頭頚部領域を中心としたヒト正常及び 腫蕩細胞の三次元培養

(
2
6
0
)
奈医誌. (
J
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.
)4
3，260~271 ，
目
1
9
9
2
頭頚部領域を中心としたヒト正常及び
腫蕩細胞の三次元培養による
組織再構築の研究
奈良県立医科大学耳鼻咽喉科学教室
鈴村滋生
TISSUERECONSTRUCTIONOFHUMANNORMALANDTUMORCELLS
MAINLYFROMTHEHEADANDNECKREGIONUSING
THREE-DIMENSIONALCULTURE
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OSUZUMURA
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代培養，および 7つの細胞株について 3次元培養を試み，
緒 言
上皮細胞のコラーゲ γ ゲ、ノレ内形態形成と悪性度との相互
上皮細胞は常に I型コラーゲンマトリックスを中心と
関係について形態学的検討を行った.また唾液腺分化モ
した間質の細胞外マトリックスと相互に作用し，その結
デノレについては免疫組織化学的，電子顕微鏡的ならびに
我々は， y線
照射により物理的条件を修飾したコラーゲンゲノレを用い
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nによる検索を行い，腺管形成とい
う唾液腺分化過程とコラーゲンゲノレ内での CEA関連抗
て 3次元培養を施行し，正常唾液腺組織 1)や頭頚部腫疹
原発現との相関について検討し，転移と分化の両面にお
果組織の構築や再生をおこなっていく
1
)
2
)
nv
i
t
r
oでの形態観察を報告した.またこの培養
組織 2)の i
いて関連する細胞外マトリックス研究に対してこの実験
系を用いて癌胎児性抗原〔以下 C
EA)が i
nv
i
t
r
oで正常
系が有用であることを確かめたのでその結呆について報
の唾液腺にも発現することを予備的に報告し 3)，さらに
告する.
経時的観察によりそれが唾液腺の分化マーカーの一つに
なることも確かめている 4). 今回この実験方法を用いて，
頭頚部に加え頭頚部以外の各種正常および腫蕩組織の初
実験方法
1 三次元培養に用いた y線照射コラーゲン
(
2
6
1
)
頭頚部領域を中心としたヒト正常及び腫蕩細胞の三次元培養による組織再構築の研究
Table 1
. Collageng
e
lpreparation
1
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1
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t
(
1
) γ線照射コラーゲンの作成とゲノレマトリックスの
調製 (Table1
)
照射コラーゲンの作成方法は， P
r
i
c
e5)や Jones6)の方法
を一部変法したもので，照射線量と最終ゲノレ濃度調製は，
岩井の報告に従って 5KGy，0.2%を用いた 7)
(
2
) コラーゲンゲノレ包埋培養法
4
'
C
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h1
0
-3NHCI
研究対象としての培養材料は手術時に得られた腫疹組
織2
2例と非腫蕩組織 1
7例の計 3
9例，そして細胞株 7例
巴 2a
，b
)
.
である CTabl
手術材料については，術中に無菌状態で得られた組織を
細切後，コラゲナーゼ〔新田ゼラチン社製〉を 0
.
1%含む
培養液 (Dulbecco.MEM)に浸し，一晩インキュベート
Table 2
. CulturedTissues(a)andcelHines(b)
a)
S
i
t
巴
M
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x
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l
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Submandibular
Gland
Hypopharynx
Larynx
ThyroidGland
MammaryGland
Pancreas
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Number
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13
)
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9
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(
10
)
(
2
6
2
)
鈴 村 滋 生
C
37
'
C， 5%CO，)した 翌日低速遠心で細胞を集め，リ
1CV!V)を基礎培養液にして， 5mg/mlb
o
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i
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eserum
ン酸緩衝液で 2回洗浄を繰り返し上清の不要浮遊物を除
p
i
d
e
r
m
a
l growth
albuminCBSA，Sigma)， 5ng/ml e
Pharmacia製〉を用いて 2
5
0
0
去した後，パーコーノレ液 C
factorCEGF，宝酒造社製〉および 10μg/mlインシュリ
rpmで 2
0分間遠心操作を施行して，組織の破片や赤血
ンを添加した無血清培地とした.
