Comments
Description
Transcript
公表特許公報 特表2015
〔実 49 頁〕 公表特許公報（Ａ） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) (11)特許出願公表番号 特表2015-530870 （Ｐ２０１５−５３０８７０Ａ） (43)公表日 平成27年10月29日(2015.10.29) (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード(参考) Ｃ１２Ｎ 15/09 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ４Ｂ０１８ Ｃ１２Ｎ 1/21 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｂ０２４ Ｃ１２Ｐ 23/00 (2006.01) Ｃ１２Ｐ 23/00 ４Ｂ０６３ Ｃ１２Ｎ 5/10 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 5/00 １０２ ４Ｂ０６４ Ａ２３Ｌ 1/30 (2006.01) Ａ２３Ｌ 1/30 審査請求 未請求 Ｚ 予備審査請求 ４Ｂ０６５ 未請求 （全74頁） 最終頁に続く (21)出願番号 特願2015-522250(P2015-522250) (71)出願人 502379147 (86)(22)出願日 平成25年7月17日(2013.7.17) イェダ (85)翻訳文提出日 平成27年2月26日(2015.2.26) ント (86)国際出願番号 PCT/IL2013/050606 イスラエル国 (87)国際公開番号 WO2014/013489 ピー．オー．ボックス (87)国際公開日 平成26年1月23日(2014.1.23) (31)優先権主張番号 61/672,796 (32)優先日 平成24年7月18日(2012.7.18) (33)優先権主張国 米国(US) リサーチ カンパニー リミテッド ７６１００ ワインツマン ブ アンド デベロップメ レホヴォト ９５ アット ザ インスティチュート オ サイエンス (74)代理人 100105050 弁理士 (72)発明者 ミロ 鷲田 公一 ロン イスラエル国 サバ ４４４５６３０ アラジム ストリート カファ− １１ 最終頁に続く (54)【発明の名称】代謝経路の生成物の製造方法 (57)【要約】 アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離 ポリヌクレオチド配列が開示される。ポリヌクレオチド は、（ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第 １の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、（ ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第 ２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、（ ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第 ３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドとを含 み、第１、第２および第３の調節配列は、Ｉｃｙ−Ｂお よびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも 大きいよう選択される。複数のポリヌクレオチドを使用 してアスタキサンチンを作製する方法ならびに高レベル のアスタキサンチンを含む細菌細胞もまた開示される。 【選択図】図１７Ｃ ( 2 ) JP 1 2015-530870 A 2015.10.29 2 【特許請求の範囲】 を含み、 【請求項１】 前記第４、第５および第６の調節配列は、前記ｌｃｙ− アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポ Ｂおよび前記ｃｒｔＷの発現が、前記ｃｒｔＩの発現の リヌクレオチド配列であって、 レベルよりも大きいよう選択される、複数の単離ポリヌ （ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の クレオチド配列。 転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 【請求項４】 （ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および 前記第１の調節配列、前記第２の調節配列および前記第 第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 ３の調節配列の各々が、リボソーム結合部位（ＲＢＳ） （ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および 第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと である、請求項１∼３のいずれか一項に記載の複数のポ 10 リヌクレオチド配列。 を含み、 【請求項５】 前記第１、第２および第３の調節配列は、前記Ｉｃｙ− 前記第１の調節配列、前記第２の調節配列および前記第 Ｂおよび前記ｃｒｔＷの発現が、前記ｃｒｔＩの発現の ３の調節配列の各々が、プロモーターである、請求項１ レベルよりも大きいよう選択される、複数の単離ポリヌ ∼３のいずれか一項に記載の複数のポリヌクレオチド配 クレオチド配列。 列。 【請求項２】 【請求項６】 （ｉｖ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第 前記第１の調節配列、前記第２の調節配列および前記第 ４の転写調節配列をコードするポリヌクレオチド、また ３の調節配列が、前記ｌｃｙ−Ｂおよび前記ｃｒｔＷの は 発現が、前記ｃｒｔＩの発現のレベルよりも少なくとも （ｖ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔ 20 １０倍大きいよう選択される、請求項１または３に記載 Ｅ）および第５の転写調節配列をコードするポリヌクレ の複数のポリヌクレオチド配列。 オチド、または 【請求項７】 （ｖｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔ （ｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号４、５、６または７ Ｂ）および第６の転写調節配列をコードするポリヌクレ に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０ オチド、または ％に、前記ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、 （ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ） （ｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号２または３に示さ および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチ れる配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 ド 前記ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号２または３に示 複数の単離ポリヌクレオチド配列。 30 される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に 【請求項３】 、前記ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される、請 アスタキサンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポ 求項１に記載の複数のポリヌクレオチド配列。 リヌクレオチド配列であって、 【請求項８】 （ｉ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第１ （ｉｖ）のＲＢＳの配列が、配列番号４、５、６または の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 ７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８ （ｉｉ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒ ０％に、前記ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され ｔＥ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌク 、 レオチドと、 （ｖ）のＲＢＳの配列が、配列番号２または３に示され （ｉｉｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒ る配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前 ｔＢ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌク 40 記ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 レオチドと、 （ｖｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号２または３に示さ （ｉｖ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第４ れる配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 前記ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される、請求 （ｖ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第 項３に記載の複数のポリヌクレオチド配列。 ５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 【請求項９】 （ｖｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第 （ｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号５に示される配列を ６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｉｄｉ （ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ） の発現を引き起こすよう選択され、 および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチ （ｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号５に示される配列 ドと 50 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃｒ ( 3 ) JP 3 2015-530870 A 2015.10.29 4 ｔＥの発現を引き起こすよう選択され、 載の複数のポリヌクレオチド配列。 （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号３に示される配 【請求項１３】 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃ 単一発現ベクター中に含まれる、請求項１、２または３ ｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、 のいずれか一項に記載の複数のポリヌクレオチド配列。 （ｉｖ）のＲＢＳの配列が、配列番号７に示される配列 【請求項１４】 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃｒ 複数の発現ベクター中に含まれる、請求項１、２または ｔＩの発現を引き起こすよう選択され、 ３のいずれか一項に記載の複数のポリヌクレオチド配列 （ｖ）のＲＢＳの配列が、配列番号２に示される配列を 。 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｌｃｙ −Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 【請求項１５】 10 前記ＲＢＳの各々に、スペーサー配列が隣接する、請求 （ｖｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号３に示される配列 項４に記載の複数のポリヌクレオチド配列。 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃｒ 【請求項１６】 ｔＷの発現を引き起こすよう選択され、 前記ＲＢＳの各々の上流の前記スペーサー配列が、配列 （ｖｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号６に示される配 番号８に示される配列と少なくとも８０％相同である、 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃ 請求項１５に記載の複数のポリヌクレオチド配列。 ｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される、請求項３に 【請求項１７】 記載の複数のポリヌクレオチド配列。 前記ＲＢＳの各々の下流の前記スペーサーが、配列番号 【請求項１０】 ９に示される配列と少なくとも８０％相同である、請求 （ｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号６に示される配列を 項１５または１６に記載の複数のポリヌクレオチド配列 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｉｄｉ 20 。 の発現を引き起こすよう選択され、 【請求項１８】 （ｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号３に示される配列 ２ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃｒ 菌細胞。 ｔＥの発現を引き起こすよう選択され、 【請求項１９】 （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号７に示される配 ５ｍｇ／ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃ 菌細胞。 ｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、 【請求項２０】 （ｉｖ）のＲＢＳの配列が、配列番号５に示される配列 請求項１∼１７のいずれか一項に記載の複数のポリヌク を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃｒ レオチドを発現する、請求項１８に記載の細菌細胞。 ｔＩの発現を引き起こすよう選択され、 30 【請求項２１】 （ｖ）のＲＢＳの配列が、配列番号２に示される配列を 請求項１∼１７のいずれか一項に記載の複数のポリヌク 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｌｃｙ レオチドを発現する、請求項１９に記載の細菌細胞。 −Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 【請求項２２】 （ｖｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号２に示される配列 アスタキサンチン経路の酵素をコードするポリヌクレオ を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃｒ チドを発現させることを含む、アスタキサンチンを作製 ｔＷの発現を引き起こすよう選択され、 する方法であって、前記ポリヌクレオチドが、 （ｖｉｉ）のＲＢＳの配列が、配列番号２に示される配 （ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｃ 転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 ｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される、請求項３に 記載の複数のポリヌクレオチド配列。 （ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および 40 第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 【請求項１１】 （ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および （ｖｉｉｉ）デオキシキシルロース−５−リン酸シンタ 第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと ーゼ（ＤＸＳ）および第８の転写調節配列をコードする を含み、 ポリヌクレオチド 前記第１、第２および第３の調節配列は、前記ｌｃｙ− をさらに含む、請求項１、２または３のいずれか一項に ＢおよびｃｒｔＷの発現が、前記ｃｒｔＩの発現のレベ 記載の複数のポリヌクレオチド配列。 ルよりも大きいよう選択される、方法。 【請求項１２】 【請求項２３】 前記第８の転写調節配列が、配列番号６に示される配列 アスタキサンチン経路の酵素をコードするポリヌクレオ を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ＤＸ チドを発現させることを含む、アスタキサンチンを作製 Ｓの発現を引き起こすよう選択される、請求項１１に記 50 する方法であって、前記ポリヌクレオチドが、 ( 4 ) JP 2015-530870 5 A 2015.10.29 6 （ｉ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第１ 請求項２５に記載の方法。 の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 【請求項２９】 （ｉｉ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒ （ｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号５に示される配 ｔＥ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌク 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｉ レオチドと、 ｄｉの発現を引き起こすよう選択され、 （ｉｉｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒ （ｉｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号５に示される ｔＢ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌク 配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記 レオチドと、 ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、 （ｉｖ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第４ の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 （ｉｉｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号３に示され 10 る配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前 （ｖ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第 記ｃｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、 ５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 （ｉｖ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号７に示される （ｖｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第 配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記 ６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、 （ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ） （ｖ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号２に示される配 および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチ 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｌ ドと ｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 を含み、 （ｖｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号３に示される 前記第４、第５および第６の調節配列は、前記ｌｃｙ− 配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記 Ｂおよび前記ｃｒｔＷの発現が、前記ｃｒｔＩの発現の 20 ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択され、 レベルよりも大きいよう選択される、方法。 （ｖｉｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号６に示され 【請求項２４】 る配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前 前記第１の調節配列、前記第２の調節配列および前記第 記ｃｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される、請求項 ３の調節配列の各々が、リボソーム結合部位（ＲＢＳ） ２８に記載の方法。 である、請求項２２に記載の方法。 【請求項３０】 【請求項２５】 （ｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号６に示される配 前記第１の調節配列、前記第２の調節配列、前記第３の 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｉ 調節配列、前記第４の調節配列、前記第５の調節配列、 ｄｉの発現を引き起こすよう選択され、 前記第６の調節配列および前記第７の調節配列の各々が （ｉｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号３に示される 、ＲＢＳである、請求項２３に記載の方法。 30 配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記 【請求項２６】 ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、 前記第１の調節配列、前記第２の調節配列および前記第 （ｉｉｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号７に示され ３の調節配列の各々が、プロモーターである、請求項２ る配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前 ２または２３に記載の方法。 記ｃｒｔＢの発現を引き起こすよう選択され、 【請求項２７】 （ｉｖ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号５に示される 前記調節配列が、前記ｌｃｙ−Ｂおよび前記ｃｒｔＷの 配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記 発現が、前記ｃｒｔＩの発現のレベルよりも少なくとも ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択され、 １０倍大きいよう選択される、請求項２２または２３に （ｖ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号２に示される配 記載の方法。 【請求項２８】 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記ｌ 40 ｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 （ｉｖ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号４、５、６ま （ｖｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号２に示される たは７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくと 配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前記 も８０％に、前記ｃｒｔＩの発現を引き起こすよう選択 ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択され、 され、 （ｖｉｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号２に示され （ｖ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号２または３に示 る配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、前 される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に 記ｃｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される、請求項 、前記ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 ２８に記載の方法。 （ｖｉ）の前記ＲＢＳの配列が、配列番号２または３に 【請求項３１】 示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％ デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ に、前記ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される、 50 ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入すること ( 5 ) JP 7 2015-530870 A 2015.10.29 8 をさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。 る、請求項４０に記載の単離ポリヌクレオチド。 【請求項３２】 【請求項４２】 ＤＸＳを発現する前記ポリヌクレオチドのＲＢＳの配列 （ｖ）第５の酵素コード配列と作動可能に連結している が、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程度の 第５のＲＢＳをさらに含む、請求項４０に記載の単離ポ 少なくとも８０％に、前記ＤＸＳの発現を引き起こすよ リヌクレオチド。 う選択される、請求項３１に記載の方法。 【請求項４３】 【請求項３３】 前記第５の酵素が、前記第１、第２、第３および第４の 前記発現が、細菌細胞において達成される、請求項２２ 酵素と同一ではなく、対象の前記同一生成物の生合成経 または２３に記載の方法。 【請求項３４】 路の部分である、請求項４２に記載の単離ポリヌクレオ 10 チド。 前記ＲＢＳの各々に、スペーサー配列が隣接する、請求 【請求項４４】 項２４に記載の方法。 （ｖｉ）第６の酵素コード配列と作動可能に連結してい 【請求項３５】 る第６のＲＢＳをさらに含む、請求項４２に記載の単離 前記ＲＢＳの各々の上流の前記スペーサー配列が、配列 ポリヌクレオチド。 番号８に示される配列と少なくとも８０％相同である、 【請求項４５】 請求項３４に記載の方法。 前記第６の酵素が、前記第１、第２、第３、第４および 【請求項３６】 第５の酵素と同一ではなく、対象の前記同一生成物の生 前記ＲＢＳの各々の下流の前記スペーサーが、配列番号 合成経路の部分である、請求項４４に記載の単離ポリヌ ９に示される配列と少なくとも８０％相同である、請求 クレオチド。 項３４または３５に記載の方法。 20 【請求項４６】 【請求項３７】 前記ＲＢＳの各々に、スペーサー配列が隣接する、請求 前記ポリヌクレオチドの各々が、単一の発現ベクター上 項３９∼４５のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオ に含まれる、請求項２２または２３に記載の方法。 チド。 【請求項３８】 【請求項４７】 前記発現後にアスタキサンチンを単離することをさらに 対象の前記生成物が、タンパク質である、請求項３９に 含む、請求項２２または２３に記載の方法。 記載の単離ポリヌクレオチド。 【請求項３９】 【請求項４８】 （ｉ）第１の酵素コード配列と作動可能に連結している 対象の前記生成物が、食品、医薬および燃料からなる群 第１のＲＢＳと、 から選択される、請求項３９に記載の単離ポリヌクレオ （ｉｉ）第２の酵素コード配列と作動可能に連結してい 30 チド。 る第２のＲＢＳと、 【請求項４９】 （ｉｉｉ）第３の酵素コード配列と作動可能に連結して 少なくとも３種の酵素を含む生合成経路の生成物である いる第３のＲＢＳと 最適量の対象の生成物を合成するために、ポリヌクレオ を含む単離ポリヌクレオチドであって、 チド配列を選択する方法であって、 前記第２のＲＢＳは、前記第２の酵素コード配列の発現 （ａ）細胞における対象の前記生成物の合成を可能にす のレベルが、前記第１の酵素コード配列の発現のレベル る条件下で、請求項３９∼４８のいずれか一項に記載の よりも大きいよう選択され、 ポリヌクレオチドを細胞中に導入することと、 前記第３のＲＢＳは、前記第３の酵素コード配列の発現 （ｂ）対象の前記生成物の量を測定することと のレベルが、前記第２の酵素コード配列の発現のレベル よりも大きいよう選択され、 を含み、対象の前記生成物の量は、選択される前記ポリ 40 ヌクレオチド配列を示す、方法。 前記第１の酵素、前記第２の酵素および前記第３の酵素 【請求項５０】 は、同一ではない酵素であり、対象の同一生成物の生合 細胞が、細菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞、真菌細胞お 成経路の各部分である、単離ポリヌクレオチド。 よび藻類細胞からなる群から選択される、請求項４９に 【請求項４０】 記載の方法。 （ｉｖ）第４の酵素コード配列と作動可能に連結してい 【発明の詳細な説明】 る第４のＲＢＳをさらに含む、請求項３９に記載の単離 【技術分野】 ポリヌクレオチド。 【０００１】 【請求項４１】 本発明は、その一部の実施形態において、アスタキサン 前記第４の酵素が、前記第１、第２および第３の酵素と チンなどの代謝経路の生成物を作製するためのバイオテ 同一ではなく、前記同一生成物の生合成経路の部分であ 50 クノロジー法に関する。 ( 6 ) JP 2015-530870 9 A 2015.10.29 10 【背景技術】 しい食品添加物であると報告された。 【０００２】 【０００７】 細菌中の天然タンパク質存在量は、５桁に及ぶ。タンパ アスタキサンチンは、種々の細菌、真菌および藻類にお ク質発現レベルのバランスをとることが自然生物系が適 いて合成されるが、生物系を使用したその産生の重要な 切に機能するための要であり、また、代謝エンジニアリ 制限は、その収率が低いことである。低収率の理由の１ ングの取り組みにとって極めて重要であることが多い。 つは、アスタキサンチン経路の複雑性であり、そのため 生物系の機能を解明するために、強力な過剰発現および 、効率的な発現のためには、経路の７種の遺伝子が、細 過小発現などの細胞内タンパク質レベルの操作が広く使 胞において発現されなければならない。これらの遺伝子 用されているが、並行して多数の遺伝子のレベルを微調 各々の発現の量の微調整が、アスタキサンチン発現の最 整する能力が、大きな未解決の課題である。タンパク質 10 適化には必須である。 レベルのバランスをとることが進化の間に選択されてい 【０００８】 る天然生物系とは対照的に、合成系の発現は、タンパク 非特許文献４には、大腸菌におけるアスタキサンチンの 質濃度の不均衡をもたらすことがある。結果として、合 発現が教示されている。 成経路は、最初に導入された時点で最適に機能すること 【０００９】 は稀であり、酵素レベルは、微調整されなければならな 非特許文献５には、リボソーム結合部位の配列が教示さ い。 れている。 【０００３】 【００１０】 図１５Ａは、２段階代謝経路モデルに基づいた不均衡な 特許文献１には、人工プロモーターライブラリーおよび 酵素濃度と関連する大きな課題を図式的に表す。第１に ／または修飾されたリボソーム結合部位ライブラリーを 、低酵素発現は、経路の流れ、したがって、生成物合成 20 含むＤＮＡライブラリーを作製し、ライブラリーを用い 速度（青色領域）を制限し得る。その一方で、過剰の発 て細菌宿主細胞を形質転換して、対象の染色体遺伝子の 現は、タンパク質負荷につながることがあり、これは、 さまざまな発現レベルを有する細菌クローンの集団を得 成長を制限する細胞資源の枯渇をもたらす（紫色領域） る方法が教示されている。 。最後に、中間代謝物を生成および消費する酵素間の不 【先行技術文献】 均衡が、代謝のボトルネックおよび高濃度の潜在的に毒 【特許文献】 性の経路中間体（緑色領域）をもたらし得る。 【００１１】 【０００４】 【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２００１５８ タンパク質の細胞内存在量を制御するためのアプローチ ４９号明細書 として、プロモーター［非特許文献１］またはリボソー 【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１００３９２ ム結合部位(RBS)［非特許文献２、非特許文献３］配列 30 ９９号明細書 を変更すること、転写物の安定性を調節することおよび 【特許文献３】米国特許出願公開第２００４０２６８４ 成熟タンパク質の分解速度を変更することが挙げられる ３６号明細書 。 【特許文献４】米国特許第４，６６６，８２８号明細書 【０００５】 【特許文献５】米国特許第４，６８３，２０２号明細書 アスタキサンチンなどのカロテノイドは、生存している 【特許文献６】米国特許第４，８０１，５３１号明細書 生物において見られる黄色、橙色および赤色の多くに関 【特許文献７】米国特許第５，１９２，６５９号明細書 与している天然の色素である。カロテノイドは、自然界 【特許文献８】米国特許第５，２７２，０５７号明細書 に広く分布しており、種々の生物系において、２つの主 【特許文献９】米国特許第３，７９１，９３２号明細書 要な生物学的機能を有し、光合成において集光性色素と して働き、また、光酸化損傷から保護する。 【特許文献１０】米国特許第３，８３９，１５３号明細 40 書 【０００６】 【特許文献１１】米国特許第３，８５０，７５２号明細 アスタキサンチンは、最も高価な商業的に使用されるカ 書 ロテノイド化合物である（今日の市場価値は、３，５０ 【特許文献１２】米国特許第３，８５０，５７８号明細 ０ドル／ｋｇより高い）。さまざまな水生動物において 書 色素沈着をもたらす栄養補給剤として主に使用される。 【特許文献１３】米国特許第３，８５３，９８７号明細 極東では、ニワトリの通常の色素沈着を生じさせるため 書 に、家禽に給餌するためにも使用される。また、食品工 【特許文献１４】米国特許第３，８６７，５１７号明細 業のための望ましい、有効な非毒性着色料でもあり、化 書 粧品において価値が高い。近年、アスタキサンチンが、 【特許文献１５】米国特許第３，８７９，２６２号明細 ヒトにおいて強力な抗酸化剤であり、したがって、望ま 50 書 ( 7 ) JP 2015-530870 11 A 2015.10.29 12 【特許文献１６】米国特許第３，９０１，６５４号明細 s Inc、(1987) Chap. 7. 書 【非特許文献１２】Sambrook、J.、et al.、MOLECULAR 【特許文献１７】米国特許第３，９３５，０７４号明細 CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor La 書 boratory Press (1989) 【特許文献１８】米国特許第３，９８４，５３３号明細 【非特許文献１３】Hardwood et al. Ed. BACILLUS、Pl 書 enum Publishing Corp. 1989中のFerrari et al.、Gene 【特許文献１９】米国特許第３，９９６，３４５号明細 tics pgs 57-72 書 【非特許文献１４】Chang et al.、(1979) Mol. Gen.Ge 【特許文献２０】米国特許第４，０３４，０７４号明細 書 net. 168:11-15 10 【非特許文献１５】Smith et al.、(1986) Appl. and E 【特許文献２１】米国特許第４，０９８，８７６号明細 nv. Microbiol. 51:634 書 【非特許文献１６】Potter、H. (1988) Anal Biochem 1 【特許文献２２】米国特許第４，８７９，２１９号明細 74:361-373 書 【非特許文献１７】Manual of Methods of General Bac 【特許文献２３】米国特許第５，０１１，７７１号明細 teriology、Eds. P. Gerhardt etal.、American Societ 書 y for Microbiology、Washington、DC (1981) 【特許文献２４】米国特許第５，２８１，５２１号明細 【非特許文献１８】T. D. Brock in Biotechnology: A 書 Textbook of Industrial Microbiology 2 ed. (1989) S 【非特許文献】 inauer Associates、Sunderland Mass. 【００１２】 20 【非特許文献１９】Cherepanov et al. (1995) Gene 15 【非特許文献１】K. Hammer、I. Mijakovic、P. R. Jen 8:9-14 sen、Synthetic promoter libraries - tuning of gene 【非特許文献２０】Deuschle et al.、EMBO Journal 5( expression、Trends in Biotechnology 24、53-55(200 11):2987-2994 (1986) 6) 【非特許文献２１】Sommer et al.、(2000) Microbiol. 【非特許文献２】H. M. Salis、E. A. Mirsky、C. A. V 146:2643-2653 oigt、Automated design of synthetic ribosome bindi 【非特許文献２２】PROMOTERS: STRUCTURE AND FUNCTIO ng sites to control protein expression、Nat Biotec N. R. L/Rodriguez and M. J. Chamberlin eds. Praege hnol 27、946-950(2009) r Scientific. New York中、Hawley D. K et al.、Chap 【非特許文献３】H.H.Wang et al.、Programming cells ter 3 by multiplex genome engineering and accelerated e 30 【非特許文献２３】「Current Protocols in Molecular volution、Nature 460、894-898(2009) Biology」 Volumes I-III Ausubel、R. M.、ed. (1994 【非特許文献４】Lemuth et al.、[Microbial Cell Fac ) tories 10、29、2011] 【非特許文献２４】Ausubel et al.、「Current Protoc 【非特許文献５】Salis et al.、Nature Biotechnology ols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、B Volume 27、No 10、page 946-950、2009 altimore、Maryland (1989) 【非特許文献６】Carrie et al.、 (1999) Biotechnol. 【非特許文献２５】Perbal、「A Practical Guide to M Prog. 15:58-64 olecular Cloning」、John Wiley& Sons、New York (19 【非特許文献７】Smolke Ed.、The Metabolic Pathway 88) Engineering Handbook: Tools and Applications、CRC Press、New York(2009) 【非特許文献２６】Watson et al.、「Recombinant DNA 40 」、Scientific American Books、New York 【非特許文献８】Stephanopoulos、Nielsen、 and Aris 【非特許文献２７】Birren et al. (eds) 「Genome Ana tidou, Eds.、Metabolic Engineering: Principles and lysis: A Laboratory Manual Series」、Vols. 1-4、Co Methodology、Academic Press、 New York (1998) ld Spring Harbor Laboratory Press、New York (1998) 【非特許文献９】Greenberg、Metabolic Pathways: Ene 【非特許文献２８】「Cell Biology: A Laboratory Han rgetics、Tricarboxylic Acid Cycle、and Carbohydrat dbook」、Volumes I-III Cellis、J. E.、ed. (1994) es、Academic Press、 New York (1967) 【非特許文献２９】「Culture of Animal Cells - A Ma 【非特許文献１０】D. M. Greenberg's multi-volume s nual of Basic Technique」 by Freshney、Wiley-Liss eries entitled Metabolic pathways、Volume 1-7 、N. Y. (1994)、Third Edition 【非特許文献１１】CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR B 【非特許文献３０】「Current Protocols in Immunolog IOLOGY Vol. 1、eds. Ausubel etal. John Wiley & Son 50 y」Volumes I-III Coligan J. E.、ed. (1994) ( 8 ) JP 13 2015-530870 A 2015.10.29 14 【非特許文献３１】Stites et al. (eds)、「Basic and 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、５ｍｇ／ Clinical Immunology」(8th Edition)、Appleton & La ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細菌細胞が nge、Norwalk、CT (1994) 提供される。 【非特許文献３２】Mishell and Shiigi (eds)、「Sele 【００１６】 cted Methods in Cellular Immunology」、W. H. Freem 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキ an and Co.、New York (1980) サンチン経路の酵素をコードするポリヌクレオチドを発 【非特許文献３３】「Oligonucleotide Synthesis」 Ga 現させることを含む、アスタキサンチンを作製する方法 it、M. J.、ed. (1984) であって、ポリヌクレオチドは、 【非特許文献３４】「Nucleic Acid Hybridization」 H ames、B. D. and Higgins S. J.、eds. (1985) （ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の 10 転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 【非特許文献３５】「Transcription and Translation （ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および 」 Hames、B. D.、 and Higgins S. J.、eds.(1984) 第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 【非特許文献３６】「Animal Cell Culture」 Freshney （ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および 、R. I.、ed. (1986) 第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと 【非特許文献３７】「Immobilized Cells and Enzymes を含み、 」 IRL Press、(1986) 第１、第２および第３の調節配列は、ｌｃｙ−Ｂおよび 【非特許文献３８】「A Practical Guide to Molecular ｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大き Cloning」 Perbal、B.、(1984) and 「Methods in Enz いよう選択される、方法が提供される。 ymology」 Vol. 1-317、Academic Press 【００１７】 【非特許文献３９】「PCR Protocols: A Guide To Meth 20 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキ ods And Applications」、Academic Press、San Diego サンチン経路の酵素をコードするポリヌクレオチドを発 、CA (1990) 現させることを含む、アスタキサンチンを作製する方法 【非特許文献４０】Marshak et al.、「Strategies for であって、ポリヌクレオチドは、 Protein Purification and Characterization - A Lab （ｉ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第１ oratory Course Manual」 CSHL Press (1996) の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 【非特許文献４１】「Idempotent Vector Design for S （ｉｉ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒ tandard Assembly of Biobrick」(worldwide webdspace ｔＥ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌク dotmitdotedu/handle/1721.1/21168) レオチドと、 【発明の概要】 （ｉｉｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒ 【課題を解決するための手段】 30 ｔＢ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌク 【００１３】 レオチドと、 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキ （ｉｖ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第４ サンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレ の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 オチド配列であって、 （ｖ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第 （ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の ５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 （ｖｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第 （ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および ６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 （ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ） （ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および 第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチ 40 ドと を含み、 を含み、 第１、第２および第３の調節配列は、Ｉｃｙ−Ｂおよび 第４、第５および第６の調節配列は、ｌｃｙ−Ｂおよび ｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大き ｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大き いよう選択される、複数の単離ポリヌクレオチド配列が いよう選択される、方法が提供される。 提供される。 【００１８】 【００１４】 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、アスタキ 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、２ｍｇ／ サンチン経路の酵素をコードする複数の単離ポリヌクレ ｇ細胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細菌細胞が オチド配列であって、 提供される。 （ｉ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第１ 【００１５】 50 の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 ( 9 ) JP 15 2015-530870 A 2015.10.29 16 （ｉｉ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒ 本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳ ｔＥ）および第２の転写調節配列をコードするポリヌク の配列は、配列番号４、５、６または７に示される配列 レオチドと、 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩ （ｉｉｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒ の発現を引き起こすよう選択され、 ｔＢ）および第３の転写調節配列をコードするポリヌク ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または レオチドと、 ３に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８ （ｉｖ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第４ ０％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示 （ｖ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および第 ５の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に 10 、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される。 （ｖｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および第 【００２４】 ６の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉｖ）のＲＢ （ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ） Ｓの配列は、配列番号４、５、６または７に示される配 および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチ 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔ ドと Ｉの発現を引き起こすよう選択され、 を含み、 ここで、（ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３ 第４、第５および第６の調節配列は、Ｉｃｙ−Ｂおよび に示される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０ ｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大き ％に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 いよう選択される、複数の単離ポリヌクレオチド配列が （ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示さ 提供される。 20 れる配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 【００１９】 ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される。 本発明のいくつかの実施形態によれば、複数の単離ポリ 【００２５】 ヌクレオチド配列は、 本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳ （ｉｖ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第 の配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの ４の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドまたは 程度の少なくとも８０％に、ｉｄｉの発現を引き起こす （ｖ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔ よう選択され、 Ｅ）および第５の転写調節配列をコードするポリヌクレ ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示さ オチドまたは れる配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 （ｖｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔ ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、 Ｂ）および第６の転写調節配列をコードするポリヌクレ 30 （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配 オチドまたは 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔ （ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ） Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチ （ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配列 ド を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩ のうち少なくとも１つをさらに含む。 の発現を引き起こすよう選択され、 【００２０】 （ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を 本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の調節配列 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂ 、前記の第２の調節配列および前記の第３の調節配列の の発現を引き起こすよう選択され、 各々は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）である。 【００２１】 （ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列を 40 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの 本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の調節配列 発現を引き起こすよう選択され、 、第２の調節配列および第３の調節配列の各々は、プロ （ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号６に示される配列 モーターである。 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＺ 【００２２】 の発現を引き起こすよう選択される。 本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の調節配列 【００２６】 、第２の調節配列および第３の調節配列は、前記ｌｃｙ 本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳ −Ｂおよび前記ｃｒｔＷの発現が、前記ｃｒｔＩの発現 の配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの のレベルよりも少なくとも１０倍大きいよう選択される 程度の少なくとも８０％に、ｉｄｉの発現を引き起こす 。 よう選択され、 【００２３】 50 （ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列 ( 10 ) JP 17 2015-530870 A 2015.10.29 18 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＥ ンは、細菌細胞中の封入体において発現される。 の発現を引き起こすよう選択され、 【００３６】 （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配 本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、遺 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔ 伝子改変される。 Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 【００３７】 （ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列 本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、本 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩ 発明の複数のポリヌクレオチドを発現する。本発明のい の発現を引き起こすよう選択され、 くつかの実施形態によれば、第１の調節配列、第２の調 （ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を 節配列、第３の調節配列、第４の調節配列、第５の調節 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂ 10 配列、第６の調節配列および第７の調節配列の各々は、 の発現を引き起こすよう選択され、 ＲＢＳである。 （ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を 【００３８】 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷの 本発明のいくつかの実施形態によれば、調節配列は、Ｉ 発現を引き起こすよう選択され、 ｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレ （ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列 ベルよりも少なくとも１０倍大きいよう選択される。 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＺ 【００３９】 の発現を引き起こすよう選択される。 本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉｖ）のＲＢ 【００２７】 Ｓの配列は、配列番号４、５、６または７に示されるよ 本発明のいくつかの実施形態によれば、複数のポリヌク うな配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 レオチド配列は、 20 ｃｒｔＩの発現をもたらすよう選択され、 （ｖｉｉｉ）デオキシキシルロース−５−リン酸シンタ （ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示され ーゼ（ＤＸＳ）および第８の転写調節配列をコードする るような配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％ ポリヌクレオチドをさらに含む。 に、ｌｃｙ−Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 【００２８】 （ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２または３に示さ 本発明のいくつかの実施形態によれば、第８の転写調節 れるような配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０ 配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程 ％に、ｃｒｔＷの発現を引き起こすよう選択される。 