第5回 独立栄養細菌の保存法について

Microbiol. Cult. Coll. 24
（1）
：9 13, 2008
連載「微生物資源の保存技術講座」
第 5 回 独立栄養細菌の保存法について
内野佳仁
独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（NBRC）
〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足 2-5-8
Preservation of lithoautotrophic bacteria
Yoshihito Uchino
NITE Biological Resource Center (NBRC), Department of Biotechnology,
National Institute of Technology and Evaluation
2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu, Chiba 292-0818, Japan
1．はじめに
本稿では，特に保存が難しいとされる，硝化細菌と，
独立栄養細菌 Lithoautotrophic bacteria は炭酸固定
好気性好酸性の硫黄酸化細菌
能を有する細菌である．呼吸あるいは光合成でエネル
と鉄酸化細菌
の
ギーを獲得し，無機物を酸化することで必要な電子を
保存を中心に解説する．また嫌気性細菌の培養・保存
得る．
に役立つ，平板培養時のガス組成の設定方法について
呼吸によりエネルギーを得る化学独立栄養細菌は，
NH3，NO2 ，H2，硫黄化合物，鉄（Fe ）など酸化
−
紹介する．
2＋
される無機物（電子供与体）の種類で分類される（e.g.
2．硝化細菌の保存について
硫黄を酸化する場合，硫黄酸化細菌）
，また，電子受
窒素循環における硝化反応（NH3 → NO2−→ NO3−）
容体として O2 を利用する好気性細菌，O2 以外の物質
を担うアンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌は，近年
（硝酸など）を利用する嫌気性細菌が存在する．光合
の環境問題への関心の高さを反映して益々その重要性
成独立栄養細菌については，嫌気・光条件下で H2 や
を増しているが，取扱いの難しさが研究の妨げとなっ
硫黄化合物等を電子供与体として利用するものが知ら
ている．表 1 のように分類学的基準株でさえ十分な研
れている．
究の態勢にあるとは言い難く，この状況が硝化細菌の
分離株を得るのに大変な時間と労力を要する独立栄
保存の難しさを物語っている．
養細菌だが，分離後は脆弱となり死滅する危険性が高
この項では，NBRC で行っている L-乾燥保存と，
まる．継代維持する場合もあるが，継代中に突然増殖
既報の様々な保存法について紹介する．
活性がなくなることもしばしばである．分離株の中に
は，①増殖速度が遅い，②収量が得られない，③有機
1）L-乾燥保存
物による増殖阻害がかかる，④自ら産生する強酸に悪
硝化細菌の分散媒は，坂根ら（1996）が検討した
影響を受ける，⑤凍結や乾燥に対する感受性，⑥コロ
SM8（表 2）を使用している．アドニトール（radical
ニー形成出来ない，などの性質を有し，培養・保存（継
scavenger）とシステインの組合せは変異防止剤とし
代維持）
・管理が困難なものも多い．それゆえに，適
て有効だが，保護効果を現すためにはグルタミン酸ナ
切に保存し，安定的に株を維持することが，独立栄養
トリウムを含むリン酸緩衝液に添加されることが必要
細菌の研究を行うための必要条件であると考える．
である（坂根ら，1982；1985）．硝化細菌はグルタミ
ン酸ナトリウムやリン酸で増殖阻害がかかる場合があ
E-mail: [email protected]
るので，一般的な従属栄養細菌用の分散媒 SM1 より
─9─
独立栄養細菌の保存法について
Ammonia-oxidizing bacteria
内野佳仁
表 1 硝化細菌の分類学的基準株
(Migula 1900) Buchanan 1925
(Watson 1965) Watson 1971
Winogradsky and Winogradsky 1933