感染予防のためにストレプトマイシン 100μg/mlベ
球等の分離に努めた.パーコーノレ液の細胞の集まってい
る液層をピペットでゆっくりと吸引し再びリン酸緩衝液
ニシリン G1
0
0D/mlを培地に添加したが，特に感染が
で洗浄し， 1
0
0
0rpmで 5分間低速遠心分離を 2団施行し
予想される時にはさらにミノサイクリン 1μg/mlとフ
た.最後に培養液で同様の操作を施行したあと上清を取
ァンギゾン 5μg/mlも添加した.
2
. 転移性とゲノレ内形態との関係についての観察方法
り除き，沈殿している細胞を培養液を含む氷冷中のゲノレ
状コラーゲンの中に包埋分散した.
(1)培養細胞の形態観察
細胞株は上記操作を省略してトリプシン処理後，維持
初 代 培 養 2週間目に倒立位相差顕微鏡(オリンパス
培養液で 3-4回洗浄し，同様に遠心操作の後，沈殿した
CK-2型〉を用いて，細胞の増殖状態について観察をし
細胞を培養液を含む氷冷中のゲノレ状コラーゲンの中に包
た.すなわちゲル内の細胞増殖形態について，無作為に
埋分散した.
グラスターを抽出し， M
ontesanoの 分 類 8)に 従 っ て
.
0ml
/d
i
s
hの割合であらかじ
それぞれの培養細胞は 1
a
s
el
a
y
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r
めコーティングしておいたコラーゲンゲソレの b
の上に C巴1c
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a
i
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gl
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.
0ml
/d
i
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hの割合
で重層した C
F
i
g
.1
)
.3
0分間インキュベーター C
37
'
C，5
O
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rL
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yM
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i
u
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%CO，)に静置し，ゲルが固まってから，維持培養液を
C
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.
0ml
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i
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hの割合で加えた.培養デ
B
a
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eL
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e
r
ツシュはコーニング社製の径 35mmを用い，コラーゲ
.
2%とした.維持培養液の交換は 3日毎に施
ン濃度は 0
行した.なお維持培養液には， D-MEM+HAMの 1
a
.S
chematicdiagramo
fg
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l巴mbeddingc
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巴
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頭頚部領域を中心としたヒト正常及び腫疹細胞の三次元培養による組織再構築の研究
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yc
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cおよびその中間型と考えられる
b
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i
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g，s
(
2
6
3
)
向を示す細胞を有するもの (
s
l
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g
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l
y
(十/ー))，同視野にお
smoothc
y
s
t
i
cの 3タイプ (
F
i
g
.2a，b，c
)に分けて検討
いて染色傾向を示す細胞がないもの (
n
e
g
a
t
i
v
e
(ー))に分
し，各サンプルの増殖形態を対して最も多いクラスター
類して判定した.
タイプで判定分類し，病理学的悪性度とゲノレ内増殖形態
(
2
) 電子顕微鏡的観察
について比較検討した.
.
5%
ゲ、ノレ標本の一部を O.lMカコジノレ酸緩衝液中 2
(
2
) ゲノレ内形態と各種細胞外マトリックス接着性との
関係の観察
グノレターノレアノレデヒド液で前固定，
さらに 2%オスミウ
ム酸で後固定した.固定標本は，脱水後エポン包埋し，
培養細胞の I型コラーゲンゲノレ内形態とフィブロネグ
M-1200)で観察し
超薄切片作成後透過型電子顕微鏡(JE
チン接着性との関係を調べるため 2つのマウス乳癌細胞
た.また一部は脱水操作の後，臨界点乾燥および金属蒸
T
a
b
l
e2b
)す な わ ち i
nv
i
v
oで 高 転 移 能 を 示 す
株(
着処理を施して，走査型電顕 (
S
4
0
5
)で観察した.
JYG9)，i
nv
i
v
oで低転移能である DD7
6
210)および細胞の
(
3
) CEA関連抗原の分析
対照として正常マウス乳腺組織を用いて検討した. ト
リ
a
) CEA関連抗原の免疫電気泳動
プシン処理によって得られた 2 X1
05個 の そ れ ら 細 胞 株
を
，
5μg/mlに希釈したヒトフィブロ
リン酸緩衝液で 2
培養初期c7日目〉と後期 (
2
8日目〉の培養唾液腺細胞
を含むゲノレサンプノレ抽出物に対して，
W巴sternblotting
ネグチン(岩城硝子〉上に撤き， D-MEM培養液を加えて
を施行した.すなわちゲノレサンフツレをかモジナイズした
9
0分間あるいは 2
4時間 3TCでインキュベートした.そ
後
，
の後リン酸緩衝液で洗浄操作で数回施行し，接着細胞数
の後 8%ランニングゲノレを用いて分子量により泳動分離
5%DTTを加え， 1
0
0
'
C， 5分間処理を施した.そ
をトリプシン処理し，サイトメトリーを用いて測定した.