度の少なくとも８０％に、ＤＸＳの発現を引き起こすよ 【００４０】 う選択される。 本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳ 【００２９】 の配列は、配列番号５に示される配列を有するＲＢＳの 本発明のいくつかの実施形態によれば、複数のポリヌク 30 程度の少なくとも８０％のｉｄｉの発現を引き起こすよ レオチド配列は、単一発現ベクター中に含まれる。 う選択され、 【００３０】 ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示さ 本発明のいくつかの実施形態によれば、複数のポリヌク れる配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 レオチド配列は、複数の発現ベクター中に含まれる。 ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、 【００３１】 （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々に 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔ 、スペーサー配列が隣接する。 Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 【００３２】 （ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配列 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩ 上流のスペーサー配列は、配列番号８に示される配列と 40 の発現を引き起こすよう選択され、 少なくとも８０％相同である。 （ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を 【００３３】 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂ 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の の発現を引き起こすよう選択され、 下流のスペーサーは、配列番号９に示される配列と少な （ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示される配列 くとも８０％相同である。 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷ 【００３４】 の発現を引き起こすよう選択され、 本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、大 （ｖｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号６に示される配 腸菌細胞である。 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔ 【００３５】 Ｚの発現を引き起こすよう選択される。 本発明のいくつかの実施形態によれば、アスタキサンチ 50 【００４１】 ( 11 ) JP 19 2015-530870 A 2015.10.29 20 本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）のＲＢＳ 本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチ の配列は、配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの ドの各々は、単一の発現ベクター上に含まれる。 程度の少なくとも８０％に、ｉｄｉの発現を引き起こす 【００５０】 よう選択され、 本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、発現 ここで、（ｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号３に示さ 後にアスタキサンチンを単離することをさらに含む。 れる配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 【００５１】 ｃｒｔＥの発現を引き起こすよう選択され、 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、 （ｉｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号７に示される配 （ｉ）第１の酵素コード配列と作動可能に連結している 列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔ Ｂの発現を引き起こすよう選択され、 第１のＲＢＳと、 10 （ｉｉ）第２の酵素コード配列と作動可能に連結してい （ｉｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号５に示される配列 る第２のＲＢＳと、 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＩ （ｉｉｉ）第３の酵素コード配列と作動可能に連結して の発現を引き起こすよう選択され、 いる第３のＲＢＳと （ｖ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列を を含む単離ポリヌクレオチドであって、 有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｌｃｙ−Ｂ 第２のＲＢＳは、第２の酵素コード配列の発現のレベル の発現を引き起こすよう選択され、 が、第１の酵素コード配列の発現のレベルよりも大きい （ｖｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示される配列 よう選択され、 を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、ｃｒｔＷ 第３のＲＢＳは、第３の酵素コード配列の発現のレベル の発現を引き起こすよう選択され、 が、第２の酵素コード配列の発現のレベルよりも大きい （ｖｉｉ）のＲＢＳの配列は、配列番号２に示されるよ 20 よう選択され、 うな配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に、 第１の酵素、第２の酵素および第３の酵素は、同一では ｃｒｔＺの発現を引き起こすよう選択される。 ない酵素であり、対象の同一生成物の生合成経路の各部 【００４２】 分である、単離ポリヌクレオチドが提供される。 本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、細胞 【００５２】 に、デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｄ 本発明のいくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレ ＸＳ）をコードするポリヌクレオチドを導入することを オチドは、 さらに含む。 （ｉｖ）第４の酵素コード配列と作動可能に連結してい 【００４３】 る第４のＲＢＳ 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＸＳを発現す をさらに含む。 るポリヌクレオチドのＲＢＳの配列は、配列番号６に示 30 【００５３】 される配列を有するＲＢＳの程度の少なくとも８０％に 本発明のいくつかの実施形態によれば、第４の酵素は、 、ＤＸＳの発現を引き起こすよう選択される。 第１、第２および第３の酵素と同一ではなく、同一生成 【００４４】 物の生合成経路の部分である。 本発明のいくつかの実施形態によれば、発現は、細菌細 【００５４】 胞において達成される。 本発明のいくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレ 【００４５】 オチドは、 本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌細胞は、大 （ｖ）第５の酵素コード配列と作動可能に連結している 腸菌細胞を含む。 第５のＲＢＳ 【００４６】 をさらに含む。 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々に 40 【００５５】 、スペーサー配列が隣接する。 本発明のいくつかの実施形態によれば、第５の酵素は、 【００４７】 第１、第２、第３および第４の酵素と同一ではなく、対 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の 象の同一生成物の生合成経路の部分である。 上流のスペーサー配列は、配列番号８に示される配列と 【００５６】 少なくとも８０％相同である。 本発明のいくつかの実施形態によれば、単離ポリヌクレ 【００４８】 オチドは、 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の （ｖｉ）第６の酵素コード配列と作動可能に連結してい 下流のスペーサーは、配列番号９に示される配列と少な る第６のＲＢＳ くとも８０％相同である。 をさらに含む。 【００４９】 50 【００５７】 ( 12 ) JP 21 2015-530870 A 2015.10.29 22 本発明のいくつかの実施形態によれば、第６の酵素は、 面を詳細に特に参照して、示される詳細は例としてであ 第１、第２、第３、第４および第５の酵素と同一ではな り、本発明の実施形態の例示的考察を目的とするという く、対象の同一生成物の生合成経路の部分である。 ことが強調される。この関連で、図面と一緒にされた説 【００５８】 明によって、本発明の実施形態が実施され得る方法は当 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々に 業者には明らかとなる。 、スペーサー配列が隣接する。 【図面の簡単な説明】 【００５９】 【００６７】 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の 【図１】多重遺伝子構築物のコンビナトリアルアセンブ 上流のスペーサー配列は、配列番号８に示される配列と 少なくとも８０％相同である。 リーのためのモジュラークローニング戦略の図である。 10 正しくアセンブルされた構築物の直接選択によって偽陽 【００６０】 性クローンを排除する方法を開発した。対象の各遺伝子 本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＢＳの各々の を、ＮｈｅＩ（「Ｎ」）およびＰｃｉＩ（「Ｐ」）制限 下流のスペーサーは、配列番号９に示される配列と少な 部位が隣接するクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性カセ くとも８０％相同である。 ットと接続した。アセンブリーのために指定される配列 【００６１】 は、上流ＳｐｅＩ（「Ｓ」）制限部位を含有する。第１ 本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の生成物は の標的配列をベクター中にアセンブルするために、ＤＮ 、タンパク質である。 ＡをＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを使用してまず消化し、続 【００６２】 いて、ライゲーションし、形質転換した。細胞を、Ｃｍ 本発明のいくつかの実施形態によれば、対象の生成物は を含む選択寒天上にプレーティングした。骨格ベクター 、食品、医薬および燃料からなる群から選択される。 20 は、Ｃｍ耐性を含まないので、適切にアセンブルされた 【００６３】 （すなわち、指定された配列および耐性マーカーを含有 本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、少なくと する）クローンが、コロニーを形成する。次の標的配列 も３種の酵素を含む生合成経路の生成物である最適量の を組み込むために、アセンブリー生成物を細胞から抽出 対象の生成物を合成するために、ポリヌクレオチド配列 し、ＮｈｅＩおよびＰｃｉＩを用いて消化し、構築物か を選択する方法であって、 ら耐性マーカーを効果的に廃棄した。第１のものと同様 （ａ）細胞における対象の生成物の合成を可能にする条 に、第２の標的配列を、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを用い 件下で本明細書に記載されたポリヌクレオチドを細胞中 て消化し、ベクターにアセンブルした。重要なことに、 に導入することと、 ＮｈｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位の付着末端は適合し一 （ｂ）対象の生成物の量を測定することと 緒に接続されて、ＮｈｅＩまたはＳｐｅＩによって切断 を含み、対象の生成物の量は、選択されるポリヌクレオ 30 され得ない配列（「ｘ」）である、傷跡（scar）を形成 チド配列を示す、方法が提供される。 する。第２のアセンブリーラウンド後に、新規構築物は 【００６４】 、ここで、標的配列およびＣｍ耐性の両方を含有し、陽 本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、細菌細 性構築物の直接選択をもう一度可能にする。多重遺伝子 胞、哺乳類細胞、植物細胞、真菌細胞および藻類細胞か オペロンをアセンブルするために、この一連の事象が反 らなる群から選択される。 復され得る。 【００６５】 【図２】標的ＯＲＦのＲＢＳ調節の図である。所望のコ 別に定義されない限り、本明細書において使用されるす ード配列を、耐性カセットと対を形成させ、次いで、挿 べての技術用語および／または科学用語は、本発明が関 入部位の上流にＲＢＳを含有するベクターにアセンブル 係する技術分野の当業者によって一般に理解されるもの と する。バーコード付加および非バーコード付加アセンブ 40 リーは、同一論理に頼るものであるが、技術的理由のた 同一の意味を有する。本発明の実施形態の実施または試 めに制限部位が異なる。 験において、本明細書に記載されるものと類似または同 【図３】ｐＮｉｖ骨格プラスミドの図である。アセンブ 等の方法および材料が使用され得るが、例示的方法およ リープロセスを通じて漏出性発現を最小にするために、 び／または材料が以下に記載される。矛盾する場合には ＲＲＮＢターミネーターを、多重クローニング部位の上 、定義を含めて本特許明細書が支配する。さらに、材料 流に置いた。 、方法および実施例は、単に例示的なものであって、必 【図４】隔離されたＲＢＳユニット設計の模式図である ずしも制限であるよう意図されない。 。隣接する配列の組成が、所与のＲＢＳの発現レベルに 【００６６】 影響を及ぼすとわかった。このような続発的効果を最小 本発明の一部の実施形態が、添付の図面を参照して単に にしようとして、ＲＢＳ配列の上流および下流に一定の 例として本明細書において記載されている。ここで、図 50 スペーサーおよびタグ配列を導入した。 ( 13 ) JP 23 2015-530870 A 2015.10.29 24 【図５】ｐＳＢ４Ｋ５：Ｐｔａｃ−発現プラスミドの図 およびｍＣｈｅｒｒｙレベル間の依存は、対数領域にお である。多重クローニング部位の上流のｐＳＢ４Ｋ５プ いて直線傾向をたどり、約１／３の傾きを有する。 ラスミド骨格に、ハイブリッドＰｔａｃプロモーターを 【図１４】カロテノイド生合成オペロン−プラスミドマ 置いた。 ップの図である。 【図６Ａ−Ｄ】種々の蛍光タンパク質および誘導条件を 【図１５Ａ−Ｂ】バランスのとれた経路機能のために酵 使用するＲＢＳセットのフローサイトメトリー蛍光測定 素発現レベルの調節が必要であることを示す図である。 のグラフ図である。 （Ａ）２種の酵素からなる可逆性ミカエリス−メンテン 【図７】予測されたＲＢＳ活性と、実験による蛍光測定 速度論に基づく簡単な定量的モデルを使用して、バラン の比較のグラフ図である。ＣＦＰ（青色）、ＹＦＰ（緑 スのとれていない酵素発現の結果を表した。 色）およびｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）リポーターを、ＲＢ 10 白色で示される酵素濃度空間の小さい領域のみが、最適 Ｓ配列（Ａ∼Ｆ、文字によって示される通り）と各々対 製造を持続する。（Ｂ）ＲＢＳ配列の小さいセットが、 を形成させた。ｘ軸は、各配列の予測されたＲＢＳ活性 数桁規模のタンパク質発現に及ぶ。６種の予めキャラク を表し、一方、ｙ軸は、測定された蛍光レベルを表す。 タライズされたＲＢＳ配列を使用し、誘導プロモーター 蛍光レベルを正規化し、その結果、予測されたダイナミ の下流の対象の遺伝子と対を形成させた。＃８ ックレンジの中点−（予測された最 Ｓ−Ａ）：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＧＡ（配列番号２）＃ 大 −予測された最 小 （ＲＢ ／２）−が、各リポーターの実験によって測定されたダ １ （ＲＢＳ−Ｂ）：ＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧ イナミックレンジの中点−（測定された最 ＴＡＣＴＧＡＧ（配列番号３）＃１７（ＲＢＳ−Ｃ）： た最 小 大 −測定され ／２）対応する。 ＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡ（配列番号４）＃２ 【図８】単一チューブコンビナトリアルアセンブリーの ７（ＲＢＳ−Ｄ）：ＴＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧ（配 図である。アセンブリー反応において、ｐＮｉｖ：ＲＢ 20 列番号５）＃２０（ＲＢＳ−Ｅ）：ＴＡＡＧＣＡＧＧＡ Ｓプラスミドの、６種の別個のＲＢＳ配列との等モル混 ＣＣＧＧＣＧＧＣＧ（配列番号６）「Ｄｅａｄ−ＲＢＳ 合物を使用した。標的コード配列をプラスミド混合物に 」（ＲＢＳ−Ｆ）：ＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧ（配列番 ライゲーションし、すべて同一コード配列を含有するが 号７） 、その上流に位置する異なるＲＢＳ上流を有する６種の 【図１５Ｃ−Ｄ】バランスのとれた経路機能のために酵 別個の生成物を得た。 素発現レベルの調節が必要であることを示す図である。 【図９】ＲＢＳ調節される遺伝子の合成オペロンのアセ （Ｃ）ＲＢＳ配列のセットと対を形成したＹＦＰのフロ ンブリーの図である。 ーサイトメトリー蛍光測定（１５）。（Ｄ）アセンブル 【図１０】バーコード付加ＲＢＳ部位を有する合成オペ された部分のバーコード付加および正しくアセンブルさ ロンのアセンブリーの図である。 れた構築物の直接選択を可能にする多重遺伝子構築物の 各アセンブリーステップで、新規にアセンブルされたＲ 30 コンビナトリアルアセンブリーのモジュラークローニン ＢＳによって調節されるコード配列に対応するバーコー グ戦略。対象の各遺伝子は、クロラムフェニコール（Ｃ ドが、オペロンの３’末端に積み重ねられる。 ｍ）耐性カセットと接続され、ＲＢＳ配列のライブラリ 【図１１】バーコード付加ＲＢＳ混合物の単一チューブ ーと対を形成している。第１の遺伝子がベクター中にア コンビナトリアルアセンブリーの図である。標的挿入物 センブルされると、適切にアセンブルされたクローンが をｐＲＢＳバーコード付加混合物とライゲートし、得ら 、Ｃｍ耐性のために選択される。次の遺伝子を挿入する れたライブラリーは、その上流に種々のＲＢＳ配列を有 ために、マーカーは廃棄され、さらなる部分がベクター する標的コード配列を含有する。 中にアセンブルされる。新規に形成された構築物は、２ 【図１２】３色リポーターオペロン−プラスミドマップ 種のＲＢＳによって調節される遺伝子および耐性マーカ の図である。 ーを含有し、陽性構築物の直接選択をもう一度可能にす 【図１３】第１の遺伝子（ＹＦＰ）に対するオペロン（ 40 る。ＲＢＳによって調節される多重遺伝子オペロンのコ ｍＣｈｅｒｒｙ）中の第２の遺伝子の依存のグラフ図で ンビナトリアルライブラリーを容易にアセンブルするた ある。ｍＣｈｅｒｒｙを制御するＲＢＳ配列は、色（Ｒ めに、この一連のステップが反復され得る。 ＢＳ Ｃについては赤色お 【図１６Ａ−Ｃ】３種の蛍光タンパク質のＲＢＳ調節が Ｅについては緑色）を使用して示されおり 色空間に及ぶことを示す図である。（Ａ）ＣＦＰ、ＹＦ Ａについては青色、ＲＢＳ よびＲＢＳ 、ＹＦＰを制御するＲＢＳ配列は、形（ＲＢＳ Ａにつ ＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを、存在するＲＢＳセットの３ いてはアステリスク、ＲＢＳ Ｂについては丸、ＲＢＳ 種の代表（配列「Ａ」、「Ｃ」および「Ｅ」）と組合せ Ｃについては三角、ＲＢＳ Ｄについては四角、ＲＢ 的に接続し、遺伝子を一緒にアセンブルした。得られた Ｓ Ｆについては星） オペロンライブラリーは、遺伝子発現を調節するＲＢＳ に対応する。ＹＦＰの発現レベルがｍＣｈｅｒｒｙの発 Ｅについては十字およびＲＢＳ 配列においてのみ異なっている。（Ｂ）オペロンライブ 現を調節する翻訳共役の効果は、明らかである。ＹＦＰ 50 ラリーで形質転換された大腸菌コロニーの蛍光顕微鏡イ ( 14 ) JP 25 2015-530870 A 2015.10.29 26 メージング。観察された色は、蛍光タンパク質の各々に 、他の実施形態であり得る、または種々の方法で実行も 割り当てられた３種の原色の付加的組合せを表す。不規 しくは実施され得る。 則なコロニーの形は、隣接するコロニーの接触境界の結 【００７０】 果である。 組換え酵素の発現を調整することは、代謝経路の最適化 弱いＲＢＳを有するいくつかのコロニーは、黒く現れる に必須である（図１５Ａ）。バランスのとれた発現レベ 。差し込み図：明視野像。（Ｃ）３色ＲＢＳ調節性オペ ルを達成するための２つの主な戦略がある。合理的設計 ロンを含有する大腸菌コロニーの蛍光イメージング。像 は、経路の成分各々の相対および絶対量の算出または推 は、３Ｄグリッドに配置されており、各軸上の位置は、 定を含む。しかし、このような試みは、経路成分の速度 蛍光タンパク質のＲＢＳの強度に対応する。 論、エネルギー論および調節に関する十分な情報を欠く 【図１６Ｄ】３種の蛍光タンパク質のＲＢＳ調節が色空 10 ことによって制限されることが多い。あるいは、調節エ 間に及ぶことを示す図である。（Ｄ）２色オペロンライ レメントのランダム突然変異誘発に基づく戦略は、発現 ブラリーからサンプリングされたクローンのＹＦＰおよ 空間をサンプリングし、所望の表現型をスクリーニング びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レベル。バーコード配列決定によ または選択できる。しかし、突然変異体の大きなプール って決定されるようなＲＢＳ組成（関係オンラインテキ でさえ、発現空間の適切なカバレッジを保障せず、遺伝 ストを参照のこと）が示されている。同一遺伝子型（個 子型の大部分が、表現型空間の小さい部分に密集してい 別の色で標識された各々）は、蛍光空間中に一緒に密集 ることが多い。さらに、ランダム突然変異誘発は、所望 している。ＹＦＰの発現レベルが、ｍＣｈｅｒｒｙの発 の表現型のスクリーニングが困難なものであり、または 現を、最大５倍調節する翻訳共役の効果もまた明らかで 実現不可能でさえあり得る大きなライブラリーをもたら ある。 すことが多い。 【図１７Ａ−Ｂ】カロテノイド蓄積プロフィールが、生 20 【００７１】 合成遺伝子のＲＢＳ配列とともに変わることを示す図で 本発明者らは、調節エレメントのコンパクトなセットを ある。（Ａ）カロテノイド生合成経路の７種の遺伝子の 使用する表現型空間の調査を促進する戦略を取り入れた 各々を調節するＲＢＳ配列が異なる合成オペロンのライ 。合成オペロン中の同義遺伝子の発現を調節する、十分 ブラリーを作製した。（Ｂ）オペロンライブラリーで形 にキャラクタライズされたＲＢＳ配列の小さいセットを 質転換された大腸菌コロニーの両眼顕微鏡イメージング 使用することによって、本発明者は、各軸において数桁 。コロニーの色は、各々特徴的な色を有する蓄積された 規模にわたって多次元発現空間を効率的にサンプリング カロテノイドの組成に対応する。 できた。小さな大きさのＲＢＳセットが、ライブラリー 【図１７Ｃ】カロテノイド蓄積プロフィールが、生合成 中の遺伝子変異体の数を制限し、迅速なスクリーニング 遺伝子のＲＢＳ配列とともに変わることを示す図である を可能にすることが重要である。 。（Ｃ）形質転換されたライブラリーからサンプリング 30 【００７２】 されたクローンのカロテノイド蓄積プロフィールおよび 本発明者らは、カロテノイド生合成に関与する遺伝子の ＲＢＳ組成。各サンプリングされたクローンのＲＢＳ組 リボソーム結合部位を調節することによって、経路の代 成を、配列決定すること（バーコードでコードするＲＢ 謝生成物の蓄積が、その成分酵素を調節するＲＢＳ配列 Ｓは、３Ａに例示されるような遺伝子の順序を指す）に に従って大幅に変わることを実証する。本発明者らは、 よって決定し、各クローンのカロテノイドプロフィール アスタキサンチン生合成経路のコンビナトリアルアセン を、ＨＰＬＣを使用して分析した。異なる遺伝子型は、 ブリーが、従来のアセンブリーおよび選択法を上回って 別個の表現型、すなわち、別個のカロテノイド蓄積プロ ４倍の収量増大をもたらすことを見出し、それによって フィールをもたらす。円の面積は、右に記載された代謝 、キャラクタライズされた調節エレメントの小さいセッ 経路に従うカロテノイド中間体の製造収率を示す（１５ ）。 トを使用する発現空間のサンプリングの強度を例示する 40 。 【発明を実施するための形態】 【００７３】 【００６８】 本明細書において示される戦略は、種々の方法で拡大さ 本発明は、その一部の実施形態において、アスタキサン れ得る。具体的には、他の調節エレメントは、遺伝子発 チンなどの代謝経路の生成物を作製するためのバイオテ 現をさらに調節し得る。例えば、オペロンの転写を制御 クノロジー法に関する。 するためのプロモーターの小さいライブラリーを使用す 【００６９】 ることによって、発現空間全体のスパンが数桁規模でさ 本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前 らに増大され得る。 に、本発明は、必ずしも、以下の説明に示される、また 【００７４】 は実施例によって例示されるその適用に詳細に制限され 本発明者らは、代謝経路の生成物の最適製造に必要な代 ないということは理解されなければならない。本発明は 50 謝経路の酵素の割合を決定するために、異なる強度のも ( 15 ) JP 2015-530870 27 A 2015.10.29 28 のである、少なくとも３種の異なるＲＢＳ配列を含むポ 「リボソーム結合部位」（ＲＢＳ）は、普通、約４∼１ リヌクレオチド構築物を作製した。この構築物への、種 ６の塩基対を含む短いヌクレオチド配列であり、コード 々の順列での代謝経路の関連酵素をコードする配列の導 されるタンパク質の翻訳のためにリボソームをｍＲＮＡ 入は、最適ＲＢＳ酵素組合せのスクリーニングを可能に 分子上に位置付けることによって機能する。 する。 【００８１】 【００７５】 核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に「 したがって、本発明の一態様によれば、 作動可能に連結される」。例えば、プロモーターは、配 （ｉ）第１の酵素コード配列と作動可能に連結している 列の転写に影響を及ぼす場合にコード配列と作動可能に 第１のＲＢＳと、 連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進す （ｉｉ）第２の酵素コード配列と作動可能に連結してい 10 るよう位置付けられる場合に、コード配列と作動可能に る第２のＲＢＳと、 連結される。核酸配列の連結は、好都合な制限部位での （ｉｉｉ）第３の酵素コード配列と作動可能に連結して ライゲーションによって達成され得る。このような部位 いる第３のＲＢＳと が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプ を含む単離ポリヌクレオチドであって、 ターまたはリンカーは、アセンブリーＰＣＲなどの従来 第２のＲＢＳは、第２の酵素の発現のレベルが、第１の の実行に従って使用され得る。 酵素の発現のレベルよりも大きいよう選択され、 【００８２】 第３のＲＢＳは、第３の酵素の発現のレベルが、第２の 例示的ＲＢＳの配列およびその相対強度は、参照により 酵素の発現のレベルよりも大きいよう選択され、 本明細書に組み込まれた、その補足情報を含めて非特許 第１の酵素、第２の酵素および第３の酵素は、同一では 文献５に見出され得る。好ましくは、ＲＢＳは、その強 ない酵素であり、同一生成物の生合成経路の各部分であ 20 度が下流配列によって影響を受けないものに選択される る、単離ポリヌクレオチドが提供される。 。ＲＢＳの相対強度を選択する方法もここに開示されて 【００７６】 いる。例えば、ＲＢＳの相対強度は、検出マーカーをコ 語句「単離ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ配列、相補 ードするポリヌクレオチド配列を連結することおよび細 的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌク 胞においてマーカーを発現させることによって決定され レオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列 得る。マーカーは、蛍光タンパク質、リン光タンパク質 （例えば、上記の組合せ）の形態で単離され、提供され または抗体を使用して検出され得る任意のタンパク質で る一本鎖または二本鎖核酸配列を指す。 あり得る。検出可能なタンパク質の量は、ＲＢＳの強度 【００７７】 と相関する。 本明細書において、語句「相補的ポリヌクレオチド配列 【００８３】 」とは、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮ 30 例示的ＲＢＳ配列として、例えば、 Ａポリメラーゼを使用するメッセンジャーＲＮＡの逆転 （ＲＢＳ−Ａ）：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＧＡ（配列番号 写に起因する配列を指す。このような配列は、ＤＮＡ依 ２） 存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してｉｎ （ＲＢＳ−Ｂ）：ＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＡ はｉｎ ｖｉｖｏまた ｖｉｔｒｏでその後増幅され得る。 ＣＴＧＡＧ（配列番号３） 【００７８】 （ＲＢＳ−Ｃ）：ＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＡ（ 本明細書において、語句「ゲノムポリヌクレオチド配列 配列番号４） 」は、染色体に由来する（単離された）配列を指し、し （ＲＢＳ−Ｄ）：ＴＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧ（配列 たがって、染色体の連続部分を表す。 番号５） 【００７９】 （ＲＢＳ−Ｅ）：ＴＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＣ 本明細書において、語句「複合ポリヌクレオチド配列」 40 Ｇ（配列番号６） とは、少なくとも部分的に相補的であり、少なくとも部 （ＲＢＳ−Ｆ）：ＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＴＧ（配列番号 分的にゲノムの配列を指す。複合配列は、本発明のポリ ７） ペプチドをコードするために必要ないくつかのエキソン が挙げられる。 配列ならびにその間に入っているいくつかのイントロン 【００８４】 配列を含み得る。