(Watson
. 1971) Head
. 1995
(ex Harms
. 1976) Head
. 1995
Koops
. 2001
Koops
. 2001
Winogradsky 1892
Koops
. 2001
Koops
. 2001
Koops
. 2001
Koops
. 2001
Koops
. 2001
Koops
. 2001
no culture isolated
ATCC 19707
no culture available
ATCC 25196, C-71
Nv-1
Nm 36
Nm 2
ATCC 25978
Nm 57
Nm 1
Nm 22
Nm 90
Nm 45
Nm 10
Sorokin
. 1999
Bock
. 2001
Bock
. 2001
Winslow
. 1917
Watson and Waterbury 1971
Watson and Waterbury 1971
Watson
. 1986
Ehrich
. 2001
AN1, LMD 97.163
DSM 10229, X14
DSM 10236, Z
ATCC 25391, DSM 10237, CIP 104748
ATCC 25380, CIP 104751
no culture available
ATCC 43039
DSM 10035 (not available from the DSMZ), NSP M-1
Nitrite-oxidizing bacteria
2008 年 3 月現在，アンモニア酸化細菌は 3 属 14 種，亜硝酸酸化細菌は 4 属 8 種が記載されている．うち基準株が利用出来
ないものが 3 種．異なる国のカルチャーコレクション 2 機関で保存されていないものが 16 種（細菌命名規約に抵触）
．
属 8 種と
の基準株は，論文著者のグループ（University of Hamburg, Germany）でのみ
保存している．
表 2 独立栄養細菌の L-乾燥保存に用いられる分散媒
SM1:
SM5:
SM8:
SM9:
Sodium glutamate 3 g, Adonitol 1.5 g, Cysteine HCl 0.05 g, 0.1M Phosphate buffer (KH2PO4K2HPO4, pH 7.0) 100 m .
Sodium glutamate 3 g, Adonitol 1.5 g, Sorbitol 1 g, Ethylenediamine 2HCl 0.4 g, 0.1M Phosphate
buffer (KH2PO4-K2HPO4, pH 7.0) 100 m .
Sodium glutamate 0.5 g, Adonitol 1.5 g, Cysteine HCl 0.01 g, 0.02M Phosphate buffer (KH2PO4K2HPO4, pH 7.0) 100 m .
Sodium glutamate 0.5 g, Sucrose 0.2 g, 0.02M KH2PO4 solution 100 m .
The solution is pH adjusted to 4.0 by adding of 5% phosphate solution, and sterilized by filtration.
低濃度に設定している．定常期初期まで培養（Griess
養する．
比色法やセルカウント等で判断）した菌体を SM8 に
同法は分散媒のグルタミン酸ナトリウムを低濃度と
懸濁し，L-乾燥に供する．菌液の細胞濃度は出来る
することで保護効果が減少するという面もあり（坂根，
だけ高く 109 ∼ 1010 CFU/m を目安とする．硝化細
今井，1986），増殖阻害のない保護効果を有する物質
菌は通常の培養法では菌密度が得られないので，大量
について今後検討の余地があると考える．
の培養液を遠心などで濃縮することで対応する．復元
する際には，グルタミン酸ナトリウムによる増殖抑制
2）凍結保存について
を避けるため，分散媒から持ち込まれるグルタミン酸
細菌の凍結保存法としては，低濃度の凍結保護剤を
ナトリウムを 50 mg/m 以下に希釈して培養，また，
細胞に浸透させた後，緩慢な凍結で細胞内を脱水する
過剰な O2 の存在も抑制に働く場合があるので静置培