した.さらに 3
0V，1
2時間でニトロセルロース膜へ転写
また各種細胞外マトリックスとの接着性を比較するた
し
， MEB-Ol1抗体を用いて免疫ベノレオキシダーゼ法で
V
型コ
め
， 25μg/mlのマウスラミニン〔岩城硝子〉およびI
DAB呈色反応を施行した.またプレステインド分子量
0分間のインキュベーシ
ラーゲン〔岩城硝子〉を用いて， 9
マーカーとしてミオシン， β ガラグトシダーゼ， BSA
，
ョン後，同様操作を施行した.そして細胞外マトリック
オヴアノレミンおよびカノレボニツクアンヒドラーゼ、を用い
5μg/mlの Bovin
巴S
erumAlbuス以外の対照として， 2
た.
min(BSA，Sigma)でコーティングしたものに対して同
b
)i
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uh
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a
t
i
o
nによる CEA同定
培養ゲノレのクリオスタット凍結切片に対して i
ns
i
t
u
様操作を施行した.
3
. 1型コラーゲンマトリックス内での唾液腺細胞分
h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nを S
i
n
g
巴1
ーらの方法 12)を一部変法して施行
した 13).内因性アルカリフォスファターゼ活性の除去に
化の観察方法
(1)唾液腺細胞分化の免疫組織化学的検討
e
n
s
e
nらの方法 1勺と準じて 0
.
0
1M MgC12で 3
0分間
はJ
培養液中からケ、ノレ標本を取り出し，パラフィンによる
処理した.プロープとしては， CEAの特異的 cDNAであ
永久標本作成のあと， ABC法〔アピジンピオチン，ベノレ
る CEA3
'
-u
n
t
r
a
n
s
l
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t
e
dr
巴g
lOnの R
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e
c
t
a
s
t
i
n社〉による免疫染色を施
オキシダーゼキット， B
片0
.
3
9Kb(札幌医大第一内科学教室，東出俊之博士より
行した.各一次抗体の「希釈濃度，反応時間」は， MEB
供与〉を用いたランダムプライマ一法でピオチン標識
0
1
1
(抗 CEAマウスモノクロ一ナノレ抗体， B
i
o
t
e
s
t社〉が
dUTP(B巴t
h
e
s
d
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r
c
hl
a
b
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r
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r
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)を取り込ませ
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5
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0倍
， 3
0分 J
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nti-humanCEA，A
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h
a
F
e
t
o
p
r
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t
e
i
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(AFP，ラビットポリク戸一ナノレ抗体， Lipshaw社〉が
1
1
0
0
0倍
， o
v
e
r
n
i
g
h
t
J，抗唾液腺ホノレモン抗体〔マウスポ
リグローナル，
自家作成 1
1
)が 1
1
0
0
0倍
， o
v
e
r
n
i
g
h
t
Jであ
た.また同定方法としては F
e
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b巴r
gら15)の non-
i
s
o
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p
i
cmethodに従って，プロープ上のその標識ピオ
Bo巴h
r
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)
1
μ
g
/
m
l，ピオ
チンにストレプトアピジン (
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et
e
t
r
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った.そして発色剤として D
t
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i
e
s
)1U/ml，ニトロブルーテトラゾリウム (
S
i
g
m
a
)
drochrorideCDAB)を用いた.
O33mg/ml， 5 ブロモ 4 クロロ 3 インドリノレフォ
目
なお MEB-Ol1を用いた免疫染色においては，非特異
S
i
g
m
a
)
0.