イントロン配列は、他の遺伝子のもの さらなるＲＢＳ配列は以下の通りである： を含めた任意の供給源のものであり得、通常、保存され ＡＧＧＡＡＡ、（配列番号７０）、ＡＧＡＡＡＡ（配列 たスプライシングシグナル配列を含む。このようなイン 番号７１）、ＡＧＡＡＧＡ（配列番号７２）、ＡＧＧＡ トロン配列は、シス作動性発現調節エレメントをさらに ＧＡ（配列番号７３）、ＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡ（配列番 含み得る。 号７４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡ（配列番号７５）、ＡＡＧ 【００８０】 50 ＧＡＡＡＧ（配列番号７６）、ＡＡＧＧＡＡＡＵ（配列 ( 16 ) JP 29 2015-530870 A 2015.10.29 30 番号７７）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡ（配列番号７８）、Ａ 列がある。ＲＢＳの下流に置かれ得る例示的配列として ＡＧＧＡＡＡＡＧ（配列番号７９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡ 、（配列番号９）に対して少なくとも７０％相同、少な Ｕ（配列番号８０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ（配列番号 くとも８０％相同、少なくとも９０％相同または１００ ８１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧ（配列番号８２）、ＡＡ ％相同な配列がある。 ＧＧＡＡＡＡＡＵ（配列番号８３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡ 【００９１】 ＡＡＡ（配列番号８４）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧ（配 上記で本明細書において記載されたように、本発明は、 列番号８５）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号８６ 発現構築物への安定化ｍＲＮＡ配列の挿入をさらに考慮 ）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号８７）、ＡＡ する。 ＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号８８）、ＡＡＧＧＡＡ 【００９２】 ＡＡＡＡＡＵ（配列番号８９）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ 10 「安定化ｍＲＮＡ」は、遺伝子発現に影響を及ぼすよう ＡＡＡ（配列番号９０）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧ 使用される核酸配列挿入断片である。これらの挿入断片 （配列番号９１）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列 は、一般に、遺伝子または核酸配列の転写および翻訳開 番号９２）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号 始部位の間に位置する。 ９３）、ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ（配列番号９４ 【００９３】 ）、ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ（配列番号９５）およびＡＡ 安定化ｍＲＮＡ配列は、当技術分野で周知であり、非特 ＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵ（配列番号９６）。 許文献６が参照される。好ましいｍＲＮＡ安定化配列と 【００８５】 して、以下の配列： 一実施形態によれば、第３のＲＢＳは、第２のＲＢＳの ＧＧＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴ 少なくとも２倍、３倍、５倍またはさらに１０倍強力で ＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号９７）；ＧＧＴＧＧＡＣ ある。 20 ＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣ 【００８６】 Ｇ、（配列番号９８）；ＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣ 別の実施形態によれば、第２のＲＢＳは、第１のＲＢＳ ＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号 の少なくとも２倍、３倍、５倍またはさらに１０倍強力 ９９）；ＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧ である。 ＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列番号１００）；ＣＧ 【００８７】 ＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧ 当然のことではあるが、特定の代謝経路の酵素の数に応 ＴＴＧＡＣＧ、（配列番号１０１）；ＧＧＴＧＧＡＧＴ じて、また使用される特定の細胞系において天然に発現 ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ される酵素の数に応じて、ポリヌクレオチドは、さらな 、（配列番号１０２）およびＧＣＴＧＧＡＣＴＴＡＴＣ るＲＢＳを含み、さらなる酵素をコードし得る。したが ＴＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＣＧ、（配列 って、単離ポリヌクレオチドは、代謝経路中に存在する 30 番号１０３） 異なる酵素コード配列と作動可能に連結している第４、 が挙げられる。 第５または第６のＲＢＳを含み得る。 【００９４】 【００８８】 本発明のポリヌクレオチドは、発現構築物として使用さ 転写調節エレメント（例えば、ＲＢＳ）に隣接する配列 れ得るようなさらなる配列（例えば、プロモーター）を は、発現レベルに影響を及ぼし得るので、その上流およ 含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは、このベクター び下流に位置するスペーサー配列、すなわち、１０∼５ を、原核生物、真核生物または好ましくは、両方におけ ０ｂｐ、例えば、約２０ｂｐの一定の配列が、発現構築 る複製および組込みに適したもの（例えば、シャトルベ 物中に挿入され得る。 クター）にする配列を含み得る。通常のクローニングベ 【００８９】 クターは、以下に本明細書において記載されるような、 本明細書において、用語「スペーサー配列」とは、論じ 40 転写および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エン られている配列の上流または下流のいずれかである任意 ハンサー）ならびに転写および翻訳ターミネーター（例 の配列を指す（例えば、遺伝子ＡＢＣについては、遺伝 えば、ポリアデニル化シグナル）を含有する。 子Ｂに、ＡおよびＣ遺伝子配列が隣接する）。いくつか 【００９５】 の実施形態では、隣接配列は、ＤＮＡ断片の一方の側に 一実施形態によれば、ポリヌクレオチド中の酵素コード のみ（３’または５’のいずれか）存在するが、好まし 配列の各々は、プロモーターと作動可能に連結している い実施形態では、隣接される配列の各側にある。 。一実施形態では、同一プロモーターが、ポリヌクレオ 【００９０】 チド中にコードされる酵素の各々の発現を制御する。別 ＲＢＳの上流に置かれ得る例示的配列として、（配列番 の実施形態によれば、異なるプロモーターが、ポリヌク 号８）に対して少なくとも７０％相同、少なくとも８０ レオチド中にコードされる酵素の発現を制御する。 ％相同、少なくとも９０％相同または１００％相同な配 50 【００９６】 ( 17 ) JP 2015-530870 31 A 2015.10.29 32 特定のプロモーターの例が、本明細書において以下に記 シリン、セファロスポリン、バンコマイシン、ポリミキ 載される。 シンおよびグラミシジン； 【００９７】 ｂ）生物界面活性剤；例えば、ラムノリピド、ソホロ脂 一実施形態によれば、発現構築物は、選択マーカーをコ 質、糖脂質およびリポペプチド； ードする。 ｃ）生物燃料；例えば、バイオエタノール、バイオディ 【００９８】 ーゼルおよびバイオブタノール； 本明細書において、用語「選択マーカー」とは、導入さ ｄ）アミノ酸；例えば、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン れた核酸またはベクターを含有する宿主の容易な選択を 、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イ 可能にする、宿主細胞において発現可能な遺伝子を指す ソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プ 。このような選択マーカーの例として、それだけには限 10 ロリン（ヒドロキシプロリン）、Ｌ−トレオニン、Ｌ− らないが、抗菌剤（例えば、カナマイシン、エリスロマ メチオニン、Ｌ−チロシンおよびＤ−ｐ−ヒドロキシフ イシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコールおよ ェニルグリシン； びテトラサイクリン）が挙げられる。したがって、用語 ｅ）有機酸；例えば、クエン酸、乳酸、グルコン酸、酢 「選択マーカー」とは、宿主細胞が、外因性ポリヌクレ 酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸およびイタコン オチド配列を取り込んだという指標またはいくつかの他 酸； の反応が起こったという指標を提供する遺伝子を指す。 ｆ）脂肪酸；例えば、アラキドン酸、ポリ不飽和脂肪酸 通常、選択マーカーは、宿主細胞に抗菌剤耐性または代 （ＰＵＢＡ）およびα−リノール酸； 謝上の利点を付与して、外因性ＤＮＡを含有する細胞が ｇ）アルコールおよびポリオール；例えば、グリセロー 、形質転換の際に任意の外因性配列を受け取っていない ル、マンニトール、エリトリトール、キシリトール、ポ 細胞と区別されるのを可能にする遺伝子である。 20 リ−３−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよび１−ブ 【００９９】 タノール； 記載されたように、本明細書に記載されるポリヌクレオ ｈ）香味料および香料；例えば、バニリン、ベンズアル チドは、同一生成物の生合成経路の一部である酵素をコ デヒド、ジヒドロキシアセトン、４−（Ｒ）−デカノリ ードする。 ドおよび２−アクチル−１−ピロリン； 【０１００】 ｉ）ヌクレオチド；例えば、５’−グアニル酸および５ 本明細書において、語句「生合成経路」または「代謝経 ’−イノシン酸； 路」とは、複数の酵素を含み、１種または複数の酵素に ｊ）ビタミン；例えば、ビタミンＣ、ビタミンＦ、ビタ よって作用される基質、酵素によって触媒される反応の ミンＢ２、プロビタミンＤ２、ビタミンＢ１２、葉酸、 生成物、酵素によって利用される補助因子などをさらに ニコチンアミド、ビオチン、２−ケト−Ｌ−グロン酸お 含み得る、基質を対象の生成物に変換するための細胞系 30 よびプロビタミンＱ１０； または細胞（細胞不含）系を指す。系は、無傷の細胞中 ｋ）色素；例えば、アスタキサンチン、β−カロテン、 に、または細胞の溶解物中に存在し得る。 ロイコペン(leucopene)、モナスコルブリン(monascorub 【０１０１】 rin)およびルブロプンクタチン(rubropunctatin); 微生物系において、多数の代謝経路が公知であり、記載 ｌ）糖類およびポリ糖類；例えば、リボース、ソルボー されており、公的データベースにおいて利用できる；例 ス、キサンタン、ゲラン(gellan)およびデキストラン； えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、非特許 ならびに［００６６］ｍ）生体高分子およびプラスチッ 文献７、非特許文献８、非特許文献９、および非特許文 ク；例えば、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ） 献１０を参照のこと。 、ポリ−γグルタミン酸および１，３−プロパンジオー 【０１０２】 ルを含めた種々の化合物および材料の合成を包含する。 一実施形態では、経路は、食品、医薬または燃料の製造 40 【０１０４】 を指示する。 対象の生合成経路のその他の例として、種々の大腸菌代 【０１０３】 謝生成物の合成が挙げられる。 生合成経路は、例えば、炭水化物、アミノ酸、核酸、ス 【０１０５】 テロイド、脂肪酸および天然物生合成に関与する経路を 「代謝生成物」は、代謝（例えば、酵素、基質または生 含み得、それだけには限らないが、 成物）の間に使用されるか、または製造される任意の物 ａ）抗生物質；例えば、アクチノマイシン、ブレオマイ 質である。本明細書において、代謝生成物は、常にでは シン、リファマイシン、クロラムフェニコール、カルバ ないが、しばしば、対象の経路中の酵素の生成物である ペネム、テトラサイクリン、リンコマイシン、エリスロ 。 マイシン、ストレプトマイシン、シクロヘキサミド、ピ 【０１０６】 ューロマイシン、サイクロセリン、バシトラシン、ペニ 50 例示的大腸菌代謝生成物として、それだけには限らない ( 18 ) JP 33 2015-530870 A 2015.10.29 34 が、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、２−ケトグルタル （ＥＣ１）オキシドレダクターゼ；例えば、デヒドロゲ 酸、３−ホスホグリセリン酸、４−ヒドロキシ安息香酸 ナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、オキシドレダク 、６−ホスホグルコン酸、アセトアセチル−ＣｏＡ、ア ターゼ、シンターゼ、オキシゲナーゼ、モノオキシゲナ セチル−ＣｏＡ、アセチルリン酸、アデニン、アデノシ ーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ヒドロゲ ン、アデノシンホスホ硫酸、ＡＤＰ、ＡＤＰ−グルコー ナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、 ス、アラニン、ＡＭＰ、アントラニル酸、アルギニン、 カタラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、デメ アスパラギン、アスパラギン酸、ＡＴＰ、カルバミルア チラーゼ、不飽和化酵素、ジムスターゼ、ヒドロキシル スパラギン酸、シス−アスコット酸、クエン酸、シトル トランスフェラーゼ、デハロゲナーゼおよびデヨードナ リン、ＣＭＰ、補酵素Ａ、ＣＴＰ、サイクリックＡＭＰ ーゼ； 、シチジン、シトシン、ｄＡＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ 10 （ＥＣ２）トランスフェラーゼ；例えば、トランスアミ 、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシ ナーゼ、キナーゼ、ジキナーゼ、メチルトランスフェラ リボース−５−Ｐ、ｄＧＭＰ、ジヒドロオロト酸、ジヒ ーゼ、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミル ドロキシアセトンリン酸、ｄＴＤＰ、ｄＴＴＰ、エリト トランスフェラーゼ、ホルムイミノトランスフェラーゼ ロース−４−リン酸、ＦＡＤ、フラビンモノヌクレオチ 、カルボキシトランスフェラーゼ、カルバモイルトラン ド、フルクトース−１，６−ビスリン酸、フルクトース スフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、トランス −６−リン酸、フマル酸、ＧＤＰ、グルコン酸、グルコ アルドラーゼ、トランスケトラーゼ、アセチルトランス ノラクトン、グルコサミン−６−リン酸、グルコース− フェラーゼ、アシルトランスフェラーゼパルミトイルト ６−リン酸、グルコース−１−リン酸、グルタミン酸、 ランスフェラーゼ、スクシニルトランスフェラーゼ、マ グルタミン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド ロニルトランスフェラーゼ、ガロイルトランスフェラー 、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセリン酸、グ 20 ゼ、シナポイルトランスフェラーゼ、チグロイルトラン リセロール−３−リン酸、ＧＭＰ、ＧＴＰ、グアニン、 スフェラーゼ、テトラデカノイルトランスフェラーゼ、 グアノシン、ヒスチジン、ヒスチジノール、ホモシステ ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、フェルロ イン、イノシン二リン酸、イノシン一リン酸、イノシン イルトランスフェラーゼ、ミコリルトランスフェラーゼ 三リン酸、イソロイシン、リシン、リンゴ酸、マロニル 、ベンゾイルトランスフェラーゼ、ピペロイルトランス −ＣｏＡ、メチオニン、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセ フェラーゼ、トリメチルトリデカノイルトランスフェラ チル−グルコサミン−１Ｐ、Ｎ−アセチル−オルニチン ーゼ、ミリストイルトランスフェラーゼ、クマロイルト 、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、オル ランスフェラーゼ、チオラーゼ、アミノアシルトランス ニチン、オキサロ酢酸、フェニルアラニン、フェニルピ フェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソシルトランスフェ ルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、プロリン、プロ ラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ、シアリルトラ ピオニル−ＣｏＡ、ＰＲＰＰ、ピルビン酸、キノリン酸 30 ンスフェラーゼ、ピリジニラーゼ、ジホスホリラーゼ、 、リボフラビン、リボース−５−リン酸、リブロース− シクロトランスフェラーゼ、スルフリラーゼ、アデノシ ５−リン酸、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、セリン ルトランスフェラーゼ、カルボキシビニルトランスフェ 、シキミ酸、シキメート、コハク酸、スクシニル−Ｃｏ ラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、アミノカ Ａ、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ＵＤＰ、 ルボキシプロピルトランスフェラーゼ、ジメチルアリル ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ− トランスフェラーゼ、ファルネシルトランストランスフ Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン、ＵＴＰ、バリン ェラーゼ、ヘキサプレニルトランストランスフェラーゼ およびキシルロース−５−リン酸が挙げられる。 、デカプレニルシストランスフェラーゼ、ペンタプレニ 【０１０７】 ルトランストランスフェラーゼ、ノナプレニルトランス 特定の実施形態では、対象の経路は、シキミ酸および／ フェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、ア またはシキメート（シキメートは、シキミ酸のアニオン 40 ミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、オキシイ 型である）およびその合成中間体、イソプレノイドまた ミノトランスフェラーゼ、プリントランスフェラーゼ、 はテルペン（例えば、アモルファジエン、フェルネセン ホスホジムスターゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ヌク 、リコピン、アスタキサンチン、ビタミンＡ、メントー レオチジルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、コリン ル、β−カロテン）、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸、イソ ホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルムターゼ、硫黄 ブタノールおよび１−ブタノールの合成を提供する。 トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼおよび 【０１０８】 ＣｏＡ−トランスフェラーゼ； いくつかの反応は、対象の生合成経路中の酵素によって （ＥＣ３）ヒドロラーゼ；例えば、リパーゼ、エステラ 触媒され得る。括弧中に提供される酵素分類番号によっ ーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ラク て同定され得る広範なクラスの酵素として、それだけに トナーゼ、デアシラーゼ、デアセチラーゼ、フェオホル は限らないが、 50 ビダーゼ、デポリメラーゼ、チオールエステラーゼ、ホ ( 19 ) JP 2015-530870 35 A 2015.10.29 36 スファターゼ、ジホスファターゼ、トリホスファターゼ Ｈ基に作用するオキシドレダクターゼ、 、ヌクレオチダーゼ、フィターゼ、ホスホジエステラー （ＥＣ１．６）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよびアクセ ゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、シクラーゼ、オ プターに作用するオキシドレダクターゼ、 リゴヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌク （ＥＣ１．７）ドナーおよびアクセプターとしての他の レアーゼ、エンドヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、ヌク 窒素性化合物に作用するオキシドレダクターゼ、 レオシダーゼ、グリコシラーゼ、アミノペプチダーゼ、 （ＥＣ１．８）ドナーおよびアクセプターの硫黄基に作 ジペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、メタロカル 用するオキシドレダクターゼ、 ボキシペプチダーゼ、ω−ペプチダーゼ、セリンエンド （ＥＣ１．９）ドナーおよびアクセプターのヘム基に作 ペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパ 用するオキシドレダクターゼ、 ラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダー 10 （ＥＣ１．１）ドナーおよびアクセプターとしてのジフ ゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ、アミナーゼ、アミ ェノールおよび関連物質に作用するオキシドレダクター ダーゼ、デスクシニラーゼ、デホルミラーゼ、アシラー ゼ、 ゼ、デイミナーゼ、デアミナーゼ、ジヒドロラーゼ、シ （ＥＣ１．１１）アクセプターとして過酸化物に作用す クロヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＧＴ るオキシドレダクターゼ、 Ｐアーゼ、ハライダーゼ(halidase)、デハロゲナーゼお （ＥＣ１．１２）ドナーおよびアクセプターとしての水 よびスルホヒドロラーゼ； 素に作用するオキシドレダクターゼ、 （ＥＣ４）リアーゼ；例えば、デカルボキシラーゼ、カ （ＥＣ１．１３）分子酸素を組み込んで単一ドナーに作 ルボキシラーゼ、カルボキシキナーゼ、アルドラーゼ、 用し、１個または２個の酸素原子を組み込むオキシドレ エポキシリアーゼ(epoxylyase)、オキソ酸リアーゼ、炭 ダクターゼ、 素−炭素リアーゼ、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、シ 20 （ＥＣ１．１４）分子酸素の組込みまたは還元を伴って ンターゼ、エンドリアーゼ、エキソリアーゼ、アンモニ 対を形成するドナーに作用し、ドナーが、２−オキソグ ア−リアーゼ、アミジン−リアーゼ、アミン−リアーゼ ルタル酸、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、還元型フラビン、フ 、炭素−硫黄リアーゼ、炭素−ハライドリアーゼ(carbo ラボタンパク質、プテリジン、鉄−硫黄タンパク質、ア n-halide lyase)、リン−酸素リアーゼおよびデヒドロ スコルビン酸であるオキシドレダクターゼ、 クロリナーゼ； （ＥＣ１．１５）アクセプターとしてのスーパーオキシ （ＥＣ５）イソメラーゼ；例えば、イソメラーゼ、ラセ ドラジカルに作用するオキシドレダクターゼ、 マーゼ、ムターゼ、トートメラーゼ、ホスホムターゼ、 （ＥＣ１．１６）金属イオンおよびアクセプターを酸化 ホスホグルコムターゼ、アミノムターゼ、シクロイソメ するオキシドレダクターゼ、 ラーゼ、シクラーゼ、トポイソメラーゼ；および （ＥＣ１．１７）ＣＨまたはＣＨ２基およびアクセプタ （ＥＣ６）リガーゼ；例えば、シンセターゼ、ｔＮＲＡ 30 ーに作用するオキシドレダクターゼ、 −リガーゼ、酸−チオールリガーゼ、アミドシンターゼ （ＥＣ１．１８）ドナーおよびアクセプターとしての鉄 、ペプチドシンターゼ、シクロリガーゼ、カルボキシラ −硫黄タンパク質に作用するオキシドレダクターゼ、 ーゼ、ＤＮＡ−リガーゼ、ＲＮＡ−リガーゼおよびシク （ＥＣ１．１９）ドナーおよびアクセプターとしての還 ラーゼ 元型フラボドキシンに作用するオキシドレダクターゼ、 が挙げられる。 （ＥＣ１．２）ドナーおよびアクセプター中のリンまた 【０１０９】 はヒ素に作用するオキシドレダクターゼならびに 酵素のより具体的なクラスとして、制限するものではな （ＥＣ１．２１）Ｘ−−ＨおよびＹ−−Ｈに作用して、 いが、以下に提供されるような、オキシドレダクターゼ Ｘ−−Ｙ結合を形成し、アクセプターに作用し、各ドナ 、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよび ーカテゴリーのアクセプターが、制限されるものではな リガーゼのサブクラスが挙げられる。例示的オキシドレ 40 いが、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ヘムタンパク質、酸素、ジス ダクターゼとして、それだけには限らないが、 ルフィド、キノン、鉄−硫黄タンパク質、フラビン、窒 （ＥＣ１．１）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−Ｏ 素性基、シトクロム、二窒素およびＨ＋を含み得る、オ Ｈ基に作用するオキシドレダクターゼ、 キシドレダクターゼ （ＥＣ１．２）ドナーおよびアクセプターのアルデヒド が挙げられる。 またはオキソ基に作用するオキシドレダクターゼ、 【０１１０】 （ＥＣ１．３）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−Ｃ 例示的トランスフェラーゼとして、それだけには限らな Ｈ基に作用するオキシドレダクターゼ、 いが、 （ＥＣ１．４）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−Ｎ （ＥＣ２．１）１炭素基を転移するトランスフェラーゼ Ｈ２基に作用するオキシドレダクターゼ、 、 （ＥＣ１．５）ドナーおよびアクセプターのＣＨ−−Ｎ 50 （ＥＣ２．２）アルデヒドまたはケトン化合物基を転移 ( 20 ) JP 37 2015-530870 A 2015.10.29 38 するトランスフェラーゼ、 （ＥＣ５．２）シス−トランス−イソメラーゼ、 （ＥＣ２．３）アシルトランスフェラーゼ； （ＥＣ５．３）分子内イソメラーゼ （ＥＣ２．４）グリコシルトランスフェラーゼ； （ＥＣ５．４）分子内トランスフェラーゼ（ムターゼ） （ＥＣ２．５）メチル基以外のアルキルまたはアリール および 基を転移するトランスフェラーゼ、 （ＥＣ５．５）分子内リアーゼ （ＥＣ２．６）窒素性基を転移するトランスフェラーゼ が挙げられる。 、 【０１１４】 （ＥＣ２．７）リン含有基を転移するトランスフェラー 例示的リガーゼとして、それだけには限らないが、 ゼ、 （ＥＣ６．１）炭素−酸素結合を形成するリガーゼ、 （ＥＣ２．８）硫黄含有基を転移するトランスフェラー 10 （ＥＣ６．２）炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ、 ゼ、ならびに （ＥＣ６．３）炭素−窒素結合を形成するリガーゼ、 （ＥＣ２．９）セレン含有基を転移するトランスフェラ （ＥＣ６．４）炭素−炭素結合を形成するリガーゼ、 ーゼ （ＥＣ６．５）リン酸エステル結合を形成するリガーゼ が挙げられる。 および 【０１１１】 （ＥＣ６．６）窒素−金属結合を形成するリガーゼ 例示的ヒドロラーゼとして、それだけには限らないが、 が挙げられる。 （ＥＣ３．１）エステル結合に作用するヒドロラーゼ、 【０１１５】 （ＥＣ３．２）グリコシラーゼ、 アイソザイム（イソ酵素としても知られる）は、アミノ （ＥＣ３．３）エーテル結合に作用するヒドロラーゼ、 酸配列が異なるが、同一化学反応を触媒する酵素である （ＥＣ３．４）ペプチド結合作用するヒドロラーゼ（ペ 20 。対象の経路においていくつかの点で、２種以上のアイ プチダーゼ）、 ソザイムが存在し得る。アイソザイムは、異なる動態パ （ＥＣ３．５）ペプチド結合以外の炭素−窒素結合に作 ラメータおよび／または異なる調節特性を示し得る。 用するヒドロラーゼ、 【０１１６】 （ＥＣ３．６）酸無水物に作用するヒドロラーゼ、 対象の経路または関連経路に関与する酵素はまた、酵素 （ＥＣ３．７）炭素−炭素結合に作用するヒドロラーゼ の役割に従って分類され得る。 、 細胞または細胞溶解物中の直接関与酵素（クラス１）は （ＥＣ３．８）ハロゲン化物結合に作用するヒドロラー 、経路中の反応を触媒する。このような直接酵素が、第 ゼ、 １の酵素の生成物が、第２の酵素の基質であり、第２の （ＥＣ３．９）リン−窒素結合に作用するヒドロラーゼ 酵素の生成物が、第３の酵素の基質などであり、最終的 、 30 に対象の生成物をもたらす連鎖の１種である経路に特有 （ＥＣ３．１）硫黄−窒素結合に作用するヒドロラーゼ である。細胞または細胞溶解物中の関節関与酵素（クラ 、 ス２）は、関連経路において、普通、対象の経路におい （ＥＣ３．１１）炭素−リン結合に作用するヒドロラー て使用される基質の製造において反応する。 ゼ、 【０１１７】 （ＥＣ３．１２）硫黄−硫黄結合に作用するヒドロラー 本明細書において記載されるものの方法において使用す ゼおよび（ＥＣ３．１３）炭素−硫黄結合に作用するヒ るための対象の経路は、普通、少なくとも１種の酵素、 ドロラーゼ 少なくとも２種の酵素、少なくとも３種の酵素、少なく が挙げられる。 とも４種の酵素またはそれ以上、例えば、１∼５０種の 【０１１２】 例示的リアーゼとして、それだけには限らないが、 間の酵素、１∼４０種の間の酵素、１∼３０種の間の酵 40 素、１∼２０種の間の酵素、１∼１０種の間の酵素、１ （ＥＣ４．１）炭素−炭素リアーゼ、 ∼５種の間の酵素、１∼２種の間の酵素、２∼５０種の （ＥＣ４．２）炭素−酸素リアーゼ、 間の酵素、２∼４０種の間の酵素、２∼３０種の間の酵 （ＥＣ４．３）炭素−窒素リアーゼ、 素、２∼２０種の間の酵素、２∼１０種の間の酵素、２ （ＥＣ４．４）炭素−硫黄リアーゼ、 ∼５種の間の酵素、２∼４種の間の酵素、５∼５０種の （ＥＣ４．５）炭素−ハロゲン化物リアーゼおよび 間の酵素、５∼４０種の間の酵素、５∼３０種の間の酵 （ＥＣ４．６）リン−酸素リアーゼ 素、５∼２０種の間の酵素、５∼１０種の間の酵素、５ が挙げられる。 ∼８種の間の酵素、１０∼５０種の間の酵素、１０∼４ 【０１１３】 ０種の間の酵素、１０∼３０種の間の酵素または１０∼ 例示的イソメラーゼとして、それだけには限らないが、 ２０種の間（両端値を含む）の酵素を含む。 （ＥＣ５．１）ラセマーゼおよびエピメラーゼ、 50 【０１１８】 ( 21 ) JP 39 2015-530870 A 2015.10.29 40 経路中の酵素は、天然に存在し得るか、または対象の特 術は、非特許文献１１および非特許文献１２に開示され 定の特徴、例えば、基質特異性、反応速度論、溶解度お ている。エレクトロポレーション、プロトプラスト形質 よび／またはフィードバック阻害に対する非感受性を最 転換および会合を含めた形質転換、形質導入およびプロ 適化するよう改変され得る。さらに、いくつかの場合に トプラスト融合の方法が開示されている、非特許文献１ は、酵素を発現する遺伝子は、宿主細胞内でのコドン使 ３、非特許文献１４、非特許文献１５および非特許文献 用に向けて最適化される。いくつかの実施形態では、完 １６も参照される。形質転換の方法は、特に好ましい。 全経路は、単一生物由来の酵素を含むが、このようなこ 細菌細胞の維持および成長に適した方法は、周知であり とは必要ではなく、複数の生物に由来する酵素を組み合 、非特許文献１７および非特許文献１８が参照される。 わせることも考慮される。いくつかの理由のために、経 【０１２３】 路は、宿主細胞にとって内因性であり得るが、このよう 10 本明細書において、細胞に核酸配列を挿入することに関 なことも必要ではなく、完全経路または経路の成分は、 連して使用される、用語「導入された」は、「トランス 宿主細胞中に導入され得る。系が無傷の細胞において提 フェクション」、「形質転換」または「形質導入」を意 供される場合には、対象の経路の酵素の完全なセットが 味し、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラ 細胞中に存在し得る。 スミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）組み 【０１１９】 込まれ、自律的レプリコンに変換され得る、または一時 当然のことではあるが、本明細書に記載される実施形態 的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍ と関連する酵素をコードする遺伝子は、種々の供給源か ＲＮＡ）、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組込 ら得られ得る。当業者ならば承知するであろうが、これ みへの言及を含む。 らの標的とされる酵素の相同遺伝子は、多数の種におい 【０１２４】 て存在し、例えば、ＮＣＢＩインターネットサイト（ｎ 20 本明細書において、細胞に関連して使用される、用語「 ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で入手可能なタンパ 形質転換された」、「安定に形質転換された」および「 ク質ＢＬＡＳＴ検索による相同性検索によって同定され トランスジェニック」とは、細胞が、そのゲノム中に統 得る。これらの酵素をコードする遺伝子は、当業者によ 合された、または２以上の世代を通して維持されるエピ って理解されるように、例えば、縮重プライマーを使用 ソームプラスミドとして、非天然（異種性）核酸配列を して、所与の酵素を含有する任意の供給源から得られた 有することを意味する。 ＤＮＡからＰＣＲ増幅され得る。いくつかの実施形態で 【０１２５】 は、所与の酵素をコードする遺伝子は、合成的なもの（ 形質転換宿主細胞は、挿入ＤＮＡ構築物中に提供された 人為的なもの）、例えば、糖、窒素ベースの化合物、リ 選択マーカーに対する表現型反応に基づいて選択される ン酸およびＤＮＡ合成に必要な他の化合物／試薬から合 。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、宿主細胞 成されたＤＮＡであり得る。本明細書において論じられ 30 から切り出され得る（非特許文献１９）。 る酵素をコードする遺伝子を得る任意の手段が、本明細 【０１２６】 書に記載される実施形態の態様と適合する。 経路エンジニアリングのための宿主細胞として、それだ 【０１２０】 けには限らないが、細菌、真菌および原生動物を含めた 経路の生成物は、安定である場合も、相対的に不安定で さまざまな従属栄養性および独立栄養性微生物が挙げら ある場合もあるが、いくつかの場合には、細胞、細胞溶 れる。ある種の実施形態では、宿主細胞として、ポリペ 解物または反応混合物から単離され得る最終生成物は十 プチドが細胞区画または細胞外区画に向けられ得る手段 分に安定である。 が公知であるものが挙げられる。いくつかの実施形態で 【０１２１】 は、細胞は、本明細書に記載される核酸のうち任意の１ 反応において生じた生成物の量は、種々の方法で、例え 種または複数を組換えによって発現する任意の種類の細 ば、着色または蛍光生成物をもたらす酵素的アッセイに 40 胞である。このような細胞は、原核細胞およびの真核細 よって、または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ 胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、エシェリ Ｃ）法によって測定され得る。ある種の実施形態では、 キア属種、ストレプトマイセス属種、ザイモナス属種、 生成物は、生じる特定の生成物の活性または濃度を測定 アセトバクター属種、シトロバクター属種、シネコシス するアッセイを利用して測定される。生成物がタンパク ティス属種、リゾビウム属種、クロストリジウム属種、 質である場合には、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで定 コリネバクテリウム属種、ストレプトコッカス属種、キ 量され得る。 サントモナス属種、ラクトバチルス属種、ラクトコッカ 【０１２２】 ス属種、バチルス属種、アルカリゲネス属種、シュード 当業者ならば、ポリヌクレオチドを宿主細胞に、特に、 モナス属種、エロモナス属種、アゾトバクター属種、コ 大腸菌、バチルスおよびパントエア宿主細胞に導入する マモナス属種、マイコバクテリア属種、ロドコッカス属 ための方法を十分に承知している。一般的な形質転換技 50 種、グルコノバクター属種、ラルストニア属種、アシジ ( 22 ) JP 41 2015-530870 A 2015.10.29 42 チオバチルス属種、ミクロルナタス属種、ジオバクター って選択される。 属種、ジオバチルス属種、アルスロバクター属種、フラ 【０１２９】 ボバクテリウム属種、セラチア属種、サッカロポリスポ 反応は、小規模（例えば、普通、少なくとも約１ｍｌお ラ属種、サーマス属種、ステノトロホモナス属種、クロ よび約１５ｍｌ以下）の、または大規模な反応（例えば モバクテリウム属種、シノリゾビウム属種、サッカロポ 、反応容量が、少なくとも約１５ｍｌ、普通、少なくと リスポラ属種、アグロバクテリウム属種およびパントエ も約５０ｍｌ、より普通には、少なくとも約１００ｍｌ ア属種などの細菌細胞である。 であり、５００ｍｌ、１０００ｍｌまたはそれ以上、最 細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのグラム 大何千リットルの容量であり得る）のいずれかの任意の 陰性細胞またはバチルス種の種などのグラム陽性細胞で 容量であり得る。反応は、任意の規模で実施され得る。 あり得る。他の実施形態では、細胞は、酵母細胞、例え 10 【０１３０】 ば、サッカロマイセス属種、シゾサッカロマイセス属種 本明細書において記載される戦略を使用して、本発明者 、ピキア属種、パフィア属種、クリベロマイセス属種、 らは、アスタキサンチンの合成のための最適ＲＢＳ酵素 カンジダ属種、タラロミセス属種、ブレタノマイセス属 組合せを明らかにした。 種、パチソレン属種、デバリオマイセス属種、ヤロウィ 【０１３１】 ア属種および工業的倍数体酵母株などの真菌細胞である したがって、本発明の別の態様によれば、アスタキサン 。真菌の他の限定されない例として、アスペルギルス属 チン経路の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現さ 種、ペニシリウム属種、フザリウム属種、リゾプス属種 せることを含む、アスタキサンチンを作製する方法であ 、アクレモニウム属種、ニューロスポラ属種、ソルダリ って、ポリヌクレオチドは、 ア属種、マグナポルテ属種、アロマイセス属種、ウスチ （ｉ）フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）および第１の ラゴ属種、ボトリチス属種およびトリコデルマ属種が挙 20 転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 げられる。他の実施形態では、細胞は、藻類細胞、植物 （ｉｉ）β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）および 細胞または哺乳類細胞である。当然のことではあるが、 第２の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 本明細書において記載される実施形態と適合する一部の （ｉｉｉ）β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）および 細胞は、本明細書において記載される１種または複数の 第３の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと 遺伝子の内因性コピーならびに組換えコピーを発現し得 を含み、 る。対象の種として、制限するものではないが、Ｓ．セ 第１、第２および第３の調節配列は、ｌｃｙ−Ｂおよび レビシエ、大腸菌、シュードモナス属種、クレブシエラ ｃｒｔＷの発現が、ｃｒｔＩの発現のレベルよりも大き 属種およびシネコシスティス属種が挙げられる。 いよう選択される、方法が提供される。 【０１２７】 【０１３２】 特定の経路における適当なＲＢＳ酵素組合せの選択後、 30 本発明の方法は、アスタキサンチン経路の酵素をコード その生成物の商業的量を調製するために、ポリヌクレオ する少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種 チドは、別個の発現ベクターとして細胞系中に、または 、少なくとも４種のさらなるポリヌクレオチドの発現を 単一発現ベクターで導入され得る。次いで、最終生成物 考慮する。 は単離され得る。本明細書において記載された実施形態 【０１３３】 と関連する単離ポリペプチドを得るために、当業者に周 さらなるポリヌクレオチドは、 知の種々の方法が利用され得る。ポリペプチドは、イム （ｉｖ）イソペンテニルピロリン酸（ｉｄｉ）および第 ノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマト ４の転写調節配列をコードするポリヌクレオチドと、 グラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫 （ｖ）ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔ アフィニティークロマトグラフィーによって細胞から精 製され得る。 Ｅ）および第５の転写調節配列をコードするポリヌクレ 40 オチドと、 【０１２８】 （ｖｉ）プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔ 反応は、大規模リアクターを利用する場合もあり、また Ｂ）および第６の転写調節配列をコードするポリヌクレ は複数の同時合成を実施するために小規模が多重化され オチドと、 る場合もある。連続反応は、供給機構を使用して試薬の （ｖｉｉ）β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ） 流れを導入し、最終生成物をプロセスの一部として単離 および第７の転写調節配列をコードするポリヌクレオチ できる。活発な合成の期間を延長するためにさらなる試 ドと 薬が経時的に導入され得るバッチ系も対象である。リア を含む。 クターは、バッチ、拡張バッチ(extended batch)、セミ 【０１３４】 バッチ、セミ連続、フェッドバッチおよび連続などの任 本明細書において、用語「アスタキサンチン」とは、分 意の様式で実施されてもよく、これらは、適用目的に従 50 子式Ｃ４ ０ Ｈ５ ２ Ｏ４ を有する、３，３’−ジヒドロキ ( 23 ) JP 43 2015-530870 A 2015.10.29 44 シ−β−カロテン−４，４’−ジオン、としても知られ ロスポラ・クラッサ）、（ＮＣＵ２０９４０；ニューロ る、その３種の立体異性体（３Ｒ，３’Ｒ）、（３Ｒ， スポラ・クラッサ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００ ３’Ｓ）（メソ）および（３Ｓ，３’Ｓ）のいずれか１ ８、遺伝子座ＺＰ＿００９４３５６６；ラルストニア・ 種を指す。 ソラナケアルムＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；ラ 【０１３５】 ット）、（ＳＣＵ３１６３２；サッカロミセス・セレビ 生体細胞においてアスタキサンチンを作製するために、 シエ）、（ＡＢ０１６０９５；シネココッカス・エロン 細胞は、アスタキサンチン経路の酵素を発現することが ガタス）、（ＳＡＧＧＰＳ；シナピス・アルバ）、（Ｓ 好ましい。 ＳＯＧＤＳ；スルホロブス・アシドカルダリウス）、（ 【０１３６】 ＮＣ＿００７７５９、遺伝子座ＹＰ＿４６１８３２；シ 例示的酵素は、以下に本明細書において列挙される。 10 ントロファス・アシディトロフィカスＳＢ）および（Ｎ 【０１３７】 Ｃ＿００６８４０、遺伝子座ＹＰ＿２０４０９５；ビブ ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥまた リオ−フィッシェリＥＳ１１４）が挙げられる。特定の はＧＧＰＰシンターゼ）：用語「ｃｒｔＥ」とは、ファ 実施形態によれば、ＧＧＰＰシンターゼは、パントエア ルネシル二リン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニル二リン ・アグロメランに由来する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡ 酸ＧＧＰＰ（ＥＣ２．５．１．２９）に変換できる酵素 Ａ２１２６０．１（配列番号６２）を含む。 を指す。ｃｒｔＥの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受 【０１３９】 託番号は、以下および参照により本明細書に組み込まれ プレフィトエンピロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）：本 る特許文献２の表１５に列挙されている。本発明のｃｒ 明細書において、用語「ｃｒｔＢ」とは、フィトエンシ ｔＥはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを ンターゼとしても知られるＧＧＰＰをフィトエンに変換 使用するＮａｔｉｏｎａｌ する酵素（ＥＣ＝２．５．１．３２）を指す。ｃｒｔＢ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉ 20 Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ の限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照に ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定 より本明細書に組み込まれる特許文献２の表１８に列挙 されるような、以下に本明細書において列挙されるｃｒ されている。本発明のｃｒｔＢはまた、相同体（例えば ｔＥ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５ 、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌＣ ％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも ｅｎｔｅｒ ７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なく ｆｏｒｍａｔｉｏｎ とも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少 トウェアを使用して決定されるような、特許文献２の表 なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％ １８に列挙されるｃｒｔＥ配列に対して少なくとも５０ またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチ ％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも ド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミ 30 ６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なく ノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性 とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少 なポリペプチド断片を指す場合もある。 なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％ 【０１３８】 、少なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相 ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼのヌクレオチド 同であるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠 配列の例示的例として、それだけには限らないが：（Ａ 失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体および ＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；シロイヌナズナ）、（ＢＴ００５ その生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もあ ３２８；シロイヌナズナ）、（ＮＭ＿１１９８４５；シ る。 ロイヌナズナ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、 【０１４０】 遺伝子座ＺＰ＿００７４３０５２；バチルス・チューリ 特定の実施形態によれば、ｃｒｔＢは、パントエア・ア ンゲンシス血清型イスラエレンシス、ＡＴＣＣ グロメラン由来の配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２ ３５６ 40 ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎ （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフ ４６ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；ニチニチソウ ６４．１（配列番号６３）を含む。 ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、遺伝子座ＺＰ 【０１４１】 ＿００１４４５０９；フソバクテリウム・ヌクレアタム フィトエン脱水素酵素（ｃｒｔＩ）：本明細書において 亜種ビンセンティー、ＡＴＣＣ ４９２５６）、（ＧＦ 、用語「ｃｒｔＩ」は、フィトエンをリコピンに変換す ＧＧＰＰＳＧＮ；ジベレラ・フジクロイ）、（ＡＹ３７ る酵素（ＥＣ＝１．１４．９９）を指す。ｃｒｔＩの限 １３２１；イチョウ）、（ＡＢ０５５４９６；パラゴム 定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により ノキ）、（ＡＢ０１７９７１；ヒト）、（ＭＣＩ２７６ 本明細書に組み込まれる特許文献２の表１７Ａおよび１ １２９；ムーコル・シルシネロイデスｆ．ルシタニクス ７Ｂに列挙されている。本発明のｃｒｔＥはまた、相同 ）、（ＡＢ０１６０４４；ハツカネズミ）、（ＡＡＢＸ 体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉ ０１０００２９８、遺伝子座ＮＣＵ０１４２７；ニュー 50 ｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ( 24 ) JP 45 ｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ 2015-530870 A 2015.10.29 46 （ＮＣＢＩ）のＢｌ 本発明のｌｃｙ−Ｂはまた、相同体（例えば、デフォル ａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特 トパラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ 許文献２の表１７Ａおよび１７Ｂに列挙されるｃｒｔＩ ｒ ｏｆ 配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、 ａｔｉｏｎ 少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０ を使用して決定されるような、特許文献２の表２３に列 ％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも 挙されるｌｃｙ−Ｂ配列に対して、少なくとも５０％、 ８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なく 少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５ とも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％また ％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも はそれ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド） ８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なく を指す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸 10 とも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少 置換を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポ なくとも９５％またはそれ以上、およそ１００％相同で リペプチド断片を指す場合もある。 あるポリペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、 【０１４２】 挿入またはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその 特定の実施形態によれば、ｃｒｔＩは、パントエア・ア 生物学的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。 グロメランに由来する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２ 【０１４６】 １２６３．１（配列番号６４）を含む。 特定の実施形態によれば、ｌｃｙ−Ｂは、トマトに由来 【０１４３】 する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＲ５７２３２．１（配 イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）：本 列番号６６）を含む。 明細書において、用語「ｉｄｉ」とは、相対的に非反応 【０１４７】 性のイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の、より反応 20 β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）：本明細書 性の求電子物質ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ において、用語「ｃｒｔＺ」とは、カロテンのゼアキサ ）への変換を触媒するイソメラーゼ酵素（ＥＣ＝５．３ ンチンへの変換を触媒する酵素および／またはカンタキ ．３．２）を指す。イソペンテニル二リン酸δイソメラ サンチンのアスタキサンチンへの変換を触媒する酵素（ ーゼとしてもまた知られている。ｉｄｉの限定されない ＥＣ１．１４．１３）を指す。ｃｒｔＺの限定されない 例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書に 例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書に 組み込まれる特許文献２の表１３に列挙されている。本 組み込まれる特許文献２の表２０に列挙されている。本 発明のｉｄｉはまた、相同体（例えば、デフォルトパラ 発明のｃｒｔＺはまた、相同体（例えば、デフォルトパ メータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ ラメータを使用するＮａｔｉｏｎａｌ ｆ ｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉ ｏｆ （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用 30 ｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅ Ｉｎｆｏｒｍ （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェア Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔ （ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使 して決定されるような、特許文献２の表１３に列挙され 用して決定されるような、特許文献２の表２０に列挙さ るｉｄｉ配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも れるｃｒｔＺ配列に対して、少なくとも５０％、少なく ５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なく とも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少 とも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少 なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％ なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％ 、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８ 、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９ ９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくと ５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポリペ も９５％またはそれ以上、およそ１００％相同であるポ プチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入または リペプチド）を指す。相同体はまた、その欠失、挿入ま アミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学的に 活性なポリペプチド断片を指す場合もある。 たはアミノ酸置換を含めた置換変異体およびその生物学 40 的に活性なポリペプチド断片を指す場合もある。 【０１４４】 【０１４８】 特定の実施形態によれば、ｉｄｉは、ヘマトコッカス藻 特定の実施形態によれば、ｃｒｔＺは、パントエア・ア に由来する配列−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ３２２０８． ナナティスに由来する配列−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ １（配列番号６５）を含む。 ２１６８８．１（配列番号６７）を含む。 【０１４５】 【０１４９】 β−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ）：本明細書にお β−カロテンケトラーゼ（ｃｒｔＷ）：本明細書におい いて、用語「ｌｃｙ−Ｂ」とは、リコピンのカロテンへ て、用語「ｃｒｔＷ」とは、カロテンのカンタキサンチ の変換を触媒する酵素を指す。ｌｃｙ−Ｂの限定されな ンへの変換を触媒する酵素および／またはゼアキサンチ い例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、参照により本明細書 ンのアスタキサンチンへの変換を触媒する酵素を指す。 に組み込まれる特許文献２の表２３に列挙されている。 50 ｃｒｔＷの限定されない例のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は ( 25 ) JP 47 2015-530870 A 2015.10.29 48 、参照照により本明細書に組み込まれる特許文献２の表 【０１５３】 １９に列挙されている。本発明のｃｒｔＷはまた、相同 種々の原核細胞または真核細胞または真核細胞は、本発 体（例えば、デフォルトパラメータを使用するＮａｔｉ 明のポリペプチドを発現するための宿主発現系として使 ｏｎａｌ 用され得る。これらとして、それだけには限らないが、 ｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）のＢｌ ポリペプチドコード配列を含有する、組換えバクテリオ ａｓｔＰソフトウェアを使用して決定されるような、特 ファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮ 許文献２の表１９に列挙されるｃｒｔＷ配列に対して、 Ａ発現ベクターを用いて形質転換された細菌などの微生 少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０ 物；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現 ％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも ベクターを用いて形質転換された酵母などのＣＨＯ細胞 ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なく 10 、真菌などの哺乳類発現系；組換えウイルス発現ベクタ とも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少 ー（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、お ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、また よそ１００％相同であるポリペプチド）を指す。相同体 はポリペプチドコード配列を含有するＴｉプラスミドな はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換を含めた置 どの組換えプラスミド発現ベクターを用いて形質転換さ 換変異体およびその生物学的に活性なポリペプチド断片 れた、藻類および植物細胞系が挙げられる。