ことで凍結保護剤を濃縮し，保護効果を高める緩慢凍
─ 10 ─
Microbiol. Cult. Coll. June 2008
Vol. 24, No. 1
結法が一般的であるが（Pegg, 1976）
，これを硝化細
ルビン酸（菌種によっては 1％グルタミン酸）を蒸留
菌に適用するのは難しい．例えば
水に溶かして分散媒とする（pH 9）．緩衝剤は入れな
NBRC 14298 の場合，定常期初期の菌体を 10％
い．スキムミルク分散媒の滅菌は 105℃，8 分のオー
DMSO-HEPES 培地（NBRC medium No. 829）に懸
トクレーブで行う．乾燥標品は−80℃で保存．シリカ
濁，−80℃ディープフリーザーで凍結し，そのまま保
ゲルストックより有効とされる．
存すると，失敗する．
硝化細菌の凍結保存が難しいとされるのは，凍結障
3．硫黄酸化細菌，鉄酸化細菌の保存について
害を受けやすい部位（細胞膜など）の損傷が硝化細菌
硫黄化合物を酸化して呼吸によりエネルギーを獲得
にとって致命的となるからだろう．それでも保護剤の
する細菌は非常に多様であり，数多くの好気性あるい
種類・濃度，凍結速度，プログラムフリーズ（Nishii ＆
は嫌気性細菌が報告されている．ここでは特に保存が
Nakagiri, 1991）
，あるいは瞬間凍結による細胞試料の
難しいとされる好気好酸性の
ガラス化など検討し，最適条件を見出すことが出来れ
と
ば保存は可能なはずと考える．
を中心に述べる．分離株の多
くが凍結保存あるいは乾燥保存が可能だが，難しい場
合もあり，
3）既報の保存法
属の保存法は大いに参考
になると考える．嫌気性細菌については下記 4 で述べ
（1）流動パラフィン重層法
る．
細菌の保存法は大きく 2 つ，①細胞内外の水の状態
を凍結や乾燥で限定する方法と，②水の動きを止めず
1）
,
細菌の代謝活性を低下させて生存期間を長くする方法
,
の L-乾燥保存
がある．硝化細菌のように凍結や乾燥保存が難しい場
と
用の分散媒は硝化
合は継代維持するしかないが，死滅とコンタミの危険
細菌と同様 SM8 を用いる．
性を低くするためにも継代間隔を長くする②の方法は
中性域 pH に感受性の菌種があり（NBRC 14246 等）
，
重要である．
の中には
はアンモニア供給を制限
pH 4 に 調 製 し た SM9 を 用 い る（Imai ＆ Sakane,
すると休眠状態となり長く保持されるとの報告がある
1985; 坂根，今井，1986）．pH 4 でオートクレーブす
が（Johnstone ＆ Jones, 1988）
，保存法としては
るとグルタミン酸ナトリウムが分解されるので分散媒
Klein（1957）と Gundersen（1957）の流動パラフィ
の滅菌はろ過で行う．
ンを使った報告がある．Klein（1957）は
SM5 を用いる．エチレンジアミン二塩酸は細胞膜の
を培養後，培地を流動パラフィンでカバーすると
の保存には分散媒
保護効果を有し，ソルビトールと併用すると相乗的な
室温で 3 ∼ 7 ヶ月間保存できると報告した．また，
高い効果が得られる（坂根，今井，1988）．振とう培
Gundersen（1957）は植菌後すぐにミネラルオイルで
養する場合は容器壁面に付着しやすい硫黄ではなくチ
カバーしたものでも保存可能であるとした．植菌後し
オ硫酸塩や四チオン酸塩等を用いる．定常期初期まで
ばらく増殖するが，培地内の O2 を消費した後は増殖
培養（吸光度 OD500 で判断可能）（Gupta ＆ Agate,
がストップするとある．
1986; Barron ＆ Lueking, 1990）した菌液から鉄や硫
（2）シリカゲルを用いた凍結保存法
黄等の夾雑物を低速遠心や傾斜により取り除き，菌体
本法はリン酸緩衝液（0.05M, pH 8.0）に懸濁した菌
を 1 ∼ 2 回分散媒で洗浄することで硫酸等を取り除い
液を脱水したシリカゲルパウダーに吸着させ，−80℃
てから分散媒に懸濁，L-乾燥に供する．
で保存する方法である（Tokuyama, 1994）
．シリカゲ
と
の復元培養時に分散媒から持
ル吸着時の発熱をドライアイス−アセトン浴で抑え
ち込まれる有機物に留意する点，静置培養とする点は
る．菌液に対するシリカゲルの量は発熱量に関わるの