1
7mg/mlの混合溶液を用いて発
スフェート (
的染色性のない標本において，一定の染色態度を呈した
色した.核染色にはファストレッドを用いた.また産物
所見を正常唾液腺細胞の CEA関連抗原発現にとして採
の免疫組織化学的検索として， NCAと交差しないモノ
用した.そして発現の強さを，著明に褐色に染色された
クロ一ナノレ抗体 MA20816)を用いて同じ凍結切片を用い
d
i
s
t
i
n
c
t
(+十))，薄いが明らかに染色性を認めるも
もの (
て ABC法で検討した.
の(
m
o
d
e
r
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t
e
(+)
)
， 1
0
0倍視野においてわずかに染色傾
(
2
6
4
)
鈴 村 滋 生
結
2
. 培養唾液腺細胞の分化と細胞マトリックス
果
(1)唾液腺細胞のケソレ内で、の腺管形成
ranching型 の 増 殖 形 態 を 示 し
正常唾液腺細胞は b
1)培養細胞増殖形態と転移性
(
F
i
g
. 5a
)，形成された腺管ではムチン分泌や唾液腺ホ
(1)ゲノレ内増殖形態と悪性度
初代培養においては， b
r
a
n
c
h
i
n
g型の増殖形態は正常
細胞で 1
5例中 1
4例，良性腫虜細胞で 7例中 6例に認め
た.それに対して悪性腫疹細胞は増殖を示さないものが
1
2例中 4例もあり， branching型の増殖形態も 8例中 1
例 し か 認 め な か っ た . そ し て 悪 性 腫 湯 細 胞 は smooth
c
y
s
t
i
c型の増殖形態を 8例中 4例に認め，正常および良
ranching型の増
性腫蕩細胞に比して有意 (p<O.01)に b
Table3
)
. ところが同じ悪性腫蕩
殖形態が少なかった (
r
a
n
c
h
i
n
g型の増殖形態を
由来でも細胞株においては b
7例中 5例に認めた (p<0.05).
(
2
) ゲノレ内増殖形態と各種細胞マトリックス接着性
乳癌細胞株 DD762と JYGについて検討した結果， I
型コラーゲンに対して b
r
a
n
c
h
i
n
g型 の 増 殖 を 示 す DD
7
6
2の接着細胞数が， smoothc
y
s
t
i
c型の増殖形態を示す
JYGのそれよりも 9
0分で 4倍
， 2
4時間で 3
6倍多く，フ
a
ィブロネグチンに対して接着性の高い傾向を認めた
(
F
i
g
. 3a，b，4a
)
. また BSAに比してフィブロネグチン
と IV型コラーゲンには，両細胞株ともに接着性が高い
傾向を認めたが，ラミニンについては BSAに比して接
着性の差を認めなかった (
F
i
g
.4b
)
.
b
F
i
g
.3
. Morphologicald
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頭頚部領域を中心としたヒト正常及び腫療細胞の三次元培養による組織再構築の研究
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.
ノレモン産生を組織化学的に認めた (
F
i
g
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)
. 透過型
例で，殆ど見られなかったものも 3例認め，多数の腺管
電顕による観察では，細胞の剥離および分解による空間
を形成したサンプノレ 4例は全例とも CEA抗体に対して
F
i
g
.6
)
.
の形成および、微繊毛の存在を認めた (
濃染傾向を示した (
T
a
b
l
e4
)
.CEA関連抗原と腺管形成
(
2
)i
nv
i
t
r
o腺管形成と抗 CEA染色率の相関
との関係において例数が少ないため統計的な有意さは出
その培養標本 1
3例中，腺管形成が多数見られたのは 4
T
a
b
l
e4
)
.
せなかったが相関傾向を認めた (
(
2
6
6
)
鈴 村 滋 生
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すが (
F
i
g
. 7)，主にクラスター内部の細胞であった (
F
i
g
7a，7c
)
.それに対して対照として用いた CEA産生細胞
株S
HIN-III(Table2b)は，部位特異性がなく全ての細
胞において濃染傾向を認めた (
F
i
g
.7b
) 正常唾液腺細
胞において， CEA関連抗原はモノクロ一ナノレ抗体，ポリ
クロ一ナノレ抗体に陽性で、あるが同じ分化関連蛋白である
AFPについてはポリグロ一ナノレ抗体で、も陰性であった
(
F
i
g
.7c
，d
)
.