さらなる宿 を指す場合もある。特定の実施形態によれば、ｃｒｔＷ 主発現系は、本明細書において上記でさらに記載されて は、ノストック・スフェロイデス由来の配列−ＧｅｎＢ いる。 ａｎｋ：ＢＡＢ７４８８８．１（配列番号６８）を含む 【０１５４】 。 好ましい実施形態によれば、アスタキサンチン経路の酵 【０１５０】 20 素は、細菌細胞において発現される。 好ましくは、細胞はまた、１−デオキシキシルロース− 【０１５５】 ５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）を発現する。 一実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性菌などの細菌 【０１５１】 細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰 本明細書において、用語「１−デオキシキシルロース− 性菌である。いくつかの好ましい実施形態では、この用 ５−リン酸シンターゼ（ｄｘｓ）」とは、ピルビン酸お 語は、パントエア属、バチルス属の細胞および大腸菌細 よびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸のＤ−１−デオ 胞を指す。 キシキシルロース５−リン酸（ＤＯＸＰ）への縮合を触 【０１５６】 媒する酵素を指す（ＥＣ２．２．１．７）。例示的受託 本明細書において、「バチルス属」は、それだけには限 番号として、参照により本明細書に組み込まれる特許文 らないが、Ｂ．スブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ 献３の表３に提供されるものが挙げられる。本発明のｄ 30 ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィラ ｘｓはまた、相同体（例えば、デフォルトパラメータを ス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエン 使用するＮａｔｉｏｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ス、Ｂ．クラウジィ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｎ リウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ． ＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して決定さ ロータスおよびＢ．チューリンゲンシスを含めた当業者 れるような、特許文献３の表３に列挙されるｄｘｓ配列 に公知のすべてのメンバーを含む。バチルス属が、分類 に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少な 学的再編成を受け続けていることは認識されている。し くとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、 たがって、属は、それだけには限らないが、現在「ゲオ 少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５ バチルス・ステアロサーモフィラス」と名づけられてい ％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも るＢ．ステアロサーモフィラスのような生物を含めた再 ９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそ 40 分類された種を含むと意図される。酸素の存在下での耐 れ以上、およそ１００％相同であるポリペプチド）も指 性内生胞子の製造が、バチルス属の決定的な特徴と見な す。相同体はまた、その欠失、挿入またはアミノ酸置換 されるが、この特徴はまた、最近名づけられたアリシク を含めた置換変異体およびその生物学的に活性なポリペ ロバチルス、アンフィバチルス、アネウリニバチルス、 プチド断片を指す場合もある。特定の実施形態によれば アノキシバチルス、ブレビバチルス、フィロバチルス、 、ｄｘｓは、大腸菌に由来する配列−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒ グラシリバチルス、ハロバチルス、ペニバチルス、サリ ｏｔ：Ａ７ＺＸ７２．１（配列番号６９）を含む。 バチルス、サーモバチルス、ウレイバチルスおよびビル 【０１５２】 ジバチルスにも当てはまる。 宿主系においても発現され得るアスタキサンチン経路の 【０１５７】 さらなる酵素は、参照によって本明細書に組み込まれる 本明細書において、「パントエア属」は、それだけには 特許文献２に記載されている。 50 限らないが、Ｐ．アグロメランス、Ｐ．ディスペルサ、 ( 26 ) JP 49 2015-530870 A 2015.10.29 50 Ｐ．パンクタータ、Ｐ．シトレア、Ｐ．テレア、Ｐ．ア ｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの ナナスおよびＰ．ステラルティを含めた当業者に公知の 少なくとも１００倍である。 すべてのメンバーを含む。パントエア属が分類学的再編 【０１６３】 成を受け続けていることは認識されている。したがって 本明細書において、語句「転写調節エレメント」とは、 、属は、それだけには限らないが、エルウイニア・ヘル その転写を制御するポリヌクレオチドのタンパク質コー ビコラのような生物を含めた再分類された種を含むと意 ディング領域と作動可能に連結している塩基の配列を指 図される。 す。 【０１５８】 【０１６４】 本発明のポリヌクレオチド配列は、細胞におけるアスタ 転写調節エレメントの例として、それだけには限らない キサンチン経路のポリペプチドの発現を可能にするよう 10 が、プロモーター、エンハンサー、ｍＲＮＡ安定性達成 、発現ベクター（すなわち、核酸構築物）中に挿入され 配列およびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が挙げられる る。 。 【０１５９】 【０１６５】 特定の細胞系において発現ベクターを使用して発現され 本出願の目的上、「プロモーター」または「プロモータ るのに必要とされる酵素の数は、その特定の細胞系にお ー領域」は、転写の開始の際にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリ いて内因性に発現されるそれらの酵素の数による。した メラーゼによって認識および結合される核酸配列である がって、例えば、特定の細胞系が、ｃｒｔＷを十分な程 。プロモーターは、他の転写および翻訳調節エレメント 度に内因性に発現する場合には、その酵素は、組換え法 と一緒に、所与の遺伝子または遺伝子の群（オペロン） を使用して外因性発現される必要がない場合がある。 を発現するのに必要である。プロモーターは、ＩＰＴＧ 【０１６０】 20 または構成プロモーターによって誘導される、Ｐｔｒｃ 本発明は、単一発現ベクター上のアスタキサンチン経路 などの調節プロモーターであり得る。 のポリペプチドのうち１、２、３、４、５、６、７また 【０１６６】 は８種をコードするポリヌクレオチド配列を挿入するこ 本発明による人工プロモーターを作製するのに有用なプ とを考慮する。したがって、ポリペプチドの発現は、必 ロモーター配列として、以下の表１に列挙される前駆体 要な酵素をすべてコードする単一発現ベクターまたはア プロモーターが挙げられる。表中のすべてのプロモータ スタキサンチン経路のポリペプチドの種々の組合せをコ ーは、β−ラクタマーゼプロモーターＰｂｌａに対して ードする複数のベクターを導入するによって達成され得 キャラクタライズされており、プロモーター強度は、「 る。 Ｐｂｌａ単位」で示されている。（非特許文献２０）。 【０１６１】 プロモーターおよびその核酸配列のさらなる例は、参照 本発明者らは、アスタキサンチンの最適発現のためには 30 により本明細書において組み込まれる特許文献１に提供 、アスタキサンチン経路の成分をコードするポリヌクレ されている。一般に、本発明において有用なプロモータ オチドと作動可能に連結している転写調節エレメントが ーは、転写開始部位（＋１）から上流に２００∼２０塩 、特定の割合の発現を確実にするよう選択されなければ 基対（ｂｐ）の間、好ましくは、１５０∼２５ｂｐ、よ ならないということを見出した。 り好ましくは、１００∼３０ｂｐの間、最も好ましくは 【０１６２】 、５０∼３０ｂｐの間のプロモーター配列を含む。 特定の実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両 【０１６７】 方の発現が、その発現レベルが、ｃｒｔＩの発現のレベ 本発明において有用なさらなるプロモーターは、Ｐｔａ ルよりも高いよう操作されなければならない。好ましく ｃおよび１個または２個の塩基対の変更を含有する変異 は、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、 体の配列が教示される非特許文献２１に開示されている ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも２倍である。別の 40 。 実施形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発 【０１６８】 現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも５ 表１ 倍である。別の実施形態によれば、Ｉｃｙ−Ｂおよびｃ 【表１】 ｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔＩの発現のレベル の少なくとも１０倍である。別の実施形態によれば、Ｉ ｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現のレベルは、ｃｒｔ Ｉの発現のレベルの少なくとも２０倍である。別の実施 形態によれば、Ｉｃｙ−ＢおよびｃｒｔＷ両方の発現の レベルは、ｃｒｔＩの発現のレベルの少なくとも５０倍 である。別の実施形態によれば、Ｉｃｙ−Ｂおよびｃｒ 50 ( 27 ) JP 51 2015-530870 A 2015.10.29 52 とは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞 において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核 酸配列について配列番号２または３に示される配列を有 するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０ ％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列 の発現を引き起こすものである。 【０１７４】 本発明者によって考慮される配列の１つの特定の組合せ は、以下の通りである： 10 ｉｄｉをコードするポリヌクレオチド配列に連結された ＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一 細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、同 一核酸配列について配列番号５に示される配列を有する ＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、 【０１６９】 少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発 プロモーター強度は、ＤＮＡの特定の一部とのＲＮＡポ 現を引き起こすものである。 リメラーゼの結合の速度論を測定し、また、転写開始の 【０１７５】 測定を可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用して定量化 ｃｒｔＥをコードするポリヌクレオチド配列に連結され され得る（非特許文献２２）。さらに、プロモーター強 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 度は、本明細書において以下にさらに記載されるような 20 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 、プロモーターを、検出可能なタンパク質（例えば、蛍 同一核酸配列について配列番号５に示される配列を有す 光マーカー）をコードするポリヌクレオチド配列と連結 るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ することによって定量化され得る。ｉｎ 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の ｖｉｖｏ法も 、プロモーター強度を定量化するために使用されてきた 発現を引き起こすものである。 。この場合には、アプローチは、プロモーターを、リポ 【０１７６】 ーター遺伝子と融合し、ＲＮＡ合成の効率を測定してき ｃｒｔＢをコードするポリヌクレオチド配列に連結され た。 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 【０１７０】 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 記載されるように、転写調節エレメントは、上記で本明 同一核酸配列について配列番号３に示される配列を有す 細書においてさらに記載される、リボソーム結合部位（ 30 るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ ＲＢＳ）を含み得る。 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の 【０１７１】 発現を引き起こすものである。 特定の実施形態によれば、ｃｒｔＩに連結されたＲＢＳ 【０１７７】 とは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞 ｃｒｔＩをコードするポリヌクレオチド配列に連結され において、同時に、同一温度で、同一プロモーターを用 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 いてなど）で、同一核酸配列について配列番号４、５、 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 ６または７に示される配列を有するＲＢＳの程度の少な 同一核酸配列について配列番号７に示される配列を有す くとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、 るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ 少なくとも９０％に、核酸配列の発現を起こすものであ る。 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の 40 発現を引き起こすものである。 【０１７２】 【０１７８】 特定の実施形態によれば、ｌｃｙＢと連結されたＲＢＳ ｌｃｙ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列に連結さ とは、同一実験および転写条件下（すなわち、同一細胞 れたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、 において、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核 同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で 酸配列について配列番号２または３に示される配列を有 、同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有 するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０ するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０ ％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列 ％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列 の発現を引き起こすものである。 の発現を引き起こすものである。 【０１７３】 【０１７９】 特定の実施形態によれば、ｃｒｔＷと連結されたＲＢＳ 50 ｃｒｔＷをコードするポリヌクレオチド配列に連結され ( 28 ) JP 53 2015-530870 A 2015.10.29 54 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 、同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有 同一核酸配列について配列番号３に示される配列を有す するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０ るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ ％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の の発現を引き起こすものである。 発現を引き起こすものである。 【０１８６】 【０１８０】 ｃｒｔＷをコードするポリヌクレオチド配列に連結され ｃｒｔＺをコードするポリヌクレオチド配列に連結され たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 10 同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有す 同一核酸配列について配列番号６に示される配列を有す るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の 発現を引き起こすものである。 発現を引き起こすものである。 【０１８７】 【０１８１】 ｃｒｔＺをコードするポリヌクレオチド配列に連結され 配列の別の例示的組合せは、以下の通りである： たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 ｉｄｉをコードするポリヌクレオチド配列に連結された 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 ＲＢＳは、同一転写条件下（すなわち、同一細胞におい 同一核酸配列について配列番号２に示される配列を有す て、同一プロモーターを用いてなど）で、同一核酸配列 るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ について配列番号６に示される配列を有するＲＢＳの程 20 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の 度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも 発現を引き起こすものである。 ８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の発現を引き起 【０１８８】 こすものである。 上記で本明細書において記載されたように、本発明者ら 【０１８２】 は、ＤＸＳを発現させることをさらに考慮する。好まし ｃｒｔＥをコードするポリヌクレオチド配列に連結され くは、ＤＸＳをコードするポリヌクレオチド配列に連結 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 されたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 、同一細胞において、同一プロモーターを用いてなど） 同一核酸配列について配列番号３に示される配列を有す で、同一核酸配列について配列番号６に示される配列を るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ 有するＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７ 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の 30 ０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配 発現を引き起こすものである。 列の発現を引き起こすものである。 【０１８３】 【０１８９】 ｃｒｔＢをコードするポリヌクレオチド配列に連結され アスタキサンチンを発現するために本明細書において記 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 載される方法を使用して、本発明者は、２ｍｇ／ｇ細胞 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 乾重を超えるアスタキサンチンを含む、３ｍｇ／ｇ細胞 同一核酸配列について配列番号７に示される配列を有す 乾重を超えるアスタキサンチンを含む、４ｍｇ／ｇ細胞 るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ 乾重を超えるアスタキサンチンを含む、５ｍｇ／ｇ細胞 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の 乾重を超えるアスタキサンチンを含む、１０ｍｇ／ｇ細 発現を引き起こすものである。 【０１８４】 胞乾重を超えるアスタキサンチンを含む細菌細胞（大腸 40 菌細胞）を得た。 ｃｒｔＩをコードするポリヌクレオチド配列に連結され 【０１９０】 たＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、同 形質転換された細胞を、多量の組換えポリペプチドの発 一細胞において、同一プロモーターを用いてなど）で、 現を可能にする有効な条件下で培養する。有効な培養条 同一核酸配列について配列番号５に示される配列を有す 件は、それだけには限らないが、タンパク質製造を可能 るＲＢＳの程度の少なくとも６０％、少なくとも７０％ にする有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよ 、少なくとも８０％、少なくとも９０％に、核酸配列の び酸素条件を含む。有効な培地とは、細胞が、本発明の 発現を引き起こすものである。 組換えポリペプチドを製造するよう培養される任意の培 【０１８５】 地を指す。このような培地は、通常、同化可能な炭素、 ｌｃｙ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列に連結さ 窒素およびリン酸供給源ならびに適当な塩、ミネラル、 れたＲＢＳは、同一実験および転写条件下（すなわち、 50 金属およびビタミンなどの他の栄養素を有する水溶液を ( 29 ) JP 55 2015-530870 A 2015.10.29 56 含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、 い細胞体は、養鶏におけるタンパク質およびビタミンの 振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュお 理想的供給源としてとして使用され得る。 よびペトリプレートにおいて培養され得る。培養は、組 【０１９６】 換え細胞にとって適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で実 明確にするために、別個の実施形態との関連で記載され 施され得る。このような培養条件は、当業者の専門知識 る本発明の特定の特徴はまた、単一実施形態において組 の範囲内にある。 み合わせて提供され得るということは理解される。逆に 【０１９１】 、明確にするために、単一の実施形態との関連で簡潔に 所定の時間の培養後、アスタキサンチンの回収が達成さ 記載される本発明の種々の特徴はまた、別個に、または れ、分光光度分析またはＨＰＬＣによる分析が実施され 得る。 任意の適した部分的組合せで、または本発明の任意の他 10 の記載された実施形態において適したように提供され得 【０１９２】 る。種々の実施形態に関連して記載される特定の特徴は 本明細書において使用される、語句「アスタキサンチン 、実施形態がそれらの要素を伴わない場合に動作不能で を回収すること」は、アスタキサンチンを含有する全発 ない限り、それらの実施形態の必須の特徴と考えられて 酵培地を収集することを指し、分離または精製のさらな はならない。 るステップを暗示する必要はない。 【０１９７】 【０１９３】 本明細書において上記に描写され、以下の特許請求の範 細菌細胞または培養後の培養溶液からカロテノイドおよ 囲の節において特許請求されるような、本発明の種々の び／またはアスタキサンチンを収集するために、例えば 実施形態および態様は、以下の実施例において実験的確 、細菌細胞は、遠心分離などによって培養溶液から分離 証を見出す。 され、適当な有機溶媒によってそれから抽出され得る。 20 【実施例】 このような有機溶媒の例として、メタノール、エタノー 【０１９８】 ル、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチル ここで、上記の説明と一緒に、本発明のいくつかの実施 ケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、ク 形態を限定されない様式で例示する以下の実施例が参照 ロロホルム、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスル される。 ホキシドが挙げられる。それらの中でも、アセトンが好 【０１９９】 ましい。さらに、分離および高純度への精製は、液体ク 概ね、本明細書において使用される命名法および本発明 ロマトグラフィーなどを利用することによって達成され において利用される実験室手順は、分子的、生化学的、 得る。液体クロマトグラフィーは、例えば、イオン交換 微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。このような の分離原理、疎水性相互作用および分子篩に基づくもの 技術は、文献において十分に説明されている。例えば、 であり得る。逆相クロマトグラフィーおよび順相クロマ 30 非特許文献１２、非特許文献２３、非特許文献２４、非 トグラフィーが好ましい。あるいは、細胞からの抽出は 特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、特許 、超臨界流体抽出によって実施され得る。 文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７および特 【０１９４】 許文献８に示される方法論、非特許文献２８、非特許文 あるいは、培養を完了した後、細菌細胞は、例えば、遠 献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献 心分離、デカンテーションまたは濾過によって培養溶液 ３２を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは、特許 から分離され得る。得られた細菌細胞に水が添加されて および科学文献に広く記載されている、例えば、特許文 、好都合な粘度を有するスラリーにされる。アスタキサ 献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特 ンチンなどのカロテノイドの分解を防ぐために、スラリ 許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１ ーに適当な添加物が加えられてもよい。このような添加 ６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許 物の例として、それだけには限らないが、アスコルビン 40 文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３ 酸などの抗酸化剤が挙げられる。その後、調製されたス および特許文献２４、非特許文献３３、非特許文献３４ ラリーは、ガラスビーズもしくはジルコニアビーズを使 、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７、 用するグラインダーまたは高圧ホモジナイザーを使用し 非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０を参 てホモジナイズされ、その後の使用のために乾燥される 照のこと；それらのすべては、本明細書において十分に 。好ましい乾燥法は、噴霧乾燥である。 示されるかのように参照により組み込まれる。その他の 【０１９５】 一般的な参考文献は、この文書を通じて提供される。そ 細菌細胞は、養殖された魚などのための餌に直接添加さ れにおける手順は、当技術分野で周知であると考えられ れ得る。あるいは、それらは、使用前に上記のような極 、読者の便宜のために提供される。それに含有されるす 性溶媒などから抽出され得る。アスタキサンチンなどの べての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。 カロテノイドの抽出後に残り、ほとんど色素を含有しな 50 【０２００】 ( 30 ) JP 57 58 一般的な材料および方法 株、培地および試薬：クローニングおよび構築物アセン ブリーに使用した細菌株は、別に明記しない限り、大腸 菌ＤＨ５αであった。プラスミドＤＮＡの精製のために 、細胞を、３７℃で適した抗生物質を含むＬＢ培地で培 養し、ＤＮＡを標準キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａ ｎｙ）を使用して培養物から精製した。すべてのプライ マーをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｓｒａｅｌによ って合成した。プライマーの詳細な説明は、本明細書に おいて以下の表２に見出され得る。 10 【０２０１】 表２ 【表２−１】 【表２−３】 【表２−２】 2015-530870 A 2015.10.29 ( 31 ) JP 59 2015-530870 A 2015.10.29 60 【０２０２】 本方法の重要な特徴は、アセンブリーのために指定され ＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｎｎ るＤＮＡ配列の各々への、クロラムフェニコール耐性マ ｚｙｍｅｓ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して実施した。ク ーカー（Ｃｍ ローニング手順は、Ｃｌｏｎｅ ｐｒ ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼコード （Ｓｃｉｅｎｔｉ 配列の連結である。アセンブリープロセスの前にＰＣＲ ｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｆｉｃ ＆ ｍａｎａｇｅｒ ｓｕｉｔｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ ｅ、Ｓｔａｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒ ｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ）：構成プロモーターと、それに続くク オーバーラップ伸長を使用して、Ｃｍ Ｌｉｎｅ、ＵＳ−ＰＡ）を使用して設 計した。制限酵素は、別に明記しない限り、Ｎｅｗ Ｒ Ｒ カセットを、Ｄ ＮＡ配列と対を形成させる。標的ＤＮＡ配列（ここで、 Ｒ Ｅ Ｃｍ （Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｕ と対を形成された）が、標準制限ライゲーション プロセスを使用してベクターにアセンブルされる場合に Ｓ−ＭＡ）から購入した。ライゲーション反応は、Ｔ４ 10 ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｌｉｔｈｕａ は、適切にアセンブルされたクローンのみが、Ｃｍを含 む寒天プレート上にコロニーを形成できる。 