硝化細菌と同じである．
で注意が必要である．簡便ではないが Tokuyama ら
のグループはこの方法で多様な分離株を保存してお
り，実績がある．シリカゲルの作用機作は不明．
（3）凍結乾燥保存
2）既報の保存法
（1）凍結保存法
Manchee（1975） は 凍 結 保 護 剤 処 理 を せ ず に
上記と同じ Tokuyama らのグループが用いている
方法（Satoh
., 2004）
．10％スキムミルク＋1％ピ
の培養液（30 m ）を直接液体窒素に滴下
する超急速凍結法について報告し，109 CFU/m の菌
─ 11 ─
独立栄養細菌の保存法について
内野佳仁
図 1 ラバーセプタムを貼りつけたアネロパックパウチ袋
図 2 2.5 L 角型ジャー
a：アネロパック・ケンキ，b：試験管（チオアセトア
ミド 100 mg＋0.5N HCl 1 m ）
液を保存した場合，3 年後，107 CFU/m （1％）生存
していることを示した．また，
Gupta ＆ Agate（1986）
は，菌体を洗浄，5％グリセロール処理した菌液をキャ
嫌気性化学独立栄養細菌は数多く分離されている．ま
ピラリーに充填し液体窒素に浸漬する方法が有効であ
た，光合成独立栄養細菌（Photolithoautotroph）は基
ることを示した．低濃度の凍結保護剤を用いてはいる
本的に嫌気性である．
が Gupta ＆ Agate の方法は Manchee と同様に超急
嫌気性細菌の保存法については，本連載「第 3 回
速凍結によりガラス状凍結を行う方法である．
極限環境微生物の長期保存法」（森，2007）に詳細が
（2）低温での保持
あるので参照されたい．本項では嫌気性細菌の平板培
と
は継代により維持
養時のガス組成の設定方法について紹介する．
される場合が多いが，エネルギー源の枯渇や生成され
る硫酸の影響を考慮して短い間隔で植継ぎをしなけれ
1）平板培地周りのガス組成を設定する方法
ばならない．培養液を冷蔵することで長く生育活性を
分離株を保存管理する上でコロニー形成ができるか
保つことはできるが，硫黄酸化能，鉄酸化能は急速に
否かは非常に重要である．ガス組成を変えることで独
退行する．Gupta ＆ Agate（1986）は，菌液に黄銅
立栄養細菌の増殖が改善される場合があり，固体培地
鉱 chalcopyrite ore（CuFeS2）を混ぜることで，
周りのガス組成を細かく設定する方法は有益である．
と
を 8℃で，硫黄・鉄酸
ブチルゴム栓付バイアル瓶内で固体培養するのが確実
化能を高く保ったまま維持できることを示した．
だが，もし平板培地を使う場合は図 1 のように，アネ
（3）グリシンベタインを保護剤とした L-乾燥保存
ロパックのパウチ袋（三菱ガス化学）に粘着シール付
American Type Culture Collection（ATCC）の
ラバーセプタム（PBI-Dansensor A/S, Denmark）を
Cleland ら（2004）は，細胞の浸透圧に関連のある物
貼ったものを使用する．ガスはセプタムを通して注射
質グリシンベタインが，
針を刺入し封入する．CO2 を使用する場合は pH 変化
の L-乾燥保
護剤としても有効であることを示した．
を液体培地で確認した上で行う．
4．嫌気性独立栄養細菌について
2）スルフィドを電子供与体として利用する菌株の場
化学独立栄養細菌のエネルギー源となる物質の多く
合
は自然界の嫌気的な環境で作られ蓄積・拡散される．
スルフィドを利用する細菌の場合は，嫌気ジャー内
酸素呼吸を行う独立栄養細菌は，O2 が存在する環境
でチオアセトアミドを酸加水分解し，硫化水素を発生
下で H2 や硫黄化合物の非生物的な自動酸化と競争し
させる方法が有効である（図 2）．スルフィドは平板
つつそれらを利用するため，好気性ではあるが好気 -
培地に浸透し，酸化還元電位は下がりレサズリンは無
嫌気の狭間に生息する宿命を持つ．
色となる．著者は，絶対嫌気性である緑色硫黄細菌の
化学独立栄養細菌は嫌気環境と関係が深い．実際，
平板培養をこの方法で行っている．
─ 12 ─
Microbiol. Cult. Coll. June 2008
Vol. 24, No. 1
5．おわりに
49: 295-303.