(
3
) CEA関連抗原の同定
免疫電気泳動による分子量からの検討で，培養前期(1
週目〕では，関連蛋白である BGP(M.W.8
0
1
0
0KDa)が
F
i
g8
(1)).それに対し培養
その分子量から示唆された (
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後期 (4週目〉では，いわゆる CEA(M.W.1
の出現および B
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nおよび
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その産物の組織化学的検索からも CEA特 異 的 cDNA
の分布をクラスターにおいて認めた (
F
i
g
.9a，b
)
.
頭頚部領域を中心としたヒト正常及び腫疫細胞の三次元培養による組織再構築の研究
a
(
2
6
7
)
b
C
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Fig.7 I
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ゲノレ内増殖形態と転移性との関係について
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ところ形態形成に関与した上皮細胞と I型コラーゲンと
の接合モデノレとして，接着蛋白であるフィブロネグチン
を介して，細胞内骨格系と接合したインテグリン部分で
1
9
).いわゆる
それと結合すると L、う見方が有力である 18)，
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とした骨格蛋白と接着し，それを物理的支柱にして
コラーゲンと接着できなかったため，個々の細胞が形態
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g型の増殖形態を規定しようとする川 現在の
形成できず球形状構造になった可能性が高いと考える.
(
2
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)
鈴 村 滋 生
乳癌細胞株 DD7
6
2と JYGを用いた予備的実験で、は
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g型の増殖パターンを示す DD7
6
2が上皮細胞
の形態保持とも関係があるフィブロネクチン叩)との接着
05
性が JYGv
こ
，比べて高く，またコントローノレとして用い
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た BSAよりもフィプロネクチンが接着性が高いという
本研究の結果により，少なくとも接着性の影響が示唆さ
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れた. またゲノレ内で s
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2に比べて転移性が高い
いた JYGが i
とL、う事実は，両細胞株においてゲノレ内形態の違いが細
胞骨格への接着力の違い，ひいては i
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関係がある可能性と矛盾しない.
初代培養においても一般に転移性があるとされる悪性
腫蕩細胞は転移性がないとされる良性腫湯および正常細
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gタイプの増殖形態が少な
胞に比べて有意に b
かった.これは I型コラーゲンへの接着性への低さ，言
い換えれば細胞の易移動性とも関係してくる接着依存性
滋酔伽
の低さを示唆するものである.i
nv
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v
oでの転移性の有無
と I型コラーゲンゲノレ内形態の差異についてさらに高い
相関関係を見いだせれば，今後ある腫湯細胞の潜在的悪
性度を推測するにあたり，核異型性や N/C比等に加え，
新しい簡易定性システムを確立できる可能性を示唆する.
また細胞株は悪性腫湯から継代樹立したものであるの
にかかわらず
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7例中 5例が樹枝状増殖を示し，初代培
養の悪性腫湯細胞と異なる増殖形態になった.この実験
結果は，細胞株が必ずしもそのオリジナノレの特性を保持
するものとは限らないことを示すとともに，逆に継代に
より正常に近い形質に戻っている可能性も示唆しており
興味深い.
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頭頚部領域を中心としたヒト正常及び腫蕩細胞の三次元培養による組織再構築の研究
なお近年， RGD(Arg-Gly-Asp)とL、うトリベプチド
(
2
6
9
)
作用よりもむしろ接着性を弱める作用があるのではない
を特異的に認識する配5β1というインテグリンサブクラ
かという報告もある制.この点について現在我々は CEA
スと転移性との関係が注目されている 21)問 . RGD認識受
のcDNAをトラシスフェクタントさせた細胞〔札幌医科
容体ついては転移との関係が問題になるピトロネグチン
大学第 l内科杉山敏郎博士より供与〉を用いて検討中で
についてもその細胞表面の特異的結合部位が既に報告さ
ある.
れており叫，この細胞外マトリックス中に存在するトリ
いずれにしても本培養システムは i
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oに近い形態
ペプチドの認識受容体と I型コラーゲンゲノレ内形態の相
の変化を観察するのに有用であり 8)11)，様々なクローニン
関を調べることが今後の研究課題の 1つで、あろう.