ｎｉａ）を使用して実施した。機器、試薬、供給業者お 【０２０６】 よび関連カタログ番号のすべての詳細な説明は、本明細 耐性カセットは、制限部位が隣接するので（図１）、次 書において以下の表３に見出され得る。 のアセンブリーサイクルのためのベクターを調製すると 【０２０３】 きに容易に除去され得る。このように、単一耐性マーカ 表３ ーを使用しながら複数のアセンブリーラウンドを実施す 【表３】 ることが可能である。「バックグラウンドなし」アセン ブリー戦略の全体的なスキームは、図１に記載されてい る。 20 【０２０７】 クロラムフェニコール耐性カセットの構築：耐性カセッ トは、構成プロモーターおよび耐性マーカーとしてクロ ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を 含有する。カセットを、鋳型としてｐＳＢ３Ｃ５プラス ミド（ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｐ１００４）を使用す るＰＣＲによって増幅した。耐性カセットが、５’でＮ ｈｅＩ部位が、ならびにその３’においてＸｈｏＩおよ びＰｃｉＩ部位が隣接するように、制限部位を加えた（ 表１、本明細書において上記で）。 30 【０２０８】 【０２０４】 【０２０９】 「バックグラウンドなし」アセンブリー：全体的なクロ 発現空間に広がるようＲＢＳ配列のコンパクトなセット ーニングスキーム：複数のＤＮＡ配列の単一構築物への を選択すること：発現空間の大きな画分に広がるＲＢＳ 連続アセンブリーを促進する目的で、「バックグラウン 40 配列の小さいセットを見出すために、非特許文献５の研 ドなし」アセンブリー戦略を開発した。すべてのＤＮＡ 究において実験的に分析されたフォワード設計されたＲ 構築物は、以下に記載される方法論に従って作製した。 ＢＳシリーズを使用した。まず、種々の遺伝子につなが 「バックグラウンドなし」アセンブリーは、ＢｉｏＢｒ れたＲＢＳ配列の各々の予測される翻訳速度を、コンピ ｉｃｋ標準としても知られる、非特許文献４１に記載さ ュータによって算出した［Ｓａｌｉｓ れる原理に忠実である。ＢｉｏＢｒｉｃｋ系に記載され ｅ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ る主な特徴を保つことに加えて、中間体構築物が多段階 ａｌｃｕｌａｔｏｒ． ａｔ ｓａｌｉｓｄｏｔｐｓｕ アセンブリープロセスの間を通して正しくアセンブルさ ｄｏｔｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／］。その強度が下流 れたことをスクリーニングし、検証する必要性を排除す 配列によって一番少なく影響を受けるようなＲＢＳ配列 るさらなる特徴を加えた。 を選択した。この制限されたセットから、最大の発現空 【０２０５】 50 Ｌａｂ： Ｔｈ Ｓｉｔｅ Ｃ 間に広がった５種のＲＢＳ配列を実験によって選んだ［ ( 32 ) JP 2015-530870 61 A 2015.10.29 62 非特許文献５］。これらのＲＢＳ配列は以下であった： べてのＤＮＡ配列改変は、ＰＣＲオーバーハング伸長法 ＃８ を使用することによって達成した。 （ＲＢＳ−Ａ）：ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＧＡ（配 列番号２） 【０２１２】 ＃１ ｐＮｉｖ：ＲＢＳ−Ａ−ＹＦＰ∼ｐＮｉｖ：ＲＢＳ−Ｆ （ＲＢＳ−Ｂ）：ＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＧ ＧＴＡＣＴＧＡＧ（配列番号３） −ＹＦＰ−プラスミドセット：６種のコアＲＢＳ配列の ＃１７（ＲＢＳ−Ｃ）：ＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＣＡＡ 各々および隣接するインスレーター配列は、合成オリゴ ＧＡ（配列番号４） デオキシヌクレオチドとして購入した。コアＲＢＳ配列 ＃２７（ＲＢＳ−Ｄ）：ＴＴＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧ の各々は、インスレーション配列が上流および下流で隣 （配列番号５） 接し、アセンブリーＰＣＲ反応においてＹＦＰリポータ ＃２０（ＲＢＳ−Ｅ）：ＴＡＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣ 10 ー遺伝子と融合される（表１を参照のこと）。得られた ＧＧＣＧ（配列番号６） ６種のＲＢＳ−ＹＦＰ反応生成物（すなわち、ＲＢＳ− 「Ｄｅａｄ−ＲＢＳ」（ＲＢＳ−Ｆ）：ＣＡＣＣＡＴＡ Ａ∼ＲＢＳ−Ｆ）を、制限させ、骨格プラスミドｐＮｉ ＣＡＣＴＧ（配列番号７） ｖ中にライゲーションして、６種の指定されたプラスミ 「インスレーター」配列が隣接する：ＲＢＳに隣接する ド−ｐＮｉｖ：［ＲＢＳ−Ａ∼ＲＢＳ−Ｆ］−ＹＦＰを 配列は、発現レベルに影響を及ぼし得るので、インスレ 得た−図４を参照のこと。 ーター配列、すなわち、−ＲＢＳの各々の上流および下 【０２１３】 流に位置する約２０ｂｐの一定の配列を使用した。この 発現プラスミド：ＤＮＡアセンブリープロセスを、指定 ような単離配列は、プロモーターの場合には、隣接する されたプロモーターを含有しないｐＮｉｖ骨格プラスミ 配列の効果の低減において有効であるとこれまでに報告 ドで実施した。ひとたび、アセンブリープロセスが完了 されている。上流インスレーター配列は、大腸菌では天 20 すると、得られた生成物を、発現プラスミド−ｐＳＢ４ 然に見られない、１９塩基対：ＴＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡ Ｋ５：Ｐｔａｃ中にサブクローニングした。このプラス ＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡ（配列番号８）であ ミドは、ｐＳＢ４Ｋ５、ＢｉｏＢｒｉｃｋ標準ベクター るようとり、一方で、下流インスレーター配列をＡＴＧ から低コピーｐＳＣ１０１複製起点（ＢｉｏＰａｒｔ： ＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣ（配列番号９） ＢＢａ＿Ｉ５００４２）およびカナマイシン抗生物質耐 、６Ｈｉｓ−タグをコードする配列であるようとった。 性マーカー（ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｐ１００３）を 【０２１０】 用いて誘導した。ＬａｃＩｑ 標的ＯＲＦのＲＢＳ調節：ＲＢＳ調節のために標的コー ｒｔ：ＢＢａ＿Ｃ００１２）およびＴａｃプロモーター ド配列をクローニングするために、まず、ＰＣＲによっ （ＢｉｏＰａｒｔ：ＢＢａ＿Ｋ３０１０００）を、標準 て増幅し、上記のＣｍ耐性マーカーと対を形成させた。 アセンブリー法を使用してｐＳＢ４Ｋ５上、多重クロー ひとたび、標的遺伝子を耐性カセットと対を形成させる 30 ニング部位の上流にアセンブルして、ｐＳＢ４Ｋ５：Ｐ と、生成物を直線化したＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ｔａｃを得た（図５）。 ＫＳ＋ Ｂｒｉｃｋ（ＢｉｏＰａ プラスミド中にライゲーションした。次いで、標的ＯＲ 【０２１４】 Ｆを、ＮｓｉＩおよびＰｃｉＩのいずれか（非バーコー フローサイトメトリーを使用するＲＢＳ発現調節の実験 ド付加アセンブリー）またはＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを 測定：ｉｎ−ｖｉｖｏで発現レベルに対するＲＢＳ配列 使用してプラスミドから切り出した。次いで、標的配列 の効果を定量するために、ＹＦＰリポーター遺伝子を、 を含有する得られた断片および耐性マーカーを、挿入部 これまでに記載したクローニング戦略を使用してｐＳＢ 位の上流にＲＢＳ配列を含有するＲＢＳ骨格ベクター（ ４Ｋ５：Ｐｔａｃプラスミド上、ＲＢＳ配列の各々の上 ＲＢＳ骨格）上でアセンブルした。得られた構築物は、 流に置いた。大腸菌ＭＧ１６５５細胞を、ｐＳＢ４Ｋ５ 図２に記載されるように、所望のＲＢＳと、それに続く 標的ＯＲＦおよび耐性マーカーを含有する。 ：Ｐｔａｃ−［ＲＢＳ−Ａ∼ＲＢＳ−Ｆ］−ＹＦＰプラ 40 スミドを用いて形質転換し、０．２％グルコースを含む 【０２１１】 最小培地中３７℃で、対数増殖期中期（ＯＤ＝約０．３ ｐＮｉｖ−骨格プラスミド：ベースとしてＢｌｕｅＳｃ ）までインキュベートした。蛍光をＢＤ ｒｉｐｔ Ｋｓ＋を使用して骨格プラスミドを構築した フローサイトメーターを使用して定量した。青色レーザ 。ＬａｃＺ遺伝子を排除し、元の多重クローニング部位 ー（４８８ｎｍ）および５３０±３０ｎｍ発光フィルタ を、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩ制限部位を含 ーを使用してＹＦＰ蛍光を測定し、黄色レーザー（５６ 有する新規部位と交換した（図３）。アセンブリープロ ０ｎｍ）および６１０±２０ｎｍ発光フィルターを使用 セス中を通じて漏出性遺伝子発現を最小にするために、 してｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を測定した。各実験で約１００ 強力なＲＲＮＢターミネーター（鋳型としてｐＥＮＴＥ ，０００個の細胞を記録した（図６Ａ∼Ｄ）。予測され Ｒ１１−Ｇａｔｅｗａｙを使用するＰＣＲによって増幅 たＲＢＳ強度対実験測定値間の相関が、図７に例示され された）を新規クローニング部位の上流に挿入した。す 50 る。 ＬＳＲ ＩＩ ( 33 ) JP 63 2015-530870 A 2015.10.29 64 【０２１５】 混合物を、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを使用して消化し、 ｐＮｉｖ−ＲＢＳ混合物調製：６種のｐＮｉｖ−ＲＢＳ その結果、コード配列の上流にＲＢＳ配列の混合物およ −ＹＦＰプラスミドの各々を、ＮｓｉＩおよびＰｃｉＩ び耐性カセットを含有するＤＮＡ断片を得た。この断片 を用いて別個に消化し、骨格ベクターからＹＦＰを除去 を、オペロンライブラリー（すでに第１のＲＢＳ調節さ した。消化生成物を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ れるコード配列を有する）中にライゲーションした。こ ＣＩＰ）で処理し、ゲル精製した。クローニング部位の のアセンブリープロセスは、各変異体がコード配列の上 上流のＲＢＳ配列においてのみ各々異なる、６種の得ら 流に別個のＲＢＳ組成を有する、コンビナトリアル混合 れた直線化されたベクターの等モル混合物を調製した。 物ＲＢＳ調節されるコード配列をもたらす。ライブラリ このベクター混合物（ｐＲＢＳミックス）を使用して、 ーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、Ｃｍを含むＬＢ寒天 任意の標的を用いる１チューブコンビナトリアルアセン 10 プレート上にプレーティングした。最後に組み込まれた ブリーを実施した（図８）。 遺伝子と対を形成している耐性カセットが、新規に付加 【０２１６】 されたＲＢＳ調節される配列を含有する構築物のみが、 ＲＢＳ混合物のコンビナトリアルアセンブリー：対象の さらなるアセンブリーラウンドのために継続することを 任意のコード配列について、上記のようにコード配列を 保証した。 クローニングした。コード配列を、ＲＢＳセットと組合 【０２２０】 せ的に対を形成させるために、コード配列を、直線化し 新規に構築されたオペロンライブラリーに由来するプラ たｐＲＢＳベクター混合物中にサブクローニングした。 スミドＤＮＡを、コロニーをプレートから直接掻きとる この結果、すべて、同一コード配列を含有するが、上流 ことによってプレートから回収し、オペロンライブラリ に異なるＲＢＳ（ＲＢＳ−Ａ∼ＲＢＳ−Ｆ）配列を有す ーをコードするプラスミドを抽出した。したがって、本 るライゲーション生成物の混合物が得られた（図８）。 20 発明者らは、各ラウンドにおいて、さらなるＲＢＳ調節 【０２１７】 されるコード配列がコンビナトリアルオペロンライブラ ＲＢＳ調節される合成オペロンをアセンブルすること： リーに付加されたこのプロセスを、Ｎラウンド反復する すべて、同一のコード配列を有するが、上流に異なるＲ ことによって、所定の順序で同一のＮ個のコード配列を ＢＳ配列（ＲＢＳ−Ａ∼ＲＢＳ−Ｆ）を有する構築物の 含有し、６種のＲＢＳの変動する組合せによって駆動さ 混合物を含有する得られたライブラリーが、ベクターと れるプラスミドのコンビナトリアル混合物を連続的にア して、または挿入断片としてのいずれかで使用され得る センブルした。 。まず、ＮｈｅＩおよびＰｃｉＩを使用して混合物を制 【０２２１】 限することによって、耐性カセットが除去され、プラス バーコード付加されたＲＢＳ混合物−アプローチ：ＲＢ ミドライブラリーが、より多くのＲＢＳ調節されるコー Ｓ調節されるコード配列のオペロンライブラリーは、コ ド配列がアセンブルされるベクターとして使用され得る 30 ンビナトリアル法で構築されるので、特定のクローンの 。あるいは、ＳｐｅＩおよびＰｃｉＩを用いて混合物を ＲＢＳ組成を決定する順に、全オペロンにわたってＲＢ 消化することによって、コード配列（上流ＲＢＳととも Ｓ配列のすべてを並べることが必要である。このプロセ に）を切り出し、それをさらなるアセンブリーラウンド スを促進し、オペロン中に広がるＲＢＳのすべてを並べ のための挿入断片として使用することが可能である。 る必要性を排除するために、本発明者らは、各ＲＢＳに 【０２１８】 ３塩基対バーコード配列を割り当てた。これらのバーコ 各変異体が遺伝子の同一組合せを含有するが、ＲＢＳの ードによって、図１０に記載されるように積み重ねられ 異なる組合せを有するオペロンのライブラリーをアセン たバーコードの３’末端で単一配列決定反応を使用して ブルするために、所望の遺伝子の各々についてＲＢＳ調 各クローンの完全なＲＢＳ組成を容易に決定することが 節される混合物を上記のように構築した。次いで、各ス 可能となる。 テップで、さらなるＲＢＳ調節されるコード配列がオペ 40 【０２２２】 ロンの前に加えられる反復性アセンブリーステップを実 バーコードは以下の通りにコンピュータによって計算さ 施した。図９に示されるように、ステップごとに、先の れる：各ＲＢＳ（Ａ∼Ｆ）に数字（１∼６）が割り当て ラウンドの生成物をＮｈｅＩおよびＰｃｉＩを用いて消 られ、次いで、これが、２文字ＤＮＡコードでコードさ 化し、Ｃｍ耐性カセットを除去した。反応生成物をＣＩ れた。所与の２文字コードワード（ｂ１ ｂ２ ＝ＡＴ、例 Ｐを用いて処理し、ゲル精製した。精製された生成物、 えば）は、式ｂ１ ＋４ Ｃｍ耐性を有さない直線化されたベクターは、次のアセ 、コードワードの塩基に割り当てられた数値である（以 ンブリーステップにおいてベクターとして働く。 下の表を参照のこと））によって特定の数字に割り出さ 【０２１９】 れる。本例については、ＡＴは、０＋４＊２＝８となる さらなるＲＢＳ調節されるコード配列をオペロンにアセ 。 ンブルするために、指定の挿入断片のＲＢＳ調節される 50 【０２２３】 ＊ ｂ２ （式中、ｂ１ およびｂ２ は ( 34 ) JP 2015-530870 65 A 2015.10.29 66 表４ するいくつかの技術的変化を除いて上記に記載されたも 【表４】 のと同一の論理に頼る。標的コード配列が、上記のよう にまずクローニングされ、ＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを使 用して消化される。 挿入断片はｐＲＢＳ−バーコード混合物とライゲーショ ンされ、ＤＨ５α細胞に形質転換される。このプロセス の図式的説明が、図１１において以下に説明されている 。 【０２２４】 【０２２８】 第３の塩基をチェック塩基として付加した。この塩基は 10 単純性のために、図１１に示されるアセンブリープロセ 、以下の通りに、先の２個の塩基からコンピュータによ スは、各々、特異的ＲＢＳを有する、オペロン中にアセ って計算された：ｂ３＝（ｂ１＋５ ＊ ｂ２）％４（式中 ンブルされた２つのコード配列のみを含有する。プロセ 、「％」は、モジュロ演算子を表す）。このチェック塩 スは、さらなるアセンブリーサイクルによって反復して 基によって、任意の単一塩基突然変異または配列決定エ 拡張され得る。さらに、特定の１種に代わりに、コンビ ラーの検出が可能となる。以下の表５は、各ＲＢＳのバ ナトリアルＲＢＳ混合物が使用されてもよい。 ーコード値を提供する。ここでは６種のＲＢＳのみが使 【０２２９】 用されるが、３ｂｐスキームを使用して合計最大１６種 発現プラスミドへのサブクローニング：アセンブリープ のＲＢＳを潜在的にコードできるということは留意され ロセスが完了した後、得られたオペロンを、指定された たい。アプローチはまた、コード長が対数的に拡張し増 プロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニン 大したかなり大きなライブラリーサイズに拡張可能であ 20 グした。 る。 これは、最終オペロンに隣接する指定された制限部位を 【０２２５】 使用することによって得られた。 表５ さらに、発現プラスミドが、オペロンと対を形成してい 【表５】 るＣｍマーカーとは異なる耐性マーカーを有していたの で、両抗生物質を用いて選択する間に、陽性コロニーの みが増殖でき、自己ライゲーションした発現プラスミド またはライブラリードナープラスミドのいずれかで形質 転換されたクローンは増殖できなかった。 【０２３０】 30 ＲＧＢ−３色リポーター系 細菌株および増殖条件：クローニングおよび構築物アセ ンブリープロセスに使用される細菌株は、大腸菌ＤＨ５ 【０２２６】 αとした。蛍光測定のために、プラスミドを大腸菌Ｋ１ ｐＮｉｖ−ＲＢＳセットへのバーコードの付加：ＲＢＳ ２ ＭＧ１６５５に形質転換し、これを０．２％グルコ −ＹＦＰ挿入断片（ＲＢＳ−Ａ∼ＲＢＳ−Ｆ）を含有す ースおよびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を る６種のｐＮｉｖプラスミドの各々は、バーコード塩基 含む最小培地で３７℃で増殖させた。 および制限部位が指定のプライマー（表２）を使用して 【０２３１】 付加されるＰＣＲ反応の鋳型として働いた。ＸｈｏＩ制 遺伝子：以下のプラスミドｐＲＳＥＴＢ−ＹＦＰ、ｐＲ 限部位は、バーコード領域の上流に付加され、一方で、 ＳＥＴＢ−ＣＦＰおよびｐＲＳＥＴＢ−ｍｃｈｅｒｒｙ ＳａｌＩおよびＰｓｔＩ部位は下流に付加された。６種 40 からのＰＣＲによって、ｍＹＦＰ、ｍＣＦＰおよびｍＣ のｐＮｉｖ−ＲＢＳ−ＹＦＰバーコード付加プラスミド ｈｅｒｒｙを増幅させた。ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子上のＰ の各々を、ＮｓｉＩおよびＸｈｏＩを用いて別個に消化 ｓｔＩ制限部位は、単一サイレント突然変異を導入する し、ＹＦＰコード配列を除去した。６種の得られた直線 ことによって排除した（表１を参照のこと）。 化されたベクターの等モル混合物（すなわち、ｐＲＢＳ 【０２３２】 バーコード混合物）を、本明細書において上記で記載さ アセンブリープロセス：ｍＹＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙおよ れたように調製した。 びＣＦＰを、まず、上記で説明される耐性カセットと対 【０２２７】 を形成させた。上記の節に記載されたようにバーコード バーコード付加ＲＢＳ混合物を使用する単一チューブコ 付加ＲＢＳセットを使用してオペロンをアセンブルした ンビナトリアルアセンブリー：バーコード付加ＲＢＳプ 。ｐＲＢＳ−ｍＹＦＰ−バーコード１を、ベクターとし ラスミドセットの使用は、制限酵素の異なる使用に起因 50 て使用するために、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を ( 35 ) JP 67 2015-530870 A 2015.10.29 68 用いて消化し、一方で、ｐＲＢＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−バ 平均をとることによって算出した： ーコード２は、挿入断片として使用するためにＳｐｅＩ 【０２３７】 およびＳａｌＩを用いて消化した。これら２種の制限生 【数２】 成物をライゲーションし、その結果、新規生成物ｐＲＢ Ｓ−ｍＹＦＰ−ＲＢＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−バーコード２ −バーコード１を得た。この生成物をベクターとして、 ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、一方で、ｐＲ すべての分析ステップは、特別注文のＨａｓｋｅｌｌソ ＢＳ−ｍＣＦＰ−バーコード３は、挿入断片として、Ｓ フトウェアを使用して実施した。 ｐｅＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、得られた生成物 【０２３８】 をライゲーションして、以下のオペロンを、ｐＮｉｖプ 10 細菌コロニーの蛍光顕微鏡観察：照明のためにＮｉｋｏ ラスミド：ｐＲＢＳ−ｍＹＦＰ−ｍｃｈｅｒｒｙ−ｍＣ ｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔ（Ｃ−ＨＧＦＩＥ）を備 ＦＰ−バーコード３−バーコード２−バーコード１にア えたＮｉｋｏｎ センブルした。次いで、オペロンを消化し、上記の発現 用して蛍光像をとった。彩度フィルターキューブセット プラスミド中にサブクローニングした。 を使用して、蛍光タンパク質を撮像した。ｍＣｈｅｒｒ 【０２３３】 ｙ（励起フィルター５３０∼５６０ｎｍ、発光フィルタ ＲＧＢ蛍光ライブラリーの測定 ー５９０∼６５０、３０ｍｓ露出）、シアン蛍光タンパ 自動化蛍光測定：細胞を、自動化ロボットプラットフォ ク質（ｍＣＦＰ）（励起フィルター４２６∼４４６ｎｍ ーム（Ｅｖｏｗａｒｅ ＩＩ、Ｔｅｃａｎ）において、 、発光フィルター４６０∼５００ｎｍ、６０ｍｓ露出） Ｍ９＋０．２％グルコースを含有する９６ウェルプレー および黄色蛍光タンパク質（ｍＹＦＰ）（励起フィルタ ト中で増殖させた。１５分毎に、プレートをロボットア 20 ー４９０−５１０ｎｍ、発光フィルター５２０∼５５０ ームによってマルチウェル蛍光光度計（Ｉｎｆｉｎｉｔ ｎｍ、８００ｍｓ露出）。カメラおよびＮＩＳ−エレメ ｅ ントＢＲ３．２２ソフトウェアを用いて像を獲得した。 Ｍ２００−ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）に移した。各測定 ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ８００顕微鏡を使 では、ＯＤを６００ｎｍでサンプリングし、ｍＣｈｅｒ 種々のチャネルを重ねて、示される図を得た。 ｒｙを５８７ｎｍでの励起および６２０ｎｍでの発光測 【０２３９】 定によってサンプリングし、ＹＦＰを、５２０ｎｍでの 翻訳共役：単一オペロン内の連続する遺伝子の翻訳が上 励起および５５５ｎｍでの発光測定によってサンプリン 流遺伝子に依存性であることが示された、翻訳共役と呼 グした。 ばれる現象である。具体的には、遺伝子の発現レベルは 【０２３４】 、それに先行する遺伝子の発現レベルによって調節され データ解析：ＯＤおよび蛍光の生データを、細胞を有さ る。翻訳共役は、大腸菌ならびにその他の原核生物にお ない培地を含有するウェルを差し引くことによってバッ 30 いて種々のオペロンについて観察された。翻訳共役は、 クグラウンド補正した。 長年知られていたが、粗く定量されているだけで、その 【０２３５】 根底にある機序は、議論中である。 大きく必要とされるダイナミックレンジのために、低い 【０２４０】 細菌濃度で弱いＲＢＳを有するウェルを分析することが 図１６Ｄに示されるＲＧＢ格子は、翻訳共役を実証する 可能ではなかった。したがって、本発明者らは、中期か 。ＹＦＰの蛍光は、それを制御するＲＢＳの強度のみに ら後期対数増殖期で働くよう選択した。細胞を、標準の 応じて変わるが、一方、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光は、それ １ｃｍ経路長を用いて、約０．２のＯＤ６００に相当す を制御するＲＢＳおよびＹＦＰの蛍光の両方に応じて変 る培地差引後に、プレートリーダーによって測定される わる。この効果をさらに分析するために、本発明者らは ような０．１のＯＤ６００値あたりで分析した。各測定 、ＹＦＰが、６種のＲＢＳ（Ａ∼Ｆ）のうち１種によっ 点について、活性を、測定時間を中心に１時間の時間窓 40 て制御され、一方、ｍＣｈｅｒｒｙが、弱いＲＢＳ（Ｅ の間に測定された平均ＯＤによって除した、その間の蛍 ）、中程度の強度のＲＢＳ（Ｃ）または強力なＲＢＳ（ 光の増大として定義した： Ａ）のいずれかによって制御されるクローンを利用した 【０２３６】 。次いで、各ライブラリー変異体のＹＦＰおよびｍＣｈ 【数１】 ｅｒｒｙの蛍光を測定し、互いに対してプロットした。 得られた格子（図１３）は、翻訳共役：第１の遺伝子（ すなわち、ＹＦＰ）発現レベルが、それを制御するＲＢ ［式中、Ａは、ＲＢＳ活性であり、Ｆは、蛍光測定値で Ｓの強度に応じて変わり、使用されるＲＢＳが強力であ あり、τ＝３０分である］。結果は、細胞数によって除 るほど、測定されるＹＦＰ蛍光は大きいことを明確に実 された１時間の間の蛍光の増大を反映する。平均活性は 証する。対照的に、第２の遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）発 、各サンプルのＯＤ０．１あたりの５回の測定にわたる 50 現レベルは、それを制御するＲＢＳに、および第１の遺 ( 36 ) JP 2015-530870 69 A 2015.10.29 70 伝子を制御するＲＢＳの両方に応じて変わる。すわなち ８．１（配列番号６８）。 、ｍＣｈｅｒｒｙについて同一ＲＢＳを共有するクロー 【０２４９】 ンが、上流ＹＦＰ発現レベルに依存して異なるｍＣｈｅ ・大腸菌由来の１−デオキシキシルロース−５−リン酸 ｒｒｙ蛍光レベルを示す。交差蛍光は、このような効果 シンターゼ（ｄｘｓ）−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ａ７Ｚ の原因として除外された：単一蛍光タンパク質（ＹＦＰ Ｘ７２．１（配列番号６９）。 またはｍＣｈｅｒｒｙのいずれか）を含有するクローン 【０２５０】 は、高レベルの発現についても相互蛍光チャネルでシグ ＣｔｒＺは、アセンブリーＰＣＲを使用して合成し、ア ナルをもたらさない。本系におけるＹＦＰ発現レベルに センブリーＰＣＲのためのプライマーは、Ｊｏｈｎｓｏ よるｍＣｈｅｒｒｙの最大翻訳増強は、約６倍であると ｎ Ｌａｂオリゴマーカー（３４）を使用して算出した わかった。ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙレベル間の依存 10 。サイレント突然変異を導入することによって、列挙さ 性は、対数空間で線形依存を示す（図１３）。線形回帰 れた遺伝子から制限部位ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、Ｎｓｉ は、約１／３の傾きをもたらす（９５％信頼区間０．２ Ｉ、ＮｈｅＩ、ＰｓｔＩおよびＰｃｉＩを排除した。 ６∼０．３６）。 【０２５１】 【０２４１】 アセンブリープロセス：ｉｄｉ、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、 カロテノイド生合成経路のＲＢＳ調節 ｃｒｔＩ、ｌｃｙ−Ｂ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＺおよびｄｘ 細菌株および増殖条件：クローニングおよび構築物アセ ｓを、ＰＣＲによって増幅し、次いで、上記に説明され ンブリープロセスに使用される細菌株は、大腸菌ＤＨ５ るように、耐性カセットと対を形成させた。上記で記載 αとした。カロテノイド発現のために、形質転換された されるように各遺伝子にＲＢＳを付加した。生合成経路 細胞を、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含 に沿った遺伝子の順序に従って、反復プロセスでライブ むＬＢ培地で３７℃で増殖させた。 20 ラリーをアセンブルした。完全オペロンを、記載される 【０２４２】 ような発現プラスミド中にサブクローニングした。 アスタキサンチン生合成経路の遺伝子 【０２５２】 アスタキサンチン合成のために、以下の遺伝子を使用し カロテノイド分析 た： カロテノイド抽出：カロテノイド経路の生合成遺伝子を ・パントエア・アグロメラン由来のゲラニルゲラニルピ 有するプラスミドを保持する大腸菌細胞を、１００ｍｌ ロリン酸シンターゼ（ｃｒｔＥ）−ＧｅｎＢａｎｋ：Ａ のＬＢ培地を含有する振盪フラスコ中で懸濁培養で増殖 ＡＡ２１２６０．１（配列番号６２）。 させた。 【０２４３】 培養は、３７℃で実施した。４８時間後、２０ｍｌのサ ・パントエア・アグロメラン由来のプレフィトエンピロ ンプルを培養物から引き出し、遠心分離によって細胞を リン酸シンターゼ（ｃｒｔＢ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡ 30 回収した。細胞ペレットを冷水で洗浄し、アセトン（２ Ａ２１２６４．１（配列番号６３）。 ０ｍｌ）とともに激しく振盪することによってカロテノ 【０２４４】 イドを抽出した。抽出物の不溶性成分を遠心分離（１５ ・パントエア・アグロメラン由来のフィトエン脱水素酵 ，０００ｇ）によって除去し、上清をガラス製丸底フラ 素（ｃｒｔＩ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１２６３． スコ中に移し、ロータリーエバポレーターを使用して蒸 １（配列番号６４）。 発させた。乾燥抽出物を１．５ｍｌのアセトンで再溶媒 【０２４５】 和させ、５０μｌのサンプルをＨＰＬＣ分析のために採 ・ヘマトコッカス藻由来のイソペンテニルピロリン酸（ 取した。 ｉｄｉ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＣ３２２０８．１（配 【０２５３】 列番号６５）。 【０２４６】 ＨＰＬＣによるカロテノイド分析：ＨＰＬＣ分析を、Ｂ 40 ｏｒｗｉｎソフトウェアとともに取り付けられた高圧混 ・トマト由来のβ−リコピンシクラーゼ（ｌｃｙ−Ｂ） 合、Ｐ４９８７ポンプおよびＭＤ−９１５フォトダイオ −ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＲ５７２３２．１（配列番号６ ードアレイ検出器を備えたＪａｓｃｏプラットフォーム ６）。 で実施した。ＹＭＣパックＯＤＳ−Ａカラム（２５０× 【０２４７】 ４．６ｍｍ、５μｍ、１２ｎｍ）に５０μｌを注入する ・パントエア・アナナティス由来のβ−カロテンヒドロ ことによってサンプルを分析した。溶媒Ａ：７５％メタ キシラーゼ（ｃｒｔＺ）−Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ２ ノール水溶液、溶媒Ｂ：酢酸エチル。０．６ｍｌ／分の １６８８．１（配列番号６７）。 溶媒流速を使用し、以下の勾配を用いた：１５∼８５％ 【０２４８】 のＢ（０∼２４分）、８５％（２４∼３０分）、８５∼ ・ノストック・スフェロイデス由来のβ−カロテンケト １５％（３０∼３４分）、１５％（３４∼７４５ ラーゼ（ｃｒｔＷ）−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＢ７４８８ 50 分）。フォトダイオードアレイ検出機（３００∼９００ ４０ ( 37 ) JP 71 2015-530870 A 2015.10.29 72 ｎｍ）を用いて、溶出されたカロテノイドのスペクトル 直接選択を可能にした。次いで、ベクターを、耐性カセ をオンラインで記録した。カロテノイド化合物を、認証 ットを切り出すことによって次の反復のために「再生利 標準化合物を用いるコクロマトグラフィーによって、お 用した」（図１５Ｄ）。この戦略によって、中間スクリ よびそのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルの分析によって同定し ーニングステップが回避され、迅速で効率的なオペロン た。カロテノイド化合物の定量化のために、積分したピ 構築が可能になる。