biol 62: 325-337 91 Zhang L, Tian LH, Zhao JF, Song Y, Zhang CJ, Guo Y (2009a) Identification of an apoplastic protein involved in the initial phase of salt stress response in rice root by two-dimensional electrophoresis. Plant Physiol 149: 916-928 Zhang Q, Arbuckle J, Wessler SR (2000) Recent, extensive, and preferential insertion of members of the miniature inverted-repeat transposable element family Heartbreaker into genic regions of maize. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 1160-1165 Zhang Y, Chen C, Jin X, Xiong A, Peng R, Hong Y, Yao Q, Chen J (2009b) Expression of a rice DREB1 gene, OsDREB1D, enhances cold and high-salt tolerance in transgenic Arabidopsis. BMB Rep 42: 486-492 Zheng X, Chen B, Lu G, Han B (2009) Overexpression of a NAC transcription factor enhances rice drought and salt tolerance. Biochem Biophys Res Commun 379: 985-989 92 摘要 イネ（Oryza sativa L.）の転移因子 mPing は一部の日本型品種で転移活性が高く、品種‘銀 坊主’では 1 世代 1 個体あたり約 40 コピーの新規挿入が生じる。mPing の新規挿入の約 10 % は遺伝子の転写開始点上流 500 bp 以内に分布する。さらに、mPing 配列上には複数のスト レス応答性シス因子があり、mPing 挿入が下流の遺伝子に塩および低温応答性を付与する例 もある。したがって、 ‘銀坊主’集団中には、転写調節領域への mPing 挿入によって環境ス トレス応答性が変化した対立遺伝子（mPing::対立遺伝子）が潜在すると考えられる。mPing:: 対立遺伝子の中から環境ストレスに関して有用な変異を効率的に選抜できれば、環境スト レス耐性育種に全く新しい素材を提供できる。本研究では、mPing::対立遺伝子のストレス 応答性を解析するとともに、mPing 隣接配列(Flanking sequence tags: FSTs)のデータベースを 利用した mPing::対立遺伝子の選抜系を構築し、選抜効率を検証した。 環境ストレス応答性遺伝子に関して mPing::対立遺伝子を選抜するために、‘銀坊主’ 11,520 個体から 8 個体を 1 バルクとする DNA プールおよび種子プールを作製した。DNA プールは葉身から抽出した DNA とし、種子プールは 1 個体から 1 穂ずつとした。PCR 法に より、17 個の環境ストレス耐性関連遺伝子について、転写開始点上流 500 bp 以内への mPing 挿入を調査した。その結果、OsDREB1A、ZFP252、ONAC045 および OsCDPK7 について mPing:: 対立遺伝子が認められた。mPing 挿入の影響を検証するために、種子プールの種子の自殖後 代から得られた挿入ホモ系統および非挿入ホモ系統を用いて、塩および低温条件下におけ る該当遺伝子の発現量を解析した。ZFP252 を除き、mPing::対立遺伝子は野生型に比べ塩お よび低温応答性が低下した。これは、mPing 挿入が転写調節領域にある本来のストレス応答 性シス因子と転写開始点の距離を遠ざけた結果、本来の応答性への阻害効果が mPing 内部 のシス因子による応答性付与効果を上回ったためと考えられた。 93 PCR 法による mPing::対立遺伝子の選抜は、目的遺伝子ごとに DNA プール全体を調査す る必要があり、また検出効率も高くない。そこで、mPing FSTs データベース（DB）を利用 した mPing::対立遺伝子の選抜効率を検証した。前述の DNA プールを 12 群に分け、群ごと に FSTs のシークエンスライブラリーを調製し、Genome AnalyzerII（Illumina）で配列解析 を行った。得られた FSTs をイネゲノムにアライメントした結果、51,666 個の mPing 挿入部 位が検出された。遺伝子内部および転写開始点上流 500 bp への挿入はそれぞれ 9,095 およ び 9,309 個であった。FSTs DB で検索して得られた塩耐性を負に制御する OsRMC の mPing:: 対立遺伝子ホモ系統では、野生型ホモ系統よりも塩ストレス条件下での初期成長速度が速 くなった。mPing::OsRMC ではストレス応答性が低下した結果、ストレス耐性が向上したと 考えられた。また、mPing 挿入の影響を葉色で簡便に評価するために、クロロフィル合成関 連遺伝子の mPing::対立遺伝子を DB で検索した。その結果、黄緑色を呈する mPing::OsChlD のホモ系統(SP12+)が得られた。SP12+にアブシジン酸(ABA)処理を処理した結果、クロロフ ィル含量が増加した。mPing 配列上には ABA 応答性シス因子があることから、mPing::対立 遺伝子は ABA 応答性が付与される可能性が示唆された。一方、FSTs DB で検出した 33 個 の mPing 挿入のうち、DNA プールで検出された挿入は 32 個であったが、種子プールで検 出された挿入は僅か 19 個であった。これは、DNA プールの作製に葉身を用いたため、デー タベースに葉身特異的な挿入が多く含まれたことが原因であると考えられた。また、検出 された新規挿入が予想される数の約 3 分の 1 であったことから、シークエンスライブラリ ー作製時の増幅で FSTs 間に偏りが生じている、あるいは、従来の推定新規挿入数が過大で あると考えられた。 mPing::対立遺伝子の選抜効率を改善するために、新たな‘銀坊主’集団（10,560 個体） を育成した。まず、葉身特異的な挿入を排除するために、種子プール作製に用いる穂の穂 94 軸から DNA プールを作製した。シークエンスライブラリーの偏りの原因として、mPing 特 異的プライマーによる mPing 間領域の増幅、および、ランダムプライマーの選択的アニー リングが考えられた。suppression PCR で mPing 間領域の増幅を抑制するとともに、ランダ ム塩基数を 8 から 15 に増やした。その上で、低温でのアニーリング、mPing 特異的プライ マーでの予備的伸長反応の省略、ゲノムへの非選択的タグ付け、低温で伸長可能なポリメ ラーゼ Klenow fragment の使用の効果を比較・検証した。suppression PCR により、mPing 間 領域の増幅は抑制された。ランダム塩基の長鎖化および低温でのアニーリングだけでは、 ライブラリーの偏りを低減できなかったが、Klenow fragment による低温伸長によって偏り の少ないシークエンスライブラリーを作製できた。改善したライブラリーで検出された mPing 数は、mPing 新規挿入数の推定値（40 コピー／世代／個体）とほぼ一致した。新し い集団で最適化した FSTs DB を STAmP（Spontaneous Transposition of Active transposable element mPing）DB と名付けた。 本研究で構築した STAmP DB は mPing の転移によって‘銀坊主’集団に生み出された 遺伝的多様性を利用する上で非常に有用なツールである。選抜した mPing::対立遺伝子のな かにはストレス耐性育種に有用な遺伝資源もあり、mPing::対立遺伝子は環境ストレス耐性 育種の新しい素材になり得ることが示された。 95