2 唾液腺分化と I型コラーゲンマトリックスについ
グされた遺伝子のトランスフェクタント細胞を用いた純
粋な実験系が重要であることは上述の通りであるが，こ
の実験系がそういった転移と分化に関係する様々な研究
て
正常唾液腺細胞は，この実験系の中で I型コラーゲン
マトリックスと接着して樹枝状の増殖形態を示し，腺管
を形成していくといったような形態的分化をある程度ま
で再現していくり.今回の研究で樹枝状増殖は正常唾液
腺由来培養標本全例にみられ，その中でも CEA関連抗
原を強く発現した標本に腺管形成が多数みられた.
CEAとその関連抗原を区別しうる特異的抗体は現時
点では作成されていない.しかしウエスタンプロッテイ
にたいする補助的データの提供に役立つものであると考
える.
結
語
1
. γ線照射 I型コラーゲンゲノレを用い，各種手術材
料，細胞株に対して三次元培養を施行し，形態学的研究
を中心に転移および分化と I型コラーゲンマトリッタス
の関係について検討した.
ングによる分子量向定および CEA特 異 的 cDNAを用
2
. 初代培養においては，正常および良性腫蕩細胞は
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反応する物質は CEAであることが強く示唆された (
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. 正常唾液腺組織が CEA関連抗原を産生している
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g型の増殖形態は正常および良性腫湯細胞に比
としづ報告は正常顎下線組織について BFPフラグメン
して有意に少なかった.
トが近年報告されているのみ 24)であり，分化モデルをつ
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3例全例において b
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g型の増殖形態を示し
くり CEA関連抗原を検討した報告は未だ無い.下部消
た正常唾液腺細胞において腺管構築がみられないものも
化管である正常成人の大腸粘膜上皮細胞が癌細胞と同様
あったが，抗 CEA抗体に濃染傾向を示したサンプノレ 4
に CEAを活発に産生しているが癌細胞と細胞内の代謝
例は全例とも多数の腺管構築を認めた.
経路が異なるため検索され難いだけであるという報告が
4 転移および分化の研究のため上皮細胞と I型コラ
近年なされている 25) 大腸において CEAの発現は分化
ーゲンマトリックスの相互関係を追求する補助的実験シ
に関係しているという報告も大腸癌の細胞株を用いた研
ステムとしてこの培養系は有用である.
究から近年なされている 26). 乳腺についても分化との関
係を現在検索中である 27)
一方，近年 CEAが I型コラーゲンの RGD部位を認識
稿を終えるにあたり，ご指導，ご校閲をいただいた恩
師松永喬教授に深甚の謝意をささげます.また論文作
する受容体のサフゃユニットであるという報告が大腸癌の
成にあたりご指導いただきました奈良県立医科大学第 2
細胞株を用いた研究でなされた 28). 唾液腺の分化過程に
病理学教室日浅義雄教授，同皮膚科学教室白井利彦教授
おいてコラーゲンとの接触のないクラスター内部の細胞
に深謝いたします.そして木研究を遂行するにあたり終
の細胞質内で CEAが豊富に認められ，その細胞が剥離，
始温情あふれるご指導を賜りました大阪府立大学附属研
分解した空間が腺管になる報告 4)およびコラーゲンゲノレ
究所応用生体科学部門生体利用工学教室岩井良昭講師，
培養における唾液腺細胞の CEA産生動態についての報
岩井峯子講師および研究にご協力ご指導頂きました宮原
告川主そのサフ。ユニット説と矛盾しない.いずれにして
裕助教授をはじめ奈良県立医科大学耳鼻咽喉科学教室諸
もサブユニット説の提唱通りこの CEAという胎生期蛋
兄姉に心より感謝いたします.なお本研究の一部は文部
白の発現も RGDと関係があれば，それは転移，分化の研
省がん特別研究 II(
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4
1
5
2
1
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4，杉山〉の補助によった.
究はさらに重要性を増すことであろう.
また本研究の発展のための経済的援助を受けたオランダ
CEAの腺管形成への機能的意義については不明であ
政府文部省に感謝いたします.本研究の要旨は第 1
4回日
り，過剰産生された CEAは本来の細胞聞を接着させる
本頭頚部腫濠学会，第 4回日本口腔咽頭学会及び第 9
3回
(
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7
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)
鈴 村 滋 生
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日本耳鼻咽喉科学会総会で発表した.
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4，
よる組織再構築に関する研究.奈医誌. 4
一，草間良恵，古閑睦好目コラーゲンゲ、ル培養(1).
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