次いで、得られたオペロンのライブ ーク面積を、認証標準のものと比較した。標準溶液の濃 ラリーを、細胞中に形質転換し、所望の表現型について 度は、分光光度法で決定した（Ｊａｓｃｏ Ｖ−５７０ スクリーニングした。特定のクローンのＲＢＳ組成の推 機器）（３５）。さらなる同定のために、ＨＰＬＣによ 測は、遺伝子の３’ＵＴＲに位置するバーコードを配列 って単離されたピークを収集し、質量分析計（Ｚ−スプ 決定することによって実施した（材料および方法に記載 レーＥＳＩインターフェースおよびＷａｔｅｒｓ される通り）。バーコードは、オペロンの３’ＵＴＲに ｓｓｌｙｎｘ ｏｍａｓｓ Ｍａ 10 ｖ４．１ソフトウェアを備えたＭｉｃｒ Ｑｕａｔｔｒｏ 短い同定配列を反復して連結することによって、アセン Ｕｌｔｉｍａタンデム四 ブリープロセスの間に作製された。ライブラリー中の各 重極機器）に直接注入した。得られたフルスキャン（Ｅ 遺伝子変異体は、オペロン中のすべての遺伝子のＲＢＳ ＳＩ（＋）、ｍ／ｚ 組成が、単一配列決定反応で推測され得るものとは異な １００−１０００）質量スペクト ル（３６）から、対応する質量を分析した。 るバーコード配列を含有する。 【０２５４】 【０２５７】 写真：可視光下で両眼顕微鏡（ＷＩＬＤ Ｍ８；Ｈｅｅ ＲＢＳの組合せが、多次元発現空間に及び得るかどうか ｒｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、 を調べるために、３色リポーター系を構築した。ＣＦＰ 図１６において現れるコロニーの写真をとった。 、ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを各々、本ＲＢＳセット 【０２５５】 20 の３種の代表（ＲＢＳ配列「Ａ」、「Ｃ」および「Ｅ」 結果 ）と無作為に対を形成させ、オペロンに一緒にアセンブ 数桁規模のタンパク質発現に及ぶとこれまでに見出され ルした。したがって、得られたオペロンライブラリーは ている６種のＲＢＳ配列を選択した（９，１４）（図１ 、３ ５Ｂ）。まず、各配列をＹＦＰリポーターの上流に置く バーは、同一順序であるが、異なるＲＢＳ配列の調節下 ことおよびフローサイトメトリーを使用して蛍光シグナ に３種の遺伝子を含有する（図１６Ａ）。形質転換する ルを測定することによって、発現レベルに対する種々の と、コロニーは、蛍光リポーターの差示的発現に起因し ＲＢＳ配列の効果を定量化した（１５）。６種のＲＢＳ て別個の色パターンを示す（図１６Ｂ）。観察される色 を、発現レベルによって降順に「Ａ」から「Ｆ」と示し 空間は、ＲＢＳ配列のコンビナトリアルアセンブリーが た。図１５Ｃに示されるように、ＲＢＳの小さいセット 、オペロン内の同義遺伝子の発現レベルを大幅に調節し は、数桁規模のタンパク質発現レベルに及び得る。次い 30 得ることを示す（図１６Ｃ）。本発明者らは、サンプル で、本発明者らは、いくつかの遺伝子の発現空間に及ぶ クローンを配列決定し、その蛍光レベルを定量化するこ ライブラリーを同時にアセンブルするためにＲＢＳ配列 とによって、観察される異なる色が、ＲＢＳ配列の異な のこの小さいセットを使用することが可能かどうかを問 る組合せに起因することを検証した（１５）。さらに、 うた。各メンバーが同一遺伝子を含有するが、異なるＲ 本発明者らは、ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙからなるオ ＢＳ配列の翻訳調節下にあるオペロンのライブラリーを ペロンの蛍光レベルを測定し、図１６Ｄに示される９つ 作製した。これを達成するために、本発明者らは、対象 のクラスターの格子を見出した。各クラスターは、同一 の遺伝子の各々を、ＲＢＳ配列のセットと組合せ的に対 のＲＢＳを有するクローンを含有する。さらに、クラス を形成させ、これらのＲＢＳ−遺伝子構築物をアセンブ ターの広がりは、ＲＢＳ調節が、発現空間の各次元にお ３ ルして、合成オペロンのライブラリーを作製した（１５ ）。 ＝２７種の遺伝子変異体を含有しており、各メン いて約１００倍に及ぶことを実証する。特に、ＹＦＰの 40 発現レベルは、それを調節するＲＢＳ配列にのみ依存す 【０２５６】 る。ＹＦＰ（このオペロン中の最初に位置する）の上流 アセンブリープロセスを促進するために、増強されたＢ に同一ＲＢＳを有するすべてのコロニーが垂直に整列さ ｉｏＢｒｉｃｋ（１６）クローニング戦略を開発した。 れ、同様のレベルのタンパク質発現を示す。しかし、ｍ 時間のかかるスクリーニングステップの必要性を回避す Ｃｈｅｒｒｙ蛍光（ＹＦＰの下流に位置する）は、その る陽性選択手順を使用して、遺伝子部分を反復してアセ ＲＢＳおよび上流遺伝子の発現レベルの両方に依存する ンブルした（１５）。手短には、アセンブルされる予定 （図１６Ｄ）。上流遺伝子の発現の１０倍の増大につき のすべての遺伝子部分に、クロラムフェニコール（Ｃｍ 、約２倍の発現増大を示す、約１／３のべき乗指数を有 ）耐性カセットを接続した。各ステップにおいて、さら する、２桁を超える規模にわたる共役が見出された（図 なる遺伝子部分を構築物中に挿入し（図１５Ｄ）、一方 １６Ｄ）。依存性は、交差蛍光によるものではなく（１ で、耐性カセットが、適切にアセンブルされた構築物の 50 ５）、むしろ、オペロン中の隣接する遺伝子間の翻訳共 ( 38 ) JP 2015-530870 73 A 2015.10.29 74 役の現れである（１７）。 例または同定は、このような参考文献が、本発明の先行 【０２５８】 技術として利用可能であるということの承認と解釈され 本３色リポーター系は、ＲＢＳ配列のコンビナトリアル てはならない。節の見出しが使用される限りにおいて、 アセンブリーが、発現空間の大きな画分に広がり得るこ それらは必ずしも制限と解釈されてはならない。 とを実証する。本発明者らは、代謝経路の作動に対して 【０２６２】 このような発現調節の効果がどのように及ぶかを検討し 参考文献 た。この問題に対処するために、カロテノイド生合成経 1. P. Lu, C. Vogel, R. Wang, X. Yao, E. M. Marcott 路を構成する７種の遺伝子を、大腸菌にクローニングし e, Absolute protein expressionprofiling estimates た。この外因性代謝経路の最終生成物は、アスタキサン the relative contributions of transcriptional and チン、その強力な抗酸化特性のために公知である高価な 10 translational regulation, Nat Biotechnol 25, 117-1 キサントフィル（１９）である。大腸菌におけるアスタ 24 (2006). キサンチンの生合成に対するコンビナトリアルＲＢＳ調 2. M. Scott, C. W. Gunderson, E. M. Mateescu, Z. Z 節の効果を調査するために、カロテノイド経路の遺伝子 hang, T. Hwa, Interdependence of Cell Growth and G の各々を、ＲＢＳセットと無作為に対を形成させ、合成 ene Expression: Origins and Consequences, Science オペロンにアセンブルした（図１７Ａ）。 330, 1099-1102 (2010). 得られたライブラリーは、単一試験管中に６ ７ 種の遺伝 3. D. Na, T. Y. Kim, S. Y. Lee, Construction and o 子変異体を含有する。図１７Ｂに示されるように、形質 ptimization of synthetic pathways in metabolic eng 転換された大腸菌コロニーは、多種多様な色および強度 ineering, Current Opinion in Microbiology 13, 363- を示す。各コロニーの色パターンは、各々独特の色を有 370 (2010). する別個のカロテノイド中間体の差示的蓄積に起因する 20 4. E. Dekel, U. Alon, Optimality and evolutionary 。 tuning of the expression levelof a protein, Nature 【０２５９】 436, 588-592 (2005). 配列決定することによって、サンプリングされたクロー 5. M. Koffas, Engineering metabolism and product f ンのＲＢＳ組成を決定し、ＨＰＬＣを使用してカロテノ ormation in Corynebacterium glutamicum by coordina イドプロフィールを分析した（１５）。図１７Ｃは、そ ted gene overexpression, Metabolic Engineering 5, のＲＢＳ組成が異なるクローンは、多様なカロテノイド 32-41 (2003). プロフィールを示すことを示す。いくつかのクローンは 6. D. J. Pitera, C. J. Paddon, J. D. Newman, J. D. 、主に単一の生成物を蓄積するが、他のものは、相当な Keasling, Balancing a heterologous mevalonate pat レベルの種々のカロテノイドを製造した。本コンビナト hway for improved isoprenoid production in Escheri リアルＲＢＳアプローチを使用することで、アスタキサ 30 chia coli,Metabolic Engineering9, 193-207 (2007). ンチン生産性を２．６ｍｇ／細胞乾重１ｇ、大腸菌にお 7. B. R. Glick, Metabolic load and heterologous ge いてこれまでに製造されたものの約２倍ほどに高めるこ ne expression, Biotechnol. Adv13, 247-261 (1995). とが可能となった。さらに、ｄｘｓ−カロテノイド経路 8. K. Hammer, I. Mijakovic, P. R. Jensen, Syntheti に絡む遺伝子−をＲＢＳ調節下でオペロン中に組み込む c promoter libraries - tuning of gene expression, ことにより、アスタキサンチン生成が５．８ｍｇ／細胞 Trends in Biotechnology 24, 53-55 (2006). 乾重１ｇに増大した。これは、これまでに報告された最 9. H. M. Salis, E. A. Mirsky, C. A. Voigt, Automat 良の結果を上回るアスタキサンチン製造の４倍の増大に ed design of synthetic ribosome binding sites to c 相当する。 ontrol protein expression, Nat Biotechnol 27, 946- 【０２６０】 950 (2009). 本発明は、その特定の実施形態とともに記載してきたが 40 10. H. H. Wang et al., Programming cells by multip 、多数の代替物、改変および変法が当業者に明らかとな lex genome engineering and accelerated evolution, ることは明白である。したがって、添付の特許請求の範 Nature 460, 894-898 (2009). 囲の趣旨および広い範囲内に入る、このような代替物、 11. B. F. Pfleger, D. J. Pitera, C. D. Smolke, J. 改変および変法のすべてを包含するものとする。 D. Keasling, Combinatorial engineering of intergen 【０２６１】 ic regions in operons tunes expression of multiple 本明細書に記載されたすべての刊行物、特許および特許 genes, Nat. Biotechnol 24, 1027-1032 (2006). 出願は、各個々の刊行物、特許および特許出願が具体的 12. A. H. Babiskin, C. D. Smolke, A synthetic libr に個別に参照により本明細書に組み込まれると示される ary of RNA control modules forpredictable tuning o ように同程度に、参照によりその全文が本明細書に組み f gene expression in yeast, Mol Syst Biol 7 (2011) 込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引 50 , doi:10.1038/msb.2011.4. ( 39 ) JP 2015-530870 75 A 2015.10.29 76 13. K. E. McGinness, T. A. Baker, R. T. Sauer, Eng bdotjbeidotorg/services/studio/dac/). ineering Controllable Protein Degradation, Molecul 28. J. H. Davis, A. J. Rubin, R. T. Sauer, Design, ar Cell 22, 701-707 (2006). 14. D. Baker et al., Engineering Life: Building a FAB for Biology, Scientific American 294, 44-51 (2 construction and characterization of a set of ins ulated bacterial promoters, Nucleic Acids Research 39, 1131-1141 (2010). 006). 29. N. C. Shaner, P. A. Steinbach, R. Y. Tsien, A 15. Materials and methods are available as support guide to choosing fluorescent proteins, Nature Met ing material on Science Online. hods 2, 905-909 (2005). 16. R. P. Shetty, D. Endy, T. F. Knight, Engineeri 30. G. Baughman, M. Nomura, Localization of the ta ng BioBrick vectors from BioBrick parts, J Biol En 10 rget site for translational regulation of the L11 g 2, 5 (2008). operon and direct evidence for translational coupl 17. Translational coupling during expression of th ing in Escherichia coli, Cell 34, 979-988 (1983). e tr... [Genetics. 1980] - PubMed result (availabl 31. L. Lovdok et al., A. Levchenko, Ed. Role of Tr e at worldwidewebdotncbidotnlmdotnih.gov/pubmed/61 anslational Coupling in Robustness of Bacterial Ch 62715). emotaxis Pathway, PLoS Biology 7, e1000171 (2009). 18. L. Lovdok et al., A. Levchenko, Ed. Role of Tr 32. D. Schumperli, K. McKenney, D. A. Sobieski, M. anslational Coupling in Robustness of Bacterial Ch Rosenberg, Translational coupling at an intercist emotaxis Pathway, PLoS Biol 7, e1000171 (2009). ronic boundary of the Escherichia coli galactose o 19. F. X. Cunningham, E. Gantt, Elucidation of the peron, Cell 30, 865-871 (1982). Pathway to Astaxanthin in theFlowers of Adonis ae 20 stivalis, THE PLANT CELL ONLINE 23, 3055-3069 (201 1). 33. G. Rex, B. Surin, G. Besse, B. Schneppe, J. E. McCarthy, The mechanism of translational coupling in Escherichia coli. Higher order structure in th 20. X.-G. Zhu, E. de Sturler, S. P. Long, Optimizi e atpHA mRNA acts as a conformational switch regul ng the distribution of resources between enzymes o ating the access of de novo initiating ribosomes, f carbon metabolism can dramatically increase phot J. Biol. Chem.269, 18118-18127 (1994). osyntheticrate: a numerical simulation using an ev 34. R. Rydzanicz, X. S. Zhao, P. E. Johnson, Assem olutionary algorithm, Plant Physiol 145, 513-526 ( bly PCR oligo maker: a tool for designing oligodeo 2007). xynucleotides for constructing long DNA molecules 21. J. Holatko et al., Metabolic engineering of th for RNA production, Nucleic Acids Research 33, W52 e L-valine biosynthesis pathway in Corynebacterium 30 1-W525 (2005). glutamicum using promoter activity modulation, Jo urnal of Biotechnology 139, 203-210 (2009). 35. G. Britton,, vol. Vol. 1B: Spectroscopy(1995), pp. 13-62. 22. K. Lemuth, K. Steuer, C. Albermann, Engineerin 36. F. L. Chu, L. Pirastru, R. Popovic, L. Sleno, g of a plasmid-free Escherichia coli strain for im Carotenogenesis Up-regulation in Scenedesmus sp. U proved in vivo biosynthesis of astaxanthin, Microb sing a Targeted Metabolomics Approach by Liquid Ch ial Cell Factories 10, 29 (2011). romatography-High-Resolution Mass Spectrometry, Jo 23. DSpace@MIT: Idempotent Vector Design for Stand urnal of Agricultural and Food Chemistry59, 3004-3 ard Assembly of Biobricks (available at dspacedotm 013 (2011). itdotedu/handle/1721.1/21168). 【配列表フリーテキスト】 24. R. M. Horton, H. D. Hunt, S. N. Ho, J. K. Pull 40 【０２６３】 en, L. R. Pease, Engineering hybrid genes without 配列番号１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド the use of restriction enzymes: gene splicing by o 配列番号２：リボソーム結合部位Ａ（ＲＢＳ−Ａ） verlap extension, Gene 77, 61-68 (1989). 配列番号３：リボソーム結合部位Ｂ（ＲＢＳ−Ｂ） 25. H. M. Salis, E. A. Mirsky, C. A. Voigt, Automa 配列番号４：リボソーム結合部位Ｃ（ＲＢＳ−Ｃ） ted design of synthetic ribosome binding sites to 配列番号５：リボソーム結合部位Ｄ（ＲＢＳ−Ｄ） control protein expression, Nature Biotechnology 2 配列番号６：リボソーム結合部位Ｅ（ＲＢＳ−Ｅ） 7, 946-950(2009). 配列番号７：デッド−ＲＢＳ（ＲＢＳ−Ｆ） 26. Salis Lab: The Ribosome Binding Site Calculato 配列番号８：上流インスレーター配列 r (available at salisdotpsudotedu/software/). 配列番号９：下流インスレーター配列 27. BIOFAB Data Access Client (available at /biofa 50 配列番号１０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド ( 40 ) 77 JP 2015-530870 A 2015.10.29 78 配列番号１１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号５４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号５５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号５６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号５７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号５８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号５９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号６０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号６１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号２０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７０：例示のＲＢＳ配列 10 配列番号７１：例示のＲＢＳ配列 配列番号２１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７２：例示のＲＢＳ配列 配列番号２２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７３：例示のＲＢＳ配列 配列番号２３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７４：例示のＲＢＳ配列 配列番号２４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７５：例示のＲＢＳ配列 配列番号２５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７６：例示のＲＢＳ配列 配列番号２６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７７：例示のＲＢＳ配列 配列番号２７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７８：例示のＲＢＳ配列 配列番号２８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号７９：例示のＲＢＳ配列 配列番号２９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８０：例示のＲＢＳ配列 配列番号３０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 20 配列番号８１：例示のＲＢＳ配列 配列番号３１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８２：例示のＲＢＳ配列 配列番号３２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８３：例示のＲＢＳ配列 配列番号３３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８４：例示のＲＢＳ配列 配列番号３４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８５：例示のＲＢＳ配列 配列番号３５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８６：例示のＲＢＳ配列 配列番号３６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８７：例示のＲＢＳ配列 配列番号３７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８８：例示のＲＢＳ配列 配列番号３８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号８９：例示のＲＢＳ配列 配列番号３９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９０：例示のＲＢＳ配列 配列番号４０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 30 配列番号９１：例示のＲＢＳ配列 配列番号４１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９２：例示のＲＢＳ配列 配列番号４２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９３：例示のＲＢＳ配列 配列番号４３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９４：例示のＲＢＳ配列 配列番号４４：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９５：例示のＲＢＳ配列 配列番号４５：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９６：例示のＲＢＳ配列 配列番号４６：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９７：好適なｍＲＮＡ安定化配列 配列番号４７：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９８：好適なｍＲＮＡ安定化配列 配列番号４８：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号９９：好適なｍＲＮＡ安定化配列 配列番号４９：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号５０：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１００：好適なｍＲＮＡ安定化配列 40 配列番号１０１：好適なｍＲＮＡ安定化配列 配列番号５１：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１０２：好適なｍＲＮＡ安定化配列 配列番号５２：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド 配列番号１０３：好適なｍＲＮＡ安定化配列 配列番号５３：一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド ( 41 ) 【図１】 JP 【図３】 【図５】 【図２】 【図６Ａ−Ｄ】 2015-530870 A 2015.10.29 ( 42 ) 【図７】 JP 【図１１】 【図８】 【図１２】 2015-530870 A 2015.10.29 ( 43 ) 【図１３】 JP 【図１６Ｄ】 【図４】 【図１４】 2015-530870 A 2015.10.29 ( 44 ) 【図９】 JP 【図１５Ａ−Ｂ】 【図１０】 【図１５Ｃ−Ｄ】 2015-530870 A 2015.10.29 ( 45 ) 【図１６Ａ−Ｃ】 【図１７Ａ−Ｂ】 JP 【図１７Ｃ】 2015-530870 A 2015.10.29 ( 46 ) 【配列表】 2015530870000001.app JP 2015-530870 A 2015.10.29 ( 47 ) 【国際調査報告】 JP 2015-530870 A 2015.10.29 ( 48 ) JP 2015-530870 A 2015.10.29 ( 49 ) JP 2015-530870 A 2015.10.29 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｑ 1/02 (2006.01) Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 (81)指定国 １０３ AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,T M),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,R S,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA, BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,H R,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI ,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG, US,UZ,VC (72)発明者 ゼルクブーフ リオル イスラエル国 ７６１０００２ ツマン インスティチュート カンパニー (72)発明者 ツマン オブ サイエンス イェダ リサーチ レホヴォト ピー．オー．ボックス アンド オブ サイエンス イェダ リサーチ ９５ アンド リミテッド内 Ｆターム(参考) 4B018 LB10 MA01 MB05 MD48 MD74 ME02 ME10 MF01 4B024 AA01 AA05 AA17 BA80 CA01 CA04 CA09 CA11 CA20 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 GA11 HA01 HA08 4B063 QA01 QA05 QQ02 QQ04 QQ22 QQ40 QS17 QS32 QX02 4B064 AC37 AH01 CA02 CA10 CA19 AC14 BA01 BA05 CA18 4B065 AA01X AA26X AA83X AA87X AB01 CA42 ９５ アット ザ ワイン デベロップメント ニヴ ７６１０００２ インスティチュート カンパニー ピー．オー．ボックス リミテッド内 アントンブスキー イスラエル国 レホヴォト CA44 CA54 DA01 CA41 アット ザ ワイン デベロップメント