保存が難しいとされる独立栄養細菌でも菌体量を得
Klein, R. (1957). Preservation of
ることが出来れば，少なくとも死滅は免れるような保
.
Nature 179: 1200.
存処置を施すことが出来る．独立栄養細菌の保存で一
Manchee, R.J. (1975). Long term storage of
番難しいのは，保存そのものよりも培養，菌体量を得
. J. Appl. Bacteriol. 38: 191-192.
ることである．
森 浩二（2007）
．極限環境微生物の長期保存法─高
本稿で紹介した方法は培養が比較的容易な菌種につ
度好塩性古細菌，好熱性好酸性古細菌，メタン生成
いてのものであり，最も重要な「培養」には触れてい
古細菌─．日本微生物資源学会誌 23：17-21.
ないことを最後に付言しておきたい．
Nishii, T. & Nakagiri, A. (1991). Liquid nitrogen storage of oomycetous fungi: examination of cooling
謝 辞
rates and improvement of the freezing tube case.
独立栄養細菌の保存についてご指導ご鞭撻を賜りま
Bull. Jpn. Fed. Cult. Coll. 7: 90-96.
した坂根 健氏と中川恭好博士，また，いつも適切な
Pegg, D.E. (1976). Long-term preservation of cells
助言を頂いている森 浩二博士に心から感謝いたしま
and tissues: a review. J. Clin. Pathol. 29: 271-285.
す．
坂根 健，今井 紘（1986）．L- 乾燥法による細菌株
の保存（第 2 報）．凍結及び乾燥研究会会誌 32：
文 献
47-53.
Barron, J.L. & Lueking, D.R. (1990). Growth and
maintenance of
坂根 健，今井 紘 (1988)．
cells.
属細菌の
L- 乾燥保存における二塩酸エチレンジアミンの保
Appl. Environ. Microbiol. 56: 2801-2806.
護効果．凍結及び乾燥研究会会誌 34：60-65.
Cleland, D., Krader, P., McCree, C., Tang, J. &
坂根 健，坂野 勲，飯島貞二（1982）．L- 乾燥保存
Emerson, D. (2004). Glycine betaine as a cryopro-
における変異を防止する保護剤．凍結及び乾燥研究
tectant for prokaryotes. J. Microbiol. Methods 58:
会会誌 28：77-82.
31-38.
坂根 健，今井 紘 & 坂野 勲（1985）．L- 乾燥保
Gundersen, K. (1957). Preservation of
.
存による変異誘発を防止する保護剤（第 3 報）シス
Nature 179: 789.
テインの保護作用．凍結及び乾燥研究会会誌 31：
Gupta, S.G. & Agate, A.D. (1986). Preservation of
27-35.
and
坂根 健，西井忠止，伊藤忠義，見方洪三郎（1996）
．
with activity check. Antonie van Leeuwen-
L- 乾燥法による微生物株の長期保存法．日本微生
hoek 52: 121-127.
物資源学会誌 12：91-97.
Imai, K. & Sakane, T. (1985). Preservation of chemolithotrophic bacteria by L-drying,
Satoh, K., Tanaka, T., Oguro, Y., Takahashi, R. &
Fundamentals
Tokuyama, T. (2004). Improvement of preservation
and applications of freeze-drying to biological
method for ammonia-oxidizing bacteria by freeze-
materials, drugs and foodstuffs, p. 233-234,
International Institute of Refrigeration, Paris.
drying. Soil Sci. Plant Nutr. 50: 777-781.
Tokuyama, T. (1994). A method for long-term preser-
Johnstone, B.H. & Jones, R.D. (1988). Physiological
vation of a chemoautotrophic ammonia-oxidizing
effects of long-term energy-source deprivation on
bacterium,
the survival of a marine chemolithotrophic ammo-
Bull. Jpn. Soc. Microbiol. Ecol. 9: 119-123.
nium-oxidizing bacterium. Mar. Ecol. Prog. Ser.
using silica gel powder.
（担当編集委員：岡根 泉）
─ 13 ─